Bài giảng Vi sinh môi trường - Trương Thị Thu Hương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Trương Thị Thu Hương, Nguyễn Hoàng Mỹ, Lê Hồng Thía,

Nguyễn Thị Hàng, Nguyễn Khánh Hoàng

BÀI GIẢNG

VI SINH MÔI TRƯỜNG

Trình độ: Đại học

Ngành: Kỹ thuật môi trường, Quản lý môi trường

Tài nguyên môi trường, Khoa học môi trường

Môn: Vi sinh môi trường

Thời lượng lý thuyết: 45 tiết

Thực hành: 60 tiết

TP. HỒ CHÍ MINH – 2016

LƯU HÀNH NỘI BỘ

i

Lời nói đầu

Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong thiên nhiên cũng như trong cuộc sống của con người. Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong quá trình tham gia vào tất cả các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn của các hệ sinh thái. Vi sinh vật còn đóng vai trò quyết định trong quá trình tự làm sạch môi trường tự nhiên.

Trong thiên nhiên ngoài những nhóm vi sinh vật có ích như trên, còn có những nhóm vi sinh vật gây hại. Ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho người, động vật và thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm các nguồn nước, đất và không khí. Sinh viên cần nắm vững cơ sở khoa học của tất cả các quá trình có lợi hay có hại của vi sinh vật từ đó đưa ra những biện pháp khoa học để phát huy những mặt có lợi và hạn chế những mặt gây hại của vi sinh vật, đặc biệt là trong bảo vệ môi trường.

Tập bài giảng “Vi sinh môi trường” thể hiện đầy đủ những kiến thức bổ ích và những thông tin thiết thực phù hợp với đề cương chi tiết môn học giúp sinh viên nắm bắt những nội dung môn học. Chúng tôi xin chân thành cám ơn sự cộng tác của các thành viên tham gia hoàn thiện tập bài giảng.

Nhóm tác giả

ii

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ, HÌNH .............................................................................................. XI

PHẦN A. LÝ THUYẾT .................................................................................................................................. 1

Chương 1: Hình thái, cấu tạo của Vi sinh vật .............................................................................................................. 1 1.1. Lịch sử phát triển của vi sinh vật học .............................................................................................................................. 1

1.2 Đặc điểm chung của vi sinh vật trong sinh giới ............................................................................................................... 5

1.2.1 Đặc điểm chung của vi sinh vật .................................................................................................................................... 5

1.3 Vi sinh vật nhân sơ - PROKARYOTE ............................................................................................................................. 8

1.3.1 Định nghĩa .................................................................................................................................................................... 8

1.3.2. Vi khuẩn ....................................................................................................................................................................... 8

1.3.2.1 Định nghĩa và vai trò của vi khuẩn ............................................................................................................................ 8

1.3.2.2 Đặc điểm sinh sản ...................................................................................................................................................... 9

1.3.2.3 Đặc điểm trao đổi chất ............................................................................................................................................. 10

1.3.2.4 Khả năng di động ..................................................................................................................................................... 11

1.3.2.5 Phân loại hình thái ................................................................................................................................................... 12

1.3.2.6 Cấu tạo tế bào vi khuẩn ........................................................................................................................................... 16

1.3.3. Hình thái, cấu tạo tế bào của Xạ khuẩn ..................................................................................................................... 27

1.3.3.1 Định nghĩa và vai trò của Xạ khuẩn......................................................................................................................... 27

1.3.3.2 Cấu tạo của xạ khuẩn ............................................................................................................................................... 27

1.3.4 Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn lam ........................................................................................................................... 29

1.3.4.1 Định nghĩa và vai trò của vi khuẩn lam ................................................................................................................... 29

1.3.4.2 Đặc điểm cấu tạo ..................................................................................................................................................... 29

1.4. Vi sinh vật nhân thật- EUKARYOTE ........................................................................................................................... 31

1.4.1 Định nghĩa .................................................................................................................................................................. 31

1.4.2. Hình thái, cấu tạo tế bào của Nấm men ..................................................................................................................... 32

1.4.2.1 Định nghĩa và vai trò của nấm men ......................................................................................................................... 32

1.4.2.1 Đặc điểm cấu tạo ..................................................................................................................................................... 32

1.4.2.2 Phân loại nấm men................................................................................................................................................... 38

1.4.2.3 Đặc điểm sinh sản .................................................................................................................................................... 39

1.4.3. Hình thái, cấu tạo tế bào của Nấm mốc ..................................................................................................................... 40

1.4.3.1 Đặc điểm hình thái của nấm mốc ............................................................................................................................. 40

1.4.3.2 Cấu tạo của nấm mốc ............................................................................................................................................... 41

1.4.4. Hình thái, cấu tạo tế bào của Tảo và Động vật nguyên sinh ..................................................................................... 46

1.4.4.1 Tảo ........................................................................................................................................................................... 46

iii

1.4.4.2 Động vật nguyên sinh ............................................................................................................................................... 49

1.5. Hình thái, cấu tạo của Virus .......................................................................................................................................... 52

1.5.1 Lịch sử nghiên cứu virus ............................................................................................................................................. 52

1.5.2 Cấu tạo của virus ........................................................................................................................................................ 53

1.5.2.1 Vỏ capsid .................................................................................................................................................................. 53

1.5.2.2 Vỏ ngoài ................................................................................................................................................................... 55

1.5.2.3 Lõi acid nucleic (genome) ........................................................................................................................................ 55

Chương 2: Các quá trình sinh lý của Vi sinh vật ....................................................................................................... 57 2.1. Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật .................................................................................................................... 57

2.1.1 Nước ............................................................................................................................................................................ 58

2.1.2 Vật chất khô ................................................................................................................................................................ 59

2.1.2.1 Muối khoáng ............................................................................................................................................................ 59

2.1.2.2 Chất hữu cơ .............................................................................................................................................................. 59

2.2. Qúa trình dinh dưỡng của vi sinh vật ............................................................................................................................ 63

2.2.1. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật .......................................................................................................................... 63

2.2.2. Cơ chế hấp thụ chất dinh dưỡng của vi sinh vật ........................................................................................................ 65

2.2.2.1 Vận chuyển thụ động ................................................................................................................................................ 65

2.2.2.2 Vận chuyển chủ động ............................................................................................................................................... 67

2.3. Qúa trình trao đổi chất và năng lượng ........................................................................................................................... 67

2.3.1 Khái niệm .................................................................................................................................................................... 67

2.3.2 Quá trình trao đổi năng lượng .................................................................................................................................... 69

2.3.2.1 Quá trình đường phân .............................................................................................................................................. 70

2.3.2.2 Quá trình hô hấp hiếu khí ........................................................................................................................................ 72

2.3.2.3 Hô hấp yếm khí - quá trình lên men ......................................................................................................................... 74

2.4. Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật .................................................................................................................. 76

2.4.1. Lý thuyết về sự phát triển của vi sinh vật ................................................................................................................... 76

2.4.1.1 Khái niệm cơ bản ..................................................................................................................................................... 76

2.4.1.2 Sinh trưởng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy tĩnh............................................................................................... 76

2.4.1.3 Hiện tượng sinh trưởng kép ..................................................................................................................................... 78

2.4.1.4 Tăng trưởng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy liên tục ........................................................................................ 79

2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật ........................................................................ 80

2.4.2.1 Các tác nhân vật lý ................................................................................................................................................... 80

2.4.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố hóa học .......................................................................................................................... 83

2.4.2.3 Ảnh hưởng của yếu tố sinh học – kháng sinh ........................................................................................................... 85

Chương 3. Phân giải, chuyển hóa vật chất và các chu trình sinh địa hóa ................................................................. 88 3.1.1. Vi sinh vật phân giải các hợp chất hữu cơ chứa C .................................................................................................... 88

iv

3.1.2. Chu trình C ................................................................................................................................................................ 91

3.2. Chu trình N ................................................................................................................................................................... 92

3.2.1. Vi sinh vật chuyển hóa các dạng hợp chất chứa N .................................................................................................... 92

3.2.1. Chu trình N ................................................................................................................................................................ 92

3.3. Chu trình P .................................................................................................................................................................... 96

3.3.1. Vi sinh vật phân giải các hợp chất P hữu cơ và P vô cơ ............................................................................................ 96

3.3.2. Chu trình P ................................................................................................................................................................. 97

3.4. Chu trình S .................................................................................................................................................................... 98

3.4.1. Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất chứa S ..................................................................................................................... 98

3.4.2. Chu trình S ................................................................................................................................................................. 99

Chương 4. Vi sinh vật trong môi trường nước, đất và khí ....................................................................................... 101 4.1. Hệ vi sinh vật trong môi trường .................................................................................................................................. 101

4.1.1. Vi sinh vật trong môi trường nước ........................................................................................................................... 101

4.1.1.1. Vi sinh vật trong nước ngọt bề mặt trong đất liền ................................................................................................. 102

4.1.1.2. Vi sinh vật trong nước biển ................................................................................................................................... 106

4.1.1.3. Vi sinh vật trong nước thải .................................................................................................................................... 111

4.1.2. Hệ vi sinh vật trong môi trường đất ......................................................................................................................... 113

4.1.3. Hệ vi sinh vật trong môi trường khí ......................................................................................................................... 115

4.2. Vi sinh vật có lợi trong môi trường ............................................................................................................................. 116

4.2.1.Vi sinh vật có lợi trong môi trường đất ..................................................................................................................... 116

4.2.2. Vi sinh vật có lợi trong môi trường nước ................................................................................................................. 118

4.2.3. Ứng dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường ........................................................................................................... 120

4.2.4. Vi sinh vật chỉ thị môi trường nước .......................................................................................................................... 122

4.3. Vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nước .............................................................................................................. 126

4.3.1. Vi khuẩn gây bệnh .................................................................................................................................................... 126

4.3.2. Virus gây bệnh ......................................................................................................................................................... 127

4.3.3. Ký sinh trùng gây bệnh ............................................................................................................................................ 128

Chương 5. Công nghệ Vi sinh vật trong xử lý nước thải .......................................................................................... 130 5.1. Phân loại và thành phần nước thải .............................................................................................................................. 130

5.2. Cơ sở sinh học trong xử lý nước thải .......................................................................................................................... 139

5.2.1. Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học ........................................................................................................... 139

5.2.1.1. Quá trình phân hủy hiếu khí .................................................................................................................................. 142

5.2.1.2. Quá trình phân hủy kỵ khí ..................................................................................................................................... 144

5.2.2. Vai trò của vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước thải ...................................................................................... 149

5.2.2.1. Hệ vi sinh vật trong nước thải ............................................................................................................................... 149

5.2.2.2. Hoạt động sống của vi sinh vật trong nước thải ................................................................................................... 151

v

5.3. Các phương pháp sinh học xử lý nước thải ................................................................................................................. 153

5.3.1. Xử lý nước thải bằng bể hiếu khí (Aerotank) ........................................................................................................... 153

5.3.1.1. Đặc điểm và nguyên tắc hoạt động ....................................................................................................................... 153

5.3.1.2. Quá trình hình thành bùn hoạt tính ....................................................................................................................... 154

5.3.1.3. Các nhóm vi sinh vật có trong bùn hoạt tính......................................................................................................... 156

5.3.1.4. Một số cải tiến của quá trình bùn hoạt tính .......................................................................................................... 157

5.3.2. Xử lý nước thải bằng màng lọc sinh học .................................................................................................................. 158

5.3.3. Xử lý nước thải bằng hồ sinh học ............................................................................................................................. 160

5.3.3.1. Hồ tùy tiện ............................................................................................................................................................. 160

5.3.3.2. Các loại hồ sinh học khác ..................................................................................................................................... 161

5.3.4. Xử lý nước thải bằng phương pháp lên men kỵ khí .................................................................................................. 162

5.3.4.1. Quá trình sinh học kỵ khí ...................................................................................................................................... 163

5.3.4.2. Các yếu tố kiểm soát quá trình kỵ khí ................................................................................................................... 164

5.3.4.3. Một số phương pháp xử lý kỵ khí nước thải .......................................................................................................... 164

Chương 6. Công nghệ Vi sinh vật trong xử lý rác thải ............................................................................................. 167 6.1. Phân loại và thành phần rác thải.................................................................................................................................. 167

6.2. Vi sinh vật tham gia xử lý rác thải .............................................................................................................................. 169

6.3. Các phương pháp sinh học xử lý rác thải .................................................................................................................... 171

6.3.1. Các phương pháp xử lý kỵ khí rác thải .................................................................................................................... 171

6.3.1.1. Phương pháp ủ rác làm phân compost .................................................................................................................. 171

6.3.1.2. Phương pháp chôn lấp .......................................................................................................................................... 174

6.3.2. Các phương pháp xử lý hiếu khí rác thải ................................................................................................................. 178

6.3.2.1. Phương pháp ủ hiếu khí ........................................................................................................................................ 179

6.3.2.2. Phương pháp ủ rác không đảo trộn ...................................................................................................................... 179

Chương 7. TINH SẠCH MÔI TRƯỜNG KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC VÀ THU NHẬN KHÍ SINH HỌC .......................................................................................................................................................................... 180 7.1. Đặc trưng của khí thải ................................................................................................................................................. 181

7.2. Nguyên lý của quá trình tinh sạch khí thải .................................................................................................................. 183

7.2.1. Hấp thụ khí ............................................................................................................................................................... 183

7.2.2. Hấp phụ khí .............................................................................................................................................................. 183

7.2.3. Đốt cháy khí thải ...................................................................................................................................................... 184

7.2.4. Sử dụng thực vật xử lý khí thải ................................................................................................................................. 184

7.2.5. Sử dụng vi sinh vật xử lý khí thải ............................................................................................................................. 184

7.2.6. Phương pháp khác ................................................................................................................................................... 185

7.3. Một số phương pháp tinh sạch khí thải ....................................................................................................................... 186

7.3.1. Phương pháp lọc sinh học ........................................................................................................................................ 186

vi

7.3.2. Phương pháp khử H2S trong môi trường nhờ Vi sinh vật ........................................................................................ 188

7.4. Phương pháp thu nhận khí sinh học ............................................................................................................................ 190

PHẦN B: THỰC HÀNH ........................................................................................................................... 192

CHƯƠNG 1: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH. ............................ 192

BÀI 1: KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG. ................................................................................................... 192 1.1. Mục đích thí nghiệm ................................................................................................................................................... 192

1.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa ...................................................................................................................................... 193

1.3. Các bước tiến hành chuẩn bị môi trường. ................................................................................................................... 196

1.4. Câu hỏi ....................................................................................................................................................................... 204

BÀI 2: KỸ THUẬT PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN ĐĨA PETRI VÀ PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG KẾT HỢP VỚI ĐỔ ĐĨA. ........................................................................................................................... 205 2.1. Mục đích thí nghiệm ................................................................................................................................................... 205

2.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 207

3.3. Tiến hành thí nghiệm .................................................................................................................................................. 208

2.3.1. Kỹ thuật phân lập bằng phương pháp cấy trên đĩa petri. .......................................................................................... 208

2.3.2. Một số cách cấy phân lập. ........................................................................................................................................ 212

2.3.3. Kỹ thuật phân lập bằng phương pháp pha loãng kết hợp với đỗ đĩa. ....................................................................... 215

2.4. Câu hỏi ........................................................................................................................................................................ 218

CHƯƠNG 2: CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA ........................................................................................................... 219

BÀI 3: THỬ NGHIỆM SINH HÓA TSI (TRIPLE SUGAR IRON AGAR TEST). ................................................ 219 3.1. Mục đích thí nghiệm. .................................................................................................................................................. 219

3.2. Chuẩn bị thí nghiệm. ................................................................................................................................................... 219

3.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 219

3.4. Tiến hành thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 225

3.5. Câu hỏi ........................................................................................................................................................................ 226

BÀI 4: THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI TINH BỘT. .............................................................................. 227 4.1. Mục đích. .................................................................................................................................................................... 227

4.2. Chuẩn bị của sinh viên. ............................................................................................................................................... 227

4.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 227

4.4. Cách tiến hành. ............................................................................................................................................................ 228

4.5. Những điều cần lưu ý. ................................................................................................................................................. 229

4.6. Câu hỏi ........................................................................................................................................................................ 229

BÀI 5: THỬ NGHIỆM CÁC PHẢN ỨNG IMVIC .................................................................................................. 230

vii

5.1. Mục đích thí nghệm. .................................................................................................................................................. 230

5.2. Chuẩn bị của sinh viên. ............................................................................................................................................... 230

5.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 230

5.4.Cách tiến hành. ............................................................................................................................................................. 233

5.5. Câu hỏi ........................................................................................................................................................................ 235

BÀI 6: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME CATALASE ............................................................................. 236 6.1. Mục tiêu bài học. ......................................................................................................................................................... 236

6.2. Chuẩn bị của sinh viên. ............................................................................................................................................... 236

6.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 236

6.4. Tiến hành thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 237

6.6. Câu hỏi ........................................................................................................................................................................ 238

CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG ĐẤT. ............................................................................................................ 239

Bài 7: XÁC ĐỊNH VÒNG ĐỜI CỦA VI SINH VẬT CÁC PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG VÀ ĐỔ ĐĨA. ........... 239 7.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................... 239

7.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 239

7.3. Tiến hành thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 240

7.4. Những kinh nghiệm cần nắm bắt. ............................................................................................................................... 243

7.5. Thí dụ và tính toán. ..................................................................................................................................................... 244

7.6. Câu hỏi. ....................................................................................................................................................................... 244

Bài 8: NẤM SỢI ........................................................................................................................................................ 246 8.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................... 246

8.2. Cở sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 246

8.3. Tiến hành thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 248

8.4. Kỹ năng. ...................................................................................................................................................................... 250

8.5. Tính toán. .................................................................................................................................................................... 251

8.6. Câu hỏi. ....................................................................................................................................................................... 253

BÀI 9: QUAN SÁT VI SINH VẬT CÓ TRONG ĐẤT QUA KÍNH HIỂN VI......................................................... 254 9.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................... 254

9.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa........................................................................................................................................... 254

9.3. Tiến hành thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 255

9.4. Câu hỏi. ....................................................................................................................................................................... 258

Bài 10: VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN ....................................................................................................................... 259 10.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 259

10.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa. ........................................................................................................................................ 259

viii

10.3. Tiến hành thí nghiệm. ............................................................................................................................................... 263

10.4. Kỹ năng ..................................................................................................................................................................... 266

10.5. Câu hỏi. ..................................................................................................................................................................... 267

Bài 11: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẢO: BẢNG LIỆT KÊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN. .................................... 268 11.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 268

11.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa. ........................................................................................................................................ 268

11.3. Tiến hành thí nghiệm. ............................................................................................................................................... 269

11.4. Tính toán. .................................................................................................................................................................. 270

11.5. Câu hỏi. ..................................................................................................................................................................... 273

CHƯƠNG 4: VI SINH VẬT TRONG NƯỚC. ......................................................................................................... 275

BÀI 12: XÁC ĐỊNH SỐ COLIFORM TRONG NƯỚC BẰNG THỬ NGHIỆM MPN. ......................................... 275 12.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 275

12.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa. ........................................................................................................................................ 275

12.3. Tiến hành thí nghiệm. ............................................................................................................................................... 276

12.4. Câu hỏi. ..................................................................................................................................................................... 279

Bài 13: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC. ..................................................... 280 13.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 280

13.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa. ........................................................................................................................................ 280

13.3. Tiến hành thí nghiệm. ............................................................................................................................................... 280

13.4. Tính toán. .................................................................................................................................................................. 281

13.5. Câu hỏi. ..................................................................................................................................................................... 281

CHƯƠNG 5: SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHẤT CỦA VI SINH VẬT. ............................................................................. 282

BÀI 14: SỰ OXI HÓA CÁC HỢP CHẤT SUNFUR CÓ TRONG ĐẤT. ................................................................ 282 14.1. Mục tiêu thí nghiệm. ................................................................................................................................................. 282

14.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa. ........................................................................................................................................ 282

14.3. Tiến hành thí nghiệm. ............................................................................................................................................... 284

14.4. Tính toán. .................................................................................................................................................................. 286

14.5. Câu hỏi. ..................................................................................................................................................................... 286

BÀI 15: NITRITE HÓA VÀ SỰ KHỬ NITRITE HÓA. .......................................................................................... 287 15.1. Mục tiêu và nhiệm vụ. ............................................................................................................................................... 287

15.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa. ........................................................................................................................................ 287

15.3. Tiến hành thí nghiệm. ............................................................................................................................................... 288

15.4. Những điều cần lưu ý. ............................................................................................................................................... 289

15.5. Câu hỏi. ..................................................................................................................................................................... 289

ix

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................ 291

x

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ, HÌNH

BẢNG 1. 1 THÀNH PHẦN CẤU TẠO THÀNH TẾ BÀO VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG ........................................................................................................ 17 BẢNG 1. 2 SO SÁNH CẤU TẠO KHUẨN LAM VỚI VI KHUẨN ....................................................................................................................................................... 29 BẢNG 1. 3 THÀNH PHẦN CẤU TẠO VÁCH TẾ BÀO MỘT SỐ LOẠI NẤM MỐC ................................................................................................................................ 42

BẢNG 2. 1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TẾ BÀO VI SINH VẬT .................................................................................................................................................. 57 BẢNG 2. 2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA MỘT TẾ BÀO VI KHUẨN ............................................................................................................................................. 59 BẢNG 2. 3 PHÂN LOẠI ENZYME ............................................................................................................................................................................................ 61 BẢNG 2. 4 CÁC NHÓM VI KHUẨN THEO NHIỆT ĐỘ ................................................................................................................................................................. 81 BẢNG 2. 5 PHÂN LOẠI KHÁNG SINH THEO NGUỒN GỐC ......................................................................................................................................................... 86

BẢNG 4. 1 SINH VẬT NHÂN SƠ THƯỜNG GẶP Ở MÔI TRƯỜNG NƯỚC BIỂN VÀ NƯỚC NGỌT. ...................................................................................................... 102 BẢNG 4. 2 LƯỢNG VI KHUẨN TRONG ĐẤT XÁC ĐỊNH THEO CHIỀU SÂU ĐẤT ........................................................................................................................... 113 BẢNG 4. 3. LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG 1M3 KHÔNG KHÍ ..................................................................................................................................................... 116 BẢNG 4. 4 VI SINH VẬT CHỈ THỊ DỰA TRÊN MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG CỦA NGUỒN NƯỚC ............................................................................................................... 124 BẢNG 4. 5 SỐ LƯỢNG CÁC VI SINH VẬT CHỈ THỊ TRÊN CÁ THỂ ............................................................................................................................................... 125 BẢNG 4. 6 TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TRONG NƯỚC THẢI ........................................................................................................................ 126 BẢNG 4. 7 TÁC NHÂN NẤM GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TRONG NƯỚC THẢI ............................................................................................................................... 127 BẢNG 4. 8 VI RUS GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TRONG NƯỚC THẢI ............................................................................................................................................. 127 BẢNG 4. 9 ĐỘNG VẬT NGUYÊN SINH GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TRONG NƯỚC THẢI .................................................................................................................. 128 BẢNG 4. 10 TÁC NHÂN GIUN SÁN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP TRONG NƯỚC THẢI ...................................................................................................................... 128

BẢNG 5. 1 TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG CỦA NƯỚC THẢI VÀ NGUỒN GỐC PHÁT SINH .................................................................................................................... 131 BẢNG 5. 2 MỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ CÓ ĐỘC TÍNH CAO THƯỜNG GẶP ...................................................................................................................................... 134 BẢNG 5. 3 CÁC CHẤT Ô NHIỄM CẦN LOẠI BỎ TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ................................................................................. 140 BẢNG 5. 4 CÁC QUÁ TRÌNH XỬ LÝ SINH HỌC CHỦ YẾU ĐƯỢC ÁP DỤNG ................................................................................................................................. 141 BẢNG 5. 5 VI SINH VẬT TẠO ACID HỮU CƠ ........................................................................................................................................................................... 147 BẢNG 5. 6 VI KHUẨN SINH METHANE .................................................................................................................................................................................. 147 BẢNG 5. 7 SẢN PHẨM TẠO THÀNH TỪ CÁC NGUỒN CHẤT HỮU CƠ ......................................................................................................................................... 148

BẢNG 6. 1THÀNH PHẦN CÁC NGUYÊN TỐ TRONG MỘT SỐ LOẠI RÁC THẢI .............................................................................................................................. 167 BẢNG 6. 2 PHÂN LOẠI THÀNH PHẦN RÁC THẢI THEO KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI SINH HỌC ............................................................................................................ 168 BẢNG 6. 3 TỶ LỆ C/N CỦA MỘT SỐ CHẤT THẢI ..................................................................................................................................................................... 171 BẢNG 6. 4 CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH CỦA RÁC SAU THỜI GIAN CHÔN LẤP .................................................................................................................................... 177

BẢNG 7. 1 THÀNH PHẦN KHÔNG KHÍ KHÔ, KHÔNG BỊ Ô NHIỄM ............................................................................................................................................ 181 BẢNG 7. 2 SO SÁNH CÁC CÔNG NGHỆ KIỂM SOÁT CHẤT GÂY Ô NHIỄM DẠNG KHÍ ................................................................................................................... 187 BẢNG 7. 3 TÍNH CHẤT VÀ KHẢ NĂNG XỬ LÝ CỦA MỘT SỐ LOẠI VẬT LIỆU ĐỆM TRONG LỌC SINH HỌC....................................................................................... 188

1.Danh mục bảng

HÌNH 1. 1 MARCUS VITRUVIUS POLLIO .................................................................................................................................................................................. 1 HÌNH 1. 2 ANTONI VAN LEEUVENHOOK (1632-1723) VÀ CHIẾC KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC ĐẦU TIÊN ....................................................................................... 2 HÌNH 1. 3 LOUIS PASTEUR (1822 - 1895) .............................................................................................................................................................................. 2 HÌNH 1. 4 THÍ NGHIỆM BÁC BỎ THUYẾT TỰ SINH .................................................................................................................................................................... 3 HÌNH 1. 5 CÁC NHÀ VI SINH VẬT HỌC GIAI ĐOẠN SAU PASTEUR ............................................................................................................................................... 4 HÌNH 1. 6 KÍCH THƯỚC VI SINH VẬT TRONG SINH GIỚI ............................................................................................................................................................ 6 HÌNH 1. 7 TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT ............................................................................................................................................. 7 HÌNH 1. 8 QUÁ TRÌNH TRỰC PHÂN ......................................................................................................................................................................................... 9 HÌNH 1. 9 CÁC LOẠI CẦU KHUẨN ......................................................................................................................................................................................... 12 HÌNH 1. 10 CÁC LOẠI TRỰC KHUẨN ..................................................................................................................................................................................... 14

2.Danh mục hình

xi

HÌNH 1. 11 CẦU TRỰC KHUẨN VÀ PHẨY KHUẨN .................................................................................................................................................................... 15 HÌNH 1. 12 XOẮN THỂ VÀ XOẮN KHUẨN ............................................................................................................................................................................... 15 HÌNH 1. 13. VỎ NHẦY CỦA VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM .............................................................................................................................................. 16 HÌNH 1. 14 CẤU TRÚC THÀNH TẾ BÀO VI KHUẨN GRAM (+) VÀ GRAM (-) ............................................................................................................................... 17 HÌNH 1. 15 CẤU TRÚC MÀNG TẾ BÀO ................................................................................................................................................................................... 19 HÌNH 1. 16 VỊ TRÍ CỦA MESOSOME TRONG TẾ BÀO ................................................................................................................................................................ 20 HÌNH 1. 17 CẤU TRÚC RIBOSOME CỦA PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE .................................................................................................................................... 21 HÌNH 1. 18 THỂ NHÂN VÀ PLASMID TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI .................................................................................................................. 23 HÌNH 1. 19 CÁC DẠNG VÀ CẤU TRÚC TIÊM MAO Ở VI KHUẨN. ................................................................................................................................................ 24 HÌNH 1. 20 CẤU TẠO VÀ QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH NHA BÀO Ở VI KHUẨN ................................................................................................................................ 26 HÌNH 1. 21. CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN .................................................................................................................................................................................. 28 HÌNH 1. 22 KHUẨN LẠC VÀ VÒNG ĐỜI CỦA XẠ KHUẨN .......................................................................................................................................................... 28 HÌNH 1. 23 CẤU TẠO TẾ BÀO VI KHUẨN LAM ......................................................................................................................................................................... 30 HÌNH 1. 24 CẤU TẠO TẾ BÀO PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE .................................................................................................................................................. 31 HÌNH 1. 25 CẤU TẠO TẾ BÀO NẤM MEN ................................................................................................................................................................................ 33 HÌNH 1. 26 CẤU TRÚC VÁCH TẾ BÀO NẤM MEN ..................................................................................................................................................................... 33 HÌNH 1. 27 CẤU TRÚC MÀNG TẾ BÀO NẤM MEN .................................................................................................................................................................... 34 HÌNH 1. 28 CẤU TRÚC TY THỂ TẾ BÀO NẤM MEN ................................................................................................................................................................... 35 HÌNH 1. 29 CẤU TẠO MẠNG LƯỚI NỘI CHẤT TẾ BÀO NẤM MEN ............................................................................................................................................... 36 HÌNH 1. 30 CẤU TRÚC BỘ GOLGI ........................................................................................................................................................................................ 36 HÌNH 1. 31 HOẠT ĐỘNG KẾT HỢP CỦA GOLGI VÀ LYSOSOME TRONG TẾ BÀO ......................................................................................................................... 37 HÌNH 1. 32 CẤU TRÚC NHÂN VÀ LỖ MÀNG NHÂN CỦA TẾ BÀO NẤM MEN ................................................................................................................................. 38 HÌNH 1. 33 SINH SẢN THEO PHƯƠNG THỨC NẢY CHỒI Ở NẤM MEN ........................................................................................................................................ 39 HÌNH 1. 34 SINH SẢN THEO PHƯƠNG THỨC PHÂN CẮT Ở NẤM MEN ........................................................................................................................................ 40 HÌNH 1. 35 KHUẨN LẠC NẤM MỐC ....................................................................................................................................................................................... 41 HÌNH 1. 36 CẤU TRÚC VÙNG NGỌN SỢI NẤM. ....................................................................................................................................................................... 42 HÌNH 1. 37 HAI LOẠI KHUẨN TY CỦA NẤM MỐC .................................................................................................................................................................... 42 HÌNH 1. 38 CẤU TẠO TẾ BÀO SỢI NẤM .................................................................................................................................................................................. 43 HÌNH 1. 39 CÁC LOẠI BÀO TỬ VÔ TÍNH Ở NẤM MỐC .............................................................................................................................................................. 44 HÌNH 1. 40 QUÁ TRÌNH SINH SẢN HỮU TÍNH Ở NẤM MỐC RHYZOPUS VÀ ASPERGILLUS ........................................................................................................... 45 HÌNH 1. 41 MỘT VÀI LOẠI TẢO ĐỎ ....................................................................................................................................................................................... 46 HÌNH 1. 42 NHÓM TẢO NÂU................................................................................................................................................................................................. 47 HÌNH 1. 43 NHÓM TẢO LỤC ................................................................................................................................................................................................. 49 HÌNH 1. 44 CÁC NHÓM ĐỘNG VẬT NGUYÊN SINH .................................................................................................................................................................. 51 HÌNH 1. 45 TIÊU HÓA Ở ĐỘNG VẬT NGUYÊN SINH ................................................................................................................................................................. 52 HÌNH 1. 46. KÍCH THƯỚC VÀ HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ VIRUS ĐIỂN HÌNH ................................................................................................................................. 54 HÌNH 1. 47 CẤU TRÚC ĐỐI XỨNG XOẮN Ở VIRUS ................................................................................................................................................................... 54 HÌNH 1. 48 CẤU TRÚC KHỐI ĐA DIỆN CỦA VIRUS .................................................................................................................................................................. 55

HÌNH 2. 1 VẬN CHUYỂN THỤ ĐỘNG Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT ..................................................................................................................................................... 66 HÌNH 2. 2 CƠ CHẾ THẨM THẤU............................................................................................................................................................................................ 66 HÌNH 2. 3 CÁC KÊNH VẬN CHUYỂN CHỦ ĐỘNG ..................................................................................................................................................................... 67 HÌNH 2. 4 CẤU TẠO PHÂN TỬ CAO NĂNG ATP ...................................................................................................................................................................... 69 HÌNH 2. 5 CON ĐƯỜNG ĐƯỜNG PHÂN EMPDEN – MEYEHOF- PASNAS ................................................................................................................................... 70 HÌNH 2. 6 CON ĐƯỜNG ĐƯỜNG PHÂN PENTOSE PHOSPHAT .................................................................................................................................................. 71 HÌNH 2. 7 CON ĐƯỜNG ĐƯỜNG PHÂN ENTER – DOUDOROFF ............................................................................................................................................... 72 HÌNH 2. 8 CHU TRÌNH KREB (CHU TRÌNH ATC) ................................................................................................................................................................... 73 HÌNH 2. 9 KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA MỘT SỐ LOÀI VI SINH VẬT .............................................................................................................................................. 74 HÌNH 2. 10 SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĨNH .................................................................................................... 77 HÌNH 2. 11 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG KÉP CỦA VI SINH VẬT ............................................................................................................................................. 79 HÌNH 2. 12 SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LIÊN TỤC ................................................................................................................ 79 HÌNH 2. 13 HỆ THỐNG NUÔI CẤY LIÊN LỤC CHEMOSTAT VÀ BIOREACTOR .............................................................................................................................. 80

HÌNH 3. 1 MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT ..................................................................................................................................................................................... 88 HÌNH 3. 2 CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA CARBON ........................................................................................................................................................................ 91 HÌNH 3. 3 CHU TRÌNH PHOSPHOR ........................................................................................................................................................................................ 98

HÌNH 4. 1 NGUỒN CHẤT HỮU CƠ Ở SÔNG VÀ SUỐI. .............................................................................................................................................................. 104 HÌNH 4. 2 ĐƯỜNG CONG OXI HÒA TAN. .............................................................................................................................................................................. 104 HÌNH 4. 3 HỒ NGHÈO DINH DƯỠNG VÀ HỒ GIÀU DINH DƯỠNG. ........................................................................................................................................... 106

xii

HÌNH 4. 4 SỰ PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT VÀ ÁP SUẤT Ở MÔI TRƯỜNG BIỂN. ........................................................................................................................... 107 HÌNH 4. 5 CHU TRÌNH CACBON Ở ĐẠI DƯƠNG. .................................................................................................................................................................... 108 HÌNH 4. 6 VI SINH VẬT TRONG LỚP BĂNG Ở BIỂN.THỎI BĂNG LẤY TỪ NAM CỰC TIẾP GIÁP VỚI NƯỚC BIỂN. DẢI TỐI (MŨI TÊN) LÀ QUẦN XÃ VI SINH VẬT. (THEO

PRESCOTT-HARLEY-KLEIN, 2002) ........................................................................................................................................................................... 109 HÌNH 4. 7 TẢO PSEUDO-NITZSCHIA. ................................................................................................................................................................................... 110 HÌNH 4. 8 TẢO PFIESTERIA PISCICIDA ................................................................................................................................................................................ 110 HÌNH 4. 9 THƯƠNG TÍCH Ở CÁ DO PFIESTERIA GÂY NÊN. ..................................................................................................................................................... 111

HÌNH 5. 1 PHÂN HỦY CHẤT HỮU CƠ TRONG ĐIỀU KIỆN KỴ KHÍ............................................................................................................................................. 145 HÌNH 5. 2 SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH BÙN HOẠT TÍNH ...................................................................................................................................................................... 153 HÌNH 5. 3 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BỂ AEROTANK ........................................................................................................................................................ 154 HÌNH 5. 4 MỘT SỐ VI KHUẨN DẠNG SỢI TRONG BÙN HOẠT TÍNH .......................................................................................................................................... 157 HÌNH 5. 5 MÀNG LỌC SINH HỌC MBR ................................................................................................................................................................................ 159 HÌNH 5. 6 BỂ LỌC SINH HỌC NHỎ GIỌT ............................................................................................................................................................................... 159 HÌNH 5. 7 ĐĨA QUAY SINH HỌC (ROTATING BIOLOGICAL CONTACTORS)................................................................................................................................ 160 HÌNH 5. 8 MÔ HÌNH BỂ TỰ HOẠI ......................................................................................................................................................................................... 165 HÌNH 5. 9 MÔ HÌNH BỂ UASB ............................................................................................................................................................................................ 166

HÌNH 7. 1 CẤU TRÚC KHÍ QUYỂN ........................................................................................................................................................................................ 180 HÌNH 7. 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KHÍ ỨNG DỤNG SINH HỌC .......................................................................................................................................... 185 HÌNH 7. 3. THIẾT BỊ LỌC SINH HỌC XỬ LÝ KHÍ ..................................................................................................................................................................... 186 HÌNH 7. 4 THIẾT BỊ XỬ LÝ KHÍ H2S SỬ DỤNG VI KHUẨN SOB (NGUỒN: NGUYỄN KHÁNH HOÀNG) ........................................................................................ 189 HÌNH 7. 5 QUÁ TRÌNH LÊN MEN CỦA CÁC CHẤT HỮU CƠ DO CÁC VI SINH VẬT YẾM KHÍ .......................................................................................................... 190

xiii

PHẦN A. LÝ THUYẾT

CHƯƠNG 1: HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA VI SINH VẬT

1.1. Lịch sử phát triển của vi sinh vật học

Xét qua lịch sử phát triển, ngành vi sinh vật học trải qua 4 giai đoạn chính:

A. Giai đoạn sơ khai

* Học thuyết về sự tự sinh: Từ thời xa xưa, con người ta luôn tin vào học thuyết về sự tự sinh. Theo đó, các sinh vật sống trên Trái đất được tự nhiên sinh ra mà không cần đến các sinh vật có kết cấu tương đồng. Ví dụ như giòi được sinh ra từ đất, hay các sinh vật sống do Mặt trời và nước tạo nên chứ không cần đến cha mẹ chúng. Một ví dụ điển hình là kiến trúc sư người La Mã cổ đại Marcus Vitruvius Pollio (80 - 15 TCN) cho rằng, những con mọt sách được gió thổi đến từ hướng Nam hoặc hướng Tây, do đó thư viện nên quay mặt về phía Đông. Thậm chí cho đến cuối thế kỷ XIX, rất nhiều người vẫn tin vào học thuyết tưởng chừng như rất vô lý này. Họ tin rằng gió là một yếu tố trong việc kiến tạo sự sống. Một số người khác nghĩ, sâu và ếch tự sinh ra từ bùn, còn giòi là do thịt thối phân hủy ra mà thành.

Hình 1. 1 Marcus Vitruvius Pollio

* Chế tạo ra kính hiển vi: Người đầu tiên nhìn thấy và mô tả vi sinh vật là Antoni Van Leeuvenhook (1632-1723), người Hà Lan. Ông là một thương nhân buôn vải, muốn tìm hiểu cấu trúc của sợi vải ông đã chế tạo ra các thấu kính và lắp ráp chúng thành kính hiển vi đầu tiên có độ phóng đại 160 lần. Ông đã quan sát và mô tả thế giới nhỏ bé của vi sinh vật từ những mẫu nước sông hồ, nước ao tù, nước cống và ngay cả chính trong bựa răng của ông. Cho đến cuối đời, Leeuvenhook đã chế tạo được những chiếc kính hiển vi thô sơ với độ phóng đại từ 270 – 300 lần. Năm 1695, ông đã xuất bản quyển “Phát hiện của Leeuvenhook về những bí mật của thế giới tự nhiên”.

1

Hình 1. 2 Antoni Van Leeuvenhook (1632-1723) và chiếc kính hiển vi quang học đầu tiên

B. Giai đoạn vi sinh vật học Pasteur

Louis Pasteur (1822 - 1895), nhà hóa học, nhà vi sinh vật học người Pháp, với những phát hiện về các nguyên tắc của tiêm chủng, lên men vi sinh. Ông được xem là một trong 3 người thiết lập nên lĩnh vực vi sinh vật học, cùng với Ferdinand Cohn và Robert Koch, và được gọi là "cha đẻ của vi sinh vật học

Năm 1856, ông đã công bố Quy luật tạo sinh cho rằng, sự sống phải bắt nguồn sự sống, hay con cái phải có bố mẹ sinh ra. Một sinh vật có ý thức dù là một tế bào nhỏ nhất, đơn giản nhất không thể được tạo ra từ sự kết hợp của những nguyên tử hóa học vô cơ. Học thuyết của Pasteur đưa ra dựa trên vô số thực nghiệm, vậy nên ta đã có thể bác bỏ được học thuyết tự sinh lâu đời kéo dài hàng ngàn năm.

Hình 1. 3 Louis Pasteur (1822 - 1895)

Vào thời của Hoàng đế Napoléon III, Louis Pasteur tiến hành các nghiên cứu về sự biến đổi của rượu vang trong quá trình lên men nước ép của nho. Ông phát hiện rằng tất cả các biến đổi này đều do các sinh vật "kí sinh" vì chúng phát triển nhiều hơn các vi sinh cần thiết cho quá trình lên men rượu bình thường. Ông đã hướng dẫn những người làm rượu chỉ nên sử dụng nguồn vi sinh vật sạch, không lẫn các sinh vật ký sinh để tránh các trường hợp sản phẩm bị hư hỏng. Trong khi cố gắng tìm ra một phương thuốc hữu hiệu để điều trị chứng bệnh mà ông đã tìm ra nguyên nhân, Pasteur lại phát minh ra một kỹ thuật nhằm giảm thiểu sự tạp nhiễm môi trường nuôi cấy bằng cách đun nóng môi trường này lên đến khoảng 55-60 °C trong điều kiện không có không khí. Kỹ thuật này sau đó được đặt tên là phương pháp khử

2

khuẩn Pasteur (pasteurisation), một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế tạo và bảo quản rượu vang.

Hình 1. 4 Thí nghiệm bác bỏ thuyết tự sinh

Từ năm 1878 đến 1880, ông đã khám phá ra ba chủng vi khuẩn: liên cầu khuẩn (streptococcus), tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và phế cầu khuẩn (pneumococcus). Xuất phát từ quan niệm rằng một loại bệnh được gây nên do một loại vi sinh vật nhất định do nhiễm từ môi trường bên ngoài, Pasteur đã thiết lập nên những nguyên tắc quan trọng trong vô khuẩn. Tỉ lệ tử vong hậu phẫu cũng như hậu sản giảm xuống một cách ngoạn mục nhờ áp dụng những nguyên tắc này.

Vaccine ngừa bệnh dại đầu tiên trên cơ sở virus giảm độc lực này đã được Pasteur, sau nhiều đắn đo suy tính, sử dụng vào ngày 6 tháng 7 năm 1885 ở một bé trai tên là Joseph Meister, người bị chó dại cắn trước đó. Đây là một thành công vang dội của Pasteur cũng như của nền y khoa thế giới. Kết quả công trình nghiên cứu về bệnh dại được Pasteur trình bày trước Viện Hàn lâm Khoa học Pháp vào ngày 1 tháng 3 năm 1886. Nhân dịp này ông cũng đề nghị thành lập một cơ sở nhằm sản xuất vaccine chống bệnh dại. Năm 1887 lời kêu gọi này được công bố rộng rãi và nhận được 2 triệu Franc Pháp quyên góp. Nhờ đó vào năm 1888, Tổng thống Sadi Carnot cho tiến hành xây dựng Viện Pasteur đầu tiên tại Pháp. Các Viện Pasteur khác sau đó cũng được thành lập ở những nới khác trên thế giới nhờ ảnh hưởng của các nhà vi sinh vật học như Albert Calmette và Alexandre Yersin. Tôn chỉ của Viện Pasteur từ

Mặc dầu L. Pasteur là người đầu tiên chứng minh cơ sở khoa học của việc chế tạo vaccin nhưng thuật ngữ vaccin lại do một bác sĩ nông thôn người anh Edward Jenner (1749- 1823) đặt ra. Ông là người đầu tiên nghĩ ra phương pháp chủng đậu bằng mủ đậu mùa bò cho người lành, để phòng bệnh đậu mùa, một căn bệnh hết sức nguy hiểm cho tính mạng thời bây giờ.

3

đó đến nay không thay đổi: tiến hành các nghiên cứu chế tạo vaccine và các chiến dịch tiêm phòng chống lại các bệnh truyền nhiễm

C. Giai đoạn vi sinh vật học sau Pasteur

Tiếp theo sau Pasteur là Koch (Robert Koch 1843-1910), là người có công trong việc phát triển các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật. Ông đề ra phương pháp chứng minh một vi sinh vật là nguyên nhân gây ra bệnh truyền nhiễm mà ngày nay mọi nhà nghiên cứu bệnh học phải theo và gọi là quy tắc Koch.

Hình 1. 5 Các nhà vi sinh vật học giai đoạn sau Pasteur

Ngày 24-3-1882, Koch công bố công trình khám phá ra vi trùng gây bệnh lao và gọi nó là Mycobacterium tuberculosis, là một bệnh nan y thời đó. Khám phá này mở đường cho việc chữa trị bệnh ngày nay.

Kế đó học trò của Koch là Petri (Juliyes Richard Petri, 1852-1921) chế ra các dụng cụ nghiên cứu vi sinh vật mà ngày nay còn dùng tên của ông để đặt cho dụng cụ ấy: đĩa Petri. Ông cũng nêu ra các biện pháp nhuộm màu vi sinh vật.

4

Ivanopxki, 1892 và Beijerrinck, 1896 là những người phát hiện ra virus đầu tiên trên thế giới khi chứng minh vi sinh vật nhỏ hơn vi khuẩn, qua được lọc bằng sứ xốp, là nguyên nhân gây bệnh khảm cây thuốc lá.

D. Giai đoạn vi sinh vật học hiện đại

Ngày nay vi sinh vật đã phát triển rất sâu với hàng trăm nhà bác học có tên tuổi và hàng chục ngàn người tham gia nghiên cứu, các nghiên cứu đã đi sâu vào bản chất của sự sống ở mức độ phân tử và dưới phân tử, đi sâu vào kỹ thuật cấy mô và tháo lắp gen ở vi sinh vật và ứng dụng kỹ thuật tháo lắp này để chữa bệnh cho người, gia súc, cây trồng và đang đi sâu vào để giải quyết bệnh ung thư ở loài người.

Vi sinh học hiện đại cũng đi sâu nghiên cứu những tính chất riêng biệt của vi sinh vật và hình thành các chuyên ngành như: Tế bào học, Phân loại học, Sinh lý học, Hóa sinh học, Di truyền học của vi sinh vật.

Về mặt ứng dụng ngành vi sinh học gồm có các chuyên ngành như: Vi sinh vật học công nghiệp, Vi sinh vật học thực phẩm, Vi sinh vật học y học, Vi sinh vật học thú y, Vi sinh vật đất, Vi sinh vật học nước, Vi sinh vật học không khí, Vi sinh vật học dầu mỏ, Vi sinh vật học ngoài trái đất ….

1.2 Đặc điểm chung của vi sinh vật trong sinh giới

1.2.1 Đặc điểm chung của vi sinh vật

Kích thước nhỏ bé

Vi sinh vật thường được đo kích thước bằng đơn vị micromet (1mm= 1/1000mm hay 1/1000 000m). virus được đo kích thước đơn vị bằng nanomet (1nn=1/1000 000mm hay 1/1000 000 000m).

5

Hình 1. 6 Kích thước vi sinh vật trong sinh giới

Kích thước càng bé thì diện tích bề mặt của vi sinh vật trong 1 đơn vị thể tích càng lớn. Chẳng hạn đường kính của 1 cầu khuẩn (Coccus) chỉ có 1mm, nhưng nếu xếp đầy chúng thành 1 khối lập nhưng có thể lích là 1cm3 thì chúng có diện tích bề mặt rộng tới ...6 m2 !

Hấp thu nhiều, chuyển hoá nhanh

Tuy vi sinh vật có kích thước rất nhỏ bé nhưng chúng lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá vượt xa các sinh vật khác. Chẳng hạn 1 vi khuẩn lactic (Lactobacillus) trong 1 giờ có thể phân giải được một lượng đường lactose lớn hơn 100-10 000 lần so với khối lượng của chúng. Tốc độ tổng hợp protein của nấm men cao gấp 1000 lần so với đậu tương và gấp 100 000 lần so với trâu bò.

Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh

Nhờ kích thước nhỏ bé nên tốc độ trao đổi chất của vi sinh vật nhanh hơn các loài có kích thước lơn. Chẳng hạn, 1 trực khuẩn đại tràng Escherichia coli trong các điều kiện thích hợp chỉ sau 12-20 phút lại phân cắt một lần. Nếu lấy thời gian thế hệ là 20 phút thì mỗi giờ phân cắt 3 làn, sau 24 giờ phân cắt 72 lần và tạo ra 4 722 366 500 000 000 000 000 000 tế bào (4 722 366. 1017), tương đương với 1 khối lượng 4722 tấn. Trong nồi lên men với các điều kiện nuôi cấy thích hợp từ 1 tế bào có thể tạo ra sau 24 giờ khoảng 100 000 000- 1 000 000 000 tế bào. Thời gian thế hệ của nấm men dài hơn, ví dụ với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) là 120 phút. Với nhiều vi sinh vật khác còn dài hơn nữa, ví dụ với tảo Tiểu cầu (Chlorella) là 7 giờ, với vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ...

6

Hình 1. 7 Tốc độ sinh trưởng của một số loài vi sinh vật

Có năng lực thích ứng mạnh và dễ dàng phát sinh biến dị

Trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất khác nhau, kể cả những điều kiện hết sức bất lợi mà các sinh vật khác thường không thể tồn tại được. Có vi sinh vật sống được ở môi trường nóng đến 1300C, lạnh đến 0-50C, mặn đến nồng độ 32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong, pH thấp đến 0,5 hoặc cao đến 10,7, áp suất cao đến trên 1103 at. hay có độ phóng xạ cao đến 750 000 rad. Nhiều vi sinh vật có thể phát triển tốt trong điều kiện tuyệt đối kỵ khí, có loài nấm sợi có thể phát triển dày đặc trong bể ngâm tử thi với nồng độ Formol rất cao...

Vi sinh vật đa số là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống ... do đó rất dễ dàng phát sinh biến dị. Tần số biến dị thường ở mức 10-5-10-10. Chỉ sau một thời gian ngắn đã có thể tạo ra một số lượng rất lớn các cá thể biến dị ở các thế hệ sau. Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất. Nếu như khi mới phát hiện ra penicillin hoạt tính chỉ đạt 20 đơn vị/ml dịch lên men (1943) thì nay đã có thể đạt trên 100 000 đơn vị/ml. Khi mới phát hiện ra acid glutamic chỉ đạt 1-2g/l thì nay đã đạt đến 150g/ml dịch lên men.

Phân bố rộng, chủng loại nhiều

Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật... Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh-địa-hoá học như vòng tuần hoàn C, N, P, S, Fe...

Trong nước vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải, vùng nước nông và ngay cả ở vùng nước sâu, vùng đáy ao hồ. Trong không khí thì càng lên cao số lượng vi sinh vật càng ít. Số lượng vi sinh vật trong không khí ở các khu dân cư đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực... Hầu như không có hợp 7

chất carbon nào mà không là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó. Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dưỡng khác nhau: quang tự dưỡng, quang dị dưỡng, hoá tự dưỡng, hoá dị dưỡng, tự dưỡng chất sinh trưởng, dị dưỡng chất sinh trưởng…

Là sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất

Trái đất hình thành cách đây 4,6 tỷ năm nhưng cho đến nay mới chỉ tìm thấy dấu vết của sự sống từ cách đây 3,5 tỷ năm. Đó là các vi sinh vật hoá thạch còn để lại vết tích trong các tầng đá cổ. Vi sinh vật hoá thạch cổ xưa nhất đã được phát hiện là những dạng rất giống với Vi khuẩn lam ngày nay. Chúng được J.William Schopf tìm thấy tại các tầng đá cổ ở miền Tây Australia. Chúng có dạng đa bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 1-2 mm và có thành tế bào khá dày. Trước đó các nhà khoa học cũng đã tìm thấy vết tích của chi Gloeodiniopsis có niên đại cách đây 1,5 tỷ năm và vết tích của chi Palaeolyngbya có niên đại cách đây 950 triệu năm.

1.3 Vi sinh vật nhân sơ - PROKARYOTE

1.3.1 Định nghĩa

Prokaryote hay sinh vật nhân sơ là các sinh vật có cấu tạo tế bào đơn giản, chưa có màng nhân và nhân hoàn chỉnh. Prokaryote bao gồm vi khuẩn thật (Eubacteria) và vi khuẩn cổ (Archaebacteria). Trong vi khuẩn thật bao gồm rất nhiều nhóm khác nhau: vi khuẩn (Bacteria), xạ khuẩn (Actinomycetes), vi khuẩn lam (Cyanobacteria), nhóm vi khuẩn nguyên thủy Mycoplasma, Ricketsia và Clamidia.

1.3.2. Vi khuẩn

1.3.2.1 Định nghĩa và vai trò của vi khuẩn

Vi khuẩn - tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium (số nhiều bacteria) là những vi sinh vật mà cơ thể chỉ gồm một tế bào (sinh vật đơn bào), có kích thước nhỏ (kích thước hiển vi) thay đổi tùy theo từng loại, chiều dài khoảng 1-10 m chiều ngang khoảng 0,2 - 10 m; có cấu trúc tế bào đơn giản không có màng nhân, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và các bào quan như ty thể và lục lạp.

Vi khuẩn là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới. Người ta ước tính có khoảng 40 triệu tế bào vi khuẩn trong một gram đất và hàng triệu tế bào trong một mm nước ngọt. Ước tính có khoảng 5×1030 vi khuẩn trên Trái Đất, tạo thành một lượng sinh khối vượt hơn tất cả động vật và thực vật. Vi khuẩn có thể có ích hoặc có hại cho môi trường, và động vật, bao gồm cả con người. Một số là tác nhân gây bệnh và gây ra bệnh uốn ván, sốt thương hàn, giang mai, tả, bệnh lây qua thực phẩm và lao. Một số khác lại có lợi như các vi sinh vật sống trong nốt rễ có khả năng cố định Nitơ, các vi khuẩn sống cộng sinh trong cơ thể người hay các

8

sinh vật khác giúp ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật có hại. Một số nhóm vi sinh "chuyên hóa" đóng một vai trò rất quan trọng trong việc hình thành các khoáng chất từ một số nhóm hợp chất hữu cơ. Các vi khuẩn có khả năng phân hủy hydrocarbon trong dầu mỏ thường được dùng để làm sạch các vết dầu loang.

Cùng với nấm men và nấm mốc, vi khuẩn được dùng để chế biến các thực phẩm lên men như phô-mai, dưa chua, nước tương, dưa cải bắp, giấm, rượu, và yoghurt. Sử dụng công nghệ sinh học, các vi khuẩn có thể được "thiết kế" để sản xuất thuốc trị bệnh như insulin, hay để cải thiện sinh học đối với các chất thải độc hại

1.3.2.2 Đặc điểm sinh sản

a. Sinh sản vô tính

Hình thức sinh sản chủ yếu của vi khuẩn là sinh sản bằng phương thức nhân đôi hay còn gọi là trực phân. Đầu tiên các DNA được nhân lên, ở khoảng giữa tế bào hình thành mezosom, sau đó hình thành vách ngăn tế bào và DNA được phân đôi, tách khỏi mezosom đi về hai tế bào con. Khi phân cắt tế bào thường chia làm hai phần bằng nhau, chỉ trong một số rất ít trường hợp tế bào mới chia làm hai phần không bằng nhau lúc này được gọi là: dị hình. Kiểu phân cắt dị hình thường chỉ thấy trong môi trường cũ đã cạn thức ăn.

Hình 1. 8 Quá trình trực phân

Cách phân cắt của tế bào vi khuẩn phụ thuộc vào từng loài:

- Với trực khuẩn và xoắn khuẩn, vách ngăn hình thành theo bề ngang của tế bào. Rất

ít trường hợp vách ngăn có thể hình thành theo chiều dọc của tế bào.

- Với cầu khuẩn, vách ngăn có thể hình thành theo một hoặc hai, ba mặt phẳng. Tùy

theo vị trí của vách ngăn mà các dạng khác nhau của vi khuẩn hình thành

Đa số các vi khuẩn sau khi phân chia các tế bào con tách khỏi nhau, ở một số vi

khuẩn tế bào con không tách ra mà xếp lại thành chuỗi dài ngắn khác nhau.

9

Quá trình sinh sản này xảy ra rất nhanh. Bằng phương thức này, tế bào vi khuẩn được nhân lên theo cấp số nhân. Tùy từng loài vi khuẩn, cứ khoảng 10 đến 30 phút lại cho ra một thế hệ.

b. Sinh sản hữu tính

Mặc dù không có sinh sản hữu tính, những biến đổi di truyền hay đột biến vẫn xảy ra trong từng tế bào vi khuẩn thông qua các hoạt động tái tổ hợp di truyền. Do đó, tương tự như ở các sinh vật bậc cao, kết quả cuối cùng là vi khuẩn cũng có được một tổ hợp các tính trạng từ hai tế bào mẹ. Có ba kiểu tái tổ hợp di truyền đã được phát hiện ở vi khuẩn:

Biến nạp (transformation): chuyển DNA trần từ một tế bào vi khuẩn sang tế bào

Tải nạp (transduction): chuyển DNA của virus, vi khuẩn, hay cả virus lẫn vi

Giao nạp (conjugation): chuyển DNA từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông

 khác thông qua môi trường lỏng bên ngoài, hiện tượng này gồm cả vi khuẩn chết.  khuẩn, từ một tế bào sang tế bào khác thông qua thể thực khuẩn (bacteriophage).  qua cấu trúc protein gọi là pilus (lông giới tính).

Sau khi nhận được DNA từ một trong những cách trên, vi khuẩn sẽ tiến hành phân chia và truyền bộ gene tái tổ hợp cho thế hệ sau. Nhiều vi khuẩn còn có plasmid chứa DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể có khả năng di truyền độc lập với DNA trong vùng nhân.

1.3.2.3 Đặc điểm trao đổi chất

Các vi khuẩn có rất nhiều kiểu trao đổi chất khác nhau. Vi khuẩn dị dưỡng (heterotroph) phải dựa vào nguồn cacbon hữu cơ bên ngoài, và tất cả các vi khuẩn gây bệnh đều là các vi khuẩn dị dưỡng. Trong khi các vi khuẩn tự dưỡng (autotroph) có khả năng tổng hợp chất hữu cơ từ CO2 và nước. Các vi khuẩn tự dưỡng thu nhận năng lượng từ phản ứng ôxy hóa các hợp chất hóa học gọi là vi khuẩn hóa dưỡng (chemotroph), và những nhóm thu năng lượng từ ánh sáng, thông qua quá trình quang hợp, được gọi là vi khuẩn quang dưỡng (phototroph). Ngoài ra, các vi khuẩn còn được phân biệt nhờ vào nguồn chất khử mà chúng sử dụng. Những nhóm sử dụng hợp chất vô cơ (như nước, khí hiđrô, sulfua và ammonia) làm chất khử được gọi là vi khuẩn vô cơ dưỡng (lithotroph) và những nhóm cần hợp chất hữu cơ (như đường, axit hữu cơ) được gọi là vi khuẩn hữu cơ dưỡng (organotroph). Những kiểu trao đổi chất dựa vào nguồn năng lượng (quang dưỡng hay hóa dưỡng), nguồn chất khử (vô cơ dưỡng hay hữu cơ dưỡng) và nguồn cácbon (tự dưỡng hay dị dưỡng) có thể được kết hợp khác nhau trong từng tế bào, và nhiều loài có thể thường xuyên chuyển từ kiểu trao đổi chất này sang kiểu trao đổi chất khác.

10

Vi khuẩn quang vô cơ tự dưỡng bao gồm vi khuẩn lam (cyanobacteria), là một trong những loài cổ nhất được biết đến từ hóa thạch và có lẽ đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra nguồn ôxy cho khí quyển Trái Đất. Chúng là những tiên phong trong việc sử dụng nước như là nguồn electron vô cơ (lithotrophic) và là sinh vật đầu tiên dùng bộ máy quang hợp để phân rã nước. Những vi khuẩn quang hợp khác dùng các nguồn electron khác nên không tạo ra ôxy. Những vi khuẩn quang dưỡng không tạo ôxy nằm trong bốn nhóm phân loại: vi khuẩn lục lưu huỳnh, vi khuẩn lục không dùng lưu huỳnh, vi khuẩn tía và heliobacteria.

Những chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển bình thường gồm nitơ, lưu hùynh, phôtpho, vitamin và các nguyên tố kim loại như natri, kali, canxi, ma-nhê, mangan, sắt, kẽm, côban, đồng, nikel... Vài loài cần thêm một số nguyên tố vết khác như selen, tungsten, vanađi hay bo.

Dựa vào phản ứng với ôxy, hầu hết các vi khuẩn có thể được xếp vào 3 nhóm: một số chỉ có thể mọc khi có sự hiện diện của ôxy được gọi là vi khuẩn hiếu khí (aerobe); một số khác chỉ có thể mọc khi không có ôxy được gọi là vi khuẩn kị khí (anaerobe); và một số lại có thể sống cả khi có hay không có sự hiện diện của ôxy thuộc nhóm vi khuẩn kị khí tùy ý (facultative anaerobe). Các vi khuẩn không sử dụng ôxy nhưng vẫn có thể mọc khi có sự hiện diện của ôxy gọi là vi khuẩn chịu oxy (aerotolerant). Những vi khuẩn có thể mọc tốt trong môi trường khắc nghiệt đối với con người được gọi là extremophile (vi khuẩn chịu cực hạn). Một số vi khuẩn sống trong suối nước nóng được gọi là vi khuẩn chịu nhiệt (thermophile); một số khác sống trong hồ nước rất mặn gọi là vi khuẩn chịu mặn (halophile); trong khi đó có loài lại sống trong môi trường acid hay kiềm gọi là vi khuẩn chịu axit (acidophile) hay vi khuẩn chịu kiềm (alkaliphile) và còn một số sống trong các băng hà trong dãy núi Alps gọi là vi khuẩn chịu hàn (psychrophile)

1.3.2.4 Khả năng di động

Vi khuẩn di động nhờ vào tiên mao, trượt hay thay đổi sức nổi. Một nhóm vi khuẩn đặc biệt, nhóm spirochaete, có các cấu trúc tương tự như tiên mao, gọi là sợi trục, nằm giữa hai màng trong vùng chu chất. Chúng có một thể xoắn ốc đặc biệt quay tròn khi di chuyển.

Tiên mao của vi khuẩn được sắp xếp theo nhiều cách. Vi khuẩn có thể có một tiên mao ở mỗi cực của tế bào, hay có thể có một nhóm nhiều tiên mao ở một đầu. Peritrichous là nhóm vi khuẩn có tiên mao nằm rải rác khắp tế bào. Nhiều vi khuẩn (như E. coli) có hai kiểu di động khác nhau: di động tiến tới (bơi) và quay vòng. Di động quay vòng giúp chúng tái định hướng và là một nhân tố qua trọng tạo ra tính định hướng bất kì cho di động tiến tới.

Vi khuẩn di động bị thu hút hay đẩy ra bởi một số kích thích, hoạt động này được gọi là tính hướng động chẳng hạn như hóa hướng động, quang hướng động, cơ hướng động và từ

11

hướng động. Khi đó, các tế bào vi khuẩn có thể dính lại với nhau để tạo thành đám và có thể biệt hóa tạo thành thể quả.

1.3.2.5 Phân loại hình thái

Dựa vào hình thái bên ngoài của vi khuẩn, người ta chia vi khuẩn ra làm 6 loại hình thái khác nhau: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, phẩy khuẩn, xoắn khuẩn, xoắn thể.

A. Cầu khuẩn (Coccus)

Cầu khuẩn (Coccus, số nhiều là cocci), có nghĩa là loại vi khuẩn này có hình thái giống như quả mọng, là những vi khuẩn có dạng hình cầu, tuy nhiên có loại không thật giống với hình cầu, thường có hình bầu dục. Kích thước của cầu khuẩn thay đổi trong khoảng 0,5 - 1 m (1 m =10-3 mm).

Tùy theo vị trí của mặt phẳng phân cắt và đặc tính rời hay dính nhau sau khi phân cắt mà cầu khuẩn được chia thành các loại sau đây:

Đơn cầu khuẩn (Micrococcus): Thường đứng riêng rẽ từng tế bào một, đa số sống hoại sinh trong đất, nước, không khí như: M. agillis, M. roseus, M. luteus.

Song cầu khuẩn (Diplococcus): Cầu khuẩn được phân cắt theo một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành từng đôi một, một số loại có khả năng gây bệnh như lậu cầu khuẩn gonococcus.

Hình 1. 9 Các loại cầu khuẩn

Liên cầu khuẩn (Streptococcus): Cầu khuẩn phân cắt bởi một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành một chuỗi dài. Streptococcus lactis vi khuẩn lên men lactic, Streptococcus pyogenes liên cầu khuẩn sinh mủ. Trong chi này còn có loại liên song cầu khuẩn, tức là song cầu khuẩn tập trung từng đôi một thành chuỗi dài.

12

Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus): Cầu khuẩn phân cắt theo hai mặt phẳng trực giao và sau đó dính với nhau thành từng nhóm 4 tế bào, tứ cầu khuẩn thường sống hoại sinh nhưng cũng có loại gây bệnh cho người và động vật như Tetracoccus homari.

Bát cầu khuẩn (Sarcina): Cầu khuẩn phân cắt theo 3 mặt phẳng trực giao và tạo thành khối gồm 8, 16 tế bào. Hoại sinh trong không khí như Sarcina urea có khả năng phân giải ure khá mạnh. Sarcina putea, Sarcina aurantica.

Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus): Phân cắt theo các mặt phẳng bất kỳ và dính với nhau thành từng đám như hình chùm nho, hoại sinh hoặc ký sinh gây bệnh cho người và gia súc, nói chung cầu khuẩn không có tiên mao roi nên không có khả năng di động, khi nhuộm màu đa số cầu khuẩn bắt màu Gram dương. Đa số sống hoại sinh một số gây bệnh như Staphylococcus aureus - tụ cầu vàng.

B. Trực khuẩn (Bacillus, Bacterium)

Trực khuẩn là tên chung để chỉ những vi khuẩn có dạng hình que, hình gậy, kích thước của vi khuẩn khoảng 0,5-1 x 1-4m, có những chi thường gặp như:

Bacillus: Là trực khuẩn Gram dương, sống yếm khí tuỳ tiện, sinh nha bào, chiều ngang của nha bào không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do đó khi vi khuẩn mang nha bào vẫn không thay đổi hình dạng. Ví dụ: Trực khuẩn gây bệnh nhiệt thán Bacillus anthracis, trực khuẩn cỏ khô Bacillus subtillis. Bacillus subtillis là một trực khuẩn có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột, chúng ức chế sự phát triển các vi sinh vật có hại đối với đường tiêu hoá.

Bacterium: Là trực khuẩn Gram âm, sống hiếu khí tuỳ tiện không sinh nha bào, thường có tiên mao ở xung quanh thân, có nhiều loại Bacterium gây bệnh cho người và gia súc như, Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus.

Clostridium: Là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí bắt buộc, hình gậy hai đầu tròn kích thước khoảng 0,4 -1 x 3 - 8 m, sinh nha bào, chiều ngang của nha bào thường lớn hơn chiều ngang của tế bào vi khuẩn, nên khi mang nha bào vi khuẩn bị biến đổi hình dạng như hình thoi, hình vợt, hình dùi trống.

Corynebacterium: Vi khuẩn không sinh nha bào, có hình dạng và kích thước thay đổi khá nhiều tùy từng giống, khi nhuộm màu vi khuẩn thường tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau ví dụ: Corynebacterium diphtheriae (gây bệnh bạch hầu) bắt màu hai đầu hình quả tạ, Erysipelothrix rhusiopathiae gây bệnh đóng dấu lợn, gây viêm da và tổ chức dưới da.

Pseudomonas: Là trực khuẩn Gram âm, không có bào tử, có 1 tiên mao hoặc 1 chùm tiên mao ở đầu, thường sinh sắc tố. Pseudomonas thường gặp ở thủy hải sản. Ví dụ: Xanthomonas, Photobacterium

13

Hình 1. 10 Các loại trực khuẩn

C. Cầu trực khuẩn (Cocco-Bacillus)

Là những vi khuẩn trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn, vi khuẩn có hình bầu dục, hình trứng, kích thước khoảng 0,25-0,3 x 0,4 -1,5 m. Một số bắt màu tập trung ở hai đầu (vi khuẩn lưỡng cực). Ví dụ: vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng: Pasteurella. Vi khuẩn gây sẩy thai truyền nhiễm Brucella.

D. Phẩy khuẩn (Vibrio)

Là tên chung để chỉ những vi khuẩn hình que uốn cong lên, có hình giống hình dấu phẩy, hình lưỡi liềm, đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành hình chữ S hay số 8, có tiên mao. Phần lớn sống hoại sinh, có một số loại gây bệnh như Vibrio cholerae.

14

Hình 1. 11 Cầu trực khuẩn và phẩy khuẩn

E. Xoắn thể (Spirillum)

Là nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí hoặc vi hiếu khí, di động, có dạng xoắn, xoắn khuẩn gây bệnh thuộc chi Campylobacter. Campylobacter là những vi khuẩn Gram âm, có dạng chữ S hay dấu phẩy, có một lông roi ở một cực hoặc hai cực, di động theo kiểu vặn nút chai, kích thước 0.2-0.8 x 0.5 –5.0 m nhưng đôi khi có dạng cầu khuẩn, thông thường không có giáp mô, tuy có khi C. jejuni lại thấy có giáp mô.

Về hình thái xoắn thể khác với nhóm xoắn khuẩn (Spirochaeta) do số vòng xoắn ít hơn, vòng xoắn của xoắn thể không làm cho đường kính cơ thể tăng lên, xoắn thể không có cấu trúc sợi trục chu chất và lớp bao ngoài, vách tế bào cứng và di động mạnh nhờ có lông roi ở cực tế bào.

F. Xoắn khuẩn (Spirochaeta)

Cấu trúc cơ bản của xoắn khuẩn là màng tế bào chất của tế bào kéo dài được bọc trong một màng phức hợp bên ngoài vách tế bào tạo thành ống tế bào chất, phía ngoài được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài hay lớp bao nhầy. Khoảng không gian giữa màng tế bào chất và lớp vỏ ngoài này được gọi là không gian chu chất. Có tiên mao xuất phát từ hai cực tế bào, những sợi tiên mao này hướng vào giữa tế bào. Bắt màu Gram âm, nhưng thường khó bắt màu nên để quan sát xoắn khuẩn thường sử dụng các phương pháp nhuộm nhiễm bạc, hoặc quan sát tiêu bản sống dưới kính hiển vi nền đen. Xoắn khuẩn di động uốn khúc, vặn xoắn, uốn lượn, sinh sản bằng cách phân chắt theo chiều ngang.

Xoắn khuẩn điển hình là Leptospira canicola theo nước và thức ăn vào máu, gan,

thận gây loạn chức năng của các cơ quan này dẫn đến xuất huyết và vàng da.

Hình 1. 12 Xoắn thể và xoắn khuẩn

15

1.3.2.6 Cấu tạo tế bào vi khuẩn

A. Bao nhầy (capsula)

Một số loài vi khuẩn bên ngoài thành tế bào còn có chứa một lớp bao nhầy hay còn gọi là lớp giáp mô (vỏ nhầy). Đó là một lớp vật chất dạng keo, có độ dày bất định. Vỏ nhầy có hai loại, vỏ nhầy lớn và vỏ nhầy nhỏ. Vỏ nhầy lớn có chiều dày lớn hơn 0,2 m nên thấy được dưới kính hiển vi quang học. Còn vỏ nhầy nhỏ có chiều dày dưới 0,2 m, chỉ quan sát được qua kính hiển vi điện tử.

Thành phần hóa học chủ yếu của vỏ nhầy là nước (98%) và polysaccarit. Ở Mycobacterium màng ngoài cấu tạo từ lipid dạng sáp. Một số vi khuẩn, khi môi trường nuôi cấy cạn dần chất dinh dưỡng vi khuẩn tiêu thụ đến chất dinh dưỡng có trong vỏ nhầy, làm cho vỏ nhầy tiêu biến dần đi.

Vi khuẩn có vỏ nhầy sẽ cho khuẩn lạc tròn ướt, láng trơn, còn vi khuẩn không có vỏ nhầy hoặc dịch nhầy sẽ tạo thành khuẩn lạc khô xù xì. Còn các lớp vi khuẩn có lớp dịch nhầy nhớt sẽ cho những khuẩn lạc nhầy nhớt.

Công dụng của vỏ nhầy là để bảo vệ tế bào vi khuẩn và là nơi tích lũy chất dinh dưỡng của vi khuẩn. Ví dụ phế cầu khuẩn Streptococcus pneumoniae khi có vỏ nhầy sẽ không bị bạch cầu thực bào, còn nếu mất vỏ nhầy sẽ bị thực bào mau lẹ.

Hình 1. 13. Vỏ nhầy của vi khuẩn Acetobacter xylinum

B. Thành tế bào

Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10nm Gram dương là 14-18nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi. Nồng độ đường muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10-20%) do đó tế bào

16

hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ.

Thành tế bào có vai trò trong việc duy trì hình dạng của tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu bên trong tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao, giúp tế bào đề kháng với các lực tác động bên ngoài, điều tiết sự xâm nhập của một số chất, ngăn cản sự thất thoát các enzyme, sự xâm nhập của các chất hóa học hoặc enzyme từ bên ngoài gây hại tế bào, như muối mật, enzyme tiêu hóa, lysozim, chất kháng sinh. Thành tế bào cũng cần thiết cho quá trình phân cắt bình thường của tế bào, có liên quan mật thiết đến tính kháng nguyên, của vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt liên quan đến nội độc tố của vi khuẩn Gram âm và có vai trò trong việc bắt màu thuốc nhuộm khi nhuộm Gram, giúp phân biệt vi khuẩn gram âm và gram dương.

Gram (+) Gram (-)

Hình 1. 14 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

Bảng 1. 1 Thành phần cấu tạo thành tế bào vi khuẩn gram âm và gram dương

Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn Thành phần

G+ G-

Peptidoglycan 30-95 5-20

Acid teicoic Cao 0

Lipid Hầu như không 20

Protein Không hoặc ít Cao

17

Thành tế bào vi khuẩn Gram dương có thành phần cấu tạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn gọi là glucopeptit, murein,...chiếm 95 % trọng lượng khô của thành, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N. acetylglucozamin, N. acetylmuramic và galactozamin. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương chứa PG đầy đủ 4 lớp (chiếm >50% trọng lượng khô của thành). Ngoài ra còn thấy thành phần acid teichoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào.

Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có vách vi khuẩn gồm một màng ngoài và một khoang chu chất chứa 1-2 lớp PG (chiếm 5-10%) trọng lượng khô vách, giữa lớp PG và màng ngoài có cầu nối lipoprotein. Ngoài ra ở màng ngoài còn có thành phần lipopolysaccharit (LPS) và các protein. LPS chiếm 1-50% trọng lượng khô của vách. Phần lipd của LPS là nội độc tố (gây sốt, tiêu chảy, phá hủy hồng cầu)

Trong một số trường hợp có thể không quan sát thấy sự có mặt của thành tế bào:

- Thể nguyên sinh (Protoplast): Sau khi dùng lysozyme để phá vỡ thành tế bào hoặc dùng penicillin ức chế sự tổng hợp thành tế bào có thể chỉ tạo ra những tế bào chỉ được bao bọc bởi màng tế bào chất. Thường gặp ở vi khuẩn G +.

- Thể cầu (tế bào trần, sphaeroplast): là thể nguyên sinh chỉ còn sót lại một phần

thành tế bào, thường chỉ gặp ở vi khuẩn G-.

- Vi khuẩn dạng L: Năm 1935 Viện nghiên cứu dự phòng Lister ở Anh phát hiện ra một dạng đột biến không có thành tế bào ở trực khuẩn Streptobacillus moniliformis. Tế bào của chúng phình to lên và rất mẫn cảm với áp suất thẩm thấu. Nhiều vi khuẩn G -và G+ đều có thể hình thành dạng L. Trước đây người ta hay nhầm lẫn thể nguyên sinh và thể cầu với dạng L. Hiện nay ta chỉ coi dạng L là chủng vi khuẩn không có thành tế bào được sinh ra do đột biến trong phòng thí nghiệm và có thể mang tính di truyền ổn định.

- Mycoplasma: Một dạng vi khuẩn không có thành tế bào được sinh ra trong quá

trình tiến hoá lâu dài của tự nhiên.

- Thể nguyên sinh và thể cầu có đặc điểm chung là không có thành tế bào, tế bào trở nên có hình cầu, rất mẫn cảm với áp suất thẩm thấu, có thể có tiên mao, nhưng không di động được, không mẫn cảm với thực khuẩn thể, không phân bào được,...

C. Màng tế bào chất

Màng tế bào chất còn được gọi là màng tế bào hay màng chất (Cytoplasmic membrane), viết tắt là CM, dày khoảng 7-8 nm, có cấu tạo 3 lớp: hai lớp phân tử protein (chiếm hơn 50% trọng lượng khô của màng và 10-20% protein tế bào) và một lớp kép photpholipit (20-3% trọng lượng khô của màng) nằm ở giữa, 70-90% lipid của tế bào tập trung ở photpholipit của màng. Sự phân bố protein và photpholipit ở màng nguyên sinh chất

18

khác nhau ở từng vùng. Sự phân bố đó tạo nên các lỗ hổng trên màng thuận lợi cho sụ vận chuyển.

Hình 1. 15 Cấu trúc màng tế bào

Protein của màng gồm có hai dạng: protein cấu trúc và enzyme. Enzyme gồm có: permeaza vận chuyển các chất vào tế bào và các enzyme tổng hợp các chất murein, photpholipit, LPS,...

Hai lớp phosphor lipid (PL), chiếm khoảng 30-40% khối lượng và các protein nằm phía trong, phía ngoài hay xuyên qua màng chiếm 60-70% khối lượng. Mỗi phân tử PL chứa một đầu tích điện hay phân cực (đầu phosphate) và một đuôi không tích điện hay không phân cực (hydrat carbon). Đầu phosphate còn gọi là đầu háu nước, còn đầu hidratcarbon còn gọi là đầu kỵ nước. Hai lớp phân tử PL một lớp có gốc phosphat quay vào trong một lớp có gốc phosphat quay ra ngoài màng làm màng hóa lỏng và cho phép các protein di động tự do. Sự hóa lỏng động học này cần thiết cho các chức năng của màng. Cách sắp xếp của PL như vậy gọi là mô hình khảm lỏng.

Hầu hết màng tế bào chất của vi khuẩn không chứa các sterol, như cholesterol, do đó không cứng như màng tế bào của các tế bào có nhân thật. Màng tế bào là hàng rào đối với các phân tử tan trong nước và có tính chọn lọc hơn so với thành tế bào. Tuy vậy màng tế bào có

19

chứa các protein đặc biệt gọi là permease, chúng có thể vận chuyển các phân tử nhỏ vào tế bào theo cơ chế thụ động không cần năng lượng hay chủ động, cần năng lượng.

Nhìn chung màng tế bào có các chức năng sau: Duy trì áp suất thẩm thấu tế bào, khống chế sự vận chuyển, trao đổi ra vào tế bào của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất, duy trì một áp suất thẩm thấu bình thường bên trong tế bào, là nơi sinh tổng hợp một số thành phần của tế bào như vách, giáp mô, do trong màng có chứa enzyme và ribosom, là nơi tiến hành các quá trình photphoril oxy hoá và photphoril quang hợp, cung cấp năng lượng cho hoạt động của tiên mao và có quan hệ đến sự phân chia tế bào.

D. Tế bào chất (Cytoplasm)

Tế bào chất hay nguyên sinh chất là toàn bộ phần nằm trong màng tế bào trừ nhân. Đây là vùng dịch thể dạng keo đồng nhất khi tế bào non và có cấu trúc lổn nhổn khi tế bào già. Tế bào chất có hai bộ phận chính: Cơ chất tương bào: chủ yếu chứa các enzyme và các bào quan: mesosom, ribosom, không bào, hạt sắc tố, chất dự trữ.

E. Mesosome

Là thể hình cầu giống như cái bong bóng, mesosome có đường kính khoảng 250nm, gồm nhiều lớp bện chặt với nhau, nằm sát vách tế bào chỉ xuất hiện khi tế bào phân chia. Hình thành vách ngăn tế bào trong phân bào và là trung tâm hô hấp của tế bào vi khuẩn hiếu khí. Trong mesosome có nhiều hệ thống enzym vận chuyển điện tử.

Hình 1. 16 Vị trí của mesosome trong tế bào

F. Ribosome

Ribosome có đường kính 15-20nm, hằng số lắng 70S (tiểu thể lớn 50S và tiểu thể nhỏ 30S). Ribosome chứa 40-60% ARN và 35-60% protein và một ít lipid, một số men như ribonuclease ,... và một ít chất khoáng. Mỗi tế bào chứa khoảng 10000 ribosome chiếm 40% trọng lượng khô tế bào, khi đang phát triển mạnh có thể tăng đến 15000 ribosome (E. coli). Phần protein của ribosom làm thành một mạng lưới bao quanh phần ARN. Trong tế bào vi

20

khuẩn, phần lớn ribosome nằm tự do trong tế bào chất, phần ít bám trên màng nguyên sinh chất.

Hình 1. 17 Cấu trúc Ribosome của prokaryote và eukaryote

Ribosome là trung tâm tổng hợp protein của tế bào. Nhưng không phải mọi ribosome đều có khả năng tham gia vào quá trình này. Số ribosome tham gia vào quá trình này chiếm khoảng 5-10% và được liên kết với nhau gọi là polisome hay polyribosome. Sự liên kết này thực hiện được nhờ mARN. Quá trình tổng hợp protein này được gọi là sự dịch mã.

G. Các hạt dự trữ

Trong nguyên sinh chất thấy xuất hiện các hạt có hình dạng, kích thước và thành phần hóa học khác nhau. Sự xuất hiện của các hạt này không thường xuyên, phụ thuộc vào điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển của tế bào, đó là các hạt dự trữ hạt vùi không phải là các cơ quan con như ribosome, mesosome,...Chúng có hình dạng và kích thước khác nhau và sự có mặt của chúng không ổn định, phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh. Nhiều loại hạt được vi sinh vật sử dụng như các chất dự trữ. Chúng thường được hình thành khi tế bào tổng hợp thừa các chất đó và được sử dụng khi thiếu thức ăn.

 Các hạt hydrat carbon: các hạt này chứa tinh bột hoặc glycogen hoặc các chất tương tự nằm trong tế bào chất như những chất dự trữ. Khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ lấy các hạt này làm nguồn năng lượng hoặc nguồn thức ăn carbon.

 Hạt volutin: đây là các chất dị nhiễm sắc (bắt màu đỏ khi nhuộm xanh metylen trong khi tế bào chất bắt màu xạnh). Trừ một số vi khuẩn (như Corynebacbacterium, Mycobacterium,...) thường xuyên chứa các hạt volutin ở giai đoạn sinh trưởng cuối, còn thông thường vi sinh vật chỉ chứa hạt volutin trong điều kiện dinh dưỡng bất thường (thiếu chất nào đó). Volutin là một phức chất, cấu tạo bởi polyphosphat, lipoprotein, ARN và Mg+2. Trong số các hạt volutin có thể có là giọt mỡ, xuất hiện nhiều khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường chứa nhiều đường, glycerin hoặc các hợp chất carbon đễ đồng hóa khác.

21

H2S + 1/2O2 S + H2O + Q1

2S + 3O + H O

2H SO + Q2

 Giọt lưu huỳnh: Một số vi khuẩn ưu lưu huỳnh, có chứa thường xuyên các giọt lưu huỳnh trong tế bào, do kết quả oxy hóa H2S sinh ra. Giọt lưu huỳnh được dùng làm nguồn năng lượng khi đã sử dụng hết H2S của môi trường xung quanh.

 Tinh thể diệt côn trùng: Trong một vài vi khuẩn có thể chứa thêm một tinh thể đặc biệt. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis hoặc B. dendrolimus,... Các tinh thể đặc biệt này có khả năng giết hại một số côn trùng phá hoại mùa màng. Hiện nay, người ta sử dụng các vi khuẩn này trong công tác bảo vệ thực vật để chống lại một số sâu trong nông nghiệp. Ví dụ sản phẩm BT tức là vi khuẩn B. thuringiensis có khả năng giết sâu tơ trên cải bắp.

 Không bào khí: Các vi khuẩn quang hợp thủy sinh không có tiên mao, chứa các không bào khí trong tế bào chất. Chúng được bao bọc bởi một lớp màng protein dày khoảng 2 nm, không bào khí đóng vai trò điều tiết tỷ trọng để tế bào nổi lên những tầng nước thích hợp. Thường gặp ở các chi vi khuẩn như Halobacterium, Penlodictyon, Rhodopseudomonas, các chi vi khuẩn lam như: Anabaena.

H. Thể nhân (nuclear body)

Thể nhân là một cấu trúc ADN kép, xoắn lại khép kín thành hình cầu, hình que, hình quả tạ hay hình chữ V. Nhân tiếp xúc trực tiếp với nguyên sinh chất, liên kết với protein HU (tương tự histon) và gắn vào màng tế bào. Nhân phân chia đơn giản bằng cách thắt lại không có sự gián phân bởi vì nhân vi khuẩn là một nhiễm sắc thể duy nhất. Tế bào vi khuẩn ở thời kỳ ổn định chỉ có một nhân nhưng trong quá trình tiền phân bào thì có từ 2 - 4 nhân.

Thể nhân là nhân nguyên thủy chưa có màng nhân, đặc trưng cho các cơ thể thuộc giới Monera (hay Prokaryota). Thể nhân còn gọi là vùng nhân, thể giống nhân, khi nhuộm bằng thuốc thử Feulgen hoặc Shiff có thể quan sát thấy thể nhân có hình dạng bất định, bắt màu tím. Thể nhân của vi khuẩn là một nhiễm sắc thể duy nhất cấu tạo bởi một sợi ADN xoắn kép, rất dài và cuộn lại thành hình vòng tròn. Nhân tế bào vi khuẩn không phân hóa thành khối rõ rệt còn gắn với màng tế bào chất. Như vậy, phần lớn các tế bào của các vi sinh vật có nhân nguyên thủy là tế bào đơn bội. NST của vi khuẩn có chiều dài thay đổi trong khoảng 0,25-3m và chứa 6,6-13x106cặp base nitơ, số lượng hệ gen của vi khuẩn thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy tĩnh tế bào E. coli chứa 1-4 genom (bộ gen). Ngoài NST, nhiều vi khuẩn còn chứa ADN ngoài NST, đấy cũng là những sợi ADN kép, dạng vòng kín, có khả năng sao chép độc lập gọi là plasmid.

22

Hình 1. 18 Thể nhân và plasmid trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli

I. Tiêm mao (Flagella) và nhung mao (Pilus)

Một số loại vi khuẩn có khả năng di động một cách chủ động nhờ những cơ quan đặc

biệt gọi là tiêm mao hay còn gọi là tiêm mao.

Vi khuẩn có thể có tiêm mao hoặc không có tiêm mao tùy từng chi. Tiêm mao là những sợi nguyên sinh chất rất mảnh, rộng khoảng 0,01-0,05 m, cấu tạo từ các sợi protein bện xoắn vào nhau. Các sợi protein này khác với protein màng và có tính kháng nguyên H. Trên bề mặt thành tế bào các sợi protein này liên kết với các protein khác của vách tế bào. Phần lõi của tiêm mao gắn chặt với nền vách tế bào và màng nguyên sinh chất bởi một (ở vi khuẩn Gram dương) hoặc hai (ở vi khuẩn Gram âm) đôi vòng nhẫn. Nhờ vòng nhẫn này xoay, tiêm mao quay quanh trục của nó và làm cho vi khuẩn di động. Nguồn năng lượng này nhờ ATP hoặc thế năng điện hóa học trong và ngoài màng. Nhiệm vụ chính của tiêm mao là giúp cho vi khuẩn di dộng một cách chủ động.

Tùy theo số lượng của tiêm mao người ta chia vi khuẩn thành các loại sau:

Không có tiêm mao (vô mao khuẩn): không di động một cách chủ động được. Tiêm mao mọc ở đỉnh: một tiêm mao mọc ở một đỉnh (đơn mao khuẩn). Ví dụ: vi

Có thể là một chùm tiêm mao mọc ở đỉnh (chùm mao khuẩn). Ví dụ: Pseudomonas

- - khuẩn Xanthomonas campestris. - solanacearum. - - Mỗi đỉnh có một chùm tiêm mao. Ví dụ: Spirillum volutans. Tiêm mao mọc xung quanh (chu mao khuẩn): Ví dụ: Escherichiae,...

23

Hình 1. 19 Các dạng và cấu trúc tiêm mao ở vi khuẩn.

(a) Đơn mao, (b) Song mao, (c) Chùm mao, (d) Chu mao

Cấu tạo của tiêm mao: Nhờ kính hiển vi điện tử, chúng ta có thể quan sát được cấu tạo các tiêm mao của vi khuẩn. Tiêm mao xuất phát từ lớp ngoại nguyên sinh chất, phía bên trong màng nguyên sinh chất. Gốc tiêm mao có hai hạt: gốc có đường kính 40 nm, kế đó là các móc để tiêm mao đính vào tế bào vi khuẩn, đường kính của móc lớn hơn đường kính của tiêm mao. Quan sát một số tế bào vi khuẩn. Ví dụ: như xoắn thể (Spirillum), tiêm mao do nhiều sợi nhỏ xoắn lại với nhau.

Tốc độ và kiểu di động của vi khuẩn không giống nhau tùy loài và tùy vị trí của tiêm mao. Các loại vi khuẩn có tiêm mao mọc ở một đầu có tốc độ di chuyển mạnh mẽ nhất (60 - 120 m/giây). Nhìn chung các loài vi khuẩn khác di chuyển chậm hơn khoảng 2 - 10 m/giây. Vi khuẩn có tiêm mao ở một đầu di chuyển theo một hướng rõ rệt, nhưng vi khuẩn tiêm mao chu mao thì lại di chuyển theo một kiểu quay lung tung.

Sự có mặt hay không và số lượng, vị trí tiêm mao là một yếu tố để định tên của vi khuẩn. Có nhiều vi khuẩn giống hệt nhau về hình thái nhưng khác nhau về khả năng di động hoặc về vị trí sắp xếp của tiêm mao. Tuy nhiên, điều kiện môi trường và thời gian nuôi cấy có thể ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng di động của các loài vi khuẩn có tiêm mao. Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá, pH môi trường, nồng độ muối, nồng độ đường, sự có mặt của chất độc, các sản phẩm trao đổi chất của bản thân vi khuẩn, tác động của năng lượng bức xạ,... không những ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển mà còn làm đình chỉ hẳn sự di chuyển của vi khuẩn. Đối với vi khuẩn không có tiêm mao, trong môi trường lỏng chúng vẫn có thể chuyển động hỗn loạn do hiện tượng va chạm không ngừng của các phân tử vật chất trong chất lỏng (chuyển động Brown)

Ngoài tiêm mao, một số vi khuẩn còn có sợi pili, đó là những sợi tiêm mao rất ngắn và mảnh khoảng 0,3-1m, đường kính khoảng 0,01 m và thường có khoảng 100-400 sợi

24

trên một tế bào. Pili không phải là cơ quan di động mà là phương tiện giúp cho vi khuẩn bám được tốt trên bề mặt của cơ chất. Pili còn có thể tham gia vào quá trình dinh dưỡng của vi khuẩn, giúp cho bề mặt tế bào hấp thu chất dinh dưỡng lên rất nhiều lần.

Ngoài ra ở một số vi khuẩn có một số sợi pili (nhung mao) sinh dục có nhiệm vụ tiếp nhận các đoạn ADN từ bên ngoài vào, trong trường hợp có trao đổi tín hiệu di truyền, nhất là trong lúc hai vi khuẩn tiếp hợp nhau. Nhung mao còn là chỗ bám cho thực khuẩn thể. Số lượng nhung mao thông thường có hàng trăm nhưng nhung mao sinh dục thì chỉ có 1-5 mà thôi.

Nha bào là một một kết cấu do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Mỗi tế bào chỉ có thể tạo ra một nha bào. Thường gặp nha bào ở hai chi trực khuẩn Gram dương là Bacillus và Clotridium. Một số loài trong phẩy khuẩn (Dessulft-vibrio desulfuricans), cầu khuẩn (Sarcina ureae), xoắn khuẩn (Spirillium volutans) cũng có khả năng sinh nha bào.

Nha bào của Bacillus không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn, do đó khi vi khuẩn mang nha bào vẫn không thay đổi hình dạng. Ví dụ: Trực khuẩn gây bệnh nhiệt thán Bacillus anthracis, trực khuẩn sinh chất kháng sinh Bacillus subtillis.

Nha bào Clostridium chiều ngang của nha bào thường lớn hơn chiều ngang của tế bào vi khuẩn, nên khi mang nha bào vi khuẩn bị biến đổi hình dạng như hình thoi, hình vợt, hình dùi trống. Clostridium là loại vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.

Dưới kính hiển vi điện tử, nha bào có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng ngoài của nha bào. Kế đó là lớp vỏ của nha bào gồm nhiều lớp, có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước. Dưới đó là lớp màng trong và trong cùng là lớp khối tế bào chất có cấu tạo đồng nhất.

Nha bào không giữ nhiệm vụ sinh sản như ở các ngành vi sinh vật khác mà chỉ giữ chức năng lưu tồn mà thôi. Nha bào có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống, nha bào có khả năng sống rất lâu. Nhiệt độ 1000C, nha bào của một số loài của Bacillus có thể chịu được từ 2,5-20 giờ. Nha bào của vi khuẩn có thể chịu được 1000C trong 5 ngày liền. Muốn tiêu diệt nha bào của vi khuẩn phải thanh trùng ở 1210C trong 15-30 phút với nhiệt độ ướt hoặc 165-170 0C trong 2 giờ với nhiệt độ khô. Ngoài việc chịu được nhiệt độ khô cao, nha bào có thể chịu được khô hạn cũng như tác động của nhiều loại hóa chất, cũng như các loại tia sáng. Trong HgCl2 tế bào vi khuẩn chết ngay nhưng nha bào sống được đến hai giờ.

25

Quá trình hình thành nha bào: Các tế bào sinh nha bào khi gặp điều kiện thiếu thức ăn, hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành nha bào. Về mặt hình thái học, có thể chia quá trình hình thành nha bào ra làm các giai đoạn:

- Hình thành những búi chất nhiễm sắc. - Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử. - Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ. - Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều

PG và tổng hợp ADP, tích lũy canci, tính chiết quang cao.

- Kết thúc việc hình thành áo nha bào. - Kết thúc việc hình thành vỏ nha bào. Nha bào thành thục, bắt đầu có tính kháng

nhiệt.

- Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài.

Hình 1. 20 Cấu tạo và quá trình hình thành nha bào ở vi khuẩn

Nha bào được bao bọc bởi nhiều lớp màng. Ngoài cùng là màng ngoài. Dưới đó là lớp vỏ, vỏ bào tử gồm nhiều lớp, không thấm nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử. Trong cùng là khối tế bào chất có cấu tạo đồng nhất, thành phần hóa học của nha bào: nước chiếm 40% ở dạng liên kết, nhiều ion Ca+2, acid dipicolinic (acid này chỉ có ở nha bào).

Nha bào của vi khuẩn không chứa chức năng của cơ quan sinh sản như bào tử của sinh vật khác. Đây là hình thức sống tiềm sinh của vi khuẩn. Bào tử giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi của ngoại cảnh. Bào tử thường được sinh ra trong điều kiện khó khăn như thiếu thức ăn, nhiệt độ và pH không thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất có hại,... Một số nha bào đóng vai trò truyền bệnh (như than, uốn ván, hoại thư sinh hơi, ngộ độc thức ăn,...). Làm vô hoạt nha bào của một số vi khuẩn loại này là nguyên tắc để chế ra một số vaccin.

26

1.3.3. Hình thái, cấu tạo tế bào của Xạ khuẩn

1.3.3.1 Định nghĩa và vai trò của Xạ khuẩn

Xạ khuẩn (danh pháp khoa học: Actinobacteria; tiếng Anh: Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trước kia được xếp vào Tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes). Chúng là nhóm vi sinh vật đơn bào (có giai đoạn đa bào), dạng sợi hình tia phóng xạ, có kích thước và cấu trúc tương tự như tế bào vi khuẩn thông thường, đa số sống hiếu khí hoại sinh trong đất, gram dương. Với đặc điểm kích thước nhỏ, cơ thể đơn bào hoặc đa bào, thể nhân là nhân nguyên thủy, vách tế bào không chứa cellulose, kitin nên xạ khuẩn được xếp vào nhóm prokaryote.

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có vai trò quan trọng về nhiều mặt:

+ Tham gia vào quá trình phân giải mạnh các hợp chất hữu cơ kể cả các chất phức tạp như celluose, kitin, keratin, pectin, linhin,...trong đất bùn do đó làm tăng độ phì của đất và góp phần làm cân bằng các thành phần vật chất trong tự nhiên.

+ Hầu hết các xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces có khả năng sinh kháng sinh, nhiều kháng sinh quan trọng hiện nay được chiết suất từ xạ khuẩn như: tetraciclin, streptomycin, chloramphenicol,...một số kháng sinh sản xuất từ xạ khuẩn có tác dụng diệt côn trùng hay tuyến trùng,...

+ Một số xạ khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh các chất sinh học như vitamin nhóm

B, một số acid hữu cơ hay các enzyme như proteaza, ammylaza, kitinaza,...

+ Một số xạ khuẩn có thể gây hại cho các vi sinh vật trong đất do nó tiết độc tố phytotoxin. Một số có khả năng gây bệnh cho người, gia súc được gọi chung là bệnh Actinomycose.

1.3.3.2 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có kết cấu tế bào dạng sợi-khuẩn ty, có đường kính trong khoảng 1-1.5 m, đa số là khuẩn ty không có vách ngăn. Nuôi cấy trên môi trường đặc có thể phân biệt được ba loại khuẩn ty:

- Khuẩn ty cơ chất (ăn sâu vào trong môi trường làm nhiệm vụ hấp thụ chất dinh

dưỡng) còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng.

- Khuẩn ty trên cơ chất phát triển trên bề mặt môi trường

27

- Khuẩn ty khí sinh mọc lộ ra khỏi bề mặt môi trường. Đôi khi xạ khuẩn không có khuẩn ty cơ chất hoặc khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất hoặc khí sinh thường phân hóa thành các cành bào tử, chúng tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn.

Hình 1. 21. Cấu tạo của xạ khuẩn

Khuẩn lạc xạ khuẩn rắn chắc, bề mặt xù xì, thô ráp, dạng có phấn, có dạng nhăn, dạng vòi, dạng nhung tơ hay dạng màng xơ, các nếp nhăn thường có dạng phóng xạ hay dạng đồng tâm đường kính 0.5-10 .. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có màu sắc rất đẹp: trắng, đỏ, vàng, nâu, xanh, hồng tím,... đây là tiêu chí quan trọng trong định tên xạ khuẩn.

Hình 1. 22 Khuẩn lạc và vòng đời của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử. Sau một thời gian dài phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các sợi bào tử với nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, lượn, xoắn, mọc

28

đơn, mọc vòng ….Bào tử xạ khuẩn được hình thành theo 3 phương thức. Hình thành từ toàn bộ thành khuẩn ty, hình thành tử tầng giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty, hoặc bào tử thật được sinh ra không có vai trò của thành khuẩn ty. Hầu hết các bào tử này là bào tử trần, có thể hình tròn, hình que, hình bầu dục ….

1.3.4 Hình thái, cấu tạo của vi khuẩn lam

1.3.4.1 Định nghĩa và vai trò của vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam (danh pháp khoa học: Cyanobacteria), từng thường bị gọi sai là tảo lam hay tảo lục lam, là một ngành vi khuẩn có khả năng quang hợp và cố định đạm, sinh sống trong nhiều môi trường sống khác nhau, kể cả đất đá hay nước. Trong nhóm này, các sinh vật quang hợp có màu là cyanophycin, allo-phycocyanin và erythro-phycocyanin. Tản của chúng biến động từ đơn bào tới tế bào dạng sợi hay dị bào dạng sợi. Chúng cố định nitơ trong khí quyển trong các điều kiện ưa khí hay kị khí bằng các dị bào. Những loài vi khuẩn này đã có mặt trên Trái đất cách đây khoảng 3,8 tỉ năm và đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sinh địa hoá tự nhiên.

Một số loài vi khuẩn lam là các sinh vật nội cộng sinh trong địa y, thực vật, các dạng sinh vật nguyên sinh hoặc bọt biển và có vai trò cung cấp năng lượng cho sinh vật chủ. Một số loài còn sinh sống trên lông của một số loài thú, như những con lười, và tạo ra một dạng ngụy trang cho các động vật này.

Bảng 1. 2 So sánh cấu tạo khuẩn lam với vi khuẩn

Cấu tạo tế bào Khuẩn lam (tỉ lệ) Vi khuẩn (tỉ lệ)

Nhân 32% 29%

Không bào 45% 49%

Vách tế bào 99% 89%

Chất tế bào 71% 62%

Màng sinh chất 12% 7%

Bào quan chứa chất diệp lục 98% 1%

1.3.4.2 Đặc điểm cấu tạo

Nhiều loài vi khuẩn lam tạo thành các tế bào ở dạng sợi có khả năng di động, gọi là hormogonium, có thể tách ra khỏi sinh khối chính để sinh sôi và hình thành các tập đoàn mới ở nơi khác. Các tế bào trong hormogonium thường mỏng hơn so với các tế bào ở trạng thái sinh dưỡng, và các tế bào ở bất kỳ đầu nào của chuỗi di động đều có thể thon nhỏ. Nhằm tách ra

29

khỏi tập đoàn cha, hormogonium thường đứt ra ở tế bào yếu hơn cả trong sợi, gọi là necridium.

Mỗi tế bào riêng rẽ của vi khuẩn lam thường có vách tế bào dày dạng keo gelatin. Chúng không có lông roi (tiên mao), nhưng các hormogonium của một số loài có thể di chuyển bằng cách trượt dọc theo các bề mặt. Nhiều dạng sợi đa bào của Oscillatoria có khả năng chuyển động theo dạng sóng; với sợi dao động tới và lui. Trong các cột nước một số vi khuẩn lam trôi nổi bằng cách tạo ra các bọng khí, như ở vi khuẩn cổ (Archaea). Các bọng này không là các cơ quan tử như vậy. Chúng không bị ràng buộc bằng các màng lipit mà là bằng một màng protein.

Hình 1. 23 Cấu tạo tế bào vi khuẩn lam

Tế bào vi khuẩn lam được bao bọc bời lớp màng nhày có cấu tạo hóa học chủ yếu là polysaccharide giống với capsule của vi khuẩn. Thành tế bào là lớp lưới murein gồm nhiều lớp glycopeptide, gần giống với thành tế bào của vi khuẩn gram dương. Cấu trúc màng nguyên sinh chất cũng giống vi khuẩn, gốm 3 lớp với lớp trong và lớp ngoài cấu tạo chủ yếu là protein còn lớp giữa là phospholipid. Tế bào chất là dịch keo trong suốt có chứa hạt ribosome, volutine, không bào, glycopeptide (sản phẩm quang hợp chủ yếu của vi khuẩn lam, glycopeptide gần giống với glycogen. Không bào của vi khuẩn lam chứa đầy khí nitơ.

Vi khuẩn lam thường có màu sắc khác nhau do chứa các nhóm sắc tố là diệp lục tố, carotenoid và phytocobilin. Ở các tế bào dị hình, có thành dày, oxi không xâm nhập, có khả năng cố định Nito tự do: enzim notrogenaza, ATP, kị khí ..

30

1.4. Vi sinh vật nhân thật- EUKARYOTE

1.4.1 Định nghĩa

Sinh vật nhân thực còn gọi là sinh vật nhân điển hình hoặc sinh vật có nhân chính thức (danh pháp: Eukaryote) là một nhóm các sinh vật gồm các tế bào phức tạp, trong đó vật liệu di truyền được sắp đặt trong nhân có màng bao bọc. Eukaryote là chữ Latin có nghĩa là có nhân thật sự.

Các sinh vật này thường lớn gấp 10 lần (về kích thước) so với sinh vật nhân sơ, do đó gấp khoảng 1000 lần về thể tích. Điểm khác biệt quan trọng giữa sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn là tế bào nhân chuẩn có các xoang tế bào được chia nhỏ do các lớp màng tế bào để thực hiện các hoạt động trao đổi chất riêng biệt. Trong đó, điều tiến bộ nhất là việc hình thành nhân tế bào có hệ thống màng riêng để bảo vệ các phân tử ADN của tế bào. Tế bào sinh vật nhân chuẩn thường có những cấu trúc chuyên biệt để tiến hành các chức năng nhất định, gọi là các bào quan.

Hình 1. 24 Cấu tạo tế bào Prokaryote và Eukaryote

 Tế bào chất của sinh vật nhân chuẩn thường không nhìn thấy những thể hạt như ở sinh vật

nhân sơ vì rằng phần lớn ribosome của chúng được bám trên mạng lưới nội chất.

 Màng tế bào cũng có cấu trúc tương tự như ở sinh vật nhân sơ tuy nhiên thành phần cấu tạo chi tiết lại khác nhau một vài điểm nhỏ. Chỉ một số tế bào sinh vật nhân chuẩn có thành tế bào.

 Vật chất di truyền trong tế bào sinh vật nhân chuẩn thường gồm một hoặc một số phân tử ADN mạch thẳng, được cô đặc bởi các protein histone tạo nên cấu trúc nhiễm sắc thể. Mọi

Các đặc trưng gồm:

31

 Một vài tế bào sinh vật nhân chuẩn có thể di chuyển nhờ tiêm mao hoặc tiên mao. Những

phân tử ADN được lưu giữ trong nhân tế bào với một lớp màng nhân bao bọc. Một số bào quan của sinh vật nhân chuẩn có chứa ADN riêng.

tiên mao thường có cấu trúc phức tạp hơn so với sinh vật nhân sơ.

Sinh vật nhân thực gồm có động vật, thực vật và nấm. Cấu tạo hiển vi bao gồm nấm men,

nấm mốc, vi tảo và động vật nguyên sinh.

1.4.2. Hình thái, cấu tạo tế bào của Nấm men

1.4.2.1 Định nghĩa và vai trò của nấm men

Nấm men là các loài nấm đơn bào phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong môi trường có chứa đường, pH thấp như hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường … Chúng có thể sống trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí. Trong điều kiện thiếu oxi, nấm men có thể tạo ra năng lượng cho chúng bằng con đường chuyển hóa carbohydrate thành carbon dioxit và ethanol. Hiện nay đã có hơn 1000 loài nấm men được miêu tả, hầu hết thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota), số ít thuộc ngành Nấm đảm (Basidomycota). Loài men sử dụng phổ biến nhất là Saccaromyces cerevisiae dùng trong sản xuất rượu vang, bánh mì, bia từ hàng ngàn năm trước.

Đặc điểm chung của nấm men bao gồm:

     Tồn tại dạng đơn bào hoặc tập hợp đơn bào Sinh sản bằng bào tử theo hình thức nảy chồi Có khả năng lên men đường Thành tế bào có chứa mannan Thích nghi với môi trường chứa đường và acid cao.

1.4.2.1 Đặc điểm cấu tạo

Tế bào nấm men có cấu tạo gần giống tế bào vi khuẩn, tuy có cấu tạo đơn bào nhưng nhưng cũng mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống, chúng có cấu tạo từ màng, nguyên sinh chất và nhân gồm các phần sau:

32

Hình 1. 25 Cấu tạo tế bào nấm men

A. Thành tế bào

Thành tế bào nấm men dầy 25nm (chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào). Thành tế bào có cấu trúc nhiều lớp như vỏ vi khuẩn nhưng thành phần hóa học chủ yếu là glucan (cấu tạo bởi các gốc D-glucoza) và mannan (D-manoza). Tỷ lệ Glucan và manan chiếm 90% trọng lượng vỏ trong đó mannan cao thấp hoặc không có. Thành phần khác có protein 6-7%, hexozamin và phần còn lại là lipid, poliphotphat, các chất chứa kitin.

Hình 1. 26 Cấu trúc vách tế bào nấm men

B. Màng tế bào

Tương tự như màng nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn về thành phần cấu tạo và chức

năng tác dụng. Ngoài ra màng tế bào nấm men còn hoạt hóa ty thể.

33

Hình 1. 27 Cấu trúc màng tế bào nấm men

C. Nguyên sinh chất

Thành phần hóa học, cấu trúc nguyên sinh chất tương tự như vi khuẩn nhưng sự khác nhau chủ yếu là là sự tồn tại vài loại cơ quan con khác. Nguyên sinh chất của nấm men gồm có các bào quan sau:

* Ty thể (Mitochondria)

Khác với tế bào vi khuẩn nấm men đã có ty thể. Đây là những thể hình cầu, hình que, hình sợi nhưng hình dạng và số lượng có thể thay đổi khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lý tế bào. Là những thể hình cầu, hình que, hình sợi, kích thước 0,2-0,5 x 0,4-1 m luôn luôn di động và tiếp xúc với các cấu trúc khác của tế bào. Hình dạng và số lượng ty thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lý tế bào.

34

Hình 1. 28 Cấu trúc ty thể tế bào nấm men

Cấu tạo ty thể gồm hai lớp màng: Lớp màng trong có hình lượn sóng hay hình răng lược để tăng diện tiếp xúc với cơ chất, trong có chứa dịch. Giữa hai lớp có các hạt nhỏ bám trên màng là những hạt cơ bản. Bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ.

Chức năng của ty thể: nó được coi như là trạm năng lượng của tế bào nấm men.

+ Tham gia vào việc thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lượng ra khỏi cơ

chất, làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP.

+ Giải phóng năng lượng khỏi ATP và chuyển năng lượng đó thành dạng năng lượng có

ích cho hoạt động sống của tế bào.

+ Tham gia vào việc tổng hợp một số hợp chất protein, lipid, hydratcacbon, những hợp

chất này tham gia vào cấu tạo màng tế bào.

Ngoài ra ty thể còn chứa nhiều loại men khác nhau như: oxidase, cytocromoxidase,

peroxidase, phosphatase,...

* Ribosome: số lượng ribosome thường thay đổi tùy thuộc từng loài, từng giai đoạn phát triển và từng điều kiện nuôi cấy. Khác với vi khuẩn nấm men có hai loại ribosome trong nguyên sinh chất của nấm men:

Loại 70S tồn tại chủ yếu trong ty thể, loại 80S tồn tại chủ yếu trong mạng lưới nội chất

và một số ít tồn tại ở trạng thái tự do. Loại 80S có hoạt tính tổng hợp protein mạnh hơn.

* Không bào: mỗi tế bào nấm men có một không bào khá lớn và nhiều không bào nhỏ có tác dụng điều hòa áp suất thẩm thấu, tham gia vào quá trình trao đổi chất tế bào vì nó chứa nhiều hợp chất hữu cơ ở trạng thái trung gian, nó được coi như những phần dự trữ quan trọng của tế bào, nó tham gia vào các quá trình điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm. Hạt dự trữ: hạt lipid, hạt glycogen và một ít hạt tinh bột khác.

* Lưới nội chất

Mạng nội chất được phát hiện vào năm 1945 dưới kính hiển vi đối pha. Kính hiển vi điện tử cho thấy mạng nội chất nối liền với màng ngoài của nhân ở một số vị trí. Mạng nội chất giống như một hệ thống ống và túi, tròn hay dẹp, thông thương với nhau và có màng bao quanh. Khoảng giữa hai màng của túi, ống được gọi là khoang. Ở hầu hết tế bào, mặt ngoài của mạng nội chất có các ribosom gắn vào, khi đó nó được gọi là mạng nội chất nhám, nơi không có các ribosom được gọi là mạng nội chất trơn.

35

Hình 1. 29 Cấu tạo mạng lưới nội chất tế bào nấm men

Màng của mạng nội chất là nơi chứa các protein và các protein này có cả hai chức năng, vừa là thành phần cấu trúc vừa là enzim xúc tác các phản ứng hóa học. Mạng nội chất còn có nhiệm vụ như một xưởng chế tạo, các enzim của chúng xúc tác sự tổng hợp các phospholipid và cholesterol được dùng để tạo ra màng mới hay các protein màng được tổng hợp bởi riboxom trên mạng nội chất là thành phần của màng lipid mới.

* Bộ Golgi

Hình 1. 30 Cấu trúc bộ Golgi

Bộ Golgi (do Camillo Golgi, người đầu tiên mô tả vào năm 1898) gồm một hệ thống túi dẹp có màng bao và xếp gần như song song nhau. Mặt phía gần nhân được gọi là mặt cis, phía đối diện là mặt trans. Các túi chuyên chở chứa bên trong lipid và protein mới được tổng hợp, được tách ra từ màng của mạng nội chất hòa vào các túi dẹp của bộ Golgi ở mặt cis. Các

36

chất này vào trong bộ Golgi được biến đổi, sắp xếp lại và sau đó các túi mới được tách ra từ mặt trans. Các túi này vận chuyển các phần tử đến các bào quan khác và màng sinh chất, đôi khi các túi được chuyển đến glycocalyx.

Các túi được tách ra từ bộ Golgi có vai trò quan trọng làm tăng bề mặt của màng tế bào. Khi túi được chuyển đến bề mặt của màng sinh chất, chúng sẽ được gắn vào màng này, sau đó vỡ ra và phóng thích nội dung ra bên ngoài tế bào trong quá trình ngoại xuất bào, một phần hay tất cả màng của túi được hòa vào màng sinh chất hay trở về bộ Golgi.

Hình 1. 31 Hoạt động kết hợp của Golgi và lysosome trong tế bào

* Lysosome

Lysosome là những khối hình cầu đường kính từ 0,2 - 0,4m, có khi lớn đến 1 - 2m. Lysosome được bao bởi một màng lipoproteide. Lysosome chứa những enzyme thuỷ phân có vai trò tiêu hóa nội bào.

d. Nhân tế bào

Nhân của tế bào nấm men là nhân thật, nhân đã có sự phân hóa, có kết cấu hoàn chỉnh và ổn định, có màng nhân. Nhân có hình tròn hay hình bầu dục, bắt đầu có những biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là phân chia theo hình thức gián phân. Màng nhân, gồm hai lớp có nhiều lỗ thủng (ở tế bào nấm men già, trên mỗi tế bào có khoảng 200 lỗ chiếm 6-8 % diện tích màng), trong có chất nhân, hạch nhân và các nhiễm sắc thể (Chromosome).

37

Hình 1. 32 Cấu trúc nhân và lỗ màng nhân của tế bào nấm men

Như vậy tế bào nấm men thuộc sinh vật cao đẳng. Thành phần hóa học quan trọng nhất của nhân là nucleoprotein và các enzyme. Nhân có vai trò chủ yếu là mang hệ thống thông tin di truyền chứa trong ADN, điều khiển việc tổng hợp các protein của mỗi loài, điều khiển việc tổng hợp các enzyme điều khiển hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động sống khác của tế bào.

Muốn quan sát nhân tế bào nấm men người ta thường xử lý tiêu bản bằng dung dịch picrophocmol, dung dịch FeNH4(SO4) 3% và dung dịch hematoxilin 10% khi đó nguyên sinh chất sẽ nhuộm màu tro còn nhân nhuộm thành màu đen.

e. Plasmid

Có một loại plasmid được phát hiện năm 1976 ở nấm men Saccharomyces cerevisiae được gọi là ''2m plasmid '' có vai trò qua trọng trong thao tác chuyển gen của kỹ thuật di truyền. Loại plasmid này là một ADN vòng chứa 6300 đôi base.

Trong một số tế bào nấm men còn có các vi thể. Đó là các thể hình cầu hay hình trứng, đường kính 3m, chúng phủ một lớp màng dày khoảng 7nm. Và thường có vai trò nhất định trong quá trình oxy hóa metanol.

1.4.2.2 Phân loại nấm men

Theo hiểu biết hiên nay (I. Lodder, 1971, Macmilan, 1973) thì nấm men bao gồm 349 loài nấm khác nhau. Chúng thuộc 39 giống nấm, căn cứ vào khả năng sinh bào tử mà có thể chia thành 4 nhóm chính sau đây:

- Nhóm nấm men có bào tử túi (ascospurus): gồm 22 giống khác nhau, lớp nấm túi.

- Nhóm gần gũi với nấm đảm gồm 4 giống.

38

- Nhóm nấm men có bào tử bắn: gồm có 3 giống thuộc họ Sporoliomycetaceae.

- Nhóm nấm men không sinh bào tử: gồm 12 giống thuộc về lớp nấm bất toàn.

1.4.2.3 Đặc điểm sinh sản

a. Sinh sản vô tính bằng phương pháp nẩy chồi

Khác với các loại nấm khác, nẩy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện thuận lợi, tế bào nấm men trưởng thành sẽ bắt đầu nẩy ra một chồi nhỏ. Quá trình này nhờ các enzyme thủy phân làm phân giải phần polysaccharid của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào, vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên, đồng thời một phần nhân tế bào mẹ được chuyển sang chồi. Khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ, thành phần của vách ngăn cũng giống như thành tế bào. Trên mỗi tế bào mẹ có thể sinh ra một hoặc nhiều chồi nhỏ ở những vị trí khác nhau. Tế bào con sau khi tạo thành sẽ tách khỏi tế bào mẹ hoặc dính trên tế bào mẹ và tiếp tục nẩy sinh các chồi mới. Nhiều thế hệ nấm men có thể dính với nhau tạo thành một đám phân nhánh như xương rồng. Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào mẹ, ở chỗ tách ra còn giữ lại một sẹo của chồi, trên tế bào mẹ mang một vết sẹo, các vết sẹo này có thể thấy rõ khi nhuộm màu calcafluor hoặc primulin rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Hình 1. 33 Sinh sản theo phương thức nảy chồi ở nấm men

b, Sinh sản vô tính bằng phương pháp phân cắt

Ngoài nẩy chồi, một số nấm men còn sinh sản vô tính bằng cách phân cắt nhờ vách ngăn ngang giống như vi khuẩn, tế bào dài ra sau đó sinh ra những vách ngăn đặc biệt và phân cắt thành nhiều tế bào.

39

Hình 1. 34 Sinh sản theo phương thức phân cắt ở nấm men

c. Sinh sản bằng bào tử đơn tính

Bào tử được hình thành từ một tế bào riêng rẽ không thông qua tiếp hợp. Sự hình thành bào tử loại này có nét giống sự hình thành nội bào tử của một số vi khuẩn có sinh bào tử nhưng khác ở chỗ, trong túi nấm hình thành nhiều bào tử hơn. Bào tử đốt: ở chi Geotrichum. Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces, Sporidiobolus, Bullera. Bào tử áo hay bào tử màng dày: khuẩn ty giả ở nấm Candida albicans

d. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi

Bào tử túi được sinh ra trong các túi. Hai tế bào khác giới (mang dấu + và -) đứng gần nhau sẽ mọc ra hai mấu lồi. Chúng tiến lại với nhau và tiếp nối với nhau. Chỗ tiếp nối sẽ tạo ra một lỗ thông và qua đó chất nguyên sinh có thể đi qua để phối chất, nhân cũng đi qua để tiến hành phối nhân, sau đó nhân phân cắt thành 2, 4, 8. Mỗi nhân được bọc bởi chất nguyên sinh rồi tạo thành màng dày chung quanh và hình thành các bào tử túi. Tế bào dinh dưỡng biến thành túi.

Túi có thể được hình thành bằng cách tiếp hợp đẳng giao do hai tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau mà tạo thành (Schizosaccharomyces, Debaryomyces..) hoặc tiếp hợp dị giao do hai tế bào nấm men có hình thái, kích thước không giống nhau tiếp hợp với nhau mà thành (Nadsonia...) Bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành các tế bào nấm men mới.

1.4.3. Hình thái, cấu tạo tế bào của Nấm mốc

1.4.3.1 Đặc điểm hình thái của nấm mốc

Nấm mốc (nấm sợi) là nhóm vi sinh vật có kết cấu dạng sợi phân nhánh. Tế bào cấu tạo hoàn chỉnh, kích thước lớn, có thể là đơn bào đa nhân hoặc đa bào đơn nhân. Sợi nấm (còn gọi là khuẩn ty - hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên sinh có thể

40

lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-10 µm).

Sợi nấm không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc. Vào giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm.

Hình 1. 35 Khuẩn lạc nấm mốc

Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường cũng có màu nên cả khuẩn lạc thường có màu

1.4.3.2 Cấu tạo của nấm mốc

Nấm mốc được cấu thành bởi hai bộ phận: sợi nấm (khuẩn ty) và bào tử.

a. Khuẩn ty

Là các sợi nấm mọc ra từ bào tử, phân nhánh sinh trưởng tạo ra một mạng sợi nấm chằng chịt gọi là khuẩn ty thể. Kích thước chiều ngang 3-10 và chúng có các hình thái khác nhau tùy theo loại mốc, điển hình là: hình lo xo hay hình xoắn ốc, hình cái vợt một đầu to và cong, hình đốt quấn chặt vào nhau thành khối chặt, hình sừng hươu, hình răng lược hay hình lá dừa.

Vùng C

Vùng B

Vùng A

Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài. Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa.

41

Hình 1. 36 Cấu trúc vùng ngọn sợi nấm.

Vùng A: vùng chóp nón, Vùng B: vùng tăng trưởng, Vùng C: vùng trưởng thành

Căn cứ vào vị trí chức năng của khuẩn ty có thể phân 3 loại:

* Khuẩn ty cơ chất: phát triển sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu dinh dưỡng nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng tồn tại ở hai dạng là thể đệm giống như một cái đệm ghế, cấu tạo bởi nhiều khuẩn ty bện chặt với nhau và hạch nấm có hình hơi tròn không đều bên trong là tổ chức sợi xốp.

* Khuẩn ty khí sinh: Sợi nấm mọc lộ trên mặt môi trường từ bên trong hoặc bên trên

thể đệm hay hạch nấm.

* Khuẩn ty sinh sản: Sợi khuẩn ty của nấm sợi có thể là khuẩn ty đa bào (có vách ngăn) gặp ở các nhóm nấm như: Aspergillus, Penicillium… hoặc khuẩn ty cộng bào (không vách ngăn hoặc vách ngăn không hoàn toàn) gặp ở các nhóm nấm như: Rhyzopus, Mucor…

Hình 1. 37 Hai loại khuẩn ty của nấm mốc

Tế bào của nấm sợi có cấu tạo tương tự như cấu tạo của tế bào nấm men. Vách tế bào của nấm có thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu chí quan trọng khi định loại nấm. sau đây là các thành phần chính của vách tế bào ở một số nấm:

Bảng 1. 3 Thành phần cấu tạo vách tế bào một số loại nấm mốc

Chi nấm: Allomyces Phytophthora Mucor Aspergillus Saccharomyces Schizophyllum

Thành phần thành tế bào:

Glucan 16 54 0 43 29 6

42

Cellulose - 36 0 0 0 0

Chitine 58 0 9 19 1 10

Chitosan - 10 33 - 0 -

Mannan - <1 2 2 31 <3

Protein Lipid 10 - 5 3 6 8 11 5 13 9 7 3

Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ thủng, trong nhân có hạch nhân. Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn của sợi nấm. Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân. Nhân của nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiễm sắc thể trong nhân thường không dễ nhuộm màu, số lượng tương đối nhỏ.

Hình 1. 38 Cấu tạo tế bào sợi nấm

Trong tế bào nấm còn có các cơ quan giống như trong tế bào Eukaryote. Đó là ty thể, mạng nội chất, dịch bào hay không bào, ribosome, thể Golgi, các giọt lipid, các tinh thể và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm, các thể Vôrônin đường kính 0,2µm, chitosome đường kính 40-70nm… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm, các vi sợi đường kính 5-8nm, các thể màng biên...

Ribosome của nấm thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị (subunit); bán đơn vị lớn (large subunit ) 60S (gồm 3

43

loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein)

b. Bào tử

Là tế bào sinh sản được hình thành bằng phương thức sinh sản vô tính hay hữu tính. Kết quả của sự sinh sản vô tính hay hữu tính sẽ sinh ra các loại bào tử khác nhau. Mỗi loại nấm mốc có thể cho ra một hay vài loại bào tử.

Bào tử vô tính

Bào tử đốt (actrospore): các khuẩn ty sinh sản có sự ngắt đốt, mỗi một đốt được coi như

một bào tử, rơi vào môi trường sẽ phát triển thành một khuẩn ty mới.

Bào tử màng dầy (chlamydospore): trên các đoạn của khuẩn ty sinh sản xuất hiện các

phần lồi hình tròn hay hơi tròn có màng dầy bao bọc.

Bào tử nang (sporangiospore): trên các đoạn của khuẩn ty sinh sản phình to dần hình

thành một cái bọc hay gọi là nang, trong bọc chứa nhiều bào tử.

Bào tử đính (Conidium): nhiều loài nấm có hình thức sinh sản này, các bào tử được hình thành tuần tự, liên tiếp từ khuẩn ty sinh sản. Phần lớn bào tử đính là nội sinh -được sinh ra từ bên trong.

Hình 1. 39 Các loại bào tử vô tính ở nấm mốc

Bào tử hữu tính

Sinh sản hữu tính là quá trình sinh sản có hiện tượng chất giao, nhân giao và phân bào giảm nhiễm của sợi nấm. Do cách thức sinh sản khác nhau mà tạo thành các loại bào tử khác nhau:

44

Bào tử noãn: đầu tiên có sự xuất hiện noãn khí trên đỉnh các sợi nấm sinh sản. Noãn khí chín trong chứa nhiều noãn cầu. Hùng khí (là cơ quan giao tử đực) được sinh ra gần gần noãn khí sẽ tiến đến gần để tiếp xúc với noãn khí. Sau khi tiếp xúc hùng khí sẽ sinh ra một hoặc vài ống xuyên chứa một nhân và một phần nguyên sinh chất thụ tinh cho một noãn cầu để tạo thành một noãn bào tử. Noãn bào tử có màng bao bọc và sau sau một thời gian phân chia giảm nhiễm sẽ phát triển thành một khuẩn ty mới.

Bào tử tiếp hợp: khi hai khuẩn ty khác giống gần nhau sẽ xuất hiện hai mấu lồi được gọi là nguyên phôi nang, hai mấu lồi có sự tiếp xúc và có sự xuất hiện vách ngăn tách hai phần đầu của hai mấu lồi thành hai tế bào đa nhân-hai tiểu giao tử tiếp hợp tạo thành một hợp tử có màng dầy bao bọc được gọi là bào tử tiếp hợp. Sau một thời gian sống tiềm tàng, bào tử tiếp hợp sẽ nẩy mầm phát triển thành một nang trong chứa nhiều bào tử.

Hình 1. 40 Quá trình sinh sản hữu tính ở nấm mốc Rhyzopus và Aspergillus

Bào tử túi: trên một khuẩn ty đơn bội sinh sinh ra hai cơ quan sinh sản là túi giao tử đực hình ống-hùng khí và túi giao tử cái có một ống dài gọi là sợi thụ tinh. Khi hùng khí tiếp xúc với sợi thụ tinh thì nguyên sinh chất sẽ có sự phối hợp với nhau. Các nhân sắp xếp với nhau từng đôi một (đực, cái). Trên thể sinh túi sẽ mọc ra nhiều sợi sinh túi, các nhân kép được chuyển vào trong các sợi sinh túi từng phần sẽ phân chia nhiều lần và hình thành vách ngăn chia thành nhiều tế bào chứa nhân kép. Tế bào ở cuối sợi uốn cong lại. Nhân kép phân chia một lần tạo ra 4 nhân sau đó tế bào này tách ra thành 3 tế bào tế bào giữa chứa hai nhân, tế bào gốc và ngọn chứa 4 nhân. Tế bào giữa hình thành túi bào tử. Tế bào ngọn và gốc sau này sẽ tiếp hợp thành một tế bào hai nhân, sau đó phát triển thành một túi mới.

Bào tử đảm: Khi hai khuẩn ty đơn bội khác tính tiếp cận nhau thì trên một khuẩn ty sẽ xuất hiện một ống nối với khuẩn ty kia, nhân và nguyên sinh chất qua ống nối cũng được chuyển qua khuẩn ty ấy để tạo thành khẩn ty thứ cấp có chứa hai nhân. Từng nhân phân chia tạo thành 4 nhân con, sau đó xuất hiện hai vách ngăn tạo ra 3 tế bào: một tế bào hai nhân ở

45

đỉnh, một tế bào một nhân ở gốc và một tế bào một nhân bên cạnh. Tế bào hai nhân sẽ phát triển thành đảm và hai tế bào kia sẽ kết hợp để tạo thành một tế bào hai nhân khác. Đảm phình to, phía trên xuất hiện 4 cuống nhỏ, sau đó mỗi nhân sẽ chui vào trong một thể bình và phát triển thành bào tử đảm. Đảm có thể sinh ra trực tiếp trên đám khuẩn ty hoặc những cơ quan đặc biệt gọi là quả đảm.

1.4.4. Hình thái, cấu tạo tế bào của Tảo và Động vật nguyên sinh

1.4.4.1 Tảo

Theo cách phân loại mới hiện nay Tảo đơn bào được xếp vào Giới Protista (Giới Nguyên sinh vật). Tảo đa bào được xếp vào Giới thực vật (Plantae). Sự phân chia các ngành Tảo dựa vào các đặc điểm như sắc tố, tổ chức của lục lạp, thành phần hóa học của vách tế bào, loại chất dự trữ và nhiều đặc điểm khác... Tất cả các Tảo đều có chứa diệp lục tố a, chúng khác nhau ở các diệp lục tố khác và những sắc tố phụ tham gia vào sự quang hợp. Sự phối hợp của các sắc tố làm cho Tảo có màu sắc đặc trưng.

Sự phân biệt còn dựa vào đặc điểm về sinh hóa, hình thái, cách sinh sản, dạng của giao tử. Trong từng ngành cũng có sự đa dạng về hình thái, từ những sinh vật đơn bào đến những sinh vật đa bào phức tạp. Chu kỳ đời sống trong từng ngành cũng biến thiên kể cả sự khác biệt về giao tử, về số lượng, vị trí và hoạt động của chiên mao.

A. Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta)

Tảo đỏ chứa diệp lục tố a và sắc tố phycobilin tương tự ở Vi khuẩn lam. Mặc dù Tảo đỏ đa dạng từ đơn bào, đa bào hình sợi, hình bản hay hình dạng phân hóa thành các mô phức tạp hơn, nhưng cấu trúc chung của tản là gồm các sợi liên kết với nhau theo các kiểu khác nhau. Tản được bao bọc bởi chất nhầy của vách tế bào, một trùng phân của galactose, có giá trị kinh tế. Một số Tảo tiết ra CaCO3 vào trong vách tế bào của nó và cơ thể được bao phủ bởi chất vôi được gọi là Tảo san hô góp phần tạo ra các rạng san hô ở biển nhiệt đới.

Hình 1. 41 Một vài loại Tảo đỏ

46

Hình thức sinh sản của Tảo đỏ rất đặc trưng. Giao tử bất động và đặc biệt hơn nữa là ở một số trường hợp nhân của hợp tử di chuyển vào một tế bào phụ kế cận, hợp tử phân chia trong tế bào phụ đó. Bào tử được sinh ra từ tế bào nhiều nhân này để bắt đầu cho một thế hệ lưỡng tướng mới.

B. Nhóm Tảo nâu

Nhóm tảo nâu bao gồm 3 ngành: Ngành Khuê tảo, Ngành tảo giáp và Ngành tảo nâu.

* Ngành Khuê tảo hay Tảo cát (Bacillariophyta): là những đơn bào tròn hay dài, các tế bào dính với nhau thành sợi hay các tộc đoàn phân nhánh. Vách gồm hai mảnh vỏ gắn khớp vào nhau. Khi tế bào phân chia, mỗi nửa tế bào tạo ra một nửa mới gắn khít vào mép trong của nửa tế bào mẹ. Vách tế bào chứa tinh thể silic với kiểu chạm trổ tinh vi được dùng để phân loại. Khuê tảo có vai trò là phiêu sinh thực vật và là thành phần tạo nên trầm tích đá diatomit ở đáy biển. Chất silic trong đá diatomit dùng để chế tạo gạch chịu lửa, có thể dùng để lọc và để đánh bóng các đồ bằng bạc.

* Ngành Tảo giáp (Pyrrophyta): là một nhóm tảo đơn bào vai trò quan trọng của phiêu sinh nước ngọt và nước mặn. Nhiều loài có các tấm cellulose bao phủ. Ở một số giống trên tế bào có hai rãnh, một rãnh ngang và một rãnh dọc. Trong mỗi rãnh có một chiên mao, hoạt động như một bánh lái đẩy tế bào đi về phía trước và xoay tròn. Một số loài ở biển có thể sinh độc tố và gây ra sự nở hoa làm chết thủy hải sản.

* Ngành Tảo nâu (Phaeophyta): là những tảo biển có kích thước lớn nhất có màu vàng đến nâu đôi khi hơi đỏ do diệp lục tố a, c thêm vào đó là những phân tử xanthophyll. Tảo nâu có mô phân sinh giúp cho lá tăng trưởng, tế bào chứa chất dự trữ là laminarin, manitol và lipid. Điểm đặc trưng là vách tế bào có chứa acid alginic.

Hình 1. 42 Nhóm tảo nâu

47

. C. Nhóm Tảo lục

Tảo màu lục có ba ngành: ngành Tảo lục, Tảo vòng và Tảo mắt.

* Ngành Tảo lục (Chlorophyta): được tìm thấy trong nước ngọt và nước mặn, trong đất, cộng sinh trên cơ thể sinh vật khác. Các tảo này làm thành nhóm phiêu sinh, là nhóm sinh vật trôi nổi trong mặt nước, quan trọng vì là khâu đầu tiên trong chuỗi thức ăn. Giống như thực vật bậc cao, chúng có diệp lục tố a và b, chất dự trữ là tinh bột. Từ những dạng đơn bào đơn độc, sống tự do đến những dạng tộc đoàn di động được hay không.

Tảo đơn bào có hai chiên mao giống như Chlamydomonas, được xem là tổ tiên của Tảo lục. Chlamydomonas có 2 chiên mao mọc xuyên qua vách tế bào mỏng bằng glycoprotein, một lục lạp hình chén ở ngoại biên của tế bào. Bên trong lục lạp có một hạch lạp là nơi dự trữ tinh bột. Nhân nằm trong vùng tế bào chất có hình chén này. Một không bào co bóp ở phía đầu của tế bào để đẩy nước ra. Một điểm mắt nhận ánh sáng nằm ở gốc của chiên mao.

48

* Ngành Tảo vòng (Charophyta): Tảo vòng chứa diệp lục tố a và b và chất dự trữ là tinh bột. Bao gồm bốn giống, trong đó thường gặp là Chara và Nitella. Thân thẳng với các nhánh xếp thành vòng, các đại diện của Charophyta sống ở dưới đáy của các hồ, ao lâu năm, cạn, nhiều kiềm. Một số loài có đặc điểm là kết tủa được chất vôi trong nước làm chúng phủ vôi nên chúng thường được gọi là Tảo vòng vôi.

* Ngành Tảo mắt (Euglenophyta): Gồm những đại diện nguyên sinh vật với khoảng 40 giống đơn bào hay tộc đoàn, không có vách cellulose. Là những Tảo phiêu sinh và thường làm thành lớp váng trên mặt nước ao tù, thường gặp là loài Euglena. Ngoài đặc điểm có lục lạp, chúng mang nhiều đặc điểm của động vật như cách nuốt, tiêu hóa, biến dưỡng thức ăn. Bên trong màng sinh chất là màng protein có khe mỏng, đàn hồi giúp tế bào có roi uốn lượn quay tròn, chất dự trữ là paramylon.

Hình 1. 43 Nhóm tảo lục

1.4.4.2 Động vật nguyên sinh

Động vật nguyên sinh (Protozoa-tiếng Hy Lạp proto=đầu tiên và zoa=động vật) là

dưỡng. Chúng có phân bố ở khắp nơi: đất, nước ngọt, nước mặn, trong cơ thể sinh vật khác. Đây là

những sinh vật xuất hiện sớm nhất trên hành tinh, là sinh vật đơn bào có khả năng chuyển động và dị

khác biệt chính so với thực vật nguyên sinh (protophyta), được coi là những sinh vật đơn bào

không có khả năng chuyển động và thực hiện trao đổi chất qua quá trình quang hợp.

49

Động vật nguyên sinh có khoảng 20.000 đến 25.000 loài, trong đó một số cũng có cả

khả năng quang hợp. Động vật nguyên sinh là một dạng sống đơn giản, mặc dù cơ thể chỉ có

một tế bào, nhưng có khả năng thực hiện đầy đủ các hoạt động sống như một cơ thể đa bào hoàn

thẩm thấu, di chuyển và sinh sản. Sở dĩ chúng có thể thực hiện được các hoạt động sống đó là vì

chỉnh, chúng có thể thu lấy thức ăn, tiêu hóa, tổng hợp, hô hấp, bài tiết, điều hòa ion và điều hòa áp suất

thể, mạng nội chất, hệ Golgi, không bào co bóp và không bào tiêu hóa. Một số nguyên sinh động vật

trong cơ thể cũng có những cấu tử giống với các cấu tử ở tế bào của cơ thể đa bào như nhân, ty

còn có bào hầu nối liền bào khẩu với túi tiêu hóa, tiêm mao hoặc chiên mao hoạt động được nhờ thể

gốc. Động vật nguyên sinh thường có kích thước 0.01 - 0.05mm và không phải là động vật

thực sự.

Phân loại động vật nguyên sinh:

Nhóm 1. Sarcomastigophora: gồm Sarcodina, Mastigophora, Opalanat

* Mastigophora

• Có 1 hoặc nhiều roi

• Tế bào có thể chia dọc

• Sống vùng nước ngọt, ký sinh trên động vật

* Sarcodina

• Dạng amip, giả túc, không roi

• Tế bào chia đôi

• Sống vùng nước ngọt, mặn, ký sinh trên động vật

Nhóm 2. Sporozoa

• Thường bất động, một số có thể trườn, bò

• Tế bào chia đôi

• Ký sinh trên động vật, sâu bọ, truyền bệnh ký sinh

50

Nhóm 3. Ciliophora

• Nhiều roi ngắn, tế bào có nhiều nhân, chia đôi ngang

• Sống vùng nước ngọt, mặn, ký sinh trên động vật, dạ cỏ động vật nhai lại

Nhóm 4. Cnidospora

• Roi ngắn, tế bào có nhân to và nhân bé

• Hình thành chuỗi bào tử

• Ký sinh trên động vật

Hình 1. 44 Các nhóm động vật nguyên sinh

Động vật nguyên sinh di chuyển theo 3 cách: bằng giả túc, bằng chiên mao và bằng

tiêm mao.

+ Giả túc: là phần nhô ra của tế bào chất theo hướng di chuyển, thường là vừa di chuyển vừa bắt thức ăn. Có 4 loại: Giả túc hình sợi – Filopodia, Giả túc hình rễ cây – Rhizopodia, Giả túc hình tia – Axopodia và Giả túc hình chùy có đầu tròn.

+ Chiên mao: là bộ phận hoạt độ rẽ nước, kéo cơ thể về trước, vừa rẽ nước vừa cuốn thức ăn trong dòng nước.

51

+ Tiêm mao: hoạt động như mái chèo đẩy cơ thể về phía trước, có thể xoay tròn tạo dòng nước xoáy cuốn thức ăn vào miệng.

Động vật nguyên sinh có cơ quan tiêu hóa là các không bào chứa enzyme tiêu hóa. Các mảnh vụn thức ăn đưa vào bào khẩu nằm ở 1 vị trí nhất định trên tế bào, sau đó đưa đến bào hầu vào túi không bào tiêu hóa. Enzyme tiêu hóa được tiết vào không bào để phân hủy thức ăn, đưa chất dinh dưỡng vào tế bào chất và chất thải đưa ra ngoài qua bề mặt tế bào.

Hình 1. 45 Tiêu hóa ở động vật nguyên sinh

1.5. Hình thái, cấu tạo của Virus

1.5.1 Lịch sử nghiên cứu virus

Ngay từ năm 1883 nhà khoa học người Đức Adolf Mayer khi nghiên cứu bệnh khảm cây thuốc lá đã nhận thấy bệnh này có thể lây nếu phun dịch ép lá cây bị bệnh sang cây lành, tuy nhiên ông không phát hiện được tác nhân gây bệnh.

Năm 1884 Charles Chamberland đã sáng chế ra màng lọc bằng sứ để tách các vi khuẩn nhỏ nhất và vào năm 1892 nhà thực vật học người Nga Dimitri Ivanovski đã dùng màng lọc này để nghiên cứu bệnh khảm thuốc lá. Ông nhận thấy dịch ép lá cây bị bệnh đã cho qua màng lọc vẫn có khả năng nhiễm bệnh cho cây lành và cho rằng tác nhân gây bệnh có lẽ là vi khuẩn có kích thước nhỏ bé đến mức có thể đi qua màng lọc, hoặc có thể là độc tố do vi khuẩn tiết ra. Giả thuyết về độc tố qua màng lọc đã bị bác bỏ.

Vào năm 1898 khi nhà khoa học người Hà Lan Martinus Beijerinck chứng minh được rằng tác nhân lây nhiễm là chất độc sống (Contagium vivum fluidum) và có thể nhân lên được. Ông tiến hành phun dịch ép lá cây bệnh cho qua lọc rồi phun lên cây và khi cây bị bệnh lại lấy dịch ép cho qua lọc để phun vào các cây khác. Qua nhiều lần phun đều gây được bệnh cho cây. Điều đó chứng tỏ tác nhân gây bệnh phải nhân lên được vì nếu là độc tố thì năng lực gây bệnh sẽ phải dần mất đi. 52

Năm 1901 Walter Reed và cộng sự ở Cuba đã phát hiện tác nhân gây bệnh sốt vàng, cũng qua lọc. Tiếp sau đó các nhà khoa học khác phát hiện ra tác nhân gây bệnh dại và đậu mùa. Tác nhân gây bênh đậu mùa có kích thước lớn, không dễ qua màng lọc, do đó các tác nhân gây bệnh chỉ đơn giản gọi là virus.

Từ những thập kỷ cuối của thế kỷ XX trở lại đây ngày càng xuất hiện các dạng virus mới lạ ở người, động vật mà trước đó y học chưa hề biết tới, đe doạ mạng sống của con người. Sau HIV, SARS, Ebola, cúm A H5N1 sẽ còn bao nhiêu loại nữa sẽ xuất hiện để gây tai hoạ cho con người. Mặt khác, do có cấu tạo đơn giản và có genom nhiều kiểu với cơ chế sao chép khác hẳn ở các cơ thể khác nên virus được chọn là mô hình lý tưởng để nghiên cứu nhiều cơ chế sinh học ở mức phân tử dẫn đến cuộc cách mạng sinh học cận đại: Sinh học phân tử, di truyền học phân tử. Vì những lý do trên việc nghiên cứu virus đã được đẩy mạnh và trở thành một ngành khoa học độc lập rất phát triển.

1.5.2 Cấu tạo của virus

Tất cả các virus đều có cấu tạo gồm hai thành phần cơ bản: lõi là acid nucleic (tức genom) và vỏ là protein gọi là capsid, bao bọc bên ngoài để bảo vệ acid nucleic. Phức hợp bao gồm acid nucleic và vỏ capsid gọi là nucleocapsid hay xét về thành phần hoá học thì gọi là nucleoprotein. Một số virus có thêm lớp vỏ bao bên ngoài bản chất là protein. Đối với virus ARN thì còn gọi là ribonucleoprotein. Genom của virus có thể là ADN hoặc ARN, chuỗi đơn hoặc chuỗi kép, trong khi genom của tế bào luôn là ADN chuỗi kép, và trong tế bào luôn chứa hai loại acid nucleic, ADN và ARN.

1.5.2.1 Vỏ capsid

Capsid là vỏ protein được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome. Capsome lại được cấu tạo từ 5 hoặc 6 đơn vị cấu trúc gọi là protome. Protome có thể là monome (chỉ có một phân tử protein) hoặc polyme (có nhiều phân tử protein). Pentame (penton) có 5 protome nằm trên các đỉnh của khối đa diện, còn hexame (hexon) tạo thành các cạnh và bề mặt hình tam giác. Capsid có khả năng chịu nhiệt, pH và các yếu tố ngoại cảnh nên có chức năng bảo vệ lõi acid nucleic. Trên mặt capsid chứa các thụ thể đặc hiệu, hay là các gai glicoprotein, giúp cho virus bám vào các thụ thể trên bề mặt tế bào. Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau. Có thể chia ra ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối và cấu trúc phức tạp.

53

Hình 1. 46. Kích thước và hình thái của một số virus điển hình

a. Cấu trúc đối xứng xoắn

Các capsome sắp xếp theo chiều xoắn của acid nucleic. Tuỳ loại mà có chiều dài, đường kính và chu kỳ lặp lại của các nucleocapsid khác nhau. Cấu trúc xoắn thường làm cho virus có dạng hình que hay hình sợi ví dụ virus đốm thuốc lá (MTV), dại (Rhabdo), quai bị, sởi (Paramyxo), cúm (Orthomyxo). Ở virus cúm các nucleocapsid được bao bởi vỏ ngoài nên khi quan sát dưới kính hiển virus điện tử thấy chúng có dạng cầu.

Hình 1. 47 Cấu trúc đối xứng xoắn ở virus

b. Cấu trúc đối xứng dạng khối đa diện 20 mặt

Ở các virus loại này, capsome sắp xếp tạo vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, có 30 cạnh và 12 đỉnh. Đỉnh là nơi gặp nhau của 5 cạnh thuộc loại này gồm các virus adeno, reo, herpes và picorna. Gọi là đối xứng vì khi so sánh sự sắp xếp của capsome theo trục. Ví dụ đối xứng bậc 2, bậc 3, bậc 5, vì khi ta xoay với 1 góc 1800 (bậc 2), 1200 (bậc 3) và 720O (bậc 5) thì thấy vẫn như cũ.

54

Hình 1. 48 Cấu trúc khối đa diện của virus

Các virus khác nhau có số lượng capsome khác nhau. Virus càng lớn, số lượng capsome càng nhiều. Dựa vào số lượng capsome trên mỗi cạnh có thể tính được tổng số capsome của vỏ capsid theo công thức sau:

N= 10(n-1)2+2

Trong đó N- tổng số capsome của vỏ capsid, n-số capsome trên mỗi cạnh.

c. Virus có cấu tạo phức tạp

Một số virus có cấu tạo phức tạp, điển hình là phage và virus đậu mùa. Phage có cấu tạo gồm đầu hình khối đa diện, gắn với đuôi có cấu tạo đối xứng xoắn. Phage T chẵn (T2, T4, T6) có đuôi dài trông giống như tinh trùng, còn phage T lẻ (T3, T7) có đuôi ngắn, thậm chí có loại không có đuôi. Virus đậu mùa có kích thước rất lớn, hình viên gạch. ở giữa là lõi lõm hai phía trông như quả tạ. Đối diện với hai mặt lõm là hai cấu trúc dạng thấu kính gọi là thể bên. Bao bọc lõi và hai thể bên là vỏ ngoài.

1.5.2.2 Vỏ ngoài

chính năng chức định trúc của cấu với ổn là

Một số virus có vỏ ngoài bao bọc vỏ capsid. Vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào được virus cuốn theo khi nảy chồi. Vỏ ngoài có cấu tạo gồm 2 lớp lipid và protein. Lipid gồm phospholipid và glycolipid, hầu hết bắt nguồn từ màng sinh chất (trừ virus pox từ màng Golgi) virus. Protein vỏ ngoài thường là glycoprotein cũng có nguồn gốc từ màng sinh chất, tuy nhiên trên mặt vỏ ngoài cũng có các glycoprotein do virus mã hóa được gắn trước vào các vị trí chuyên biệt trên màng sinh chất của tế bào, rồi về sau trở thành cấu trúc bề mặt của virus.

1.5.2.3 Lõi acid nucleic (genome)

Genom của virus rất đa dạng về cấu trúc, kích thước và thành phần nucleotid. Chúng có thể là ADN hoặc ARN, chuỗi đơn hoặc kép, thẳng hoặc khép vòng. Kích thước genom có thể từ 3500 nucleotid (ở phage nhỏ) đến 560.000 nucleotid (ở virus herpes). Các trình tự genom virus phải được đọc mã bởi tế bào chủ, cho nên các tín hiệu điều khiển phải được các yếu tố của tế bào chủ nhận biết. Các yếu tố này thường liên kết với protein virus. Do có kích thước nhỏ nên genom virus đã tiến hoá để sử dụng tối đa tiềm năng mã hóa của mình. Vì thế hiện tượng gen chồng lớp và hiện tượng cắt nối (splicing) mARN ở virus là rất phổ biến.

55

Genom của virus được xác định dựa theo thành phần acid nucleic, cấu trúc đầu chuỗi, trình tự nucleotide, trình tự nucleotide, khả năng mã hóa, yếu tố điều hòa, promoter và terminater.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Lân Dũng, 2000 – Vi sinh vật học. NXB giáo dục

2. Lương Đức Phẩm, 2009 – Cơ sở khoa học trong công nghệ bảo vệ môi trường, Tập

2, Cơ sở vi sinh. NXB giáo dục.

Vi sinh môi trường. NXB Đại học Quốc gia.

3. Đỗ Hồng Lan Chi, Bùi Lê Thanh Khiết, Nguyễn Thị Thanh Kiều, Lâm Minh Triết, 2010 –

4. Edward A.B, 2006 – Bacterial and Bacteriophage. 5th Edition, Springer.

56

CHƯƠNG 2: CÁC QUÁ TRÌNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT

2.1. Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật

Chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật, là bất kỳ chất nào được vi sinh vật hấp thụ từ môi

trường xung quanh và được chúng sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp và

tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi năng lượng. Quá

trình hấp thụ các chất dinh dưỡng để thỏa mãn mọi nhu cầu sinh trưởng và phát triển được gọi

là quá trình dinh dưỡng.

Không phải mọi thành phần của môi trường nuôi cấy vi sinh vật đều được xem là chất

dinh dưỡng. Một số chất rất cần thiết cho vi sinh vật nhưng chỉ làm nhiệm vụ bảo đảm các

điều kiện về thế oxi hóa khử, pH, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion ... Chất dinh dưỡng phải là

các chất có tham gia vào các quá trình trao đổi chất nội bào.

Bảng 2. 1 Thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật

Hàm lượng % Thành phần Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc

50,4 49,8 47,9 C

12,3 12,4 5,3 N

6,8 6,7 6,5 H

30,5 31,1 40,2 O

9 – 13 6 – 6,9 2,7 – 8,8 Chất tro

75 – 90,6 85 63 – 83 Nước

9,4 – 25 17 – 33 15 – 30 Chất khô

Thành phần hóa học cấu tạo bởi các nguyên hóa học. Trong đó, 4 nguyên tố C, H, N, O

là các nguyên tố tạo nên sự sống, chiếm 90-97% chất khô trong tế bào. Các nguyên tố đa

lượng và vi lượng được gọi là chất tro hay chất khoáng, chiếm 3-10%. P và S là nguyên tố

khoáng đa lượng quan trọng nhất, có trong thành phần của tế bào chất acid nucleic, tham gia

vào quá trình trao đổi chất và năng lượng của tế bào. Các nguyên tố vi lượng như Cu, Zn, Mn,

Mo … cũng giữ một vai trò nhất định trong hoạt động sống của vi sinh vật.

57

Người ta chia thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật làm 2 phần là nước (nước tự do

và nước liên kết) và vật chất khô (muối khoáng và hợp chất hữu cơ). Thành phần hóa học của

tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Lượng chứa của các nguyên tố

trong vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Các điều kiện nuôi cấy vi sinh vật khác

nhau, các giai đoạn khác nhau, lượng chứa các nguyên tố trong cùng một loài vi sinh vật cũng

không giống nhau.

2.1.1 Nước

Nước là thành phần không thể thiếu được đối với cơ thể sống. Nước chiếm khoảng 70-

90% khối lượng cơ thể vi sinh vật. Tất cả các phản ứng xẩy ra trong tế bào vi sinh vật đều đòi

hỏi có sự tồn tại của nước. Trong vi khuẩn lượng chứa nước thường là 70-85%, nấm sợi 85-

90%.

Nước trong tế bào thường tồn tại ở hai trạng thái khác nhau: nước tự do và nước liên

kết. Nước tự do là nước không tham gia vào cấu trúc các hợp chất hóa học của tế bào nên nó

dễ bay hơi khi sấy khô. Nước liên kết là nước tham gia vào cấu tạo các hợp chất hữu cơ trong

tế bào, nước liên kết khó tách ra khi sấy.

Yêu cầu của vi sinh vật đối với nước được biểu thị một cách định lượng bằng độ hoạt

động của nước trong môi trường ký hiệu aw. Độ hoạt động của nước hay độ hoạt động của

thủy phần môi trường được xác định:

aw= P/Po

Ở đây P là áp lực hơi nước của dung dịch, còn Po là áp lực hơi của nước nguyên chất, dung

dịch có nồng độ càng cao thì P càng nhỏ. Nước nguyên chất có aw=1, nước biển có aw=0,98,

máu người aw=0,995, cá muối có aw= 0,75.

Mỗi vi sinh vật thường có một aw tối thích và một aw tối thiểu, một số vi sinh vật có thể

phát triển được trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao người ta gọi chúng là các vi sinh

vật chịu áp lực cao. Chẳng hạn aw có thể chấp nhận được của Saccharoces rouxii là 0,85,

Halococcus là 0,75. Khả năng chịu khô hạn của nấm cao hơn so với các vi sinh vật khác.

58

Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là

nước tự do. Phần lớn nước trong vi sinh vật tồn tại dưới dạng nước tự do. Nước kết hợp là

nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào (L, P, hydrate carbon,...),

nước liên kết mất khả năng hòa tan và lưu động.

2.1.2 Vật chất khô

Chất khô chiếm 10 – 15% khối lượng tế bào vi sinh vật, trong đó, 85 – 90% là chất

hữu cơ, ít hơn 5 – 15% là thành phần khoáng dưới dạng liên kết hóa học với chất hữu cơ và

tham gia vào thành phần cấu tạo tế bào.

2.1.2.1 Muối khoáng

Muối khoáng là phần còn lại khi đốt cháy hoàn toàn chất hữu cơ, thường tồn tại dưới

-, SO4

dạng các muối sulphate, phosphate, carbonate, clorua ... trong tế bào chúng thường ở dạng 2-, Cl-... Các ion các ion. Dạng cation như: Mg2+, Ca2+, K+, Na+,... Dạng anion như HPO4

trong tế bào vi sinh vật luôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định nhằm duy trì pH và áp suất thẩm

thấu cho từng loài vi sinh vật.

2.1.2.2 Chất hữu cơ

Chất hữu cơ trong tế bào vi sinh vật bao gồm 4 đại phân tử sinh học là protein, nucleic

acid, lipid, hydrate carbon.

Bảng 2. 2 Thành phần hoá học của một tế bào vi khuẩn

Chất hữu cơ % khối lượng khô Chất hữu cơ % khối lượng khô

Protein 55 Tổng các đơn phân tử 3,5

Polysaccharide 5 Acid amine và tiền thể 0,5

Lipid 9,1 Đường và tiền thể 2

ADN 3,1 Nucleotit và tiền thể 0,5

ARN 20,5 Các ion vô cơ 1

* Protein: Là polymer cấu tạo từ đơn phân là 20 loại acid amine nhờ liên kết peptide.

Đây là liên kết cộng hoá trị -CO-NH- được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm

+H3N - CH(R1) - COO- + +H3N - CH(R2) - COO-

59

3) của một acid amine khác và loại

carboxil (COO- ) của acid amine này và nhóm amine (NH+

đi một phân tử nước.

Tùy theo số lượng các acid amine liên kết với nhau mà ta có dipeptide, tripeptide,

tetrapeptide,... phân tử có 15 liên kết peptide trở lên được gọi là polypeptide, protein được

hình thành từ một vài chuỗi polypeptide. Các protein có thể được xếp loại theo hình dạng,

theo cấu trúc hoặc theo chức năng:

- Xếp loại theo hình dạng: Protein hình sợi, Protein hình cầu.

- Xếp loại theo cấu trúc: Protein đơn giản, protein phức tạp

- Xếp loại theo chức năng: Protein cấu trúc, protein dự trữ, protein vận chuyển, protein là

enzyme

* Acid nucleic: bao gồm 2 loại là DNA- Deoxyribonucleic Acid – cấu tạo từ đơn phân

là Nucleotide và ARN – Ribonucleic Acid – cấu tạo từ đơn phân là Ribonucleotide. Mỗi đơn

phân này cấu tạo gồm 3 phần: 1 gốc H3PO4 liên kết ester với 1 đường pentose liên kết

glucosid với 1 bazo nitơ. Nếu là DNA thì đường pentose là đường deoxiribose với 4 loại bazo

nitơ là Adenine, Thymine, Guanine, Cytocine. Nếu là RNA thì đường pentose là đường

ribose với 4 loại bazo nitơ là Adenine, Uracine, Guanine, Cytocine

Tỷ lệ G + C ở các vi sinh vật khác nhau là có thể không giống nhau. Đây là một chỉ tiêu

quan trọng trong phân loại hiện nay.

* Lipid: gồm có hai loại, lipid phân cực và lipid trung tính. Lipid phân cực thường ở

trạng thái hoạt động, tham gia vào cấu trúc màng (lypoprotein, phosphorlipid, glycolipid).

Lipid trung tính ở dạng dự trữ là các hạt lipid dự trữ trong tế bào chất)

Mesosom là nơi chuyển hóa phosphor lipid từ dạng trung tính dự trữ sang dạng hoạt

động, nó như mạng lưới nội chất ở vi sinh vật. Tế bào phát triển thì màng tế bào rộng ra khi

đó lipid từ dạng dự trữ nó chuyển sang dạng hoạt động để tham gia cấu trúc.

60

* Glucide: Tế bào vi khuẩn thường chứa một lượng glucide, khoảng 12-18 % trọng

lượng chất khô. Các glucide thường gặp gồm các dạng đường đơn (ose), đường kép (osie)

đường đa. Các loại đường đa thường gặp ở vi sinh vật là: glucan (glucarl), dextran (dextrane),

amylose, chitin, cellulose ,...

Glucide tham gia cấu tạo acid nucleic, vào cấu trúc của thành tế bào, vỏ nhầy,... của vi

sinh vật. Vỏ nhầy và việc hình thành vỏ nhầy liên quan đến độc lực và quá trình bảo vệ vi

khuẩn. Một số polysaccharide có thể phối hợp với protein để hình thành gluco-protein.

Gluco-protein là kháng nguyên của cơ thể vi sinh vật, polysaccharide đóng vai trò bán kháng

nguyên. Một số polysaccharide vi sinh vật cũng có khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng

thể. Glucide còn là nguồn dự trữ năng lượng và là sản phẩm trung gian của các quá trình trao

đổi năng lượng trong tế bào vi sinh vật.

* Vitamine: đây là nhóm chất hữu cơ vi sinh vật cần nhưng không tự tổng hợp được và

chỉ cần với lượng rất ít. Nhu cầu về vitamine của các loại vi khuẩn khác nhau không giống

nhau. Vitamine có vai trò quan trọng trong trung tâm hoạt động của enzyme xúc tác các quá

trình chuyển hóa vật chất.

* Enzyme: là các protein được chuyên hóa đặc biệt có vai trò xúc tác cho các phản

ứng hóa học xảy ra trong tế bào. Enzyme thường có phân tử lượng lớn, có cấu hình không

gian từ bậc 3 trờ lên. Mỗi enzyme đều có trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động là nơi cơ

chất tham gia phản ứng gắn kết vào dưới tác động của enzyme. Mỗi loại enzyme đều có một

loại cơ chất nhất định, điều này quyết định tính đặc hiệu theo mô hình chìa khóa – ổ khóa.

Bảng 2. 3 Phân loại enzyme

61

Theo cấu tạo, có 2 loại enzyme: Enzyme đơn giản: cấu tạo từ một hoặc nhiều đoạn

polypeptide, bản chất là protein đơn giản. Enzyme phức tạp: bản chất là protein phức tạp, bao

gồm một thành phần có bản chất protein gọi là apoenzyme, một phần phi protein gọi là

cofactor. Cofactor có thể là kim loại, nhân hem, vitamin … Cofactor luôn nằm tại vị trí trung

tâm hoạt động của enzyme, quyết định loại phản ứng mà enzyme đó xúc tác.

Tùy theo vị trí hoạt động, người ta chia làm enzyme nội bào và enzyme ngoại bào.

Enzyme nội bào (endoenzyme) ở trong tế bào vi khuẩn và phát huy tác dụng xúc tác chuyển

hóa trong tế bào. Enzym ngoại bào exoenzyme) phát huy tác dụng ở cả trong và ngoài cơ thể

vi sinh vật.

Tùy theo phản ứng xúc tác, enzyme có 6 lớp, được ký hiệu từ 1-6. Mỗi lớp chia thành

phân lớp, mỗi phân lớp có nhiều nhóm bao gồm nhiều enzyme khác nhau (bảng 2.3).

* Sắc tố: Khuẩn lạc của nhiều vi sinh vật có màu sắc rõ rệt. Màu sắc có khi chỉ xuất

hiện trong khuẩn lạc, có khi hòa tan vào trong nước và khuếch tán ra môi trường xung quanh.

Việc tạo thành các màu sắc này là một trong những đặc điểm thường được sử dụng khi phân

loại vi sinh vật (nhất là nấm mốc và xạ khuẩn). Ngoài sắc tố quang hợp (được sinh ra từ các

vi sinh vật dinh dưỡng quang năng) còn có nhiều sắc tố khác. Sắc tố của vi sinh vật thuộc

nhiều nhóm các hợp chất rất khác nhau: carotenoit, phenazim, piaron, araquinon,

antoxiamine,...

62

Khi có mặt của sắc tố carotenoit khuẩn lạc có màu đỏ da cam (Sarcina, Micrococcus,

Mycobacterium, Corynebacterium,...). Các sắc tố carotenoit phân bố trong màng nguyên sinh

chất của tế bào. Loại sắc tố này giúp cho vi khuẩn tránh khỏi ảnh hưởng có hại của ánh sáng

mặt trời và ánh sáng tử ngoại. Các sắc tố này cùng với bacteriochlorophill có hoạt tính quang

hợp. Sắc tố puncherimin được tạo thành trong nấm men Candida puncherima. Sắc tố này nếu

trên môi trường có chứa Fe nó sẽ tạo nên màu đỏ tối. Sắc tố prodigiozin làm cho khuẩn lạc

Serratia marcescens (Bacterium prodigiosum) có màu đỏ sáng. Sắc tố indigoidin ở

Pseudomonas indigofera và nhiều vi khuẩn khác làm cho vi khuẩn có màu lam. Vi khuẩn mủ

xanh Pseudomonas acruginosa tạo thành sắc tố piocianin và một số sắc tố khác. Một số sắc tố

có tính chất kháng sinh. Chính vì vậy nhiều vi sinh vật có màu sắc có khả năng sinh ra chất

kháng sinh.

2.2. Qúa trình dinh dưỡng của vi sinh vật

2.2.1. Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật

Căn cứ vào nhu cầu của vi sinh vật người ta chia thức ăn làm ba loại:

- Thức ăn năng lượng: thức ăn sau khi hấp thu sẽ cung cấp cho vi sinh vật một số năng

lượng cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Ví dụ: các loại protein, glucid, lipid ...

- Thức ăn kiến tạo: thức ăn loại này sau khi hấp thụ sẽ tham gia xây dựng các cấu trúc của

vi sinh vật. Trong thực tế thì một loại thức ăn nó vừa là nguồn năng lượng vừa là nguyên

liệu để xây dựng các cấu trúc.

- Chất sinh trưởng: là những chất cần thiết cho hoạt động sống của một loại vi sinh vật nào

đó mà nó không tự tổng hợp được. Ví dụ: vitamin

Căn cứ vào, nguồn các bon, nguồn năng lượng, chất nhận điện tử cuối cùng, người ta

còn phân chia vi sinh vật thành các kiểu dinh dưỡng sau.

Căn cứ vào nguồn carbon:

+ Dị dưỡng carbon: sử dụng nguồn carbon trong tự nhiên từ các hợp chất hữu cơ, đồng

thời thu được nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của mình.

63

+ Tự dưỡng carbon: sử dụng nguồn các bon từ các chất vô cơ như CO2 hoặc các muối

carbonate. Nguồn năng lượng được lấy trực tiếp năng lượng của ánh sáng mặt trời hoặc sử

dụng năng lượng hóa học nhờ sự oxi hóa hợp chất vô cơ.

Căn cứ vào nguồn năng lượng:

+ Dinh dưỡng quang năng: lấy năng lượng từ ánh sáng mặt trời và chuyển hóa thành

năng lượng hóa học (tích lũy dưới dạng ATP), các vi sinh vật này phải có chứa sắc tố quang

hợp.

+ Dinh dưỡng hóa năng: là những vi sinh vật sử dụng năng lượng chứa trong các hợp

chất hóa học.

Căn cứ vào nguồn carbon và nguồn năng lượng:

Nhóm tự dưỡng

- Tự dưỡng quang năng: Nguồn C là CO2, nguồn năng lượng là ánh sáng.

- Tự dưỡng hoá năng: Nguồn C là CO2, nguồn năng lượng là hợp chất vô cơ

Nhóm dị dưỡng

- Dị dưỡng quang năng: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là ánh sáng.

- Dị dưỡng hoá năng: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là từ sự chuyển hoá

trao đổi chất của chất nguyên sinh của một cơ thể khác.

- Dị dưỡng hoại sinh: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là từ sự trao đổi chất

của chất nguyên sinh các xác hữu cơ.

- Dị dưỡng kí sinh: Nguồn C là chất hữu cơ, nguồn năng lượng là lấy từ các tổ chức

hoặc dịch thể của một cơ thể sống.

64

2.2.2. Cơ chế hấp thụ chất dinh dưỡng của vi sinh vật

Để tồn tại và phát triển, tế bào vi sinh vật thường xuyên phải trao đổi chất và năng

lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng nhận các chất dinh dưỡng cần thiết từ môi

trường ngoài, mặt khác thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Như vậy, giữa môi trường

xung quanh và môi trường bên trong tế bào tồn tại một hàng rào thẩm thấu, hàng rào này

chính là màng tế bào chất lypoprotein.

Vận chuyển của các chất qua thành tế bào tương đối đơn giản. Sự xâm nhập của nước và

các chất hòa tan qua màng tế bào chất là quá trình động học; tế bào vi sinh vật đang sống

không bao giờ ở trạng thái cân bằng với môi trường xung quanh. Các chất được vận chuyển

qua màng tế bào chất thông qua một trong hai cơ chế: vận chuyển thụ động (bao gồm cơ chế

khuếch tán và thẩm thấu) và vận chuyển chủ động nhờ các kênh protein đặc biệt có trên bề

mặt tế bào (bao gồm kênh đơn cảng, kênh đồng cảng và kênh đối cảng). Ngoài ra, đối với các

chất có kích thước lớn, các tế bào vi sinh vật còn có cơ chế ẩm bào và thực bào.

2.2.2.1 Vận chuyển thụ động

* Khuếch tán: Các phân tử đi qua màng nhờ sự chênh lệch nồng độ hay chênh lệch điện

thế ở hai phía của màng. Quá trình này không đòi hỏi việc cung cấp năng lượng của tế bào.

Các phân tử kích thước nhỏ, không phân cực như CO2, O2 có thể trực tiếp khuếch tán

qua lớp màng phospholipid kép. Các phân tử lớn hơn, có phân cực như glucose phải nhờ các

kênh protein xuyên màng (được gọi là permease). Chất hòa tan liên kết thuận nghịch vào một

vị trí trên phân tử permease nằm ở bên trong màng (có thể ở các lỗ của màng). Phức hợp chất

hòa tan được vận chuyển theo cả hai phía của màng nhờ sự chênh lệch nồng độ của một chất

nào đó, nghĩa là sự vận chuyển diễn ra theo kiểu ''xuôi dòng'' và không cần sử dụng năng

lượng.

65

Hình 2. 1 Vận chuyển thụ động ở tế bào vi sinh vật

* Thẩm thấu: Là cơ chế vận chuyển phân tử nước qua màng tế bào thông qua kênh đặc

hiệu Aquaporin. Nước có thể được vận chuyển đi vào hoặc đi ra tế bào tùy thuộc môi trường

xung quanh là nhược trương, ưu trương hay đẳng trương so với dịch tế bào chất. Trong môi

trường nhược trương, tế bào sẽ ở trạng thái trương phồng, do nước thẩm thấu vào trong tế bào

chất. Trong môi trường ưu trương, nước thoát ra ngoài môi trưòng dẫn đến hiện tượng co

nguyên sinh.

Hình 2. 2 Cơ chế thẩm thấu

66

2.2.2.2 Vận chuyển chủ động

Vận chuyển các chất đi ngược chiều gradient nồng độ, nhờ kênh permease trên màng tế

bào hoạt động nhờ năng lượng ATP. Tốc độ vận chuyển vật chất phụ thuộc vào trạng thái

sinh lý và nhu cầu tế bào. Quá trình diễn ra theo 3 bước:

Bước 1. Chất hòa tan kết hợp với permease

Bước 2. Permease xoay 180O hoặc biến đổi cấu hình

Bước 3. Permease giải phóng chất hòa tan ở phía bên kia.

Có 3 loại kênh permease đảm nhiệm vai trò này.

Kênh đơn cảng (Uniport): vận chuyển riêng từng chất

Kênh đồng cảng (Symport): vận chuyển đồng thời 2 chất cùng chiều

Kênh đối cảng (Antiport): vận chuyển đồng thời 2 chất ngược chiều

Hình 2. 3 Các kênh vận chuyển chủ động

2.3. Qúa trình trao đổi chất và năng lượng

2.3.1 Khái niệm

Trao đổi chất là chỉ các chuyển hoá có liên quan đến quá trình tổng hợp và phân huỷ

trong tế bào. Trao đổi chất gồm có hai quá trình đồng hoá và dị hoá.

67

Quá trình đồng hoá: là quá trình chế biến lại các chất dinh dưỡng được hấp thụ thành

chất riêng của tế bào từng loại vi sinh vật. Quá trình này còn gọi là sự trao đổi kiến tạo hay sự

sinh tổng hợp, đây là quá trình thu nhiệt.

Quá trình dị hoá: quá trình phân huỷ các thành phần bên trong tế bào. Sản phẩm của sự

phân huỷ được thải ra ngoài môi trường hay được tế bào sử dụng.

Quá trình trao đổi năng lượng: là quá trình phân huỷ có kèm giải phóng năng lượng.

Sự chuyển hóa năng lượng (trao đổi năng lượng) của động vật bậc cao trùng hợp với

quá trình trao đổi chất (đồng hóa và dị hóa). Nhưng đối với vi khuẩn không nhất thiết có sự

trùng hợp này. Đối với nhóm vi sinh vật kỵ khí quá trình oxi hóa sinh năng lượng không kèm

theo việc liên kết với oxi không khí. Ngày nay người ta hiểu rằng oxi hóa không chỉ có nghĩa

là liên kết với oxi mà bao gồm cả quá trình mất hydro như quá trình tách hydro hoặc quá trình

mất electron tăng thêm hóa trị dương.

* Phụ thuộc vào sự có mặt của oxi trong quá trình chuyển hóa của vi khuẩn, người

ta chia chúng ra làm các nhóm sau:

- Vi khuẩn hiếu khí: cần oxi cho quá trình phát triển, hô hấp là quá trình chuyển hóa

năng lượng diễn ra trong chuỗi dài cytochrom có sự tham gia của men vàng Obiquinon,

nhưng chất nhận e cuối cùng là O2. Bao gồm nhóm hiếu khí tuyệt đối và nhóm vi hiếu khí, chỉ

cần 5% O2.

- Vi khuẩn kỵ khí: hô hấp kỵ khí thuần túy và lên men, chất nhận điện tử cuối cùng

không phải là oxi mà là các chất vô cơ, hoặc chất hữu cơ. Các vi khuẩn nhóm này không có

hệ thống Cytocrom và các men peroxidase, deoxidase để phân hủy O2 cho nên O2 độc với

chúng

Tóm lại quá trình đồng hóa năng lượng là quá trình tăng ATP trong tế bào còn quá trình

dị hóa là giảm ATP trong tế bào.

68

2.3.2 Quá trình trao đổi năng lượng

Bản chất của quá trình trao đổi năng lượng – sự hô hấp – là quá trình oxi hoá khử được

thực hiện bằng sự khử điện tử của cơ chất và chuyển điện tử này cho chất nhận, hoàn thành

giai đoạn oxi hoá khử giải phóng ra năng lượng. Sự hô hấp khác nhau của vi sinh vật phụ

thuộc vào chất nhận điện tử cuối cùng của quá trình oxi hoá khử: có thể là oxi phân tử (O2), là

chất hữu cơ hay chất vô cơ.

Năng lượng giải phóng sẽ được giữ lại trong các hợp chất giàu năng lượng trong tế bào

(ATP, axetyl photphat, axetyl CoA) trong số này quan trọng nhất là ATP. Năng lượng của

của ATP được dùng trong hầu hết các phản ứng cần năng lượng; AMP, ADP, ATP rất dễ

chuyển hoá tương hỗ lẫn nhau, do đó sử dụng rất tốt trong quá trình trao đổi năng lượng.

Hình 2. 4 Cấu tạo phân tử cao năng ATP

Quá trình trao đổi năng lượng bắt đầu với quá trình đường phân glycolysis, chuyển hóa

glucose thành pyruvat. Nếu đây nhóm vi sinh vật hô hấp hiếu khí, pyruvat sẽ tham gia vào

chu trình Krebs, để oxi hóa hoàn toàn thành năng lượng cung cấp cho tế bào, sản phầm tạo

thành kèm theo là CO2 và H2O. Nếu đây là nhóm vi sinh vật hô hấp kỵ khí, pyruvat sẽ tham

gia vào quá trình lên men tạo sản phẫm hữu cơ tích trữ năng lượng cho tế bào, lượng ATP thu

được của quá trình này là rất ít.

69

2.3.2.1 Quá trình đường phân

Quá trình đường phân hay còn gọi là Glycolysis, là giai đoạn đầu tiên thực hiện các

phản ứng hóa học, phân cắt phân tử glucose 6C thành acetyl Coenzyme A 3C. Quá trình này

diễn ra trong phần nền tế bào chất. Có 3 con đường chính sau đây:

 Con đường E.M.P

(Empden-Meyehof-Pasnas): 1 phân tử

glucose chuyển thành 2 phân tử pyruvat

qua 10 phản ứng tạo ra các chất trung

gian đều ở dạng photphoryl hóa, cung cấp

6 tiền chất dùng để tổng hợp các đơn vị

cấu trúc là Glc-6-P, Fruct-6P, 3-P

2NAD+

Glyceralde hye

2P

glyceraldehyd, 3-P-glyxerat, P-enol

pyruvat và pyruvat. ATP được tạo thành

7

6 (2) 1,3-bisphosphoglycerate 2AD P

Phosphoglyce rate kinanase

do photphoryl hóa cơ chất

(2) 3-

8

Phosphoglyce rate mutase

Glucose  2 pyruvat +2ATP +2NADH2

2H2

(2) 2- 9

Enola

Piruvate

1

(2) Phosphoenolpyruvate 2AD P

Hình 2. 5 Con đường đường phân

(2)

Empden – Meyehof- Pasnas

 Con đường PP (Pentose-phostphat): Chuyển hóa 1 glucose thành 1 phân tử puruvat,

cung cấp cho tế bào hai tiền chất khác nhau trong tổng hợp các đơn vị cấu trúc là ribose-5P

(dùng để tổng hợp acid nucleic, ADP,...), erytrose -4-P- (tổng hợp các acid amin thơm) cùng

các NADPH2

Glucoza  1 pyruvat  +3 CO2 + 6NADPH2+1NADH2+1ATP

70

Hình 2. 6 Con đường đường phân Pentose phosphat

 Con đường Enter-Doudoroff (KDPG)

Chỉ gặp ở vi khuẩn chuyển hóa gluconat: Pseudomonas, saccharofhila và Alcaligenes

phân giải 100% glucose theo con đường này.

71

Hình 2. 7 Con đường đường phân Enter – Doudoroff

Giữa 3 con đường chuyển hóa chuyển hóa trên có mối quan hệ qua lại với nhau và tùy

thuộc vào loại hình vi sinh vật khác nhau tỷ lệ % đường được phân giải theo từng con đường

là không giống nhau.

2.3.2.2 Quá trình hô hấp hiếu khí

Trước hết pyruvate sinh ra từ quá trình đường phân trong điều kiện có oxi được chuyển

hóa thành acetyl -CoA nhờ phức hệ pyruvat-dehydrogenase.

Pyruvate +CoA + NAD  Axetyl-CoA +NADH2 +CO2

Acetyl-CoA là phân tử có 2 C, chứa liên kết cao năng sẽ đi vào chu trình krebs xảy ra ở chất

nền ty thể. Chu trình Krebs còn gọi là chu trình axit citric, chu trình axit tricarboxylic (chu

trình ATC), là một chuỗi các phản ứng hóa học xúc tác bởi enzyme có vai trò quan trọng bậc

nhất trong mọi tế bào sống có dùng oxy trong hô hấp tế bào.

72

Hình 2. 8 Chu trình Kreb (Chu trình ATC)

Về mặt chức năng, có thể xem chu trình krebs là con đường oxi hóa acetyl-CoA thành

CO2. Bước đầu tiên là gắn kêt acetyl vào chất mang là oxaloacetae để tạo thành citrate. Bước

thứ 2 bắt đầu với citrate và kết thúc với việc tạo thành succinyl-CoA, phần mang acetyl của

citrate bị mất 2C khi oxi hóa tạo 2 CO2. Bước thứ 3 chuyển hóa succinyl-CoA trở lại thành

axaloacetae, vai trò là chất mang acetyl-CoA để chất này quay lại chu trình nhận mang 1 phân

tử acetyl-CoA mới.

Kết quả của chu trình:

+ Hai nguyên tử c dưới dạng acetyl CoA vào chu trình ngưng tụ với acid oxaloacetic.

Hai nguyên tử c ra khỏi chu trình dưới dạng C02 do các phản ứng khử C02 ở phản ứng

3 và 4.

+ Bốn cặp H2 ra khỏi chu trình: 3 ở dạng NADH và 1 là FADH2. Các cặp H2 này vào

chuỗi hô hấp tế bào cho 11 ATP. 1 liên kết phosphat giàu năng lượng hình thành ở

GTP được dùng tạo 1 phân tử ATP. Tổng cộng 12 ATP.

+ Sử dụng 2 phân tử H2O

73

Các enzyme tham gia trong chu trình Krebs đều là các enzyme phổ biến gặp ở vi sinh

vật. Chu trình thực hiện hoàn toàn ở các nhóm vi khuẩn hiếu khí, nguyên sinh động vật, hầu

hết tảo và nấm. Đây là nguồn cung cấp năng lượng chính cho cơ thể sinh vật hiếu khí, đồng

thời cung cấp các chất trung gian là khung carbon dùng cho sinh tổng hợp các chất khác trong

tế bào.

2.3.2.3 Hô hấp yếm khí - quá trình lên men

Hô hấp hiếu khí hay còn gọi là quá trình lên men là quá trình oxi hóa khử acid purivic –

sản phẩm của quá trình đường phân – tích trữ năng lượng trong các hợp chất hữu cơ. Quá

trình đòi hỏi sự vắng mặt oxi, tạo thành rất ít năng lượng ATP. Tùy thuộc sản phẩm tạo thành

mà người ta phân loại các quá trình lên men khác nhau.

Hình 2. 9 Khả năng lên men của một số loài vi sinh vật

 Lên men rượu: Chuyển hóa đường glucose thành rượu etylic và CO2. Loài phổ biến là

nấm men Saccharomyces cerevisiae.

74

 Lên men lactic: chuyển hóa glucose thành acid lactic.

Nhóm vi khuần lên men lactic đồng hình như Lactose bacterium và Streptococcus sẽ

đường phân glucose thyanh2 acid pyruvic theo con đường E.M.P, sau đó khử thành

acid lactic.

C6H12O6 2CH3COCOOH + 4H

CH3COCOOH + 4H  2CH3CHOHCOOH

Nhóm vi khuần lên men lactic dị hình như Streptococcaceae và Lactobacillaceae

đường phân glucose không theo con đường E.M.P, sản phẩm tạo thành chỉ có 40% là

acid lactic, còn lại là các sản phẩm phụ khác như acid succinic (20%), rượu etylic

(10%), acid acetic (10%), các chất khác (20%)…

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + CH3COOH + CH3CH2OH +CO2

 Lên men butyric: Thường gặp ở vi khuẩn Clotridium sống trong điều kiện kỵ khí tuyệt

đối, chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic rồi chuyển hóa thành acid butyric.

Đây là quá trình đóng vai trò quan trọng trong sản xuất phomat, tạo nên vị hơi nồng

và các lỗ trong phomat.

C6H12O6  2CH3COOH + 4H

2CH3COOH  2CH3CHO + CO2

CH3CHO + CH3CHO  CH3CHOHCH2CHO

CH3CHOHCH2CHO  CH3CH2CH2COOH

 Lên men propionic: vi khuần Bacterium acidi propionici có khả năng lên men acid

pyruvic thành acid propioni nhờ enzyme hoạt động trong điều kiện yếm khí

3CH3CH(OH)COOH  2CH3CH2COOH + CH3COOH + CO2 + H2O + Q

75

 Lên men acid acetic: Acetobacter orleanenes, A. schutzenbacii oxi hóa rượu etylic

thành acid acetic trong điều kiện yếm khí.

CH3CH2OH + O2  CH3COOH + H2O + 117kcal

2.4. Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

2.4.1. Lý thuyết về sự phát triển của vi sinh vật

2.4.1.1 Khái niệm cơ bản

Tế bào vi khuẩn khi được nuôi cấy vào môi trường dinh dưỡng thích hợp, vi khuẩn sẽ

sinh trưởng, tăng khối lượng và thể tích, tổng hợp các thành phần tế bào cho đến khi kích

thước lớn gấp đôi. Vi khuẩn phân chia cho hai tế bào. Hai tế bào này, lại tiếp tục sinh trưởng

và phân chia thành 4, rồi 8, 16, 32 … tế bào. Sự sinh trưởng của 1 quần thể vi sinh vật được

định nghĩa là sự tăng sinh số lượng hoặc sinh khối của quần thể đó. Tốc độ tăng trưởng: là sự

tăng sinh số lượng hoặc sinh khối của quần thể vi sinh vật trên 1 đơn vị thời gian.

Để biểu thị tốc độ tăng trưởng, ta có thời gian thể hệ hay thời gian nhân đôi: thời gian 1

quần thể vi sinh vật tăng gấp đôi số lượng = thời gian từ 1 tế bào mẹ ban đầu hình thành 2 tế

bào con. Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là N0 thì sau n lần phân chia ta sẽ có số tế

bào tổng cộng là N:

N = N0 x 2n

Quần thể vi sinh vật có thể tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy liên tục – hệ thống

mở hoặc môi trường nuôi cấy không liên tục – hệ thống kín

2.4.1.2 Sinh trưởng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

Phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta không thêm vào đó chất dinh dưỡng

cũng không loại bỏ đi các sản phẩm trao đổi chất cuối cùng gọi là nuôi cấy tĩnh, sự phát triển

của vi khuẩn khi nuôi cấy tĩnh diễn ra qua 4 pha:

76

Hình 2. 10 Sinh trưởng phát triển của vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

* Pha lag: pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy cho đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ

sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa có khả năng sinh

sản), có thể đây là giai đoạn vi sinh vật làm quen với môi trường nuôi cấy mới và chuẩn bị

cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó. Thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình

tổng hợp các chất, trước hết là các cao phân tử (protein, enzime, acid nucleic,...) diễn ra mạnh

mẽ. Chẳng hạn một số enzime cần cho quá trình tổng hợp thuộc các endoenzime loại

proteinase, amylase, và các enzime nằm trong quá trình chuyển hóa glucide, đều được hình

thành trong pha này. Độ dài của pha này phụ thuộc vào tuổi của ống giống và thành phần của

môi truờng. Chẳng hạn pha lag sẽ không có nếu chúng ta dùng ống giống gồm các tế bào ở

pha sinh trưởng logarit và cấy chúng vào cùng một môi trường dưới những điều kiện nuôi cấy

như nhau. Trái lại nếu ta cấy các tế bào ở pha ổn định vào một môi trường và điều kiện nuôi

cấy như nhau thì vẫn có pha lag. Thường tế bào giống càng già thì pha lag càng dài. Như vậy

pha lag phụ thuộc vào những yếu tố sau: tuổi giống, lượng cấy giống và thành phần của môi

trường.

* Pha logarit: Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa, nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình: N = N0 x 2ct, kích thước tế bào thành

phần dinh dưỡng, hoạt tính sinh lý, nói chung không thay đổi theo thời gian. Tế bào ở trạng

thái động học và đuợc coi như là những tế bào tiêu chuẩn.

77

* Pha ổn định: trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, đa số

tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả cả tế bào và cả sinh khối không tăng

cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho nên khi

giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hòan toàn) tôc độ sinh trưởng của vi khuẩn

cũng giảm. Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của trao

đổi chất (rượu acid hữu cơ) và việc cạn chất dinh duỡng.

* Pha tử vong: trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo luỹ thừa

(mặc dù số lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào tự phân nhờ các

enzyme của bản thân. ở các vi khuẩn sinh bào tử thì giai đoạn này phức tạp hơn do quá trình

hình thành bào tử.

2.4.1.3 Hiện tượng sinh trưởng kép

Trong trường hợp khi nguồn năng lượng và cacbon trong môi trường mới khác với môi

trường trước đó, thì sự thích nghi với điều kiện mới có thể dẫn đến sự tổng hợp các loại

enzym mới mà trước đây chưa có trong môi trường cũ. Chất dinh dưỡng mới có thể là nguyên

nhân khiến vi sinh vật tạo ra enzym mới.

Ví dụ nếu trong môi trường nuôi cấy có nguồn C của hỗn hợp gồm 2 chất hữu cơ khác

nhau, lúc này vi sinh vật sẽ tổng hợp loại enzym để phân giải loại hợp chất dễ đồng hóa hơn.

Khi chất này đã cạn, vi sinh vật sẽ tổng hợp loại enzym để phân giải hợp chất cacbon thứ hai

này.

Trên đồ thị sinh trưởng ta sẽ thấy hai pha tiềm phát, hai pha cấp số, hai pha cân bằng

động. Trong trường hợp tỷ lệ các nguồn cacbon khác nhau, ta cũng có đồ thị sinh trưởng kép

nhưng độ dài của từng pha khác nhau.

78

Hình 2. 11 Đường cong sinh trưởng kép của vi sinh vật

2.4.1.4 Tăng trưởng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy liên tục

Trong điều kiện nuôi cấy liên tục, kéo dài thời gian sinh trưởng, tức là kéo dài pha thứ

III. Muốn làm được như vậy người ta bố trí, hệ thống nuôi cấy gồm một hệ thống bình cấy,

phía trên nối với dung dịch nuôi cấy. Phía dưới nối với hệ thống thu sinh khối. Trong bình

nuôi cấy có hệ thống sục khí và que khuấy. Sau một thời gian nuôi cấy người ta rút ra một

lượng dung dịch vi khuẩn, sau đó cho vào bình, dịch nuôi cấy vi khuẩn, bằng lượng lấy ra.

Như vậy, vi khuẩn sinh sản liên tục, phương pháp này có thể thu được sinh khối lớn.

Hình 2. 12 Sinh trưởng của vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy liên tục

Ngày nay trong công nghiệp, người ta có thể nuôi cấy thu sản phẩm từ vi sinh vật liên tục nhờ

vào các hệ thống nuôi cấy liên tục bioreactor có các thiết bị kiểm soát toàn bộ quá trình nuôi

cấy. 79

Hình 2. 13 Hệ thống nuôi cấy liên lục chemostat và bioreactor

2.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật

2.4.2.1 Các tác nhân vật lý

a. Độ ẩm

Hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan đến nước và tỷ lệ nước trong tế bào của

chúng rất cao. Nấm men 73-82%, nấm mốc 84-90%, vi khuẩn 75-85%. Vì vậy thiếu nước tế

bào có thể bị chết do hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào. Sự đề kháng của vi sinh vật với

trạng thái khô phụ thuộc vào:

• Nguồn gốc vi sinh vật: vi sinh vật trong không khí chịu khô tốt hơn vi sinh vật

trong đất, nước.

• Loại hình vi sinh vật: sự đề kháng với trạngthái khô của nhóm xạ khuẩn > vi

khuẩn > nấm mốc.

• Trạng thái tế bào: tế bào già, tế bào có nha bào đề kháng đè kháng tốt hơn tế bào

khô, tế bào không có nha bào.

b. Nhiệt độ

Hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì

các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu

sắc đến các quá trình sống của tế bào. Hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở

nhiệt độ cao protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hô hấp

đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. 80

Nhiệt độ thấp (dưới vùng sinh động học) có thể làm bất hoạt các chất vận chuyển các

chất hòa tan qua màng tế bào chất, do thay đổi cấu hình không gian của permease chứa trong

màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ

động các chất dinh dưỡng.

Nhiệt độ cao trên 650C sẽ gây tác hại cho vi sinh vật và ở nhiệt độ 1000C hoặc hơn vi

sinh vật sẽ bị tiêu diệt gần hết trong một thời gian nhất định. Đó là do nhiệt độ cao đã làm

biến tính protein tế bào, enzyme bất hoạt, mang tế bào bị phá hủy và có thể tế bào bị đốt cháy

hoàn toàn.

Giới hạn giữa nhiệt độ cực tiểu và nhiệt độ cực đại là vùng nhiệt sinh trưởng của vi sinh

vật. Giới hạn này rất khác nhau giữa các loài vi khuẩn: tương đối rộng ở các vi khuẩn hoại

sinh nhưng rất hẹp ở các vi khuẩn gây bệnh. Tùy theo quan hệ với vùng nhiệt có thể chia vi

khuẩn thành một số nhóm.

+ Vi khuẩn ưa lạnh: sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ dưới 200C thường gặp trong nước

biển, các hồ sâu và suối nước lạnh, chẳng hạn vi khuẩn phát quang, vi khuẩn sắt …

+ Vi khuẩn ưa ấm: chiếm đa số, cần nhiệt độ trong khoảng 20-400C. Ngoài các dạng

hoại sinh ta còn gặp các dạng ký sinh gây bệnh cho người và động vật, chúng sinh trưởng tốt nhất ở 37 0C - tương ứng với nhiệt độ cơ thể người và động vật.

+ Vi khuẩn ưa nóng: giới hạn nhiệt độ sinh trưởng là 30-70oC, thích hợp 55-60oC gồm

các vi sinh vật sinh trưởng trong đất, phân rác, suối nước nóng. Các vi khuẩn ưa nóng gồm

chủ yếu là các xạ khuẩn, các vi khuẩn sinh bào tử. Thường gặp chúng trong suối nước nống,

trong phân ủ.

Bảng 2. 4 Các nhóm vi khuẩn theo nhiệt độ

Nhiệt độ sinh trưởng (0C) Nhóm vi

khuẩn Cực tiểu Tối thích Tối đa

0-5 5-15 15-20 Ưa lạnh

10-20 20-40 40-45 Ưa ấm

81

Ưa nóng 25-45 45-60 60-80

c. Áp suất thẩm thấu

Màng tế bào vi khuẩn là màng bán thấm và việc điều chỉnh thẩm áp qua các hệ thống

permease đều có liên quan đến màng này. Trong môi trường ưu trương tế bào mất khả năng

hút nước và các chất hòa tan, tế bào chịu trạng thái khô sinh lý, bị co nguyên sinh chất và có

thể chết nếu kéo dài. Ngược lại khi đưa vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước sẽ xâm

nhập vào tế bào, áp lực bên trong tế bào tăng lên.

Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt hơn trong môi trường chứa ít hơn 20% muối. Nồng độ

muối cao hơn có hại cho tế bào, nhưng cũng có loại vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường

chứa 30% muối, ta gọi chúng là vi khuẩn ưa muối, nhiều vi khuẩn ở biển thuộc nhóm này.

Chúng có thể phát triển tốt trong môi trường có nồng độ đường cao gọi là vi khuẩn ưa đường.

d. Sóng siêu âm

Sóng âm thanh đặc biệt là trong vùng siêu âm có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi

khuẩn. Với tần số 8.800-8.900Hz xử lý trong 40-60 phút sẽ giảm 99% vi khuẩn. Các tế bào

sinh dưỡng bị chết nhanh chóng, tế bào non mẫn cảm hơn nhiều so với tế bào già. Mẫn cảm

nhất là tác dụng của sóng siêu âm lên các tế bào hình sợi, ít mẫn cảm nhất là các tế bào hình

cầu. Nhưng sóng siêu âm hầu như không có tác dụng với các bào tử và các tế bào vi khuẩn

kháng acid.

Do tác dụng của siêu âm mà độ nhớt của môi trường tăng lên, xuất hiện các chất nâng

cao sức căng bề mặt và trong nguyên sinh chất hình thành bọt khí nhỏ. Kết quả là tế bào bị

hủy hoại. Hiện nay người ta ứng dụng siêu âm để thu nhận các chế phẩm vô bào hoặc để tách

các enzyme nội bào, phân lập một số thành phần của tế bào, riboxom, thành tế bào và màng tế

bào chất.

e. Sức căng bề mặt

Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể, vi khuẩn chịu ảnh hưởng của sức căng bề

mặt của môi trường. Đa số các môi trường dịch thể dùng trong phòng thí nghiệm có sức căng

82

bề mặt trong khoảng 5,7-0,63 mN/cm. Những thay đổi mạnh mẽ của sức căng bề mặt có thể

làm ngừng sinh trưởng và làm chết tế bào. Khi sức căng bề mặt thấp, các thành phần tế bào bị

tách khỏi tế bào. Điều này chứng tỏ thành tế bào bị tổn thương. Các chất nâng cao sức căng

bề mặt, hầu hết là các muối vô cơ, các chất làm giảm sức căng bề mặt hầu hết là các acid béo,

anchol, các chất này được gọi là các chất có hoạt tính bề mặt. Tác dụng của chúng thể hiện

trong việc làm thay đổi các đặc tính của bề mặt tế bào vi khuẩn, trước hết là nâng cao tính

thấm của tế bào. Trong thực tế người ta ứng dụng hiện tượng này trong nuôi cấy vi khuẩn

kháng acid. Khác với các vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng acid, có bề mặt kỵ nước và giảm sức

căng bề mặt của môi trường sẽ kích thích sinh trưởng của chúng. Sức căng bề mặt còn ngăn

cản vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khỏi cạnh tranh sinh trưởng.

f. Tia bức xạ

Ánh sáng có thể gây ra những biến đổi hóa học và tổn thương sinh học, nếu tế bào hấp

thu. Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức năng lượng trong lượng tử ánh sáng hay tùy thuộc

vào chiều dài bước sóng ánh sáng. Các tia bức xạ gây nên những biến đổi hóa học của các nguyên tử và phân tử có chiều dài sóng khoảng 10000 A0. Thuộc loại sau: ánh sáng mặt trời,

tia tử ngoại, tia X, tia Gamma và tia vũ trụ, các tia sáng này có năng lượng rất lớn. Khi được

vật chất hấp phụ chúng có thể làm bắn ra các electron từ vật chất đó. Vì vậy các tia này được

gọi là tia bức xạ ion hóa. Những bức xạ với chiều dài bước sóng lớn hơn có năng lượng quá

nhỏ, không đủ gây nên những biến đổi hóa học và tác dụng biểu hiện chủ yếu là nhiệt như tia

hồng ngoại.

2.4.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố hóa học

Trong các yếu tố hóa học ảnh hưởng đến chức phận sống của tế bào, trước hết phải kể

đến, nồng độ ion hydro (pH), thế oxy hóa khử của môi trường, các chất sát trùng và các chất

hóa trị liệu.

a. Ảnh hưởng của pH môi trường

Đa số vi sinh vật sinh trưởng tốt trong môi trường có pH =7, nhưng nhiều vi khuẩn gây

bệnh trên cơ thể người và động vật thì pH của máu, huyết thanh là 7,4. Các vi khuẩn nitrat

83

hóa, vi khuẩn nốt sần, vi khuẩn phân giải ure lại ưa môi trường kiềm, một số khác lại ưa acid

như Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thioxydans (oxy hóa lưu huỳnh thành SO4 có thể

sinh trưởng ở pH <1).

Màng tế bào chất của vi khuẩn ít thấm đối với các ion H+ và OH-. Mặc dù pH bên ngoài

môi trường dao động trong giới hạn rộng, nồng độ của hai ion trong tế bào chất nói chung

tương đối ổn định. Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt động của vi sinh vật có thể do kết quả của sự tác động qua lại giữa ion H+và men chứa trong màng tế bào chất và thành tế bào.

b. Thế oxi hóa khử (Eh)

Mức độ thoáng khí, nói cách khác là độ oxy hóa khử của môi trường có quan hệ chặt

chẽ với hoạt động sống của vi sinh vật, được biểu thị bằng đại lượng rH: rH= -log(H2), ở đây

H2 là nồng độ nguyên tử của H trong dung dịch hay trong khí quyển. Dung dịch bão hòa

hydro có rH=0, bão hòa oxy có rH=41. Thang rH từ 0-41 biểu thị mức độ thoáng khí của môi

trường, pH có ảnh hưởng đến giá trị rH của môi trường, sự phụ thuộc này biểu thị bởi phương

trình:

rH2= + 2pH (Eh: thế oxy hóa khử (điện thế dung dịch) tính ra volt).

Các vi sinh vật kỵ khí tuyệt đối sinh trưởng ở rH < 8 -10).

Vi sinh vật hiếu khí bắt buộc rH2 từ 10-30.

Các giá trị rH2 > 30 không có lợi ngay cả vi sinh vật hiếu khí bắt buộc.

Vi sinh vật kỵ khí hay hiếu khí tùy tiện thích ứng ở rH2 = 0- 30.

c. Các chất diệt khuẩn (sát trùng)

Các chất diệt khuẩn thường dùng nhất là phenol và các hợp chất của phenol, các

ancohol, halogen, kim loại nặng, H2O2 các thuốc nhuộm, xà phòng và các chất tẩy rửa tổng

hợp của các muối amon bậc bốn.

84

+ Phenol: Được dùng ở dạng các dung dịch để sát trùng các dụng cụ bị nhiễm bẩn. Tùy theo

nồng độ của phenol có tác dụng ức khuẩn hay diệt khuẩn. Hoạt tính của phenol bị giảm trong

môi trường kiềm và có mặt chất hữu cơ, trái lại tăng lên khi có mặt muối. Bào tử của vi sinh

vật kháng lại tác dụng của phenol. Phenol và crezol tác dụng chủ yếu lên lớp màng tế bào,

phá hoại tính bán thấm của màng tế bào chất và làm biến tính protein.

+ Ethanol: Dùng để sát trùng da, nhưng cũng như phenol ethanol không có tác dụng với bào

tử. Alcohol tác dụng bằng cách gây đông tụ protein và dung giải cấu trúc màng phospholipid.

Nhưng alcohol có nồng độ cao khử nước mạnh, do đó rút nước khỏi tế bào, cản trở sự xâm

nhập của ancohol vào tế bào vì vậy chỉ có tác dụng ức khuẩn, cố định vi khuẩn (ethanol 70%

có tác dụng sát trùng mạnh hơn 90%).

+ Các halogen tác dụng độc với vi khuẩn: Khí Cl2 được dùng để sát trùng nước, các hợp chất

của Cl được dùng để khử trùng nước. Iot dễ hòa tan trong ancol và trong dung dịch nước của

iodua kali hoặc natri. Iod có tác dụng sát trùng mạnh với tất cả các loài vi khuẩn và bào tử,

thường dùng dể sát trùng da tẩy và không khí.

d. Kim loại nặng

Đa số kim loại nặng dù ở dạng nguyên chất hay hợp chất đều có tác dụng đầu độc với vi

khuẩn, đáng kể nhất là bạc, thủy ngân, đồng, asen,... Tác dụng của các ion kim loại nặng khác

là làm bất hoạt các nhóm -SH trong phân tử enzyme và permease.

R - SH +X+  R - S -X + H (X+ là kim loại nặng)

2.4.2.3 Ảnh hưởng của yếu tố sinh học – kháng sinh

Kháng sinh là mọi chất có tác động chống vi khuẩn, ngăn cản vi khuẩn nhân lên hoặc

phá hủy vi khuẩn ở liều thấp (tầm phân tử) một cách đặc hiệu, vào một hay nhiều giai đoạn

chuyển hóa cần thiết cho sự sống của vi khuẩn, hoặc tác động vào sự sống của vi khuẩn, hoặc

tác động vào sự cân bằng hóa lý.

Kháng sinh tác động đặc hiệu có nghĩa là một loại kháng sinh chỉ tác động lên một hay

một số nhóm vi khuẩn nhất định. Tính đặc hiệu của kháng sinh càng cao thì hoạt phổ của nó 85

càng hẹp. Hoạt phổ của một kháng sinh là phạm vi các loại vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh

đó đối với toàn bộ giới vi khuẩn. Người ta chia kháng sinh thành: kháng sinh hoạt phổ rộng

và kháng sinh hoạt phổ hẹp.

Kháng sinh có thể sản xuất bằng cách, tổng hợp hóa học hoàn toàn, bán tổng hợp, nghĩa

là hóa tổng hợp từ một nhân cơ bản do vi sinh vật sản xuất ra, nguyên liệu lấy hoàn toàn từ vi

sinh vật (từ vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc).

Bảng 2. 5 Phân loại kháng sinh theo nguồn gốc

Nguồn gốc Loài Kháng sinh Phổ tác dụng

Bacillus licheniformis Bacitdraxin Gram +

Vi khuẩn Bacillus polymixa Polimycin Gram-/+

Bacillus brevis Tirotricin Tụ cầu, liên cầu

Strepstomycin (A, Streptomyces griceus Gram âm B, C) Xạ khuẩn Actinomyces fradiae Neomycin Gram -/+

Act. kanamyceticus Kanamycin Gram -

Penecilin, G, F, K, Gram + Nấm Penixillium Chrysogenum X,V, O

Tỏi Alicin Gram -/+

Thực vật Bồ công anh Lactuxin Gram -/+

Mã đề Ocubin Gram -/+

Nước bọt, nước mắt, niêm Lysozyme Gram -/+ dịch, huyết thanh Động vật Hồng cầu Eritrin Gram -/+

Huyết thanh Kháng thể Gram -/+

- Cơ chế tác động của kháng sinh

Thuốc kháng sinh tác động ở tầm phân tử, nó tác động vào tế bào vi khuẩn theo hai cơ

chế sau đây:

86

+ Cơ chế che phủ: Thuốc kháng sinh gắn lên một phân tử nhất định và ngăn cản hoạt

động của enzyme trên phân tử.

+ Cơ chế cạnh tranh: Do gần giống cấu trúc phân tử, chất kháng sinh chiếm được chỗ

của một chất khác. Đặc biệt nó có thể chiếm chỗ một phần tử cần thiết cho sự chuyển hóa của

vi khuẩn. Hai phân tử này giống nhau, cạnh tranh với enzym, làm rối loạn hoạt động của tế

bào.

Hai cơ chế trên tác động vào 4 hướng sau:

- Làm ngừng tổng hợp vách tế bào, kháng sinh ngăn trở murein

- Tác động vào màng, làm cho màng tế bào chất thay đổi tính thấm, hoặc phá vỡ màng

tế bào chất, làm ngưng quá trình trao đổi chất.

- Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic, đó là tổng hợp ARN hay ADN của tế bào.

- Làm ngưng quá trình tổng hợp protein, hoặc xúc tiến tổng hợp protein nhưng không có

quan hệ khăng khít với quá trình sống của tế bào.

Tóm lại, quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật rất đa dạng và chịu nhiều ảnh

hưởng của các yếu tố khác nhau. Qua thời gian, các loài vi sinh vật dần thích nghi với các

điều kiện môi trường và các yếu tố ảnh hưởng, dần hình thành cho mình cơ chế chống chịu và

thích nghi tốt nhất, về mặt phân tử cũng như về mặt tế bào.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Lân Dũng, 2000 – Vi sinh vật học. NXB giáo dục

2. Lương Đức Phẩm, 2009 – Cơ sở khoa học trong công nghệ bảo vệ môi trường, Tập

2, Cơ sở vi sinh. NXB giáo dục.

Vi sinh môi trường. NXB Đại học Quốc gia.

3. Đỗ Hồng Lan Chi, Bùi Lê Thanh Khiết, Nguyễn Thị Thanh Kiều, Lâm Minh Triết, 2010 –

4. Edward A.B, 2006 – Bacterial and Bacteriophage. 5th Edition, Springer. 87

CHƯƠNG 3. PHÂN GIẢI, CHUYỂN HÓA VẬT CHẤT VÀ CÁC CHU TRÌNH SINH ĐỊA HÓA

Sự chuyển hoá vật chất liên tục của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên chính là yếu tố quyết định của sự tồn tại môi trường sống xung quanh chúng ta. Trong thiên nhiên vật chất luôn luôn chuyển hoá từ dạng này sang dạng khác tạo thành những vòng tuần hoàn vật chất. Sự sống có được trên hành tinh chúng ta chính nhờ sự luân chuyển đó.

Trong các khâu của các chu trình chuyển hóa vật chất, vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng. Các nhóm vi sinh vật khác nhau tham gia vào các khâu chuyển hoá khác nhau. Nếu như vắng mặt một nhóm nào đó thì toàn bộ quá trình chuyển hoá sẽ bị dừng lại, điều này sẽ ảnh hưởng đến toàn bộ hệ sinh thái vì sự tồn tại của các loài sinh vật trong hệ sinh thái phụ thuộc vào nguồn thức ăn có trong môi trường.

3.1. Chu trình C

Sự chu chuyển của nguyên tố cacbon giữa cơ thể và môi trường nhờ hoạt động sống của các sinh vật trong hệ sinh thái. Cacbon đioxit ( CO2) trong khí quyển hay trong nước được sinh vật tự dưỡng hấp thụ và biến đổi thành các hợp chất hữu cơ phức tạp như hyđrat cacbon, protein, lipit ... thông qua quá trình quang hợp và những phản ứng sinh hoá. Một phần các chất được tạo thành cấu trúc nên cơ thể thực vật. Thực vật được động vật hay các sinh vật dị dưỡng sử dụng, sau đó, các chất bài tiết cũng như xác chết của sinh vật bị vi khuẩn phân huỷ đến giai đoạn cuối cùng ( giai đoạn kháng hoá ) trả lại Cacbon đioxit cho môi trường.

3.1.1. Vi sinh vật phân giải các hợp chất hữu cơ chứa C

Trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ chứa C nhờ có hệ enzym ngoại bào

Vi nấm Vi khuẩn Xạ khuẩn

Hình 3. 1 Một số loại vi sinh vật

88

- Vi nấm: Là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi trường một lượng lớn enzym đầy đủ các thành phần. Nấm mốc có hoạt tính phân giải các hợp chất hữu cơ chứa C đáng chú ý là Tricoderma. Ngoài ra còn có Aspergillus, Fusarium, Mucor , Rhizopus

- Vi khuẩn cũng có khả năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ chứa C, tuy nhiên cường độ không mạnh bằng vi nấm, do số lượng enzym tiết ra môi trường của vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần các loại enzym không đầy đủ. Nhóm vi khuẩn hiếu khí: Bacillus, Pseudomonas, Xenllulomonas, Achromobacter. Nhóm vi khuẩn kị khí bao gồm Clostridium. Nhóm tùy nghi bao gồm Pseudomonas, Cytophaga,…

- Xạ khuẩn cũng có khả năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ chứa C. Người ta thường sử

dụng xạ khuẩn đặc biệt là chi Streptomyces trong việc phân huỷ rác thải sinh hoạt.

3.1.1.1. Vi sinh vật phân giải hydratcarbon

* Sự phân giải Xenluloza:

Xenluloza là thành phần chủ yếu của màng tế bào thực vật. Ở cây bông, xenluloza chiếm tới 90% trọng lượng khô, ở các loại cây gỗ nói chung xenluloza chiếm 40 - 50%. Hàng ngày, hàng giờ, một lượng lớn xenluloza được tích luỹ lại trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống. Một phần không nhỏ do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, phoi bào, mùn cưa v.v.... Nếu không có quá trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất.

Xenluloza có cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là 1 polimer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccarrit gọi là xenlobioza. Xenlobioza có cấu trúc từ 2 phân tử D - glucoza. Cấu trúc bậc 2 và bậc 3 rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro. Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, bởi vậy xenluloza là hợp chất khó phân giải. Dịch tiêu hoá của người và động vật không thể tiêu hoá được chúng. Động vật nhai lại tiêu hoá được xenluloza là nhờ khu hệ vi sinh vật sống trong dạ dày cỏ.

Xenluloza là một cơ chất không hoà tan, khó phân giải. Bởi vậy vi sinh vật phân huỷ xenluloza phải có một hệ enzym gọi là hệ enzym xenlulaza bao gồm 4 enzym khác nhau: C1- xenlobiohydrolaza, Cx- Endoglucanaza, Cx- Exogluconaza, β – glucosidaza

• Enzym C1 có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng xenluloza tự nhiên có cấu hình

không gian thành dạng xenluloza vô định hình

• Endoglucanaza có khả năng cắt đứt các liên kết β - 1,4 bên trong phân tử tạo thành

những chuỗi dài

• Exogluconaza tiến hành phân giải các chuỗi trên thành disaccarit gọi là xenlobioza

89

• β - glucosidaza tiến hành thủy phân xenlobioza thành glucoza.

* Sự phân giải tinh bột:

Tinh bột (C6H10O5)n là chất dự trữ chủ yếu của thực vật. Trong tế bào thực vật, nó tồn tại ở dạng cáchạt tinh bột. Khi thực vật chết đi, tàn dư trong đất một lượng lớn tinh bột. Nhóm vi sinh vật phân huỷ tinh bột sống đất sẽ tiến hành phân huỷ chất hữu cơ này thành những hợp chất đơn giản, chủ yếu là đường và chất hữu cơ.

Tinh bột gồm 2 thành phần amilo và amylopectin. Amilo là những chuỗi không phân nhánh bao gồm hành trăm đơn vị glucoza liên kết với nhau bằng dãy nối 1,4 glucozit. Amilopectin là các chuỗi phân nhánh; các đơn vị glucoza liên kết với nhau bằng dây nối 1,4 và 1,6 glucozit (liên kết 1.6 glucozit tại những chổ phân nhánh).

Vi sinh vật phân giải tinh bột có khả năng tiết ra môi trường hệ enzym amilaza bao

gồm 4 enzym:

• α- amilaza phân tử tinh bột được cắt thành nhiều đoạn ngắn gọi là sự dịch hoá tinh bột

• β - amilaza chỉ có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,4 glucozit ở cuối phân tử tinh bột

• Amilo 1,6 glucosidaza có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,6 glucosit tại những chỗ

phân nhánh của amilopectin

• Glucoamilaza phân giải tinh bột thành glucoza và các oligosaccarit. Enzym này có khả

năng phân cắt cả hai loại liên kết 1,4 và 1,6 glucozit

* Sự phân giải đường đơn:

Quá trình phân giải xenluloza và tinh bột đều tạo thành đường đơn (đường 6 cacbon). Đường đơn tích luỹ lại trong đất sẽ được tiếp tục phân giải các nhóm vi sinh vật phân giải đường. Có hai nhóm vi sinh vật phân giải đường: nhóm háo khí và nhóm lên men. Sản phẩm của sự phân giải đường nhờ các quá trình lên men là những chất hữu cơ chưa được oxy hoá triệt để. Dựa vào các sản phẩm sinh ra người ta đặt tên cho các quá trình đó: quá trình lên men lactic, quá trình lên men etylic,..Ngoài các quá trình lên men, trong thiên nhiên còn có các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải đường bằng con đường oxy hoá. Đó là các nhóm vi sinh vật háo khí có khả năng phân huỷ triệt để đường glucoza thành CO2 và H2O qua chu trình Crebs. Sảnphẩm của các quá trình háo khí không phải là các chất hữu cơ như ở các quá trình lên men mà là CO2 và H2O.

90

3.1.1.2. Vi sinh vật phân giải lignin

Lignin là những hợp chất cao phân tử có thành phần và cấu trúc phức tạp. Vi sinh vật tiết enzym phân giải lignin có khoảng 15 loại nhưng có các enzym đóng vai trò chủ chốt là: Ligninaza, lignin pezocydaza, mangan pezocydaza và lacaza.

Vi sinh vật tham gia phân giải lignin bao gồm vi khuẩn (pseudomonas, Xanthomonas,

Acinebacter), nấm (Basidiomycetes, Acomycetes), xạ khuẩn (Streptomytes)

3.1.2. Chu trình C

Hình 3. 2 Chu trình chuyển hóa Carbon

Các hợp chất cacbon hữu cơ chứa trong động vật, thực vật, vi sinh vật, khi các vi sinh vật này chết đi sẽ để lại một lượng chất hữu cơ khổng lồ trong đất. Nhờ hoạt động của các 91

nhóm vi sinh vật dị dưỡng cacbon sống trong đất, các chất hữu cơ nàydần dần bị phân huỷ tạo thnàh CO2. CO2 được thực vật và vi sinh vật sử dụng trong quá trình quang hợp lại biến thành các hợp chất cacbon hữu cơ của cơ thể thực vật. Động vật và con người sử dụng cacbon hữu cơ của thực vật biến thành cacbon hữu cơ của động vật và người. Người, động vật, thực vật đều thải ra CO2 trong quá trình sống, đồng thời khi chết đi để lại trong đất một lượng chất hữu cơ, vi sinh vật lại bị phân huỷ nó. Cứ thế trong tự nhiên các dạng hợp chất cacbon được chuyển hoá liên tục.

3.2. Chu trình N

3.2.1. Vi sinh vật chuyển hóa các dạng hợp chất chứa N

Trong các môi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơ phân tử ở dạng khí cho đến các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong cơ thể động, thực vật và con người. Trong cơ thể sinh vật, nitơ tồn tại chủ yếu dưới dạng các hợp chất đạm hữu cơ như protein, axit amin. Khi cơ thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu cơ này tồn tại ở trong đất. Dưới tác dụng của các nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein được phân giải thành các axit amin. Các axit amin lại được một nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 hoặc NH4 gọi là nhóm vi khuẩn amôn hoá. Quá trình này còn gọi là sự khoáng hoá chất hữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng. Dạng NH4 sẽ được chuyển hoá thành dạng NO3 nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hoá. Các hợp chất nitrat lại được chuyển hoá thành dạng nitơ phân tử, quá trình này gọi là sự phản nitrat hoá được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn phản nitrat. Khí nitơ sẽ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hoá thành dạng nitơ hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố định nitơ. Như vậy, vòng tuần hoàn nitơ được khép kín. Trong hầu hết các khâu chuyển hoá của vòng tuần hoàn đều có sự tham gia của các nhóm vi sinh vật khác nhau. Nếu sự hoạt động của một nhóm nào đó ngừng lại, toàn bộ sự chuyển hoá của vòng tuần hoàn cũng sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.

3.2.1. Chu trình N

Vi sinh vật tham gia vào chu trình nitơ gồm 5 giai đoạn: Cố định N, đồng hóa N- assimilation, khoáng hóa N- ammonification, Nitrat hóa- nitrification, Khử Nitrat hóa- denitrification

92

3.2.1.1 Cố định N

Quá trình khử N bằng con đường hoá học đòi hỏi rất nhiều năng lượng và đắt tiền. Có một số tảo và vi khuẩn có khả năng khử N bằng con đường sinh học, hay nói cách khác là những vi sinh vật trên có khả năng cố định N, sản phẩm của quá trình này là NH3.

Hàng năm, các vi sinh vật cố định được một lượng N rất lớn cho môi trường tự nhiên. Vai trò của các vi sinh vật cố định N có ý nghĩa hết sức lớn lao trong nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp phân hoá học chưa phát triển.

Vi sinh vật cố định N: nhóm vi sinh vật cố định N tham gia vào phản ứng kết hợp giữa

N2 và H2 tạo thành NH3 nhờ tác dụng của E. Nitrogenaza

Có hai loại vi vật cố định N, đó là:

-Vi sinh vật cố định N không cộng sinh: bao gồm Azotobacter (A. agilis, A. chroococcum, A. vinelandii), đây là các vi khuẩn gram âm, có nang, cố định N trong đất, vi khuẩn Klebsiella, Clostridium là các loại vi khuẩn kỵ khí, tạo bào tử, có mặt trong bùn lắng;

- Vi sinh vật cố định N sống cộng sinh như vi khuẩn Rhizobium và các vi khuẩn lam như Anabaena, Nostoc, nhóm này cố định N trong đất và nước, tốc độ cố định cố định N của chúng cao gấp 10 lần các vi sinh vật cố định N sống tự do trong đất. Vị trí cố định N của vi khuẩn lam là một tế bào đặc biệt gọi là dị bào. Đôi khi vi khuẩn lam có các dạng kết hợp với các thực vật nước như Anabaena – Azolla

93

Vi sinh vật Cố định nitơ sống tự do

Azotobacter - Hiếu khí

Beijerinckia

Azospirillum - Microaerophilic (cần ít oxy)

Corynebacterium

Klebsiella - Kỵ khí tùy tiện

Erwinia

Erwinia - Kỵ khí

Clostridium

Desulfovibrio

Cộng sinh

- Vi sinh- thực vật bậc cao Cây họ đậu+Rhizobium

- Vi khuẩn lam-thực vật nước Anabaena-Azolla

3.2..1.2 Sự đồng hóa N

Các vi khuẩn dị dưỡng và tự dưỡng sử dụng nitrat và đồng hoá chúng thành amôn. Trong các công trình xử lý nước thải, sự đồng hoá N chịu trách nhiệm loại bỏ N. Các tế bào thực vật và tảo thích sử dụng N ở dạng amôn. Trong đất, các phân bón có amôn sẽ được ưa thích hơn là phân bón nitrat. Tế bào sẽ chuyển hoá nitrat hoặc amôn thành protein và tăng trưỏng cho đến khi N trở thành yếu tố giới hạn. Cứ mỗi 100 đơn vị C được đồng hoá, tế bào cần khoảng 10 đơn vị N (tỉ số C/N = 10).

3.2..1.3 Sự khoáng hóa N

Sự khoáng hoá N là sự chuyển hoá các hợp chất N hữu cơ tạo thành các dạng vô cơ.

Quá trình này được thực hiện bởi rất nhiều loại vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm).

Các protein được khoáng hoá đến amôn theo trình tự sau:

Protein → acid amin → khử amin đến amôn

94

Thí dụ sự chuyển hoá urea đến amôn được xúc tác bởi urease:

CO(NH2)2+ H2O→2NH3 + CO2

Protein được chuyển thành peptid hoặc acid amin bởi các enzym proteolytic ngoại bào.

+

Amôn được tạo bởi quá trình khử amin sau:

+

Amino acid + O2 → keto acid + NH4

Amino acid +H+ → acid + NH4

3.2..1.4 Quá trình Nitrat hóa

Sự nitrat hoá là sự chuyển hoá amôn thành nitrat bởi hoạt động của vi sinh vật. Quá

trình này được thực hiện bởi 2 loại vi sinh vật.

Chuyển hoá amôn thành nitrit:Nitrosomonas (N. europasa, N, oigocarbogenes) oxy +

hoá amôn đến nitrit thông qua hydroxyamin NH2OH. Một số vi sinh vật khác oxy hoá NH4 là Nitrosopira, Nitrosococcus, và Nitrosolobus

+ + O2 -------> 2 NH2OH + 2 H+

2 NH4

+ 1,5 O2 -------> NO2+2 H++H2O + 275 KJ (

NH4

Chuyển hoá nitrit thành nitrat: Nitrobacter (N. agilis, N. winogradski) chuyển hoá

- + 75 KJ

nitrit thành nitrat.

- + ½ O2 ---------> NO3

-, CO3

NO2

Những vi khuẩn khác oxy hoá amôn thành nitrit và sau đó nitrat là quá trình tạo ra năng 2-. Sự hiện diện của lượng. Vi sinh vật sử dụng năng lượng này để đồng hoá CO2, HCO3 oxy và lượng kiềm là để trung hoà ion H+ trong quá trình oxy hoá sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nitrat hoá.

Đối với vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, ái lực của chúng đối với oxy vẫn thấp hơn vi khuẩn

dị dưỡng hiếu khí. pH tối ưu cho sự tăng trưởng của Nitrobacter trong khoảng 7,2 – 7,8. Sự tạo thành acid của quá trình nitrat hoá có thể gây vấn đề cho khả năng đệm kém của nước thải. Mặc dù vi khuẩn tự dưỡng nitrat hoá có rất nhiều trong tự nhiên, sự nitrat hoá cũng có thể thực hiện được bởi vi khuẩn dị dưỡng ( như Anthrobacter) và nấm (như Aspergillus). Những vi sinh này sử dụng nguồn cacbon hữu cơ và oxy hoá amôn đến nitrat. Tuy nhiên, sự nitrat hoá dị dưỡng thì chậm hơn nhiều so với nitrat hoá tự dưỡng.

3.2..1.5 Quá trình khử Nitrat

95

Các hợp chất đạm dạng nitrat ở trong đất rất dễ bị khử biến thành nitơ phân tử. Quá trình này gọi là quá trình khử (phản) nitrat hoá. Nó khác với quá trình oxy hoá nitrat tạo thành NH4 còn gọi là quá trình amôn hoá (khoáng hóa). Có thể phân biệt hai quá trình trên qua sơ đồ sau:

Phản ứng khử NO3 → N2 chỉ xảy ra trong điều kiện kỵ khí. NO3- là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp kỵ khí, năng lượng tạo ra được dùng để tổng hợp nên ATP. Vi sinh vật có khả năng khử nitat hoá gồm các giống sau đây: Pseudomonas, Bacillus, Spirillum, Hyphomicrobium, Agrobacterium, Acinetobacter,...chúng thường được tìm thấy trong nước, đất và nước thải.

3.3. Chu trình P

Phospho (P) là một trong những nguyên tố đại lượng cần thiết cho mọi tế bào sống. P là thành phần quan trọng của ATP, acid nucleic (DNA, RNA), và phospholipid của màng tế bào. P có thể được dự trữ trong các hạt volutin nội bào như là polyphosphate ở cả procaryote (tiền nhân) và eucaryote (nhân thật). P còn là chất dinh dưỡng giới hạn tăng trưởng của tảo trong các ao, hồ. Nồng độ P tổng cộng trung bình dạng (vô cơ và hữu cơ) trong nước thải khoảng 10 – 20 mg/L.

3.3.1. Vi sinh vật phân giải các hợp chất P hữu cơ và P vô cơ

Sự loại bỏ phospho nhờ hoạt động của vi sinh vật như Acinetobacter, Pseudomonas, Moraxella, E. coli, Aerobbacter, Mycobacterium, Beggiatoa, thường gọi chúng là vi khuẩn polyphospho, có khả năng tích luỹ Phospho ở lượng lớn hơn nhu cầu của tế bào, khoảng 1 – 3% trọng lượng khô của tế bào. Phospho được tích tụ trong nội bào dưới dạng các hạt polyphosphate (hạt volutin) mà các hạt này có thể quan sát được dễ dàng dưới kính hiển vi. Enzyme polyphosphate kinase xúc tác sự tổng hợp polyphosphate trong sự có mặt củ ion Mg2+ bằng cách chuyển nhóm phosphoryl cuối của ATP đến chuổi polyphosphate. Sự phân hủy polyphosphate được thực hiện bởi Enzyme polyphosphate kinase

Vi khuẩn hiếu khí tích tụ polyphosphate như Acinetobacter sẽ lấy phospho dưới dạng hô hấp hiếu khí, tích luỹ chúng trong các hạt polyphosphate và giải phóng chúng trong điều kiện kỵ khí. Ví dụ như vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus lấy phospho trong điều kiện 96

hiếu khí ở tốc độ 0,4 – 0,5 mmole/g tế bào khô mỗi giờ và giải phóng chúng trong điều kiện kỵ khí ở tốc độ 0,015 mmole/g tế bào khô mỗi giờ. Mg cũng tham gia đáng kể trong polyphosphate, chúng được sử dụng và giải phóng cùng lúc với phosphate. Các vi khuẩn polyphosphate khác như: Aeromonas, Enterobacter, Pseudomonas, Klebsiella, Moraxella, cũng góp phần trong quá trình loại bỏ phosphate trong bùn hoạt tính.

3.3.2. Chu trình P

Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau. P hữu cơ có trong cơ thể động vật và thực vật, được tích luỹ trong đất khi động vật và thực vật chết đi. Những hợp chất photpho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất photpho vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành dạng dễ tan. Các hợp chất photpho vô cơ khí tan còn có nguồn gốc từ những quặng thiên nhiên như apatit, photphorit, photpho sắt, photphat nhôm ... Những hợp chất này rất khó hoà tan và cây trồng không thể hấp thụ trực tiếp được. Cây trồng chỉ có thể hấp thu được khi chúng được chuyển hoá thành dạng dễ tan. Quá trình này được thực hiện một phần quan trọng là nhờ nhóm vi sinh vật phân hủy lân vô cơ. Các muối của axit photphoric dạng dễ tan được cây trồng hấp phụ và chuyển thành các hợp chất photpho hữu cơ trong cơ thể thực vật. Động vật và người sử dụng các sản phẩm thực vật làm thức ăn lại biến photpho hữu cơ của thực vật thành P hữu cơ của động vật và người. Người, động vật và thực vật chết đi để lại P hữu cơ trong đất. Vòng tuần hoàn của các dạng hợp chất photpho trong tự nhiên cứ thế diễn ra. Vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn đó. Nếu như thiếu sự hoạt động của một nhóm vi sinh vật nào đó thì sự chuyển hoá của vòng tuần hoàn sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng.

97

Hình 3. 3 Chu trình phosphor

Chu trình phospho gồm các giai đoạn sau: khoáng hoá, đồng hoá, sự kết tủa của các hợp

chất phospho,...

Khoáng hoá (Mineralization) các hợp chất phospho hữu cơ (như inositol phosphat, caid nucleic) được khoáng hoá đến orthophosphate bởi nhiều loại vi sinh vật gồm vi khuẩn (Bacillus subtillus, Arthobacter). xạ khuẩn (Streptomyces) và nấm (Aspergillus, Penicillium). Phosphatse là enzym chịu trách nhiệm phân hủy các hợp chất có chứa phospho.

Đồng hoá Cac vi sinh vật có khả năng đồng hoá phospho, đây là thành phần trong các cấu trúc của tế bào. Một số vi sinh vật có khả năng dự trữ phoshpo ở dạng polyphosphat trong các hạt đặc biệt của tế bào.

3.4. Chu trình S

Lưu huỳnh là nguyên tố khá phong phú trong môi trường, và nước biển là nguồn chứa sulfat lớn nhất. Các nguồn khác bao gồm các khoáng chứa lưu huỳnh (FeS2, CuFeS2, pyrite, ...), nhiên liệu hoá thạch, và chất hữu cơ lưu huỳnh là một trong số các nguyên tố các nguyên tố chính của vi sinh vật, tham gia thành phần cấu tạo của acid amin (cystin, cystein và methionin), coenzym (thyamin, biotin, và CoA), ferredoxin và các enzym (nhóm –SH). Các nguồn lưu huỳnh trong nước thải bao gồm lưu huỳnh hữu cơ, có trong các sản phẩm bài tiết, và sulfate là ion thường gặp nhất trong nước tự nhiên.

3.4.1. Vi sinh vật chuyển hóa hợp chất chứa S

Sự oxy hoá các hợp chất lưu huỳnh do vi khuẩn tự dưỡng hoá năng

Trong nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng có một số loài có khả năng oxy hoá các hợp chất lưu huỳnh vô cơ như Thiosulfat, khí sulfua hydro và lưu huỳnh nguyên chất thành dạng SO42- theo các phương trình sau:

2H2S + O2 → 2 H2O + 2S + Q 2S + 3O2 + 2H2O → 2H2SO4 + Q 5Na2S2O3 + H2O + 4O2 → 5Na2SO4 + 2S2 + H2SO4 + Q H2SO4 sinh ra làm pH đất hạ xuống (diệt trừ được bệnh thối do Streptomyces gây ra và bệnh ghẻ khoai tây do pH thấp vi khuẩn không sống được). Năng lượng sinh ra trong quá trình oxy hoá trên được vi sinh vật sử dụng để đồng hoá CO2 tạo thành đường. Đồng thời một số ít hợp chất dạng S cũng được đồng hoá tạo thành S hữu cơ của tế bào vi khuẩn. Các loài vi khuẩn có khả năng oxy hoá các hợp chất lưu huỳnh theo phương thức trên là Thiobacillus thioparus và Thiobacillus thioxidans. Cả 2 loài này đều sống được ở pH thấp, thường là pH = 3, đôi khi ở pH = 1 - 1,5 hai loài này vẫn có thể phát triển. Nhờ đặc điểm này mà người ta dùng 2 loài vikhuẩn trên để làm tăng độ hoà tan của apatit.Ngoài 2 loài vi khuẩn trên còn có 2 loài vi khuẩn khác có khả năng oxy hoá các hợp chất S vô cơ, đó là Thiobacillus denitrificans

98

và Begiatra minima. Thiobacillus denitrificans có khả năng vừa khử nitrat vừa oxy hoá S theo các phương trình sau: 5S + 6KNO3 + 2CaCO3 → 3K2SO4 + 2CaSO4 + 2CO2 + 2N2 + Q

Vi khuẩn Begiatra minima có thể oxy hoá H2S hoặc S. Trong điều kiện có nhiều H2S nó sẽ oxy hoá H2S tạo thành S tích lũy trong tế bào. Trong điều kiện thiếu H2S các hạt S sẽ được oxy hoá đến khi S dự trữ hết thì vi khuẩn chết hoặc ở trạng thái tiềm sinh. Sự oxy hoá các hợp chất S do vi khuẩn tự dưỡng quang năng

Một số nhóm vi khuẩn tự dưỡng quang năng có khả năng oxy hoá H2S tạo thành SO4 2-. H2S đóng vai trò chất cho điện tử trong quá trình quang hợp của vi khuẩn. Các vi khuẩn thuộc họ Thiodaceae chlorobacteriae thường oxy hoá H2S tạo C6H12O6, H2SO4 và S. Ở nhóm vi khuẩn trên, S được hình thành không tích luỹ trong cơ thể mà ở ngoài môi trường. Sự khử các hợp chất S vô cơ do vi sinh vật

Ngoài quá trình oxy hoá, trong đất còn có quá trình khử các hợp chất S vô cơ thành H2S. Quá trình này còn gọi là quá trình phản sulfat hoá. Quá trình này được tiến hành ở điều kiện kị khí, ở những tầng nước sâu. Nhóm vi sinh vật tiến hành quá trình này gọi là nhóm vi khuẩn phản sulfat hoá:

C6H12O6 + 3H2SO4 → 6CO2 + 6H2O + 3H2S + Q Ở đây chất hữu cơ đóng vai trò cung cấp hydro trong quá trình khử SO4 có thể là đường hoặc các axit hữu cơ hoặc các hợp chất hữu cơ khác. H2SO4 sẽ bị khử dần tới H2S theo sơ đồ sau:

H2SO4 → H2SO3 → H2SO2 → H2SO → H2S

Quá trình phản sulfat hoá dẫn đến việc tích luỹ H2S trong môi trường làm ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến đời sống của thực vật và động vật trong môi trường đó. Lúa mọc trong điều kiện yếm khí có quá trình phản sulfat hoá mạnh sẽ bị đen rễ và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển.

99

3.4.2. Chu trình S

Lưu huỳnh là một trong những chất dinh dưỡng quan trọng của cây trồng. Trong đất nó thường ở dạng các hợp chất muối vô cơ như CaSO4, Na2SO4, FeS2, Na2S ... một số ở dạng hữu cơ. Trong cơ thể sinh vật, S nằm trong thành phần của các axit amin chứa lưu huỳnh như metionin, xystein và trong nhiều loại enzym quan trọng. Thực vật hút các hợp chất S vô cơ trong đất chủ yếu dưới dạng SO4 2- và chuyển sang dạng S hữu cơ của tế bào. Động vật và người sử dụng thực vật làm thức ăn và cũng biến S của thực vật thành S của động vật và người. Khi động thực vật chết đi để lại một lượng lưu huỳnh hữu cơ trong đất. Nhờ sự phân giải của vi sinh vật, S hữu cơ sẽ được chuyển hoá thành H2S. H2S và các hợp chất vô cơ khác có trong đất sẽ được oxy hoá bởi các nhóm vi khuẩn tự dưỡng thành S và SO4 2-, một phần được tạo thành S hữu cơ của tế bào sinh vật. SO4 2- lại được thực vật hấp thụ, cứ thế vòng chuyển hoá các hợp chất lưu huỳnh diễn ra liên tục. Trong đó các nhóm vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng không thể thiếu được.

100

CHƯƠNG 4. VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC, ĐẤT VÀ KHÍ

4.1. Hệ vi sinh vật trong môi trường

Trong tự nhiên, ở những môi trường bình thường nơi có các điều kiện thuận lợi cho hầu hết cơ thể sống (về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH, oxi…) thì có một khu hệ vi sinh vật phong phú về chủng loại và đông đúc về số lượng. Ví dụ: trong 1gam đất ở tầng canh tác có thể có tới khoảng hơn 20 tỷ vi khuẩn, vài chục triệu vi nấm, vài chục nghìn vi tảo; trên cơ thể chúng ta, trong 1cm2 da của vùng trán có thể có tới bốn mươi nghìn vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, còn ở vùng các ngón chân thì số vi khuẩn này là hơn một triệu; đó là chưa kể các vi sinh vật khác. Trong chương này chúng ta tìm hiểu về hệ vi sinh vật trong môi trường nước, đất và không khí để có thể áp dụng các kiến thức về hệ vi sinh vật trong nhằm giải quyết những vấn đề liên quan

Hệ vi sinh vật trong môi trường nước: Nước nguyên chất không phải là nguồn môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, vì nước nguyên chất không phải là môi trường giàu dinh dưỡng. Trong nước có hoà tan nhiều chất hữu cơ và muối khoáng khác nhau. Những chất hoà tan này rất thuận lợi cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển.

Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: Đất là môi trường thích hợp nhất đối với vi sinh vật, bởi vậy nó là nơi cư trú rộng rãi nhất của vi sinh vật, cả về thành phần cũng như số lượng so với các môi trường khác. Sở dĩ như vậy vì trong đất nói chung và trong đất trồng trọt nói riêng có một khối lượng lớn chất hữu cơ. Đó là nguồn thức ăn cho các nhóm vi sinh vật dị dưỡng, ví dụ như nhóm vi sinh vật các hợp chất các bon hữu cơ, nhóm vi sinh vật phân huỷ các hợp chất Nitơ hữu cơ ... Các chất vô cơ có trong đất cũng là nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi sinh vật tự dưỡng. Đó là các nhóm phân huỷ các chất vô cơ, chuyển hoá các chất hợp chất S, P, Fe ...

Hệ vi sinh vật trong môi trường khí: Môi trường khí không phải là đồng nhất, tuỳ từng vùng khác nhau, môi trường khí rất khác nhau về thành phần các loại khí. Thí dụ như thành phần oxy, nitơ, CO2 và các hợp chất bay hơi khác như H2S, SO2 v.v... Môi trường khí còn khác nhau về nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng ... Ở những vùng không khí trong lành như vùng núi, tỷ lệ khí O2 thường cao. Ở những vùng không khí bị ô nhiễm, tỷ lệ các khí độc như H2S, SO2, CO2 ... thường cao, nhất là ở các thành phố và các khu công nghiệp. Không khí không phải là điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Tuy nhiên, với kích thước nhỏ bé vi sinh vật có thể dễ dàng hiện diện trong không khí từ các nguồn đất và nước.

4.1.1. Vi sinh vật trong môi trường nước

Vi sinh vật có mặt ở khắp nơi trong các nguồn nước nhưng sự phân bố không đồng nhất mà rất khác nhau tuỳ thuộc vào đặc trưng của từng loại môi trường nước. Các yếu tố môi trường quan trọng quyết định sự phân bố của vi sinh vật là hàm lượng muối, chất hữu cơ, pH, nhiệt độ và ánh sáng. Nguồn nhiễm vi sinh vật cũng rất quan trọng vì ngoài những nhóm chuyên 101

sống ở nước ta còn có những nhóm nhiễm tù các môi trường khác vào. Ví dụ như từ đất, từ chất thải của người và động vật.

Vi sinh vật trong nước được đưa từ nhiều nguồn khác nhau:

- Có thể từ đất do bụi bay lên, nguồn nước này chủ yếu bị nhiễm vi sinh vật trên bề mặt.

- Có thể do nước mưa sau khi chảy qua những vùng đất khác nhau cuốn theo nhiều vi sinh vật nơi nước chảy qua.

- Do nước ngầm hoặc nguồn nước khác qua những nơi nhiễm bẩn nghiêm trọng.

- Số lượng và thành phần vi sinh vật thấy trong nước mang đặc trưng vùng đất bị nhiễm mà nước chảy qua.

4.1.1.1. Vi sinh vật trong nước ngọt bề mặt trong đất liền

Môi trường nước ngọt nằm trong đất liền tồn tại ở hai dạng chính: lỏng và đóng băng. Môi trường đóng băng thường được coi như là sa mạc của vi sinh vật, tuy nhiên điều này không chính xác vì một số loại vi sinh vật vẫn có khả năng phát triển. Môi trường lỏng rất đa dạng về đặc tính vật lý và hóa học, điều này ảnh hưởng đến các thông số của vi sinh vật sống ở đó. Môi trường nước ngọt dạng lỏng được chia thành 2 loại: động (sông, suối, cửa sông, kênh) và tĩnh (ao, hồ, đầm lầy, hệ thống nước đóng kín).

Nước cung cấp môi trường sống và hoạt động cho rất nhiều vi sinh vật. Đa dạng vi sinh vật nước do nhiều yếu tố tạo nên, bao gồm: loại chất dinh dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng, nồng độ oxi, sự có mặt của các chất oxi hoá và chất khử trong môi trường nước. Thêm vào đó, khi ánh sáng xuyên tới vùng nước kị khí bên dưới sẽ tạo điều kiện cho một số vi sinh vật đặc biệt có khả năng quang hợp phát triển. Trong phần này sẽ trình bày về những trường hợp đặc biệt của vi sinh vật thích nghi với môi trường nước.

Bảng 4. 1 Sinh vật nhân sơ thường gặp ở môi trường nước biển và nước ngọt.

Nhóm Chi Nhóm Chi

Quang tự dưỡng Chlorobium Hóa tự dưỡng Blastobacter

Chloroherpeton Caulobacter

Chromatium Flexibacter

Pelodictyon Flexithrix

102

Thiodictyon Gemmobacter

Thiopedia Hyphomicrobium

Leucothrix

Sphaerotilus

Quang dị dưỡng Chloroflexus Hóa dị dưỡng Beggiatoa

Heliobacterium Gallionella

Heliothrix Thioploca

Rhodocyclus Thiothrix

Rhodomicrobium Thiovulum

Rhodopseudomonas

Rhodospirillum

Nguồn: Prescott-Harley-Klein, 2002

Nước sông và suối

Sông và suối là môi trường khác với hồ và ao vì sự chuyển động của các thành phần trong đó chủ yếu là theo chiều ngang. Sự phân lớp theo chiều thẳng đứng là rất hạn chế. Sông thường không sâu, chỉ vài mét, tuy nhiên có một số sông có vùng trũng sâu tới 50 m. Thể tích của sông và suối phụ thuộc vào mùa. Hầu hết vi sinh vật ở môi trường này tồn tại trên mặt nước, chỉ trừ một số sông lớn thì vi sinh vật có thể tồn tại lơ lửng trong nước. Chất dinh dưỡng trong sông và suối có nguồn gốc từ hoạt động quang hợp của các vi sinh vật tự dưỡng hoặc từ bên ngoài như từ vùng đất ở 2 bên bờ, lá cây, và các chất hữu cơ từ bên ngoài rơi vào. Vi sinh vật hoá hữu cơ dưỡng ở sông và suối sẽ chuyển hoá chất hữu cơ và cung cấp năng lượng cơ sở cho hệ sinh thái. Trong hầu hết trường hợp, lượng chất hữu cơ được bổ sung vào sông và suối thường không lớn hơn năng lực oxi hoá chất hữu cơ của vi sinh vật, do đó sông và suối luôn duy trì trạng thái sạch.

Năng lực chuyển hoá chất hữu cơ của vi sinh vật ở sông và suối là có hạn. Nếu đưa quá nhiều chất hữu cơ vào sông và suối sẽ dẫn đến hiện tượng nước thiếu oxi. Hiện tượng này xảy ra ở sông và suối chảy qua vùng thành phố và khu nông nghiệp. Việc đưa chất thải sinh hoạt chưa được xử lý hoàn chỉnh hoặc chất dinh dưỡng từ một vị trí nhất định nào đó vào sông dẫn đến ô nhiễm, thì ô nhiễm này được gọi là ô nhiễm từ nguồn. Việc bổ sung các chất hữu cơ từ các điểm này sẽ gây ra những thay đổi rất đặc trưng và đoán trước được về số phận của quần xã vi sinh vật và nguồn oxi (hình 21). Ví dụ điển hình của ô nhiễm không từ điểm nguồn (non-

103

point source of pollution) là ô nhiễm do dòng chảy từ cánh đồng và trại nuôi, đó là hiện tượng “nở hoa” của tảo ở môi trường nước giàu dinh dưỡng.

Hình 4. 1 Nguồn chất hữu cơ ở sông và suối.

Chất hữu cơ có thể được tổng hợp trong nước hay từ bên ngoài đưa vào. (a) Nguồn hữu cơ tự tổng hợp trong nước nhờ quá trình quang hợp; (b) Nguồn hữu cơ từ bên ngoài đi vào sông và suối. (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002)

Khi hạn chế nguồn chất dinh dưỡng bổ sung, tảo sẽ sinh trưởng và sử dụng khoáng chất được giải phóng từ các chất hữu cơ. Tảo thực hiện quang hợp và giải phóng oxi vào ban ngày và tiến hành hô hấp vào ban đêm, dẫn đến hiện tượng thay đổi nồng độ oxi trong ngày. Cuối cùng thì lượng oxi đạt trạng thái bão hoà, nghĩa là kết thúc quá trình tự làm sạch.

Hình 4. 2 Đường cong oxi hòa tan.

104

Khi bổ sung chất dinh dưỡng, vi sinh vật và hoạt động của chúng có thể tạo gradient nồng độ theo không gian và thời gian. Ví dụ điển hình là đường cong đi xuống của oxi gây ra do chất thải hữu cơ được đưa vào hệ thống sông sạch. Sau giai đoạn tự làm sạch, quần xã quang dưỡng sẽ phát triển mạnh mẽ và hình thành sự thay đổi nồng độ oxi. (Theo Prescott-Harley- Klein, 2002)

Nước ao hồ

Hồ và ao là môi trường nước ngọt thuộc hệ tĩnh, đa dạng về độ sâu (có thể từ vài mét đến 1000 m) và diện tích bề mặt (có thể từ vài m2 đến 100 000 m2). Ngoài ra hồ và ao còn da dạng về dòng chảy của nước, sự tích lũy chất dinh dưỡng, nguồn ánh sáng, sự hòa trộn của các nguồn nước. Hồ được chia thành 2 khu vực chính: gần bờ và giữa hồ. Mặc dù nước ở hồ là dạng tĩnh, tuy nhiên vẫn nhận thấy quá trình động học của hồ do dòng chảy vào và ra, sự hòa trộn do gió và do thay đổi nhiệt độ. Một số hồ chứa nước mặn như Great Salt Lake ở Utah. Một số hồ có thành phần hóa học rất đặc biệt như giàu MgSO4, Na2B4O7 hay NaHCO3. Dinh dưỡng trong mỗi hồ là khác nhau, một số hồ nghèo chất dinh dưỡng còn số khác thì giàu chất dinh dưỡng (hình 19). Hồ nghèo dinh dưỡng thì nước tồn tại ở dạng hiếu khí quanh năm, sự thay đổi nhiệt độ theo mùa không dẫn đến hiện tượng phân lớp theo nồng độ oxi. Ngược lại, ở hồ giàu dinh dưỡng, chất hữu cơ kết tủa xuống đáy. Nước ở hồ này được phân lớp theo nhiệt độ, lớp nước ấm bên trên là vùng hiếu khí còn lớp nước lạnh bên dưới là kị khí. Giữa 2 lớp nước này tồn tại một vùng có nhiệt độ thay đổi rất nhanh gọi là vùng biến nhiệt. Tại đây ít khi xảy ra sự hòa trộn giữa 2 lớp nước. Vào mùa xuân và thu, lớp nước hiếu khí bên trên và lớp nước kị khí bên dưới sẽ thay đổi vị trí do nhiệt độ và trọng lượng riêng thay đổi, dẫn đến có hiện tượng hòa trộn giữa 2 lớp nước. Sau khi xảy ra sự hòa trộn thì các vi khuẩn và tảo có khả năng di chuyển theo các cột nước và tìm môi trường sống thích hợp nhất cho chúng.

Khi bổ sung một lượng lớn chất dinh dưỡng vào hồ, hiện tượng phú dưỡng xuất hiện và thúc đẩy sự sinh trưởng của thực vật, tảo và vi khuẩn. Trong hồ, nguồn nitơ và phosphat luôn bị hạn chế nên việc bổ sung hợp chất chứa nitơ và phosphat vào hồ sẽ gây ảnh hưởng lớn tới hệ thống nước ngọt này. Tùy thuộc vào thể tích của hồ và tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng mà thời gian để hồ trở thành giàu dinh dưỡng có thể rất nhanh hoặc sau vài thế kỷ.

105

Hình 4. 3 Hồ nghèo dinh dưỡng và hồ giàu dinh dưỡng.

Hồ có nồng độ dinh dưỡng khác nhau, từ nghèo đến rất giàu dinh dưỡng. (a) Hồ nghèo dinh dưỡng có nồng độ oxi bão hòa và số lượng vi sinh vật hạn chế; (b) Hồ giàu dinh dưỡng chia 3 lớp: lớp nước hiếu khí, lớp nước kị khí và lắng tụ ở đáy. Vi sinh vật quang dưỡng lưu huỳnh sống ở lớp nước kị khí. (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002)

Nếu bổ sung phosphat vào nước nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn lam sẽ là vi khuẩn chính trong quá trình tích lũy chất dinh dưỡng, thậm chí ngay cả khi không bổ sung nguồn nitơ. Đó là do một số vi khuẩn lam, nhất là Anabaena, Nostoc và Cylindrospermum, có khả năng cố định nitơ ở điều kiện hiếu khí. Ngoài ra, vi khuẩn lam Oscillatoria có khả năng sử dụng H2S là chất cho điện tử để quang dưỡng, do vậy chúng có thể cố định nitơ ngay cả trong điều kiện kị khí. Thậm chí ngay cả khi nitơ và phosphat cùng được bổ sung thì vi khuẩn lam vẫn có khả năng cạnh tranh với tảo.Vi khuẩn lam hoạt động tốt hơn ở pH kiềm (8,5 - 9,5) và ở nhiệt độ cao (30 - 35oC). Tảo nhìn chung thích hợp với pH trung tính và nhiệt độ thấp hơn vi khuẩn lam. Vi khuẩn lam cũng có thể làm tăng pH môi trường bằng cách sử dụng CO2 với tần suất cao dẫn đến môi trường không còn phù hợp cho tảo phát triển.

Ngoài cơ chế nêu trên, vi khuẩn lam còn cạnh tranh với tảo bằng nhiều cơ chế khác. Nhiều vi khuẩn lam sản sinh hydroxamat, chất này sẽ bám vào sắt làm cho chất khoáng quan trọng này sẽ không còn sẵn có để phục vụ sự sinh trưởng của tảo nữa. Vi khuẩn lam còn có khả năng kháng các sinh vật ăn mồi vì chúng có khả năng sinh chất độc. Ngoài ra, một số vi khuẩn lam tổng hợp hợp chất gây mùi làm giảm chất lượng nước uống.

Cả vi khuẩn lam và tảo đều đóng góp phần rất lớn vào hiện tượng “nở hoa”, nhất là ở hồ giàu dinh dưỡng. Hiện tượng này có thể kéo dài trong nhiều năm cho đến khi chất dinh dưỡng bị lấy ra khỏi hồ hoặc lắng xuống đáy. Để cải thiện tình huống này có thể tiến hành nạo vét, lấp kín lớp kết tủa hoặc bổ sung chất gây lắng tụ để thúc đẩy quá trình kết tụ xuống đáy.

4.1.1.2. Vi sinh vật trong nước biển

Môi trường nước biển ở đại dương chiếm 97,2% tổng lượng nước toàn cầu. Đại dương có độ sâu khá lớn, phần nước ở độ sâu 1000 m trở xuống chiếm 75% thể tích đại dương. Nơi sâu nhất của đại dương là 11.000 m. Phần nước dưới độ sâu 100 m thường có nhiệt độ ổn định là 3oC. Cứ xuống sâu 10 m thì áp suất nước biển tăng 1 atm, ở nơi sâu nhất của đại dương áp suất có thể đạt tới sấp xỉ 1000 atm. Môi trường nước biển còn được đặc trưng bởi độ mặn. Sự hòa trộn và chuyển động của nước biển là do thủy triều, dòng chảy, chuyển động nổi lên theo nhiệt độ, gió…

Vi sinh vật sống trong môi trường nước biển chịu tác động của áp suất, có thể thấy được mối tương quan giữa vi sinh vật và áp suất. Một số vi khuẩn có khả năng tồn tại trong phạm vi dao động áp suất từ 0 - 400 atm, tuy nhiên chúng thường phát triển tốt nhất ở áp suất khí quyển. Nhiều vi khuẩn sinh trưởng tốt ở áp suất cao và được gọi là vi sinh vật ưa áp (barophile). Vi sinh vật ưa áp trung bình (moderate barophile) sinh trưởng tốt nhất ở 400 atm, tuy nhiên chúng có thể tồn tại ở 1 atm. Vi sinh vật ưa áp cực đoan (extreme barophile) chỉ có thể phát triển ở áp suất cao. Sự thay đổi áp suất có ảnh hưởng rất lớn tới các quá trình sinh học của vi sinh vật như phân bào, lắp ráp tiên mao, tổng hợp DNA, vận chuyển chất qua màng, sinh tổng hợp protein… Các protein hình thành kênh vận chuyển vật chất ở màng thường hoạt động có hiệu quả ở một áp suất nhất định.

106

Vi sinh vật biển còn chịu ảnh hưởng của ánh sáng. Người ta chia đại dương thành 2 vùng: vùng có ánh sáng (có thể quang hợp) và vùng không có ánh sáng (không thể quang hợp). Hầu hết chất dinh dưỡng ở đại dương xuất hiện trong vùng nước từ bề mặt tới độ sâu 300 m. Đây là vùng ánh sáng có thể xuyên tới, ở đây có sự phát triển của thực vật phù du (tảo và vi khuẩn lam). Sinh khối thực vật phù du từ từ rơi xuống đáy đại dương trông giống như “tuyết biển”. Chuyến đi này của thực vật phù du thường kéo dài ít nhất một tháng. Chỉ có 1% chất hữu cơ có nguồn gốc quang tổng hợp tới được thềm đại dương, phần còn lại bị phân huỷ trong quá trình rơi xuống. Nguồn dinh dưỡng tại đáy đại dương rất hạn chế vì vậy đây là vùng tồn tại các vi sinh vật có khả năng phát triển trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.

Hình 4. 4 Sự phân bố của vi sinh vật và áp suất ở môi trường biển.

Sự phân bố của vi sinh vật dựa vào khả năng chịu áp suất ở các độ sâu khác nhau: chịu áp, ưa áp, cực ưa áp. Áp suất cao nhất là 1100 atm ở nơi sâu nhất của đại dương. Ánh sáng chỉ xuyên qua lớp nước mỏng ở vùng sáng. (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002)

- và NO2

Chu trình cacbon ở trong môi trường biển vẫn chưa được nghiên cứu kỹ, tuy nhiên một điều rõ ràng là vi sinh vật có ảnh hưởng lớn tới chu trình cacbon ở đây. Phần lớn cacbon hữu cơ tan có tuổi trung bình dự đoán là hơn 1000 năm. Chất hữu cơ ở đáy biển cũng có độ tuổi tương tự. Ngoài cacbon hữu cơ tan, một lượng khổng lồ cacbon tồn tại dưới dạng tinh thể mêtan hydrat trong lắng cặn đại dương. Ở thềm đại dương có độ sâu dưới 500 m, trong môi trường nhiệt độ thấp và áp suất cao, phân tử nước kết tinh tạo dạng tổ ong bền vững và khép kín để giữ khí mêtan bên trong. Có tới 10 000 tỉ x 1000 kg cacbon tồn tại dưới dạng kết tinh mêtan hydrat trên toàn Thế giới (gọi là mỏ mêtan hydrat), gấp 80 000 lần nguồn khí tự nhiên dự trữ hiện nay trên Thế giới.

Chu trình nitơ và lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng trong môi trường nước biển và tác động lớn đến các quá trình ở mức độ toàn cầu. Hàm lượng nitơ trong nước biển thường dao động. Ở vùng nước biển chứa nồng độ oxi thấp thì sẽ xảy ra hiện tượng phản nitrate hóa (sử - là chất oxi hóa và giải phóng nitơ vào khí quyển) dẫn đến làm giảm tỷ lệ dụng NO3 N: P trong nước. Ngược lại, sự cố định nitơ xảy ra mạnh mẽ sẽ làm tăng lượng nitơ trong nước. Điều này cho thấy nitơ chứ không phải phospho đã hạn chế các hoạt động sinh học 107

trong môi trường biển. Chu trình lưu huỳnh ở đại dương cũng có tác động lớn đến các quá trình ở mức độ toàn cầu. Dimethylsulfide (DMS), được tổng hợp bởi tảo, có thể được giải phóng vào khí quyển và chiếm 90% tổng số hợp chất chứa lưu huỳnh bay hơi trong chu trình. Khi DMS bị oxi hoá thì sản phẩm cuối của chúng có thể ảnh hưởng đến độ acid của khí quyển cũng như nhiệt độ Trái đất và sự hình thành mây.

Như trình bày ở trên, tinh thể mêtan hydrat được tìm thấy ở điều kiện nhiệt độ thấp và áp suất cao ở nhiều đại dương. Một số vi khuẩn ưa lạnh có khả năng sử dụng tinh thể mêtan hydrat, sau đó lại là nguồn thức ăn cho Hesiocaeca methanicola. Trong quần xã vi khuẩn phức tạp ở đại dương, vi khuẩn cổ là sinh vật thực hiện quá trình chuyển hoá CH4 trong điều kiện nồng 2-. Đây là quá trình phân hủy CH4 (ngược với quá trình sinh độ hidro thấp và có mặt SO4 CH4). Một phần lớn môi trường nước biển được bao phủ bởi băng. Ở vùng địa cực vào mùa đông thì lớp băng này bao phủ 7% bề mặt Trái đất. Vi sinh vật có khả năng sinh trưởng ở vùng nằm giữa băng và nước biển.

Hình 4. 5 Chu trình cacbon ở đại dương.

Vi sinh vật ở đại dương tác động đến chu trình cacbon toàn cầu và mối liên hệ giữa đại dương và khí quyển. Hầu hết sự biến đổi của cacbon xảy ra ở vùng nước bề mặt, chất hữu cơ không tan (POC), chất hữu cơ hòa tan (DOC) và mêtan hydrat là nguồn cacbon chính ở đại dương. - và CO2 hòa tan có nguồn gốc từ khí quyển. Mêtan hydrat kích Đại dương còn chứa HCO3 thích sự phát triển của một số dạng vi sinh vật và sâu băng nhiều chân. (Theo Prescott- Harley-Klein, 2002)

Người ta phát hiện thấy một lớp vi sinh vật ở phần dưới tảng băng nơi tiếp giáp với nước biển. Các vi sinh vật có mặt ở đây thuộc các chi

108

- Polaromonas,

-Marinobater,

-Psychroflexus,

-Iceobacter,

-Polibater

-Psychromonas antarticus.

Do sự bổ sung chất hữu cơ từ đất liền nên số lượng vi sinh vật tổng số ở vùng bờ biển nhiều hơn là ở vùng giữa biển. Sự gia tăng dân số và mở rộng thành thị tại các khu vực ven biển đã dẫn đến hiện tượng ô nhiễm. Ở vùng nước ven biển (như biển Baltic, cửa biển Long Island Sound, vịnh Chesapeake và Địa Trung Hải), do hạn chế trong hòa trộn với các phần khác của đại dương nên có dấu hiệu tích lũy nhiều chất hữu cơ và vi sinh vật có hại. Điển hình là quá trình ô nhiễm ảnh hưởng đến động vật có vỏ ở các vùng biển bị đô thị hóa. Vài năm trước đây, động vật có vỏ có thể đánh bắt được khá dễ dàng sau những trận mưa. Tuy nhiên hiên nay thì cần phải chờ khoảng 1 tuần sau mưa mới có thể đánh bắt để loại bỏ các vi sinh vật gây ô nhiễm. Điều này tác động đến đời sống của cư dân sống nhờ đánh bắt động vật có vỏ.

.

Hình 4. 6 Vi sinh vật trong lớp băng ở biển.Thỏi băng lấy từ Nam Cực tiếp giáp với nước biển. Dải tối (mũi tên) là quần xã vi sinh vật. (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002)

Ở vịnh Mexico, tại châu thổ sông Mississippi, việc giải phóng chất dinh dưỡng từ các thành phố vào sông thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn và làm cạn kiệt oxi. Điều này tạo nên “vùng chết”, đó là vùng không có oxi, diện tích vùng này rất lớn có thể lớn hơn bang New Jersey của Mỹ. Khi nồng độ oxi giảm xuống, động vật có vỏ không thể sống sót, dẫn đến phá huỷ nền kinh tế của các vùng sống nhờ vào nuôi hải sản.

Một vấn đề khác liên quan đến nước biển là sự phát triển mạnh mẽ của tảo hay còn gọi là hiện tượng “nở hoa” của tảo. Hiện tượng này xảy ra trong điều kiện nước phú dưỡng và khí hậu phù hợp (ấm, nắng, yên tĩnh). Trong điều kiện nêu trên thì tảo hoặc vi khuẩn lam phát triển mạnh mẽ dẫn đến hiện tượng nở hoa (hiện tượng này thường xuất hiện theo chu kỳ ở biển và hồ). Khi xảy ra sẽ làm giảm chất lượng nước vì nước thường có váng, mùi khó chịu và không còn thích hợp cho mục đích giải trí và thậm chí còn nguy hiểm cho đánh cá, du thuyền và bơi lội. Trường hợp xấu nhất là sự nở hoa của tảo độc, còn gọi là “thuỷ triều đỏ” (red tide). Sự

109

xuất hiện của thuỷ triều đỏ ở Thái Bình Dương ngoài bờ biển trung tâm California đã làm cá heo bị chết hàng loạt. Loại tảo chính gây nên sự thiệt hại lớn cho động vật biển này là Pseudo-nitzschia. Động vật trung gian chính là cá cơm biển. Cá cơm ăn tảo, tảo chứa lượng lớn chất độc thần kinh neurotoxin, acid domoic. Cá heo ăn phải cá cơm nhiễm độc sẽ bị chết.

Hình 4. 7 Tảo Pseudo-nitzschia.

Ngoài hiện tượng thủy triều đỏ, tảo còn gây ra một số vấn đề khác. Ví dụ điển hình là loại tảo có roi Pfiesteria piscicida, loại tảo này tiết độc tố gây tê liệt và chết cá ở vùng biển từ tiểu bang Maryland sang phía Nam của bờ biển Đại Tây Dương của Mỹ. Ngoài ra, nếu người tiếp xúc với độc tố này sẽ bị chóng mặt và mất trí nhớ. Pfiesteria có một chu trình sống vô cùng phức tạp, bao gồm 24 giai đoạn. Ở giai đoạn tế bào sinh dưỡng có roi (flagellated vegetative cell), khi cá bơi về phía tảo, tảo sẽ tấn công cá.

Pfiesteria sinh ra ít nhất 2 chất rất độc: 1 chất làm cá bị choáng, 1 chất gây thương tích cho cá (hình 4.9). Loại tảo có roi này trước đây sử dụng các loại tảo khác là thức ăn chính, nhưng các nghiên cứu hiện nay cho thấy chúng có thể tiêu diệt cá, lươn, cua, và các động vật khác. Việc tăng nồng độ chất dinh dưỡng trong nước được cho là nguyên nhân làm tăng sự phát triển của tảo.

Hình 4. 8 Tảo Pfiesteria piscicida

110

Hình 4. 9 Thương tích ở cá do Pfiesteria gây nên.

Người cũng bị mẫn cảm với chất độc, chất độc của tảo Pfiesteria piscicida gây chóng mặt, mất trí nhớ và hư hỏng chức năng vận động (cho nên cần phải đeo găng tay dầy). (Theo Prescott-Harley-Klein, 2002) Vi sinh vật trong nước biển còn chịu tác động của quá trình chuyển động của không khí ở mức toàn cầu. Sự chuyển động của bụi đất trong khí quyển và các hoạt động sản xuất công nghiệp ảnh hưởng đến sinh trưởng và tỷ lệ Redfield của thực vật phù du. Ở phía Bắc Thái Bình Dương, nguồn sắt trong nước rất hạn hẹp, nguồn sắt được bổ sung vào nước qua quá trình sa mạc hoá hay còn gọi là thoái hoá đất (desertification) và các cơn bão bụi ở vùng trung tâm Châu Á. Ngược lại, ở phía Bắc Đại Tây Dương thì nguồn nitơ bị hạn chế, nguồn nitơ được bổ sung từ khí quyển do hoạt động của con người. Tỷ lệ N: P ở vùng nước đáy biến Bắc Đại Tây Dương đang tăng lên và làm thay đổi tỷ lệ Redfield của thực vật phù du.

4.1.1.3. Vi sinh vật trong nước thải

Hệ vi sinh vật tồn tại trong nước thải bao gồm:

-Vi sinh vật có cấu trúc nhân sơ (Procaryotic)

-Vi sinh vật có cấu trúc nhân thật (Eucaryotic)

Vi sinh vật có cấu trúc nhân sơ (Procaryotic)

Nhóm vi sinh vật có cấu trúc tế bào nhân sơ (Procaryotic) trong nước thải bao gồm vi khuẩn và cổ khuẩn.

-Nhóm vi khuẩn: Mặc dù thuộc hai nhóm sinh vật khác nhau nhưng vì chúng có một số điểm tương đồng với nhau nên thường được gọi phổ biến là Vi khuẩn. Vi khuẩn xâm nhập vào nước thải thông qua chất thải phân, đất và vi sinh vật nước.

-Nhóm cổ khuẩn bao gồm: Vi khuẩn ưa mặn (Halophiles); Vi khuẩn ưa nhiệt ưa axit (Thermacidophiles) và vi khuẩn sinh Metan (methanogens). Tuy nhiên chỉ có nhóm vi khuẩn sinh Metan đóng vai trò quan trọng trong xử lý nước thải thông qua quá trình phân hủy các chất ô nhiễm bản chất hữu cơ thành khí metan (CH4). Vi khuẩn ưa mặn (Halophiles) tìm thấy

111

trong nước mặn có nồng độ muối (3,5%) đây là điều kiện tối ưu cho sinh vật biển phát triển. Vi khuẩn ưa mặn cần hàm lượng ion Na + cao trong môi trường để duy trì ổn định vách tế bào và cần lượng ion K + cao tập trung trong tế bào để duy trì hoạt động các enzyme thích hợp. Vi khuẩn ưa mặn có khả năng tạo không bào đóng vai trò giúp vi khuẩn nổi trong môi trường nước. Vi khuẩn ưa nhiệt ưa axít (Thermacidophiles) là những sinh vật sống trong môi trường axit và nóng như miệng núi lửa dưới đáy đại dương. Nhóm vi khuẩn này thường không có vai trò trong các nhà máy xử lý nước thải.

Vi sinh vật có cấu trúc nhân thật (Eucaryotic)

Trong nước thải có bốn nhóm vi sinh sinh vật cấu trúc tế bào nhân thật (Eucaryotic) đóng vai trò quan trong trong quá trình xử lý nước thải. Những sinh vật này bao gồm: Nấm (fungi); Động vật nguyên sinh (Protozoa); Luân trùng (Rotifer); Tuyến trùng (Nematodes). Những sinh vật này tồn tại tự do, không gây bệnh và hiện diện trong nước thải khi dòng nước chảy qua môi trường đất và nước.

Nấm

Hầu hết nấm phát triển trong điều kiện hiếu khí tuyệt đối, nghèo Nito và pH thấp. Mặc dù dãy pH của nấm có thể phát triển từ 2-9 nhưng nấm có giá trị pH tối ưu ở khoảng 5,6. Nấm có thể phát triển trong môi trường chứa nguồn Nito thấp hơn khoảng 50% so với yêu cầu của vi khuẩn. Trong quá trình xử lý nước thải, nấm sợi đóng vai trò ổn định cấu trúc bùn hoạt tính ở bể lắng. Ngoài ra nấm còn đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất hữu cơ do khả năng phân hủy Cellulose, chịu được môi trường pH thấp, dinh dưỡng thấp, độ ẩm thấp.

Động vật nguyên sinh

Động vật nguyên sinh là những sinh vật đơn bào chúng tồn tại tự do và độc lập trong môi trường nước. Hầu hết động vật nguyên sinh có kiểu hô hấp hiếu khí tuyệt đối tuy nhiên cũng có một số loài như amibe và trùng roi có thể tồn tại trong môi trường kị khí. Có 2 nhóm vật nguyên sinh tồn tại trong nước thải, các nhóm động vật nguyên sinh này được phân loại dựa vào phương tiện di chuyển của chúng bao gồm: Nhóm trùng chân giả (Amoeboid); Nhóm trùng roi (Flagellas). Nhóm trùng roi có vai trò quan trọng trong việc hình thành bùn hoạt tính của quá trình xử lý nước thải (tăng trọng lượng bùn; Làm giảm thành phần lơ lửng trong nước; Tăng diện tích bề mặt bùn giúp tăng khả năng lắng bùn; Tái tạo nguồn dưỡng chất trong môi trường nước thông qua chất thải của chúng)

Luân trùng (Rotifer) và Tuyến trùng (Nematodes)

Luân trùng và tuyến trùng là những động vật đa bào tồn tại trong nước thải. Những sinh vật này cùng với động vật nguyên sinh đóng vai trò quan trọng trong quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp bùn hoạt tính. Chúng xâm nhập vào hạt bùn tạo điều kiện kích hoạt các

112

quá trình chuyển hóa cơ chất của vi khuẩn do tạo điều kiện tăng lượng oxy hòa tan và trung tâm hạt bùn thúc đẩy quá trình nitrate hóa. Mặc dù có khá nhiều lợi ích trong xử lý nước thải nhưng luân trùng và tuyến trùng cũng mang lại bất lợi trong bể lắng do giảm lượng bùn.

4.1.2. Hệ vi sinh vật trong môi trường đất

Vi sinh vật là những cơ thể nhỏ bé dễ dàng phát tán nhờ gió, nước và các sinh vật khác. Bởi vậy nó có thể di chuyển một cách dễ dàng đến mọi nơi trong thiên nhiên. Nhất là những vi sinh vật có bào tử, bào tử của chúng có khả năng sống tiềm sinh trong các điều kiện khó khăn. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng lại phát triển, sinh sôi. Bởi vậy trên trái đất này, nếu có một loại sinh vật nào phân bố rộng rãi nhất, phong phú nhất thì đó chính là vi sinh vật. Đất là nơi vi sinh vật cư trú nhiều nhất so với các môi trường khác. Sự phân bố của vi sinh vật đất còn gọi là khu hệ vi sinh vật đất.

Các nhóm vi sinh vật chính cư trú trong đất bao gồm: Vi khuẩn, Vi nấm, Xạ khuẩn, Virus, Tảo, Nguyên sinh động vật. Trong đó vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất về số lượng. Chúng bao gồm vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dưỡng, vi khuẩn dị dưỡng ... Nếu chia theo các nguồn dinh dưỡng thì lại có nhóm tự dưỡng cacbon, tự dưỡng amin, dị dưỡng amin, vi khuẩn cố định nitơ v.v...

Số lượng và thành phần vi sinh vật trong đất thay đổi khá nhiều. Trước hết số lượng và thành phần vi sinh vật trên bề mặt đất rất ít do ngay trên bề mặt đất độ ẩm không phải là thích hợp cho vi sinh vật phát triển, hai nữa bề mặt đất bị mặt trời chiếu rọi nên vi sinh vật bị tiêu diệt.

Số lượng và thành phần vi sinh vật thấy nhiều hơn khi chiều sâu đất 10 - 20 cm so với bề mặt, ở tầng lớp này độ ẩm vừa thích hợp, các chất dinh dưỡng tích luỹ nhiều, không bị tác dụng của ánh sáng mặt trời nên vi sinh vật phát triển nhanh, các quá trình chuyển hoá quan trọng trong đất chủ yếu xảy ra trong tầng đất này. Số lượng và thành phần vi sinh vật sẽ giảm đi khi độ sâu của đất hơn 30 cm và sâu 4 - 5m hầu như rất ít (trừ trường hợp đất có mạch nước ngầm). Rõ ràng là vi sinh vật ở tầng đất này phải là loài yếm khí đồng thời phải chịu được áp suất lớn mới phát triển được.

Số lượng và thành phần vi sinh vật trong đất còn thay đổi tuỳ chất đất, ở nơi đất nhiều chất hữu cơ, giàu chất mùn có độ ẩm thích hợp vi sinh vật phát triển mạnh, thí dụ ở đầm lầy, đồng nước trũng, ao hồ, khúc sông chết, cống rãnh, ... Còn ở những nơi đất có đá, đất có cát số lượng và thành phần vi sinh vật ít hơn. Lợi dụng sự có mặt của vi sinh vật trong đất mà người ta phân lập, tuyển chọn, đồng thời duy trì những chuyển hoá có lợi phục vụ cho cuộc sống.

Bảng 4. 2 Lượng vi khuẩn trong đất xác định theo chiều sâu đất

Chiều sâu đất (cm) Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Rong tảo

3 - 8 9.750.000 2.080.000 119.000 25.000

113

20 - 25 2.179.000 245.000 50.000 5.000

35 - 40 570.000 49.000 14.000 500

65 - 75 11.000 5.000 6.000 100

135- 145 1.400 3.000

Theo nhiều tài liệu đáng tin cậy thì trung bình trong đất vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số. Xạ khuẩn chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo, nguyên sinh động vật. Tỷ lệ này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác v,v... Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ.

Bởi vậy, khi đánh giá độ phì nhiêu của đất phải tính đến thành phần và số lượng vi sinh vật. Nếu chỉ tính đến hàm lượng chất hữu cơ thì khó giải thích được tại sao ở một vùng đất chiêm trũng hàm lượng chất hữu cơ, chất mùn, đạm, lân đều cao mà cây trồng phát triển lại kém. Đó là do điều kiện yếm khí của đất hạn chế các loại vi sinh vật háo khí phát triển làm cho các chất hữu cơ không được phân giải. Các dạng chất khó tiêu đối với cây trồng không được chuyển thành dạng dễ tiêu. Các chất độc tích luỹ trong đất trong quá trình trao đổi chất của cây cũng không được phân giải nhờ vi sinh vật, gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra theo các kiểu phân loại sau đây:

Phân bố theo chiều sâu:

Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác. Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật. Theo số liệu của Hoàng Lương Việt: ở tầng đất 9 - 20 cm của đất đồi Mộc Châu - Sơn La có tới 70,3 triệu vi sinh vật trong 1 gram đất. Tầng từ 20 - 40 cm có chứa 48,6 triệu, tầng 40 - 80cm có 45,8 triệu, tầng 80 - 120cm có chứa 40,7 triệu.

Riêng đối với đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất hữu cơ hơn tầng 20 - 40cm. Bởi vậy ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn tầng trên. Sau đó giảm dần ở các tầng dưới.

Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn háo khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy. Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật háo khí càng giảm mạnh. Ngược lại, các nhóm vi khuẩn kị khí như vi khuẩn phản nitrat hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40cm. Ở vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20cm dễ biến động, tầng 20 - 40cm ổn định hơn.

Phân bố theo các loại đất

114

Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau. Bởi vậy sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng ... Chỉ có mộ lớp mỏng ở trên, khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng dưới quá trình khử oxy chiếm ưu thế. Bởi vậy, trong đất lúa nước ác loại vi sinh vật kị khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amôn hoá, vi khuẩn phản nitrat hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật háo khí như vi khuẩn nitrat hoá, vi khuẩn cố định nitơ, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí/ yếm khí luôn luôn nhỏ hơn 1.

Ở đất trồng màu, không khí lưu thông tốt, quá trình ôxy hoá chiếm ưu thế, bởi thế các loài sinh vật háo khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu. Tỷ lệ giữa vi khuẩn háo khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp đạt tới 4 - 5. Ở đất giàu chất dinh dưỡng như phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật tổng số rất cao. Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật ít nhất.

Phân bố theo cây trồng

Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh nhất so với vùng không có rễ. Sở dĩ như thế vì rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡngcho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm. Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ.

Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần các chất khác nhau. Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng vi sinh vật sống trong vùng rễ đó. Ví dụ như vùng rễ cây họ Đậu thường phân bố nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh còn ở vùng rễ Lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitơ tự do hoặc nội sinh ... Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng. Ở đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa hồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh. Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ cũng lớn - đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ. Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín. Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai đoạn phát triển của cây phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ.

4.1.3. Hệ vi sinh vật trong môi trường khí

Sự phân bố của vi sinh vật trong không khí cũng khác nhau tuỳ từng vùng. Không khí không phải là môi trường sống của vi sinh vật. Tuy nhiên trong không khí có rất nhiều vi sinh vật tồn tại. Nguồn gốc của những vi sinh vật này là từ đất, từ nước, từ con người, động vật, thực vật, theo gió, theo bụi phát tán đi khắp nơi trong không khí. Một hạt bụi có thể mang theo rất nhiều vi sinh vật, đặc biệt là những vi sinh vật có bào tử có khả năng tồn tại lâu trong không khí. Nếu đó là những vi sinh vật gây bệnh thì đó chính là nguồn gây bệnh có trong không khí.

115

Ví dụ như các vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp có thể tồn tại lâu trong không khí. Khi người khoẻ hít phải không khí có nhiễm khuẩn đó sẽ có khả năng nhiễm bệnh. Những vi khuẩn gây bệnh thực vật như nấm rỉ sắt có thể theo gió bay đi và lây bệnh cho các cánh đồng ở rất xa nguồn bệnh.

Sự phân bố của vi sinh vật trong môi trường không khí phụ thuộc vào 3 yếu tố sau:

Phụ thuộc khí hậu trong năm

Thường vào mùa đông, lượng vi sinh vật hầu như ít nhất so với các mùa khác trong năm. Ngược lại lượng vi sinh vật nhiều nhất vào mùa hè. Có lẽ do độ ẩm không khí, nhiệt độ cao, gió mưa, do các hoạt động khác của thiên nhiên. Theo kết quả nghiên cứu của Omelansku lượng vi sinh vật trong các mùa thay đổi như sau (số lượng trung bình trong 10 năm).

Bảng 4. 3. Lượng vi sinh vật trong 1m3 không khí

Vi khuẩn Nấm mốc

Mùa đông 4305 1345

Mùa xuân 8080 2275

Mùa hè 9845 2500

Mùa thu 5665 2185

Phụ thuộc vùng địa lý

+ Lượng vi sinh vật gần khu quốc lộ có nhiều xe qua lại bao giờ cũng nhiều vi sinh vật trong không khí hơn vùng nơi khác.

+ Không khí vùng núi và vùng biển bao giờ cũng ít vi sinh vật hơn vùng khác. Đặc biệt trong không khí ngoài biển lượng vi sinh vật rất ít.

+ Ngoài ra nó còn phụ thuộc chiều cao lớp không khí. Không khí càng cao so với mặt đất, lượng vi sinh vật càng ít, kết quả nghiên cứu trên bầu trời Matxcơva cho thấy:

Phụ thuộc hoạt động sống của con người

Con người và động vật là một trong những nguyên nhân gây nạn ô nhiễm không khí. Thí dụ như trong giao thông, vận tải, trong chăn nuôi, trong sản xuất công nông nghiệp, do bệnh tật hoặc do các hoạt động khác của con người và động vật mà lượng vi sinh vật tăng hay giảm.

4.2. Vi sinh vật có lợi trong môi trường

4.2.1.Vi sinh vật có lợi trong môi trường đất

Mối quan hệ giữa vi sinh vật trong môi trường đất và thực vật

116

Mỗi loại cây đều có một khu hệ vi sinh vật vùng rễ đặc trưng cho cây đó bởi vì rễ thực vật thường tiết ra một lượng lớn các chất hữu cơ và vô cơ, các chất sinh trưởng ..., thành phần và số lượng của các chất đó khác nhau tùy loại cây. Những chất tiết của rễ có ảnh hưởng quan trọng đến vi sinh vật vùng rễ. Trên bề mặt và lớp đất nằm sát rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên tập trung vi sinh vật với số lượng lớn. Càng xa rễ số lượng vi sinh vật càng giảm.

Thành phần vi sinh vật vũng rễ không những phụ thuộc vào loại cây trồng mà còn phụ thuộc vào thời kỳ phát triển của cây. Vi sinh vật phân giải xenluloza có rất ít khi cây còn non nhưng khi cây già thì rất nhiều. Điều đó chứng tỏ vi sinh vật không những sử dụng các chất tiết của rễ mà còn phân huỷ rễ khi rễ cây già, chết đi.

Vi sinh vật sống trong vùng rễ có quan hệ mật thiết với cây, chúng sử dụng những chất tiết của cây làm chất dinh dưỡng, đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho cây qua quá trình hoạt động phân giải của mình. Vi sinh vật còn tiết ra các vitamin và chất sinh trưởng có lợi đối với cây trồng. Bên cạnh đó có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho cây, có những loại ức chế sự sinh trưởng của cây, có những loại tàn phá mùa màng nghiêm trọng.

Trong khu hệ vi sinh vật vùng rễ ngoài những nhóm vi sinh vật có ích, có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cây. Đó là mối quan hệ ký sinh của vi sinh vật trên thực vật. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cây thuộc loại dị dưỡng, sống nhờ vào chất hữu cơ của thực vật đang sống (khác với nhóm hoại sinh- sống trên những tế bào thực vật đã chết).

Mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật trong đất

Sự phân bố của vi sinh vật trong đất vô cùng phong phú cả về số lượng cũng như thành phần. Trong quá trình sống chung như thế, chúng có một mối quan hệ tương hỗ vô cùng chặt chẽ. Dựa vào tính chất của các loại quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật, người ta chia ra làm 4 loại quan hệ: ký sinh, cộng sinh, hỗ sinh và kháng sinh.

* Quan hệ ký sinh:

Quan hệ ký sinh là hiện tượng vi sinh vật này sống ký sinh trên vi sinh vật, hoàn toàn ăn bám và gây hại cho vật chủ. Ví dụ như các loại virus sống ký sinh trong tế bào vi khuẩn hoặc một vài loài vi khuẩn sống ký sinh trên vi nấm. Các loại vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh thường hay bị một loại thực khuẩn thể ký sinh và tiêu diệt. Khi nuôi cấy vi khuẩn Rhizobium trên môi trường dịch thể thường có hiện tượng môi trường đang đục trở nên trong. Nguyên nhân là do thực khuẩn thể xâm nhập và làm tan tất cả các tế bào vi khuẩn - gọi là hiện tượng sinh tan. Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc cũng có hiện tượng như vậy. Các thực khuẩn thể này tồn tại ở trong đất trồng cây họ Đậu làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình hình thành nốt sần ở cây Đậu.

* Quan hệ cộng sinh:

Quan hệ cộng sinh là quan hệ hai bên cùng có lợi, bên này không thể thiếu bên kia trong quá trình sống. Ở vi sinh vật người ta ít quan sát thấy quan hệ cộng sinh. Có một số giả thiết cho rằng: Ty thể - cơ quan hô hấp của tế bào vi nấm chính là một vi khuẩn cộng sinh với vi nấm.

117

Giả thiết đó dựa trên cấu tạo của ty thể có cả bộ máy ADN riêng biệt, có thể tự sao chép như một cơ thể độc lập. Giả thiết này còn chưa được công nhận hoàn toàn. Lại có giả thiết cho rằng: Các plasmid có trong vi nấm và vi khuẩn chính là sự cộng sinh giữa virus và vi nấm hay vi khuẩn đó. Ví dụ như các plasmid mang gen kháng thuốc đá mang lại mối lợi cho vi khuẩn chủ là kháng được thuốc kháng sinh. Vì thế mà hai bên cùng có lợi và gọi là quan hệ cộng sinh.

* Quan hệ hỗ sinh:

Quan hệ hỗ sinh là quan hệ hai bên cùng có lợi nhưng không nhất thiết phải có nhau mới sống được như quan hệ cộng sinh. Quan hệ này thường thấy trong sự sống của vi sinh vật vùng rễ. Ví dụ như mối quan hệ giữa nấm mốc phân huỷ tinh bột thành đường và nhóm vi khuẩn phân giải loại đường đó. Mối quan hệ giữa nhóm vi khuẩn phân giải photpho và nhóm vi khuẩn phân giải protein cũng là quan hệ hỗ sinh, trong đó nhóm thứ nhất cung cấp P cho nhóm thứ hai và nhóm thứ hai cung cấp N cho nhóm thứ nhất.

* Quan hệ kháng sinh:

Quan hệ kháng sinh là mối quan hệ đối kháng lẫn nhau giữa hai nhóm vi sinh vật. Loại này thường tiêu diệt loại kia hoặc hạn chế quá trình sống của nó. Ví dụ điển hình là xạ khuẩn kháng sinh và nhóm vi khuẩn mẫn cảm với chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra. Khi nuôi cấy 2 nhóm này trên môi trường thạch đĩa, ta có thể thấy rõ hiện tượng kháng sinh: xung quang nơi xạ khuẩn có một vòng vô khuẩn, tại đó vi khuẩn không mọc được. Người ta căn cứ vào đường kính của vòng vô khuẩn đó mà đánh giá khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn. Tất cả các mối quan hệ trên đây của khu hệ vi sinh vật đất tạo nên những hệ sinh thái vô cùng phong phú trong từng loại đất.

Mối quan hệ giữa đất và vi sinh vật đất

Đất có kết cấu từ những hạt nhỏ liên kết với nhau thành cấu trúc của đất. Vậy yếu tố nào đã liên kết các hạt đất với nhau. Có quan điểm cho rằng vi sinh vật đóng vai trò gián tiếp trong sự liên kết các hạt đất với nhau. Hoạt động của vi sinh vật, nhất là nhóm hiếu khí đã hình thành nên một thành phần của mùn là axit humic. Các muối của axit humic tác dụng với ion Canxi tạo thành một chất dẻo gắn kết những hạt đất với nhau. Người ta đã tìm ra vai trò trực tiếp của vi sinh vật trong việc tạo thành kết cấu đất: Trong quá trình phân giải chất hữu cơ, nấm mốc và xạ khuẩn phát triển một hệ khuẩn ti khá lớn trong đất. Khi nấm mốc và xạ khuẩn chết đi, vi khuẩn phân giải chúng tạo thành các chất dẻo có khả năng kết dính các hạt đất với nhau. Bản thân vi khuẩn chết đi và tự phân huỷ cũng tạo thành các chất kết dính. Ngoài ra lớp dịch nhày bao quanh các vi khuẩn có vỏ nhày cũng có khả năng kết dính các hạt đất với nhau.

4.2.2. Vi sinh vật có lợi trong môi trường nước

Đa số các dòng sông và ao hồ, một số vùng bờ biển dễ dàng bị ô nhiễm với mức độ khác nhau bởi rác và nước thải của con người.Vì thế khả năng tự làm sạch nguồn nước có ý nghĩa rất

118

lớn. Nhờ quá trình này, các chất bẩn thường xuyên được loại bỏ khỏi nguồn nước. Quá trình tự làm sạch của nguồn nước có thể chia thành 2 giai đoạn:

-Quá trình xáo trộn, pha loãng giữa các dòng chất bẩn với nguồn nước.

-Quá trình chuyển hóa, phân hủy các chất bẩn hữu cơ nhờ các thủy sinh vật, vi sinh vật.

Quá trình vật lý và hóa học như hiện tượng sa lắng và oxy hóa giữ một vai trò quan trọng, song đóng vai trò quyết định vẫn là các quá trình sinh học. Tham gia vào quá trình này chủ yếu phải kể là các vi sinh vật (vi khuẩn phân hủy hợp chất N, P, S...), các loại tảo và thực vật thủy sinh (quang hợp), các động vật ăn các chất bẩn hữu cơ, các sinh vật có khả năng tích tụ chất độc trong cơ thể, trong số này chủ yếu là các loài tảo, động vật không xương sống cỡ nhỏ với số lượng lớn. Bùn hoạt tính có thành phần chủ yếu là vi khuẩn và động vật nguyên sinh, đôi khi chứa nấm, trùng bánh xe và động vật thân ống. Các nhóm vi khuẩn tạo là thành phần chịu trách nhiệm loại bỏ ô nhiễm và tạo thành bùn.

Vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ tồn tại dưới dạng hòa tan và không hòa. Sinh vật tham gia vào làm sạch nước thông qua các quá trình:

+ Vô cơ hóa các chất hữu cơ trong nước,

+ Tích tụ chất độc vào cơ thể, loại trừ chất độc ra khỏi vực nước.

Sự vô cơ hóa các chất hữu cơ trong nước ô nhiễm là do hoạt động của các vi sinh vật, chế độ nước chảy và sự quang hợp của tảo và cây thủy sinh đã làm cho hàm lượng O2 hòa tan trong nước tăng giúp thuận lợi cho quá trình này. Trong quá trình vô cơ hóa các chất hữu cơ, một phần được chính các vi sinh vật này dùng cho sinh trưởng. Nhiều ấu trùng động vật, động vật cỡ nhỏ cũng ăn trực tiếp các chất vụn hữu cơ. Tảo và thực vật bậc cao hơn, như rong , rêu, cỏ lác, rau ngổ, các loại bèo,... khác sử dụng các chất khoáng, trong đó có CO2 và amoni, photphat do vi khuẩn tạo thành, để phát triển tăng sinh khối và thải ra oxy. Các sinh vật còn loại trừ chất bẩn và các chất độc ra khỏi tầng nước trong thủy vực bằng cách sau khi tiêu thụ chất ô nhiễm chúng thải ra ngoài dưới dạng phân và sau cùng lắng xuống đáy. Các loài thân mềm, nhiều động vật không xương sống ở đáy kể cả cá,... đã tham gia tích cực vào quá trình này. Thông thường thì protein, đường và tinh bột được phân giải nhanh nhất. Ngược lại gỗ, sáp, cenlulose bị phân giải chậm và không hoàn toàn. Do vậy quần thể sinh vật cũng thay đổi tuỳ theo từng gia đoạn của quá trình tự làm sạch. Do đó chất thải giàu protein thuận lợi cho phát triển các giống Alcaligen, Bacillus hay vi khuẩn Flavo. Nước thải chứa nhiều gluxít hay hiđrocacbua có lợi cho giống Thithrix, Microthrix,… Quần thể vi sinh vật thay đổi tuỳ theo tiến độ của tự làm sạch. Chẳng hạn nếu nước bị ô nhiễm bởi nước thải sinh hoạt thì tỷ lệ vi khuẩn phân giải protein giảm, còn các vi khuẩn phân giải xenlulozơ tăng dần.

119

Khả năng tự làm sạch tức là khả năng mà nguồn nước bị ô nhiễm có thể phục hồi được như trạng thái trước lúc ô nhiễm trong một giới hạn nhất định. Khả năng này khác nhau tùy từng loại vực nước như ở sông thì lớn hơn ở hồ. Hiện tượng tự làm sạch của nước tự nhiên là khi tồn tại chất ô nhiễm trong môi trường nước sẽ diễn ra nhiều quá trình lý hóa sinh học để tái lập lại trạng thái tương tự như ban đầu. Đó là các quá trình hấp thụ các kim loại nặng bởi các chất cặn hữu cơ, loại trừ, phân hủy và tích tụ các chất hữu cơ và các chất khác, lắng đọng các chất lắng vô cơ và hữu cơ xuống đáy, vô cơ hóa các chất hữu cơ không bền vững, tăng hàm lượng O2 hòa tan do quang hợp của tảo và cây thủy sinh, hủy diệt các vi khuẩn hoại sinh và gây bệnh. Trong thực tế, khả năng tự làm sạch các nguồn nước luôn thay đổi và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nguồn nước; Chế độ dòng chảy; Hàm lượng oxy hòa tan…

Khả năng tự làm sạch các nguồn nước cũng thay đổi theo mùa. Ở các vĩ độ Bắc trong tháng mùa hè khả năng tự làm sạch cao hơn hẳn trong tháng mùa lạnh vì 2 nguyên nhân:

-Nhiệt độ cao hoạt động của vi khuẩn được kích thích;

-Do chiếu sáng nên thực vật nổi cung cấp thêm nhiều oxy.

4.2.3. Ứng dụng vi sinh vật trong xử lý môi trường

Vai trò quan trọng của vi sinh vật trong việc duy trì các chu trình vật chất đã được xác định trong các chu trình địa hóa. Rất nhiều hoạt động của tự nhiên được ứng dụng bởi con người nhằm mang lại lợi ích giúp cải thiện cuộc sống và tạo ra môi trường sống tốt hơn. Các hoạt động ứng dụng vi sinh vật được áp dụng trên quy mô công nghiệp như: -Ngành công nghiệp thực phẩm và đồ uống -Ngành công nghiệp khai khoáng -Ngành công nghiệp dược phẩm. Đáng chú ý trong số này là khai thác các quá trình phân hủy sinh học trong tự nhiên để xử lý khối lượng khổng lồ chất thải lỏng và rắn được tạo ra bởi hoạt động của con người. Xử lý chất thải rắn: Bãi chôn lấp: Tính bình quân, mỗi người tạo ra khoảng 2 tấn chất thải rắn mỗi năm, và tất cả điều này phải được xử lý. Hầu hết lượng chất thải rắn này được xử lý bằng phương pháp chôn lấp nên cần một diện tích đất không nhỏ trong điều kiện gia tăng dân số và hiện tượng nước biển dâng là một bài toán khó cho các nhà quản lý. Ngoài ra, những thành phần không thể hoặc khó phân hủy như: kim loại, nhựa, đá dăm... cũng là một vấn đề cần quan tâm. Tuy nhiên, trong một khoảng thời gian nhất định các vật liệu có khả năng phân hủy sinh học (chất thải thực phẩm, dệt may, giấy, vv) đều được chuyển hóa bởi vi sinh vật. Tốc độ phân hủy phụ thuộc vào bản chất của các chất thải và điều kiện chôn lấp nhưng cũng có thể kéo dài nhiều thập kỷ. Ở các bãi chôn lấp quá trình phân hủy kị khí xảy ra chủ yếu và sản phẩm sinh ra là khí mêtan cần được quan tâm nhằm tránh nguy cơ cháy nổ. Khí metan sinh ra từ bãi chôn lấp có thể được khai thác và sử dụng như một nguồn nhiên liệu trong những điều kiện cụ thể

120

Ủ Compost: Ở quy mô hộ gia đình ở vùng nông thôn chất thải hữu cơ thường được sử dụng để làm phân bón. Điều này rất hữu ích vì ngoài việc cung cấp cho đất trồng trọt một nguồn bổ sung dưỡng chất hữu ích còn làm giảm đáng kể khối lượng của vật liệu phải được xử lý bằng các phương tiện khác. Ở quy mô công nghiệp, quá trình ủ compost ngày càng phổ biến nhằm tạo ra sản phẩm thương mại là phân compost cung cấp cho ngành nông nghiệp. Chúng ta đang đề cập đến vai trò của vi sinh vật trong việc tái chế nguồn carbon trong tự nhiên thông qua quá trình ủ compost để phân hủy các chất thải hữu cơ, đặc biệt là cellulose làm giảm đáng kể số lượng lớn chất thải rắn trong hoạt động của con người. Trong quá trình làm phân compost, nấm và vi khuẩn, đặc biệt là xạ khuẩn, phá vỡ cấu trúc chất hữu cơ để sản xuất CO2, nước và đất mùn, một sản phẩm phân hủy cuối cùng của hữu cơ tương đối ổn định. Phân hữu cơ không thực sự là một loại phân bón, vì hàm lượng nitơ của nó không cao, nhưng nó vẫn cung cấp chất dinh dưỡng cho một đất và thường giúp cải thiện tình trạng của đất. Xử lý nước thải Mục đích của xử lý nước thải là loại bỏ các chất không mong muốn và các vi sinh vật nguy hiểm trước khi thải một cách an toàn vào nguồn nước tiếp nhận như sông hoặc suối. Quá trình xử lý nước cũng là một công đoạn không thể thiếu trong xử lý nước cấp. Xử lý nước thải và nước cấp cần phải được quan tâm trong xã hội phát triển vì có thể giúp làm giảm đáng kể tỷ lệ các bệnh mắc phải do nguồn nước. Có nhiều nguồn nước thải khác nhau như: Nước thải sinh hoạt; Nước thải công nghiệp của các ngành chế biến sản xuất...; Nước thải có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất và phương pháp xử lý khác nhau. Xử lý nước thải bằng công nghệ vi sinh vật được ứng dụng để xử lý các chất hữu cơ hoà tan có trong nước thải cũng như một số chất ô nhiễm vô cơ khác như H2S, sunfit, ammonia, nitơ… dựa trên cơ sở hoạt động của vi sinh vật để phân huỷ chất hữu cơ gây ô nhiễm. Vi sinh vật sử dụng chất hữu cơ và một số khoáng chất làm thức ăn để sinh trưởng và phát triển. Một cách tổng quát, phương pháp xử lý sinh học có thể chia làm 2 loại: -Phương pháp kỵ khí sử dụng nhóm vi sinh vật kỵ khí, hoạt động trong điều kiện không có oxy; -Phương pháp hiếu khí sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí, hoạt động trong điều kiện cung cấp oxy liên tục. Quá trình phân huỷ các chất hữu cơ nhờ vi sinh vật gọi là quá trình oxy hoá sinh hoá. Để thực hiện quá trình này, các chất hữu cơ hoà tan, cả chất keo và các chất phân tán nhỏ trong nước thải cần di chuyển vào bên trong tế bào vi sinh vật theo 3 giai đoạn chính như sau: -Chuyển các chất ô nhiễm từ pha lỏng tới bề mặt tế bào vi sinh vật; -Khuyếch tán từ bề mặt tế bào qua màng bán thấm do sự chênh lệch nồng độ bên trong và bên ngoài tế bào; -Chuyển hoá các chất trong tế bào vi sinh vật, sản sinh năng lượng và tổng hợp tế bào mới. Tốc độ quá trình oxy hoá sinh hoá phụ thuộc vào nồng độ chất hữu cơ, hàm lượng các tạp chất và mức độ ổn định của lưu lượng nước thải vào hệ thống xử lý. Ở mỗi điều kiện xử lý nhất định, các yếu tố chính ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng sinh hoá là chế độ thuỷ động, hàm 121

lượng oxy trong nước thải, nhiệt độ, pH, dinh dưỡng và nguyên tố vi lượng.

Phân hủy sinh học

Có lẽ vấn đề lớn nhất đối với các nước phát triển vào đầu thế kỷ 21 là ô nhiễm môi trường. Sự phát triển và phụ thuộc vào các sản phẩm của ngành công nghiệp hóa học dẫn đến một lượng lớn chất thải độc hại được phát thải ra môi trường. Nhằm giảm tác hại của một số loại hóa chất có bản chất hữu cơ, giải pháp sử dụng vi khuẩn và nấm có khả năng oxy hóa các chất gây ô nhiễm được gọi là xử lý sinh học. Khá nhiều vi sinh vật có thể sử dụng chất ô nhiễm có nguồn gốc là các hợp chất hữu cơ như một nguồn carbon (vi khuẩn Burkholderia cepacia Gram âm có thể sử dụng hơn 100 hợp chất). Ngoài ra, việc phát hiện những vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học hóa chất tổng hợp có nguồn gốc hữu cơ còn được xem như chỉ thị sinh vật tại những vùng có nghi ngờ ô nhiễm hóa chất.

4.2.4. Vi sinh vật chỉ thị môi trường nước

Mọi sinh vật, kể cả con người trong đời sống đều chịu ảnh hưởng của các điều kiện vật lý, hóa học ở môi trường xung quanh. Đối với động vật, đặc biệt những động vật bậc thấp, sự có mặt hay vắng mặt trong môi trường nước được gọi là những sinh vật chỉ thị môi trường và có thể nhận diện được chủng loại và nồng độ của các chất gây ô nhiễm mà không nhất thiết phải tiến hành phân tích hóa - lý học.

Quần thể vi sinh vật chỉ thị cho từng điều kiện môi trường bao gồm cả sinh vật có hại (gây bệnh) và vô hại đối với con người. Việc lựa chọn sinh vật chỉ thị môi trường không phù hợp sẽ dẫn đến nguy hiểm cho những người làm công tác phát hiện sinh vật chỉ thị. Nói cách khác, sự có mặt của những vi sinh vật chỉ thị trong nước cũng nói lên sự có mặt của những vi sinh vật gây bệnh khác có trong nước. Khái niện chung và cơ bản nhất của sinh vật chỉ thị “Những đối tượng sinh vật có yêu cầu nhất định về điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, cũng như khả năng chống chịu một hàm lượng nhất định các yếu tố độc hại trong môi trường sống và do đó, sự hiện diện của chúng biểu thị một tình trạng về điều kiện sinh thái của môi trường sống nằm trong giới hạn nhu cầu và khả năng chống chịu của đối tượng sinh vật đó”. Thông qua sinh vật chỉ thị môi trường, chúng có thể nhận diện được sự có mặt của các chất để đánh giá chất lượng môi trường nhằm phục vụ cho việc giám sát môi trường nước.

Một số biểu hiện về sự tác động bởi các chất gây ô nhiễm và sự biến đổi của sinh vật có thể quan sát bằng mắt hoặc qua một số biểu hiện như sau:

- Những thay đổi về thành phần loài hoặc các nhóm ưu thế trong quần xã sinh vật.

- Những thay đổi về đa dạng loài trong quần xã.

122

- Tỷ lệ chết trong quần thể gia tăng, đặc biệt ở giai đoạn non mẫn cảm như trứng và ấu trùng. - Thay đổi sinh lý và tập tính trong các cá thể.

- Những khiếm khuyết về hình thái và tế bào trong các cá thể.

- Sự tích lũy dần các chất ô nhiễm hoặc sự trao đổi chất của chúng trong các mô của cá thể. Như vậy, vi sinh vật chỉ thị được hiểu là sinh vật chỉ được phát hiện hoặc xuất hiện trong một môi trường có mức ô nhiễm nhất định. Nhưng quan trọng nó phải đặc trưng, không xuất hiện trong "ngưỡng" ô nhiễm khác. Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các sinh vật để đánh giá, kiểm soát và cải thiện chất lượng môi trường đã đạt được nhiều thành tựu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tại các nước phát triển, đặc biệt một số nước trong khu vực như Trung Quốc, Ấn độ, Thái lan, việc nghiên cứu và sử dụng các vi sinh vật chỉ thị đã được tiến hành từ nhiều năm nay. Ở Việt Nam, các khái niệm về vi sinh vật chỉ thị môi trường còn rất mới mẻ và việc ứng dụng chúng trong nghiên cứu cũng mới chỉ là bước đầu. Việc lựa chọn chỉ thị sinh học để xác định liệu môi trường nước đó là sạch hay bị ô nhiễm. Cần xác định sinh vật đó là chỉ thị cho cái gì.

Sinh vật chỉ thị môi trường thường có những tính chất sau:

- Vật chỉ thị dễ dàng định loại.

- Dễ thu mẫu ngoài thiên nhiên, dễ nuôi trồng trong điều kiện thí nghiệm.

- Dễ tích tụ chất ô nhiễm mà không bị chết.

- Có nhiều tài liệu về sinh thái cá thể của đối tượng nghiên cứu để đảm bảo rằng chất ô nhiễm mà nó tích tụ có liên quan đến khu vực nghiên cứu.

- Có kích thước vừa phải để có thể cung cấp những mô đủ lớn cho việc phân tích.

- Có phân bố rộng để có thể đối chiếu giữa các khu vực.

- Có đời sống dài để có thể lấy mẫu nhiều lần khi cần.

- Ít biến dị.

Trong thực tế, khó có loài sinh vật nào đáp ứng được tất cả các tiêu chí. Tuy nhiên, những sinh vật được lựa chọn cho nghiên cứu phải đáp ứng được một hoặc một vài tiêu chí trên

- Thực vật cỡ lớn: như bèo, lau, sậy, thường có mặt ở vùng nước tù hãm. Thường dùng chỉ thị cho thực vật phú dưỡng (nguồn thải chứa N, P), kim loại nặng. Có nhiều ưu điểm khi sử dụng đối tượng này: dễ lấy mẫu, dễ phân biệt, số lượng nhiều, phân bố rộng, có khả năng chống chịu với mức ô nhiễm cao.

123

- Động vật nguyên sinh: là các loài động vật trong nước chỉ có 1 tế bào và sinh sản theo cơ chế phân bào. Kích thước rất nhỏ (lớn nhất cũng chỉ vài centimét). Chúng có khả năng thực hiện đầy đủ các hoạt động sống như một cơ thể đa bào hoàn chỉnh, chúng có thể thu lấy thức ăn, tiêu hóa, tổng hợp, hô hấp, bài tiết, điều hòa ion và điều hòa áp suất thẩm thấu, chuyển động và sinh sản. Động vật nguyên sinh có khoảng 20.000 đến 25.000 loài, trong đó một số cũng có cả khả năng quang hợp.

- Cá: là chỉ thị rất tốt cho kim loại nặng trong nước. Cá có thể hấp thụ kim loại nặng và nhiều chất ô nhiễm khác. Tuy nhiên, cá là loài di động nên không dễ dàng để xác định mối quan hệ giữa hàm lượng chất ô nhiễm trong cơ thể chúng và nguồn thải ô nhiễm. - Động vật hai mảnh vỏ: Động vật hai mảnh vỏ thường được sử dụng để đánh giá ô nhiễm kim loại nặng vì chúng đã được định loại rő ràng, dễ nhận dạng, có kích thước vừa phải, số lượng nhiều, dễ tích tụ chất ô nhiễm, có thời gian sống dài và có đời sống tĩnh tại.

- Sinh vật ô nhiễm do phân.

- Các thông số thủy sinh.

Trong trường hợp đánh giá tác động ô nhiễm sinh thái nước, cần quan trắc bổ sung các thông số: động vật đáy không xương sống (đĩa, giun dẹp, ...), thực vật nổi

Bảng 4. 4 Vi sinh vật chỉ thị dựa trên mục đích sử dụng của nguồn nước

Mục đích sử dụng của nguồn nước Vi sinh vật chỉ thị

Nước uống Coliform tổng số (Total coliform)

Nguồn nước ngọt cho các dịch vụ giải trí Fecal coliform;

E. Coli;

Enterococci

Khu vực sinh trưởng của các loài ốc, sò... Fecal coliform

Coliform tổng số (Total coliform)

Tưới tiêu trong nông nghiệp Coliform tổng cho nước đã xử lý (Total coliform)

Nước thải sau khi khử trùng Fecal coliform

Coliform tổng số (Total coliform)

124

Vi khuẩn nhóm Coliform (Coliform, Fecal coliform, Fecal streptococci, Escherichia coli ...) có mặt trong ruột non và phân của động vật máu nóng, qua con đường tiêu hoá mà chúng xâm nhập vào môi trường và phát triển mạnh nếu có điều kiện nhiệt độ thuận lợi. Số liệu Coliform cung cấp cho chúng ta thông tin về mức độ vệ sinh của nước và điều kiện vệ sinh môi trường xung quanh. Đôi khi chúng ta cần phải xác định là nguồn nước bị nhiễm bẩn bởi phân người hay phân gia súc để có những biện pháp quản lý thích hợp. Khi đó người ta thường sử dụng tỉ lệ Fecal coliform trên Fecal streptococci. Các số liệu về tỉ lệ Fecal coliform/Fecal streptococci được trình bày trong bảng sau:

Bảng 4. 5 Số lượng các vi sinh vật chỉ thị trên cá thể

Cá thể

TB mật độ VSV/g phân

TB mật độ VSV/cá thể. 24 h

Tỷ lệ FC/FS

Fecal coliform (106)

Fecal streptococci (106)

Fecal coliform (106)

Fecal streptococci (106)

13,0 Người 3,0 2.000 450 4,4

0,23 Bò 1,3 5.400 31.000 0,2

3,3 Heo 84,0 8.900 230.000 0,04

16,0 Cừu 38,0 18.000 43.000 0,4

1,3 Gà 3,4 240 620 0,4

33,0 Vịt 54,0 11.000 18.000 0,6

Qua bảng trên, chúng ta thấy tỉ lệ FC/FS của các gia súc, gia cầm đều dưới 1 trong khi tỉ lệ FC/FS của người lớn hơn 4. Nếu FC/FS nằm trong khoảng từ 1 - 2 và mẫu được lấy cận khu vực nghi ngờ bị ô nhiễm bởi phân, ngưới ta có thể suy luận là nguồn nước bị ô nhiễm bởi cả phân người và phân gia súc. Để việc suy luận đạt được độ tin cậy, các điều kiện sau đây phải được thỏa mãn:

- pH của mẫu phải từ 4 - 9 để bảo đảm không có ảnh hưởng xấu đến cả hai nhóm vi khuẩn này. - Mỗi mẫu phải được đếm ít nhất 2 lần.

- Để giảm thiểu sai số do tỉ lệ chết khác nhau, mẫu phải được lấy tại nơi cách nguồn gây ô nhiễm không quá 24h (tính theo vận tốc dòng chảy).

- Chỉ những cá thể Fecal coliform phát hiện ở phép thử ở 44oC mới được dùng để tính tỉ lệ FC/FS

125

4.3. Vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nước

Tác nhân gây bệnh có trong nước thải có khả năng gây nguy hiểm đến sức khỏe người tiếp xúc tại các cơ sở xử lý nước thải đồng thời có khả năng gây nguy hiểm cho cộng đồng dân cư gần nguồn thải hoặc nhà máy xử lý nước thải. Một số lượng lớn và đa dạng của các tác nhân gây bệnh là virus, vi khuẩn, nấm, sinh vi ật đơn bào, giun sán (giun) gây dị ứng được tìm thấy trong nước thải và bùn. Số lượng các tác nhân gây bệnh có thể đạt đến con số hàng 100 triệu/mi. Những tác nhân cần quan tâm trong nước thảii và bùn đối với nhân viên trực tiếp vận hành các hệ thống xử lý nước thải là các virus đường ruột, vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là Campylobacter, vi khuẩn Leptospira, nấm Aspergillus, các sinh vật đơn bào Giardia và Cryptosporidium, và sán dải Tác nhân gây bệnh xâm nhập vào nước thải từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chủ yếu từ chất thải là phân và nước tiểu của người và động vật. Nước thải từ phòng tắm, máy rửa bát, vòi sen, bồn rửa, và máy giặt cũng có thể chứa các mầm bệnh. Lượng Virus chứa trong phân của vật chủ bị nhiễm bệnh có thể đạt đến mật độ hàng tỉ virus/g phân ướt; mật độ vi khuẩn gây bệnh có thể đạt đến hàng triệu vi khuẩn trên một gam phân Theo Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (Mỹ EPA), mầm bệnh trong chất thải động vật và trên mặt đất cũng có thể xâm nhập vào nước thải thông qua quá trình rửa chuồng trại và quá trình cuốn trôi khi dòng chảy đi qua mặt đất chứa mầm bệnh. Nước thải từ các cơ sở giết mổ, đóng gói thịt cũng là nguồn cung cấp mầm bệnh có trong nước thải. Các mầm bệnh lây qua đường nước, ngộ độc thực phẩm, lây qua đường máu và mầm bệnh lây truyền qua đường tình dục cũng được phát hiện trong nước thải.

4.3.1. Vi khuẩn gây bệnh

Bảng 4. 6 Tác nhân vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong nước thải

Tên Vi khuẩn Gây bệnh

Actinomyces israelii Hội chứng Actinomyocsis

Bacillus anthracis Than

Brucella spp. Sốt Malta

Campylobacter jejuni Viêm dạ dày, ruột

Clostridium spp Hoại tử

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Tiêu chảy, Viêm dạ dày, ruột

Francisella tularensis Sốt thỏ

Leptospira interrogans icterohemorrhagiae Bệnh viêm Weil

126

Mycobacterium tuberculosis Lao

Nocardia spp. Hội chứng Nocardiosis

Salmonella enterica paratyphi Sốt phó thương hàn

Salmonella spp. Thương hàn, ngộ độc thực phẩm

Salmonella typhi Sốt thương hàn

Shigella spp Lỵ trực trùng

Vibrio cholerae Tiêu chảy cấp

Vibrio parahaemolyticus Viêm dạ dày, ruột

Viêm dạ dày, ruột Yersinia enterocolitica

Bảng 4. 7 Tác nhân Nấm gây bệnh thường gặp trong nước thải

Tên Nấm Gây bệnh

Aspergillus fumigatus Phổi dị ứng

Candida spp. Nhiễm nấm

4.3.2. Virus gây bệnh

Bảng 4. 8 Vi rus gây bệnh thường gặp trong nước thải

Tên Vi rus Gây bệnh

Adenovirus Suy đường hô hấp trên

Coxsackievirus Cảm lạnh thông thường và viêm thanh quản

Enterovirus Suy đường hô hấp trên và viêm dạ dày ruột

Hepatitis Viêm gan

Influenza Cúm

Norwalk viêm dạ dày ruột

127

Poliovirus Bại liệt

Reovirus Suy đường hô hấp trên và viêm dạ dày ruột

Rotavirus viêm dạ dày ruột

4.3.3. Ký sinh trùng gây bệnh

Bảng 4. 9 Động vật nguyên sinh gây bệnh thường gặp trong nước thải

Tên ký sinh trùng Gây bệnh

Balantidium coli Bệnh đường ruột

Cryptosporidium parvum Tiêu chảy

Entamoeba coli Tiêu chảy, loét đường ruột

Entamoeba histolytica Lỵ amib

Giardia lamblia Tiêu chảy, kém hấp thu

Bảng 4. 10 Tác nhân giun sán gây bệnh thường gặp trong nước thải

Tên ký sinh trùng Gây bệnh

Taenia saginata Sán dải bò

Ancylostoma spp Giun móc

Ascaris spp. Giun đũa

Enterobius spp. Giun kim

Necator americanus Giun mỏ

Strongyloides stercoralis Giun lươn

Taenia spp Sán dải

Trichuris spp Giun tóc

128

Michael H. Gerardi (2005). Wastewater Pathogens. A John Wiley & Sons, Inc Publication, USA, 179 p Michael H. Gerardi (2006). Wastewater Bacteria. A John Wiley & Sons, Inc Publication, USA, 255 p Stuart Hogg (2005). Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England, 468 p

Tài liệu tham khảo

David C. Sigee (2005). Freshwater Microbiology. John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England, 524 p

Prescott-Harley-Klein, 2002

129

CHƯƠNG 5. CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI

5.1. Phân loại và thành phần nước thải

Nước thải là nước đã qua sử dụng vào các mục đích như sinh hoạt, dịch vụ, tưới tiêu, thủy lợi, chế biến công nghiệp, chăn nuôi. Thông thường, nước thải được phân loại theo nguồn gốc phát sinh, bao gồm các dạng sau:

- Nước thải sinh hoạt

Nước thải sinh hoạt là nước thải từ khu vực dân cư bao gồm nước sau sử dụng từ các hộ

gia đình, bệnh viện, khách sạn, trường học, cơ quan, khu vui chơi giải trí.

Đặc điểm của nước thải sinh hoạt là có hàm lượng lớn các chất hữu cơ dễ bị phân hủy (carbonhydrate, protein, chất béo), các chất vô cơ dinh dưỡng (phosphate, N), vi sinh vật gây bệnh, trứng giun sán...

Hàm lượng các chất gây ô nhiễm trong nước thải sinh hoạt phụ thuộc vào điều kiện sống, chất lượng bữa ăn, lượng nước sử dụng và hệ thống tiếp nhận nước thải. Để đánh giá chính xác cần phải khảo sát đặc điểm nước thải từng khu vực dân cư như khu vực đô thị, nông thôn, miền núi, đồng bằng, khu du lịch...Để có thể dễ dàng tính toán, người ta ước tính lượng nước dùng cho một người trong một ngày là 100- 150 lít, kể cả chuồng trại chăn nuôi là 250l/người/ngày.

- Nước thải công nghiệp

Nước thải công nghiệp là nước thải từ các nhà máy, xí nghiệp sản xuất công nghiệp, thủ công nghiệp, giao thông vận tải. Loại nước thải này không có đặc điểm chung mà phụ thuộc vào quy trình công nghệ của từng loại sản phẩm. Nói chung, nước thải của các ngành công nghiệp hay của các xí nghiệp khác nhau có thành phần hóa học, hóa sinh rất khác nhau.

Ví dụ: nước thải từ các cơ sở chế biến nông sản, thực phẩm, thủy sản như đường, sữa, bột, tôm cá, rượu, bia...thường chứa nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy; nước thải của nhà máy thuộc da thường chứa nhiều kim loại nặng, sulfua; nước thải của xí nghiệp sản xuất acquy thường có nồng độ chì và acid cao...

- Nước thấm qua: là nước mưa thấm vào hệ thống ống bằng nhiều cách khác nhau như qua

các mối nối hay thành của hố ga...

- Nước thải tự nhiên: nước mưa được xem như là nước thải tự nhiên ở các thành phố lớn,

chúng được thu gom theo hệ thống thoát nước riêng,

- Nước thải đô thị: là hỗn hợp gồm các loại nước thải nêu trên được thu gom theo hệ thống

cống thoát nước của một thành phố

130

Tính chất đặc trưng của nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp được thể hiện

qua bảng sau:

Bảng 5. 1 Tính chất đặc trưng của nước thải và nguồn gốc phát sinh

(Metcalfvafeddy, 1991)

Tính chất

Nguồn phát sinh

Tính chất vật lý

Màu

Chất thải sinh hoạt và công nghiệp, sự phân rã tự nhiên các chất hữu cơ

Mùi

Sự thối rữa nước thải và chất thải công nghiệp

Nhiệt độ

Các chất thải sinh hoạt và sản xuất

Chất rắn

Cấp nước cho sinh hoạt, chất thải sinh hoạt và sản xuất, xói mòn đất, dòng thấm chảy vào hệ thống cống

Thành phần hóa học

+ Nguồn hữu cơ

Chất thải sinh hoạt, thương mại, sản xuất

Carbohydrate, Mỡ, dầu, dầu nhờn

Thuốc trừ sâu, phenol Chất thải nông nghiệp

chất

hoạt

Chất thải sinh hoạt và thương mại

Protein, động bề mặt

Các chất khác

Phân rã tự nhiên các chất hữu cơ

+ Nguồn vô cơ

Độ kiềm

Nước thải sinh hoạt, nước cấp sinh hoạt, sự thấm của nước ngầm

Clorua

Nước thải sinh hoạt, nước cấp sinh hoạt, sự thấm của nước ngầm, các chất làm mềm nước

Kim loại nặng

Chất thải công nghiệp

131

Chất thải sinh hoạt và nông nghiệp

N, P

Nước cấp sinh hoạt, nước thải sinh hoạt và công nghiệp

S

pH

Chất thải công nghiệp

Hợp chất độc

Chất thải công nghiệp

+ Các khí

Phân hủy chất thải sinh hoạt

H2S, CH4

Nước cấp sinh hoạt, sự thấm của nước bề mặt

O2

Thành phần sinh học Động vật - Thực vật

Các dòng nước hở và trạm xử lý

Vi sinh vật

Các chất thải sinh hoạt, nhà máy xử lý chất thải sinh hoạt

a) Hiện tượng nước bị ô nhiễm

Nước bị ô nhiễm hay nước nhiễm bẩn có thể quan sát bằng cảm quan qua các hiện

tượng khác thường như:

- Màu sắc: nước tự nhiên sạch không màu; nước có rong tảo phát triển thường có màu xanh đậm hơn; nước có màu vàng do nhiễm sắt; nước có màu vàng bẩn là do nhiễm acid humic có trong mùn; nước thải thường làm cho nước có màu nâu đen hoặc đen

- Mùi vị: nước sạch không có mùi vị; khi nhiễm bẩn, trong nước thải có chứa nhiều tạp chất

làm cho nước có mùi lạ như mùi thối, vị tanh.

- Độ trong: nước tự nhiên sạch thường ít hoặc không có tạp chất nên rất trong, khi bị nhiễm bẩn thường có độ đục cao do chất rắn lơ lửng gây ra. Ngoài ra nước đục còn do các nguyên nhân khác như: do lẫn bụi và hóa chất công nghiệp; do các chất hòa tan vào nước sau đó kết tủa thành hạt rắn; do đất hòa vào nước ở dạng hạt phân tán

Độ đục của nước càng cao thì khả năng hấp thụ ánh sáng của nước càng giảm, làm cho quá trình quang hợp trong nước giảm, nồng độ oxy hòa tan trong nước thấp, môi trường nước trở nên kỵ khí ảnh hưởng đến đời sống của nhiều loài thủy sinh vật.

b) Một số hiện tượng khác thường trong môi trường nước

132

- Hiện tượng “tảo nở hoa”: do nước giàu dinh dưỡng (phú dưỡng) nên tảo bùng phát về số

lượng tế bào.

- Hiện tượng cá hay một số nhóm thủy sinh vật chết hàng loạt: Trường hợp này xảy ra có thể do nước bị nhiễm độc cao các khí hòa tan, các ion kim loại nặng, các hợp chất phenol, các chất bảo vệ thực vật hay do hàm lượng các chất hữu cơ quá cao, oxy hòa tan quá thấp hoặc không có trong môi trường nước.

c) Các chất gây ô nhiễm nước

Có thể xếp các chất gây ô nhiễm nước thành 9 loại như sau: Các chất hữu cơ bền vững, khó phân hủy; Chất hữu cơ dễ bị phân hủy, chủ yếu do tác nhân sinh học; Kim loại nặng; Ion vô cơ; Dầu mỡ, các chất hoạt động bề mặt; Các chất có mùi hoặc màu; Chất rắn; Chất phóng xạ; Vi sinh vật.

 Chất hữu cơ

Chất hữu cơ dễ bị phân hủy: gồm các hợp chất như protein, hydratecarbon, chất béo có nguồn gốc động- thực vật. Đây là nguồn gây ô nhiễm chính có nhiều trong nước thải sinh hoạt, nước thải từ các nhà máy, xí nghiệp chế biến thực phẩm. Thành phần các chất hữu cơ trong nước thải sinh từ các khu dân cư thường bao gồm: khoảng 40- 60% protein, 25- 50% hydratecarbon, 10% chất béo. Các hợp chất này chủ yếu làm suy giảm oxi hòa tan trong nước dẫn đến suy thoái tài nguyên thủy sản và làm giảm chất lượng nước cấp sinh hoạt.

Chất hữu cơ khó bị phân hủy: gồm các chất hữu cơ có vòng thơm (carbuahydro của dầu khí), các chất đa vòng ngưng tụ, các hợp chất clo hữu cơ, phospho hữu cơ…trong đó một số chất ở dạng chất hữu cơ tổng hợp. Hầu hết các hợp chất này đều có độc tính đối với sinh vật và con người. Chúng tồn lưu lâu dài trong môi trường hoặc trong cơ thể sinh vật từ đó có thể gây độc và ảnh hưởng đến môi trường.

Một số hợp chất hữu cơ có độc tính cao trong môi trường nước: đây là những chất thường khó bị phân hủy bởi vi sinh vật. Trong tự nhiên chúng thường rất bền, có khả năng tích lũy và lưu giữ lâu dài trong môi trường, gây ô nhiễm và ảnh hưởng xấu đến các hệ sinh thái. Chúng có thể tích lũy trong cơ thể các nhóm thủy sinh vật, từ đó gây ngộ độc hoặc là tác nhân gây bệnh cho con người cũng như các nhóm động vật khác. Các chất hữu cơ gây độc thường gặp như Polyclorophenol (PCP), polyclorobiphenyl (PCB), carbuahydro đa vòng ngưng tụ, hợp chất dị vòng N, O. Chúng thường có trong nước thải công nghiệp và nguồn nước ở khu vực canh tác nông nghiệp sử dụng nhiều thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng cây trồng.

133

Bảng 5. 2 Một số chất hữu cơ có độc tính cao thường gặp

Đặc điểm Loại chất hữu cơ có độc tính cao

Hợp chất phenol

Phenol và các dẫn xuất của phenol có nhiều trong nước thải công nghiệp hóa học, có độc tính cao có thể gây hại đến các hệ sinh thái

PCP: có dạng tinh thể không màu, công thức hóa học C6HCl5O, thường sử dụng để diệt nấm, khử khuẩn, bảo quản gỗ. Chất này thường bền trong nước hoặc tồn tại trong dạ dày, ruột hay phổi của người và động vật, gây độc cho quá trình hô hấp và quá trình quang hợp của thực vật

Hợp chất bảo vệ thực vật

Là những hợp chất hữu cơ tổng hợp có cấu trúc hóa học đa dạng. Thành phần hóa học ngoài C, H còn có S, P, Cl, N. Chúng có độc tính và ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của sinh vật. các hợp chất này (kể cả sản phẩm sau phân hủy của chúng) cũng có thể là tác nhân gây ung thư. Có thể chia các hợp chất bảo vệ thực vật thành các dạng: thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, thuốc chống vi khuẩn, thuốc diệt nấm mốc, thuốc diệt loài gặm nhấm..

chất Hợp Carbonhydro

Các hợp chất này là thành phần chủ yếu của dầu mỏ, khí đốt. Thành phần chủ yếu là C và H với các dạng hợp chất no, không no, mạch vòng, mạch nhánh…Nhiễm độc dầu có thể làm giảm số lượng, chất lượng thủy sản, có thể làm cho thủy sinh vật phát triển không bình thường hoặc phá vở hệ sinh thái

Xà phòng và chất tẩy rửa (detergen)

Xà phòng là muối của acid béo bậc cao như natri stearate, được sử dụng như các tác nhân làm sạch cao. Các chất tẩy rửa có hoạt tính bề mặt cao, hòa tan tốt trong nước và có sức căng bề mặt nhỏ. Chất tẩy rửa khi có trong nước thải sẽ làm cho nước tạo một khối bọt lớn và làm giảm khả năng khuếch tán khí vào nước. Khi polyphosphate phân hủy trong nước tạo thành các dạng ion phosphate, là nguồn dinh dưỡng cho các nhóm thực vật thủy sinh.

134

Tanin và lignin

Đây là 2 hợp chất có nguồn gốc từ thực vật, rất khó bị phân hủy sinh học. Tanin có nhiều trong nước thải ngành thuộc da, trong khi lignin có nhiều trong nước thải sản xuất giấy. Các chất này làm cho nước thải có màu nâu hoặc đen, có độc tính đối với thủy sinh vật và làm giảm chất lượng nước.

 Chất vô cơ

-)

+ Các hợp chất chứa N: trong môi trường nước, hợp chất chứa N thường tồn tại ở 3

-, NO3

- chứng tỏ quá trình phân hủy đã kết thúc. NO3

. dạng: hợp chất hữu cơ, NH3 và dạng oxi hóa (NO2

Nếu nước chứa hầu hết các hợp chất N hữu cơ, NH3 hay NH4OH chứng tỏ nước mới bị ô nhiễm, NH3 trong nước thường gây độc cho cá và các nhóm thủy sinh vật khác. Nếu trong - thì nước đã bị ô nhiễm một thời gian dài. Nếu trong nước nước chứa chủ yếu N ở dạng NO2 - thường chỉ bền ở chứa chủ yếu N ở dạng NO3 điều kiện hiếu khí, nếu thiếu khí hay kị khí chúng dễ dàng bị khử thành N2O, NO và N2 rồi - trong nước cao có thể ảnh hưởng gây tách khỏi nước đi vào không khí. Nếu hàm lượng NO3 ngộ độc ở người.

+ (NH4OH, NH4NO3, (NH4)2SO4...) tùy thuộc vào pH của nước. Cùng với 3-), amoniac cũng thúc đẩy quá trình phú dưỡng trong phosphat (PO4 nước. Với nồng độ 0,01mg/l NH3 đã có thể gây độc cho cá qua đường máu, ở nồng độ 0,2- 0,5mg/l gây độc cấp tính

-)

Amoniac (NH3) Trong nước amoniac tồn tại ở các dạng: NH3 và NH4

Nitrate (NO3

-, H2PO4

Đây là sản phẩm cuối cùng của quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa N. Trong nước tự nhiên, nồng độ nitrate thường <5mg/l; ở - >10mg/l. vùng nước bị ô nhiễm hữu cơ thường có hàm lượng NO3 Bản thân nitrate không có độc tính nhưng trong cơ thể sinh vật -) rồi kết hợp với một số chúng có thể chuyển hóa thành nitrite (NO2 chất khác tao thành nitroso là chất có khả năng gây ung thư

+ Các hợp chất chứa P: P trong nước thường tồn tại ở dạng orthophosphat; muối 3- từ phân bón hoặc tôm cá bị thối rữa; 2-, PO4 phosphate của acid phosphoric H2PO4 polyphosphate từ chất tẩy rữa như pyrometaphosphate có thể chuyển hóa thành orthophosphate trong môi trường nước, đặc biệt ở điều kiện nhiệt độ cao (gần điểm sôi) và pH acid.

Trong vùng nước không ô nhiễm, phosphate thường có nồng độ < 0,01mg/l; vùng nước bị ô nhiễm do hoạt động nông nghiệp, sinh hoạt thường có nồng độ > 0,5mg/l. Phosphate có nhiều trong phân động vật và người, trong nước thải sản xuất phân lân, trong ngành chế biến thủy

135

sản. Phosphate không độc nhưng là nguyên nhân gây phú dưỡng hóa các thủy vực, gây hiện tượng ”tảo nở hoa”, giảm chất lượng môi trường nước.

 Kim loại nặng

Hầu hết kim loại nặng (KLN) đều có tính độc cao đối với người và động vật. Trong nước

thải công nghiệp thường có các KLN như Pb, Hg, Cr, Cd. As...

Chì (Pb)

Đây là KLN có tính độc đối với não và có khả năng tích lũy lâu dài trong cơ thể sinh vật. Các hợp chất hữu cơ chứa chì thường độc hơn gấp 100 lần so với hợp chất vô cơ có chứa chì. Hàm lượng chì phụ thuộc vào pH, độ cứng, nhiệt độ, thời gian tiếp xúc. Dạng tồn tại của chì trong nước là Pb2+, với nồng độ > 0,1mg/l có thể kìm hãm quá trình oxi hóa sinh học các hợp chất hữu cơ và gây độc cho các nhóm sinh vật bậc thấp trong nước, nồng độ > 0,5mg/l có thể kìm hãm quá trình nitrate hóa. Chì có thể thâm nhập vào cơ thể người qua nguồn thức ăn, nước uống hay hít thở. Chúng tích lũy trong xương và thường gây độc ở nồng độ cao. Chì thường có trong nước thải công nghiệp sản xuất pin, acquy, luyện kim, hóa dầu, trong xăng pha chì...Vùng nước không ô nhiễm thường có hàm lượng chì thấp hoặc ở dạng vết, nước biển khoảng 0,03g/l, nước sông hồ khoảng 1- 50g/l

Thủy ngân (Hg)

Thủy ngân ở dạng vô cơ hay hữu cơ đều là chất độc mạnh đối với sinh vật, thủy ngân có thể tạo muối ở dạng Hg+ hoặc Hg2+. Trong đất không ô nhiễm, nồng độ Hg khoảng 0,02- 0,5mg/kg, trong than đá khoảng 0,1- 1mg/kg; trong nước mặt, nước ngầm nồng độ Hg rất thấp, thường < 0,5g/l. Thủy ngân có thể kìm hãm khả năng tự làm sạch của nước ở nồng độ 18g/l, một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hợp chất thủy ngân vô cơ thành dạng methyl, làm tăng thêm tính độc của nó. Thủy ngân thâm nhập vào cơ thể người từ nguồn thức ăn khoảng 2- 20mg/ngày, tùy theo mỗi vùng khác nhau. Trong cơ thể, Hg kết hợp với nhóm sulfhydryl của protein, kìm hãm hoạt động của enzyme, ảnh hưởng đến cơ thể sinh vật. Ngoài ra chúng còn phá vỡ màng sinh chất, làm giảm lượng ARN trong tế bào. Thủy ngân methyl là hợp chất rất độc do khả năng hòa tan tốt trong mỡ. Nồng độ quy định trong nước uống theo WHO và nhiều quốc gia trên thế giới là 1g/l.

Asen (As) Asen là chất cực độc, có khả năng tích lũy trong cơ thể và gây ung thư. Đây là nguyên tố bán dẫn, tồn tại ở nhiều dạng thù hình khác nhau. As ở

136

dạng kim loại có màu xám và là dạng bền nhất, các dạng khác là loại á kim có độ bền không cao. Trong tự nhiên chúng tồn tại ở dạng hợp chất với lưu huỳnh: realgar (As4S4), auripigment (As2S3), asenkies (FeAsS), cobaltit (Co, Fe)AsS hoặc hợp kim với đồng và antimon. Trong đất đá, phụ thuộc vào điều kiện địa chất, hàm lượng asen vào khoảng 5- 10mg/kg mẫu khô. As thâm nhập vào nước do quá trình hòa tan, phong hóa từ đất đá, từ các nguồn thải công nghiệp hoặc lắng đọng từ khí quyển. Trong nước có nhiều oxi, As tồn tại ở dạng hóa trị V, trong nước ít oxi (nước ngầm), As ở dạng asenat (III) và As kim loại. Ở nồng độ > 0,76mg/l, As có thể kìm hãm khả năng tự làm sạch của nước, Natri asenit ở nồng độ 6- 10mg/l có thể gây chết các nhóm thực vật bậc cao nhưng lại kích thích sự phát triển của tảo và nấm. As hóa trị 3 có độc tính cao hơn ở hóa trị 5.

Crom (Cr) Đây cũng là kim loại có tính độc cao đối với người và động vật. Crom VI thường độc hơn Crom III. Nồng độ cho phép của WHO đối với Cr trong nước uống là 0,05mg/l

Cadimi (Cd)

Cd thường được sử dụng trong công nghiệp mạ, sơn và làm chất ổn định trong công nghiệp chất dẻo. Vì vậy, nó có thể có trong các loại nước thải công nghiệp thuộc lĩnh vực sản xuất này. Cá và các loại thủy sinh vật rất nhạy cảm đối với kim loại này. Chúng có thể xâm nhập vào cơ thể người qua đường ăn uống, đường hô hấp. Cd thường tích lũy ở thận và xương, ngưỡng gây hại của Cd là 200g/l. WHO quy định lượng Cd tối đa trong nước uống là 0,005mg/l.

 Một số chất cần quan tâm trong môi trường nước

2- là hợp chất ít độc hại nhất ở trong nước, trong nước biển và SO4 2- có thể nước phèn thường có nồng độ sulphat cao. Ở nồng độ cao, SO4 gây rỉ sét đường ống và công trình bê tông hoặc tạo thành H2S gây mùi khó chịu, gây độc đối với thủy sinh vật

Sulphat 2-) (SO4

Clorua (Cl-) Là thành phần gây nên vị mặn trong nước. Nước có hàm lượng Cl-, Na+ cao thường gây hại đến cây trồng. Theo FAO, trong nước có nồng độ Cl- <142mg/l thì không ảnh hưởng đến cây trồng, > 355mg/l thường gây tác hại nặng đối với cây trồng

Xianua (CN-) Gốc xianua tồn tại ở dạng muối của acid xianic (HCN). Xianua kết hợp với đường trong hoa quả, củ gây ra vị đắng. Trong nước xianua tồn tại ở dạng anion CN-, HCN hay dạng hợp chất với kim loại với tổng nồng

137

độ khoảng <10g/l. Xianua tự do có tính độc cao hơn ở dạng hợp chất. Tính độc của xianua trước hết là do khả năng tạo phức bền với các loại enzyme có chứa sắt

2-.

Hydrosulfua (H2S)

H2S trong điều kiện thường tồn tại ở trạng thái khí không màu và rất độc, có mùi trứng thối ở nồng độ thấp. Độ hòa tan của nó trong nước thấp và có tính chất của một acid yếu. Trong môi trường acid hoặc trung tính chúng tồn tại ở dạng H2S và HS, trong môi trường kiềm chủ yếu tồn tại ở dạng S2-. H2S được hình thành chủ yếu trong môi trường nước yếm khí. Trong nước giàu oxi và thoáng khí, H2S hầu như không tồn tại vì đã chuyển hóa thành lưu huỳnh (S) hay SO4

Sắt (Fe)

Là nguyên tố phân bố rộng trong đất, đá thường ở trạng thái có độ tan thấp. Hàm lượng sắt trong nước ngầm tùy theo từng vùng, thường trong khoảng 0,5- 50mg/l. Sự tồn tại của Fe trong nước thúc đẩy sự phát triển của các nhóm vi khuẩn sắt, chúng sử dụng năng lượng oxi hóa Fe (II) thành Fe (III). Sắt (III) trong vùng nước chua phèn khó tạo thành hydroxit sắt mà tồn tại ở dạng phức chất với các chất hữu cơ tan, đặc biệt với acid humic, acid fulvic.

Mangan (Mn) Là nguyên tố thường gặp trong nước ngầm, cùng tồn tại với Fe và có những điểm tương đồng với sắt. Sự có mặt của Mn trong nước ở nồng độ 0,1mg/l có thể gây ra màu và mùi khó chịu. Nồng độ Mn được xem là an toàn khi < 0,05mg/l. Nồng độ Mn theo tiêu chuẩn của các nước EU là 0,03mg/l, của Mỹ là 0,04mg/l.

Nhôm (Al)

Nhôm là nguyên tố thường gặp và phân bố rộng, chiếm khoảng 8% lớp vỏ trái đất, là thành phần hóa học trong đất và tế bào động-thực vật. Al được sử dụng làm chất keo tụ cho quá trình xử lý nước. Al tồn tại trong nước do quá trình rửa trôi từ đất đá, đặc biệt ở những vùng mà nước có dung lượng đệm thấp và nhiều mưa. Nguồn nhôm chủ yếu đưa vào cơ thể từ thức ăn với lượng 5- 20mg/ngày. Nhôm thường có tính độc thấp đối với động vật nên theo WHO (1988) lượng Al cho phép đưa vào cơ thể tảm thời là 7mg/kg thể trọng trong một tuần

Florua (F-)

Trong lớp vỏ trái đất, nguyên tố F có hàm lượng khoảng 0,3g/kg. Trong nước tự nhiên chứa một lượng F nhất định, khoảng < 1,5mg/l; nước ngầm có thể đạt 10mg/l ở những vùng có nhiều khoáng chất F. F là thành phần hóa học được nhiều quốc gia bổ sung vào nước sinh hoạt nhằm chống sâu răng.

138

Đồng (Cu)

Trong tự nhiên đồng tồn tại dưới dạng khoáng sulfua, dạng oxi hóa (oxit đồng, carbonate) hoặc dạng kim loại. Trong nước tự nhiên, Cu tồn tại ở trạng thái hóa trị +1 và +2, trong nước biển có hàm lượng khoảng 1-5g/l. Đồng tích tụ trong các hạt trầm tích và phân bố vào môi trường nước ở dạng phức chất với các hợp chất hữu cơ tự nhiên. Cu rất độc đối với cá, đặc biệt khi có thêm các kim loại khác như Zn, Cd và Hg.

5.2. Cơ sở sinh học trong xử lý nước thải

5.2.1. Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học

Mục tiêu của quá trình xử lý sinh học đối với nước thải là làm đông tụ, loại bỏ các hạt keo lơ lửng và ổn định chất hữu cơ. Đối với nước thải sinh hoạt, quá trình xử lý sinh học nhằm loại bỏ các chất hữu cơ, chất dinh dưỡng như N, P ra khỏi nước thải. Ngoài ra còn xử lý các chất hữu cơ vi lượng có khả năng gây độc. Đối với nước thải công nghiệp, xử lý sinh học còn nhằm loại bỏ hoặc giảm hàm lượng chất hữu cơ và vô cơ, vì các chất này có thể gây độc cho vi sinh vật.

Trong phương pháp xử lý sinh học, vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) góp phần vào 3 quá trình, bao gồm sự loại bỏ BOD carbon, sự đông tụ các hạt keo lơ lửng và sự ổn định chất hữu cơ một cách hoàn chỉnh. Vi sinh vật sẽ chuyển hóa vật chất hữu cơ dạng keo, hòa tan thành khí và sinh khối tế bào. Sinh khối tế bào tiếp tục được loại bỏ khỏi nước thải qua quá trình lắng.

Quá trình sinh học sẽ chưa hoàn chỉnh khi sinh khối được tạo ra từ chất hữu cơ trong nước thải chưa được khử bỏ. Vì sinh khối tế bào cũng là chất hữu cơ nên chúng được đo bằng thông số BOD trong nước đầu ra. Nếu sinh khối không được loại bỏ, quá trình xử lý chỉ làm được một phần việc chuyển hóa sinh học một phần chất hữu cơ ban đầu thành khí bởi vi khuẩn.

Xử lý nước thải bao gồm các bước sau:

+ Xử lý sơ bộ: loại bỏ cặn và vật liệu thô có thể làm tắc các thiết bị trong nhà máy

+ Xử lý bậc 1: được tiến hành bởi các quá trình vật lý như lọc hoặc lắng

+ Xử lý bậc 2: bao gồm quá trình xử lý sinh học (bùn hoạt tính, lọc sinh học, hồ oxi hóa) và xử lý hóa học (khử trùng); loại bỏ chất dinh dưỡng cũng được áp dụng trong bước xử lý bậc 2 này

+ Xử lý bậc 3 (xử lý cao cấp): gồm các công trình được thiết kế để loại bỏ thêm BOD, chất dinh dưỡng, vi sinh vật gây bệnh, ký sinh trùng và cả chất độc hại.

139

Tóm lại, mục tiêu của quá trình xử lý sinh học là nhằm:

 Giảm hàm lượng chất hữu cơ của nước thải như BOD, loại bỏ hoặc giảm bớt các chất ô

nhiễm vi lượng khó phân hủy sinh học, có thể gây bệnh

 Loại bỏ/giảm bớt chất dinh dưỡng (N, P) để giảm bớt ô nhiễm cho nguồn nước nhận và

nước ngầm khi nước thải thải vào môi trường đất

 Loại bỏ hay bất hoạt các nhóm vi sinh vật gây bệnh hay ký sinh trùng

Các quá trình sinh học áp dụng trong xử lý nước thải gồm 3 nhóm:

- Quá trình hiếu khí (aerobic)

- Quá trình kỵ khí (anaerobic)

- Quá trình hồ sinh học (stabilization ponds)

Quá trình xử lý được thực hiện theo các phương thức khác nhau tùy thuộc vào hệ thống tăng trưởng vi sinh ở dạng lơ lửng, tăng trưởng dính bám hay kết hợp. Về cơ bản, để áp dụng quá trình xử lý sinh học cần hiểu rõ hoạt tính sinh hóa của các nhóm vi sinh vật chính, bao gồm: nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật trong nước thải và tính chất của quá trình trao đổi chất dựa vào nhu cầu oxi.

Điều kiện để xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học

- Không có chất độc ức chế vi sinh vật

- Chất hữu cơ có trong nước thải là nguồn C và năng lượng cho vi sinh vật

- Xử lý hiếu khí: COD/BOD < 2 hoặc BOD/COD > 0,5

• BOD < 500 mg/l

• Ngắn ngày: BOD:N:P = 100:5:1

• Dài ngày: BOD:N:P = 200:5:1

- Xử lý kỵ khí: COD : BOD > 2

Bảng 5. 3 Các chất ô nhiễm cần loại bỏ trong xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học

Chất ô nhiễm Ví dụ Tính chất

Chất rắn lơ lửng Tăng lắng tụ bùn

140

Tạo điều kiện kỵ khí

Giảm nguồn O2

Chất hữu cơ phân hủy sinh học Protein, carbohydrate, lipid Tăng điều kiện kỵ khí

Chất dinh dưỡng C, N, P Gia tăng nguồn vi sinh vật nước không mong muốn

Chất hữu cơ bền Khó xử lý bằng sinh học Chất hoạt động bề mặt, phenol, hóa chất bảo vệ thực vật

Kim loại nặng Pb, Hg… Gây độc thực vật thủy sinh, vi sinh vật

Chất vô cơ hòa tan Ca, Na, S … Tạo muối

Gây dịch bệnh Vi sinh vật gây bệnh

Bảng 5. 4 Các quá trình xử lý sinh học chủ yếu được áp dụng

Kiểu xử lý Tên thông thường Áp dụng

Xử lý hiếu khí

Quá trình bùn hoạt tính Loại bỏ BOD, nitrat hóa Tăng trưởng lơ lửng Hồ/Mương oxi hóa Loại bỏ BOD, nitrat hóa

Bể lọc sinh học chậm Loại bỏ BOD, nitrat hóa

Tăng trưởng dính bám Bể lọc sinh học nhanh Loại bỏ BOD, nitrat hóa

Bể lọc sinh học quay Loại bỏ BOD, nitrat hóa

Xử lý hiếu khí

Bể phân hủy kị khí Ổn định, loại bỏ BOD Tăng trưởng lơ lửng Bể UASB Ổn định, loại bỏ BOD

Tăng trưởng dính bám Lọc kị khí Loại bỏ BOD, ổn định chất thải

Hồ sinh học

Hồ hiếu khí Loại bỏ BOD

141

Loại bỏ BOD, nitrat hóa Hồ bậc ba

Loại bỏ BOD Hồ tùy tiện

Loại bỏ BOD, ổn định chất thải

Hồ kị khí

5.2.1.1. Quá trình phân hủy hiếu khí

Các phản ứng xảy ra trong quá trình này là do vi sinh vật hoại sinh hiếu khí hoạt động cần có oxi của không khí để phân hủy các chất hữu cơ nhiễm bẩn trong nước. Theo Eckenfelder W.W và Conon D.J (1961) quá trình phân hủy hiếu khí nước thải gồm 3 giai đoạn, được thể hiện qua các phản ứng sau:

 Giai đoạn 1: Oxy hóa toàn bộ chất hữu cơ có trong nước thải để cung cấp năng lượng cho

tế bào.

CxHyOzN + (x+y/4+z/3+3/4) O2 xCO2 + [(y-3)/2] H2O + NH3 + ∆H Enzyme

Enzyme

 Giai đoạn 2 (quá trình đồng hóa): Tổng hợp để xây dựng tế bào

CxHyOzN + NH3 + O2 tế bào vi sinh vật + CO2 + H2O + C5H7NO2 - ∆H

Enzyme

 Giai đoạn 3 (quá trình dị hóa): Hô hấp nội bào

C5H7NO2 + 5O2 5CO2 + 2H2O + NH3 ± ∆H

Vi sinh vật hoại sinh có trong nước thải hầu hết là vi khuẩn hiếu khí, kị khí và kị khí tùy tiện. Có thể gặp các nhóm vi khuẩn sau: Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Flavobacterium, Cytophaga, Micrococcus, Lactobacillus, Achromobacterm, Spirochaeta, Clostridium và Euterobacterium, Streptococcus. Trong đó, Pseudomonas thường gặp ở hầu hết các loại nước thải và có thể đồng hóa được mọi chất hữu cơ, kể cả hợp chất hữu cơ tổng hợp như PVA (polyvinyl alcohol) và sống khá lâu trong môi trường nước. Tiếp đến là nhóm Bacillus, chúng cũng tồn tại lâu trong nước thải và phân hủy được nhiều dạng hợp chất hữu cơ, đặc biệt là protein và tinh bột. Bên cạnh đó còn có các nhóm Alcaligenes và Flavobacterium cũng giữ vai trò quan trọng trong phân giải protein.

Pseudomonas là nhóm trực khuẩn gram (-), chuyển động nhờ tiên mao ở đầu, tế bào có dạng hình que thẳng hoặc hơi cong, không tạo bào tử và phát triển ở điều kiện hiếu khí. Nhiều loài có đặc tính ưa lạnh, nhiệt độ tối thiểu -2 ÷5oC, nhiệt độ tối ưu là 20 ÷25oC. Tất cả các loài thuộc chi

142

Tế bào trực khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas đều tiết enzyme amilase và protease, đồng thời lên men được nhiều loại đường và tạo màng nhầy. pH <5,5 kìm hãm vi khuẩn Pseudomonas phát triển; nồng độ muối trong nước đạt 5- 6% thì vi khuẩn này ngừng phát triển.

Tế bào trực khuẩn Bacillus

Bacillus là trực khuẩn phổ biến trong tự nhiên (đất, nước, thực vật...) với các loài thường gặp như Bacillus subtilis, B.mesentericus. Tế bào hình que, gram (+), sinh bào tử, sống hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, tạo enzyme protease và amilase, nhiệt độ thích hợp 35- 45oC, pH< 4,5 chúng ngừng phát triển.

Trong nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp ngành chế biến nông sản, thực phẩm, thủy sản, nước thải chăn nuôi...đều giàu các chất hữu cơ với 3 nhóm: protein 40- 50%; hydratcarbon 50% và chất béo 10%. Số lượng vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn có trong nước thải vào khoảng 105- 109 tế bào/ml. Vi sinh vật để phân giải được các hợp chất hữu cơ phải có khả năng tổng hợp các enzyme tương ứng, như để phân giải protein, vi sinh vật phải tạo enzyme protease hay để phân giải tinh bột, chúng phải tạo ra enzyme amilase...

Quá trình phân hủy các chất hữu cơ xảy ra ở bên ngoài tế bào do các enzyme thủy phân như amilase, protein, lipase...thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp có thể đi qua màng vào bên trong tế bào, quá trình này gọi là phân hủy ngoại bào. Các chất này tiếp tục được phân hủy hoặc chuyển hóa thành vật liệu xây dựng tế bào mới, quá trình này xảy ra trong tế bào gọi là phân hủy nội bào.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy hiếu khí:

 Phải đủ lượng oxi hòa tan trong nước để cung cấp cho đời sống vi sinh vật và các phản ứng

oxi hóa- khử

 Các chất hữu cơ có trong nước, trước hết là các chất hòa tan được vi sinh vật phân hủy

hoặc sử dụng, sau đó đến các chất khó tan hoặc không tan

 Hầu hết vi khuẩn tham gia quá trình làm sạch đều thuộc nhóm hoại sinh, hiếu khí và ưa ấm, đặc biệt là phản ứng sinh hóa nhờ enzyme xúc tác. Vì vậy, nhiệt độ xử lý nước thải ảnh hưởng lớn đến đời sống vi sinh vật và động học các phản ứng enzyme.

143

Đối với O2 hòa tan cung cấp cho quá trình sống của vi sinh vật trong nước, ngoài lượng hòa tan tự nhiên còn cần phải bổ sung trong các công trình xử lý nước thải. Oxi cung cấp cho quá trình phân hủy chất hữu cơ được chia thành 2 giai đoạn:

+ Giai đoạn C: phân hủy các hợp chất hydratecarbon như quá trình hô hấp, giải phóng

năng lượng, CO2, H2O và vật liệu tế bào.

+ Giai đoạn N: phân hủy các hợp chất có chứa N trong phân tử như protein hay các sản

- và tiếp tục chuyển thành NO3

phẩm phân hủy trung gian (peptone, acid amin...) và giải phóng NH3.

Từ acid amin và NH3 vi sinh vật có thể tổng hợp thành protein mới, enzyme mới, và tế bào mới. Lượng NH3 dư không dùng hết cho việc xây dựng tế bào sẽ được vi khuẩn - nhờ vi khuẩn Nitrobacter; Nitrosomonas chuyển thành NO2 sau đó nhờ vi khuẩn phản nitrate hóa chuyển thành N2 phân tử trong không khí. Giai đoạn nitrate hóa cần nhiều O2 nhưng không bằng pha C trong khi vi khuẩn khử nitrate thường cần điều kiện hiếu khí thấp (điều kiện thiếu khí).

Các nhóm vi khuẩn khử NO3

- thành NO3

- thường gồm Achromobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Proteus, Pseudomonas, Spirillum. Chúng là nhóm vi khuẩn dị dưỡng có khả năng khác nhau trong - và tạo NO, N2O và N2. Nhóm vi việc khử nitrate theo 2 bước: chuyển hóa NO3 khuẩn này rất mẫn cảm và chịu đựng được nhiều chất kìm hãm, chúng hoạt động mạnh ở pH= 7,5- 8,6.

Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus,

Điều kiện chung cho vi khuẩn nitrate hóa là pH= 5,5- 9, tối ưu là 7,5; lượng O2 hòa tan cần là 0,5mg/l; nhiệt độ 5- 40oC. Một số nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có hoạt tính +. Các nhóm này bao protease có khả năng phân hủy protein, tạo sản phẩm cuối cùng là NH4 gồm một số chủng như: Vi khuẩn có Bacillus, Proteus, Pseudomonas, Chromobacterium, Clostridium và E.coli; xạ khuẩn gồm Streptomyces, Actinomyces; nấm mốc gồm Aspergillus, Penicilium, Mucor, Rhizopus...

5.2.1.2. Quá trình phân hủy kỵ khí

Là quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ, vô cơ trong điều kiện không có O2 của không khí nhờ vi sinh vật kỵ khí. Quá trình phân giải kỵ khí các chất hữu cơ có trong nước thải, rác thải hoặc cặn bùn, cặn thải gồm hai giai đoạn:

+ Giai đoạn thủy phân: dưới tác dụng của các enzyme thủy phân do vi sinh vật tiết ra, chất hữu cơ sẽ được thủy phân. Hydratecarbon phức tạp (kể cả các chất không hòa tan) sẽ được thủy phân thành đường đơn; protein thành albumoz, peptone, peptide, acid amine; chất béo (lipid) sẽ thành glycerine và các acid béo.

144

+ Giai đoạn tạo khí: sản phẩm thủy phân tiếp tục được phân giải và tạo thành sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp các khí chủ yếu gồm CO2 và CH4; ngoài ra còn tạo thành một số khí khác như H2, N2, H2S và muối khoáng.

Hydratecarbon bị phân hủy sớm nhất và nhanh nhất, hầu hết chuyển thành CH4 và CO2. Các hợp chất hữu cơ hòa tan bị phân hủy gần như hoàn toàn: acid béo tự do được phân hủy 80- 90%, acid béo loại este được phân hủy 65- 68%. Riêng lignin là hợp chất hữu cơ khó phân giải nhất, nó là nguồn tạo ra mùn.

Quá trình phân hủy kỵ khí sinh ra sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp khí, trong đó khí CH4 chiếm chủ yếu với 60- 75%, vì vậy quá trình này còn được gọi là quá trình lên men methane. Quá trình này gồm hai pha điển hình gồm pha acid và pha kiềm.

+ Ở pha acid, hydratecarbon (cellulose, hemicellulose, tinh bột, các loại đường, dextrin...) rất dễ bị phân hủy và tạo thành các acid hữu cơ có phân tử lượng thấp (acid propionic, acid butyric, acid acetic...). Một phần acid béo cũng chuyển thành acid hữu cơ. Đặc trưng của pha này là tạo thành acid, pH môi trường có thể đạt < 5 và kèm theo mùi hôi thối.

Cuối pha, acid hữu cơ và các chất tan có chứa N tiếp tục bị phân hủy thành hợp chất amoni, amin, muối của acid carbonic, một lượng nhỏ các khí CO2 H2, N2, CH4, pH môi trường tăng và chuyển sang trung tính hoặc kiềm. Mùi rất khó chịu do trong hỗn hợp khí có chứa H2S, indol, scatol và mercaptan.

Chất hữu cơ phức tạp (Hydratecarbon, protein, lipid)

Chất hữu cơ đơn giản

(đường, peptide, acid béo)

Acid bay hơi

(propionic, butyric…)

Acetate

H2, CO2

CH4, CO2

+ Ở pha kiềm- pha tạo khí CH4, các sản phẩm thủy phân của pha acid làm cơ chất cho quá trình lên men metan, tạo thành CO2 và CH4, pH kiềm. Các nhóm amin tác dụng với CO2 tạo thành muối carbonate, giúp môi trường có tính đệm cao

Hình 5. 1 Phân hủy chất hữu cơ trong điều kiện kỵ khí

145

Quá trình phân hủy chất hữu cơ ở điều kiện kỵ khí là một quá trình phức tạp, với sự tham gia của rất nhiều nhóm vi khuẩn kỵ khí bắt buộc hay không bắt buộc. Chúng có thể tiến hành phân hủy cơ chất ở 3 thang nhiệt độ: 10- 15oC, 30- 40oC, và > 45oC.

Thời gian lên men tương đối dài: với điều kiện tối ưu ở nhiệt độ 45- 55 oC, thời gian lên men khoảng 10- 15 ngày; ở thang nhiệt độ thấp hơn thì thời gian lên men kéo dài hàng tháng.

Vi khuẩn tham gia quá trình lên men methane gồm hai nhóm: nhóm vi khuẩn không

sinh methane và nhóm vi khuẩn sinh methane

 Nhóm vi khuẩn không sinh methane

Gồm vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc. Nhóm vi khuẩn kỵ khí thường là Gr (-), không sinh bào tử, phân hủy polysaccharide thành acid acetic, acid butyric và CO2, H2.

Khi có mặt cellulose có thể gặp các loài sau: Bacillus cereus, B.megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Pse.riboflavina, Pse.reptilorova, Leptespira biflexa, Alcaligenes faecalis và Proteus vulgraris.

Khi có mặt tinh bột với hàm lượng cao có thể gặp các loài Micrococcus candidus,

M.varian, M.urea, Bacillus cereus, B.megaterium, Pseudomonas spp.

Nếu môi trường giàu protein thì thường gặp các nhóm vi khuẩn như Clostridium, Bacillus cereus, B.circulans. B.sphaericus, B.subtilis. Micrococcus varians, Escherichia coli, các nhóm vi khuẩn Coliform và Pseudomonas spp. Môi trường giàu chất béo thường gặp các giống Bacillus, Micrococcus, Streptomyces, Alcaligenes và Pseudomonas...

Trong các nhóm vi khuẩn phân hủy protein, cần chú ý đến giống Clostridium. Chúng có mặt nhiều trong nước thải giàu protein, có đặc điểm kỵ khí, phân hủy mạnh protein và chia thành 3 nhóm:

- Clostridium nhóm I (C.butylicum): phân hủy trực tiếp tinh bột tạo acid acetic, chủ yếu là

acid butyric

- Clostridium nhóm II: Phân hủy protein, tạo acid isovaleric và acid acetic

- Clostridium nhóm III: Phân hủy protein, không phân hủy đường, thu nhận năng lượng từ

chuyển hóa các acid amin

 Nhóm vi khuẩn sinh methane

Đây là nhóm vi khuẩn sống kỵ khí nghiêm ngặt, rất mẫn cảm với O2, sinh trưởng và phát triển chậm. Vi khuẩn sinh methane được chia thành 4 nhóm theo hình thái và khả năng tạo bào tử:

146

+ Methanobacterium: hình que, không sinh bào tử

+ Methanobacillus: hình que, sinh bào tử

+ Methanococcus: tế bào hình cầu, đứng riêng lẻ, không kết thành chuỗi

+ Methanosarsina: tế bào hình cầu, kết thành chuỗi hoặc khối

Vi khuẩn sinh methane là nhóm Gr (-), không di động, phần lớn không sinh bào tử và kỵ

khí nghiêm ngặt. Chúng có thể sử dụng NH3 làm nguồn N, phát triển rất chậm.

Methanobacterium omelianskii được phân lập từ năm 1940, chúng có khả năng khử CO2

thành metan nhờ sử dụng H2 và rượu là chất cho điện tử trong các phản ứng oxi hóa khử.

Vi sinh vật phân hủy kỵ khí gặp ở mọi nơi trong tự nhiên, đặc biệt ở những nơi có rác bẩn, bùn đáy ao hồ tù đọng, cống rãnh...Ở đây có thể thấy đủ các nhóm vi khuẩn phân hủy cellulose, protein, chất béo, vi khuẩn amon hóa, vi khuẩn khử sulfate...Các nhóm vi sinh vật này có hai khoảng nhiệt độ hoạt động: nhóm ưa ấm với nhiệt độ 25- 37oC và nhóm ưa nhiệt với khoảng 50- 55oC.

Bảng 5. 5 Vi sinh vật tạo acid hữu cơ

Vi khuẩn pH Sản phẩm Nhiệt độ (oC)

5,2

25- 35 Acid acetic, acid lactic 5,2 – 8,0 25- 35 Acid acetic, acid lactic 5,2 – 7,5 28- 35 Acid acetic, acid lactic 5,2 – 7,5 25- 35 Acid acetic, acid succinic 5,0 – 8,5 25- 37 Acid acetic, acid formic 5,0 – 8,5 36- 38 Acid lactic, ethanol, CO2 5,0 – 8,5 35- 51 Acid acetic, acid formic

- Bacillus cereus Bacillus knolfekampi Bacillus megaterium Bacteroides succinigenes Clostridium carnefectium Clostridium cellobinharus Clostridium dissolvens Clostridium thermocellulaseum 5,0 – 8,5 55- 65 Acid lactic, ethanol, succinic 3- 42 A.formic, a.acetic, a.lactic, Pseudomonas

ethanol, a.succinic 33- 48 Acid formic, acetic, succinic - Ruminococcus sp

Bảng 5. 6 Vi khuẩn sinh methane

Vi khuẩn pH Sản phẩm Nhiệt độ (oC)

Methanobacterium omelianskii 6,5- 8,0 37- 40 CO2, H2, rượu I và II 147

Methanopropionicum Methanoformicum Methanosochngenii Methanosuboxydans Methanoruminanticum Methanococcus vanirielli Methanococcus mazei Methanosarcina methanica Methanosarcina barkerli - - Acid propionic CO2, H2, acid formic acid acetic Acid butyric, a.valeric, caprionic H2, acid formic H2, acid formic Acid butyric, a.acetic Acid butyric, a.acetic CO2, H2, a.acetic và methanol

Vi khuẩn sinh methane rất nhạy cảm với môi trường, đặc biệt rất dễ bị ức chế bởi sự có

mặt của kim loại nặng trong môi trường.

Nguồn C của chúng là hợp chất hữu cơ, vô cơ đơn giản như acid formic, acid butyric, propionic, acetic, methanol, ethanol, CO2, H2, CO. Để vi khuẩn methane phát triển bình thường, trong môi trường cần có đủ CO2 và các hợp chất chứa N. Nguồn N tốt nhất cho vi khuẩn methane là amon carbonate và amon clorua, đặc biệt vi khuẩn methan không sử dụng N trong acid amine. Để quá trình lên men tiến hành bình thường, lượng C và N trong môi trường phải đảm bảo tỷ lệ C/N=20:1

Bảng 5. 7 Sản phẩm tạo thành từ các nguồn chất hữu cơ

Sản phẩm phân hủy

Enzyme

Chất bị phân hủy

Hiếu khí

Kỵ khí

Protein

Protease

+, NO2

-, H2S, H2SO4,

-, NO3 NH4 rượu, acid hữu cơ, CO2, H2O

+, H2S Acid amine, NH4 methane, CO2, H2, rượu, acid hữu cơ, phenol, indol

Rượu, acid hữu cơ, CO2, H2O

CO2, H2, rượu, acid hữu cơ

Hydrate carbon

Amilase, Cellulase, Zima, dehydrogenase

Lipid

Lipase

Rượu, acid hữu cơ, CO2, H2O

CO2, H2, rượu, acid hữu cơ

148

5.2.2. Vai trò của vi sinh vật trong quá trình làm sạch nước thải

5.2.2.1. Hệ vi sinh vật trong nước thải

Phần lớn vi sinh vật xâm nhập vào môi trường nước là từ đất, các nguồn thải và từ bụi trong không khí. Số lượng và chủng loại vi sinh vật trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất hữu cơ hòa tan trong nước, chất độc, tia tử ngoại, pH môi trường, chất dinh dưỡng.

 Vi khuẩn (Bacteria)

Đây là nhóm sinh vật đơn bào, kích thước nhỏ, nhân chưa hoàn chỉnh. Vi khuẩn thường có dạng hình cầu, hình que, hình xoắn. Chúng sinh sản bằng cách phân đôi tế bào. Nếu các điều kiện về dinh dưỡng, oxi, pH và nhiệt độ môi trường thích hợp thì thời gian thế hệ là 15- 30 phút.

Vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy chất hữu cơ, làm sạch nước thải. Theo phương thức dinh dưỡng, vi khuẩn được chia thành 2 nhóm chính: vi khuẩn tự dưỡng và vi khuẩn dị dưỡng.

+ Vi khuẩn tự dưỡng: loại vi khuẩn này có khả năng oxi hóa chất vô cơ để thu năng lượng và sử dụng CO2 làm nguồn C cho quá trình sinh tổng hợp. Trong nhóm này gồm có nhóm vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn sắt, vi khuẩn lưu huỳnh...với các phản ứng oxi hóa như sau:

- + 4H+ + 2H2O + năng lượng - + năng lượng

- Ở Nitrosomonas: 2NH4

+ + O2 → 2NO2 - + O2 → 2NO3

- Ở Nitrobacter: 2NO2

- Vi khuẩn sắt oxi hóa Fe tan trong nước thành Fe không tan

tan + O2 → Fe3+

không tan + năng lượng

- Fe2+

- Vi khuẩn Leptothrix và Crenothrix làm kết tủa sắt thành Fe(OH)3

- Vi khuẩn lưu huỳnh có khả năng chịu được pH thấp, oxi hóa H2S thành acid sulfuric

(H2SO4) gây ăn mòn đường ống hay các công trình xây dựng ngập trong nước

+ Vi khuẩn dị dưỡng: là nhóm vi khuẩn sử dụng chất hữu cơ làm nguồn C dinh dưỡng và nguồn năng lượng để sinh trưởng, phát triển, xây dựng tế bào. Có 3 nhóm vi khuẩn dị dưỡng:

- Vi khuẩn hiếu khí (aerobe): cần O2 để sống như quá trình hô hấp ở động vật bậc cao. Quá

Tăng sinh khối

trình này thể hiện qua phản ứng:

Vi khuẩn hiếu khí

Chất hữu cơ + O2 CO2 + H2O + năng lượng

-, SO4

- Vi khuẩn kị khí (anaerobe): có thể sống và hoạt động ở điều kiện không cần O2 trong 2- để oxi hóa chất hữu cơ. Quá trình

không khí mà sử dụng O2 trong các hợp chất NO3 được thể hiện qua các phản ứng sau:

149

- → CO2 + N2 + năng lượng

Chất hữu cơ + NO3

2- → CO2 + H2S + năng lượng

Chất hữu cơ + SO4

Acid hữu cơ + CO2 + H2O + năng lượng

Chất hữu cơ

+ Vi khuẩn tùy nghi: loại này có thể sống trong điều kiện có hoặc không có O2 tự do. Chúng luôn có mặt trong nước thải. Năng lượng được giải phóng một phần sử dụng cho việc hình thành tế bào mới, một phần thoát ra ở dạng nhiệt.

CH4 + CO2 + năng lượng

 Virus và thực khuẩn thể

Virus là nhóm sinh vật có kích thước rất nhỏ, khoảng 20- 100nm chỉ có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi điện tử. Chúng là tác nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm ở người, động vật và thực vật. Virus không thể sống độc lập mà phải kí sinh trong tế bào vật chủ và ở đây chúng mới thể hiện đặc tính sống của mình.

Thực khuẩn thể là virus của vi khuẩn, chúng có khả năng làm tan các tế bào vi khuẩn rất nhanh. Thực khuẩn thể bám vào và làm tan một lỗ nhỏ trên vỏ tế bào vi khuẩn, phần acid nucleic của virus nhanh chóng xâm nhập vào nội bào. Quá trình hình thành thực khuẩn thể mới cũng tương tự như hình thành virus nhưng xảy ra nhanh hơn, có thể 15- 20 phút.

Trong nước thải thường có vi khuẩn gây bệnh cho người, động vật và kèm theo đó là

các nhóm thực khuẩn thể tương ứng với từng loại vi khuẩn.

 Nấm và các nhóm vi sinh vật khác

Trong nước thải, ngoài vi khuẩn còn có các nhóm vi sinh vật khác như nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. Các nhóm vi sinh vật này thường phát triển mạnh trong các vùng nước tù đọng. Chúng là những nhóm vi sinh vật dị dưỡng, hiếu khí. Nấm mốc có khả năng phân hủy chất hữu cơ như cellulose, hemicellulose, lignin. Nấm men có thể lên men được một số loại đường thành alcol, acid hữu cơ, glycerin trong điều kiện kị khí và phát triển tăng sinh khối trong điều kiện hiếu khí.

Một số chi nấm mốc thường gặp trong nước thải như Saprolegnia và Leptomitus. Trong đó, loài Leptomitus lacteus thường sống ở sông hồ, chúng phát triển thành khối nhầy cùng với vi khuẩn Sphaerotilus natans có thể bịt kín hoàn toàn song chắn rác làm cản trở dòng chảy hoặc bịt kín màng lọc, ảnh hưởng đến việc xử lý nước thải.

 Tảo (Algae)

150

Tảo là nhóm thực vật bậc thấp, cơ thể đơn bào, một số nhóm mọc nhánh dài; chưa phân hóa thành các bộ phận thân, rễ, lá. Đây là nhóm sinh vật tự dưỡng quang hợp, sống trôi nổi trong nước nên có thể gọi là thực vật phù du (phytoplankton) hoặc sống bám vào các giá thể (đất đá trong nước, thực vật thủy sinh).

- (bicarbonate) làm nguồn C, cùng với nguồn N, P vô cơ để cấu tạo tế bào dưới tác dụng của năng lượng ánh sáng mặt trời, thải ra O2. Quá trình quang hợp được thể hiện qua phản ứng sau:

Tảo sử dụng CO2 hoặc HCO3

3- + NH4

+ tế bào tảo mới + O2 Ánh sáng

CO2 + PO4

Trong nước giàu nguồn N, P là điều kiện tốt cho tảo phát triển. Nguồn CO2 có thể do vi sinh vật trong nước phân hủy các chất hữu cơ tạo thành, từ đó cung cấp cho tảo quang hợp hoặc có thể từ nguồn không khí.

Tảo phát triển mạnh làm cho nước có mùi khó chịu. Trong thủy vực còn xuất hiện một

số nhóm tảo độc, chúng phát triển có thể gây ảnh hưởng đến các nhóm thủy sinh vật khác.

 Động vật nguyên sinh (Protozoa)

Đây là nhóm động vật bậc thấp, sống trôi nổi trong nước, là nhóm sinh vật có khả năng chỉ thị cho nước vì sự có mặt của chúng cho thấy bùn hoạt tính thích ứng với cơ chất có trong nước, không có mặt của độc chất. Trùng bánh xe có thể chỉ thị cho hệ thống sinh học đặc biệt ổn định.

Động vật nguyên sinh sử dụng tảo, vi khuẩn hoặc vụn bã hữu cơ làm nguồn thức ăn, thậm chí chúng còn ăn lẫn nhau. Vì vậy, có thể sử dụng động vật nguyên sinh để loại bỏ một số nhóm vi khuẩn gây bệnh có trong nước thải. Trong xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học, động vật nguyên sinh có mặt trong bùn hoạt tính được xem là chỉ số quan trọng để đánh giá kết quả xử lý nước thải.

5.2.2.2. Hoạt động sống của vi sinh vật trong nước thải

Nước thải mới thường có ít vi sinh vật nhưng trong hệ thống thoát nước, chỉ một thời gian ngắn vi sinh vật có thể thích nghi, sinh sản và phát triển tăng sinh khối, trừ những loại nước thải có chứa chất độc, ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật như nước thải có hàm lượng kim loại nặng cao, các chất hữu cơ, chất vô cơ có độc tính. Sau một thời gian sinh trưởng, chúng tạo thành quần thể vi sinh vật có ở trong nước và kéo theo sự phát triển của hệ thủy sinh vật

Mỗi loại nước thải có hệ vi sinh vật thích ứng riêng, tuy nhiên chúng chủ yếu đều là nhóm vi sinh vật hoại sinh, dị dưỡng. Chúng phân hủy, chuyển hóa chất hữu cơ để xây dựng tế bào đồng thời phân hủy các hợp chất trong nước đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O hoặc tạo thành các loại khí khác như CH4, H2S, N2, indol, mercaptan, scatol...

151

Trong nước thải, các chất nhiễm bẩn chủ yếu là chất hữu cơ hòa tan hoặc các chất hữu cơ ở dạng keo và phân tán nhỏ ở dạng lơ lửng. Các dạng này tiếp xúc với bề mặt tế bào vi khuẩn bằng cách hấp phụ hay keo tụ sinh học sau đó thực hiện quá trình đồng hóa và dị hóa.

Như vậy quá trình làm sạch nước thải gồm 3 giai đoạn:

- Các hợp chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt tế bào vi sinh vật

- Khuếch tán và hấp thụ các chất ô nhiễm nước qua màng bán thấm vào trong tế bào vi sinh

vật

- Chuyển hóa các chất này trong nội bào để sinh ra năng lượng và tổng hợp các vật liệu mới

cho tế bào vi sinh vật

Các giai đoạn này có mối liên quan chặt chẽ với nhau và kết quả là nồng độ các chất nhiễm bẩn trong nước giảm dần. Phân hủy các chất hữu cơ chủ yếu xảy ra trong tế bào vi sinh vật.

Cơ chế của quá trình phân hủy các chất trong tế bào vi sinh vật được tóm tắt như sau:

 Hợp chất bị oxi hóa đầu tiên là hydratcarbon và một số chất hữu cơ khác.

• Nếu là tinh bột hấp phụ trên bề mặt tế bào vi sinh vật theo cơ chế cảm ứng, tế bào vi

sinh vật sẽ tiết ra hệ enzyme amilase để thủy phân tinh bột thành đường.

+.

• Đối với protein, vi sinh vật sẽ tiết ra hệ enzyme protease xúc tác, phân hủy thành

polypeptide, peptone, acid amine và cuối cùng là NH4

• Đối với chất béo, sẽ có hệ enzyme lipase phân hủy thành acid béo, glycerine

• Đối với các sản phẩm là đường, rượu và một số chất hữu cơ bị oxi hóa trong tế bào nhờ

hệ enzyme oxi hóa- khử dehydrogenase.

 Đường, rượu và một số chất hữu cơ khác là sản phẩm đặc trưng của quá trình oxi hóa nhờ vi sinh vật hiếu khí. Các chất này khi phân hủy sẽ tạo thành CO2 và H2O. Quá trình oxi hóa khử hay quá trình hô hấp hiếu khí trong tế bào vi sinh vật chính là chu trình Kreb.

Trong quá trình phân hủy hay quá trình oxi hóa khử, không phải tất cả cơ chất đều bị oxi hóa hoàn toàn đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O, một số sản phẩm trung gian của quá trình này tham gia vào quá trình đồng hóa hay quá trình tổng hợp vật chất để xây dựng tế bào mới cho quá trình sinh trưởng; đồng thời trong tế bào còn xảy ra quá trình dị hóa (tự oxi hóa) các vật liệu tế bào khi đã già để tạo ra vật liệu và năng lượng cho quá trình đồng hóa. Như vậy, quá trình chuyển hóa vật chất trong tế bào vi sinh vật gồm hàng loạt các phản ứng hóa sinh với hai quá trình dị hóa và đồng hóa.

152

5.3. Các phương pháp sinh học xử lý nước thải

5.3.1. Xử lý nước thải bằng bể hiếu khí (Aerotank)

5.3.1.1. Đặc điểm và nguyên tắc hoạt động

- Vi sinh vật hiếu khí phân hủy các chất hữu cơ trong điều kiện có oxy hòa tan

+ cũng bị loại nhờ quá trình nitrate hóa của

Chất hữu cơ + O2 H2O + CO2 + NH3 vi sinh v(cid:0)t

- Ở điều kiện hiếu khí (DO >1,5 – 2,0 mg/l), NH4

vi sinh v(cid:0)t

vi sinh vật tự dưỡng.

+ + 2O2 NO3

- + 2H+ + H2O + Q

NH4

Quá trình xử lý hiếu khí kinh điển còn gọi là quá trình bùn hoạt tính, được minh họa qua

sơ đồ sau:

Hình 5. 2 Sơ đồ quá trình bùn hoạt tính

Thành phần hệ thống xử lý hiếu khí kinh điển gồm có:

+ Bể thổi khí (Aerotank)

Nước thải sau khi đã được xử lí sơ bộ còn chứa phần lớn các chất hữu cơ ở dạng hòa tan

cùng các chất lơ lửng đi vào bể Aerotank.

Bể aerotank là công trình bê tông cốt thép hình khối chữ nhật hoặc hình tròn. Quá trình oxi hóa hiếu khí các hợp chất hữu cơ được thực hiện trong bể này. Nước thải được đưa vào trộn lẫn với bùn tuần hoàn tạo thành dung dịch hỗn hợp, chứa khoảng 1500- 2500mg/l chất rắn lơ lửng. Nước thải chảy qua suốt chiều dài của bể và được sục khí, khuấy đảo nhằm tăng cường lượng oxy hòa tan và tăng cường quá trình oxy hóa chất bẩn hữu cơ có trong nước.

153

Một đặc tính quan trọng của bùn hoạt tính là sinh ra một lượng sinh khối lớn. Tuổi bùn cao hơn nhiều so với thời gian lưu nước nên giúp cho việc duy trì một lượng lớn vi sinh vật oxi hóa có hiệu quả các hợp chất hữu cơ trong thời gian tương đối ngắn. Thời gian lưu nước thải trong bể thổi khí thay đổi 4-8 giờ.

Trong bể Aerotank quá trình oxi hóa các chất bẩn hữu cơ trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1 : tốc độ oxi hóa bằng tốc độ tiêu thụ oxi. Bùn hoạt tính hình thành và phát

triển

Giai đoạn 2 : Vi sinh vật phát triển ổn định và tốc độ tiêu thụ oxi ít thay đổi. Giai đoạn này các chất bẩn hữu cơ bị phân hủy nhiều nhất. Hoạt tính enzyme của bùn hoạt tính cũng đạt tới mức cực đại và kéo dài trong thời gian tiếp theo

Giai đoạn 3 : giai đoạn nitrate hóa các muối amon

Hình 5. 3 Nguyên lý hoạt động của bể Aerotank

+ Bể lắng

Là bể được dùng để lắng những bông cặn bùn (vi sinh vật) được tạo thành trong giai đoạn oxi hóa ở bể thổi khí (Aerotank). Một phần bùn trong bể này được tuần hoàn trở lại bể thổi khí và phần còn lại được thải ra ngoài để duy trì tỷ số thức ăn/vi sinh vật (F/M) đúng mức.

5.3.1.2. Quá trình hình thành bùn hoạt tính

Mục đích của quá trình bùn hoạt tính là (1) oxi hóa chất hữu cơ có thể phân hủy trong bể thổi khí tức là chất hữu cơ hòa tan được chuyển thành sinh khối tế bào và (2) kết bông, tức là tách sinh khối tế bào mới được tạo thành ra khỏi nước thải

Bùn hoạt tính được hình thành bằng cách thổi khí vào nước thải với sự có mặt của vi sinh vật cho đến khi vi sinh vật ổn định chất hữu cơ. Bông bùn được tạo thành không chỉ do vi khuẩn tạo bông mà còn do một hiện tượng liên quan đến mức năng lượng của chúng.

154

Bùn hoạt tính có thể được tạo thành từ nước thải có thành phần huyền phù cao như nước thải sinh hoạt cho đến nước thải chứa nhiều hóa chất tổng hợp như nước thải công nghiệp. Sự hình thành bùn hoạt tính xảy ra khi nước thải có đủ các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu không đủ người ta có thể bổ sung nguồn vi sinh vật từ đất ô nhiễm, bùn cống rãnh...

Khi bắt đầu thổi khí, tỷ số F/M rất cao, vi sinh vật có thừa nguồn thức ăn và chúng tăng trưởng theo pha log. Khi vi khuẩn bắt đầu tăng trưởng, protozoa cũng bắt đầu tăng trưởng theo. Trong pha log, các chất hữu cơ trong nước thải sẽ được loại bỏ với tốc độ tối đa hay nói cách khác là chất hữu cơ được chuyển hóa thành sinh khối tế bào ở mức cao nhất. Mức năng lượng trong hệ thống đủ lớn để giữ cho tất cả vi sinh vật lơ lửng trong hỗn dịch. Như vậy, bông bùn hoạt tính không thể được tạo thành khi vi sinh vật đang tăng trưởng ở pha log.

Sau khi vi sinh vật tiêu thụ quá nhiều thức ăn để tạo sinh khối mới, tỷ số F/M sẽ giảm nhanh. Lúc này vi sinh vật bắt đầu tăng trưởng chậm lại, một số tế bào bắt đầu chết đi và bông bùn bắt đầu được hình thành. Khi vi sinh vật có đầy đủ năng lượng chúng nhanh chóng phân chia hay tồn tại riêng lẻ để duy trì hoạt động trao đổi chất bình thường. Khi năng lượng trong hệ thống giảm dần, lượng vi sinh vật không có đủ năng lượng để vượt qua lực hấp dẫn giữa chúng tăng lên và chúng bắt đầu kết cụm lại và theo cách đó bông bùn nhỏ được hình thành.

Tỷ số F/M tiếp tục giảm, vi sinh vật kết thúc pha ổn định. Khi bắt đầu vào pha trao đổi chất nội bào, tỷ số F/M sẽ duy trì không đổi trong pha này. Ở pha trao đổi chất nội bào, hệ thống rất ổn định, một lượng rất nhỏ chất dinh dưỡng được trao đổi chất và vi sinh vật chỉ cần rất ít năng lượng để duy trì hoạt động sống. Dần dần vi sinh vật không còn đủ năng lượng để lấy thức ăn xung quanh và chúng bắt đầu sử dụng chất dinh dưỡng được dự trữ trong tế bào. Ở giai đoạn này bông bùn được hình thành rất nhanh. Số lượng vi khuẩn giảm, protozoa dạng bơi tự do bắt đầu chết vì không có vi khuẩn làm nguồn thức ăn, lúc này rotifer chiếm ưu thế vì chúng ăn những bông bùn nhỏ. Hệ thống bùn hoạt tính không nên duy trì quá lâu đến mức tất cả các dạng sinh học đều chết (khoảng vài tháng).

Thông thường, khi pha trao đổi chất nội bào bắt đầu, các bông bùn nhỏ được tạo thành và được tách ra khỏi nước thải. Một lượng bông bùn đậm đặc được cho vào bể xử lý sẽ làm cho tỷ số F/M trong bể giảm đi và vi khuẩn sẽ nhanh chóng tăng trưởng. Duy trì việc thổi khí liên tục để hệ thống luôn có một lượng nhỏ vi sinh vật ở pha trao đổi chất nội bào ở mỗi chu kỳ. Như vậy sẽ thu được kết quả bùn kết cụm tốt hơn, nước sau khi xử lý được trong hơn.

Tóm lại, tốc độ loại bỏ chất hữu cơ nhanh nhất ở pha log, trong khi tốc độ tạo bông bùn

tốt nhất ở pha trao đổi chất nội bào.

155

5.3.1.3. Các nhóm vi sinh vật có trong bùn hoạt tính

Trong bùn hoạt tính chứa tế bào vi sinh vật và các chất hữu cơ, vô cơ. Bông bùn có kích thước thay đổi trong khoảng 1- 1000m. Những tế bào còn sống trong bông bùn được đo bởi hoạt tính ATP và dehydrogenase chiếm khoảng 5- 20% tổng số tế bào.

+ Vi khuẩn

Là nhóm vi sinh vật chiếm chủ yếu trong bùn hoạt tính với hơn 300 chủng. Vi khuẩn hoạt động thực hiện quá trình oxi hóa chất hữu cơ và để chuyển hóa chất dinh dưỡng tạo thành polysaccharide và các polymer khác giúp cho việc tạo bông của sinh khối vi sinh vật. Một số giống vi khuẩn thường gặp: Zooglea, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Achromobacter, Corynebacterium, Comomonas, Brevibacterium, Acinetobacterium. Một số nhóm vi khuẩn dạng sợi có bao như Sphaerotilus hay vi khuẩn trượt như Beggiatoa, Vitreoscilla thường gặp trong sự cố bung bùn.

Khi nồng độ O2 trong bông bùn bị giới hạn, số lượng vi khuẩn hiếu khí giảm khi kích thước bông bùn tăng. Phần bên trong của bông bùn tương đối lớn tạo điều kiện thuận lợi cho nhóm vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt như vi khuẩn tạo methane phát triển. Theo tiêu chuẩn, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong bùn hoạt tính đạt > 108 CFU/mg bùn.

Zooglea là nhóm vi khuẩn có khả năng tạo polysaccharide ngoại bào, có hình dạng phân nhánh như hình ngón tay, thường có mặt nhiều trong nước thải giàu chất hữu cơ. Chúng được phân lập bằng cách sử dụng môi trường giàu m- butanol, tinh bột hay m- toluate làm nguồn C. Chúng được tìm thấy ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình xử lý nước thải và chiếm khoảng 0,1- 1% tổng số vi khuẩn trong hỗn dịch.

Ngoài ra, trong bông bùn hoạt tính còn có vi khuẩn tự dưỡng như vi khuẩn nitrate hóa,

vi khuẩn quang dưỡng như vi khuẩn tím không sulfur.

156

Hình 5. 4 Một số Vi khuẩn dạng sợi trong bùn hoạt tính

+ Vi nấm

- Nấm thường phát triển trong điều kiện pH thấp, có độc tính và

thiếu N nên ít xuất hiện trong bùn hoạt tính

- Các chi nấm thường gặp trong bùn hoạt tính: Pencillium,

Geotrichum, Alternaria, Cephalosporium

- Hiện tượng bung bùn có thể do tăng sinh nhiều của Geotrichum

candidum, pH thấp nước thải acid

+ Protozoa

- Protozoa là vi sinh vật chủ yếu ăn vi khuẩn

- Động vật nguyên sinh giữ cân bằng cho quần thể

VSV trong bùn

- Việc săn bắt vi khuẩn của protozoa có thể bị ảnh

hưởng đáng kể nếu tồn tại độc chất

5.3.1.4. Một số cải tiến của quá trình bùn hoạt tính

 Hệ thống thông khí kéo dài

Quá trình này được ứng dụng trong các nhà máy xử lý lắp sẵn với các đặc điểm:

Thời gian thông khí kéo dài (khoảng 30 giờ) so với hệ thống kinh điển, tuổi bùn cũng

kéo dài hơn và có thể kéo dài hơn 15 ngày

Hệ thống hoạt động ở tỷ số thức ăn/vi sinh vật (F/M) thấp hơn, khoảng <0,1 lb

BOD/ngày/lb MLSS

Hệ thống ít cần thông khí hơn hệ thống kinh điển, chủ yếu thích hợp cho các cộng đồng

nhỏ sử dụng hệ thống xử lý lắp sẵn

 Mương oxi hóa

157

Là dạng bể aerotank được cải tiến khuấy trộn hoàn chỉnh trong điều kiện hiếu khí kéo dài, nước chuyển động tuần hoàn trong mương.

Gồm một kênh hình bầu dục với một hay nhiều cánh quạt để thông khí nước thải. Kênh này nhận nước thải đã được sàng lọc và có thời gian lưu nước khoảng 24 giờ.

Ưu điểm :

+ Hiệu quả xử lý BOD, N, P cao.

+ Quản lý vận hành đơn giản.

+ Ít bị ảnh hưởng bởi sự dao động lớn về chất lượng và lưu lượng.

Nhược điểm: Đòi hỏi diện tích xây dựng lớn; thời gian lưu nước dài; Lượng O2 cung cấp

cho mương lớn.

 Thông khí từng bước

Nước thải sơ cấp đi vào bể thổi khí qua một số vị trí cho phép cải thiện sự phân bố trong

hồ và cho phép sử dụng oxi hiệu quả hơn. Nó làm tăng khả năng xử lý của hệ thống.

 Hệ thống thông khí trộn lẫn hoàn toàn

Hệ thống này cho phép việc thông khí đồng nhất nước thải trong bể thổi khí và có thể

chịu đựng được shock và tải lượng độc

 Bùn hoạt tính tốc độ cao

Hệ thống này được sử dụng để xử lý nước thải có hàm lượng BOD cao, có thời gian lưu

nước ngắn.

5.3.2. Xử lý nước thải bằng màng lọc sinh học

Thiết bị lọc sinh học là thiết bị được bố trí đệm và cơ cấu phân phối nước cũng như

không khí.

- Trong thiết bị lọc sinh học, nước thải được lọc qua lớp vật liệu bao phủ bởi lớp màng

vi sinh vật theo cơ chế dính bám

- Vật liệu đệm là vật liệu có độ xốp cao, khối lượng riêng nhỏ và diện tích bề mặt lớn

(sỏi, đá, sơ dừa…)

158

Hình 5. 5 Màng lọc sinh học MBR

Hình 5. 6 Bể lọc sinh học nhỏ giọt

159

Hình 5. 7 Đĩa quay sinh học (Rotating biological contactors)

Đĩa quay sinh học

Gồm hàng loạt đĩa tròn, phẳng được làm bằng PVC (poly vynil clorit) hoặc PS (poly styren), lắp trên một trục. Các đĩa này được đặt ngập vào nước một phần và quay chậm khi làm việc. Xử lý nước thải bằng kỹ thuật màng sinh học dựa trên sự sinh trưởng gắn kết của vi sinh vật trên bề mặt của các vật liệu đĩa.

5.3.3. Xử lý nước thải bằng hồ sinh học

Hồ sinh học là các thủy vực tự nhiên hoặc nhân tạo mà tại đó xảy ra quá trình xử lý các chất ô nhiễm với vai trò chủ yếu của các nhóm sinh vật. Người ta dùng hồ sinh học như là cách xử lý bậc hai cho nước thải.

5.3.3.1. Hồ tùy tiện

Là loại hồ phổ biến để xử lý nước thải sinh hoạt. Trong hồ xảy ra cả hai quá trình hiếu khí và kỵ khí. Chiều sâu của hồ khoảng 1- 2,5m được phân thành ba lớp: lớp trên cùng thoáng khí; lớp giữa là tầng tùy tiện và lớp dưới cùng kỵ khí. Thời gian lưu thay đổi 5- 30 ngày.

- Ưu điểm của hồ: Chi phí ban đầu thấp, dễ vận hành.

- Nhược điểm: Có mùi do sự tăng trưởng của tảo, sự phát triển của muỗi gây ra các vấn

đề về sức khoẻ.

Sinh học của hồ tùy tiện

Xử lý chất thải trong hồ sinh học là quá trình sinh học tự nhiên được thực hiện chủ yếu bởi tảo và vi khuẩn. Trong đó, Vi sinh vật gồm 3 nhóm hiếu khí, kỵ khí và tùy tiện đều có mặt trong hồ. Loại hồ này cho phép tích tụ các chất bùn lắng được phân hủy kỵ khí ở đáy hồ. Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình như tảo, vi khuẩn dị dưỡng, động vật nguyên sinh…

Hoạt động của vùng quang hợp

Trong vùng quang hợp sẽ có các loại tảo thực hiện quá trình quang hợp, với các chi thường gặp như Chlamydomonas, Euglena, Chlorella, Scenedesmus, Microactinium, Oscillatoria và Microcystis

Quá trình quang hợp của tảo phụ thuộc vào nhiệt độ và ánh sáng. Sự khuấy trộn có ý nghĩa quan trọng trong việc duy trì điều kiện hiếu khí của hồ, cung cấp sự trao đổi giữa chất

160

dinh dưỡng và không khí của các nhóm sinh vật quang dưỡng và dị dưỡng. Sự trao đổi này ngăn không cho hồ bị phân tầng vì sự phân tầng xảy ra sẽ làm chênh lệch nhiệt độ giữa các tầng: ấm ở tầng mặt và càng xuống đáy càng lạnh.

Tảo liên quan đến sự tiêu thụ chất dinh dưỡng, đặc biệt là N và P. Một số loại tảo có khả năng cố định N như tảo lam, trong khi các nhóm tảo khác sử dụng amoni hay nitrate. Quá trình quang hợp làm tăng pH, đặc biệt đối với nước thải có độ kiềm thấp, giúp tăng khả năng +. Ngoài ra, sự loại bỏ các chất dinh dưỡng. Ở pH cao, P kết tủa thành Ca3(PO4)2 và ion NH4 quang hợp tạo ra O2 cung cấp cho các nhóm thủy sinh vật hô hấp.

Hoạt động dị dưỡng

Các nhóm vi sinh vật tham gia gồm Vi khuẩn dị dưỡng, nấm và động vật nguyên sinh. Quá trình dị dưỡng sinh ra CO2 và chất vi dinh dưỡng cho sự tăng trưởng của tảo; ngược lại tảo cung cấp O2 cho quá trình dị dưỡng.

Các tế bào vi khuẩn và tảo chết, cũng như các vật chất khác tích tụ dưới đáy hồ sẽ được các vi sinh phân hủy kỵ khí. Hoạt động này sinh ra khí CH4, H2S, CO2, N2. Trong đó, H2S là nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi khuẩn lưu huỳnh màu tía như Chromatium, Thiocapsa, Thiopedia.

Mặc dù C một phần bị mất vào không khí dưới dạng CO2 và CH4 nhưng phần lớn C vẫn

được chuyển thành sinh khối.

Hoạt động của zooplankton

Zooplankton ăn tảo và vi khuẩn. Chúng giữ vai trò quan trọng trong kiểm soát số lượng

quần thể này, có ích trong việc làm giảm độ đục của nước thải sau xử lý.

5.3.3.2. Các loại hồ sinh học khác

 Hồ hiếu khí (aeroboc ponds).

Có độ sâu 0,3- 0,5m. Thường được xáo trộn để tăng lượng ánh sáng mặt trời cho tảo và

sinh ra oxy. Thời gian lưu từ 5 – 7 ngày. Thường là hồ nhân tạo

 Hồ thoáng khí (aerated lagoons).

Chiều sâu 2-6 m. Thời gian lưu nước ít hơn 10 ngày. Dùng để xử lý nước thải ô nhiễm nặng. Vận hành bằng cách phân phối khí và khấy trộn liên tục. Xử lý được 85% BOD ở 25oC với thời gian 5 ngày. Có thể gây mùi nếu vận hành sai. Thường là hồ nhân tạo.

 Hồ kỵ khí (anaerobic ponds)

161

Chiều sâu 2,5- 9m. Thời gian lưu 20-50 ngày. Xử lý nước thải có hàm lượng BOD cao, nhiều protein, nhiều chất béo và hàm lượng SS cao. Không cần khuấy trộn, sinh ra mùi hôi. Thường là hồ nhân tạo, bán nhân tạo.

 Hồ bậc ba (maturation hay tertiary ponds).

Chiều sâu 1-2 m. Xử lý nước thải của bể bùn hoạt tính hoặc bể lọc sinh học. Thời gian lưu 20 ngày. Xáo trộn dể cung cấp oxy cho tảo quang hợp và quá trình nitrat hóa. Vai trò loại bỏ hơn nửa BOD, SS, P, N và các vsv gây bệnh.

5.3.4. Xử lý nước thải bằng phương pháp lên men kỵ khí

Là quá trình vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ thành khí CH4, CO2, H2, N2. Quá trình này cũng có thể gọi là quá trình lên men metan và quần thể vi sinh vật được gọi tên chung là vi sinh vật metan.

Sự tạo thành methane là quá trình thông thường trong các môi trường tự nhiên khác nhau. Từ lâu, người ta đã áp dụng quá trình kỵ khí để ổn định bùn trong các công trình xử lý nước thải, đặc biệt là nước thải công nghiệp. Quá trình xử lý kỵ khí có những ưu điểm so với quá trình xử lý hiếu khí:

- Sử dụng CO2 làm chất nhận điện tử, không cần O2 nên có thể giảm chi phí xử lý nước thải.

- Sử dụng bùn ít hơn 3-20 lần so với quá trình hiếu khí.

- Sinh ra khí có ích là metan, giúp giảm thiểu BOD trong bùn đã phân hủy.

- Nhu cầu năng lượng cho quá trình được giảm thiểu

- Thích hợp cho các loại nước thải ô nhiễm nặng.

- Bể phản ứng kỵ khí có thể hoạt động ở chế độ tải trọng cao.

- Có thể phân hủy sinh học các hợp chất tổng hợp như hydrocarbon béo có chlor như

trichloroethylen, trihalometan và một số hợp chất thiên nhiên khó phân hủy như lignin

Bên cạnh đó vẫn tồn tại một số nhược điểm:

- Diễn ra chậm hơn

- Nhạy cảm hơn trong việc phân hủy các chất độc

- Quá trình khởi động cần nhiều thời gian hơn

- Đòi hỏi nồng độ cơ chất ban đầu tương đối cao

162

5.3.4.1. Quá trình sinh học kỵ khí

Phản ứng chung của quá trình:

Chất hữu cơ → CH4 + CO2 + H2 + NH3 + H2S

Giai đoạn thủy phân

Với sự tham gia của vi khuẩn thủy phân, phân hủy các phân tử hữu cơ phức tạp (protein, cenllulose, lignin, lipids) thành những đơn phân tử hòa tan như acid amin, acid béo, glucose, glycerol…Các đơn phân tử này sau khi phân hủy sẽ được nhóm vi khuẩn thứ hai trực tiếp sử dụng ngay. Quá trình thủy phân được xúc tác bởi các enzyme ngoại bào như cellulase, protease, và lipase. Tuy nhiên, quá trình thủy phân xảy ra tương đối chậm và có thể giới hạn khả năng phân hủy kỵ khí của một số chất thải có chứa lignin.

Giai đoạn acid hóa

Với sự tham gia của vi khuẩn lên men acid thực hiện chuyển hóa đường, acid amin, acid béo thành acid hữu cơ như acetic, formic, lactic, butyric, succinic hay alcol, keton như ethanol, methanol, glycerol, aceton, acetate và CO2, H2...Các sản phẩm tạo thành khác nhau tùy theo loại vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, PH, thế oxy hóa khử)

Giai đoạn acetate hóa

Vi khuẩn acetic chuyển hóa các acid béo và alcol thành acetate, hydrogen, CO2 mà chúng sẽ được vi khuẩn metan sử dụng tiếp theo. Dưới áp suất riêng phần của H2 khá cao, sự tạo thành acetate sẽ giảm và cơ chất được chuyển hóa thành acid propionic, butyric và ethanol hơn là tạo thành methane. Vì vậy, có sự cộng sinh giữa vi khuẩn acetogenic với vi khuẩn methane để vi khuẩn methane giúp đạt được thế H thấp mà vi khuẩn acetogenic cần.

Ethanol, acid propionic và butyric được chuyển hóa thành acid acetic bởi nhóm vi khuẩn

acetogenic theo phương trình sau:

CH3CH2OH + CO2 → CH3COOH + 2H2

CH3CH2COOH + 2H2O → CH3COOH + CO2 + 2H2

CH3CH2CH2COOH + 2H2O → 2CH3COOH + 2H2

Giai đoạn metan hóa

163

Vi khuẩn methane bao gồm Gr (-) và Gr (+) thương tăng trưởng chậm trong nước thải và thời gian thế hệ thay đổi từ 3 ngày ở 35oC đến 50 ngày ở 10oC. Chúng được chia thành 2 nhóm phụ:

+ Nhóm vi khuẩn metan hydrogenotrophic sử dụng H2 hoá tự dưỡng: Chuyển hoá H2 và

CO2 thành metan.

CO2 + 4H2  CH4 + 2H2O

+ Nhóm vi khuẩn metan acetotrophic: còn gọi là vi khuẩn phân giải acetate, chuyển

acetate thành metan và CO2

CH3COOH  CH4 + CO2

5.3.4.2. Các yếu tố kiểm soát quá trình kỵ khí

- Nhiệt độ tối ưu: 30–350C cho VK Mesophilic.

- Thời gian lưu (HTR): Tuỳ theo loại nước thải và điều kiện môi trường nhưng phải đủ lâu

để cho phép các hoạt động trao đổi chất kỵ khí xảy ra.

Ví dụ: Bể kỵ khí tăng trưởng lơ lửng: 10-60 ngày; Bể kỵ khí tăng trưởng dính bám: 1-10 ngày

- pH: Vi khuẩn metan hoạt động ở pH 6,7- 7,4, tối ưu khi pH=7,0-7,2

- Cạnh tranh giữa vi khuẩn methane và vi khuẩn khử sulfate ở tỷ số COD/SO4 1,7 – 2,7

- Các yếu tố gây độc: O2, NH3, Formaldehyd, kim loại nặng, acid bay hơi, hợp chất vòng

benzen…

5.3.4.3. Một số phương pháp xử lý kỵ khí nước thải

Bể tự hoại

Đây là loại bể được dùng từ xưa và phổ biến nhất trong các kiểu xử lý kỵ khí. Một bể tự

hoại gồm bể phản ứng và vùng thấm

Nguyên tắc hoạt động của bể phản ứng: sau khi có sự phân chia phần chất lỏng và chất rắn từ đầu vào thì trong bể sẽ diễn ra quá trình phân hủy các chất thải hữu cơ trong điều kiện kỵ khí. Bể phản ứng được làm bằng betong, kim loại hoặc sợi thủy tinh, được thiết kế nhằm loại bỏ phần rắn của nước thải để không làm tắc nghẽn vùng thấm.

164

Nước thải sẽ trải qua quá trình phân hủy kỵ khí, tạo thành bùn gọi là bùn tự hoại và một lớp váng các chất rắn nhẹ, chất béo. Thời gian lưu của nước thải trong bể tự hoại 24- 72 giờ. Bể tự hoại tạo thành rất ít bùn, lượng bùn này thường được chế biến làm phân bón hoặc được đưa vào xử lý chung với nước thải.

Bể tự hoại cần được kiểm tra định kỳ và làm sạch 3-5 năm để loại bỏ lớp bùn tự hoại tích tụ trong đó. Bể tự hoại có tác dụng diệt một phần vi sinh gây bệnh nhưng virus có thể vẫn còn và có thể di chuyển vào nước ngầm. Hình 5. 8 Mô hình bể tự hoại

Hoạt động của vùng thấm: nước thải ra của bể tự hoại sẽ được đưa vào vùng thấm thông qua hệ thống ống mà xung quanh có sỏi, đá. Hiệu quả hoạt động của vùng thấm chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như đặc trưng của nước thải, tải trọng của nước thải, địa chất và đặc trưng của đất.

Bể tự hoại là nguồn gây ô nhiễm chủ yếu nguồn nước ngầm bởi các nhóm vi sinh vật gây bệnh và virus đường ruột khác nhau. Giếng nước uống phải cách xa bể tự hoại một khoảng nhất định để không ảnh hưởng bởi các nhóm vi sinh vật gây bệnh này.

Bể UASB

Bể UASB (Up-ward-flow Anaerobic Sludge Blanket) là một dạng bể phân hủy bao gồm đáy có lớp bùn nén chặt, một lớp bùn và lớp chất lỏng phía trên. Nước thải đi vào bể theo kiểu từ dưới lên xuyên qua lớp bùn này được bao phủ bởi bông bùn vi khuẩn hoạt tính. Một màng lắng phân chia bông bùn và nước đã xử lý và khí được thu ở phần trên của bể.

Quá trình này sinh ra hạt bùn lắng ở dưới. Vi sinh vật kết cụm có tính lắng cao sẽ làm cho bùn trở nên bất động, tăng trưởng tạo thành các hạt tách biệt có kích thước 1- 5mm với hàm VSS cao và có trọng lực riêng.

165

Hình 5. 9 Mô hình bể UASB

Lý thuyết “spaghetti” trong tạo bùn hạt

Theo thuyết này, vi sinh vật dạng sợi đan xen vào nhau tạo ra một viên nấm. Vi khuẩn methane (Methanosaete) thích nghi với nồng độ cơ chất thấp trở thành vi khuẩn dạng sợi. Những hạt bùn ban đầu (còn gọi là viên spaghetti) của Methanosaeten có thể lôi kéo các nhóm vi sinh vật khác tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí.

Cấu trúc của một bùn hạt gồm 3 lớp: lớp trong cùng gồm nhóm vi khuẩn Methanothrix, các tế bào này được xem như là trung tâm hình thành hạt; lớp giữa gồm vi khuẩn hình que như vi khuẩn acetone sinh H2 và vi khuẩn tiêu thụ H2; lớp ngoài cùng gồm hỗn hợp vi khuẩn lên men và sinh H2 có dạng hình que, hình cầu, hình sợi.

Như vậy, một hạt bùn là nơi tập hợp nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau cần thiết để chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành methane. Thành phần các nhóm vi khuẩn trong hạt bùn phụ thuộc vào từng loại cơ chất. Quá trình tạo bùn hạt thường chịu ảnh hưởng của các yếu tố như đặc trưng của nước thải, điều kiện vận hành, nhiệt độ, pH, chất dinh dưỡng.

166

CHƯƠNG 6. CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ RÁC THẢI

6.1. Phân loại và thành phần rác thải

Các loại rác thải, phế thải nông- công nghiệp thường đồng nhất về thành phần vì nguồn nguyên liệu đầu vào tương đối thuần nhất. Rác thải đô thị (chủ yếu là rác thải sinh hoạt) thường không kiểm soát được các nguồn nguyên liệu ban đầu do đó không đồng nhất về thành phần và thay đổi hàng ngày. Rác thải đô thị phụ thuộc vào mức độ hoạt động của con người ở các khu dân cư, khu du lịch, khu vui chơi giải trí…và hệ thống cơ sở hạ tầng của đô thị.

Rác thải đô thị được phân thành 4 loại:

+ Rác thải sinh hoạt (kể cả khu thương mại, trường học, du lịch, dịch vụ…)

+ Rác thải, phế thải khu chế biến nhỏ, làng nghề

+ Rác thải, phế thải công nghiệp

+ Rác thải bệnh viện

Rác thải, phế thải tùy thuộc vào từng ngành mới có thể đưa vào xử lý cùng với rác thải sinh hoạt. Ví dụ như các loại phế thải của công nghiệp chế biến sữa, thịt, rau quả và thực phẩm khác…có thể xử lý chung với rác thải đô thị.

Khác với các nước phát triển, thành phần rác thải đô thị ở nước ta chủ yếu là chất thải

hữu cơ

Bảng 6. 1Thành phần các nguyên tố trong một số loại rác thải

Thành phần các nguyên tố (%)

Loại rác thải

C H O N S Tro

Thực phẩm 48,0 6,4 37,6 2,6 0,4 5,0

Giấy vụn 43,5 6,0 44,0 0,3 0,2 6,0

Bìa cacton 44,0 5,9 44,6 0,3 0,2 5,0

Chất dẻo 60,0 7,2 22,8 0 0 10,0

Vải 55,0 6,6 31,2 1,6 0,15 0

Cao su 78,0 10,0 0 2 0 10,0

Da 60,0 8,0 11,6 10 0,4 10,0

167

Rác vườn 47,8 6,0 38,0 3,4 0,3 4,5

Gỗ vụn 49,5 6,0 64,27 0,2 0,1 1,5

Do tỷ lệ các chất hữu cơ cao trong rác thải đô thị nên vấn đề xử lý rác thải để thu thập được một loại mùn hữu cơ chế biến thành phân bón là điều quan tâm đặc biệt và rất cần thiết.

Trong thành phần hữu cơ được quan tâm nhiều nhất là các xác, mảnh cơ thể của các loài động vật và thực vật, các loại thực phẩm, lương thực dư thừa do con người thải ra. Trong các hợp chất hữu cơ ở đây được vi sinh vật phân hủy là cacbohydrat, protein, lipit... nhưng cũng có một số bộ phận trong cơ thể sinh vật khó bị phân hủy hoặc không bị phân hủy (như lignin trong thực vật, sừng, móng, tóc, vỏ chai, vỏ sò ốc, kitin... của động vật).

Để có thể xử lý rác được tốt cần phải phân loại và loại bỏ các chất không bị phân hủy có trong rác. Thành phần rác thải sinh hoạt của các thành phố là không giống nhau và khả năng phân giải sinh học của các thành phần trong đó cũng khác nhau. Ta lấy một ví dụ:

Ở Mỹ có nền kinh tế phát triển và cũng thải ra nhiều rác nhất thế giới. Hằng năm, rác thải sinh hoạt ở các thành phố ở Mỹ tới trên 200 triệu tấn. Tính bình quân một người dân Mỹ thải ra 2kg rác/ngày. Thành phần của rác ở Mỹ là như sau: giấy các loại chiếm 38% (tỉ lệ cao nhất); chất dẻo, đồ nhựa 9,4%; kim loại các loại 7,7%; thủy tinh, đồ gốm 5,9%; nguyên liệu đồ gỗ 5,2%; rau cỏ, thảm cỏ 13,4%; thực phẩm 10,4%. Như vậy, trong rác thải sinh hoạt có các loại có thể xử lý qua phân loại để tái sinh sử dụng được, có loại khó hoặc không bị phân giải như kim loại, thủy tinh, đồ gốm sứ và các loại vi sinh vật phân giải được.

Bảng sau đây cho ta biết các chất có trong các cơ thể có thể bị phân giải bởi vi sinh vật.

Bảng 6. 2 Phân loại thành phần rác thải theo khả năng phân giải sinh học

(Loub, 1975)

Stt Phân giải sinh học các chất trong thành phần rác thải Mức độ (%)

17- 68 1

Chất dễ bị phân hủy sinh học: chất thải thực phẩm, rau cỏ, thảm cỏ, rơm rạ, thực phẩm tươi sống, bánh mì, vải từ tơ sợi tự nhiên, day, gai, giấy các loại, chất dẻo…

8- 48 2 Các chất khó hoặc không bị phân hủy sinh học: gỗ, hàng dệt sợi tổng hợp, chất dẻo các loại, nhựa tổng hợp có thể bị vsv phân hủy,

3- 22 3 Chất không có khả năng bị phân hủy: kim loại, thủy tinh, sành sứ,

168

đá, cát

4 1- 20 Chất thải có kích thước nhỏ dưới 8mm: muối, trò, cát…có thể bị phân hủy hoặc không bị phân hủy

6.2. Vi sinh vật tham gia xử lý rác thải

Trong rác thải có nhiều chất dinh dưỡng cho vi sinh vật, đặc biệt là những hợp chất cao phân tử tự nhiên như xenlulozơ, hemixenlulozơ, pectin, tinh bột, axit nucleic, protein, vitamin,... Do vậy, ở rác thải thấy đủ mặt các nhóm vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, nấm mốc, nấm men). Riêng nấm men phát triển là khó khăn.

Đối với các nhóm vi sinh vật có khả năng tiết ra ngoại bào các enzym thủy phân cơ chất là cacbohydrat, protein, chất béo là có khả năng phát triển mạnh hơn cả. Các enzym thủy phân có tác dụng ở đây là hệ cacbohydraza, proteinaza, lipaza, pectinaza... trong đó các vi sinh vật và một số sinh xenlulazơ là thích nghi nhất. Các vi sinh vật ở đây là các thể dị dưỡng hoại sinh: cần sự có mặt của các chất hữu cơ có ở môi trường làm chất dinh dưỡng trong quá trình sống của các vi sinh vật này sẽ tiết ra enzym thủy phân để phân cắt các hợp chất hữu cơ vốn là các chất cao phân tử thành các hợp chất đơn giản hoặc là đơn vị cấu thành phân tử (monomer) thấm vào tế bào tham gia vào quá trình đồng hóa trao đổi chất để xây dựng tế bào mới.

Ngoài các nhóm vi sinh vật thuộc các thể dị dưỡng hoại sinh, người ta còn thấy ở trong rác các nhóm vi khuẩn tự dưỡng cố định amon, nitrat hóa và phản nitrat hóa, nhóm vi khuẩn khử sulfat và chuyển hóa lưu huỳnh. Quá trình dinh dưỡng và trao đổi chất của các nhóm này có nhiều khác biệt so với các nhóm dị dưỡng. Chúng ta có thể xem thêm ở phần I, xem thêm một số chương, mục ở phần II và chương XII phần III.

Vi sinh vật ở đây là các thể hiếu khí (cần có oxy hoặc không khí để phục vụ hoạt động sống), các thể kỵ khí (không cần oxy) hoặc các thể tùy tiện (sống cả ở điều kiện kỵ khí và cả ở điều kiện hiếu khí) và các thể thiếu khí (chủ yếu là sống kỵ khí hoặc cần một ít oxy có trong môi trường). Nói chung, vi sinh vật trong rác thải có nhiều các thể ưa ấm(25 – 35oC), ưa nhiệt (50 - 55 oC) và có cả các thể chịu nhiệt (70 - 85 oC).

Từ thành phần vi sinh vật của rác thải là có mặt cả các thể hiếu khí và kỵ khí người ta đã chọn các loại hình công nghệ thích hợp cho xử lý: phương pháp xử lý hiếu khí và phương pháp xử lý kỵ khí.

Phương pháp xử lý hiếu khí gồm có các quá trình công nghệ như sau:

169

- Trải rác thành các lớp mỏng (vài chục cm) hoặc chất thành đống có đảo trộn để tạo hiếu

khí cho vi sinh vật phát triển.

- ủ trong các bể ủ không thổi khí nhưng đảo trộn hoặc thổi khí bằng quạt cao áp hoặc khí

nén có thể kiểm tra cac thông số công nghệ.

- Phân hủy rác hiếu khí trong các thiết bị có thổi khí đầy đủ và kiểm soát được các thông

số nhiệt độ, độ ẩm và có thể bổ sung các chất khoáng và các chất dinh dưỡng khác.

Các quá trình công nghệ trên đây hiệu quả là ủ hiếu khí rác trong các thiết bị, nhưng áp dụng mở rộng bị hạn chế, vì vậy quá trình ủ rác trong các bể ủ lớn có thổi khí và kiểm soát được các thông số công nghệ là thích hợp nhất. Quá trình công nghệ này được áp dụng ở nhiều nước và ở nước ta đã thực hiện ở Cầu Diễn, Tây Mỗ, Việt Trì, Hải Phòng, Đà Nẵng, Hóc Môn (thành phố Hồ Chí Minh), Bà Rịa – Vũng Tàu...

Phương pháp xử lý kỵ khí gồm có các quá trình công nghệ như sau:

- Ủ kín để tạo điều kiện kỵ khí. Cách này được sử dụng nhiều ở nông thôn nước ta dùng để ủ phân chuồng (có thêm rơm rác): thường đổ và chất phân rác thành đống rồi trát kín bằng bùn. Ban đầu các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển sau đó ít oxy dần rồi bị chết. Tiếp theo là các thể kỵ khí tùy tiện phát triển ( các thể này là chủ yếu trong ủ phân rác – composting) và cuối cùng là các thể kỵ khí. Trong quá trình ủ các thể ưa ấm phát triển sớm nhất và tỏa nhiệt, sau cùng là các thể kỵ khí ưa nhiệt và chịu nhiệt thấy có mặt ở đống ủ, khi nhiệt độ tới 70-85 oC chỉ còn các thể chịu nhiệt.

- Chôn lấp : đây là biện pháp dùng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có nước ta. Rác thải sinh hoạt và một số rác thải công nghiệp được cho xuống các hố sâu và rộng đã gia công chống thấm ở đáy và thành, rồi nén chặt, phủ kín. Một hố chôn rác có thể chứa tới hàng vài trăm ngàn tấn. Chôn lấp cũng giống như ủ kín kỵ khí.

- Ủ kín kỵ khí là quá trình phân giải hợp chất hữu cơ không có mặt oxy, sản phẩm cuối cùng là khí CH4 (60 – 65%), CO2 (30- 35%), lượng nhỏ các khí khác và sinh khối vi sinh vật lẫn trong mùn. Xử lý rác thải, các phụ phẩm nông nghiệp, bùn thải, nước thải... bằng lên men metan trong các thiết bị sinh metan (methantank) để thu khí đốt (CH4). Về vấn đề này sẽ được giới thiệu ở chương sau.

Đối với rác thải bệnh viện, rác thải công nghiệp có lẫn các chất độc hại cần phải có biện pháp xử lý riêng như thiêu đốt, chôn lấp tro trong các đồ chứa đựng đặc biệt để tránh truyền rộng các chất độc ra môi trường. Rác thải bệnh viện có lẫn nhiều vi sinh vật gây bệnh được xử lý bằng các lò đốt riêng biệt là biện pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay.

Tỷ lệ C/N của một số chất thải

170

Tỷ lệ C/N nói lên mức độ phân hủy các chất thải hữu cơ và mức cân bằng dinh dưỡng có trong khối ủ, báo hiệu thời điểm kết thúc của quá trình ủ. Nếu C/N quá cao chứng tỏ hàm lượng C nhiều, N thiếu. Các thời điểm cần lưu ý:

Thời điểm bắt đầu ủ: cần cung cấp nguồn N

Thời điểm cuối: nếu C/N cao chứng tỏ tốc độ phân giải các hợp chất chứa N nhanh, tốc

độ phân giải hợp chất chứa carbohydrate chậm

Bảng 6. 3 Tỷ lệ C/N của một số chất thải

Tỷ lệ C/N Các chất thải Hàm lượng N (% trọng lượng khô)

Phân, hầm cầu 5,5- 6,5 6- 10

Nước tiểu 15- 18 0,8

Máu Phân bò Phân gà Phân heo Chất cặn lắng tươi 10- 14 1,7 6,7 3,8 4- 7 3,0 18 15 - 11

Chất cặn lên men Bùn hoạt tính Cỏ ủ Trấu lúa mì Trấu lúa nước 2,4 5 3- 6 0,3- 0,5 0,1 - 6 12- 15 128- 150 200- 500

6.3. Các phương pháp sinh học xử lý rác thải

Dựa vào hoạt động của vi sinh vật trong rác thải, có hai phương pháp xử lý rác thải theo

quá trình phân giải kỵ khí và phân giải hiếu khí

6.3.1. Các phương pháp xử lý kỵ khí rác thải

6.3.1.1. Phương pháp ủ rác làm phân compost

Đây là phương pháp ủ tự nhiên có từ lâu đời, thích hợp cho quy mô hộ gia đình, trang

trại hoặc khu dân cư.

Rác được trộn lẫn với phân chuồng tùy theo tỷ lệ rồi ủ đống hoặc cho vào bể kín tạo điều kiện kỵ khí. Ban đầu, nhóm vi sinh vật hiếu khí phát triển, rồi chết dần vì thiếu O2, lúc

171

này các nhóm vi sinh vật kỵ khí phát triển và đóng vai trò phân hủy chủ yếu các chất hữu cơ có trong rác thải.

Trong quá trình ủ, thời điểm đầu môi trường trong đống ủ còn hiếu khí nên có đầy đủ các nhóm vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và nấm men. Sau đó chỉ còn lại các nhóm vi khuẩn hô hấp tùy tiện, nhóm vi sinh vật yếm khí chịu nhiệt độ cao tồn tại trong đống ủ.

Điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt và phân hủy rác có hiệu quả cần chú ý:

- Độ ẩm khối rác khoảng 40- 60%, tối ưu là 45- 55%

- Đống ủ cần phủ kín bằng đất bùn hoặc bằng vật liệu khác tạo điều kiện kỵ khí

- Tỷ lệ rác: phân càng nhiều thì phân hủy càng nhanh hoặc có thể thêm các nguồn hữu cơ

khác, tỷ lệ này được đánh giá qua tỷ số C/N= 30- 35 là thích hợp nhất.

- Nhiệt độ khối rác: 75- 85oC

Bản chất của quá trình ủ phân yếm khí là nhờ hoạt động của vi sinh vật mà các chất khó tan như cellulose, hemicellulose, tinh bột…được chuyển thành dạng dễ tan và tiếp tục bị phân hủy hoàn toàn.

Quá trình phân hủy trong đống ủ phân yếm khí trải qua các giai đoạn sau:

• Giai đoạn đầu: xảy ra trong một vài giờ, phía ngoài đống ủ không kín tuyệt đối nên lúc này

là quá trình phân giải hiếu khí rác thải

• Giai đoạn sau: là quá trình phân giải kỵ khí, kéo dài hàng tuần, hàng tháng (60- 70 ngày),

chủ yếu xảy ra bên trong đống ủ

Ngoài rác thải sinh hoạt, có thể bổ sung thêm vào đống ủ mùn cưa, rơm rạ hay cỏ, lá cây, than bùn...để đảm bảo tỷ lệ C/N đạt khoảng 30- 35. Như vậy, rác thải sinh hoạt đô thị muốn ủ làm phân bón cần phải phân loại trước để loại bỏ các thành phần không bị phân hủy bởi vi sinh vật như túi nilong, sành, sứ, thủy tinh, cát sỏi...Với nhiệt độ cao trong đống ủ, các nhóm vi sinh vật gây bệnh hay ký sinh trùng đều chết, giúp cho phân bón khi sử dụng cho cây hợp vệ sinh.

Đống ủ kỵ khí ở quy mô trang trại (quy mô nhỏ) có đặc điểm sau: chiều cao 2m, chiều dài và chiều rộng tùy thuộc vào lượng rác và mặt bằng, xung quanh có hệ thống rãnh thu nước rỉ rác từ đống ủ, thường dùng bùn các loại để phủ kín, độ ẩm không quá 75%, thời gian ủ: 60-70 ngày

172

Nhược điểm của ủ compost kỵ khí: Quá trình kéo dài, khó triển khai mở rộng xử lý với khối lượng lớn rác thải, sản phẩm thu được là mùn nhưng chất lượng không cao. Ngoài ra trong quá trình còn sinh khí CH4, H2S và các khí gây thối khác làm ô nhiễm môi trường khí.

Trong đống ủ, oxi vẫn tồn tại sẽ làm cho các nhóm vi sinh vật hiếu khí phát triển và tỏa nhiệt dẫn đến làm tăng nhiệt độ của đống ủ. Lượng oxi giảm dần và điều kiện kỵ khí sẽ thay thế hiếu khí. Nhiệt độ đống ủ đang ở mức cao 50- 70oC giảm còn 30oC. Sự phân hủy chất hữu cơ ở điều kiện kỵ khí chậm hơn so với hiếu khí. Đầu tiên là acid hữu cơ và rượu được hình thành, sau đó sẽ tạo thành CO2 và CH4.

Trong quá trình ủ rác và chất thải thường xảy ra hiện tượng như sau:

- Sự ổn định và khôi phục các hoạt động sinh học

Rác thải đô thị tập hợp nhiều chủng vi sinh vật. Số lượng và hoạt động của chúng rất mạnh vào thời điểm khởi đầu, sau đó giảm dần đến trạng thái ổn định. Tiếp đó vi sinh vật có thể chuyển sang dạng bào tử và giảm hoạt động ở mức thấp nhất, đó là trạng thái ổn định sinh học. Nếu tiếp tục quá trình phân hủy thì sản phẩm sinh ra chủ yếu chỉ là CO2 và CH4. Quá trình này tạo thành sự ổn định vật chất và được xem như là quá trình khoáng hóa tạo ra sản phẩm vô cơ và sản phẩm khó phân hủy. Thông thường bãi rác hiếu khí ổn định sau 6- 8 tháng, trong khi bãi rác kỵ khí ổn định ít nhất 12 tháng. Việc bổ sung rác mới lên bề mặt đống rác sẽ giúp cho vi sinh vật hoạt động trở lại nhưng chỉ với cường độ thấp.

- Sự chuyển động của vi sinh vật và chất lỏng trong đống rác

Thành phần của chất lỏng sinh ra thường không ổn định, thành phần này phụ thuộc vào chủng loại rác và hoạt động của vi sinh vật. Trong bãi rác, thành phần rác thường không đồng nhất nên trong khối rác thường có các khoảng trống, đấy chính là đường di chuyển của vi sinh vật. Có nhiều nhóm vi sinh vật tồn tại trong đống ủ rác nhưng vị trí và khả năng hoạt động của các loài là khác nhau. Sự thay đổi về hàm lượng O2, chất dinh dưỡng, pH…quyết định sự tồn tại của các nhóm vi sinh vật. Sự di chuyển của vi sinh vật gây bệnh trong rác là vấn đề cần quan tâm vì nó là yếu tố ô nhiễm nguy hiểm có thể thấm vào mạch nước ngầm. Bãi rác thông khí sẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh trong thời gian ngắn do nhiệt độ cao.

- Sự hình thành và tính chất của chất lỏng rò rỉ trong rác

Chất lỏng từ rác góp phần duy trì sự cân bằng nước trong một bãi rác, tuy nhiên số

lượng và chất lượng của chúng rất khó xác định

- Các yếu tố ảnh hưởng đến sự cân bằng nước trong bãi rác

+ Trạng thái của bãi rác (khả năng thấm nước), dòng nước thoát ra, lượng mưa

+ Khả năng bốc thoát hơi và độ ẩm của chất thải

173

+ Tỷ lệ chất thải dạng lỏng

+ Khả năng giữ nước của vật chất

Khả năng giữ nước của rác trước khi hình thành dịch lỏng của rác là 100 lít/tấn. Nước rỉ rác xuất hiện khoảng 4 tháng sau khi đổ rác, tuy nhiên tốc độ sinh ra nước chỉ ổn định từ 12- 14 tháng trở lên. Trong bãi rác, thành phần acid béo giảm đáng kể, pH nước từ rác khoảng 6,1- 8,0 do sự hình thành CH4.

Nếu nước từ rác ít đi thì quá trình trao đổi và phân hủy vật chất sẽ xảy ra liên tục, các phản ứng sẽ đạt đến mức cân bằng. Tốc độ phân hủy cao xảy ra trong 35 ngày đầu và tiêu thụ nhiều oxi, sau đó giảm dần vào khoảng 75 ngày tiếp theo.

Đa số các chất từ rác đều dễ phân hủy, chất khó phân hủy còn lại là mùn. Số lượng và thành phần chất vô cơ trong rác thải thay đổi mạnh, kết quả cho thấy như sau: pH kiềm nhẹ, hàm lượng Na, K, Mg, Ca cao; hàm lượng As, Pb, Cu, Zn, Cd và Cr thấp; Cl cao và F thấp.

- Sự hình thành khí

Khí CH4 trong đống rác sinh ra ở điều kiện kỵ khí được thể hiện qua phản ứng sau: C-

O-H-N-S → (R)COOH + H2S + NH3 + CO2

(R)COOH → CH4 + CO2

Trong tự nhiên, methane được sinh ra nhờ vi khuẩn methane tồn tại trong điều kiện

không có oxi.

6.3.1.2. Phương pháp chôn lấp

Bản chất của phương pháp chôn lấp là lưu giữ các loại chất thải trong một hố, phía trên có phủ lớp đất. Phương pháp này được áp dụng phổ biến do dễ thực hiện và chi phí không cao.

Phương pháp chôn lấp rác trên cơ sở tạo môi trường yếm khí để vi sinh vật tham gia phân hủy các thành phần hữu cơ có trong rác thải. Thời gian đầu của quá trình chôn lấp cả hai nhóm vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện đều hoạt động. Trong thời gian này, trong khối rác chôn lấp vẫn tồn tại một lượng O2 có trong không khí nên nhiều nhóm vi sinh vật trong khối rác hoạt động mạnh mẽ, sau đó dần chuyển sang giai đoạn yếm khí. Nhiệt độ ở thời gian hiếu khí bắt đầu tăng và khi chuyển sang giai đoạn yếm khí nhiệt độ dần chuyển sang ổn định ở mức cao.

Vì lưu lượng không khí có trong rác không đủ nên quá trình hô hấp hiếu khí là quá trình không hoàn toàn. Các quá trình phân giải cellulose, hemicellulose, pectine, protein, tinh bột trong giai đoạn này không đạt đến mức tạo ra sản phẩm cuối cùng, thậm chí chưa được phân giải. 174

Cùng với sự phân giải hiếu khí là sự tăng sinh khối của vi sinh vật hiếu khí. Trong giai đoạn đầu, sinh khối vi sinh vật tăng nhanh sau đó giảm mạnh do thiếu oxi đột ngột, lượng sinh khối này sẽ bị tự phân. Thành phần protein của sinh khối vi sinh vật kết hợp với thành phần phân hủy không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ để tạo thành mùn trong khối ủ.

Khi nhiệt độ tăng, lượng O2 giảm, nhiều loài giun sán, côn trùng, động vật nguyên sinh cũng bị tiêu diệt. Trong đống rác chôn lấp lúc này chỉ còn tồn tại các nhóm vi sinh vật yếm khí tùy tiện và nhóm vi sinh vật yếm khí bắt buộc. Sản phẩm của quá trình phân hủy yếm khí nhờ vi sinh vật này bao gồm chất mùn, acid hữu cơ, các loại khí như CO2, NH3, CH4, H2S...và sinh khối tế bào vi sinh vật. Về nguyên tắc, các chất dễ phân giải sẽ được vi sinh vật phân giải trước, các chất khó phân giải sẽ được phân giải dần cho đến khi mức độ phân giải thấp nhất và khối rác chôn lấp đạt mức độ ổn định.

Mặt khác, có thể thấy ở đáy hố chôn lấp vi sinh vật thường phải chịu áp suất và độ ẩm cao hoặc tích tụ, chứa đựng nhiều độc chất của rác thải từ trên xuống, do đó số lượng vi sinh vật ở đây thường rất thấp.

Như vậy, bản chất của phương pháp chôn lấp rác là duy trì và phát triển các quá trình sinh học xảy ra trong hố chôn lấp chất thải hữu cơ và thực hiện các biện pháp kiểm soát ô nhiễm do hố chôn lấp gây ra.

Các loại chất thải được xử lý theo phương pháp chôn lấp

Bãi chôn lấp bao gồm các ô chôn lấp, vùng đệm, các công trình phụ trợ, khu xử lý nước

rò rĩ, khu xử lý khí thải, trạm cung cấp điện, nước.

Các loại chất thải xử lý theo phương pháp chôn lấp hợp vệ sinh không chứa chất độc hại, nguy hiểm ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Một số loại rác thải đủ điều kiện để tiến hành chôn lấp hợp vệ sinh bao gồm:

- Rác thải sinh hoạt: rác thải nhà bếp, rác đường phố, khu vui chơi giải trí, công sở...

- Rác thải thương mại: rác chợ, siêu thị

- Rác thải công nghiệp: chất thải từ các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm như nhà máy sản xuất rượu, bia, nước giải khát, nhà máy chế biến đồ hộp, chế biến lương thực, thực phẩm, nhà máy sản xuất giấy, giày da...

- Chất thải từ các khu xử lý nước thải như bùn thải, cặn dầu mỡ

- Các chất thải từ nhựa tổng hợp

- Thuốc bảo vệ thực vật hay phế liệu có hàm lượng PCB > 50mg/kg

175

- Các loại tro không chứa thành phần nguy hại, tro từ các lò thiêu đốt công nghiệp, y tế, lò

đốt rác...

- Chất thải xây dựng: đất, đá, xi măng, phế liệu

- Chất thải có tính lây nhiễm như xác động vật, thực vật bị dịch bệnh

- Các loại chất thải phóng xạ có chứa một hoặc nhiều hạt nhân phóng xạ theo quy chế an

toàn phóng xạ

- Rác thải dễ cháy nổ

Rác được phân loại từ đầu nguồn hoặc từ hộ gia đình sẽ tiết kiệm được thời gian và nhân lực để phân loại sau này, đặc biệt là đơn giản hóa được khâu công nghệ xử lý và có được hiệu quả cao trong việc tái chế nhiều vật liệu quý cũng như thu hồi được khí CH4 có chất lượng cao với số lượng nhiều hơn.

Rác thu gom được đưa về trạm trung chuyển và được ép để giảm thể tích và giảm hàm lượng nước, xử lý kỵ khí được tốt hơn. Rác được tập kết đến khu liên hợp và được chôn lấp. Hố chôn rác cần được xử lý nền đáy và tường thành, tránh không để nước bên ngoài thấm vào hoặc nước rỉ rác thấm ra gây ô nhiễm cho hệ thống nước ngầm. Mỗi hố chôn rác có chiều cao hố chôn vào khoảng 15- 20m, chiều dài- rộng khoảng 200 x 400-600m. Mỗi hố có thể chứa hàng trăm ngàn tấn rác và được phủ đất chặt. Thời gian khai thác mỗi khu liên hợp khoảng 40- 60 năm. Sau 10 năm mỗi hố chôn có thể được khai thác chế biến mùn làm phân compost, trong thời gian này có thể thu khí sinh học.

Trong quá trình chôn lấp và khai thác cần phải:

- Thu gom nước rỉ rác từ các hố chôn lấp: hố chôn cần phải có hệ thống thoát nước ở đáy hố và đưa ra giếng thu nước rác, cần có hệ thống xử lý nước rỉ rác riêng vì có hàm lượng chất ô nhiễm cao.

- Thu gom khí sinh học: với các loại khí CH4, CO2, H2S để tránh cháy nổ và giảm ô nhiễm

không khí

Cả hai vấn đề này ở nước ta đều chưa làm tốt, xử lý nước rỉ rác đang thực hiện nhưng

chưa hiệu quả.

Nước rỉ rác được hình thành như sau:

- Có sẵn trong rác chôn lấp, hình thành qua quá trình phân giải rác hoàn toàn

- Nước mưa rơi xuống khu vực chôn lấp rác

- Nước từ khu vực khác thấm xuống hố chôn rác

176

Thông thường, lượng nước rác thải chiếm tỷ lệ khá lớn, hàm lượng COD và BOD rất cao. Đặc biệt trong nước rác ủ kỵ khí bằng phương pháp chôn lấp thường có mùi thối rất nặng. Vì vậy, khu vực xung quanh bãi chôn lấp thường bị ô nhiễm nặng, ảnh hưởng đến cuộc sống của người dân xung quanh. Thành phần của nước rỉ rác thể hiện qua bảng sau:

Bảng 6. 4 Chỉ tiêu phân tích của rác sau thời gian chôn lấp

Thời gian chôn lấp

Thành phần

< 2 năm > 10 năm

pH 5,0- 6,5 6,5- 7,5

BOD (mg/l) 4000- 30.000 < 100

COD (mg/l) 10.000- 60.000 50- 500

TOC (mg/l) 1000- 2000 < 100

Chất rắn tổng hợp (mg/l) 8000- 50.000 1000- 3000

3- (mg/l)

N (mg/l) 100- 1000 < 100

5- 100 <5 PO4

2- (mg/l)

Clorite (mg/l) 500- 2000 100- 500

50- 1000 < 10 SO4

Fe (mg/l) 100- 1500 10- 400

Na (mg/l) 500- 3000 <200

K (mg/l) 200- 1000 50- 400

Ca (mg/l) 500- 2500 100- 400

Với thành phần nước rỉ rác có mức độ ô nhiễm nặng như bảng trên, trước khi thải ra môi trường nước rác cần phải được xử lý. Phương pháp xử lý chung nhất là xử lý sơ bộ rồi thải vào hệ thống nước thải của thành phố. Nếu bãi chôn lấp xa thành phố thì nước rác phải được xử lý tại bãi rác bằng các phương pháp sau:

• Xử lý kỵ khí kết hợp với xử lý hiếu khí: phương pháp này có hiệu quả đối với các loại nước nhiễm bẩn nặng như nước rỉ rác, xử lý ban đầu trong các bể phản ứng kỵ khí (bể UASB) sau đó đưa vào xử lý trong các bể phản ứng hiếu khí

177

• Hồ ổn định sinh học: nước rác cho chảy vào hồ rông và sâu khoảng 2- 4m. Đây là hồ tùy tiện để xử lý sinh học các loại nước thải nhưng hiệu quả chậm và gây ra nhiều mùi hôi thối khó chịu

+, PO4

• Kết hợp phương pháp hóa lý với phương pháp sinh học: ban đầu cho các loại tạo bông kết tủa các chất hữu cơ nhiễm bẩn, cho qua các chất hấp phụ rồi xử lý bằng bể aerotank, sau đó cho vào hồ ổn định sinh học. Có thể sau phương pháp xử lý hóa lý là xử lý kỵ khí và tiếp theo đến xử lý hiếu khí và hồ ổn định sinh học với sự tham gia của tảo và thực vật thủy sinh. Cuối cùng, cho nước chảy qua bãi lau sậy sẽ làm giảm thiểu ô nhiễm hoặc làm sạch 3-, kim loại nặng cho đến khi đạt mức cho phép đổ vào thủy vực chung NH4

6.3.2. Các phương pháp xử lý hiếu khí rác thải

Phương pháp ủ rác hiếu khí là quá trình phân giải chất hữu cơ với sự có mặt của oxy,

sản phẩm chính thu được là mùn

Xử lý rác thải theo phương pháp hiếu khí thường có mặt O2. Các chất hữu cơ có trong rác thải là cellulose, hemicellulose, pectin, tinh bột, protein, chất béo trong quá trình ủ đều bị vi sinh vật phân giải, chủ yếu là các nhóm hiếu khí bắt buộc hoặc tùy tiện.

Quá trình xảy ra như sau:

+ Oxy hóa carbon hiếu khí:

Tế bào VSV mới + CO2 + H2O + NH3 +

Chất hữu cơ (C,O,H,N) + VSV dị dưỡng Kcal

+ Nitrate hóa hiếu khí:

+ + VSV dị dưỡng (Nitromonas)

Giai đoạn 1:

-+ H2O +

Tế bào VSV mới + NO2

CO2, CO, NH4 H+

- + VSV dị dưỡng (Nitrobacter)

Giai đoạn 2:

- + H2O

CO2, NO2 Tế bào VSV mới + NO3

Sản phẩm tạo ra của quá trình này là CO2, H2O và sinh khối vi sinh vật. Các hợp chất hữu cơ có trong rác thải là những chất cao phân tử nên sản phẩm tạo thành cùng với sinh khối vi sinh vật là khối mùn hữu cơ rất thích hợp dùng chế biến thành phân bón cho cây trồng.

178

6.3.2.1. Phương pháp ủ hiếu khí

Phương pháp này tương đối đơn giản và được thực hiện như sau: Rác được chất thành lớp hoặc chất đống: 1,5- 2m; cần đảm bảo độ ẩm: 45- 50%; Có thổi khí, đảo trộn và tưới nước đủ ẩm; Nhiệt độ trung bình trong đống ủ là 55oC; quá trình ủ có đảo trộn trong khoảng thời gian 3- 4 tuần thì nhiệt độ giảm còn 30- 35oC, sau đó ủ tĩnh 2-3 tuần có thể thu được mùn hữu cơ nhờ vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ trong rác tạo thành.

Phương pháp này dễ thực hiện nhưng có thể gây mất vệ sinh, gây ô nhiễm nguồn nước và

môi trường xung quanh.

6.3.2.2. Phương pháp ủ rác không đảo trộn

Theo phương pháp này, rác được ủ thành đống hoặc trong bể ủ có chiều cao 2- 2,5m; Ở đáy đống ủ được trang bị hệ thống thổi khí và phân tán khí; Nhờ cung cấp đủ oxi mà quá trình chuyển hóa vật chất nhờ vi sinh vật xảy ra nhanh hơn. Ủ có thổi khí kéo dài khoảng 3 tuần và ủ tĩnh khoảng 2 tuần.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ủ rác có thổi khí

- Nhiệt độ: để quá trình ủ có được kết quả nhanh và tốt, đảm bảo nhiệt độ ở đống ủ: 50-

55oC. Tạo điều kiện cho vi sinh vật ưa nhiệt hoặc chịu nhiệt phát triển

- Độ ẩm và thành phần rác: đa số vsv phát triển tốt ở độ ẩm cơ chất 40- 60% (tốt nhất là 50- 55%). Cần thường xuyên phun ẩm. Thành phần rác chứa nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động sống của vsv

- Bổ sung vi sinh vật: cần bổ sung thêm vsv dưới dạng các chế phẩm sinh học hay dịch nước

phân, phân chuồng, bùn cống, nước thải, bùn hoạt tính…

- Thời gian ủ: quá trình ủ rác thổi khí: 15- 21 ngày

179

CHƯƠNG 7. TINH SẠCH MÔI TRƯỜNG KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC VÀ THU NHẬN KHÍ SINH HỌC

Dựa trên những đặc tính vật lý và tính chất hoạt động, khí quyển trái đất được chia thành 5 tầng mỗi tầng có những đặc trưng vật lý khác nhau

Hình 7. 1 Cấu trúc khí quyển

Tầng đối lưu (Troposphere)

Là tầng không khí gần mặt đất nhất, độ cao trung bình của nó vào khoảng 11 km: ở hai cực trái đất chỉ cao từ 8 - 10 km, còn ở vùng xích đạo là 13-15 km. Tầng đối lưu chiếm 80% khối lượng khí quyển và 90% hơi nước, thành phần khí quyển ở tầng này luôn luôn diễn ra sự trao đổi giữa mặt đất, mặt đại dương và khí quyển.

Tầng bình lưu (Stratosphere)

Tầng bình lưu là tầng tiếp giáp với tầng đối lưu, lên cao tới 50km. Ðặc điểm của tầng bình lưu là không khí ít bị xáo trộn theo chiều thẳng đứng. Có thể tách tầng này thành hai lớp: Lớp đẳng nhiệt và Lớp nghịch nhiệt

Tầng trung lưu (Mesosphere)

180

Tầng trung gian nằm trên tầng bình lưu cho đến độ cao 80 - 90 km. Tầng này nhiệt độ

giảm dần theo độ cao và đạt đến giá trị -920C.

Tầng nhiệt lưu (Thermosphere)

Còn gọi là tầng nhiệt quyển là tầng không khí có độ cao từ 80 - 500km. Ở tầng này không khí rất thưa loãng. Dưới tác dụng của các tia bức xạ, các chất khí đều bị phân ly và bị ion hoá mạnh. Khí quyển ở đây có độ dẫn điện cao.

Tầng khuyếch tán (Exosphere)

Giới hạn trên của tầng này vào khoảng 2000 đến 3000 km, là tầng chuyển tiếp giữa khí quyển và không gian vũ trụ (Outer space), không khí tầng này rất thưa loãng thành phần chủ yếu là Hydrô và Hêli..

7.1. Đặc trưng của khí thải

Tầng đối lưu là môi trường sống của tất cả các sinh vật trên trái đất. Các hiện tượng thời tiết, mưa, nắng, mây, dông bão... đều xảy ra ở tầng khí quyển này. Trung bình cứ lên cao 100m nhiệt độ giảm xuống 0,640C. Ở tầng này thường xảy ra hiện tượng các dòng không khí đi lên hoặc đi xuống (do các trung tâm khí áp cao, khí áp thấp..., do gặp các chướng ngại vật trên mặt đất, do sự tranh chấp giữa các khối không khí...). Hiện tượng thăng giáng của các khối không khí đã làm thay đổi chế độ nhiệt, ẩm của không khí

Thành phần không khí lớp khí quyển gần mặt đất

Sự trao đổi liên tục giữa khí quyển, địa quyển, thủy quyển và sinh quyển đã tạo nên những cân bằng động duy trì sự có mặt và tồn tại của các chất khí trong khí quyển. Trong một đơn vị thể tích của không khí khô và sạch có chứa 78,08% nitơ (N2), 20,95% ôxy (O2), 0,93% acgon (Ar), 0,03% cacbonic. Các chất khí nêon, hê li, cripton, hyđrô, xênon và ôzôn chỉ chiếm 0,01% . Trong khí quyển còn có một số chất có thành phần biến động như hơi nước, bụi khói, các chất khí độc hại, các ion và các chất hữu cơ do thực vật thải ra.

Bảng 7. 1 Thành phần không khí khô, không bị ô nhiễm

STT Tên chất Công thức Tỉ l ệ Tổng khối lượng (tấn)

1 Nitơ 78,09% 3850. 1012 N2

2 Oxy 20,94% 1180. 1012 O2

3 Argon Ar 0,93% 65. 1012

4 Cacbonic 0,032% 2,5. 1012 CO2

181

STT Tên chất Công thức Tỉ l ệ Tổng khối lượng (tấn)

Neon Ne 5 18 ppm 64. 109

Heli He 6 5,2 ppm 3,7. 109

Metan 7 1,3 ppm 3,7. 109 CH4

Kripton Kr 8 1,0 ppm 15. 109

Hydro 9 0,5 ppm 0,18. 109 H2

Nitơ ôxit 10 0,25 ppm 1,9. 109 N2O

Cacbon monoxit CO 11 0,10 ppm 0,5. 109

Ôzon 12 0,02 ppm 0,2. 109 O3

Sulfurdioxit 13 0,001 ppm 11. 106 SO2

Nitơ dioxit 14 0,001 ppm 8. 106 NO2

Các hoạt động của tự nhiên và con người có thể làm thay đổi thành phần của lớp không khí gần mặt đất. Ô nhiễm môi trường không khí xảy ra khi xuất hiện hiện tượng môi trường không khí bị nhiễm bẩn dẫn đến tính chất vật lý, hóa học, sinh học của môi trường bị thay đổi gây tác hại tới sức khỏe con người và các sinh vật khác. Ô nhiễm môi trường chủ yếu do hoạt động của con người gây ra. Đặc trưng các nguồn gây ô nhiễm không khí do hoạt động của con người

Các hoạt động công nghiệp

Đây là nguồn gây ô nhiễm lớn nhất của con người. Các quá trình gây ô nhiễm là quá trình đốt các nhiên liệu hóa thạch: than, dầu, khí đốt tạo ra: CO2, CO, SO2, NOx, chất hữu cơ cháy chưa hoàn toàn: muội than, bụi, quá trình thất thoát, rò rỉ trên dây chuyền công nghệ, các quá trình vận chuyển các hóa chất bay hơi, bụi. Đặc điểm: nguồn khí thải công nghiệp có nồng độ chất độc hại cao, thường tập trung trong một không gian nhỏ. Tùy thuộc vào quy trình công nghệ, quy mô sản xuất và nhiên liệu sử dụng thì lượng chất độc hại và loại chất độc hại sẽ khác nhau.

Các hoạt động giao thông vận tải

Đây là nguồn gây ô nhiễm lớn đối với không khí đặc biệt ở khu đô thị và khu đông dân cư. Các quá trình tạo ra khí gây ô nhiễm là quá trình đốt nhiên liệu động cơ: CO, CO2, SO2, NOx, 182

Pb,CH4 Các bụi đất đá cuốn theo trong quá trình di chuyển. Nếu xét trên từng phương tiện thì nồng độ ô nhiễm tương đối nhỏ nhưng nếu mật độ giao thông lớn và quy hoạch địa hình, đường xá không tốt thì sẽ gây ô nhiễm nặng cho không khí hai bên đường.

Các hoạt động sinh hoạt

Là nguồn gây ô nhiễm tương đối nhỏ, chủ yếu là các hoạt động đun nấu sử dụng nhiên liệu nhưng đặc biệt gây ô nhiễm cục bộ trong một hộ gia đình hoặc vài hộ xung quanh. Tác nhân gây ô nhiễm chủ yếu: CO, bụi, khí thải từ máy móc gia dụng.

7.2. Nguyên lý của quá trình tinh sạch khí thải

Phương pháp tốt nhất để hạn chế ô nhiễm không khí là ngăn chặn ngay từ nguồn phát thải ra. Mặc dù bầu khí quyển có khả năng rất lớn trong việc phát tán, pha loãng và làm thay đổi tính chất của phần lớn các vật chất trong khí quyển mà con người không thể làm được nhưng khả năng này không phải vô hạn.

Việc quy hoạch một khu dân cư, khu công nghiệp hay đô thị có liên quan chặt chẽ đến các nguồn thải cao nhằm ngăn chặn khả năng lan tỏa chất ô nhiễm ở mức độ nguy hại sang vùng lân cận. Việc nghiên cứu khí hậu học giúp cho việc khoanh vùng không khí quy hoạch cho khu dân cư, bảo đảm cho các khu dân cư một vành đai an toàn. Số liệu khí hậu cho phép dự đoán được những sự thay đổi của thời tiết, từ đó ta có biện pháp thích hợp để ngăn chặn sự phát tán khí thải khí vào trong khí quyển dựa trên những báo cáo hàng ngày về khí hậu

7.2.1. Hấp thụ khí

Nguyên lý cơ bản của việc hấp thụ khí là tạo ra một sự tiếp xúc giữa dòng khí chứa các chất ô nhiễm và các hạt dung dịch hấp thụ thường được phun ra với kích thước nhỏ và mật độ lớn. Các chất ô nhiễm được tách ra bằng việc hoà tan trong chất lỏng hấp thụ hoặc xảy ra phản ứng hoá học giữa chất ô nhiễm và dung dịch hấp thụ. Trong kỹ thuật hấp thu, dòng khí thường được cho đi ngược chiều với các hạt dung dịch hấp thụ với tốc độ hợp lý, thông thường người ta thường chọn vận tốc này trong khoảng 1,0 – 2,5m/s. Hiệu quả của các quá trình phụ thuộc vào diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dòng khí và các hạt dung dịch hấp thụ, thời gian tiếp xúc, dung dịch hấp thụ, nhiệt độ khí thải, hướng chuyển động tương đối của dịng khí và dung môi, tốc độ của dòng khí

7.2.2. Hấp phụ khí

Hấp phụ khí dựa trên cơ sở các chất khí bị các chất rắn hấp phụ. Quá trình xảy ra khi các phân tử hoặc nguyên tử cần hấp phụ được tập trung chỉ ở trên bề mặt của chất rắn hoặc trong các mao quản của chất rắn. Hấp phụ khí dựa trên nguyên tắc dòng khí tiếp xúc trực tiếp khi chuyển động xuyên qua lớp chất rắn hấp phụ chứa trong một thiết bị. Chất hấp phụ có thể là những chất mà có tính chất lý học hoặc hóa học tự nhiên, ví dụ than hoạt tính, các hạt xilicagen…

183

Hiệu quả của thiết bị phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chất hấp phụ lý học sẽ hấp phụ ở điều kiện nhiệt độ và áp suất thấp của hỗn hợp hai pha khí - rắn. Trái lại, chất hấp phụ hóa học thì được thực hiện chỉ khi khí đó bám được trên bề mặt chất hấp phụ.

7.2.3. Đốt cháy khí thải

Thông thường đó là các chất hữu cơ khó phân hủy, chúng thường có cấu tạo mạch vòng khá phức tạp ví dụ dioxin, furan, các hợp chất dung môi từ các quá trình sơn. Để xử lý các chất ô nhiễm này, phương pháp thiêu đốt là thích hợp nhất. Để cho quá trình cháy được hoàn toàn, phải có đủ lượng ôxy cung cấp cho quá trình cháy, nhiệt độ, sự xáo trộn, thời gian cháy phù hợp.

7.2.4. Sử dụng thực vật xử lý khí thải

Căn cứ vào phản ứng của thực vật đối với khí NOx và SO2 cho phép chia thực vật thành hai nhóm: Nhóm thực vật có khả năng chống chịu các khí ô nhiễm nói trên như cây sanh, cây keo lá tràm có khả năng thanh lọc NOx và SO2 và nhóm thực vật dễ bị tổn thương bởi các khí ô nhiễm NOx và SO2 có khả năng phát hiện sự có mặt các khí ô nhiễm nói trên trong môi trường không khí.

7.2.5. Sử dụng vi sinh vật xử lý khí thải

Phương pháp sinh học xử lý khí thải dựa trên nguyên tắc sử dụng vi sinh vật chuyển hóa các chất ô nhiễm trong khí thải có bản chất hữu cơ hoặc vô cơ thành CO2, H2O và các sản phẩm ít độc hại hơn.

Hiện nay có 4 phương pháp sinh học để xử lý khí thải hiện thường được sử dụng: Lọc sinh học (Biofiltration); Màng sinh học (Biobeds); Tháp tưới sinh học (Bioscrussber); Lọc sinh học nhỏ giọt (Bio-Trickling Biofilter)

Lọc sinh học (BIOFILTRATION)

Nguyên lý tạo điều kiện cho vi khuẩn tiếp xúc với các chất ô nhiễm trong khí thải. Hệ thống lọc khí thải này là nơi chứa các nguyên liệu lọc và nơi sinh sản cho các vi sinh vật. Trong hệ thống này, các vi sinh vật sẽ tạo thành một màng sinh học (biofilm), đây là một màng mỏng và ẩm bao quanh các nguyên liệu lọc. Trong quá trình lọc, khí thải được bơm chậm xuyên qua hệ thống lọc, các chất ô nhiễm trong khí thải sẽ bị các nguyên liệu lọc hấp thụ. Các chất khí gây ô nhiễm sẽ bị hấp phụ bởi màng sinh học, tại đây, các vi sinh vật sẽ phân hủy chúng để tạo nên năng lượng và các sản phẩm phụ là CO2 và H2O

Màng sinh học (BIO BEDS)

Khi bề mặt giá thể có nước, chất dinh dưỡng và vi sinh vật Màng Sinh Học sẽ bắt đầu xuất hiện. Tiếp đó vi sinh vật bắt đầu bám dính phủ kín giá thể tăng sinh khối liên tục và tạo thành một lớp màng dày trên bề mặt giá thể. Trong quá trình lọc, khí thải được bơm chậm qua hệ 184

thống lọc, các chất ô nhiễm trong khí thải sẽ bị các nguyên liệu lọc hấp thụ. Các chất khí gây ô nhiễm sẽ bị hấp phụ bởi màng sinh học, tại đây, các vi sinh vật sẽ phân hủy chúng để tạo nên năng lượng và các sản phẩm phụ là CO2 và H2O

Tháp tưới sinh học (BIOSCRUSSBER)

Khí thải được đưa vào tháp hấp thu tại đây dòng nước có nhiệm vụ lôi cuốn những chất ô nhiễm di chuyển đi xuống. Dòng nước chứa chất ô nhiễm được bơm vào bể bùn hoạt tính có chứa vi sinh được cung cấp chất dinh dưỡng trong điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp, chúng sinh trưởng, thực hiện nhiệm vụ phân giải chất ô nhiễm.

Lọc sinh học nhỏ giọt (BIO-TRICKLING FITER)

Khí thải có chứa chất ô nhiễm được đưa vào đáy tháp xử lý có lớp vật liệu lọc. Hệ thống điều khiển tự động sẽ duy trì môi trường sống của hệ vi sinh vật bằng cách phun chất dinh dưỡng với liều lượng và thời gian thích hợp từ trên đỉnh tháp. Màng sinh học gia tăng trên bề mặt lớp vật liệu lọc cho phép các vi sinh vật hấp thụ các chất gây ô nhiễm tốt hơn.

Hình 7. 2 Các phương pháp xử lý khí ứng dụng sinh học

7.2.6. Phương pháp khác

Trong việc kiểm soát mùi, việc bao kín và trung hòa có thể được thực hiện bằng cách thêm vào một yếu tố thích ứng với mùi, đủ để át hết mùi ở nồng độ cao hoặc trộn hai loại mùi có nồng độ tương đương, do đó chúng sẽ tự khử nhau. Một điều đáng lưu ý là mùi dùng để trung hòa phải là không độc, không gây cháy, không gây dị ứng hoặc ăn mòn. Ví dụ, khi muốn át mùi cho xử lý nước thải người ta phun vani vào, hơi vani sẽ thay thế vị trí của hơi H2S và metal. Có nhiều chất có thể gây ra mùi tồn tại ở dạng lỏng trong điều kiện không khí xung quanh. Làm lạnh hơi có thể xử lý được những mùi do làm ngưng tụ các hơi. Trong các lò tái chế và các cơ sở nghiền thực phẩm có thể ứng dụng của kỹ thuật này. Nhiều loại khí hữu cơ và hơi sinh ra các mùi có thể được khử bớt mùi bằng việc tạo ra quá trình ôxy hóa làm chuyển chúng sang dạng có ít mùi hơn, hóa chất dùng làm chất ôxy hóa là clo, ozon, thuốc tím (KMnO4). Biện pháp khử mùi trong các nhà máy chế biến các loại thịt có thể ứng dụng biện pháp xử lý mùi bằng phương pháp ôxy hóa nhờ hoá chất. 185

7.3. Một số phương pháp tinh sạch khí thải

Rất nhiều chất ô nhiễm môi trường không khí do sản xuất công nghiệp đốt nhiên liệu than, dầu, khí gây ra, nhất là công nghiệp năng lượng.Vì vậy để bảo vệ chất lượng môi trường không khí trước hết phải quan tâm đến xử lý và giảm thiểu nguồn thải ô nhiễm công nghiệp. Kiểm soát nguồn thải ô nhiễm công nghiệp thông thường bằng 2 hệ thống biện pháp cơ bản là: giảm thiểu tiêu dùng nhiên liệu và sau đó là giảm thiểu chất thải khi đốt nhiên liệu

Xu hướng của các quốc gia trong quá trình phát triển sẽ tiến tới việc sử dụng công nghiệp sản xuất theo nguyên tắc công nghệ “không có chất thải”. Trong phương án này khí thải sinh ra được sử dụng như là các nguyên liệu có giá trị trong sản xuất công nghiệp tiếp theo. Bằng biện pháp khí hoá các nhiên liệu lỏng có lưu huỳnh cao để thu được khí dùng cho mục đích sản xuất năng lượng và lưu huỳnh, cũng như các sản phẩm khác. Tổ chức sản xuất công nghiệp theo nguyên tắc công nghệ không có khí thải đáp ứng đồng thời yêu cầu sử dụng hợp lý tài nguyên thiên nhiên và bảo vệ môi trường. Nhưng để chuyển tất cả công nghiệp hiện nay sang công nghiệp bảo đảm không có chất thải cần có một thời gian dài, không những đối với nước ta mà còn là đối với tất cả các nước trên thế giới.

7.3.1. Phương pháp lọc sinh học

Lọc sinh học là những tháp phản ứng có một tầng lọc là vật liệu đệm được nhồi hoặc nén chặt, không khí cần xử lý được thổi qua hoặc hút qua lớp vật liệu đệm có mang vi sinh vật hình thành những màng mỏng sinh học (biofilms). Cấu hình cơ bản của thiết bị lọc sinh học được mô tả trên hình 7.1.

Hình 7. 3. Thiết bị lọc sinh học xử lý khí

Màng sinh học (biofilm) được cấu tạo bởi tế bào vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn); các polysaccarit ngoại bào, và nước liên kết. Một màng chất lỏng phải tồn tại xung quanh các vi

186

sinh vật vì chúng thu nhận toàn bộ chất dinh dưỡng cho mình từ pha lỏng. Trong các thiết bị lọc sinh học thông thường, vận hành ở độ ẩm 50- 60%.

Xử lý khí thải bằng lọc sinh học trước đây thường được áp dụng để khống chế các hợp chất gây mùi, nhưng ngày nay chúng còn được sử dụng để loại bỏ các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi. Các nhóm chất gây ô nhiễm được phân loại có thể xử lý bằng phương pháp lọc sinh học bao gồm: các chất vô cơ (H2S, NH3, NO, N2O), các chất hữu cơ ưa nước, và các chất hữu cơ kỵ nước (BTEX).

Lọc sinh học có ưu điểm quan trọng so với các hệ thống khác nhằm kiểm soát sự ô nhiễm không khí là: chi phí đầu tư và chi phí vận hành thấp, đòi hỏi ít năng lượng, và không có các chất thải và các sản phẩm phụ cần được xử lý tiếp hoặc thải bỏ. Mặc dù mục đích của các hệ thống thông thường dùng cho việc loại bỏ các chất ô nhiễm khỏi dòng chất thải, kiểm soát sự ô nhiễm do pha khí gây ra, nhưng chính mỗi hệ thống lại sinh ra một dòng chất thải đòi hỏi được xử lý hoặc thải bỏ.

Bảng 7. 2 So sánh các công nghệ kiểm soát chất gây ô nhiễm dạng khí

Công nghệ

Các chất thải/ Sản phẩm phụ

Nhận xét

Chi phí năng lượng

Hấp phụ

Vừa phải đến cao

Cacbon hoạt tính hết tác dụng (các hệ thống tái sinh được cacbon này thường được dùng kết hợp với sự ngưng tụ và sự thiêu đốt)

Sự phát thải khí ở mức thấp đến vừa phải, với các chất có trọng lượng phân tử khoảng từ 45 đến 130.

Hấp phụ

Nước thải, bùn hóa chất

Vừa phải

Các chất thải chỉ giới hạn ở nhóm các hợp chất hòa tan (ví dụ H2S, axeton, metanol).

Cao

Oxy hóa bằng nhiệt

NOx, CO, HCl, các chất hữu cơ độc tiềm tàng.

Hiệu suất ổn định, nếu thực hiện với đủ thời gian, nhiệt độ, và sự khuấy trộn tốt.

NOx, CO, HCl, các chất hữu cơ độc tiềm tàng.

Vừa phải tới cao

H2S, HCl, hoặc vật chất dạng hạt có thể phá hủy chất xúc tác.

Oxy hóa có xúc tác (thiêu đốt có xúc tác)

Ngưng tụ

Cao

ít chất có nồng độ cao.

Các chất không bị phá hủy; tuy nhiên, có thể từ đây thu được các sản phẩm khác.

Lọc sinh học

Thấp

Môi trường compost, được thải ra cứ 2- 5 năm một lần.

Các chất thải ra có khả năng bị phân hủy sinh học, có nồng độ từ thấp đến vừa phải.

Lọc chảy giọt sinh học

Các vật liệu tổng hợp, dòng tế bào thải ra có tốc độ thấp.

Thấp đến vừa phải

Các chất thải ra có khả năng bị phân hủy sinh học, có nồng độ vừa phải đến cao.

187

Vật liệu đệm sử dụng trong lọc sinh học yêu cầu phải có diện tích bề mặt lớn, tính thấm cao, đồng thời dễ dàng trong việc cung cấp nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng của vi sinh vật. Vật liệu ấy có thể là vật liệu tự nhiên hay tổng hợp.

Vật liệu tự nhiên bao gồm: đất, compost, than bùn, vỏ bào gỗ. Sỏi và đá có thể được dùng, nhưng do tỷ số diện tích bề mặt/khối lượng nhỏ nên tốc độ phản ứng theo khối lượng đạt hiệu quả không cao.

Vật liệu tổng hợp bao gồm: Hạt gốm, Hạt polyetylen

Bảng 7. 3 Tính chất và khả năng xử lý của một số loại vật liệu đệm trong lọc sinh học

7.3.2. Phương pháp khử H2S trong môi trường nhờ Vi sinh vật

Trong tự nhiên với sự tham gia tích cực của hệ vi sinh vật một lượng lớn H2S được vi sinh vật chuyển hóa đáp ứng nhu cầu phát triển. Trong chu trình địa hóa, lưu huỳnh có trong các hợp chất hữu cơ được hệ vi sinh vật khử lưu huỳnh (Sulfate Reduce Bacterium) chuyển hóa tạo

188

thành các dạng vô cơ trong đó có H2S. Một phần H2S sinh ra sẽ hòa tan vào nước và được 2- với sự tham gia của hệ vi sinh vật chuyển hóa tạo thành các dạng lưu huỳnh phân tử và SO4 oxy hóa lưu huỳnh (SOB). Trong số những vi sinh vật có khả năng oxy hóa lưu huỳnh thì nhóm vi khuẩn hiếu khí oxy hóa lưu huỳnh đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới phân lập và nghiên cứu, từ những nghiên cứu thực nghiệm đã cho thấy khả năng ứng dụng trong quá trình xử lý H2S trong môi trường nước và khí đạt hiệu quả cao với chi phí thích hợp.

Hình 7. 4 Thiết bị xử lý khí H2S sử dụng vi khuẩn SOB (Nguồn: Nguyễn Khánh Hoàng)

Thiết bị xử lý H2S trong khí thải hoạt động theo nguyên tắc tiếp xúc pha: pha lỏng (chứa môi trường dinh dưỡng và vi sinh vật) được cấp vào thiết bị từ đỉnh tháp. Pha khí chứa H2S (được hòa trộn với không khí nhằm cung cấp lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa) được cấp vào từ đáy tháp. Thiết bị dạng tháp đệm với bản chất lọc sinh học với quá trình khử H2S nhờ hoạt động của các vi khuẩn oxy hóa lưu hùynh.

Năng suất của thiết bị có thể dễ dàng thiết kế dựa vào sự thay đổi khối lượng đệm, lưu lượng khí thải và hiệu quả xử lý kỳ vọng. Tuy nhiên, để bảo đảm tính liên tục của quá trình xử lý, thiết bị được thiết kế gồm hai đơn nguyên hoạt động song song. Trong trường hợp cần bảo dưỡng: một tháp thực hiện quá trình oxy hóa; một tháp được bảo dưỡng.

OSH





SOB



Bản chất của quá trình xử lý xảy ra theo phương trình sau:

2

2

Sinh khối tế bào vi sinh vật + CO2 +H2O

189

H2S đóng vai trò là một chất nhận điện tử trong quá trình chuyển hóa của vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh. Vì thế trong quá trình thiết bị cần phải bổ sung những thành phần dưỡng chất cần thiết khác để sự phát triển của tác nhân vi sinh vật được bảo đảm.

7.4. Phương pháp thu nhận khí sinh học

Biogas hay khí sinh học là hỗn hợp khí metan (CH4) và một số khí khác phát sinh từ sự phân huỷ các vật chất hữu cơ trong điều kiện yếm khí, xúc tác nhờ nhiệt độ từ 20-40oC. Thành phần chính của Biogas gồm:

-CH4 (60-70%)

-CO2 (30-40%)

-Các chất khác như hơi nước N2, O2, H2S, CO …,

Khí CH4 là 1 chất khí không màu, không mùi nhẹ hơn không khí. Ở điều kiện 200C, 1atm, 1m3 khí CH4 có trọng lượng 0,716 kg. Methane cũng là một khí tạo ra hiệu ứng nhà kính gấp 21 lần hơn khí carbonic (CO2). Nhiệt trị thấp của CH4 khoảng 5500 – 6000 kcal/1m3 do đó có thể sử dụng biogas làm nhiên liệu.

Hình 7. 5 Quá trình lên men của các chất hữu cơ do các vi sinh vật yếm khí

Để sử dụng biogas làm nhiên liệu cần phải quan tâm xử lý biogas trước khi sử dụng vì có thể tạo nên hỗn hợp nổ với không khí. Ngoài ra trong khá sinh học còn chứa khí H2S có thể ăn mòn các chi tiết thiết bị do sinh sản phẩm H2SO4 và SOx cũng là một khí rất độc. Hơi nước có 190

Đinh Xuân Thắng (2007), Giáo trình Ô nhiễm không khí, NXB ĐHQG Trần Ngọc Chấn(2004), Ô nhiễm không khí và xử lý khí thải, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Phạm Ngọc Đăng (2002), Môi trường không khí, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội. Phạm Ngọc Đăng (2004), Quản lý môi trường đô thị và Khu công nghiệp, NXB Xây Dựng.

hàm lượng nhỏ nhưng ảnh hưởng đáng kế đến nhiệt độ ngọn lửa, giới hạn cháy. Khí biogas có tính dễ cháy nếu được hòa lẫn với không khí ở tỉ lệ từ 6 đến 25%. Nếu hỗn hợp khí biogas có chứa khí CH4 chiếm 60% sẽ cháy tốt khi được hòa trộn với không khí ở tỉ lệ 1/9 – 1/10.

191

PHẦN B: THỰC HÀNH

CHƯƠNG 1: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG THỰC HÀNH VI SINH.

BÀI 1: KỸ THUẬT CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG.

1.1. Mục đích thí nghiệm

Nắm rõ các dạng khác nhau của môi trường nuôi cấy, thành phần của chúng và đặc tính

của từng loại.

Thực hiện được các thao tác đóng nắp ống nghiệm.

Biết cách chuẩn bị và pha chế môi trường.

Chuẩn bị được các loại môi trường đặc trưng, không đặc trưng và môi trường thạch.

Hiểu rõ nguyên tắc về khử trùng.

Biết cách khử trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm.

Sử dụng nồi hấp an toàn và hiệu quả.

Vật liệu và dụng cụ

Escherichia coli (ATCC 11229) được nuôi cấy từ 24-48h trên canh trường tryptic.

Nồi hấp

Đĩa Petri

Ống nghiệm nuôi cấy VSV.

Giá đỡ hoặc rổ đựng ống nghiệm.

Nắp ống nghiệm.

Môi trường tổng hợp.

Môi trường tự nhiên

Bình Erlen 2 lít.

Pipet 10 ml.

Giấy bao gói.

Cân.

192

Agar.

Găng tay bằng vải chịu nóng.

Bể điều nhiệt ở 48-500C.

Bể nước đang sôi.

Giấy nhôm.

Đũa thủy tinh.

Đèn cồn hoặc đèn Busen.

1.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa

Trước hết, chất dinh dưỡng là chất có thể hình thành một môi trường mà môi trường này có thể đáp ứng được yêu cầu cho sự phát triển của sinh vật, nó phải nắm được những nhu cầu cơ bản của sinh vật. Bất kì một môi trường nào muốn thích hợp để sử dụng cho một nhóm sinh vật cụ thể đều phải thỏa 7 yếu tố sau: nước, cacbon, năng lượng, nitơ, khoáng, yếu tố phát triển và pH. Sau đây là vai trò của mỗi yếu tố.

Nước: Chất nguyên sinh chứa từ 70 % đến 85% là nước. Nước có trong mỗi tế bào sinh vật cùng với nước trong môi trường và những phân tử tự do ở bên trong và ngoài tế bào sẽ cung cấp những chất mang có vai trò mang chất dinh dưỡng đi vào hoặc bài tiết chất thải ra ngoài. Tất cả những enzym điều chỉnh phản ứng hóa học, những phản ứng này diễn ra ở bên trong tế bào, và những phản ứng này chỉ xảy ra khi tế bào chứa đủ lượng nước. Chất lượng nước dùng để chuẩn bị môi trường thì rất quan trọng. Nước máy thì độ cứng lớn, có nồng độ ion Ca2+, Mg2+ cao. Các ion này không hòa tan được photphat, nếu có mặt peptone và dịch chiết thịt bò, các ion này có thể sẽ bị kết tủa. Biện pháp tốt nhất là luôn sử dụng nước cất.

Cácbon: Dựa vào nguồn cacbon mà sinh vật sử dụng, sinh vật được chia làm hai nhóm. Nhóm có thể sử dụng cacbon từ CO2 để tổng hợp các nguyên liệu tế bào gọi là sinh vật tự dưỡng. Nếu chúng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ như nguồn cacbon thì gọi là sinh vật dị dưỡng. Bên cạnh cơ quan tổng hợp nguồn cacbon, sinh vật dị dưỡng cũng phụ thuộc vào CO2, nếu khí từ môi trường bị ngăn chặn hoàn toàn, sự phát triển của chúng sẽ bị giảm nhanh, đặc biệt trong giai đoạn mới bắt đầu nuôi cấy. Nhu cầu cacbon của cơ quan cũng đa dạng như chính các loại sinh vật. Có những sinh vật chỉ cần một hợp chất đơn giản như axit acetic, số khác có thể cần nhiều chất dinh dưỡng hữu cơ với mức độ phức tạp khác nhau.

Năng lượng: Sinh vật có những sắc tố, mà sắc tố này làm cho chúng có thể sử dụng được năng lượng mặt trời gọi là sinh vật quang tự dưỡng. Môi trường cho các sinh vật này không có thành phần cung cấp năng lượng. Sinh vật tự dưỡng không có thể sử dụng năng lượng mặt trời nhưng nó có thể oxi hóa chất hữu cơ đơn giản tạo năng lượng được gọi là sinh vật hóa tự

193

dưỡng. Năng lượng dùng cho các sinh vật này có thể được chuyển hóa từ các chất đơn giản như nitrite, nitrate, hoặc sulfide. Hầu hết vi khuẩn được xếp vào loại sinh vật dị dưỡng, những loài này đòi hỏi có nguồn năng lượng như đường hoặc amino acids. Trong môi trường, tổng số năng lượng dùng trong quá trình hóa tổng hợp chiếm khoảng 0.5% so với các hoạt động khác. Một số ít vi khuẩn được xếp vào nhóm quang dị dưỡng. Những sinh vật này có sắc tố quuang hợp nên chúng có thể sử dụng ánh sáng mặt trời làm năng lượng. Nguồn cacbon của chúng phải là một hợp chất hữu cơ như là rượu.

Nitơ: Mặc dù các sinh vật tự dưỡng có thể sử dụng nguồn nitơ tự nhiên, sinh vật dị dưỡng lấy nitơ từ amino axit và hợp chất trung gian của protein như peptide, proteoses và peptones. Dịch chiết thịt bò và peptone đã được sử dụng trong nước thịt dinh dưỡng cung cấp nitơ cho sự phát triển của sinh vật dị dưỡng.

Chất khoáng: Tất cả sinh vật đều đòi hỏi vài nguyên tố như Na, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Zn, P, Cu, có để phát triển bình thường. Vi khuẩn cũng không ngoại lệ. Lượng được đòi hỏi rất ít.

Yếu tố phát triển: Bất kì thành phần thiết yếu nào của nguyên liệu tế bào mà sinh vật không có khả năng tổng hợp được nó từ nguồn cacbon và nitơ cơ bản thì thành phần đó được xếp vào nhóm yếu tố phát triển. Yếu tố này bao gồm amino axit và vitamin. Nhiều sinh vật dị dưỡng được đáp ứng yếu tố phát triển từ dịch chiết thịt bò của canh dinh dưỡng. Hầu hết những mầm bệnh hiếm đòi hỏi môi trường giàu dưỡng chất như máu agar có dư thừa yếu tố phát triển.

pH: Sự phát triển của sinh vật trong môi trường đặc trưng có thể hoàn toàn bị ức chế nếu pH của môi trường không nằm trong giới hạn cho phép. Hệ enzyme của vi sinh vật bị ảnh hưởng lớn bởi yếu tố này. Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt nhất trong khoảng pH =7, hoặc thấp hơn, pH của môi trường dinh dưỡng có thể điều chỉnh pH=6.8. Những mầm bệnh thì ngược lại, chúng thích hợp với pH kiềm hơn. Trypticase soy broth, môi trường này thích hợp cho những mầm bệnh hiếm, nó có thể được điều chỉnh pH=7.3.

Các loại môi trường cơ bản.

Môi trường của vi sinh vật là gì? Môi trường của vi sinh vật là nguồn thức ăn mà vi sinh vật sử dụng được để sinh trưởng và phát triển. Môi trường có thể tồn tại ở ba dạng: lỏng, đặc, bán lỏng.

Môi trường lỏng: Bao gồm các chất dinh dưỡng như: citrate, glucose, litmus milk,…Những môi trường này được dùng cho việc tăng sinh nhiều loại sinh vật, khảo sát sự lên men và nhiều cuộc kiểm tra khác như là định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN, phương pháp đo độ đục…vv

194

Môi trường đặc: Được tạo ra bằng cách cho thêm vào môi trường lỏng tác nhân gây đặc như: agar, gelatin, silica gel. Một tác nhân gây đặc tốt là tác nhân mà nó không bị vi sinh vật tiêu thụ, đồng thời không ức chế vi khuẩn phát triển và không hóa lỏng ở nhiệt độ phòng. Agar và silicagel không hóa lỏng ở nhiệt độ phòng và có rất ít loại sinh vật sử dụng nó. Ngược lại, Gelatin thì bị thủy phân bởi khá nhiều loại sinh vật và hóa lỏng ở nhiệt độ phòng. Nutrient agar, blood agar, and Sabouraud’s agar là những ví dụ về môi trường đặc mà những môi trường này được dùng cho việc tạo ra bề mặt cho khuẩn lạc của vi khuẩn và nấm mốc phát triển. Trong môi trường đặc thì tác nhân gây đặc là agar thì người ta thêm vào đó khoảng 15- 20g trên một lít môi trường. Trong các bài tập tới, chúng ta sẽ thấy sự phát triển của khuẩn lạc trên bề mặt của môi trường là hết sức cần thiết khi cần phân lập sinh vật từ hổn hợp nuôi cấy.

Môi trường bán lỏng: Ở giữa môi trường đặc và môi trường lỏng. Mặc dù chúng tương tự như môi trường đặc ở chổ là chúng chứa tác nhân gây đặc như agar, gelatin, tuy nhiên chúng giống jell hơn do nó chứa tỉ lệ chất gây đặc thấp hơn. Môi trường này đặc biệt được dùng để xác định xem nó có chứa vi khuẩn có khả năng di động hay không.

Môi trường có thể được chuẩn bị trước để đảm bảo về mặt kĩ thuật,vì vậy cần phải biết bảng tổng hợp chính xác của nó. Những môi trường này thường được điều chế từ những hợp chất hóa học mà những hợp chất này đã được làm tinh sạch và định rõ tính chất. Môi trường canh dinh dưỡng là môi trường có thành phần tổng hợp không chính xác gọi là môi trường không tổng hợp.Cả hai chất là dịch chiết thịt bò và peptone trong môi trường canh dinh dưỡng không chính xác ở bảng tổng hợp.

Môi trường đặc biệt: Hai loại môi trường đặc biệt sẽ được sử dụng rộng rãi trong sách hướng dẫn này là môi trường chọn lọc và môi trường phân lập.

Môi trường chọn lọc: Môi trường chọn lọc là môi trường mà chỉ cho phép những dạng vi sinh vật nhất định phát triển ở chính môi trường đó bởi vì:

- Thiếu chất dinh dưỡng cần thiết , điều đó gây bất lợi cho hầu hết các sinh vật nhưng không phải là tất cả.

- Sự có mặt của chất ức chế, những chất này ngăn cản những loại sinh vật nào đó để chúng phát triển.Chất ức chế có thể là muối NaCl, axit, chất độc hóa học (tím tinh thể), kháng sinh, (streptomycin) hoặc một vài chất khác, ví dụ đối với môi trường BGBL có chất ức chế là muối mật hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương, trong môi trương EMB có chất hạn chế là eosin…

Môi trường phân lập: Là môi trường có chất, mà chất này là nguyên nhân tạo ra sư khác nhau về hình thức để cho biết vi sinh vật là nó chứ không phải là loài khác, cho phép phân lập một loài từ nhiều loài.Trong một vài trường hợp, môi trường có cùng công thức của hai môi

195

trường chọn lọc và phân lập.Ví dụ như môi trường Levine EMB agar , dùng để xác định sự có mặt của coliforms trong phân tích nước.

1.3. Các bước tiến hành chuẩn bị môi trường.

a) Chuẩn bị ống nghiệm.

Trong phòng thí nghiệm, sinh viên sẽ làm việc với người cộng sự của mình, chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường, những ống này sẽ được sử dụng trong các cuộc thí nghiệm sắp tới. Giáo viên sẽ hướng dẫn cho sinh viên biết sinh viên phải chuẩn bị môi trường nào. Ghi lại số lượng ống nghiệm đối với mỗi loại môi trường ví dụ:

Canh dinh dưỡng……………………

Thạch dinh dưỡng lỏng ……………..

Thạch dinh dưỡng nghiêng …………

Môi trường khác ……………………

Có vài cỡ ống ngiệm khác nhau được dùng để làm khuôn, nhưng hai cỡ phổ biến nhất là 16mm và 20mm( đường kính), dài 15cm. Lựa chọn ống nghiệm có kích thước chính xác, phải tuân theo những nguyên tắc sau:

Ống nghiệm lớn (đường kính 20mm): sử dụng những ống nghiệm này để đổ môi trường i.e., nutrient agar, Sabouraud’s agar, EMB agar, etc. Đĩa petri cũng dùng cho việc đổ môi trường.

Ống nghiệm nhỏ (đường kính 16mm), dùng những ống này cho tất cả các loại canh, thạch nghiêng và thạch đứng. Nếu trong ống đã được làm sạch và được bảo đảm không bị nhiễm bụi và các nguồn ô nhiễm khác, bên ngoài ống nghiệm cũng cần được làm sạch. Nếu chúng cần được làm sạch, cọ rửa bên ngoài, bên trong với nước ấm, và chất tẩy rửa ta dùng cây cọ để rửa ống nghiệm. Rửa 2 lần, lần đầu dùng nước máy, cuối cùng dùng nước cất để tráng hết chất tẩy rửa ra khỏi ống nghiệm. Đặt chúng lên giá đỡ ống nghiệm, úp ngược để chúng được ráo nước. Không lau khô bằng khăn.

196

Hình 1-1: Chuẩn bị hóa chất và ống nghiệm để nấu môi trường.

b) Cân hóa chất và nấu môi trường.

Lượng môi trường mà sinh viên cho vào mỗi đợt có thể sẽ quyết định khá chính xác khả năng thiếu hoặc dư môi trường.

Đo chính xác lượng nước cần dùng cho vào mẻ, sau cho thể tích cho vào mỗi ống phải đáp ứng yêu cầu:

ống nghiệm đỗ đĩa:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12ml

Thạch sâu:………... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6ml

Thạch nghiêng……... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4ml

Môi trường lỏng….. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5ml

Môi trường lỏng dùng để lên men………….. . . . . . 5-7ml

Xem xét hướng dẫn ghi ở nhãn bình để quyết định cần cho bao nhiêu gam vào trong 1,000ml. Sau đó, phải xem sinh viên cần sử dụng bao nhiêu nước để chọn phương pháp thích hợp. Cân lượng hóa chất này bằng cân rồi đổ nó vào cái cốc có nước. Nếu môi trường không có agar, pha loãng như bình thường, không dùng nhiệt. Nếu môi trường có agar, đun hỗn hợp trên đèn Busen hoặc trên bếp điện cho đến khi sôi, để tránh hiện tượng nước trào ra ngoài, trước khi đun, dùng bút chì đánh dấu mực môi trường cao nhất có thể trên beaker. Khi nào nó sủi bọt thì ngưng đun. Nếu sử dụng bếp điện, môi trường phải được đặt cao hơn so với bếp, nếu không nó sẽ sôi trào ra khỏi vật chứa. Cẩn thận: phải luôn khuấy trộn từ dưới đáy bình với đũa thủy tinh để môi trường không bị cháy ở dưới đáy beaker và lưu ý chỉ ngừng lại khi agar đã tan hoàn toàn.

197

Kiểm tra mực môi trường với mực đã đánh dấu trên beaker, chú ý nếu lượng nước bị thất thoát đi, ta thêm nước cất vào đúng mực nước quy định. Giữ nhiệt độ môi trường khoảng 600C để tránh sự đông đặc lại. Môi trường sẽ đông đặc ở nhiệt độ 400C.

Hình 1-2: Cân các thành phần chất để cho vào nấu môi trường.

Hình 1-3: Cho thành phần môi trường vào nước với lượng nước xác định.

198

Hình 1-4: Đun môi trường và khuấy đều.

c) Chỉnh pH.

Mặc dù, môi trường khan có tác nhân đệm để giữ pH môi trường trong khoảng cho phép, tuy nhiên pH của môi trường trong mẻ có thể khác so với pH lúc đầu cho vào bình trộn. Do đó, trước khi cho môi trường vào ống nghiệm sinh viên nên kiểm tra lại pH và chỉnh đến pH cần thiết. Nếu máy đo pH có sẵn và nó đúng tiêu chuẩn thì sinh viên dùng nó để kiểm tra pH cho môi trường của sinh viên. Nếu môi trường cần phải chỉnh lại pH, sinh viên dùng HCl và NaOH để chỉnh nó. Nếu không có máy đo pH, sinh viên dùng giấy đo pH để kiểm tra. Chỉnh pH như sau:

Vật liệu:

Beeaker chứa môi trường

Axit và bazơ dùng để hiệu chỉnh (thiết lặp cả 2 nồng độ 1N và 0.1N cho HCl và NaOH)

Đũa thủy tinh

Giấy đo pH

Máy đo pH (nếu có)

- Lấy 1 mảnh giấy đo pH cho vào môi trường để biết được pH của môi trường.

- Nếu pH quá cao, thêm vào một đến 2 giọt HCl 1N để hạ thấp pH, nếu pH sai lệch rất ít thì dùng HCl 0,1N để chỉnh, dùng đũa thủy tinh để khuấy đều dung dịch.

- Nếu pH quá thấp, thêm vào từng giọt NaOH, để nâng pH, nếu pH sai lệch ít thì dùng dd NaOH 0.1N, sai lệch nhiều dùng dd NaOH 1N. Dùng đũa thủy tinh để khuấy đều dd.

199

Hình 1-5: Tiến hành chỉnh pH bằng máy.

d) Đổ ống nghiệm.

Khi pH của môi trường đã được chỉnh, môi trường sẽ được phân vào trong các ống nghiệm. Nếu sử dụng pipet tự động, người hướng dẫn sẽ cài dặt cho sinh viên. Máy này có thể được dùng để phân phát môi trường với lượng và tốc độ tùy ý. Khi cần đổ quá nhiều ống nghiệm, sinh viên nên sử dụng pipet tự động. Đối với mẻ ít hơn, phương pháp dùng phễu thì thích hợp để sử dụng. Khi dùng phễu đổ ống nghiệm , ta sử dụng quy trình sau:

Vật liệu

Đưa ra mức tiêu chuẩn

Hệ thống phễu ( phễu thủy tinh, ống cao su, kẹp).

Thước đo ( cỡ nhỏ).

- Môi trường được đổ vào ống nghiệm với lượng nhất định.

- Đổ môi trường vào phễu và dẫn vào ống nghiệm với mực thích hợp. Nhìn vào các ống chuẩn để sinh viên có thể biết được lượng môi trường có thể cho vào.

- Giữ beaker chứa môi trường trên bếp nếu môi trường có agar.

200

Hình 1-6: Cho môi trường vào ống nghiệm bằng máy Hình 1-7: Cho môi trường vào ống nghiệm bằng phểu.

e) Đậy nắp ống nghiệm.

Trước khi tiệt trùng ta phải bịt kín các ống nghiệm. Nút nhựa thì thích hợp cho hầu hết các trường hợp. Tất cả các nút xoay đậy ống nghiệm, đều có rãnh ở bên trong, khớp với rãnh của ống nghiệm, và phòng ngừa không khí có thể len vào các kẻ hở lúc hấp tiệt trùng. Nếu sinh viên sử dụng ống nghiệm, với nút có răng, trước khi tiệt trùng những nút này không nên siết quá chặt, thay vào đó mỗi ống phải được vặn hơi lỏng về bên trái. Nếu nắp vặn không vừa với cỡ ống nghiệm có sẵn, những ống này có thể được đậy bằng các nút bông. Nút bông được làm đúng cách thì nên vừa chặt với ống, để nó không dể bị bung ra ngoài.

201

Hình 1-8: Đậy nắp ống nghiệm.

f) Triệt trùng môi trường và dụng cụ thí nghiệm.

Ngay sau khi môi trường được cho vào ống nghiệm, chúng phải được đem tiệt trùng. Sinh vật trên thành ống nghiệm, trong nước tiệt trùng, trong môi trường khan sẽ bắt đầu phát triển trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, phá hỏng môi trường. Giai đoạn tiệt trùng ống nghiệm chứa môi trường nên được đặt trong giá và có dán nhãn bên ngoài giá đỡ. Nhãn nên nêu rõ loại môi trường, ngày và tên của sinh viên. Sự tiệt trùng có thể thực hiện ở nồi hấp. Sau đây là những chú ý quan trọng khi sử dụng nồi hấp:

Cùng với người hướng dẫn, kiểm tra quy trình sử dụng đối với những dạng nồi hấp khác nhau. Sự tiệt trùng hoàn toàn xảy ra ở 2500F (121.6°C). Để đạt được nhiệt độ này, nồi hấp nên được mở với áp suất 15spi. Để đạt được chính xác nhiệt độ này, phải có khí dự trữ trong buồng đốt, phòng ngừa không khí thất thoát ra ngoài. Ngoài ra, cần phải cho hơi nước vào để đẩy không khí ra ngoài trước khi đóng nó lại.

Không để nồi quá đầy. Không nên cố gắng để hết vào, khi thấy có quá nhiều môi trường cần hấp. Phải có khoảng cách nhất định giữa các giá đỡ chứa môi trường để hơi nước có thể lưu thông.

Điều chỉnh thời gian tiệt trùng theo thể tích từ khi để vào. Lượng để vào nhỏ có thể hấp từ 10 đến 15 phút. Nếu môi trường để đầy nồi hấp, yêu cầu phải hấp tới 30 phút để tiệt trùng hoàn toàn.

Thao tác nồi hấp

1. Người chỉ dẫn sẽ giải thích cho bạn cách sử dụng nồi hấp. 2. Cho vào nồi hấp các môi trường nuôi cấy đã dược chuẩn bị. 3. Đóng và khóa nắp nồi. 4. Thiết lập thời gian cho nồi hấp khoảng 15 phút hoặc lâu hơn và chỉnh tốc độ xả khí

mức độ thấp.

5. Đảm bảo nhiệt độ bên trong nồi hấp đạt 1210C. 6. Khởi động nồi hấp bằng cách nhấn nút Start hoặc nút gạt.

Khi thời gian khử trùng kết thúc, áp suất trong nồi giảm xuống 0, chúng ta bắt đầu mở nắp và lấy cẩn thận dụng cụ có chứa môi trường ra bằng găng tay chống nóng.

202

Hình 1-9: Triệt trùng môi trường nuôi cấy.

Hầu hết các môi trường và vật dụng khác đều có thể được khử trùng ở 1210C bằng hơi nước bão hoà. Thông thường, những vật bằng thủy tinh như pipet và đĩa Petri phải được khử trùng trước khi sử dụng. Nếu khử trùng bằng hơi nước dễ làm cho chúng ẩm ướt . Vì vậy, thường sử dụng hơi nóng khô để khử trùng. Những dụng cụ bằng thủy tinh được đặt trong tủ sấy hoat động ở khoảng nhiệt độ từ 1600C và 1700C. Do không hiệu quả bằng hơi nước nóng nên vật liệu được giữ trong tủ sấy khoảng 2 giờ hoặc có thể lâu hơn. Nhiệt độ của hơi nóng khô không được vượt quá 1800C vì có thể gây cháy các loại nhựa hoặc giấy bao gói.

Nhiều vật dụng nhạy cảm với nhiệt như đĩa Petri bằng nhựa (chỉ dùng1 lần) và các ống nối sẽ được khử trùng bằng khí ethylene oxide. Khí này có thể tiêu diệt bào tử lẫn tế bào sinh dưỡng và phá hủy các tế bào protein. Đây là một tác nhân khử trùng đặc biêt hiệu quả vì nó có thể thấm vào bên trong những vật liệu bao gói kể cả những gói bằng nhựa.

g) Để thạch nghiêng sau khi triệt trùng.

Nếu sinh viên có giá đỡ ống nghiệm, sinh viên có thể sử dụng nó để tạo thạch nghiêng, cần đặt ống nghiệm hơi ngang ngay khi lấy chúng ra khỏi nồi hấp. Cách dể nhất để làm việc này là sử dụng thanh cao su dài (đường kính 0.5), để giúp cho việc nâng phần nút của ống nghiệm để cho ống nghiệm nằm yên. Quá trình đông đặc có thể diễn ra từ 30-60 phút.

Môi trường khác: ống nghiệm chứa broth, agar deeps, nutrient gelatin, ...sau khi lấy ra từ nổi hấp thì nên để cho chúng nguội đi ở nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị đĩa thạch

Như đã hướng dẫn ở các mục trước và trong các hình 13.2 a-f , chúng ta sử môi trường tryptic agar đã khử trùng để tạo đĩa thạch.

203

Khi đĩa nguội( agar hoá rắn), lật ngược đĩa lại tránh làm ngưng tụ hơi ẩm trên bề mặt.

Tất cả các đĩa và ống nghiệm được ủ tối thiểu 24 giờ để đảm bảo độ vô trùng trước khi sử dụng.

1.4. Câu hỏi

1. Ba dạng môi trường chủ yếu dùng trong nuôi cấy VSV là gì?( phân loại theo trạng

thái vật lý).

2. Phân biệt môi trường nuôi cấy, môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên. 3. Tại sao môi trường nuôi cấy phải khử trùng trước khi sử dụng? 4. Nêu 3 phương pháp khử trùng môi trường và dụng cụ? 5. Tại sao phải úp ngược đĩa Petri sau khi nguội? 6. Tại sao phải làm nguội môi trường nuôi cấy đến khoảng 48- 500C trước khi đỗ đĩa?

204

BÀI 2: KỸ THUẬT PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤY TRÊN ĐĨA PETRI VÀ PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG KẾT HỢP VỚI ĐỔ ĐĨA.

2.1. Mục đích thí nghiệm

Sử dụng pipette đúng cách

Sử dụng que cấy thẳng và que cấy vòng đúng cách

Sử dụng kỹ thuật vô trùng để chuyển vi sinh vật hoặc sinh khối của nó

Hiểu được môi trường mình đang sử dụng là vào mục đích gì

Chuẩn bị được các môi trường phân lập

Nói được cách mà sinh khối vi sinh vật được bảo quản

Vật liệu và dụng cụ

Máy xoáy trộn dung dịch (nếu có); que cấy vòng; que cấy thẳng; đèn cồn; pipetteman; pipette; vật hút pipette (bóp cao su); canh trường tryptic ủ qua 24h và thạch nghiêng tryptic đã cấy Serratia marcescens; chất nhuộm (ATCC e13880) hoặc Micrococcus roseus (ATCC 186) hoặc môi trường thạch đĩa; ống canh trường tryptic; thạch nghiêng tryptic; thạch sâu tryptic; bút chì sáp

Pipette là dụng cụ thường được sử dụng trong quá trình xác định một lượng thể tích môi trường lỏng, chuẩn bị dãy pha loãng môi trường (đã chứa vi sinh vật), và phân phối chất hóa học vào cho từng ống. Có 2 loại pipette thường được dùng là pipette có vạch chia nhỏ (cũng được gọi là huyết thanh pipette) và pipette (pipette đo lường) được đặt tên Francis Mohr một nhà dược sĩ Mỹ ở thế kỉ 19. Pipette có vạch chia nhỏ để lấy thể tích chính xác chất lỏng; pipette thường để lấy một thể tích chất lỏng không cần chính xác, lượng chất lỏng còn lại ở đầu pipette không nên hút ra hết. Để hút pipette sử dụng bóp cao su hoặc dụng cụ hút khác. Không hút bằng miệng. Thể tích chất lỏng được đọc ở phần dưới của bề mặt cong chất lỏng. Cho vào miệng của pipette một mảnh vải bông nhỏ trước khi khử trùng nó. Không được làm nhiễm dụng cụ hút pipette và hộp đựng pipette vô trùng. Nên để vải bông mềm dưới những cây pipette để tránh làm nứt vỡ nó sau khi sử dụng pipette xong, bỏ chúng vào hộp đem đi tiệt trùng ở nồi hấp, sấy khô. Pipette cũng có thể được tiệt trùng trong tủ sấy. Để sử dụng đúng pipette, giữ pipette trong một tư thế nằm thẳng và cẩn thận loại bỏ lượng lỏng ở đỉnh với một sự chuyển động xoắn đầu pipette, lượng lỏng ở đỉnh sẽ theo lực xoắn chảy ra. Không đặt pipette xuống trước khi sử dụng, vì như thế rất dễ bị nhiễm khuẩn. Sau khi một pipette được sử dụng, nó phải lập tức được đặt xuống và hoàn toàn nhúng chìm trong một hộp chứa chất khử trùng 3 tới 5% Ly-sol.

205

Pipetting. (a) pipette có vạch chia nhỏ (huyết thanh pipette). (b) pipette thường hoặc Mohr pipette. (c) Bơm plastic được gắn với pipette, vặn bánh răn lên xuống để hút chất lỏng hoặc đẩy bỏ chất lỏng ra khỏi pipette.(d) Bóp cao su chuyên dụng, khi ấn vào van A, bóp bóp cao su, B, nó sẽ xẹp xuống. Để hút chất lỏng ấn vào van S, để đẩy bỏ chất lỏng, ấn vào van E. (e) Một phát minh bơm pipette điện, phân phối 1-150 ml thể tích lỏng. Chỉ cần ấn nút nó sẽ tự động hút đầy và đẩy bỏ chất lỏng ra khỏi pipette. (f ) Một lọai bơm pipette an tòan, là lọai bóp cao su hút chất lỏng từng lượng nhỏ một, cứ việc hút chất lỏng lên rồi lấy bóp cao su ra, điều chỉnh mức chất lỏng bằng ngón tay trỏ. (g) Thể tích trên pipette được đọc dưới mặt khum của chất lỏng

Que cấy thẳng, và que cấy vòng được sử dụng để chuyển khối vsv trong điều kiện vô trùng từ môi trường lỏng hoặc môi trường thạch. Cả hai loại que cấy đều gồm các bộ phận: tay cầm, cán tay cầm, phần cố định đầu que cấy, đầu que cấy là sợi kim loại thẳng đối với que cấy thẳng, có vòng ở cuối đối với que cấy vòng. Trước khi hay sau khi sử dụng que cấy phải khử trùng bằng cách đun trên ngọn lửa đèn cồn, nếu làm đúng thì sợi kim loại que cấy phải được đun đỏ nóng.

206

Sinh khối vsv được chuyển từ môi trường này sang môi trường khác trong một quy trình cụ thể và vô trùng (vô trùng có nghĩa là tránh sinh khối vsv được chuyển bị nhiễm loại vsv không mong muốn khác). Kỹ thuật vô trùng này rất quan trọng, nó sẽ được sử dụng trong hầu hết các bài tập trong tài liệu này. Đa số vi sinh vật luôn luôn có mặt trong phòng thí nghiệm, như vậy nếu kỹ thuật vô trùng được ứng dụng không đúng, thì khả năng nhiễm khuẩn từ bên ngoài môi trường là rất cao và nó sẽ đem lại kết quả không mong muốn. Kỹ thuật vô trùng thích hợp cũng bảo vệ người làm ở phòng thí nghiệm.

2.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa

Sau khi cấy ria phân lập vi sinh vật trên đĩa petri, chọn khuẩn lạc đứng riêng lẻ (phải trên đường cấy) phát triển tốt, dùng que cấy thẳng chuyển khuẩn lạc đó sang môi trường ống nghiệm như là thạch nghiêng tương tryptic (loại thạch phụ thuộc vào chủng vi sinh vật). Nên lấy vi sinh vật từ tâm của khuẩn lạc để truyền khối, bởi vì tâm khuẩn lạc ít bị nhiễm hơn so với rìa của khuẩn lạc. Mỗi ống thạch nghiêng lúc này tiêu biểu cho sự phát triển một loại vi sinh vật thuần chủng được gọi là nuôi cấy giống gốc. Một trong những vấn đề quan trọng trong môn vi sinh vật học phòng thí nghiệm là sự bảo quản nuôi cấy giống gốc thuần chủng của một loại vi sinh vật trong một thời gian dài. Lý tưởng nhất, là ứng dụng kỹ thuật làm lạnh hay sấy khô trong nuôi cấy giữ giống vi sinh vật, khi đó vi sinh vật được dự trữ trong một tình trạng ngủ. Lưu giữ vi sinh vật hiếu khí trong một thời gian ngắn khoảng 1-3 tháng bằng cách cấy chúng lên thạch nghiêng để trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 4-10°C. Nên sử dụng ống nghiệm có nắp cho những ống thạch nghiêng này để giảm thiểu môi trường bị khô trong quá trình lưu giữ. Một trong những cách giữ môi trường trong thời gian dài là phủ kín nó bởi dầu khoáng vô trùng để tránh sự mất nước. Dầu khoáng được khử trùng bằng cách đun nó ở nhiệt độ 110°C trong một giờ. Sau khi vi sinh vật trên bề mặt thạch nghiêng phát triển, phủ nó với lớp dầu vô trùng, và lưu giữ ở nhiệt độ thường. Một số chủng được lưu giữ dưới lớp dầu như: Bacillus, hầu hết các loại thuộc họ Enterobacteriaceae, một số loại Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, và Streptococcus. Một số chủng không thể lưu giữ dưới lớp dầu như: Azotobacter và Leuconostoc. Trong một vài trường hợp, lưu giữ vi sinh vật trong một thời gian dài không cần

207

phủ lên nó một lớp dầu. E. coli và một số thành viên trong họ Enterobacteriaceae, staphylococci, và enterococci có thể được lưu giữ trong vài năm ở nhiệt độ phòng với quy trình sau:

Cấy sâu vsv vào môi trường dinh dưỡng thạch agar hoặc 0.7% agar trong nước cất. Ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, vặn chặt nắp ống nghiệm và làm kín nó với paraffin. Bảo quản chúng ở chỗ an toàn, ở nhiệt độ phòng. Cách tốt nhất là bảo quản chúng ở tình trạng lạnh khô trong một thời gian dài. Bỏ bớt những giai đọan cấy truyền không cần thiết, và giảm thiểu những biến đổi không mong muốn trong quá trình bảo quản. Trong quá trình lạnh đông, huyền phù vi sinh vật phát triển trong một số môi trừơng bảo vệ tiệt trùng như sữa, huyết thanh, hoặc dung dịch 3% lactose. Lấy lượng nhỏ trong lớp dày huyền phù này cấy sang ống bảo quản. Lạnh đông nhanh trong hỗn hợp đá khô với cồn. Dịch huyền phù lạnh đông này được làm khô dưới máy hút chân không (trong khi vẫn còn lạnh đông chúng), làm kín ống bảo quản. Những ống kín này có thể được bảo quản trong nhiều năm. Đối với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, hoặc một số lọai kỵ khí tùy tiện, chúng sẽ khó sống được nếu có mặt khí O2. Chúng được bảo quản trong môi trường thạch đâm sâu. Trong quy trình này, ta chuẩn bị ống nghiệm thạch đứng, sau đó dùng que cấy thẳng lấy sinh khối vi sinh vật, rồi đâm thẳng vi sinh vật xuống sâu dưới thạch để vsv mọc sâu bên trong thạch, đó là điều kiện kỵ khí thích hợp cho nó phát triển, sau đó có thể bảo quản lạnh. Những vsv kỵ khí có thể được bảo quản trong canh trường thioglycollate

3.3. Tiến hành thí nghiệm

2.3.1. Kỹ thuật phân lập bằng phương pháp cấy trên đĩa petri.

Khi chúng ta nghiên cứu hệ vi khuẩn trong cơ thể sinh vật, đất, nước, thức ăn hoặc bất cứ phần khác của môi trường sống, chúng ta sẽ sớm phát hiện rằng vi khuẩn tồn tại trong nhiều quần thể sinh vật. Rất hiếm trường hợp chúng xuất hiện như những loài đơn độc. Chúng ta có thể nghiên cứu các đặc trưng nuôi cấy, hình thái và sinh lý hóa của một loài riêng biệt, đó là yếu tố cần thiết trước tiên mà sinh vật được phân lập từ những loài khác mà bình thường được tìm thấy trong môi trường sinh sống của nó. Nói cách khác, chúng ta phải có một sự nuôi cấy thuần vi sinh vật.

- Một số phương pháp nuôi cấy thuần khác nhau từ một hỗn hợp giống nuôi cấy có sẵn cho chúng ta. Hai phương pháp thường sử dụng là đổ đĩa và cấy phân lập. Cả hai kỹ thuật đĩa bao gồm việc làm mỏng vi sinh vật ra để các loài riêng lẻ có thể được chọn từ các loài khác.

- Trong bài tập này bạn sẽ có cơ hội sử dụng cả hai phương pháp trong việc thử phân lập ba loài riêng biệt từ một ống chứa một hỗn hợp các loài. Sự khác biệt chủ yếu giữa ba sinh vật là màu của khuẩn lạc: Serratia marcescens: đỏ, Micrococcus luteus: vàng, Escherichia coli: trắng. Nếu Chromobacterium violaceum được sử dụng để thay thế Micrococcus luteus, ba màu tương ứng sẽ là đỏ, tím, trắng.

208

Cấy phân lập đòi hỏi một lượng nhất định kỹ năng, tuy nhiên nó cũng cần đến kinh nghiệm. Việc thực hiện cấy đĩa sẽ nhận được một kết quả phân lập tốt như mong muốn. Hình 2-1 minh họa khuẩn lạc của một giống tạp lan rộng như thế nào làm thành những vệt cấy trên đĩa. Điều quan trọng là tạo được khoảng cách thích hợp giữa các khuẩn lạc.

Nguyên liệu:

-Bếp điện.

-Đèn bunsen và một beaker nước.

-Một vòng cấy, nhiệt kế, và bút chì ghi nhãn bằng sứ.

-Môi trường agar và một đĩa Petri vô trùng.

-Một hỗn hợp giống: Serratia marcescens, Escherichia coli, Micrococcus luteus (hoặc Chromobacterium violaceum ).

Hình 2-1: Khuẩn lạc của một số loại vi khuẩn.

Nếu đĩa cấy của bạn biểu hiện ba màu của các khuẩn lạc được phân lập một cách rõ rệt (đỏ, trắng, vàng) bạn sẽ có một đĩa phù hợp để nuôi cấy lần hai.

- Chuẩn bị mặt bàn bằng cách tẩy trùng trên bề mặt của nó bằng thuốc tẩy trùng có sẵn trong phòng thí nghiệm (Roccal, Zephiran, Betadine…). Sử dụng vật xốp để lau nó sạch sẽ.

- Ghi tên vào giữa bề mặt của đĩa Petri vô trùng với tên của bạn và ngày. Sử dụng bút chì bằng sứ ghi nhãn.

- Hóa lỏng ống môi trường agar, làm lạnh xuống 50oC và đổ môi trường vào giữa đĩa, thao tác tiếp theo được minh họa trong (hình 2-2). Phải chắc chắn ngọn lửa để gần cổ của ống

209

trước khi đổ vào đĩa để tiêu diệt bất cứ vi khuẩn xung quanh điểm kết thúc của ống. Sau đó đỗ môi trường vào đĩa, nhẹ nhàng xoay đĩa để môi trường phân bố đều, nhưng không làm văng bất cứ phần môi trường nào lên thành đĩa. Thạch, tác nhân làm đặc trong môi trường này trở thành dạng lỏng khi đun nóng và làm lỏng ở gần 42oC. Việc làm lạnh thất bại trước khi đỗ môi trường vào đĩa sẽ dẫn đến sự ngưng tụ của hơi nước trên thành ống. Bất cứ lượng nước nào trên thành ống đều không được cho phép vì nếu nó nhỏ giọt xuống những khuẩn lạc, sinh vật từ khuẩn lạc này có thể lan sang khuẩn lạc khác, làm hỏng toàn bộ kỹ thuật phân lập.

Làm lạnh xuống môi trường xuống 50oC .

Hóa lỏng môi trường dinh dưỡng agar bằng cách đun sôi trong 5 phút

Mở nắp ống và ngọn lửa đốt đến cuối

Đổ các thành phần trong ống vào giữa đĩa Petri và để nó đặc lại.

Hình 2-2: Thao tác đổ agar vào đĩa để cấy thạch.

210

- Cấy vạch trên đĩa là một trong những phương pháp được mô tả trong (hình 2-4). Giáo viên hướng dẫn của bạn sẽ chỉ ra những kỹ thuật mà bạn nên sử dụng.

Cẩn thận: Chắc chắn làm theo cách thức trong (hình 2-3) để tách vi sinh vật ra khỏi môi trường nuôi cấy.

Đốt nóng vòng và dây đến nóng đỏ, ngọn lửa cũng tác dụng lên cán mảnh.

Lắc ống nuôi cấy từ thành này sang thành kia để trộn đều sinh vật. Không cho nước đọng trên nắp ống.

Mở nắp ống và hơ lửa gần cổ ống. Không đặt nắp xuống bàn.

Sau đó dùng que cấy đã làm nguội tối thiểu trong 5s vào, lấy một vòng sinh vật. Tránh chạm vào thành ống

211

Hơ lửa quanh miệng ống cấy một lần nữa Đậy nắp ống lại và đặt ống vào trong giá đỡ.

Cấy vạch vào đĩa, giữ nó như trên hình. Hơ que cấy trước khi đặt nó xuống.

Hình 2-3: Thao tác cấy trên đĩa petri.

- Úp ngược đĩa đem ủ ở 25oC trong 24 – 48h. Bằng cách ủ đĩa úp ngược xuống, thì lượng nước trên thành ( nắp ) giảm đến mức tối thiểu.

2.3.2. Một số cách cấy phân lập.

2.3.2.1. Cấy theo gốc phần tư phương pháp A.

- Cấy một vòng sinh vật khắp vùng 1 gần cạnh của đĩa. Đặt que cấy nhẹ nhàng vào. Đừng đâm thủng môi trường.

- Hơ nóng vòng cấy, làm lạnh trong 5s, thực hiện 5 – 6 đường cấy từ vùng 1 – 2. Đặt nhanh vòng cấy vào vùng môi trường vô trùng trước khi cấy để đảm bảo vòng cấy đã nguội.

- Hơ nóng vòng cấy một lần nữa, làm nguội nó, thực hiện 6 – 7 đường cấy từ vùng 2 – 3.

- Hơ nóng vòng cấy một lần nữa và thực hiện nhiều đường cấy như trên từ vùng 3 -4, sử dụng trên bề mặt còn lại của đĩa.

- Hơ nóng vòng cấy trước khi đặt nó sang một bên.

212

Hình 2-4: Cấy theo gốc phần tư phương pháp A.

2.3.2.2. Cấy theo gốc phần tư phương pháp B.

- Cấy một vòng sinh vật qua lại quanh vùng 1, bắt đầu từ điểm s. Đặt vòng cấy nhẹ nhàng. Tránh đâm thủng vào môi trường.

- Hơ nóng vòng cấy, làm nguội 5s và tiếp xúc với môi trường trong điều kiện vô trùng để đảm bảo vòng cấy đã được làm nguội

- Xoay đĩa 90o trong khi đĩa được giữ kín. Cấy vào vùng 2 một số đường qua lại, lặp lại đường cấy một vài lần.

- Hơ nóng vòng cấy một lần nữa. Xoay đĩa và cấy vào vùng 3 một vài đường, chạm vào vùng cuối một vài lần.

- Hơ nóng vòng cấy, làm nguội và xoay đĩa 90o một lần nữa. Cấy vào vùng 4, tiếp xúc với vùng 3 một vài lần và kéo ra ngoài như minh họa

- Hơ nóng vòng cấy trước khi đặt ra ngoài.

213

Hình 2-5: Cấy theo gốc phần tư phương pháp B.

2.3.2.3. Cấy thành vệt rời.

- Trải vòng cấy sinh vật trong một vùng nhỏ gần cạnh đĩa trong vùng 1. Tránh đâm thủng vào môi trường.

- Hơ nóng vòng cấy và làm nguội nó trong 5s. Tiếp xúc với vùng vô trùng của môi trường sẽ đảm bảo sự làm nguội.

- Từ cạnh vùng 1 thực hiện 7 hoặc 8 vạch cấy thẳng lên bề mặt đối diện của đĩa.

- Hơ nóng vòng cấy một lần nữa, làm nguội vừa đủ, cấy ngang qua những vạch cấy cuối, bắt đầu gần vùng 1.

- Hơ nóng vòng cấy một lần nữa trước khi đặt nó sang một bên.

Hình 2-6: Cấy thành vệt rời.

2.3.2.4. Cấy thành vệt liên tục.

- Bắt đầu từ cạnh của đĩa ( vùng A ) bằng vòng cấy sinh vật, trải sinh vật theo đường đơn liên tục trong trung tâm của đĩa. Sử dụng sức ép nhẹ tránh đâm thủng môi trường.

214

- Xoay đĩa 180o để phần chưa cấy của đĩa tránh xa bạn.

- Không hơ nóng vòng cấy, và sử dụng những bề mặt giống nhau của vòng cấy, tiếp tục cấy một nữa còn lại của đĩa bắt đầu từ vùng B và hướng vào trung tâm.

- Hơ vòng cấy của bạn trước khi đặt nó ra ngoài.

Hình 2-7: Cấy thành vệt liên tục.

2.3.3. Kỹ thuật phân lập bằng phương pháp pha loãng kết hợp với đỗ đĩa.

Phương pháp này phân lập một trong những loài vi khuẩn từ những loài khác bao gồm việc pha loãng một vòng cấy sinh vật với 3 ống môi trường dinh dưỡng agar hóa lỏng bằng một số cách mà một trong những đĩa được đổ sẽ có một số lượng tối ưu sinh vật cung ứng tốt cho việc phân lập. Hình 2-8 minh họa hầu hết quá trình. Một trong những ưu điểm của phương pháp này là nó đòi hỏi một phần ít kỹ năng so với phương pháp cấy vạch trên đĩa. Tuy nhiên, một bất lợi khác là nó đòi hỏi lượng môi trường, ống nghiệm và đĩa cấy nhiều hơn. Tiến hành như sau pha loãng dung dịch vào 3 ống rồi đổ đĩa, sử dụng giống nuôi cấy hỗn hợp như bạn đã dùng trong phương pháp cấy đĩa sọc.

Nguyên liệu:

-Hỗn hợp giống vi khuẩn.

-3 thạch dinh dưỡng để đổ.

-3 đĩa Petri vô trùng.

-Bếp điện.

-Beaker nước.

-Nhiệt kế.

215

Vòng cấy và bút chì ghi nhãn bằng sứ

- Ghi nhãn của 3 môi trường thạch I, II, III bằng bút chì và đặt chúng vào beaker nước đặt trên bếp điện để hóa lỏng môi trường. Để tiết kiệm thời gian, bắt đầu dùng nước máy nếu nó có sẵn.

- Trong khi môi trường của những ống này được đun nóng, ghi nhãn vào giữa đĩa Petri I, II, III.

- Làm nguội môi trường trong các ống xuống 50oC, sử dụng phương pháp giống như sử dụng đối với đĩa cấy sọc

- Theo tiến trình trong hình 2-5, cấy vào ống thứ I một vòng sinh vật từ hỗn hợp giống. Ghi nhớ chuỗi và thao tác trình bày các ống trong hình 2-6

- Cấy vào ống thứ II một vòng sinh vật từ ống thứ I sau khi trộn lẫn hoàn toàn sinh vật trong ống thứ I bằng cách lắc ống từ thành này sang thành kia hay lăn ống một cách mãnh liệt giữa hai lòng bàn tay. Tránh làm văng môi trường. Trả ống thứ I vào bể nước.

- Khuấy ống thứ II để phân tán đều sinh vật và cấy vào ống thứ III bằng một vòng cấy từ ống thứ II. Trả ống thứ II vào bể nước.

- Khuấy ống thứ III, hơ nóng cổ ống và đổ các thành phần của nó vào đĩa thứ III.

- Hơ nóng cổ của những ống thứ I và II đổ thành phần của chúng vào những đĩa tương ứng.

- Sau khi môi trường hoàn toàn hóa đặc, ủ ngược đĩa ở 25oC trong 24 – 48h.

Hình 2-8: Các bước trong kỹ thuật pha loãng để phân lập vi sinh vật.

216

Chuyển một vòng cấy giống vào ống thứ I

Hóa lỏng 3 ống thạch, làm nguội xuống 50oC, giữ trong 10 phút Sau đó lắc giống để phân tán sinh vật, hơ nóng vòng dây và cổ các ống.

Hơ nóng vòng cấy và cổ của hai bình Đậy nắp vào ống và đặt chúng vào giá đỡ.

Phân tán sinh vật trong ống thứ I bằng cách lắc ống hay lăn chúng giữa lòng bàn tay.

217

Đổ dịch cấy vào từng đĩa Petri tương ứng

Chuyển một vòng cấy từ ống thứ I sang ống thứ II, trả ống một vào bể nước Sau đó lắc ống II và chuyển vào ống thứ III, hơ nóng cổ của mỗi ống

Hình 2-9: Thao tác trong việc xử lý ống nghiệm trong việc đỗ đĩa.

2.4. Câu hỏi

1. Hãy nói cách sử dụng hai lọai pipette phổ biến nhất?

2. Mục đích của việc dùng ngọn lửa trong quy trình vô trùng là gì?

3. Mục đích của quá trình nuôi cấy vsv là gì?

4. Trong quá trình nuôi cấy vsv khi nào thì sử dụng que cấy vòng?

5. Những nguyên nhân có thể làn nhiễm môi trường nuôi cấy?

6. Cách mà bạn xác định môi trường của giáo viên hướng dẫn đưa bạn đã được tiệt trùng

trước khi bạn dùng nó?

7. Dấu hiệu của sự phát triển vsv trên môi trường lỏng?

218

CHƯƠNG 2: CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

BÀI 3: THỬ NGHIỆM SINH HÓA TSI (TRIPLE SUGAR IRON AGAR TEST).

3.1. Mục đích thí nghiệm.

- Hiểu được các phản ứng hóa sinh xảy ra trong kiểm tra triple sugar iron agar.

- Phân biệt các giống Enterobacteraceae

- Phân biệt giống Enterobacteriaceae với các giống vi khuẩn khác

- Chạy thử nghiệm sinh hóa TSI

3.2. Chuẩn bị thí nghiệm.

- Canh trường tryptic của Alcaligenes faecalis (ATCC 8750), Escherichia coli (ATCC 11229), Proteus vulgaris (ATCC 13315), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145), và Shigella flexneri (ATCC 12661).

- 5 ống thạch nghiêng triple sugar iron agar.

- Đèn Bunsen.

- Que cấy thẳng.

- Tủ ấm đặt ở 35°C.

- Giá đỡ ống nghiệm.

3.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa

Triple sugar iron (TSI) agar được sử dụng để nhận biết vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae). Nó cũng được dùng để phân biệt Enterobacteriaceae với các trực khuẩn đường ruột gram âm khác bằng khả năng lên men glucosa, lactose, hay sucrose, và giải phóng sulfides từ amoni sunfat có chứa sắt hay natri thiosunfat. Môi trường thạch nghiêng TSI chứa 1% lactose và sucrose, 0.1% glucose. Chất chỉ thị pH phenol red được dùng để phát hiện khả năng sinh axit từ sự lên men hydrat cacbon. KLigler Iron Agar (được phát hiện bởi I.J.Kligler 1917) là một môi trường giống tương tự TSI . Trên ống thạch nghiêng TSI, mẫu được cấy trên bề mặt theo đường zig-zag, sau đó sử dụng que cấy thẳng cấy mẫu đâm vào agar theo đường thẳng. Sau đó ủ 18 đến 24 giờ, để thấy khả năng lên men đường, sinh khí và sinh H2S. Các phản ứng sinh ra trong ống TSI.

 Trường hợp phần thạch ở đáy màu vàng (A) và thạch nghiêng màu đỏ (A), có sự lên men của glucose ( chỉ thị phenol red chuyển sang vàng chứng tỏ có sinh acid ở đáy thạch). Phần thạch nghiêng có màu đỏ (kiềm) (K) vì hàm lượng glucose trong môi

219

trường rất nhỏ và vì thế lượng sinh acid sinh ra không đủ để làm chuyển màu môi trường.

 Thạch ở đáy và thạch nghiêng đều có màu vàng (A) có sự lên men của đường lactose và/hoặc sucrose ( phần thạch đáy và thạch nghiêng có màu vàng nhờ nồng độ của 2 loại đường này cao) dẫn tới sự hình thành acid quá mức trong môi trường.

 Thạch nứt chứng tỏ vi sinh vật có khả năng sinh khí.  Môi trường có màu đen chứng tỏ vi sinh vật có khả năng sinh H2S.  Phần thạch đáy và thạch nghiêng có màu đỏ cho thấy không có đường nào được lên

men và không sinh khí và H2S. Bảng 3.1. Cho thấy phản ứng thường gặp.

Phản ứng TSI Vi khuẩn Đáy thạch Thạch nghiêng Sinh khí Sinh H2S

- + Enterobacter A A

- + Escherichia A A hay K

- + Klebsiella A A

V + Citrobacter A K hay A

+ + Proteus vulgaris A A hay K

V + Edwardsiella A K

- + Morganella A K

- V Serratia A K hay A

- - Shigella A K

+ - Salmonella typhi A K

A = acid, K = alkaline, V = có sự thay đổi giữa hai dạng.

220

Hình 3-1. Phản ứng TSI. Ống (a) có màu vàng ở đáy ống (acid), có màu đỏ ở phần thạch nghiêng (kiềm), H2S sinh ra làm đen phần agar, và không có sinh khí. Ống (b) không có sự hình thành H2S, sinh khí, cả phần thạch nghiêng lẫn phần đáy đều có màu vàng. Phần khí sinh ra ở giữa ống làm nứt thạch và đẩy thạch lên.

ống A ống B

Thạch nghiêng K A

Thạch ở đáy A A

Sinh khí - +

+ - H2S

221

Hình 3-2. Phản ứng TSI. Ống (a) có màu đỏ cả ống (kiềm) và không có acid hay H2S. Ống (b) có màu vàng cả phần thạch nghiêng lẫn phần đáy (acid), không sinh khí và không sinh H2S.

Ống a Ống b

Thạch nghiêng K A

Thạch đáy K A

Sinh khí - -

- - H2S

222

Hình 3-3. Ống (a) là ống không cấy vi sinh vật vào có màu đỏ. Ống (b) vàng cả phần thạch nghiêng lẫn phần đáy (acid), có sinh khí phần dưới của ống, và không sinh H2S, ở ống này thì lactose bị lên men 1 phần. Ống (c) là ống thứ 3 từ trái đếm qua có màu đỏ cả 2 phần thạch nghiêng và phần thạch ở đáy (kiềm), và sinh H2S nhưng không sinh khí. Ống (d) có phần thạch nghiêng màu đỏ (kiềm) còn phần thạch ở đáy có màu vàng (acid), sinh H2S không sinh khí, ống này không có sự lên men của đường lactose.

ống a ống b ống c ống d

K Thạch nghiêng - A K

A Thạch ở đáy - A K

- Sinh khí - + -

+ - - + Sinh H2S

Các phản ứng sinh hóa và kết quả khi tiến hành thử nghiệm sinh hóa trên môi trường TSI agar

 Không có sự lên men của carbohydrate hay sinh H2S

Ví dụ như Alcaligenes faecalis

glucose, lactose, sucrose → glucose, lactose, sucrose

(thạch nghiêng và thạch đáy có màu đỏ)

(Kiềm; thạch nghiêng và thạch đáy có màu đỏ)

223

cysteine → cysteine

(không có màu đen)

 Chỉ lên men đường glucose

Ví dụ như Shigella flexneri

glucose → làm giảm pH của môi trường chuyển thành acid

(đáy thạch màu đỏ) (acid; đáy thạch có màu vàng)

Theo hình 3-2

Lacotse, sucrose → lactose,sucrose

(thạch nghiêng màu đỏ) (kiềm, thạch nghiêng màu đỏ)

Cysteine → cysteine

( không có màu đen)

 Chỉ có đường glucose lên men và sinh ra H2S

Ví dụ: Pseudomonas aeruginosa

Glucose → làm giảm pH thành acid

(thạch đáy có màu đỏ) (Acid, thạch đáy có màu vàng)

Lactose, sucrose → lactose, sucrose

(thạc nghiêng màu đỏ) (kiềm, thạch nghiêng màu đỏ)

cysteine→ sinh H2S

H2S + FeSO4 → FeS

(môi trường có màu đen)

 Lên men Lactose và/hay sucrose và glucose

Ví dụ: Escherichia coli

Glucose → làm giảm pH chuyển thành acid

( thạch đáy có màu đỏ) (acid, thạch đáy có màu vàng)

Lactose và/hay sucrose → làm giảm pH chuyển thành acid

224

(thạch nghiêng có màu đỏ) (acid, thạch nghiêng có màu vàng)

Cysteine → cysteine

( môi trường không có màu đen)

 Lên men Lactose và/hay sucrose và glucose với sự tạo thành H2S

Ví dụ: Proteus vulgaris

Glucose → làm giảm pH chuyển thành acid

( thạch đáy có màu đỏ) (acid, thạch đáy có màu vàng)

Lactose và/hay sucrose → làm giảm pH chuyển thành acid

(thạch nghiêng có màu đỏ) (acid, thạch nghiêng có màu vàng)

cysteine→ sinh H2S

H2S + FeSO4 → FeS

(môi trường có màu đen)

3.4. Tiến hành thí nghiệm.

 Giai đoạn chuẩn bị:

- Dán nhãn tên môi trường TSI và tên của chủng vi sinh vật mà bạn cấy. Cần một ống nghiệm để đối chứng. Ghi tên của sinh viên vào ống nghiệm.

- Sử dụng kỹ thuật vô trùng, sau đó cấy vi sinh vật lên phần thạch nghiêng, sau đó dùng que cấy thẳng đâm vào phần thạch đáy. Vặn nắp ống nghiệm lại nhưng đừng chặt quá.

- Sau đó đưa vào tủ ấm giữ ở nhiệt độ 35°C từ 18 đến 24 giờ để xem sự biến đổi ở phần thạch nghiêng và thạch đáy. Sau đó cho vào tủ ấm và kiểm tra hàng ngày cho tới ngày thứ bảy để quan sát sự biến đổi làm đen thạch.

 Giai đoạn hai

- Khảo sát việc cấy để thấy sự biến đổi màu của phần thạch nghiêng và thạch đáy, và quan sát sự biến đổi đen trong môi trường.

- Ghi kết quả vào bài báo cáo.

Gợi ý và đề phòng:

(1) Nếu nắp vặn vào ống nghiệm để lỏng sau khi cấy thì ngăn ngừa được sự nứt thạch bởi 1 lượng khí được sinh ra trong quá trình ủ.

225

(2) Ghi lại hiện tượng biến đổi màu của chỉ thị ở phần đáy thạch do khả năng lên men sinh ra acid của vi khuẩn trước khi lớp thạch đáy bị đen do FeS sinh ra.

3.5. Câu hỏi

1. Môi trường TSI sử dụng cho những vi sinh vật nào?

2. Tại sao người ta lại đọc kết quả môi trường TSI trong khoảng thời gian từ 18 đến 24 giờ sau khi cấy?

3. Phân biệt hiện tượng giữa thạch nghiêng acid và thạch nghiêng kiềm?

4. Thiosulfat trong TSI có tác dụng gì?

5. Thế nào là vi khuẩn phân giải đường? Phản ứng nào xảy ra trong ống TSI?

6. Tại sao trong môi trường TSI lại có hàm lượng đường lactose, sucrose nhiều hơn hàm lượng glucose?

7. Chất chỉ thị pH nào có trong môi trường TSI?.

226

BÀI 4: THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI TINH BỘT.

4.1. Mục đích.

Sau khi thực hành bài này sinh viên có khả năng:

- Hiểu cơ chế hóa sinh phân giải tinh bột - Thực hiện test phân giải tinh bột

4.2. Chuẩn bị của sinh viên.

 Bacillus subtilis (ATCC 6051), Escherichia coli (ATCC 11229), và Proteus vulgaris

(ATCC 13315) được nuôi cấy từ 24h đến 48 giờ trên môi trường canh tripsin.

 Môi trường thạch tinh bột trên đĩa petri (1 cái)  Dung dịch iode (1 g I2, 2 g KI, 300 ml nước cất)  Bút chì sáp  Que cấy vòng  Đèn Bunsen  Pipet tiệt trùng, bóp cao su  Tủ ấm

4.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa

Nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo ra các enzyme được gọi là enzyme thủy phân, các enzyme này phân cắt các phân tử hữu cơ thành các phân tử nhỏ hơn khi có mặt của nước. Bài thực hành này sẽ khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của một số loài vi khuẩn.

Tinh bột chứa 2 thành phần chính: amylose và amylosepectin, amylose là một polyme được cấu tạo từ các đường glucose liên kết với nhau, không nhánh; amylopectin có cấu tạo tương tự amylose nhưng có nhánh. Cả hai loại này đều bị thủy phân nhanh chóng nhờ enzyme amylaza, được tiết ra từ nhiều loại vi khuẩn. Sản phẩm của quá trình thủy phân là các dextrin, maltose và glucose. Phản ứng theo phương trình sau:

 dextrin (sp trung gian) + maltose (đường đôi)

2H O amylaza

TINH BỘT(amylose +amylopectin)

amylaza

amylaza



+ glucose (đường đơn)

. Ngược lại vi khuẩn không có khả năng tổng hợp enzyme

Iode được dùng để kiểm tra sự có mặt của tinh bột. Khi kết hợp với tinh bột nó tạo thành màu xanh hay màu tím. Tinh bột đã được thủy phân hoàn toàn không tạo màu với iode. Khi nhỏ iode vào khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch tinh bột, nếu xuất hiện một vùng sáng xung quanh khuẩn lạc (hình 5-1a) chứng tỏ vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme thủy phân  tinh bột (hình 5-1b)

227

Hình 4-1. Test phân giải tinh bột sau khi nhỏ iode, (a,c) dương tính, màu sáng (trắng) vùng tinh bột bị thủy phân hoàn toàn, (b) âm tính, tinh bột không bị thủy phân, xuất hiện màu hồng đến màu nâu quanh đường cấy

4.4. Cách tiến hành.

 Giai đoạn đầu: thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột.

- Dùng bút chì sáp chia đĩa petri thành 3 vùng theo hình dưới, ghi tên mỗi vùng tương ứng với tên của các vi khuẩn sẽ cấy. Ghi tên bạn và ngày nuôi cấy lên đĩa.

- Bằng thao tác vô trùng, cấy vết vi khuẩn theo đường thẳng vào vùng tương ứng trên đĩa petri.

- Ủ trong tủ ấm 24 đến 48 giờ ở 35°C.

 Giai đoạn hai.

228

- Nhỏ một vài giọt iode vào mỗi vùng đã cấy vi khuẩn trên đĩa petri. Nếu vùng xung quanh đường cấy chuyển thành màu sáng, thì có nghĩa tinh bột đã bị thủy phân, test dương tính; ngược lại không chuyển thành màu sáng hay chuyển thành màu xanh có nghĩa tinh bột vẫn chưa bị phân giải, test âm tính.

- Nếu khó khăn trong việc đọc kết quả, có thể lật ngược đĩa petri (đã mở nắp) và úp vào becher có chứa tinh thể iode. Iode thăng hoa sẽ phản ứng với tinh bột tạo thành màu không lẫn với màu đỏ nâu do iode không phản ứng gây ra.

- Ghi kết quả của bạn vào báo cáo bài thực hành.

4.5. Những điều cần lưu ý.

- Cẩn thận khi thêm iode vào đường cấy, chỉ nhỏ vào một phần đường cấy và tránh bị nhiễm, để có thể nuôi cấy và kiểm tra lại khi cần thiết.

- Sau khi nhỏ iode, phải xác định sự thay đổi màu ngay lập tức.

- Đối với mẫu cho màu tím đỏ với iode (thủy phân một phần) nên kiểm tra lại sau khi ủ thêm một khoảng thời gian.

4.6. Câu hỏi

1) Nêu chức năng của enzyme thủy phân?

2) Nêu cơ chế của của enzyme thủy phân tinh bột?

amylaza



3) Chất dùng để nhận biết khả năng phân giải tinh bột của vi khẩn là?

4) Bằng cách nào vi khuẩn có thể sống và phát triển trên môi trường thạch tinh bột trong khi không sản sinh ra enzyme ?

5) Thành phần của môi trường thạch tinh bột?

229

BÀI 5: THỬ NGHIỆM CÁC PHẢN ỨNG IMVIC

5.1. Mục đích thí nghệm.

- Hiểu cơ chế chuyển hóa amino axit tryptophan của một số vi khuẩn.

- Xác định khả năng oxy hóa glucose để tạo thành sản phẩm cuối là axits của một số vi khuẩn.

- Phân biệt sự khác nhau giữa các vi khuẩn đường ruột dựa trên khả năng sử dụng citrate.

- Giải thích mục đích của thử nghiệm VP (Voges-Proskauer).

- Thực hiện thử nghiệm IMViC.

5.2. Chuẩn bị của sinh viên.

Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Escherichia coli (ATCC 11229), Klebsiella oxytoca (ATCC 13182), và Proteus vulgaris (ATCC 13315) được nuôi cấy từ 24 đến 48 giờ trên môi trường canh trypsin

- 4 ống môi trường thạch sâu SIM.

- Thuốc thử Kovac.

- Đèn Bunsen.

- Que cấy vòng và que cấy thẳng

- 4 ống nghiệm chứa 5ml môi trường MR-VP

- Chỉ thị Methyl red.

- Thuốc thử Barrit (dung dịch A và B).

- 4 ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Simmons Citrate.

- 4 ống nghiệm .

- Pipet 4 ml, bóp cao su.

- Bút chì sáp

- Bao tay dùng một lần.

5.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa

Việc xác định vi khuẩn đường ruột là bước đầu tiên quan trọng để xác định các vi khuẩn gây bệnh có trong thực phẩm và nước uống. Nhiều vi khuẩn được tìm thấy trong đường ruột của người cũng như các động vật có vú khác thuộc họ Enterobacteriaceae. Chúng

230

là những vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, không sinh bào tử. Có thể chia chúng thành hai nhóm: nhóm lên men lactose và không lên men lactose. Ví dụ như vi khuẩn thường gây bệnh (Samonella và Shigella, không lên men lactose), vi khuẩn không gây bệnh thường xuyên (Klebsiella và Escherichia, lên men lactose; Proteus, không lên men lactose) và vi khuẩn đường ruột thường (Enterobacter, lên mên lactose).

Thử nghiệm IMVic (indole, methyl red, Voges-Proskauer, và citrate; ký tự “i”

thêm vào để dễ phát âm) được dùng để phân biệt và định danh các vi khuẩn trên.

Thử nghiệm Indole

Tryptophan là một amino axit có mặt hầu như trong tất cả các protein. Những vi khuẩn có khả năng sinh enzyme tryptophanase sẽ phân giải tryptophan thành các sản phẩm trao đổi chất bậc thấp: indole, axit pyruvic và amoniac. Vi khuẩn sử dụng pyruvic và amoniac để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Trong khi đó indole không được sử dụng, do đó tích tụ lại trong môi trường. Thuốc thử Kovac được dùng để phát hiện indole. Thuốc thử Kovac phản ứng với indole, tạo thành hợp chất có màu đỏ tươi trên bề mặt của môi trường. Vi khuẩn tạo thành lớp màu đỏ sau khi thêm thuốc thử Kovac có nghĩa test dương tính, ngược lại không có màu đỏ được tạo thành, có nghĩa tryptophan không được phân giải, test âm tính.

Hình 5-1: Thử nghiệm indol ống bên trái âm tính, ống bên phải dương tính.

 Thử nghiệm Methyl Red

Tất cả các vi khuẩn đường ruột phân giải glucose để tạo thành năng lượng; tuy nhiên, sản phẩm trao đổi chất cuối cùng lại thay đổi phụ thuộc vào hệ enzyme trong mỗi loài vi khuẩn. Chỉ thị methyl red thay đổi màu từ vàng sang đỏ khi pH môi trường giảm xuống thấp, do các sản phẩm cuối được tạo thành như: axit lactic và E. formic. Thử nghiệm này hữu dụng khi dùng phân biệt E. coli (lên men tạo thành hỗn hợp các axit) và aerogenes (lên men tạo thành butanediol). Khi E. coli lên men hỗn hợp các axit được tạo thành do đó làm pH môi trường giảm, gây đổi màu chỉ thị từ vàng sang đỏ. Khi E. aerogenes lên men tạo thành các rượu như butanediol, acetoin và một số acid hữu cơ. Vì thế pH môi trường không giảm đến

231

mức có thể làm đổi màu chất chỉ thị. Như minh họa trên (hình 6-2), tại pH = 4 chỉ thị chuyển sang màu đỏ - test dương tính. Tại pH = 6, chỉ thị giữ màu vàng – test âm tính.

Hình 5-2: Thử nghiệm methyl red, ống a dương tính, ống b âm tính.

 Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

Thử nghiệm VP (được đặt tên theo Daniel Voges, Thầy thuốc người Đức, và Bernhard Proskauer, nhà an toàn vệ sinh học người Đức, vào đầu thế kỷ hai mươi) xác định vi khuẩn có khả năng lên men Glucoza, dẫn tới tích tụ 2,3- butanediol trong môi trường. Dung dịch 40% KOH và 5% alpha- naphtol trong cồn tuyệt đối (thuốc thử Barritt) sẽ phát hiện ra sự có mặt của acetoin, một tiền chất để tổng hợp 2,3-butanediol. Thuốc thử Baritt kết hợp với acetoin sẽ tạo thành màu đỏ tươi. Thử nghiệm VP dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trong 15 phút sau khi thêm thuốc thử. Thử nghiệm âm tính khi màu môi trường không thay đổi (hình 6-3).

Hình 5-3: Thử nghiệm VP, ống a dương tính, ống b âm tính.

 Thử nghiệm Citrate

232

Thử nghiệm Citrate xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn cacbon để tạo thành năng lượng của vi khuẩn. Khả năng này phụ thuộc vào sự mặt của những chất giúp vận chuyển citrate qua màng bán thấm. Khi vào trong tế bào, citrate được chuyển hóa thành axit pyruvic và CO2. Môi trường thạch Simmon citrate chứa Natri citrate (nguồn cacbon), NH4 (nguồn Nitơ) và chỉ thị pH Bromothylmol blue. Thử nghiệm này được thực hiện trên môi trường thạch nghiêng do cần nhiều O2 để chuyển hóa citrate. Khi vi khuẩn oxi hóa citrate, chúng giải phóng CO2, CO2 sinh ra kết hợp với Natri trong môi trường (được cung cấp từ Natri citrate) và nước tạo thành Na2CO3 (chất kiềm) làm tăng pH môi trường. Màu của chỉ thị sẽ chuyển sang màu xanh dương, thử nghiệm dương tính. Nếu citrate không được chuyển hóa không xuất hiện màu xanh dương, thử nghiệm âm tính (hình 6-4), vi khuẩn sẽ không phát triển được trên ống âm tính.

Hình 5-4: Thử nghiệm citrate, ống a dương tính, ống b âm tính.

5.4.Cách tiến hành.

 Thử nghiệm indole

Giai đoạn đầu

- Ghi ngày tháng, tên bạn, tên vi khuẩn được nuôi cấy vào mỗi ống môi trường SIM (E. coli, P. vulgaris và E. aerogenes), (nếu không có môi trường SIM có thể thay thế bằng môi trường canh trypsin)

233

- Bằng thao tác vô trùng, cấy vào mỗi ống một vòng môi trường có chứa vi khuẩn.

- Ủ trong tủ ấm ở 35°C trong 24 giờ.

Giai đoạn hai

- Dùng bao tay dùng một lần lấy ống ra khỏi tủ cấy, nhỏ vào mỗi ống 0,5 ml (khoảng 10 giọt) thuốc thử Kovac. Sau đó lắc nhẹ ống. Thử nghiệm indole dương tính khi màu đỏ đậm xuất hiện. Âm tính khi môi trường không màu hoặc có màu vàng nhạt.

- Dựa vào hiện tượng quan sát được, hoàn thành báo cáo bài thực hành.

 Thử nghiệm Methyl Red

Giai đoạn đầu

- Ghi ngày tháng, tên bạn, tên vi khuẩn (E. coli, E. aerogenes, và K. oxytoca) được nuôi cấy vào mỗi ống môi trường MR – VP.

- Bằng thao tác vô trùng, cấy chuyền vào mỗi ống một vòng môi trường có chứa vi khuẩn

- Ủ tất cả các ống trong tủ ấm ở 350C trong 24 đến 48 giờ. Nếu lên men chậm, làm lại và ủ trong 4 đến 5 ngày.

Giai đoạn hai

- Chuyển 1/3 môi trường vào một ống nghiệm khác, ống nghiệm này sẽ dùng để thử nghiệm VP

- Thêm 0,2 ml chỉ thị methyl red vào 2/3 môi trường còn lại trong ống. Chú ý quan sát chuyển màu của methyl red (màu đỏ - thử nghiệm dương tính)

- Dựa vào các phản ứng quan sát được của mỗi vi khuẩn, ghi báo cáo vào bài thực hành 25.

 Thử nghiệm VP

Giai đoạn hai

- Đeo bao tay, cẩn thận nhỏ 0,6ml (khoảng 15 giọt) dung dịch Barrit A và 0,2ml (khoảng 5 giọt) dung dịch Barrit B vào 1/3 môi trường trong ống nghiệm lấy từ thử nghiệm metyl red. Lắc mạnh, quan sát sự chuyển màu của chỉ thị, thử nghiệm dương tính khi màu đỏ xuất hiện ngay lập tức hoặc trong vòng 20 phút.

- Dựa vào các phản ứng quan sát được của mỗi vi khuẩn, ghi báo cáo vào bài thực hành 25.

 Thử nghiệm Citrate

234

Giai đoạn đầu

- Ghi ngày tháng, tên bạn, tên vi khuẩn (E. coli, E. aerogenes, và K. oxytoca) sẽ được nuôi cấy vào mỗi ống môi trường Simmon citrate.

- Bằng thao tác vô trùng, cấy chuyền (cấy đâm sâu và cấy ria) các vi khuẩn vào ống tương ứng.

- Ủ trong tủ ấm ở 35°C trong 24 đến 48 giờ

Giai đoạn hai

- Kiểm tra sự chuyển màu của chỉ thị và sự phát triển của vi khuẩn trên bề mặt nghiêng. Phản ứng dương tính khi có sự chuyển màu từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương và có sự phát triển của vi khuẩn ở đường cấy đâm sâu.

- Dựa vào các phản ứng quan sát được của mỗi vi khuẩn, ghi báo cáo vào bài thực hành.

Những gợi ý và đề phòng

a) Chỉ ủ môi trường thạch sâu SIM trong 24 giờ trước khi nhỏ thuốc thử Kovac, nếu không

indole có thể bị tiếp tục chuyển hóa. Kết quả làm thử nghiệm âm tính.

b) Trong trường hợp không có môi trường SIM có thể thay thế bằng môi trường canh

trypsin.

c) Không sử dụng hơn 5 giọt methyl red, nếu cho nhiều hơn, màu đỏ được tạo thành

nhưng không liên quan đến sản phẩm cuối. Dẫn đến không thể đọc kết quả.

5.5. Câu hỏi

1) Thành phần chính của môi trường thạch sâu SIM giúp phát hiện ra indole?

2) Hợp chất hữu cơ nào dùng để nhận biết hỗn hợp các acid, do vi khuẩn lên men tạo

thành?

3) Tại sao phải lắc môi trường MR-VP? 4) Liệu vi khuẩn sử dụng con đường tạo thành 2,3-butandiol có thể sử dụng con đường

tạo thành hỗn hợp các axít để lên men hay không? Giải thích?

235

BÀI 6: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME CATALASE

6.1. Mục tiêu bài học.

Mỗi sinh viên cần nắm

- Hiểu được qui trình hóa sinh của hydrogen peroxide có thể nhận biết vi sinh vật thong qua các sản phẩm của enzyme catalase.

- Miêu tả được cách sản phẩm enzyme catalase được phát hiện.

- Thực hiện được việc kiểm tra catalase.

6.2. Chuẩn bị của sinh viên.

Canh tryptic nuôi cấy Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 19433) được ủ từ 18-24h và thạch nghiêng triptic nuôi cấy Micrococcus luteus (ATCC 9341), hydrogen peroxide (H2O2) 3% hoặc thuốc thử catalase Difco, đèn Busen, que cấy vòng, pipette và vật hút pipette, tủ ấm để ở 35oC, giá ống nghiệm, bút chì sáp, phiến kính sạch, que bôi bằng gỗ (hay vòng dây Nichrome).

-

- theo phương trình sau:

6.3. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa

Một số loại vsv có khả năng làm giảm bớt lượng O2. Đó là sản phẩm của hydrogen peroxide (H2O2) hay superoxide (O2 ). Chúng rất độc bởi vì chúng có khả năng oxi hóa rất mạnh và phá vỡ cấu trúc tế bào vsv rất nhanh. Một số loại vi khuẩn có khả năng tự bảo vệ nó bằng cách sản xuất ra enzym chống lại O2. Những loại vsv hiếu khí bắt buộc hay kỵ khí tùy tiện thường tạo ra enzym superoxidedismutase, catalase hay peroxidase, chứa catalyzes là chất phá hủy O2

Hầu hết vi khuẩn kỵ khí bắt buộc đều không có hai enzyme trên nên chúng không thể không bị tổn hại khi gặp O2. Enzyme catalase và hoạt tính của nó có thể được phát hiện ra bằng cách thêm H2O2 vào môi trường nuôi cấy tryptic đã được ủ qua 18 đến 24h. Nếu có mặt catalase (được tạo ra bởi vsv nuôi cấy), thì nó sẽ phản ứng với H2O2 giải phóng ra khí O2. Bọt khí O2 là dấu hiệu của catalase dương tính, nếu không có bọt khí O2 thì kết quả là catalase âm tính. Việc xác định hoạt tính của catalase rất hữu dụng trong việc chỉ ra các nhóm vsv. Ví dụ, Enterococcus (catalase âm tính), Staphylococcus (catalase dương tính) dù chúng có hình thái giống nhau nhưng dựa vào việc kiểm tra catalase mà ta phân biệt được chúng.

236

6.4. Tiến hành thí nghiệm.

Giai đoạn thứ nhất

- Ghi tên vsv được cấy, tên bạn, ngày tháng trên mỗi ống thạch nghiêng tryptic.

- Với kỹ thuật vô trùng, cấy ria vsv bằng que cấy vòng vào đúng ống nghiệm ghi tên nó.

- Ủ những ống thạch nghiêng này ở 35oC từ 18 đến 24h.

Giai đoạn thứ hai

- Để kiểm tra catalase, đặt ống thạch nghiêng ở vị trí nghiêng và dùng pipette nhỏ vài giọt H2O2 phủ lên lớp vsv mọc trên môi trường, hoặc nhỏ từ 3 đến 5 giọt thuốc thử catalase Difco.

- Nếu xuất hiện bọt khí thì kết quả là dương tính và nếu không có bọt khí thì kết quả là âm tính.

- Dựa vào sự quan sát của bạn, xác định kết quả và ghi lại trong bài báo cáo.

Hình 6-1: Thử nghiệm catalase

6.5. Những điều cần lưu ý:

- Sắp đặt tấm lam chứa hydrogen peoxide trong một vật chứa thích hợp.

- Khi muốn sử dụng ống thạch nghiêng cho mục đích khác trong cùng một thời gian thí nghiệm, thì ta thực hiện nó trước sau khi xong thì ta cho H2O2 vào ống nghiệm để kiểm tra catalase.

- Phải thật cẩn thận nếu có một khuẩn lạc được mang từ đĩa agar máu. Vì hồng cầu chứa catalase, và nếu trong quá trình dịch chuyển chỉ cần có một ít tế bào máu cũng sẽ đưa ra kết quả dương tính sai.

- Luôn sử dụng hydogen peroxide còn mới.

237

6.6. Câu hỏi

1. Sự quan trọng của catalase với vi khuẩn là gì?

2. Vi sinh vật kỵ khí có cần enzyme catalase không? Ví dụ minh hoạ?

3. Viết phản ứng phân huỷ H2O2 dưới tác dụng của enzyme catalase?

4. Trình bày hai nhóm vi khuẩn được phân biệt bởi thử nghiệm catalase?

5. Nêu tên một số vi khuẩn có thể tiết ra enzyme catalase?

6. Những cơ chất nào cần cho phản ứng catalase xảy ra?

238

CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG ĐẤT.

BÀI 7: XÁC ĐỊNH VÒNG ĐỜI CỦA VI SINH VẬT CÁC PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG VÀ ĐỔ ĐĨA.

7.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: Sử dụng phương pháp pha loãng và đỗ đĩa trong việc nuôi cấy vi sinh vật sẽ giới thiệu cho sinh viên những phương pháp luận trong nuôi cấy và những khái niệm cơ bản sự phát triển của vi sinh vật.

Sinh viên sẽ biết được ước số của chủng E.coli trong quá trình ủ còn thời gian là một biến số trong một khoảng nào đó sẽ cho kết quả khác nhau và mật độ phát triển của vi sinh vật.

Ước số vi sinh vật đó sẽ được pha loãng và đổ đĩa. Sau mỗi lần ủ ta đếm số khuẩn lạc có trên đĩa. Đường cong sinh trưởng là một đồ thị

mô tả thế hệ vi sinh vật sinh ra trong một khoảng thời gian.

7.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Có lẽ hầu hết các kỹ thuật được sử dụng rộng rãi hiện nay cho việc nghiên cứu sự phát triển của vi sinh vật với môi trường dinh dưỡng ở dạng lỏng cho việc pha loãng và đổ đĩa dưới dạng rắn (môi trường lỏng bổ sung thêm agar). Học thuyết này giả sử một khuẩn lạc (colony) tương ứng với một tế bào vi sinh vật. Mỗi một khuẩn lạc được xem như là một đơn vị CFU (colony forming unit). Thông thường, để xác định mật độ vi sinh vật các nhà nghiên cứu sẽ đo độ đục của môi trường nuôi cấy ở những khoảng thời gian khác nhau bằng cách sử dụng máy đo quang (spectrophotometer). Với hai phương pháp đo độ đục và đổ đĩa thì phương pháp đo độ đục cho kết quả nhanh hơn. Bài thực hành này sẽ giới thiệu cho sinh viên biết được chu kỳ phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng, qua trực giác chúng ta có thể nhận thấy rằng sự phát triển của vi sinh vật có thể tiếp tục xảy ra cho đến khi chất dinh dưỡng bị cạn kiệt và những sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình phát triển được tích lũy đến mức nào đó ức chế ngược trở lại sự phát triển của vi sinh vật. (Maier et al.,2000).

Trong chu kỳ phát triển của vi sinh vật chúng ta có thể thấy 4 giai đoạn rõ rệt đó là pha lag còn gọi là giai đoạn thích nghi, pha log còn được gọi là pha phát triển theo hàm số mũ, pha ổn định và cuối cùng là pha suy vong được thể hiện trên hình 11.1. Bảng 11.1 sẽ giải thích cho sinh viên biết được mối liên quan giữa sự phát triển và những thay đổi về sinh lý học của vi sinh vật.

239

Hình 7-1: Biểu đồ thể hiện các pha trong chu kỳ sống của vi sinh vật.

Bảng 7.1: Bốn pha phát triển của vi sinh vật.

Đặc điểm Pha

Pha lag

Ở giai đoạn này vi sinh vật phát triển chậm hoặc ít phát triển do phải thích nghi dần dần với điều kiện môi trường mới.

Pha log

Giai đoạn này vi sinh vật phát triển nhanh chóng theo hàm số mũ, lúc này vi sinh vật thích nghi hoàn toàn với điều kiện môi trường mới.

Pha ổn định

Ở giai đoạn này số tế bào sinh ra bằng với số tế bào mất đi nên không có sự thay đổi trong đường cong sinh trưởng nên nó là một đường thẳng.

Pha suy vong

Ở pha này số tế bào mất đi nhiều hơn tế bào sinh ra nên số lượng tế bào giảm dần nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này là do các chất dinh dưỡng trong môi trường gần như bị cạn kiệt hơn nữa là do trong quá trình phát triển vi sinh vật tạo ra một số sản phẩm phụ ức chế ngược trở lại sự phát triển của nó nên số lượng giảm đi rất nhanh.

7.3. Tiến hành thí nghiệm.

Chuẩn bị nguyên vật liệu.

- 50 ml flask 240

- Canh trường chứa E.coli trong môi trường TSA

- Micropipet .

Hình 7-2: Tế bào phân chia theo hàm số mũ. Sau mỗi lần phân chia một tế bào sẽ tạo ra hai tế bào. Sau n lần phân chia tạo ta có 2n tế bào.

Hai ngày trước khi làm thí nghiệm: ủ 50 ml môi trường TSB với E.coli . Ủ qua đêm ở 270C. Sau khi ủ ta có số tế bào khoảng109 CFU/ml.

Một ngày trước khi làm thí nghiệm: lấy 100 microlit canh trường đã chuẩn bị cho vào 250 ml môi trường TSB sau đó trộn đều, lấy 5ml canh trường đó đem làm lạnh ở 40C ngay lập tức, cách làm này cho phép chúng ta xác định được T=0, với số lượng khoảng 5.105 CFU/ml.

-Tiến hành ủ với E.coli sau mỗi giờ lấy 5ml canh trường và đem đi làm lạnh như trên, tiến hành liên tục đến 8 giờ, điều này cho phép chúng ta xác định từ T0 đến T8.

Giai đoạn 1:

Nguyên liệu:

- 1 ml canh trường chứa E. coli ( có thể dùng vi sinh vật khác).

- 0.9 ml nước cất vô trùng ( dùng để pha loãng). Micropipettes

241

- Đĩa petri chứa môi trườngTSA.

- Đèn cồn.

- Ethyl alcohol dùng để khử trùng lam kính.

Bước 1: cho 0.9 ml dung dịch pha loãng vào mỗi ống nghiệm có đánh số nồng độ từ 10-1 đến 10-9.

Bước 2: bắt đầu pha loãng bằng cách thêm 0.1 ml canh trường chứa E.coli vào ống A. Ống A lúc này có độ pha loãng 10-1.

Bước 3: lắc nhẹ ống A trong 5 giây.

Bước 4: dùng micropipet hút 100 microlit từ ống A cho vào ống B. lúc này ống B có độ pha loãng là 10-2. Tiến hành như trên ta được các độ pha loãng như bảng 1.2. Cần lưu ý rằng nên lắc nhẹ các ống nghiệm trước khi hút mẫu và sau mỗi lần hút dùng các micropipet mới đã được triệt trùng.

Bước 5: lập lại cách pha loãng để có T1 đến T8 như bảng 11.2.

Bước 6: phải ghi đầy đủ các thông tin lên trên nhãn về độ pha loãng cũng như thể tích thêm vào một cách cẩn thận.

Bước 7: cho 100 microlit các độ pha loãng ở trên vào các đĩa petri có chứa sẵn môi trường.

Bước 8: dùng que trang trải đều mẫu trên bề mặt thạch.

Bước 9: lập lại như trên để làm cho T1 đến T8.

Bước 10: tiến hành ủ các đĩa trên trong tủ ấm ở 370C.

Bảng 7.2: các nồng độ pha loãng để đỗ đĩa của E.coli.

E.coli Nồng độ pha loãng để đổ đĩa

10-1 10-2 10-3 T0

10-1 10-2 10-3 T1

10-2 10-3 10-4 T2

10-3 10-4 10-5 T3

10-4 10-5 10-6 T4

10-5 10-6 10-7 T5

242

10-6 10-7 10-8 T6

10-5 10-6 10-7 T* 7

10-4 10-5 10-6 T* 8

(*) Nồng độ pha loãng thấp hơn để dể đếm hơn vì lúc này chúng ta thí nghiệm ở pha suy vong.

Giai đoạn 2:

Bước 1: xem kỹ các đĩa khảo sát sao cho các khuẩn lạc phải đồng nhất và không có sự tạp nhiễm với vi sinh vật khác.

Bước 2: ứng với mỗi lần khảo sát (T0 đến T8) đếm ở 3 nồng độ pha loãng với đĩa đó phải chứa số khuẩn lạc từ 30-300.

Bước 3: tính số lượng tế bào trên 1 ml canh trường ban đầu từ T0 đến T8.

Bước 4: ví dụ số lượng khuẩn lạc ở độ pha loãng 10-4 cho kết quả là 28,30,32. (đếm 3 lần cho một nồng độ)

Vậy số khuẩn lạc trung bình là 30.

Số ml ban đầu làm thí nghiệm là 0.1 ml với độ pha loãng là 10-4, vậy số tế bào có trong 1ml là: 30x10-4/0.1

Bước 5: vẽ đồ thị bằng cách lấy log10CFU/ml trong một đơn vị thời gian (giờ).

Bước 6: từ đồ thị nhận ra pha log sau đó dựa vào hai điểm thời gian của pha này với số tế bào tương ứng để tính toán giá trị trung bình thế hệ ra đời.

7.4. Những kinh nghiệm cần nắm bắt.

Nên:

Giữ canh trường ở nhiệt độ lạnh cho đến khi sinh viên tiến hành làm thí nghiệm. Tiến hành pha loãng ở các nồng độ thập phân liên tiếp nhau để kết quả đảm bảo hơn. Thay đổi pipet sau mỗi lần hút mẫu ở các nồng độ khác nhau. Nên dán nhãn dưới đáy đĩa petri không dán ở trên.

243

Hình 7-3: Đổ đĩa ở ba nồng độ pha loãng liên tiếp nhau cho chủng E.coli. Nồng độ giảm dần từ trái qua phải (photo courtesy K.L. Josephson).

Không nên:

Không nên đặt lọ chứa ethanol gần ngọn đèn cồn nếu không sẽ dẫn đến cháy nổ. Không nên để đĩa petri có không có nắp đậy nếu không sẽ dẫn đến tạp nhiễm.

7.5. Thí dụ và tính toán.

Thực hiện thí nghiệm như các bước như trên, giả sử người ta cho số tế bào ở giai đoạn đầu tiên T0 = 1000 tế bào/ml, ở khoảng thời gian là 6 giờ số tế bào là 16000 tế bào/ml.

Ta có: X = 2nX0

Ở đây: X0: là số tế bào ban đầu 1000 tế bào/ml.

X: là số tế bào sau khoảng thời gian T là 16000 tế bào/ml.

N: số thế hệ sinh ra.

Ta có: 16000 = 2n.1000

Nên : 2n = 16  n = 4.

Nlog102 = log1016

n.0.301 = 1.204 nên n = 4.

Khoảng thời gian khảo sát là 6h nên thời gian trung bình cho một thế hệ là 6/4 = 1.5 h.

7.6. Câu hỏi.

1)Từ những dữ liệu cho sau đây sinh viên hãy tính toán thời gian trung bình:

244

- ở thời gian bắt đầu phát triển theo hàm số mũ (pha log) t=0, số tế bào ban đầu là

2500/ml.

- Sau khoảng thời gian là 8h thì số tế bào tăng lên đến 10000 tế bào/ml.

2) Nguyên nhân dẫn đến pha lag trong suốt quá trình phát triển của vi sinh vật là gì?

3) Nguyên nhân gì dẫn đến pha suy vong của vi sinh vật?

4) Nêu lên một vài nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt giữa pha loãng và đỗ đĩa ở cùng một nồng độ?

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Tài liệu tham khảo.

245

BÀI 8: NẤM SỢI

8.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu : Phân lập, quan sát, xác định số lượng bằng cách pha loãng và đổ đĩa.

- Xác định độ ẩm của đất tiến hành khảo sát.

- Làm cho đất có độ ẩm mới theo yêu cầu bằng cách ủ trong một tuần.

- Pha loãng đất và tiến hành đổ đĩa.

- Ủ các đĩa đó trong một tuần.

- Đếm khuẩn lạc của nấm sau đó nhận thấy sự khác nhau giữa các loài nấm bằng cách quan sát dưới kính hiển vi.

8.2. Cở sở lý thuyết và ý nghĩa.

Nấm là loại sinh vật di dưỡng có nhân thật, có những trường hợp ngoại lệ là nấm men, là loại hiếu khí. Chúng thường có mặt ở bề mặt đất và đóng một vai trò quan trọng trong các chu kỳ dinh dưỡng và góp phần phân giải một số hợp chất hữu cơ (Maire et al, 2000).

Hình 8-1: Một số loài nấm trên đĩa petri (photo courtesy K.L. Josephson).

Môi trường đất có nhiều chất dinh dưỡng là nơi lý tưởng cho nhiều loại vi sinh vật, bình thường trong một gram đất có đến hàng triệu loài nấm. Vì số lượng rất lớn và mật độ lại dày đặt như vậy nên người ta tiến hành pha loãng cho đến khi nào xuất hiện từng khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch đĩa.

Sau quá trình ủ trên môi trường thạch đĩa ở một khoảng nhiệt độ nào đó và chúng ta có thể đếm được khuẩn lạc của loài nấm (hình 13-1), với điều giả định là một khuẩn lạc là một tế bào. Khi chấp nhận giả định trên thì chúng ta có thể xác định được số CFU/gram đất khô.

Hình 8.2 mô tả việc pha loãng và đỗ đĩa theo sơ đồ. Bắt đầu ở bước 1, pha loãng theo bậc 10, việc pha loãng và tính toán để xác định số lượng vi sinh vật nhìn chung rất đơn giản. Ở đây, 10g đất sau đó thêm 95ml nước và lắc đều để phân tán vi sinh vật. Lý do để chọn 10g đất là

246

trong 10 gram đất đó chứa khoảng 5ml. Thực vậy chúng ta có 10 gram đất trong 100ml, ở đây độ pha loãng khoảng 1:10.

Kế tiếp, thêm 1.0 ml mẫu có chứa vi sinh vật vào ống B có chứa sẵn 9.0 ml dung dịch pha loãng như ở ống A. Tương tự như vậy ta làm cho các ống C,D,E. Ứng với một nồng độ ta làm ba mẫu và trải đều lên trên đĩa. Với 3 độ pha loãng khác nhau chúng ta sẽ xác định được số lượng vi sinh vật như hình (8-3).

Hình 8-3: Mô tả khuẩn lạc của một số loài nấm sau khi pha loãng và đỗ đĩa.

Một số lỗi và những giả định.

- Gỉa sử rằng một tế bào khi phát triển sẽ hình thành nên một khuẩn lạc. Khi xác định

trực tiếp bằng kính hiển vi không cần thiết phải có giả thuyết này.

- Những lỗi sai trong quá trình pha loãng là: nếu mẫu quá ít tế bào mà tiến hành pha loãng hoặc nếu mẫu có nhiều tế bào lắng xuống đáy không lắc mà tiếp tục pha loãng, đều dẫn đến thiếu chính xác.

247

Hình 8-2: Quy trình xác định số lượng nấm sợi bằng phương pháp đỗ đĩa

8.3. Tiến hành thí nghiệm.

 Giai đoạn 1: Nguyên liệu.

- 25g đất tươi.

- Pipette 25ml.

- Pipette bầu

248

- Deionized water.

Tính toán khối lượng nước cần bổ sung vào trong 25g đất để đạt độ ẩm theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn. Sau đó bổ sung thêm một lương ẩm bằng deionized vào 25g đất đó.

Tiến hành bao gói mẫu đất bằng bao nilong, dùng que tăm đâm thành những lỗ nhỏ nhằm tạo điều kiện hiếu khí trong quá trình ủ. Khối lượng của đất cũng như khối lượng của vỏ bọc sinh viên nên nắm vững để tính toán lượng ẩm mất đi trong suốt quá trình ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 1 tuần.

 Giai đoạn 2: Nguyên liệu.

- Dung dịch dùng để pha loãng.

- 9 đĩa petri .

- 6 pipette 1ml.

- Pipette bầu.

- Nước ấm ở 450C làm tan chảy agar.

1. Mỗi mẫu đất được sinh viên chuẩn bị sau đó đem gói và ghi lại khối lượng. Khối lượng có thể bị mất đi vì độ ẩm giảm. Do đó cần phải tính toán và xác định độ ẩm một cách chính xác. Sau đó đem pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1:10 như hướng dẫn hình 2.2.

2. Việc pha loãng tiến hành như sau: 10-1 cho ống A, 10-2 cho ống B, 10-3 cho ống C, 10-4 cho ống D, 10-5 cho ống E g đất trên 1 ml.

3. Mỗi nồng độ pha loãng nên chuẩn bị hai đĩa petri, ví dụ 10-2, 10-3, 10-4 như vậy chúng ta có cả thảy 6 đĩa petri, thêm vào mỗi đĩa 1.0 ml dung dịch đã pha loãng ứng với mỗi nồng độ. Môi trường chúng ta sử dụng trong đĩa petri là môi trường Rose Bengan Streptomycin Agar. Môi trường này có Rose Bengal và streptomycin có tác dụng là hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Đối với các loại đất màu mỡ có mật độ vi sinh vật tương đối cao vì thế chúng ta chọn độ pha loãng tương đối cao hơn khoảng 10-3, 10-4, 10-5. Giáo viên hướng dẫn sẽ chọn độ pha loãng thích hợp cho mẫu đất của sinh viên.

4. Tiến hành ủ các đĩa petri trong phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian một tuần.

 Giai đoạn 3: Nguyên liệu.

Các đĩa petri được ủ ở giai đoạn hai.

249

Kính hiển vi quang học.

Dầu soi kính.

1. Tiến hành đếm các khuẩn lạc ở các độ pha loãng khác nhau. Nên đếm những khuẩn lạc được mọc riêng biệt. đối với những khuẩn lạc mọc tràn ra thành đĩa không nên đếm, chúng ta cũng không nên đếm những đĩa petri nào có số khuẩn lạc < 10. ghi chép cẩn thận những khuẩn lạc riêng biệt và có những đặc điểm khác nhau về màu sắc, kích th

ước, hình dạng…đối với những khuẩn lạc quá nhỏ cũng không nên đếm.

2. Chuẩn bị lam kính sạch sau đó cho một giọt lactophenol lên giữa lam kính (sinh viên dùng nhãn hoặc bút lông dầu để đánh dấu mặt lam kính mà chúng ta tiến hành thử nghiệm) sau đó dùng que cấy tiến hành lấy mẫu và làm tiêu bản để quan sát.

3. Sinh viên đưa ra được 3 loại nấm khác nhau được quan sát dưới kính hiển vi và bảng nhận dạng các loài nấm được mô tả ở hình (8-4). Sinh viên nên mô tả đặc điểm về hình dạng và kích thước bằng các bản vẻ của mình qua hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi.

Hình 8-4 Mô tả hình dạng một số loài nấm thường được phân lập từ đất.

8.4. Kỹ năng.

Nên: 250

- Thêm nước vào mẫu đất mà không nên khuấy để tránh trường hợp làm nhão đất trong

suốt quá trình đỗ đĩa.

- Chuẩn bị đỗ đĩa từ ba nồng độ pha loãng mà sinh viên cho là tốt nhất để đảm bảo rằng

việc đếm khuẩn lạc sau quá trình ủ cho một kết quả khả quan hơn.

- Thay đổi pipette sau mỗi lần thao tác ở các độ pha loãng khác nhau. Pipette phải đảm

bảo vô trùng.

- Thao tác nên nhẹ nhàng ở khâu cho môi trường vào và lắc nhẹ tránh cho agar văng trên nắp cũng như trên thành đĩa petri. Nên xoay nhẹ đĩa petri để phân bố đều mẫu với môi trường vì thao tác này sẽ giúp chúng ta dễ đếm khuẩn lạc hơn ở công đoạn sau.

- Phải kiểm tra cẩn thận khi agar đã đông lại mới tiến hành lật ngược đĩa petri. - Chỉ tiến hành đếm những khuẩn lạc riêng lẻ.

Không nên:

- Đừng quên cho streptomycin vào môi trường. - Không cho môi trường vào đĩa petri khi còn quá nóng đều này sẽ làm chết hoặc làm

biến dạng và thay đổi về kích thước của vi sinh vật.

- Không nên cho môi trường quá cứng vì điều này sẽ làm phá hủy những tơ nấm.

8.5. Tính toán.

Tính toán số khuẩn lạc quan sát được trên một gram đất khô, sau đó tính toán giá trị trung bình có trên mẫu, độ sai số, và hệ số biến thiên.

Tính toán việc pha loãng và đổ đĩa.

Lấy 10 gram đất với độ ẩm của mẫu là 20% sau đó đem xác định số nấm mốc bằng các kỹ thuật đổ đĩa và pha loãng được tiến hành như sau:

Quá trình Pha loãng

10 g đất 95 ml nước muối sinh lý (dung dịch A) 10-1 (g/ml)

1ml dd A 9 ml nước muối sinh lý (dung dịch B) 10-2 (ml/ml)

1ml dd B 9 ml nước muối sinh lý (dung dịch C) 10-3 (ml/ml)

1ml dd C 9 ml nước muối sinh lý (dung dịch D) 10-4 (ml/ml)

1ml dd D 9 ml nước muối sinh lý (dung dịch E) 10-5 (ml/ml)

Ví dụ: trong 1ml dung dịch E sau khi đỗ đĩa và ủ chúng ta đếm được khoảng 200 khuẩn lạc/đĩa. Thì :

Số CFU là: 1/độ pha loãng x số khuẩn lạc.

251

= 1/10-5 x 200 CFU/g đất ẩm = 2.107 CFU/g đất ẩm

Nhưng đối với đất khô thì:

Độ ẩm = (khối lượng ướt – khối lượng khô)/ khối lượng khô.

 0,20 = (10 – khối lượng khô)/ khối lượng khô.

 khối lượng khố = 8,33 g.

Vậy số CFU/g đất khố = 2.107 x 10/8,33 = 2,4. 107 CFU/ g đất khô.

Một số công thức cho tính toán.

 Công thức tính giá trị trung bình:

Trong đó:

y: giá trị trung bình.

i: chỉ số có giá trị từ 1…..n

yi: giá trị của một mẫu tương ứng với chỉ số i.

n: giá trị tổng các điểm đang xét.

 Công thức tính độ lệch chuẩn.

Trong đó:

Sy: là độ lệch chuẩn.

y: giá trị trung bình.

i: chỉ số có giá trị từ 1…..n

yi: giá trị của một mẫu tương ứng với chỉ số i.

252

n: giá trị tổng các điểm đang xét.

 Công thức tính hệ số biến thiên.

Trong đó:

Cv: là hệ số biến thiên.

Sy: là độ lệch chuẩn.

Y: là giá trị trung bình mẫu.

8.6. Câu hỏi.

1. Vẽ phác họa hai loại nấm mà sinh viên nhận thấy được?

2. Tác động của pH như thế nào đến sự phong phú các loài nấm có trong đất? Tại sao?

3. Những loài nấm nào sẽ chiếm ưu thế hơn trong đất ở sa mạc hoặc ở các đồng cỏ trên cao nguyên? Tại sao?

4. Có hay không sự khác nhau về số lượng các loài nấm trên các loại đất khác nhau?

5. Người ta nói rằng phương pháp pha loãng và đỗ đĩa là một phương pháp tốt nhất để xác định hoàn toàn số lượng các loài nấm có trong đất điều này đúng hay sai? Tại sao đúng? Tại sao sai?

6. Sinh viên hãy nêu tên hai loài nấm có ích và hai loài nấm có hại cho đất?

7. Ý nghĩa của độ lệch tiêu chuẩn là gi? Ý nghĩa của hệ số biến thiên là gì? Sinh viên hãy thảo luận xem tại sao phải sử dụng thống kê trong việc nghiên cứu số lượng vi sinh vật có trong đất?

Hammel, K.E. (1995) Organopollutant degradation by ligninolytic fungi. In: Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals. L.Y. Young and C.E. Cerniglia, eds. Wiley & Sons, New York, NY.

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Pepper, I.L., Gerba, C.P., and Brusseau, M.L. (1996) Pollution Science. Academic Press, San Diego.

Tài liệu tham khảo.

253

BÀI 9: QUAN SÁT VI SINH VẬT CÓ TRONG ĐẤT QUA KÍNH HIỂN VI.

9.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: Sử dụng kính hiển vi để quan sát vi sinh vật có trong đất và so sánh hình dạng và kích thước của các loại vi sinh vật với nhau.

- Chuẩn bị mẫu đất ẩm. - Đặt lam kính vào beaker chứa đất ẩm và ủ trong một tuần. - Lấy lam kính ra và nhuộm với phenolic rose bengal. - Sau đó quan sát dưới kính hiển vi.

9.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Quan sát được các loại vi sinh vật có trong mẫu đất mà chúng ta khảo sát la điều hết sức quan trọng vì chúng ta có thể biết được mối quan hệ giữa các loài vi sinh vật có trong đất và sự tương tác của chúng. Việc quan sát kích thước của khuẩn lạc có trong đất cũng như la hình dạng và kích thước cũng không mấy dễ dàng. Bằng kỹ thuật hiện đại quan sát dưới kính hiển vi qua lam kính có từ năm 1930 nhưng vẫn không thay đổi đến thời điểm hiện nay, (Rossi et al 1936), đây là công nghệ đơn giản nhưng đánh giá được mối quan hệ giữa các loài vi sinh vật có trong đất. Tuy nhiên kết quả đánh giá chỉ mang tính chất định hướng cho các loại vi sinh vật có trong đất, không đủ độ tin cậy cho việc xác định số lượng mà chúng ta mong đợi. Bổ sung chất dinh dưỡng, như nguồn cacbon, đường và nguồn nitơ ,NH4NO3 khuyến khích sự tăng nhanh của vi sinh vật dị dưỡng.Sau khi di chuyển bản kính từ trong đất, bản kính được cố định với acid acetic và được nhuộm màu để tạo ra sự tương phản, khi sinh vật không màu không thể phân biệt dưới kính hiển vi. Khi quan sát dưới kính hiển vi, vi sinh vật đất,khuẩn tia và nấm được nhìn thấy đang phát triển trên mẩu đất.

Hình 9-1: Lam kính được chôn trong các bình đựng đất. (Photo courtesy K.L. Josephson)

254

Hình 9-2: Hình ảnh vi sinh vật quan sát dưới vật kính 100 (Photo courtesy W.H. Fuller).

Hình 9-3: Hình ảnh vi sinh vật trong đất quan sát với vật kính 100 (Photo courtesy W.H. Fuller).

9.3. Tiến hành thí nghiệm.

Nguyên liệu:

- 300g đất tươi. - Glucose 1%. - NH4NO3 - 2 cốc đựng polystyrene thể tích 250ml. - 4 tấm lam kính. - Cân phân tích.

- Cân 150 g chia vào 2 tách, ghi lại khối lượng của mẫu đất ta đã thêm vào tách. Dán lên 1 nhãn “xử lý” và tách còn lại nhãn “đối chứng”. Cân 100 g đất mẫu thử nghiệm được dùng cho đất chứa chất hữu cơ cao. 255

- Tính độ ẩm của mẫu đất đem đi thí nghiệm và bổ sung lượng ẩm cần thiết theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn.

Hình 9-4: Vị trí của 2 tấm lam trên beaker

- Bổ sung thêm vào cốc một lượng nước với cốc đựng glucose sao cho nồng độ glucose cuối cùng là 1%. Thêm vào đó 200mg NH4NO3 với cốc xử lý. Khuấy nhẹ để làm hòa tan các chất thêm vào. Đối với mẫu kiểm chứng thì không thêm chất bổ sung vào.

- Khuấy trộn thành phần trong mẫu xử lý và mẫu kiểm tra tương ứng mỗi tách khi bổ sung dịch lỏng vào đất và trộn đều lên sau mỗi lần bổ sung nước. Đối với đất sét tránh khuấy trộn như với đất nhão.

- Ứng với mỗi tách cho vào đó hai tấm lam. Đặt 2 tấm lam nhô lên khoảng 2cm so với bề mặt mẫu đất. Tránh chèn quá mạnh tấm lam vào mẫu đất sẽ làm vỡ lam kính. (Hình 9-4)

- Đậy kín tách lại với túi nhựa và buộc chặt dùng que đâm thủng túi nhựa vài lần cho không khí lọt vào để làm bay hơi một phần ẩm thừa. Sau đó cân trọng lượng của mỗi tách. Ủ các mẫu đó trong một tuần ở nhiệt độ phòng.

Giai đoạn 2

Nguyên vật liệu

- Mẫu đất đã chuẩn bị ở giai đoạn 1.

- 40% (v/v) acid acetid .

- Thuốc nhuộm Phenolic Rose Bengal.

- Kính hiển vi

- Dầu soi kính

256

- Khăn giấy.

Hình 9-5: Thao tác trước khi rút tấm lam ra khỏi cốc chứa mẫu đất.

- Cân lại tách đất và tính độ ẩm đất trước khi di chuyển lam kính. - Dùng tay ấn nhẹ lam kính về phía phải để tạo ra một khoảng trống sau đó rút lam kính lên nhẹ nhàng (hình 9-5).

- Loại bỏ những mẫu đất lớn trên bề mặt lam kính và để khô ở nhiệt độ phòng.

- Mang kính bảo hộ nhúng vào bản kính 40% acid acetid trong 1 – 3 phút thao tác thực hiện trong tủ hút sử dụng kẹp gắp để nhúng lam kính trong dung dịch.

- Rửa sạch acid thừa nhẹ nhàng bằng nước, và tráng lên bề mặt với phenolic Rose Bengal từ ống nhỏ giọt , lưu ý không nên rửa dưới vòi nước có áp lực quá mạnh nếu không sẽ dễ dàng làm trôi các vi sinh vật có trên lam kính.

- Nhuộm màu trong khoảng 5-10 phút, đừng để bản kính trở nên quá khô. Thêm màu nhuộm khi cần thiết.

- Rửa bản kính làm sạch màu nhuộm còn dư. Làm khô và kiểm tra bằng kính kính hiển vi dùng dầu soi kính. So sánh với phần 2 và 3.

257

Hình 9-6: Di chuyển lam kính ra khỏi mẫu đất ủ (Photo courtesy K.L. Josephson).

9.4. Câu hỏi.

1.Mô tả kích thước và hình dáng tế bào sinh vật, khuẩn ti và bào tử nấm sợi và xạ khuẩn?

2.Mô tả và vẽ sơ lược những gì sinh viên quan sát được và so sánh hình dạng các loài với nhau đâu là vi khuẩn, khuẩn ti, xạ khuẩn?

3.Mô tả sự khác nhau trong những loài vi khuẩn phổ biến giữa các loại đất khác nhau cho từng cách xử lý, giữ nguyên hay thay đổi với glucose và NH4NO3?

4. Có hay không sự khác nhau về số lượng vi sinh vật trong các loại đất và giữa các loại đất có cách xử lý khác nhau? Xem xét tại sao có hay không có sự khác nhau về cách xử lý các loại đất?

5. Bằng cách nào bạn có thể phân biệt được giữa nấm sợi và xạ khuẩn?

5 .Thảo luận sự hữu ích của phương pháp. Hãy nêu lên ý nghĩa về số lượng vi sinh có trong đất mà bạn xác định được so với số liệu trong tài liệu và từ đó giải thích ý nghĩa số liệu ấy?

8. Có sự cạnh tranh về không gian giữa các loài vi sinh vật không?

9.Những tác nhân làm hạn chế khả năng phát triển cũng như khả năng hoạt động của các loài vi sinh vật trong đất?

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Rossi, G., Riccardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Wang, T.K. (1936) Direct microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science 41, 52–66.

Tài liệu tham khảo.

258

BÀI 10: VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN

10.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: phân lập, quan sát, xác định số lượng vi khuẩn và thử nghiệm khả năng kháng sinh đối với các vi sinh vật phân lập được.

- Xác định độ ẩm của đất tiến hành khảo sát.

- Làm cho đất có độ ẩm mới theo yêu cầu bằng cách ủ trong một tuần.

- Pha loãng đất và tiến hành đổ đĩa.

- Chuẩn bị sẵn hai đĩa một đĩa dùng để nghiên cứu vi khuẩn, đĩa còn lại dùng cho xạ khuẩn.

- Đối với vi khuẩn ủ trong vòng một tuần, đối với xạ khuẩn ủ trong vòng hai tuần.

- Đếm vi khuẩn và xạ khuẩn vào thời điểm cuối của quá trình ủ.

- Phân lập vi khuẩn và xạ khuẩn theo các đường cấy riêng biệt.

- Tiến hành nhuộm Gram đối với các loại vi khuẩn phân lập được.

- Thử nghiệm thuốc kháng sinh với các vi khuẩn phân lập được.

10.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Vi khuẩn có rất nhiều trong đất chúng sống chủ yếu trên lớp mặt đất. Vi khuẩn sống trong đất gồm nhiều chủng loại khác nhau, tất cả chúng đều thuộc nhóm prokaryotic, là những loại vi khuẩn hiếu khí, kị khí hoặc kị khí tùy tiện. Trong đó bao gồm cả vi sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng (Maier et al.,2000). Đối với nhóm prokaryotic có những vi sinh vật có hình dạng sợi chủ yếu là xạ khuẩn. Vi khuẩn và xạ khuẩn có tầm quan trọng rất lớn trong chu trình dinh dưỡng cho đất cũng như góp phần phân hủy các chất gây ô nhiễm. Hơn nữa, chúng tương tác với các cây thực vật như là “rhi-zosphere” chúng tập trung chủ yếu ở gần rễ cây. Theo (Pepper và Gentry, 2002) thì vi khuẩn có trong đất có thể gây bệnh cho thực vật (Agrobacterium tumefaciens) và con người như là Clostridium perfrigens và Bacillus anthracis.

Theo lý thuyết việc nuôi cấy và đếm khuẩn lạc số vi khuẩn và xạ khuẩn chúng ta tham khảo bài 2 các loại nấm sợi.

Thông thường trong mẫu đất thì số lượng vi khuẩn sẽ chiếm ưu thế nhiều hơn so với các loại xạ khuẩn và phát triển nhanh hơn. Việc pha loãng và đỗ đĩa phải được đảm bảo để việc đếm khuẩn lạc được dễ dàng hơn. Hình 15-1 đã chỉ ra kết quả của việc đếm khuẩn lạc ở các loài sinh vật dị dưỡng hình ảnh chỉ rằng độ pha loãng tăng dần từ trái qua phải và mật độ khuẩn

259

lạc cũng ít dần, tuy nhiên trong 3 đĩa A,B,C thì chỉ có đĩa A là được đếm vì lúc này số khuẩn lạc của đĩa A từ 30-200 khuẩn lạc.

Hình 10-1: Kết quả nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng co trong đất trên đĩa petri (photo courtesy K.L. Josephson).

Cả vi khuẩn và xạ khuẩn đề thuộc nhóm prokaryotic. Nhưng khi phát triển trên môi trường thạch chúng ta có thể nhận biết sự khác biệt giữa vi khuẩn và xạ khuẩn vì màu sắc của vi khuẩn thường có màu sáng như màu: cam, vàng, hồng…trái lại khuẩn lạc của xạ khuẩn thường phát triển thành dạng sợi và có màu trắng phấn. Không giống như vi khuẩn, xạ khuẩn thường sống được ở các điều kiện khô hạn và sống được trong các đất sa mạc và chịu được độ kiềm (Pepper et al., 1996). Vì thế, người ta làm khô đất trước khi tiến hành nuôi cấy và đếm khuẩn lạc trên đĩa để hạn chế các loại vi khuẩn. Tác nhân kháng nấm được thêm vào như là cycloheximide để kiểm tra nấm.

Về cách cấy phân lập vi khuẩn hoặc xạ khuẩn chúng ta có thể tham khảo ở hình 10-2.

260

Hình 10-2: Mô tả đường cấy phân lập.

Chúng ta thấy rằng khi bắt đầu điểm cấy đầu tiên trên đĩa petri chứa nhiều vi sinh vật nhất, khi di chuyển que cấy theo đường A thì mật độ vi sinh vật giảm dần đến cuối đường A tiến hành triệt trùng que cấy lúc này trên que cấy không còn chứa vi sinh vật nữa. Khi bắt đầu đường cấy B thì trên que cấy lúc này chỉ có một phần nhỏ vi sinh vật ở cuối đường A, khi kéo dài que cấy đường B thì mật độ vi sinh vật cũng giảm dần, tương tự như vậy cho các đường D và C, lúc này chúng ta có thể thấy được những khuẩn lạc riêng lẻ như hình (10-3).

Hình 10-3: Cấy phân lập tạo ra các khuẩn lạc riêng biệt.

Việc thử nghiệm những vi sinh vật có thể chịu đựng chất kháng sinh hay không cũng là một vấn đề cần phải nghiên cứu. Không phải bất kỳ loại vi sinh vật nào cũng chịu được chất

261

kháng sinh, và nồng độ chất kháng sinh khác nhau thì mức tồn tại của vi sinh vật cũng khác nhau. Có loài vi sinh vật sống sót ở chất kháng sinh này nhưng lại bị ức chế bởi chất kia. Hiện nay, có nhiều loại chất kháng sinh khác nhau và tác dụng của chúng cũng khác nhau được mô tả ở bảng 10.1.

Bảng 10.1: Các chất kháng sinh dùng để chọn lựa môi trường.

Tên Giới hạn tác động Phương thức hoạt động

Đa số Hạn chế sự tổng hợp protein Chloramphenicol

Hầu hết gram dương Hạn chế sự tổng hợp protein Erythromycin

Đa số Hạn chế sự tổng hợp protein Tetracycline

Đa số Hạn chế sự tổng hợp protein Streptomycin

Vi khuẩn gram âm Phá vỡ màng tế bào. Polymyxin

Đặc biệt là Peudomonas

Vi khuẩn gram âm Hạn chế tổng hợp DNA Nalidixic acid

Vi khuẩn gram âm Hạn chế tổng hợp DNA Novobiocin

Vi khuẩn gram âm Hạn chế tổng hợp purine Trimethoprim

Vi khuẩn gram dương Hạn chế tổng hợp RNA Rifampicin

Vi khuẩn gram dương Penicillin

Hạn chế tổng hợp peptidoglucan ở thành tế bào

Để phân biệt các loài vi khuẩn với nhau người ta còn dùng phương pháp nhuộm gram. Vi khuẩn tồn tại hai dạng có loại gram dương (+), gram âm (-).Bước đầu tiên trong phương pháp cần phải nhuộm mẫu với thuốc nhuộm cơ bản crystal violet. Sau đó mẫu được xử lý bằng dung dịch iốt, với mục đích là làm tăng sự tương tác giữa tế bào vi khuẩn với thuốc nhuộm, kết quả thành tế bào được nhuộm bền hơn với thuốc nhuộm. Tiếp theo, các vệt được tẩy màu bằng cách rửa với cồn 95% hay isopropanol - axeton. Kết quả là vi khuẩn gram (+) giữ lại hỗn hợp phức tạp crystal violet-iodine khi rửa với chất khử màu. Ngược lại vi khuẩn gram (-) làm mất hỗn hợp phức tạp crystal violet-iodine và trở nên không màu. Cuối cùng mẫu được nhuộm lại với thuốc nhuộm có màu khác với thuốc nhuộm cơ bản crystal violet ban đầu, và thuốc nhuộm này thông thường là safranin. Những vi khuẩn gram (-) đã được tẩy màu ở giai đoạn trước sẽ bắt màu với safranin và có màu hồng, còn vi khuẩn gram (+) vẫn giữ màu đỏ tía. Kết quả cuối cùng là vi khuẩn gram (+) có màu đỏ tía và vi khuẩn gram (-) có màu hồng nhạt. 262

10.3. Tiến hành thí nghiệm.

Giai đoạn 1:

Nguyên liệu:

- 25g đất tươi.

- 1 tách đựng đất.

- Deionized

- Tiến hành cân 25g mẫu đất và cho vào một cái cốc có dán nhãn riêng biệt cho mỗi loại đất. Tính toán lượng nước cường toan cho vào mẫu đất đó theo yêu cầu của giáo viên về độ ẩm. Dùng bao nilong bao kín lấy mẫu đất sau đó dùng que tăm đâm vài lỗ nhỏ sao cho vừa tạo điều kiện hiếu khí mà độ ẩm giảm xuống không đáng kể.

- Nên xác định khối lượng của bao gói để tính độ ẩm của đất vào thời điểm cuối. Tiến hành ủ mẫu trên ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian một tuần.

Giai đoạn 2:

Nguyên liệu:

- Mẫu đã ủ ở giai đoạn 1.

- 9 đĩa có sẵn môi trường peptone-yeast agar cho mỗi loại đất.

- 9 đĩa có môi trường glycerol-casein agar với cycloheximide cho mỗi loại đất.

- 128ml nước dùng để pha loãng.

- 10 pipette 1ml .

- 1 pipette bầu.

- 1 ống nghiệm

- Đèn cồn.

Chuẩn bị pha loãng và đỗ đĩa.

1. Tính toán hàm lượng ẩm cho mỗi loại đất sau khi ủ.

2. Chuẩn bị pha loãng cho mỗi loại đất.

3. Cân 10g đất dùng 95ml nước để pha loãng được ống A với độ pha loãng 10-1.

263

4. Dùng pipette 1ml hút 1ml từ ống A cho vào 9ml nước ta được ống B với độ pha loãng 10-2, lập lại 3 lần như trên ta được các ống C,D,E với độ pha loãng lần lượt là 10-3, 10-4, 10-5.

Tiến hành đổ đĩa.

 Đối với vi khuẩn.

- Chuẩn bị hai hoặc ba đĩa petri chứa sẵn mối trường pepton yeast agar cho các độ pha

loãng 10-3, 10-4, 10-5.

- Dùng que trang nhúng vào cồn sau đó hơ trên ngọn lửa trong khoảng thời gian đủ dài

để làm cho que trang vô khuẩn.

- Dùng tay mở nhẹ nắp đĩa petri sau đó cho một 0.1ml mẫu đã pha loãng vào rồi dùng que trang vô trùng và được làm nguội tiến hành trải đều lên trên bề mặt thạch rồi nhẹ nhàng đóng nắp đĩa petri lại.

- Các đĩa petri sau khi được trải đều tiến hành ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian

một tuần.  Đối với xạ khuẩn.

- Tiến hành giống như với vi khuẩn nhưng môi trường sử dụng cho xạ khuẩn là glycerol

casein agar.

- Đối với xạ khuẩn cũng ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian là hai tuần. Giai đoạn 3:

Đếm vi khuẩn sau một tuần ủ.

- Đếm tất cả các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri nhưng phải ghi lại những khuẩn lạc có sự

khác nhau về kích thước và hình dạng.

- Chỉ đếm những đĩa petri có số khuẩn lạc từ 30-200 khuẩn lạc/đĩa đếm kể cả xạ khuẩn. - Tính toán số CFU trung bình trên 1g đất khô. Sau đó tính độ lệch chuẩn và phương sai

của mẫu.

Phân lập giống thuần.

- Tiến hành chọn 5 khuẩn lạc riêng biệt mà sinh viên cho là đặc trưng ở mỗi đĩa với các độ pha loãng khác nhau, thông thường người ta khuyến khích sử dụng ở độ pha loãng cao nhất.

- Triệt trùng que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn, nhanh chóng mở nắp đĩa petri có chứa khuẩn lạc mà sinh viên đã chọn dùng que cấy hơ nhẹ lên nắp trên đĩa petri không có chứa vi sinh vật nhằm muc đích làm nguội que cấy sau đó dùng que cấy lấy chính xác khuẩn lạc mà sinh viên đã chọn ngay từ đầu.

- Hãy cẩn thận mở nắp đĩa petri mới có chứa sẵn môi trường, dùng que cấy đã lấy khuẩn lạc ở bước trên dùng tay cầm que cấy trải trên bề mặt thạch đĩa như đường cấy A trên hình 3.1. Sau khi thực hiện xong đường cấy A tiên hành triệt trùng que cấy để thực hiện đường cấy B,C,D như hướng dẫn trên hình 3.1.

264

- Việc phân lập thành công khi khuẩn lạc mà sinh viên lấy là duy nhất và riêng biệt, quá

trình thao tác đòi hỏi phải cẩn thận.

Giai đoạn 4:

Đếm xạ khuẩn sau hai tuần ủ ở nhiệt độ phòng.

- Đếm tất cả các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri loại trừ vi khuẩn, cách đếm cũng tương tự

như vi khuẩn.

- Tính toán số CFU trung bình của xạ khuẩn trên 1g đất khô. Sau đó tính độ lệch chuẩn

và phương sai của mẫu.

Nhuộm gram.

- Sau khi tiến hành quan sát các khuẩn lạc về hình dạng và kích thước, các khuẩn lạc phải mọc riêng rẽ với nhau và có những đặc trưng riêng.

- Nhỏ một giọt nước lên giữa lam kính, dùng que cấy vòng lấy một khuẩn lạc đặc trưng sau đó hòa đều vào giọt nước đó tiến hành cà nhẹ để phân tán mật độ vi sinh vật trên vết bôi. Cố định vết bôi bằng cách để tự nhiên cho vết bôi khô hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn trong khoảng thời gian 2-3 giây.

- Vết bôi sau khi được cố định tiến hành nhỏ 5 giọt crystal violet và để yên trong khoảng thời gian 30 giây.

- Rửa với nước khoảng 5 giây.

- Nhỏ dung dịch iốt lên và để yên 1 phút.

- Rửa với nước khoảng 5 giây .

- Tẩy màu bằng cồn 95% từ 15 đến 30 giây. Không tẩy màu quá nhiều. Có thể làm mất màu từ 30 – 60 giây với dung dịch isopropanol-acetone.

- Rửa với nước khoảng 5 giây .

- Nhuộm lại với safranin khoảng 60 – 80 giây. Dung dịch safranin được chuẩn bị với nồng độ phù hợp và thời gian nhuộm đối với mỗi loại thuốc nhuộm là khác nhau. (Nếu sinh viên không nhìn thấy màu rõ ràng, có thể sử dụng thuốc nhuộm Bismark brown tốt hơn safranin.)

- Rửa với nước khoảng 5 giây .

- Làm khô với giấy thấm nước và quan sát dưới dầu soi. Vi khuẩn gram (+) cho màu xanh lục tới màu đỏ tía, vi khuẩn gram (-) cho màu hồng nhạt tới màu đỏ. Quy trình trên được minh họa qua (hình 10-4).

265

Hình 10-4: Quy trình nhuộm gram.

10.4. Kỹ năng

Nên:

- Việc pha loãng và đổ đĩa phải đảm bảo sao cho số lượng khuẩn lạc đếm được phải

mang tính chất thống kê.

- Thay đổi pipette sau mỗi lần hút. - Nên đeo găng tay trong suốt quá trình nhuộm gram.

Không nên:

- Trong quá trình phân lập không nên lấy khuẩn lạc mà sinh viên nghi ngờ là dính với

bất kì khuẩn lạc nào khác.

- Trong quá trình làm khô vết bôi không nên hơ quá nóng vết bôi.

266

- Không nên dùng chất tẩy vào quá nhiều và trong khoảng thời gian quá dài vì lúc này cớ thể tẩy hết tất cả những chất màu và sinh viên sẽ không thấy được dưới kính hiển vi.

10.5. Câu hỏi.

1. Nêu những điểm khác nhau về hình dạng và kích thước của một số khuẩn lạc của vi khuẩn và của xạ khuẩn.

2. Tính toán số CFU của vi khuẩn và xạ khuẩn trên một gram đất khô của sinh viên từ đó tính thêm độ lệch chuẩn và phương sai của mẫu.

3. Quan sát khuẩn lạc trong quá trình cấy phân lập về hình dạng và kích thước. Có hay không những khuẩn lạc mà sinh viên cho là tạp nhiễm trong đĩa cấy của sinh viên? Tìm hiểu những nguyên nhân gây ra sự tạp nhiễm trên.

4. Mô tả và vẽ chi tiết việc nhuộm gram và sau khi quan sát bằng dầu soi dưới kính hiển vi cho tiêu bản mà sinh viên chuẩn bị.

5. Báo cáo đường kính phân giải của các chất kháng sinh mà sinh viên thử nghiệm.

6. Thảo luận ảnh hưởng của chất kháng sinh đối với mỗi loại vi khuẩn.

7. Nhân tố nào có trong đất có tác dụng quyết định đến số lượng vi khuẩn và xạ khuẩn có trong đất?

8. Môi trường mà sinh viên chọn đỗ đĩa có ảnh hưởng đến kết quả của sinh viên không? Ảnh hưởng như thế nào? Tại sao môi trường đổ đĩa dùng cho xạ khuẩn khác với vi khuẩn? Trong các thành phần của môi trường đó chất nào có ý nghĩa quyết định?

9. Trong quá trình nhuộm gram sinh viên nên lưu ý những vấn đề gì?

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Pepper, I.L., and Gentry, T.J. (2002) Incidence of Bacillus anthracis in Soil. Soil Science 167, 627–635.

Pepper, I.L., Gerba, C.P., and Brusseau, M.L. (1996) Pollution Science. Academic Press, San Diego.

Tài liệu tham khảo.

Pillai, S.D., and Pepper, I.L. (1991) Transposon Tn5 as an identifiable markerin rhizobia: Survival and genetic stability of Tn5 mutant bean rhizobia under temperature stressed conditions in desert soils. Microbial Ecology 21, 21–33.

267

BÀI 11: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẢO: BẢNG LIỆT KÊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN.

11.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: Xác định số lượng tảo có trong đất bằng phương pháp MPN (most probable number) số có chỉ số cao nhất.

- Xác định độ ẩm của đất trước và sau khi ủ.

- Cho mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm chứa sẵn môi trường.

- Quan sát sự phát triển trong ống nghiệm sau 4 tuần ủ.

- Tính toán nồng độ tảo có trong đất bằng phương pháp MPN.

11.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Tảo là một loại vi sinh vật quang dưỡng thuộc họ eukaryotic, trong quá trình phát triển đòi hỏi phải có ánh sáng để tổng hợp nên nguồn photpho. Vì thế hầu hết các tế bào tảo sẽ được tìm thấy trên lớp bề mặt đất. Tuy nhiên, có một vài loại tảo dị dưỡng có thể được tìm thấy ở cách mặt đất khoảng 1m (Maier et al, 2000). Tảo là một loại vi sinh vật rất quan trọng cho đất và chúng phát triển hiếm khi sử dụng bất kỳ một chất hữu cơ nào bên cạnh đó nó giúp cho đất giữ lại các ngoại bào của polysaccharides (Killham,1994). Trên bề mặt đất chúng ta có thể tìm thấy khoảng 10000 tế bào/g đất khô (Maier et al, 2000). Nhưng số lượng tảo trên bề mặt vẫn ít hơn số vi sinh vật và các loại nấm.

Tảo là một loại vi sinh vật quang dưỡng, môi trường để phân lập chúng cần những chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng. Để xác định số lượng tảo ta dùng phương pháp số có chỉ số cao nhất. MPN là phương pháp cơ bản để khẳng định sự có mặt của vi sinh vật sau khi pha loãng, việc khẳng định này dựa vào sự thay đổi về màu sắc của môi trường hoặc khả năng sinh khí của vi sinh vật, kiểm chứng lại điều này người ta có một mẫu dùng để đối chứng. Việc tính toán cho phương pháp này không có gì phức tạp, người ta đã xây dựng một bảng thống kê dành riêng cho phương pháp này, sinh viên chỉ cần dựa vào kết quả thực hành sau đó dựa vào bảng thống kê để dò tìm kết quả. Phương pháp MPN dùng để phân tích cho vi sinh vật có trong đất bên cạnh đó người ta thường dùng để xác định số lượng vi sinh vật gây bệnh có trong các mẫu nước và thực phẩm như là Coliforms, E.coli,..vv.

Đối với phương pháp MPN công việc chuẩn bị cũng tương tự như các bài pha loãng và đổ đĩa nhưng ở phương pháp này sau khi pha loãng ứng với mỗi độ pha loãng người ta cho vào 5 ống nghiệm và mỗi ống chỉ dùng 1ml mẫu đã pha loãng. Thông thường người ta chỉ dùng ba nồng độ pha loãng liên tiếp nhau như 10-1, 10-2, 10-3. sau đó đem ủ các ống nghiệm này dưới ánh sáng. Quy trình thực hiện sinh viên có thể tham khảo theo (hình 16-1) dưới đây.

268

Hình 11-1: Quy trình xác định số vi sinh vật bằng phương pháp MPN.

11.3. Tiến hành thí nghiệm.

Giai đoạn 1:

- Tiến hành cân 25g mẫu đất và cho vào một cái cốc có dán nhãn riêng biệt cho mỗi loại đất. Tính toán lượng nước cường toan cho vào mẫu đất đó theo yêu cầu của giáo viên về độ ẩm. Dùng bao nilong bao kín lấy mẫu đất sau đó dùng que tăm đâm vài lỗ nhỏ sao cho vừa tạo điều kiện hiếu khí mà độ ẩm giảm xuống không đáng kể.

- Nên xác định khối lượng của bao gói để tính độ ẩm của đất vào thời điểm cuối. Tiến hành ủ mẫu trên ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian một tuần.

Giai đoạn 2:

269

- Tiến hành pha loãng và cho 10g đất vào 95ml nước và chuẩn bị 5 ống nghiệm mỗi ống

chứa 9ml môi trường Bristol’s.

- Tiến hành pha loãng với các nồng độ từ 10-2 đến 10-6, ở mỗi nồng độ pha loãng cho 1ml vào mỗi ống nghiệm tiến hành 5 ống nghiệm ở một nồng độ pha loãng. Ủ các ống nghiệm trong 4 tuần có ánh sáng.

Giai đoạn 3:

- Quan sát và đếm số ống nghiệm dương tính ứng với mỗi nồng độ cần có sự ghi chép

cẩn thận sau đó dựa vào bảng thống kê và tính toán kết quả.

11.4. Tính toán.

Hai ví dụ tính toán sau đây sẽ giúp sinh viên nắm bắt được cách xác định số lượng tảo có trong một gram đất khô nói riêng và số lượng vi sinh vật nói chung bằng phương pháp MPN.

Ví dụ 1:

Hình 16.2 sẽ mô tả cho sinh viên biết được đặc điểm các ống nghiệm sau quá trình ủ. Các ống nghiệm có màu đậm sẽ cho kết quả dương tính, ống nghiệm rỗng cho kết quả âm tính. Các ống nghiệm được pha loãng theo quy trình hình 8.1 số lượng đất khô trong mỗi ống từ 8,2.10- 3g ống B đến 8,2.10-7g ống F. Vì khối lượng đất ước ban đầu là 10g sau quá trình ủ và quá trình pha loãng ta được kết quả như trên.

Hình 11-2: Minh họa cho ví dụ 1.

Hình 16-2: Gỉa thuyết kết quả xác định số lượng tảo bằng phương pháp MPN.

270

- Trên hình 11-2 sinh viên thấy cột B có 5 ống dương tính nhưng ta không tính cột này vì cột C cũng có 5 ống dương tính nhưng độ pha loãng của cột C cao hơn cột B lưu ý rằng cột B và C đều có số ống nghiệm có số ống dương tính đạt tối đa. Vì thế ta chọn p1 =5 ở cột C với độ pha loãng là 10-3.

- Tương tự như vậy ta chọn p2=3 và p3 = 1. Sau đó lấy giá trị p1=5 dò tìm ở bảng 4.1 và p2=3. Khi chúng ta thấy được dòng giá trị của p1 và p2 và tìm cột giá trị của p3. giá trị của kết quả là giao điểm của dòng p1 và p2 và cột p3 tìm ở bảng 4.1 ta được giá trị cần xác định là 1,1.

Vậy số tế bào tảo trên 1g đất khô là : 1,1/8,2.10-5 = 1,34.104 tế bào tảo/g đất khô.

Giới hạn tin cậy trên và giới hạn tin cậy dưới ở mức 95% được tính toán từ bảng 11.2. Trong bài thí nghiệm này ta dùng độ pha loãng 10 lần và sử dụng 5 ống nghiệm do đó tra bảng 11.2 ta có giá trị là 3,3.

Vậy giới hạn trên là: 1,34.104x3,3 = 4,42.104 tế bào tảo/g đất khô.

Vậy giới hạn dưới là: 1,34.104/3,3 = 4060 tế bào tảo/g đất khô.

Bảng 11.1: Xác định chỉ số P3 số có chỉ số lớn nhất (Alaxander 1982).

271

Ví dụ 2:

Hình 16-3 cho p1=4, p2=3, p1=0, cho p2 có 8,2.10-4g/ml. Xác định chỉ số MPN cho kết quả là 0,27 tế bào/ml hay là 329 tế bào tảo/g đất. giá trị này ít hơn giá trị trong ví dụ 1. Gía trị giới hạn trên là 1086.

272

Hình 11-3: Minh họa cho ví dụ 2.

Bảng 11.2: Bảng dùng để tính toán giới hạn dưới và giới hạn trên trong phương pháp MPN (Alaxander 1982).

11.5. Câu hỏi.

1. Tính toán số lượng tảo có trong mẫu đất thí nghiệm.

2. Tính toán giới hạn trên và giới hạn dưới.

273

3. Điều kiện như thế nào thì loài tảo có thể cạnh tranh và phát triển thuận lợi hơn so với vi sinh vật dị dưỡng?

Alexander, M. (1982) Most probable number methods for microbial popula- tions. In: Methods of Soil Analysis, Part 2: Chemical and Microbiological Properties, 2nd edition, pp. 815–820. American Society of Agronomy, Inc., Soil Science Society of America, Inc., Madison, Wisconsin.

Killham, K. (1994) Soil Ecology, Cambridge University Press, Cambridge, UK.

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Tài liệu tham khảo.

274

CHƯƠNG 4: VI SINH VẬT TRONG NƯỚC.

BÀI 12: XÁC ĐỊNH SỐ COLIFORM TRONG NƯỚC BẰNG THỬ NGHIỆM MPN.

12.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: xác định số lượng coliform trong nước bằng phương pháp MPN.

- Ủ mẫu nước trong môi trường LST lactose broth. - Quan sát và ghi nhận ống nghiệm nào có sinh khí. - Để khẳng định mẫu đó có coliform ta cấy ống nghiệm có sinh khí trên môi trường

EMB hoặn Endo agar.

- Tính toán số lượng coliform trong nước bằng phương pháp MPN.

12.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Môi trường nước là điều kiện tốt nhất để tồn tại nhiều loại vi sinh vật với độ ẩm rất cao bao gồm các loại vi khuẩn, tảo, sinh vật đơn bào, vi rút.. Trong đó có nhiều loại vi sinh vật gây bệnh cho con người như là E.coli, Clostridium, Staphylococcus… các loại vi sinh vật này xâm nhận vào cơ thể con người qua nhiều con đường khác nhau sống chủ yếu trong đường ruột và theo phân được thảy ra ngoài. Trong môi trường nước rất bị nhiễm các loại vi sinh vật này chính vì biết nguyên nhân và tác hại của các loại vi sinh vật gây bệnh việc khử trùng và lọc nước được thực hiện cách nay khoảng một thế kỷ trên đất nước Hoa Kỳ do đó đã loại khỏi hoàn toàn các bệnh về tả lị và thương hàn trên đất nước này.

Coliform là một nhóm vi khuẩn thường gây bệnh đường ruột ở người và động vật. chúng là loại hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, thuộc loại vi khuẩn gram âm, không tạo bào tử và không có khả năng di động thường ở dạng trực khuẩn. chúng có khả năng lên men đường lactose và sinh khí trong môi trường sau 48h ở 350C. Coliform bao gồm E.coli, Citrobacter, Enterobacter, Klecbsiella. Thử nghiệm bằng phương pháp MPN và phương pháp dùng màng lọc thường được áp dụng cho việc xác định số lượng coliform có trong nước. Tuy nhiên phương pháp màng lọc cũng không thể áp dụng dễ dàng như chúng ta nghĩ, ở phương pháp này có nhược điểm là không thể lọc được với các loại nước có độ cặn cao vi nó sẽ cản trở cho việc lọc. Phương pháp MPN cho việc xác định coliform gồm ba bước cơ bản là: cơ sở, chứng thực và cuối cùng là khẳng định.

Bước đầu tiên chúng ta tiến hành ủ mẫu nước trong ống nghiệm có chứa môi trường lauryl sulfate tryptose (LST) lactose broth hình (12-1). Trong môi trường này laurylsunfate là chất hoạt động bề mặt có tác dụng ức chế các loại vi khuẩn gram dương tạo điều kiện cho vi khuẩn gram âm phát triển. coliform sử dụng oxy có mặt trong môi trường để lên men lactose và tạo ra acid và khí dưới điều kiện yếm khí. Khí được tạo ra trong khoảng thời gian từ 24- 48h sẽ cho kết quả dương tính. Khí được tạo ra và phát hiện nhờ có ống Durham (hình 12-2).

275

Nếu có khí sinh ra chúng ta có cơ sở nói rằng có quá trình lên men đường lactose. Tuy nhiên không thể chắc chắn được rằng đó là coliform vì có những loại vi khuẩn gram dương vẫn có khả năng lên men đường lactose như là Clostridium perfringens. Để xác nhận quá trình lên men đường lactose của vi sinh vật gram âm ta cần ủ vi sinh vật trên trong môi trường EMB hoặc là môi trường BGBL, vì các loại môi trường này sẽ ức chế hoàn toàn các vi sinh vật gram dương. Trong môi trường EMB có chứa methylen blue sẽ hạn chế được vi khuẩn gram dương. Khi phát triển trên môi trường này khuẩn lạc của E.coli sẽ cho màu đen nhỏ có ánh kim. Trong môi trường Endo chứa chất chỉ thị fuschsin sulfite nhận thấy quá trình lên men đường lactose khá dễ dàng. Và khuẩn lạc của coliform sẽ có một vùng đỏ trên môi trường Endo agar, nếu không có hiện tượng lên men sẽ không có sự thay đổi màu của môi trường. ngoài hai loại môi trường kể trên còn có môi trường BGBL có khả năng chứng thực sự có mặt của coliform vì trong môi trường này có chứa muối mật sẽ ức chế được các loại vi khuẩn gram dương và chấy chỉ thị là Brillian green và một số môi trường khác như là Eijkman’s EC.

Khi có kết quả thử nghiệm dương tính với BGBL và trên môi trường EMB kết hợp với quá trình nhuộm gram cho kết quả gram âm. Điều này cho chúng ta xác nhận rằng vi khuẩn này thuộc nhóm coliform. Tuy nhiên trên thực tế người ta còn có thể thử nghiệm các phản ứng sinh hóa như IMVIC.

12.3. Tiến hành thí nghiệm.

Giai đoạn 1:

Nguyên liệu.

- Mẫu nước. - 3 ống nghiệm có ống durham trong môi trường lactose broth nồng độ kép. - 6 ống nghiệm có ống durham trong môi trường lactose broth nồng độ đơn. - 1 pipette 10ml. - 1 pipette 1ml. - 1 pipette bầu. - 1 tủ ấm ở 350C.

Bảng 12.1: Bảng MPN sử dụng dùng để ước lượng giá trị trong bài thí nghiệm cho 3 ống ở ba nồng độ pha loãng liên tiếp nhau.

276

Thử nghiệm cơ sở:

- Chuẩn bị 3 ống lactose kép và 6 ống lactose đơn ở bước 1 và dán nhãn theo số lượng

mẫu nước cho vào 10ml, 1ml, 0.1ml.

- Lắc đều mẫu khoảng 25 lần. - Dùng pipette 10ml hút 10 ml mẫu nước cho vào ống nghiệm chứa lactose kép. Làm

như thế cho hai ống còn lại.

- Dùng pipette 1ml hút 1ml mẫu nước vào ống lactose đơn và 0.1ml vào ống lactose

đơn. Mỗi nồng độ làm 3 ống.

- Ủ các ống nghiệm trên trong 24-48 giờ ở 350C.

277

Thử nghiệm xác định:

- Chọn ống nghiệm dương tính trong môi trường lactose broth. Tiến hành cấy lên các

đĩa chứa môi trường EMB và môi trường Endo.

- Tiến hành ủ trong 24h ở 350C. - Quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc sau đó ghi vào bài báo cáo của sinh viên.

Thử nghiệm kết luận:

278

- Quan sát khuẩn lạc mọc ở hai môi trường nếu không có kết quả nào dương tính thì có thể kết luận rằng mẫu nước đó là an toàn.

12.4. Câu hỏi.

1. Tại sao xác định coliform là đại diện cho các loại vi sinh vật gây bệnh? 2. Nêu tên hai loại vi sinh vật thuộc nhóm coliform mà sinh viên thường gặp nhất? 3. Coliforms được định nghĩa như thế nào? 4. Nêu tên bốn loại vi sinh vật gây bệnh có trong nước? 5. Khuẩn lạc của coliforms trong môi trường EMB là màu gì? Tại sao lại có màu đó? 6. Xung quanh khuẩn lạc của coliforms trong môi trường Endo có màu gì ? Tại sao lại

có màu đó?

7. Tại sao phải thêm muối mật vào môi trường BGBL? 8. Mục đích của việc cho ống Durham vào ống nghiệm để làm gì? 9. Tiêu chuẩn xác định coliform trong nước uống ở Mỹ là tiêu chuẩn nào? 10. Lưu ý điều gì khi cho ống Durham vào ống nghiệm?

APHA (1998) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association, Washington, DC.

Tài liệu tham khảo.

279

BÀI 13: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC.

13.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: Xác định coliform và coliform phân bằng phương pháp màng lọc.

- Lọc mẫu nước bằng màng lọc. - Ủ màng lọc trên môi trường thạch đĩa từ 24-48h. - Quan sát và đếm số khuẩn lạc coliform và coliform phân. - Tính toán số lượng coliform và coliform phân trong mẫu nước.

13.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Ngoài phương pháp MPN người ta còn sử dụng phương pháp màng lọc để xác định số lượng vi sinh vật có trong nước, màng lọc phải đảm bảo kích thước lỗ lọc khoảng 0.45µm. Phương pháp màng lọc rất dể thao tác và cho kết quả nhanh hơn phương pháp MPN và áp dụng với lượng mẫu lớn hơn khoảng 250ml, tuy nhiên còn phụ thuộc nhiều ở điều kiện môi trường, chọn môi trường nào phù hợp sao cho ở trên môi trường đó vi sinh vật dễ phát triển và có một điểm đặt biệt để phát hiện là nó chứ không phải vi sinh vật khác. Cũng dùng phương pháp màng lọc để xác định coliform và coliform phân nhưng khác nhau ở chổ coliform phân chịu nhiệt hơn ở 44,50C còn coliform phát triển ở 350C. Tuy nhiên đối với phương pháp màng lọc không thể áp dụng đối với các mẫu nước quá đục và có nhiều cặn lơ lửng vì như vậy sẽ làm cản trở quá trình lọc.

13.3. Tiến hành thí nghiệm.

Nguyên liệu:

- Kẹp gấp. - Đèn cồn. - 6 đĩa petri. - 6 mảng lọc có đường kính 0.45µm. - 15ml FC agar . - 6ml Endo broth. - Tủ ấm 450C.

1. Lấy màng lọc đặt trên cổ bình sau đó đặt phểu đựng nước lên trên, dùng kẹp kẹp chặt giữa phểu và cổ bình sao cho màng lọc ở vị trí trung tâm.

2. Tiến hành lọc mẫu nước bằng cách cho vào từ từ đến khi nào hết nước trên phểu.

3. Thao tác cẩn thận dùng kẹp triệt trùng gấp nhẹ nhàng màng lọc ra và nhanh chóng đặt trên môi trường Endo broth – MF đối với coliform phân và đặt vào đĩa petri chứa môi trường FC agar đối với coliform.

4. Ủ đĩa petri xác định coliform phân ở 450C và ủ đĩa petri xác định coliform ở 350C. 280

5. Quan sát khuẩn lạc mọc trên môi trường Endo broth MF nếu khuẩn lạc của coliform sẽ có màu đỏ hoặc hồng hoặc xanh và có ánh kim. Khuẩn lạc không có ánh kim xem như không phải là coliform phân.

6. Quan sát trên môi trường FC khuẩn lạc của coliform phân có màu xanh lục chúng ta không nên quan tâm đến hình dạng. Các khuẩn lạc khác không phải coliform phân.

Hình 13-1: Thao tác tiến hành lọc.

13.4. Tính toán.

Số lượng vi khuẩn có trong dung dịch lọc sẽ là:

Số vi khuẩn trên bề mặt lọc x 100/ số ml nước lọc.

Ví dụ: Lọc 250 ml nước máy sau khi lọc và ủ trên môi trường thạch ta đếm được số khuẩn lạc là 50 khuẩn lạc. vậy số vi khuẩn có trong 100ml nước là: 50x100/250 = 20 vi khuẩn/100ml.

13.5. Câu hỏi.

1.Nhược điểm của phương pháp dùng màng lọc là gì?

2. Sự khác nhau giữa coliform và coliform phân là gì?

3. Tiêu chuẩn xác định coliform phân thường áp dụng cho những loại nước nào? (Nước giếng, nước hồ bơi, nước sinh hoạt, nước uống, nước đá).

4. Nêu lên những ưu điểm của phương pháp sử dụng màng lọc ?

APHA (1998) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2nd edition. American Public Health Association, Washington, DC.

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Tài liệu tham khảo.

281

CHƯƠNG 5: SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHẤT CỦA VI SINH VẬT.

BÀI 14: SỰ OXI HÓA CÁC HỢP CHẤT SUNFUR CÓ TRONG ĐẤT.

14.1. Mục tiêu thí nghiệm.

Mục tiêu: Theo dỏi sự oxy hóa các hợp chất sunfur thành sunfate đồng thời với sự giảm pH do tạo ra các sản phẩm mang proton.

- Ủ ba mẫu đất ( mẫu đất bình thường dùng để kiểm chứng, mẫu đất có thêm sulfur,

mẫu đất có thêm sulfur và glucose).

- Xác định độ ẩm của tất cả ba mẫu đất kể tên. - Ủ các mẫu đất đó trong thời gian 3 tuần. - Xác định khả năng oxy hóa sulfur bằng việc phân tích hàm lượng sulfate và giá trị pH

hàng tuần.

14.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Một trong những phương pháp ước định số vi sinh vật có trong đất người ta còn xác định các hoạt động sinh lý của chúng mà tiêu biểu là xác định enzyme và hoạt lực của chúng. Các phản ứng enzyme có trong đất có thể xảy ra ở hai dạng hữu sinh và vô sinh. Vì thế việc thêm các chất dinh dưỡng vào trong tế bào để xác nhận các phản ứng hóa học xảy ra do sự xúc tác của enzyme là công việc cần thiết (Burns, 1982; Skujins 1976). Có hai loại enzyme ngoại bào và enzyme nội bào. Việc oxy hóa các hợp chất sulfur có trong đất là do các loại vi sinh vật tự dưỡng hoặc các loại vi sinh vật dị dưỡng hoặc vi sinh vật dị dưỡng gây ra đôi khi có ích và cũng có khi gây nguy hại cho đất. Oxy hóa các hợp chất sulfur tạo ra dạng sunfate làm giảm pH của phản ứng bằng cách tạo ra sản phẩm theo phương trình sau đây:

Các loại vi sinh vật hóa tự dưỡng như là Thiobacillus thiooxidans sử dụng nguồn năng lượng giải phóng ra từ phản ứng tạo ra CO2. Tuy nhiên, các vi sinh vật hóa tự dưỡng oxy hóa S bị hạn chế bởi nguồn Cacbon như (hình 19- 1). Vì thế ở các loại đất có có hàm lượng các chất hữu cơ cao có thể hạn chế sự oxy hóa các hợp chất sulfur bởi các vi sinh hóa tự dưỡng.

282

Hình 14-1: Mô tả sự oxy hóa S bởi Thiobacillus thiooxidans với sự có hay không có glucose ( Pepper và Miler, 1978).

Đối với các loại vi sinh dị dưỡng có thể oxy hóa S theo phản ứng trên, nhưng việc oxy hóa có thể không cần năng lượng và vẫn tạo ra sản phẩm là H+ và SO4 2-. Sự oxy hóa S của các loại vi sinh vật dị dưỡng sẽ không xảy ra nếu không có mặt của nguồn cacbon được thể hiện ở (hình 14-2).

Hình 14-2: Mô tả sự oxy hóa S bởi các loại vi sinh vật dị dưỡng với sự có hay không có glucose ( Pepper và Miler, 1978).

Đối với các loại vi sinh vật không oxy hóa sulfur chúng ta có thể thêm glucose vào để cho sự chuyển hóa cơ chất diển ra dễ dàng hơn. Chúng ta có thể cố định sinh khối của vi sinh vật mà vẫn có thể tạo ra sulfate được thể hiện ở (hình 14-3).

283

2- bằng cách thêm BaCl2 vào để tạo ra BaSO4 đây là dung dịch có Để xác định hàm lượng SO4 độ đục vì thế để xác định hàm lượng SO4 chúng ta dùng phương pháp đo quang để xác định lượng SO4 tạo thành. Mật độ quang càng lớn chứng tỏa hàm lượng SO4 càng nhiều. Để đo mật độ quang xác định hàm lượng SO4 người ta đo ở bước sóng 470nm.

2- µg/ml với độ hấp thu A.

Hình 14-3: Ảnh hưởng của glucose và S đến sự oxy hóa các hợp chất sulfur.

2- µg/ml

Bảng 19.1. Mối quan hệ giữa nồng độ SO4

Độ hấp thu A SO4

0.00 0.000

12.50 0.293

25.00 0.478

50.00 0.883

78.00 1.380

14.3. Tiến hành thí nghiệm.

Chuẩn bị:

- 640 g đất để phân tích. 284

- Cân phân tích.

- pH kế.

- Glucose.

- 40 ml CaCl2 0.01M.

- 25ml NaCl 0.1M.

- Pipette.

- BaCl2.

- Máy đo quang ở bước sóng 470nm.

Chuẩn bị:

- Cân 240 g mẫu đất dùng để đối chứng. - Cân 200g đất có bổ sung thêm 0.5g Sulfur. - Cân 200g đất có bổ sung thêm 0.5g Sulfur và 0.5% glucose.

- Trộn các mẫu đất trên sao cho đồng nhất.

- Thêm vào một lượng nước bằng cách cho vào từ từ để đảm bào yêu cầu về độ ẩm của giáo viên.

- Tiến hành bao gói các mẫu đất lại và đảm bảo điều kiện hiếu khí xảy ra.

- Cân mẫu đất và dụng cụ chứa đựng kể cả bao gói.

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH LOẠI ĐẤT TRƯỚC KHI TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM.

1.Xác định pH.

- Cân chính xác 10g đất cho vào một cái bercher 100ml.

2-.

- Cho vào đó 20ml 0.01M CaCl2 sau đó khuấy đều và để ổn định ít nhất 30s. Sau đó dùng Ph kế đo kết quả lưu ý rằng chỉ đọc kết quả khi nào số chỉ trên Ph không thay đổi nửa hoặc thay đổi không quá 0.1 đơn vị.

2. Xác định SO4

- Cân 10 g đất cho vào erlen 125ml. Sau đó cho thêm 25ml dung dịch NaCl 0.1M sau đó khuấy đều trong 30s.

- Thêm 0.2g than hoạt tính để hấp thụ tất cả các chất màu không mong muốn có trong dung dịch.

285

- Dùng giấy lọc để lọc ít nhất 5ml dung dịch lọc để tiến hành xác định hàm lượng SO4.

- Cho 5ml dung dịch lọc được vào ống nghiệm sau đó cho thêm 1ml 0.5% chất ổn định gum agarbic và thêm 0.5g BaCl2 tinh thể với lượng này đủ để kết tủa toàn bộ lượng SO4 có trong dung dịch.

- Cho dung dịch thu được ở trên vào cuvet và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 470nm sau đó tra ở bảng 19.1 để xác định nồng độ SO4. Trong trường hợp đặt biệt nếu độ hấp thụ A lớn hơn nhiều so với 1.3 thì chúng ta tiến hành pha loãng rồi mới đo quang.

-Ủ mẫu đất thí nghiệm ở nhiệt độ phòng để chuẩn bị cho bước 2.

2-. Làm công việc này

- Cân lại khối lượng của đất và cả bao chứa.

- Tiến hành xác định mẫu đất cho 3 loại về giá trị PH và nồng độ SO4 sau mỗi tuần ủ.

2 trên 1g đất khô ta áp dụng công thức sau:

14.4. Tính toán.

Để tính toán nồng độ SO4

14.5. Câu hỏi.

1.Các chất hữu cơ có ảnh hưởng như thế nào đến việc oxy hóa các hợp chất sulfur có trong đất?

2. Mô tả quá trình oxy hóa hợp chất sulfur của Thiobacillus thiooxidans?

3.Tại sao phân bón ở tây nam nước Mỹ thường phải bổ sung thêm sulfur?

Burns, R.G. (1982) Enzyme activity in soil: Location and possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry 14, 423–427.

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Pepper, I.L., and Miller, R.H. (1978) Comparison of the oxidation of thiosul- fate and elemental sulfur by two heterotrophic bacteria and Thiobacillus thiooxidans. Soil Science 126, 9–14.

Skujins, J. (1976) Extracelluar enzymes in soil. CRC Critical Reviews in Microbiology 4, 383–421.

Tài liệu tham khảo.

286

BÀI 15: NITRITE HÓA VÀ SỰ KHỬ NITRITE HÓA.

15.1. Mục tiêu và nhiệm vụ.

Mục tiêu: Nhận thấy được tầm quan trọng của vi sinh vật chuyển đổi các hợp chất nito có trong đất.

-Thêm nitrate vào trong đất và đảm bảo sự thay đổi số lượng trong suốt quá trình ủ. -Thêm muối amoni vào trong đất và ủ trong vòng một tuần với các cách xử lý sau: hiếu khi, kị khí, hiếu khí kết hợp với glucose, kị khí kết hợp với glucose. -Xác định hàm lượng nitrate ban đầu để xác định sự nitrite hóa hoặc khử nitrite hóa.

15.2. Cơ sở lý thuyết và ý nghĩa.

Nitrat hóa (Nitrification): Là quá trình chuyển hóa từ NH3 (NH4 + ) dưới tác dụng của các loài vi sinh vật thành NO3 - được gọi là quá trình nitrát hóa. Quá trình nitrát hóa xảy ra hai giai đoạn: nitrít hóa và nitrát hóa.

- Quá trình nitrít hóa:

+ + 3/2O2 → NO2 - + 2H+ + H2O + Q

Vi sinh vật + NH4

Tham gia quá trình này có 4 giống chủ yếu: Nitrosomonas; Nitrosolobus; Nitrocystis; Nitrosospira.

- Quá trình nitrát hóa:

Vi sinh vật + NO2 - + 1/2O2 → NO3 - + Q

Tham gia quá trình này gồm có 3 giống vi sinh vật: Nitrobacter; Nitrospira; Nitrococcus. Điều kiện chung cho vi khuẩn nitrat hóa là pH: 5,5 - 9, nhưng tốt nhất là 7,5, khi pH < 7 thì vi khuẩn phát triển chậm lại

Phản Nitrat (Denitrification): Là quá trình chuyển hóa NO3 - thành N2 để bù trả lại nitơ cho không khí được gọi là quá trình phản nitrát hóa. Vi khuẩn tham gia vào quá trình phản nitrate hóa bao gồm các loại yếm khí không bắt buộc như: Achromobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Proteus, Pseudomonas,... Những vi khuẩn này đều là dị dưỡng, có khả năng khác nhau trong sự khử nitrat theo 2 bước:

- Chuyển hóa nitrat thành nitrit.

- Tạo ra nitơ oxít, đinitơ oxít, khí nitơ.

Cơ chế: Dưới tác dụng của các loài vi sinh vật:

HNO3 →HNO2 →HNO→ N2O →N2 + H2O

287

NH4Cl + HNO2 → HCl + H2O + N2↑

R-NH2 + HNO2 → R-OH + H2O + N2↑

R – CO – NH2 + HNO2 → R – COOH + H2O + N2↑

15.3. Tiến hành thí nghiệm.

Giai đoạn 1:

Chuẩn bị.

- cân 400g đất đối với mỗi loại đất. - 4 cốc đủ lớn để chứa 100g đất. - KNO3 - Cân phân tích. - Deionized water.

Tiến hành.

- Cho 4x100g đất vào 4 beaker. Thêm 0.1% KNO3 so với trọng lượng khô của đất vào

các mẫu đất trên. Trộn đều hổn hợp đất và chất được thêm vào.

- Cân 2x25g đất vào trong beaker mà không có nitrate. - Bổ sung thêm nước để đạt yêu cầu về độ ẩm theo sự hướng dẫn của giáo viên. Sau đó

dùng bao nilong cột lại và ủ các mẫu trên trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.

Giai đoạn 2.

Chuẩn bị.

Nguyên liệu.

- Mẫu đất đã ủ ở giai đoạn 1. - Cân phân tích. - 6 erlen 125ml. - (NH4)2SO4. - Glucose.

Nồng độ nitrate trong tuần đầu.

- cân lại tất cả các mẫu đất. - xác định độ ẩm mới. - cho vào 6 erlen 125ml mỗi erlen 10g đất (4 mẫu có bổ sung nitrate và 2 mẫu không có

bổ sung nitrate).

- Thêm tiếp 25ml nước deionized vào mỗi bình chứa và khuấy không liên tục trong

vòng 30s.

- Tiến hành lọc dung dịch trên bằng giấy lọc, chỉ cần vài ml dung dịch lọc.

288

- Ngâm test thử nitrate vào dung dịch lọc sau đó sử dụng thang đo màu để xác định hàm - trong tuần đầu tiên. Có thể pha loãng rồi

lượng nitrate có trong mẫu. Đọc kết quả NO3 đem đi xác định nồng độ nếu hàm lượng nitrate trong mẫu quá cao.

- Tính toán lượng nitrate có mặt trong mỗi mẫu đất.

Thêm muối amoni vào trong đất.

- Bổ sung vào 4 mẫu đất có nitrate với 0.1%(NH4)2SO4 trên một g đất khô, trộn hổn hợp

trên.

- Dán nhãn vào các bình chứa như sau: kị khí, kị khí kết hợp với glucose, hiếu khí, hiếu

khí kết hợp với glucose.

- Thêm glucose vào 2 lọ xử lý với glucose và nồng độ glucose là 0.5% trên 1g đất khô,

trộn đều hổn hợp trên.

- Đôi với hai mẫu xử lý với điều kiện kị khí thêm vào một lượng nước và thay đổi loại

vỏ bọc để đảm bảo điều kiện kị khí, cân lại khối lượng của bao gói.

Giai đoạn 3:

- mẫu đất đã ủ trong tuần trước. - cân phân tích. - 5 erlen 125 ml.

Tiến hành

- Cân lại khối lượng mỗi bình chứa và ghi lại trọng lượng. Tính toán lại độ ẩm mới của

đất.

- Phân tích hàm lượng nitrate có trong 10g đất ở giai đoạn 2.

15.4. Những điều cần lưu ý.

Nên:

- Trong các mẫu xử lý hiếu khí và kị khí phải được đảm bảo, đối với mẫu xử lý kị khí

tránh oxy lọt vào.

Không nên:

- Để oxy lọt vào trong điều kiện kị khí.

15.5. Câu hỏi.

1). Mục đích của việc xử lý hiếu khí và kị khí để làm gì? So sánh giữa hai cách xử lý trên? Xử lý như thế nào ảnh hưởng đến quá trình nitrite và khử nitrite hóa?

2). Mục đích của việc thêm glucose vào các mẫu xử lí với glucose để làm gì?

3). Tại sao phải thêm muối amoni vào trong quá trình xử lý?

4). So sánh hiệu quả các cách xử lý hiếu khí, kị khí, hiếu khí kết hợp với glucose, kị khí kết

289

hợp với glucose?

5). Nhận định ích lợi và quan sát ảnh hưởng của quá trình nitrite hóa?

Atlas, R.M., and Bartha, R. (1987) Microbial Ecology: Fundamentals and Applications, 2nd edition. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park.

Maier, R.M., Pepper, I.L., and Gerba, C.P. (2000) Environmental Micro- biology. Academic Press, San Diego.

Pepper, I.L., Gerba, C.P., and Brusseau, M.L. (1996) Pollution Science. Academic Press, San Diego.

Tài liệu tham khảo.

290

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

[1].

[2].

[3].

[4]. I.L. Pepper and C.P. Gerba (2004). Environmental Microbiology A Laboratory Manual Secomd edition. Elsevier Academic Press, USA, 209 p

Tiếng Anh:

291