Tách chiết và tinh sạch Protein

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:39

Thêm vào BST

Báo xấu

288
lượt xem 69
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Protein (Protit hay Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tách chiết và tinh sạch Protein

Tách chi t và tinh s ch protein Các phương pháp chi t rút tinh s ch và xác đ nh protein I. Khái ni m Trong các t ch c c a cơ th s ng, protein có th dư i d ng t do trong các d ch sinh v t ho c dư i d ng k t h p, ho c b c m trong các t bào. Hơn n a, trong t bào có ch a hàng nghìn lo i protein khác nhau, n u ta c n nghiên c u t ng lo i protein, trư c h t ph i chi t rút và tinh s ch chúng. Chính vì v y, các k thu t chi t rút, tinh s ch và nghiên c u protein luôn v trí trung tâm c a các nghiên c u hóa sinh và luôn ư c c p nh t và hi n i hóa. II. Các bi n pháp c n thi t nh n protein nguyên th Các phương pháp chi t rút và tinh s ch protein u d a trên nh ng tính ch t hóa lý c a protein như tích i n, kích thư c phân t , hòa tan... c a protein c n chi t rút. Nhi u protein còn liên k t v i các phân t sinh h c khác nên vi c chi t rút các protein này còn ph thu c vào b n ch t c a các liên k t. Mu n thu nh n ư c các protein nguyên th t c là protein có t t c tính ch t t nhiên c trưng c a nó, c n s d ng các bi n pháp khác nhau. 2.1. Nhi t tách các protein khác nhau d a trên k t t a c a chúng, ngư i ta có th s d ng phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c a nhi t. M t i u c n lưu ý là ch nên dùng i v i trư ng h p các protein enzyme b n v i nhi t. D ch protein enzyme ư c gi 50 - 700C trong th i gian xác nh, sau ó protein t p ã b bi n tính ư c lo i b b ng cách l c ho c ly tâm. Như v y, d ch chi t protein thô b n v i nhi t có th ư c thu nh n b ng cách cho k t t a không thu n ngh ch ph n l n các protein t p. thu nh n ch ph m protein theo phương pháp k t t a thu n ngh ch b ng các mu i trung tính, c n ti n hành nhi t th p, i v i dung môi h u cơ c n ti n hành nhi t dư i 00C tránh bi n tính c bi t là protein enzyme. 2.2. N ng proton (pH) Protein là các ch t lư ng tính, vì v y, trong các dung d ch acid và ki m chúng s b phân ly như sau:
pixelLineWidth 0"> Do các acid amin trong chu i polypeptide còn t n t i nhi u nhóm ch c t do dư i d ng các ion hóa là nguyên nhân t o ra tính a i n c a protein. Phân t protein r t dài nên nhóm ion t do t n cùng c a chu i polypeptide không áng k , ch y u các nhóm ch c t do khác c a chu i bên (R) quy t nh tính ch t tích i n c a phân t protein (nhóm cacboxyl c a amino acid, OH c a Tyrosine, ε - NH2 c a lysine, guamidin c a Arginine, inidazol c a histidine) M c ion hóa c a các nhóm này ph thu c vào giá tr pH. Các nhóm acid d ng anion trong môi trư ng ki m, các nhóm ki m t n t i d ng cation trong môi trư ng acid. Như v y, m t giá tr pH xác nh, m i phân t protein có m t i n tích t ng s nào y mà l n c a nó ph thu c vào s lư ng các nhóm tích i n dương và tích i n âm. K t qu là giá tr n ng ion hydro c nh, các protein khác nhau trong h n h p s có t ng i n tích khác nhau. Nhi u phương pháp dùng tách các h n h p protein u d a vào c tính này. Các phân t protein mang i n tích t ng s (dương ho c âm) cùng d u y nhau ra xa nên d tan vào dung d ch. M i m t protein có m t giá tr pH nh t nh mà ó t ng s i n tích âm và i n tích dương trong phân t b ng không. Giá tr ó g i là i m ng i n c a protein. i m ng i n c a các acid amin trung tính có giá tr pH t 5,6 - 7,0; i v i các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là t 3,0 - 3,2; i v i các acid amin có tính ki m (diamino) là t 9,7 - 10,8. i m ng i n, hòa tan c a protein là th p nh t, protein d b k t t a. D a vào tính ch t này, ngư i ta có th tách t ng ph n các protein enzyme trong h n h p. Cũng gi ng như trư ng h p tác d ng c a nhi t trong vi c tách chi t protein, có th dùng phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c a pH c a môi trư ng. D ch protein enzyme ư c gi pH ≤ 5 trong th i gian xác nh. Protein t p b bi n tính cũng ư c lo i b b ng cách l c ho c ly tâm. Ví d citochrom C cũng tan
trong acid trichloracetic trong khi ó acid này làm k t t a ph n l n protein. Như v y các protein b n v i acid có th ư c tách chi t b ng cách này. 2.3. Tác nhân hóa h c Có th dùng mu i trung tính ho c các dung môi h u cơ tách chi t các protein enzyme. Phương pháp này ư c ti n hành d a tr n cơ s : hòa tan c a protein ph thu c vào s tương tác c a các nhóm tích i n trong phân t protein v i các phân t nư c. S tương tác ó (còn g i là s hydrate hóa) s b gi m xu ng khi thêm vào dung d ch protein enzyme các dung môi h u cơ ho c các mu i trung tính. Dung môi h u cơ thư ng dùng là etanol, isopropanol, acetone ho c h n h p các lo i rư u. Khi s d ng các dung môi h u cơ, c n chú ý ti n hành nhi t th p (t 50C tr xu ng). Dùng dung môi h u cơ có th ti n hành tách phân o n dư i 00C và có th n -200C, như v y có tác d ng t t n n nh c a protein enzyme. Khi ã có k t t a, chú ý l y nhanh k t t a ra kh i dung môi b ng cách dùng máy ly tâm l nh. Các mu i trung tính có th dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, ngư i ta ã nh n th y mu i (NH4)2SO4 là t t nh t vì nó không làm h i mà làm n nh (làm b n) h u h t các lo i protein enzyme. Lo i mu i này l i r ti n và ph bi n. hòa tan c a nó l i r t l n (b o hòa 767g/l 250C) Ngoài ra n ng (NH4)2SO4 c n thi t k t t a protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhi u. Ví d : Protease c a n m m c d b k t t a 70% c a (NH4)2SO4 b o hòa hoàn toàn, còn amilase c a m m lúa b k t t a 50% b o hòa c a dung d ch mu i này. i u ó nói lên tính k t t a l a ch n c a (NH4)2SO4 cao hơn các mu i khác. Có th dùng (NH4)2SO4 c 2 d ng: d ng b t và d ng dung d ch b o hòa. Khi dùng b t, ngư i ta cho t ng ít m t vào d ch chi t protein enzyme. Cách cho cũng nh hư ng l n n lư ng k t t a ban u c a protein enzyme. Khi cho mu i vào d ch chi t c n ph i có máy khu y t m b o s hòa tan c a mu i. Khi dùng dung d ch b o hòa, trong nhi u sách v phương pháp nghiên c u, ngư i ta ưa ra b ng tính s lư ng mu i c n thi t pha các dung d ch có bão hòa khác nhau nh ng nhi t nh t nh. Khái ni m v s ph n trăm c a b o hòa hoàn toàn ã ư c c p n. Như ví
d trên thì protein enzyme có th b k t t a 50% (0,5) ho c 70% (0,7) c a bão hòa hoàn toàn c a (NH4)2SO4. Khi cho dung d ch (NH4)2SO4 bão hòa vào d ch chi t protein enzyme thì n ng (NH4)2SO4 không tăng t ng t. Sau khi k t t a xong ngư i ta thư ng l ng kho ng 2 gi ho c qua êm, m c ích là t o k t t a hoàn toàn ( phương pháp dùng dung môi h u cơ thì không c n lâu). K t t a ư c l y ra b ng cách ly tâm ho c l c qua ph u Buchner. Khi hòa tan k t t a l i ngư i ta thư ng thêm ion Ca++ làm b n protein enzyme (dùng CaCl2 ho c Ca(CH3 COO)2 ti n l i, ngư i ta ưa ra công th c cách tính lư ng (NH4)2SO4 cho vào d ch có bão hòa cho trư c (S1) t nm t bão hòa c n thi t (S2) Tùy theo tr ng thái (NH4)2SO4 cho thêm vào d ch chi t protein enzyme mà có công th c tính toán khác nhau. - i v i (NH4)2SO4 d ng b t x(g) = Trong ó V là th tích dung d ch, S1, S2 là bão hòa cho trư c và bão hòa c n t (ví d : S1 = 0,5; S2 = 0,7 ch ng h n). Ngư i ta cũng có th dùng b n toán (nomogram) chi u và xác nh ư c lư ng (NH4)2SO4 thêm vào d ch chi t protein enzyme t ư c m t bão hòa nh t nh. Ho c có th i chi u b ng có s n. Lư ng (NH4)2SO4 ưa vào dung d ch có bão hòa nh t nh có khác nhau tùy theo nhi t thí nghi m. - i v i (NH4)2SO4 d ng dung d ch bão hòa. Th tích (tính theo ml) c a dung d ch bão hòa c n cho vào 100ml dung d ch có bão hòa ban u S1 t nm t bão hòa S2 c n thi t ư c tính theo công th c sau:
V(ml) = Như v y, n u thêm t ng ph n các dung môi h u cơ ho c t ng ph n mu i (NH4)2SO4 (có n ng bão hòa khác nhau) thì ta có th tách t ng ph n h n h p protein enzyme. Tuy nhiên, phân chia hoàn toàn nh ng h n h p ph c t p, phương pháp này không cho k t qu t t vì hòa tan c a m t s protein b tăng lên. M c d u v y, cách k t t a t ng ph n này cũng r t có l i, c bi t là i v i giai o n u c a vi c tách chi t và làm s ch protein emzyme, vì phương pháp khá ơn gi n. Ngoài ra, các tác ng khác như cơ h c, sóng siêu âm... có nh hư ng n quá trình tách chi t protein emzyme. III. Phá v t bào và chi t rút protein 3.1. Phá v t bào Protein enzyme có trong t t c các cơ th ng v t, th c v t và vi sinh v t. Sau khi ư c t ng h p nó có th ư c ti t ra ngoài t bào t n t i trong các d ch cơ th , d ch môi trư ng (g i là protein enzyme ngo i bào) ho c ư c gi l i bên trong t bào (protein enzyme n i bào). Các protein enzyme n i bào có th t n t i d ng hòa tan trong t bào ch t và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v...) c a t bào. T bào ư c bao b c b ng m t l p màng.L p màng này vi khu n ôi khi r t b n và dày. Ngư i ta còn th y nhi u protein enzyme liên k t r t ch t ch v i các bào quan c a t bào. Các phân t protein enzyme không có kh năng i qua màng c a t bào và màng c a các bào quan c a t bào. Do ó có th chi t rút các protein enzyme n i bào, bư c u tiên là ph i phá v c u trúc c a các t bào có ch a protein enzyme và chuy n chúng vào dung d ch. Có th phá v c u trúc c a t bào b ng các bi n pháp cơ h c như nghi n v i b t th y tinh ho c cát th ch anh, làm ng hóa b ng thi t b nghiên ng th (homogenizator). Thi t b này có chày th y tinh g n v i m t môtơ quay và có th i u ch nh ư c t c quay theo yêu c u. Các t bào gi a chày thùy tinh và thành c i s b phá h y. vi c phá v có hi u qu , mô th c v t, trư c khi nghi n, ngư i ta thư ng thái nh m u vào ngăn á ho c cho trương nư c. (ví d như i v i m u h t khô). Còn các mô c a ng v t như gan ho c th n, khi chi t protein enzyme ngư i ta c n c t b các mô liên k t. Mu n tách ư c các protein trong các c u t c a t bào, ngư i ta còn ph i dùng
các y u t v t lý và hóa h c khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi h u cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat... và ch t t y (detergent). Các hóa ch t t t cho vi c phá v các bào quan c a t bào vì trong các cơ quan này thư ng ch a m. 3.2. Chi t rút protein Sau khi ã phá v c u trúc c a các t bào ti n hành chi t xu t các protein enzyme b ng các d ng d ch m thích h p, dung d ch mu i trung tính ho c b ng nư c i v i protein enzyme n i bào ho c b ng ly tâm tách t bào i v i các protein enzyme ngo i bào: vi c ch n phương pháp tách chi t protein enzyme tùy thu c vào tính ch t c a protein enzyme c n nghiên c u. IV. Tinh s ch protein 4.1. Lo i các t p ch t Trong d ch chi t thô thu ư c ngoài protein enzyme còn có các protein t p, các ch t cao phân t khác như polysaccharid, acid nucleic và các ch t phân t nh như ư ng monose, các ch t lipid, mu i khoáng v.v... lo i b chúng ph i s d ng ph i h p nhi u bi n pháp khác nhau. lo i b mu i khoáng và các lo i ư ng... là các t p ch t có phân t lư ng th p ngư i ta thư ng dùng phương pháp th m tích (dialysis) i nư c hay i các dung d ch m loãng ho c b ng cách l c qua gel sephadex. lo i b các protein t p và các t p ch t có phân t lư ng cao khác, ngư i ta hay dùng k t h p nhi u bi n pháp khác nhau: phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c a nhi t ho c pH c a môi trư ng, phương pháp k t t a phân o n b ng mu i trung tính ho c các dung môi h u cơ (xem 5.2.1; 5.2.2. và 5.2.3), các phương pháp s c ký trao i ion, i n di, phương pháp l c gel. 4.2. Các k thu t thông thư ng trong tinh s ch protein Như trên ã trình bày, sau khi nh n ư c d ch chi t protein thô, ngư i ta thư ng s d ng các phương pháp khác nhau tách chi t và ng th i làm tinh s ch protein. Ngoài các k thu t ã ư c gi i thi u c th các ph n trên, có th s d ng các phương pháp dư i ây ph c v cho vi c tinh s ch các protein. 4.2.1. Ly tâm M t trong nh ng k thu t không th thi u ư c trong vi c tách chi t và tinh ch protein là ly tâm. Máy ly tâm ư c s d ng tách các ph n khác nhau kh i dung d ch. Ngư i ta g i pha l ng là ch t l ng bên trên k t t a, pha r n mà thư ng l ng k t xu ng áy ng ly tâm ư c g i là k t t a. Th c ch t, s ly tâm tăng t c k t t a c a nh ng ti u ph n r n nh l c ly tâm. S sai khác v t tr ng c a nguyên li u lơ l ng so v i ch t l ng càng l n thì t c k t t a s càng cao. M c d u ngư i ta coi s vòng quay trong m t phút là ơn v thông thư ng c a l c ly tâm, nhưng quy ư c y không th a mãn. Chính vì v y, m c tăng l c ly tâm ư c o m t cách chính xác hơn b ng nh ng b i s c a tr s gia t c c a l c hút m t bi n, có nghĩa là ư c
o m t l c ly tâm tương i (relative centrifugal force, RCF) ho c là ư c o b ng các giá tr là b i s c a l c hút tr ng trư ng (xg). Công th c tính l c ly tâm tương i là: Trong ó r là bán kính n áy c a ng ly tâm tính ra "phút" (foot, 1foot = 30,48cm), n là s vòng quay trong 1 giây. Có th tính giá tr c a l c ly tâm tương i m t cách tr c ti p theo công th c: L c ly tâm tương i (g) = 1,1118 x 10-5 x R x N2. Trong ó R là bán kính (cm) n p ly tâm tính t tâm c a tr c n áy ng ly tâm, N là s vòng quay trong m t phút. Cũng có th dùng b n toán (nomogram) tính l c ly tâm tương i Thông thư ng có th làm k t t a nh ng ti u ph n l n v i l c ly tâm tương i bé b ng các máy ly tâm bàn. làm k t t a nh ng ti u ph n bé hơn k c nh ng thành ph n c a t bào c n có nh ng máy ly tâm c hi u b o m ư c các giá tr l c ly tâm tương i cao hơn 15000 x g i v i b t kỳ nh lư ng nào. Có nh ng nguyên t c làm vi c an toàn hơn v i máy ly tâm i v i ngư i thao tác cũng như i v i nguyên li u ư c x lý mà lúc thí nghi m c n chú ý tuân th . ó là nguyên t c cân b ng i x ng khi ly tâm và thăng b ng máy ly tâm khi t máy làm vi c. Do tính ch t không b n v i nhi t c a ph n l n các protein enzyme, khi tách chi t tinh ch chúng, c n s d ng máy ly tâm l nh. Trong trư ng h p i u ki n thí nghi m có h n ch , có th s d ng m t s phương cách nh m m b o duy trì m u nhi t th p. C n làm l nh t t m u và ng ly tâm trư c khi ly tâm. N u trong máy có các m thay th có th làm l nh chúng trong t l nh trư c khi ly tâm. C n ph i ti n hành ly tâm v i th i gian t i thi u tránh nóng máy. Có th t tr c ti p máy ly tâm bé vào t l nh, ưa dây d n ra ngoài qua l p m c a cánh c a t l nh. 4.2.2. Th m tích Th m tích là s khu ch tán vi phân qua màng v n không th m i v i nh ng ch t keo hòa tan (protein, m t s các polysaccharid) nhưng th m i v i các d ng d ch các tinh th .Các tinh th (các mu i, các h p ch t h u cơ có tr ng lư ng phân t th p...) có th khu ch tán qua màng theo nh lu t Fick. Nư c s khu ch tán t dung d ch có n ng th p hơn (thư ng là dung d ch r a) vào dung d ch keo, trong
khi ó các ion (cation và anion) và các ch t phân t nh s chuy n vào dung d ch có n ng th p hơn (thư ng chuy n vào dung d ch r a). Trong quá trình tách chi t và tinh s ch protein, lo i mu i ammonium sulphate ra kh i dung d ch protein thì cho dung d ch protein vào cái túi c hi u làm b ng nguyên li u bán th m. Thông thư ng ngư i ta hay dùng túi colodion ho c cellophane (lo i sau hay ư c dùng hơn). Sau ó t c túi vào bình ch a lư ng l n nư c ho c lư ng l n dung d ch m ư c pha loãng (ví d m phosphate có pH = 7, n ng 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán th m, có kích thư c l ch cho các ch t có phân t i qua vào các dung d ch m loãng theo nh lu t khu ch tán. Như v y, mu i s khuy n tán vào nư c ho c dung d ch êm loãng (di chuy n theo hư ng gi m n ng ), còn nư c ho c m loãng s di chuy n t dung d ch r a vào túi ch a protein. Protein là nh ng i phân t không th vư t qua túi th m tích và ư c gi l i trong túi. B ng cách thay i thư ng xuyên dung d ch r a có th t y s ch mu i ra kh i protein , m c d u trong quá trình th m tích, nó là dung d ch ư c pha loãng hơn. Có th làm gi m b t ho c lo i tr s pha loãng như th khi ti n hành th m tích dư i áp su t, có nghĩa là khi dung d ch ư c x lý n m dư i m t áp su t th y tĩnh y , dòng th y ng h c c a nư c t dung d ch s cân b ng s khu ch tán c a các phân t vào dung d ch. Phương pháp này thư ng òi h i có thi t b c bi t. Hình 5.1 Th m tích lo i mu i (NH4)2SO4 trong k t t a protein. Phương pháp th m tích thông thư ng là cho dung d ch có k t t a protein vào túi th m tích (không quá 2/3 th tích túi). Cho thu c sát trùng ho c toluen b o qu n protein (vì th i gian th m tích lâu, protein có th b th i h ng). Bu c túi vào m t que th y tinh, gác que th y tinh lên mi ng ch u nư c gi túi gi a ch u. Cho vòi nư c ch y nh liên t c vào áy ch u thay i nư c thư ng xuyên (hình 5.1). Mu i (NH2)SO4 hòa tan trong nư c và b lo i d n. Th i gian th m tích có th t 24 - 48 gi , làm th m tích l n cu i cùng b ng nư c c t. Có th tăng t c th m tích khi khu y dung d ch r a b ng máy tr n cơ h c hay máy tr n t ho c là quay ch m túi nh ng cơ không l n. Khi th m tích các
protein thư ng ngư i ta ti n hành t t c các thao tác môi trư ng l nh. 4.2.3. S c ký l c gel S c ký l c gel là m t trong nh ng k thu t s c ký c t ư c dùng ph bi n trong tách chi t và tinh s ch protein. D ch chi t protein enzyme ã ư c lo i b ph n l n các protein t p nhưng v n chưa m b o ng nh t c n thi t ư c ti p t c làm s ch b ng phương pháp s c ký c t. Phương pháp s c ký (chromatography) là do hai ch "chroma" là màu s c và "grapho" là vi t, nghĩa là vi t b ng màu. Thu ban u, ngư i ta s d ng phương pháp s c ký tách các ch t màu và ch sau này ngư i ta áp d ng cho vi c tách các ch t không màu. S c ký l c gel còn ư c g i là phương pháp dùng ch t rây phân t , l c gel (gel filtration) Cơ s c a phương pháp l c gel là d a vào s khác nhau nhau v kích thư c, hình d ng và phân t lư ng c a protein enzyme có trong h n h p tách chúng ra. m b o cho vi c tách protein enzyme ư c t t, ch t rây phân t ph i là ch t trơ, không ph n ng v i protein enzyme. Ch t này cũng không hòa tan và tương i b n v i các y u t v cơ h c cũng như sinh h c. Ngoài ra ch t ư c s d ng cho m c ích l c phân t ph i là ch t không có tính àn h i (không co) và ph i là ch t ưa nư c (hidrofil). Gel sephadex là ch t th a mãn các y u t trên. Sephadex là ch ph m dextran do các loài vi sinh v t khác nhau là Leuconostoc t o ra khi chúng ư c nuôi c y trên môi trư ng ch a saccharose. Tr ng lư ng phân t c a dextran có th t t i hàng tri u và l n hơn. Phân t dextran bao g m các chu i do các g c glucose t o thành các liên k t 1,6. Sephadex Nh n t dextran b ng cách x lý hóa h c (do tác d ng c a epichlohidrin) t o ra các lư i phân nhánh có liên k t ngang g i là "sàng phân t " và ch t này tr thành không tan trong nư c. S liên k t ngang t o ra càng nhi u, kích thư c c a l sàng phân t càng nh . Phương pháp l c phân t trên Sephadex ư c ti n hành như sau: cho sephadex vào c t th y tinh dài và cân b ng b ng dung d ch m có pH nh t nh. Sau ó cho dung d ch protein enzyme lên c t. Khi l c và chi t b ng dung môi thích h p, các phân t có tr ng lư ng phân t nh ( ây là các mu i) s khu ch tán ch m ch p qua các l nh c a các h t Sephadex b trương ph ng, còn ch t có tr ng lư ng phân t l n hơn ( trư ng h p này là protein enzyme) không có kh năng i vào mà lách nhanh qua các h t sephadex và s ư c chi t nhanh ra kh i c t (hình 5.2 và hình 5.3). Vì v y ta có th tách ư c ch t có tr ng lư ng phân t cao hơn thoát ra kh i c t gel trư c so v i ch t có phân t lư ng nh . Hãng Sephadex (Pharmacia) c a Th y i n ã tung ra th trư ng các lo i sephadex có kích thư c khác nhau có ký hi u t G10 n G200. S ký hi u ch ra m c nh n (hút) nư c c a chúng. Ví d G10 ch khi trương ph ng thì 1g gel khô nh n 1ml nư c (1ml/g)
Hình 5.2 Ho t ng c a l c phân t sephadex. Các sephadex có ký hi u khác nhau t G10 n G200 ph c v trong vi c l c phân t cho phép các ch t có tr ng lư ng phân t khác nhau l t vào các ngư ng khác nhau. Ngư i ta còn s d ng sephadex lo i mu i thay cho quá trình th m tích. Cùng nhóm ch t rây phân t có ngu n g c polisacharid, là ch ph m dextran như sephadex (pharmacia) còn có molselect (Reanal) - là s n ph m c a Hungary ư c ng d ng nhi u trong nghiên c u. Có th dùng làm cô c các ch t có tr ng lư ng phân t l n như protein, peptid, lo i mu i kh i protein enzyme (dùng nhanh hơn so v i th m tích), l c gel tách theo tr ng lư ng phân t (như protein huy t thanh) Hình 5.3 Tách các phân t theo kích thư c b ng s c ký l c gel. ho c tách các s n ph m protein ư c hình thành dư i tác d ng c a enzyme phân c t (như γ - G - globulin b c t b i papain). Ngoài nhóm ch t rây phân t là ch ph m dextran còn có nhóm ch t rây phân t là ch ph m gel acrilamid bao g m Biogel (Bio - Rad) và Acrilex (Reanal). Acrilex gel là lo i copolimer, s n ph m c a Hungary ư c t o ra t acrilamid và N, N' - metilen bisacrilamid. Các acrilex gel có ký hi u t P - 300 dùng tách các ch t có tr ng lư ng phân t trong ngư ng t 100 - n 300.000. Có th s d ng vùng pH t 2 - 11. Ch t th ba là agarose gel, ã lo i sulphate. Hay ph bi n là lo i sepharose (Pharmacia). Ngư i ta thư ng dùng ch t này tách các phân t có tr ng lư ng l n hơn 106. Tóm l i b ng phương pháp l c rây phân t ngư i ta th tách các ch t có tr ng
lư ng phân t khác nhau có trong h n h p (như polimer, polisaccharid, acid nucleic, protein). Ngư i ta có th dùng k thu t này lo i mu i thay cho quá trình th m tích. Và hơn th n a, trong quá trình tinh ch protein enzyme, chúng còn ư c s d ng cô c dung d ch protein enzyme. 4.2.4. Phương pháp s c ký trao i ion. Phương pháp s c ký trao i ion d a vào s khác nhau v i n tích t ng s c a các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này ư c d a trên cơ s c a ph n ng trao i ion gi a protein ư c tan trong nư c ho c dung d ch m loãng và các tác nhân trao i ion. Tác nhân (hay nguyên li u) trao i ion có th là ch t nh a có tích nhóm sinh ion ho c là ch t ionit. ây là nh ng ch t giá trơ, không tan trong nư c, có b n ch t là cellulose ho c ch t gel dextran có lư i phân nhánh (Sephadex, Molselect) ho c là ch t nh a polistirol. Ch t giá th này thư ng k t h p v i các nhóm ion hóa. Các ch t trao i ion có ch t giá là celluose, sephadex, molselect thông thư ng ư c dùng tách protein enzyme, còn các ch t trao i ion có ch t giá là polistirol (ví d như Dowex, Amberlite) ch dùng tách các peptid có tr ng lư ng phân t nh hơn. * Các ch t trao i ion có ch t giá cellulose - Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose)- là m t d n xu t este c a cellulose. Cellelose - O - CH2 - COOH Khi phân li cho ra COO-. ây là ch t trao i cation. Trên nh ng cationit, thì các protein ki m có th a nh ng nhóm amin và nh ng nhóm ki m khác ư c h p ph (liên k t ion). S h p ph trên các cationit ư c ti n hành v i nh ng dung d ch loãng pH 1,5 - 6,5. (Các protein ki m có ch a các acid amin diamino - mono carboxylic như lys, Arg, His) - Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là d n xu t este c a cellulose) Trong H2O nó ư c phân ly:
o:href="http://mail.google.com/mail/?name=dd3fcf75bc82a822.jpg&attid=0.3&dis p=vahi&vie w=att&th=11d94e949413c887" src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_ image009.jpg"> ây là ch t trao i anion, b n thân tích i n dương. Các anionit ư c áp d ng phân tích các protein acid có th a nh ng nhóm carboxyl t do. S h p ph protein trên nh ng ionit như v y ư c ti n hành v i nh ng dung d ch m có l c ion th p (0,005 - 0,1M) pH 7,5 - 8,5. (các protein acid có ch a các amino acid monoamin dicarboxylic như glu, Asp) Trong h n h p ch t ionit v i dung d ch m có pH tương ng, các ch t ionit ã nói trên tr nên tích i n. Vì v y trên b m t l p ch t giá s hình thành m t l p i n tích có d u ph thu c vào ki u nhóm ch c hóa h c c a nó. N u thêm protein enzyme vào dung d ch m thì các phân t protein enzyme mang i n tích s b các nhóm tích i n trái d u c a ch t trao i ion kéo l i. Khi dùng m t dung d ch m ph n h p ph có pH khác ho c khi thêm m t lo i ion khác có l c ion l n hơn thì phân t protein enzyme s b y ra kh i ch t trao i ion. Khi ti n hành ph n h p ph , thư ng ngư i ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có n ng tăng d n theo b c thang hay theo gradient. Các phân t protein enzyme nào có i n tích t ng s nh thì s b y ra trư c do l c liên k t v i ch t trao i ion y u. Còn nh ng protein enzyme nào có liên k t v i ionit l n hơn thì s b y ra b ng m t l c ion c a mu i l n hơn. Như v y, b ng cách này, chúng ta có th tách ư c t ng ph n các lo i protein enzyme. Vi c tách t ng ph n có l a ch n t t nh t là khi tăng d n n ng các ion thay th . Nh n ng ion c a mu i tăng d n (gradient) ngư i ta có th rút ra t c t các lo i protein enzyme khác nhau. Có th thu nh n d ch chi t enzyme protein sau khi qua c t b ng máy thu phân o n t ng. Theo th t t ng ph n d ch thu ư c, ngư i ta ti n hành nh lư ng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp o quang ph và xác nh o t ho t c a enzyme. * N u ch t giá là sephadex thì chúng ta có ch t trao i ion sephadex. ó là các lo i DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu i m c a lo i này là v a tách ư c protein enzyme v kích thư c và v i n tích t ng s c a các protein enzyme. Trư ng h p CM - sephadex trên ch t giá sephadex có g n nhóm COO-
COO-: mang i n tích âm → là ch t trao i cation 4.2.5. Phương pháp dùng ch t h p ph c hi u sinh h c hay là phương pháp s c ký ái l c (affinity Chromatography). Cơ s c a phương pháp này là ngư i ta g n nh ng phân t g n (ligand) vào ch t mang (ch t giá) r n b ng liên k t c ng hóa tr mà protein enzyme c n tách s tương tác c hi u v i nó. Nh ng ch t ó có th là cơ ch t (Substrate) ho c ch t c ch (inhibitor) c nh tranh. Trong trư ng h p hai ch t kháng nguyên và kháng th có ái l c liên k t c hi u v i nhau, ngư i ta thay th v trí ch t g n vào giá th gi a kháng nguyên và kháng th nghiên c u t ng lo i gi ng như cơ ch t, ch t c ch và enzyme c hi u c a chúng. Hay nói cách khác dùng ch t ch có kh năng liên k t c hi u v i m t enzyme ho c protein ta nghiên c u. Ch t mang th r n có th là b t kỳ m t lo i nào ph c v cho l c gel như sephadex, nhưng ngư i ta hay s d ng nh t là gel Sepharose trên c t giá th hay ch t mang ch a cơ ch t c nh pH và l c ion phù h p, ch có protein enzyme nào có kh năng chuy n hóa cơ ch t m i g n vào, các protein khác thì ch y xu ng c t. B ng cách thay i pH và l c ion phù h p ho c có th b ng cách thêm ch t c ch c nh tranh ã ư c hòa tan vào thì có th tách ư c protein enzyme kh i c t tr ng thái s ch. 4.2.6. K t tinh protein. ây là phương pháp c hi u t t nh t tách t ng ph n protein enzyme giai o n tinh ch cu i cùng. Khi protein enzyme ã ư c làm tinh khi t hoàn toàn, trong nh ng trư ng h p riêng bi t, ngư i ta có th ti n hành k t tinh chúng. M t i u c n chú ý là protein enzyme tr ng thái tinh th không th ư c coi là b ng ch ng v s tinh khi t. Các tinh th protein enzyme k t tinh l n u ôi khi có s ch không vư t quá 50% và có th ch a các protein enzyme khác. Ngư i ta thư ng ti n hành k t tinh protein enzyme trong dung d ch (NH4)2SO4. Quá trình k t tinh có th ti n hành t t kéo dài vài ngày th m chí hàng tu n n u mu n nh n ư c các tinh th t t. Thông thư ng là thêm mu i (NH4)2SO4 vào dung d ch protein enzyme khá m c cho n khi làm v n c nh nhàng dung d ch. Sau ó t dung d ch vào m t nơi, ng th i tăng r t t t n ng mu i trong dung d ch. Có
th ti n hành tăng n ng mu i theo nhi u cách, thêm dung d ch mu i m c hơn vào dung d ch protein enzyme theo t ng gi t, thêm mu i qua màng bán th m ho c có th cho bay hơi ch m ch p dung d ch protein enzyme. Trong quá trình k t tinh có th thay i ch s pH ho c nhi t . k t tinh protein enzyme ư c d dàng, nh ng giai o n trư c ó, ngư i ta thư ng tách t ng ph n các protein enzyme b ng các dung môi h u cơ. i u này có l liên quan n vi c các ch t cơ b n, ch t lipid b lo i ra kh i dung d ch protein enzyme t o i u ki n t t cho quá trình k t tinh. 4.2.7. Làm khô và b o qu n ch ph m protein. Tính c nh c u trúc c a protein ư c b o m nh kh năng liên k t nư c c a chúng. N u dung d ch protein enzyme b khô nhi t trong phòng thì a s protein enzyme b bi n tính. Protein enzyme ch có th ư c gi dang khô trong trư ng h p n u vi c s y khô ư c ti n hành vô cùng nhanh ho c nhi t th p. Nhi u protein như chúng ta ã bi t, nhi t th p có th ư c k t t a b ng rư u ho c acetone. N u k t t a thu ư c b ng cách ó em x lý b ng rư u tuy t ói, b ng acetone ho c b ng ether và sau ó làm khô th t nhanh thì protein s không b bi n tính. d ng khô, b t protein có th gi m t th i gian lâu, khi hòa tan nó trong nư c nó th hi n nh ng tính ch t ban u c a mình. Tuy nhiên, nhi u protein không ch u ư c cách x lý như v y. Vì v y, ngư i ta s d ng phương pháp làm ông khô là phương pháp làm khô protein th n tr ng nh t, phương pháp này có th s d ng ư c cho h u h t protein. Dung d ch protein ã ư c th m tích ư c làm óng băng và làm thăng hoa băng áp su t 0,01-0,001 mm thu ngân ( ư c t o ra nh máy hút chân không m nh). Nơi nư c ư c t o ra u ư c óng băng trong b u d tr nhi t th p hơn (- 70, -80oC). Sau m t vài gi ch còn l i b t protein. Sau ó b t này (trong chân không) có th ư c gi nhi t cao hơn. Protein ã ư c làm ông khô b ng cách như th khi hoà tan trong nư c c t s cho dung d ch protein (nguyên th ) ngay sau m t vài năm. Ngư i ta ã b o qu n huy t thanh máu b ng phương pháp như th , huy t thanh khô này có th ư c s d ng trong m c ích truy n máu. V. nh lư ng và ánh giá tinh s ch c a ch ph m protein 5.1. Các phương pháp xác nh hàm lư ng protein Protein sau khi ã ư c tách chi t và làm s ch có th nh lư ng ư c. N u protein nghiên c u là enzyme thì vi c nh lư ng thông qua xác nh ho t c a enzyme (theo quy ư c qu c t : 1 ơn v ho t enzyme là lư ng enzyme làm chuy n hoá 1µmol cơ ch t trong 1 phút các i u ki n tiêu chu n). Như v y c sau các bư c tách chi t và làm s ch protein ngư i ta th y t ng lư ng protein gi m nhưng ho t enzyme tăng nghĩa là ho t riêng tăng r t cao. Protein ư c coi là s ch n u nh ng bư c tách chi t và làm s ch sau không làm tăng ho t riêng c a chúng n a, và ch khi ó ta m i hoàn thành vi c tách chi t và làm s ch protein. N u
protein không ph i là enzyme thì ta có th nh lư ng chúng b ng các phương pháp khác. N u protein ta nghiên c u là hormon ho c các c t thì chúng ư c xác nh qua hi u ng sinh h c mà chúng gây ra; ví d như hormon sinh trư ng (growth hormone) s kích thích s sinh trư ng c a các t bào ích nuôi c y. N u là protein v n chuy n thì có th xác nh chúng thông qua n ng ch t mà chúng v n chuy n. Sau ây là m t s phương pháp thư ng ư c s d ng xác nh hàm lư ng protein. - nh lư ng nitrogen theo phương pháp kjeldahl: Ph n l n các phương pháp gián ti p xác nh protein u d a trên cơ s xác nh lư ng nitrogen. Lư ng nitrogen có trong các protein là g n gi ng nhau không ph thu c vào ch t lư ng và ngu n protein. ương nhiên trên cơ s lư ng nitrogen có th xác nh ch các protein ã ư c tinh s ch ho c lư ng protein c a các m u nghiên c u mà ngoài protein ra không ch a nh ng ch t ch a nitrogen khác. Trong nông nghi p và công nghi p th c ph m, protein thô ư c nh lư ng b ng cách xác nh lư ng nitrogen toàn ph n và k t qu nhân v i 6,25, nghĩa là coi protein luôn luôn ch a 16% nitrgen. Th c t , trong th c ph m, bên c nh protein còn có nh ng ch t h u cơ khác có ch a nitrogen như amid, alcaloid, ammonia (ví d như trong th c ph m lên men) acid nitric... do ó hàm lư ng nitrogen toàn ph n chính th c cao hơn 16% (16-17%) nhưng protein th c v t thì hàm lư ng này l i th p hơn 16%. H s 6,25 là h s trung bình thô. Trong m t vài trư ng h p, mu n có k t qu chính xác, nên dùng nh ng h s c bi t. Nguyên lý c a phương pháp này là vô cơ hoá m u b ng H2SO4 m c và ch t xúc tác. Dùng m t ki m m nh (NaOH ho c KOH) y NH3 t mu i (NH4)2SO4. Sau ó h ng NH3 vào dung d ch acid có n ng xác nh. Sau ó dùng ki m có n ng xác nh chu n acid dư. T ó tính ư c lư ng nitrogen có trong nguyên li u. - nh lư ng protein theo phương pháp Lowry: Phương pháp này d a trên cơ s dùng máy o màu xác nh màu s n ph m kh c a phosphomolipden - phosphowolframate (thu c th Folin - Ciocalteau) v i ph c h p ng - protein. Ph c màu xanh t o thành có th o bư c sóng 675nm. Cư ng màu c a h n h p ph n ng t l thu n v i n ng protein. D a vào th chu n protein (thông thư ng dùng tinh th albumin huy t thanh bò) ta có th tính ư c hàm lư ng protein trong m u nghiên c u. Phương pháp Lowry ư c dùng r ng rãi xác nh nhi u lo i protein khác nhau. Phương pháp này có nh y cao, cho phép phát hi n ư c protein trong dung d ch n ng 1µg/ml. Tuy nhiên cư ng màu còn tuỳ thu c nhi u vào lo i protein. Ví d , cùng m t n ng , dung d ch trypsin cho cư ng màu cao g p 3 l n gelatin, hemoglobin cho cư ng màu th p hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin.
Ngoài ra, nhi u ch t khác có th làm tăng hay gi m cư ng màu ph n ng, vì v y phương pháp này cho k t qu chính xác khi xác nh protein ã ư c tinh s ch. - nh lư ng protein b ng phương pháp quang ph : Phương pháp ơn gi n nh t o n ng protein trong dung d ch là h p th tia c c tím c a nó. N u protein tinh s ch thì n ng tuy t i c a nó ư c tính theo giá tr o ư c. N u protein không tinh s ch (ví d , d ch chi t t m t s c ký) thì n ng c a protein t ng ư c tính tương i t h p th . Nguyên t c c a phương pháp này là các protein h p th tia c c tím c c i bư c sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine. h p th 280nm thay i tuỳ lo i protein nhưng h s t t o ư c (nghĩa là h p th c a dung d ch protein 1% v i ư ng sóng truy n qua 1cm) cho m i protein cho phép tính n ng c a protein tinh s ch. V i m t h n h p các protein ho c v i b t c m t loai protein nào mà không bi t h s t t thì n ng protein ư c tính như sau: N ng protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260 Trong ó: A280: h p th bư c sóng 280nm A260: h p th bư c sóng 260nm Phương pháp này không dùng ư c cho các dung d ch có n ng protein th p hơn 0,1mg/ml ho c khi có m t nhi u ch t khác mà h p th cùng m t vùng c c tím (ví d , m, acid nucleic và m t s ch t béo), ho c khi protein trong d ch truy n phù ch không ph i trong dung d ch. (Ví d , trong màng ho c các ph c h p có tr ng lư ng phân t l n). Cũng c n chú ý là n u t l A280/A260 th p hơn 0,6 nghĩa là dung d ch protein chưa s ch, b l n các ch t khác, c bi t v i acid nucleic thì nên s d ng phương pháp Lowry o n ng protein. Vì v y, phương pháp o h p th tia c c tím thư ng ư c dùng nh lư ng protein ã tinh s ch ho c xác nh protein trong các phân o n nh n ư c khi s c ký tách các protein qua c t. 5.2. ánh giá tính ng th c a protein: Khi ã nh n ư c m t protein enzyme tr ng thái k t tinh, ngư i ta ph i th l i mc tinh khi t hay tính ng th c a nó. ng th c a ch ph m protein enzyme ph i ư c ki m tra b ng m t s phương pháp d a trên nh ng nguyên lý khác nhau. Trong m t s trư ng h p protein enzyme ư c coi là ng th khi ly tâm, nhưng l i có th phân chia thành m t s isoenzyme b ng phương pháp i n di trên gel. Chính vì v y, n u dùng nhi u lo i phương pháp khác nhau ki m tra s ch c a protein mà k t qu u cho là ng th thì protein ó có th ư c công nh n là tinh khi t. Nh ng phương pháp ki m tra tính ng th hay dùng là xây d ng th v hoà tan, i n di và siêu ly tâm. - Phương pháp ki m tra tính ng th (ho c còn g i là tính ng nh t) c a protein
ơn gi n và nh y nh t là xây d ng ư ng bi u di n v hoà tan. Cách làm như sau: Trong hàng lo t m u dùng m t th tích không i m t lo i dung môi (nư c ho c dung d ch mu i) l c v i nh ng s lư ng enzyme khác nhau. Sau ó l c và xác nh s protein trong d ch l c. Cu i cùng xây d ng ư ng th . Trong nh ng lo i m u u, t t c các protein thêm vào b hoà tan và s lư ng protein thêm vào b ng s lư ng protein có trong d ch l c hay d ch ly tâm. K t qu nh n ư c bi u di n là m t ư ng th ng. Sau ó dung d ch t ư c bão hoà. N u protein em hoà tan là tinh khi t nghĩa là ng nh t thì khi thêm protein trong d ch l c s không tăng lên và ư ng bi u di n có m t i m u n. N u trong m u có m t protein th hai thì sau khi t ư c bão hoà i v i protein ít hoà tan hơn, lo i protein th hai còn có th hoà tan ư c n a. K t qu là có m t i m bão hoà th hai và ư ng bi u di n có hai i m u n. N u d ch chi t (h n h p) có nhi u protein enzyme thì s có nhi u i m u n. Phương pháp này ư c Northrop và Kunitz s d ng r t có k t qu . Nay v n còn ng d ng nhi u. - Phương pháp th hai xác nh ng th c a protein enzyme là phương pháp i n di. Phương pháp i n di là ng d ng tính ch t lư ng tính c a protein, d a trên cơ s d ch chuy n c a các ti u ph n ch ph m protein enzyme mang i n trong i n trư ng. em ch ph m protein enzyme i n di pH và l c ion nh t nh. N u trên i n di có m t băng protein thì ch ng t protein enzyme ó là ơn th . N u có hai băng ch ng t có hai protein enzyme trong ch ph m ó. B n i n di này ư c ua vào máy detector phát hi n không ch n ng c a băng i n di mà còn phát hi n ư c s lư ng các băng v t. Hình 5.4: ư ng bi u di n hoà tan protein - Phương pháp siêu ly tâm: ây cũng là phương pháp r t quan tr ng xác nh tính ng th c a protein enzyme. Phương pháp ư c th c hi n như sau: Dùng l c ly tâm r t l n b ng cách tăng s vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng v n vòng trong m t phút. V i t c ly tâm r t l n, ngư i ta có th tách ra ư c các phân t enzyme có tr ng lư ng phân t khác nhau. T c k t t a c a protein enzyme trong máy siêu ly tâm ư c xác nh b ng tr ng lư ng phân t c a nó. Khi d ng quay thì các phân t protein l i khuy ch tán vào
dung d ch. B i v y, c n ph i quan sát t c l ng trong quá trình siêu ly tâm. Chính vì v y, trong c c siêu ly tâm, ngư i ta g n m t thi t b quang h c c bi t, v các ư ng ánh sáng c a k t qu phân tích lên m t màn. N u trong dung d ch có m t loai protein enzyme (có m t tr ng lư ng phân t ) thì trên màn sáng s cho ư ng th có m t nh. N u làm vi c v i hai protein enzyme thì s có hai nh v.v... TÀI LI U THAM KH O 1. Nguy n H u Ch n, Nguy n Th Hà, Nguy n Nghiêm Lu t, Hoàng Bích Ng c, Vũ Th Phương. 2001. Hoá sinh. Nxb Y h c - Hà N i. 2. Ph m Th Trân Châu, Tr n Th Áng. 1999. Hoá sinh h c.Nxb Giáo d c - Hà N i. 3. Nguy n Ti n Th ng, Nguy n ình Huyên. 1998. Giáo trình sinh hoá hi n i. Nxb Giáo d c - Hà N i. 4. Lê Ng c Tú, Lê Văn Ch , ng Th Thu, Ph m Qu c Thăng, Nguy n Th Th nh, Bùi c H i, Lưu Du n, Lê Doãn Diên. 2002. Hoá sinh công nghi p. Nxb Khoa h c & K thu t - Hà N i. 5. Ajtai K., Szilagyi L..1985. Biokémiai gyakorlatok.Tankonyv. Jankonyv Kiado, Budapest. 6. Kerese I. 1984 Methods of Protein analysis. Akademiai Kiado, Budapest 7. Lehninger A.L. 2004. Principles of Biochemistry, 4th Edition. W.H Freeman, 2004 8. Stryer l., 1981. Biochmistry. W. H. Freeman and company, San francisco. VI. Các quá trình tách chi t và tinh s ch protein Qua nhi u năm, vi c gia tăng s d ng vi sinh v t như là m t ngu n cung c p protein, c bi t là các enzyme, ã c i thi n áng k hi u qu s n xu t và s n ph m ư c t o ra nhi u hơn. Ph n l n enzyme s d ng trong công nghi p là các protein ngo i bào t các cơ th như Aspergillus sp. và Bacillus sp., bao g m: α- amylase, β-glucanase, cellulase, dextranase, protease và glucoamylase. Nhi u lo i trong s này v n còn ư c s n xu t t các ch ng g c t nhiên c a vi sinh v t. Tuy nhiên, trong s n xu t protein s d ng các lĩnh v c ch n oán lâm sàng và cho các ng d ng tr li u, công ngh protein và công ngh DNA tái t h p ã th hi n m t vai trò ngày càng quan tr ng. Công ngh DNA tái t h p, ngoài vi c cho phép c i thi n hi u su t cao, nó cũng cho phép chuy n các v t li u di truy n t ng v t vào vi khu n v t ch . Theo phương th c này, các protein v n ch có m t lư ng nh t mô ng v t bây gi có th ư c s n xu t trong m t lư ng g n như vô h n t các vi khu n sinh trư ng d dàng. M t ví d i n hình là hormone sinh trư ng ngư i, ch t này ư c s n xu t m i l n v i m t lư ng r t nh t tuy n yên c a ngư i cho n khi nó ư c th a nh n hi n di n m t r i ro ti m tàng i v i b nh nhân t s nhi m b n prion là y u t ư c ám ch trong h i ch ng Creutzfeld- Jacob. Hormone sinh trư ng ngư i bây gi ư c s n xu t v i m t lư ng l n hơn
r t nhi u t vi khu nE. coli và nó hoàn toàn s ch không b nhi m prion không mong mu n. Các protein ho c enzyme ư c s n xu t b ng vi sinh v t có th n i bào, khoang gian bào ho c ti t vào môi trư ng nuôi c y. i v i các enzyme ngo i bào, mc tinh s ch c n thi t thư ng là t i thi u, khi s n ph m cu i cùng ư c dùng trong công nghi p và không c n tinh s ch cao. Các quá trình quy mô l n như th có th cho s n lư ng protein lên n hàng t n. Nhi u lo i protein khác ư c s n xu t trong các h n h p n i bào ph c t p ã gây ra nhi u khó khăn trong quá trình tinh s ch chúng. Nh ng protein òi h i ph i tinh s ch này thư ng ư c s n xu t s d ng trong i u tr , do ó ph i c g ng hư ng t i các tiêu chu n tinh s ch r t cao, và có ư c i u này ngư i ta c n ph i phát tri n các quy trình tinh s ch ph c t p. M t l n n a, công ngh DNA tái t h p ã có óng góp hi u qu trong lĩnh v c này. Trong trư ng h p các protein tr li u, thư ng có nh ng thu n l i n u protein quan tâm có th ư c ti t ho c vào kho ng gian bào ho c vào trong môi trư ng. i u này giúp gi m r t l n nhi m b n c a protein và các i phân t khác, s n ph m tinh s ch như th thư ng thu ư c ch trong hai ho c ba bư c tinh s ch. Ch n l a h th ng bi u hi n thích h p có th cho hi u qu cao hơn trong h lên men, có liên quan t i vi c c i thi n ho t tính c bi t c a nguyên li u kh i u. Cũng có kh năng b sung các nhóm ch c vào protein giúp cho s tinh s ch, t o ra cho nó các tính ch t c bi t và sau ó lo i b các nhóm ch c này khi chúng không ư c yêu c u lâu hơn. Trong thi t k quy trình tinh s ch quy mô l n thì s lư ng các bư c, và s thu h i s n ph m m i bư c ã nh hư ng quan tr ng lên s n lư ng toàn ph n. S thu h i c trưng c a m t bư c s c ký là trong kho ng 80% và 90%, vì s tinh s ch ph c t p òi h i nhi u bư c do ó s n lư ng toàn ph n nhi u khi ch b ng 10% c a nguyên li u kh i u. i u này không thành v n trư ng h p tinh s ch quy mô phòng thí nghi m, nhưng n u tinh s ch quy mô l n thì ó là v n r t quan tr ng c n quan tâm t i ưu toàn b quá trình t h th ng bi u hi n ho c s lên men n bư c tinh s ch cu i cùng, gi m thi u s bư c tinh s ch c n thi t. 1. Thu h i protein S thu h i và tinh s ch các protein và enzyme cũng quan tr ng như các giai o n lên men xét theo góc kinh t c a quá trình s n xu t. Thách th c chính trong các bư c thu h i là gi m thi u s m t ho t tính c a protein. Trong ph n này s trình bày các bư c thu h i và tinh s ch truy n th ng cho protein. 1.1. Thu h i các protein ngo i bào Các protein ngo i bào tương i d thu h i và tinh s ch. T bào và n ng ca dung d ch ho t ng ư c lo i b m t cách ơn gi n, và có th cung c p tr c ti p protein thô thích h p cho m t s ng d ng.
Dung d ch protein tương i s ch có th thu ư c b ng cách cho các nuôi c y sinh trư ng trên môi trư ng ơn gi n có thành ph n xác nh. Các bư c thu h i và tinh s ch gi ng như các bư c ã dùng cho protein n i bào sau khi phá v t bào. 1.2. Thu h i các protein n i bào tách chi t các protein n i bào t các ngu n ng-th c v t, mô ph i ư c phá v gi i phóng chúng. 1.2.1. Phá v t bào a. Nguyên lý chung Làm khô mô là phương pháp thu n l i n nh và phá v t bào ng-th c v t. Phương pháp ông khô không thích h p phá v mô nhưng tránh ư c s t gãy protein, m c dù nó vô cùng t trong s n xu t quy mô l n. Mô có th ư c làm khô trong i u ki n chân không ho c trong không khí, ho c k t t a b ng dung môi tr n v i nư c. Sau ó, thu d ch chi t enzyme t các nguyên li u khô b ng cách hydrate hóa tr l i nguyên li u trong m t dung d ch m thích h p. Phương pháp ông l nh ơn gi n cũng có tác d ng phá v m t ít mô, m c dù ây là phương pháp không thích h p cho vi c tăng quy mô s n xu t. M t s nguyên li u ng-th c v t c n có quá trình ng hóa trư c ó, sao cho mô ư c phá thành nh ng m nh nh và tr n l n v i nhau, sau ó s d ng phương pháp cơ h c phá v t bào. M t khi protein ư c hòa tan, các v t bào ch t ư c lo i b d dàng b ng phương pháp l c. Ly tâm t c th p cũng có th ư c s d ng. m t s mô có s hi n di n c a ch t béo, vi c lo i b l p ch t béo b ng ly tâm g p nhi u khó khăn. Các ch t béo ch ư c lo i b d dàng b ng tách chi t dung môi; k t t a acetone là phương th c thích h p tách protein ra kh i các nguyên li u lipid. M t phương th c khác là các dung môi tr n nư c như hexane, cũng có th ư c s d ng. Phá v các t bào vi sinh v t thư ng g p nhi u khó khăn hơn các t bào ng th c v t. Các t bào vi sinh v t thư ng dai hơn và có kích thư c nh (kho ng 0,2-10 µ m) nên ph i có phương pháp phá v c bi t. Nhi u enzyme t n m men và các vi khu n Gram âm có th ư c chi t b ng cách dùng các dung môi không tr n nư c, như toluen ho c chloroform, có th phá v màng t bào và gi i phóng enzyme. Các dung môi hòa tan nư c, như ethanol và 2-propanol, ư c dùng tách chi t enzyme t kho ng gian bào, nhưng s d ng các dung môi này òi h i mc an toàn cao trong s n xu t quy mô l n. Các ch t t y thích h p có th ư c dùng tách chi t các phân t enzyme nh (kh i lư ng phân t dư i 70.000 Da). Trong m t s trư ng h p enzyme n nh giá tr pH cao, có th s d ng dung d ch ki m phân gi i các t bào vi khu n. Thành t bào vi khu n ư c phân gi i b ng lysozyme, tuy nhiên giá thành c a enzyme này là r t cao. Tương t , n m men