Tài liệu: Tinh sạch protein

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST

Báo xấu

126
lượt xem 30
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tài liệu: Tinh sạch protein

Tinh s ch protein Gi i thi u chung I. S tinh s ch c a protein r t quan tr ng vì t protein tinh s ch chúng ta có th xác nh ư c trình t acid amin, m i liên h v ti n hóa gi a các protein trong nh ng cá th khác nhau và kh o sát các ch c năng sinh hóa c a các protein ó. Hơn th n a, vi c tinh th hóa protein ch có th th c hi n v i nh ng protein tinh s ch và t nh ng tinh th ó chúng ta s bi t ư c c u trúc b c 4 cũng như các ơn v ch c năng c a protein thông qua d li u chi u x tia X. Vì v y, quá trình tinh s ch protein không ng ng ư c c i ti n t ưc tinh s ch cao nh t nhưng nhìn chung m t quá trình tinh s ch protein cũng c n i qua các bư c căn b n sau: 1. Nh n bi t protein m c tiêu 2. Ly trích protein t t bào hoà tan, kích thư c, i n tích, và liên k t ái l c 3. Thu nh n protein m c tiêu d a trên 4. Phân tách protein b ng i n di trên gel Xác nh tr ng lư ng và kh i lư ng c a protein 5. Nh n bi t protein m c tiêu II. K t qu c a s tinh s ch là m t m u protein ch ch a úng m t lo i phân t , ây là m t lo i protein mà nhà sinh hóa quan tâm. M u protein này ch là m t phân o n chi m 1% v t li u ban u, v n có th là d ch nuôi c y t bào hay m t cơ quan riêng bi t l y c a xác nh ư c protein m c tiêu t h n h p protein, nhà sinh th c v t hay ng v t. hóa c n th c hi n m t th nghi m d a vào c tính c a protein ó. N u protein m c tiêu là m t enzyme thì th nghi m s ư c th c hi n d a trên ho t tính c a enzyme ó. C th như v i enzyme lactate dehydrogenase, m t enzyme có vai trò trong vi c s n xu t năng lư ng t glucose cũng như t ng h p glucose t lactate, xác nh enzyme này thì d a trên ph n ng c a nó trong t bào Sau ó, d a vào kh năng h p th ánh sáng m nh bư c sóng 340nm c a Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có th o ư c lư ng ánh sáng ư c h p th bư c sóng 340nm trong m t ơn v th i gian xác nh ho t tính c a enzyme lactate dehydrogenase. Trên th c t vi c tìm ra m t th nghi m hi u qu thư ng r t khó, nhưng n u có ư c m t cách th nghi m càng c hi u thì quá trình tinh s ch càng hi u qu . Tuy nhiên, ch c ch n quá trình tinh s ch ho t ng t t, chúng ta còn c n m t thông s là lư ng protein có trong h n h p ư c th nghi m. Hi n nay có r t nhi u phương pháp phát hi n nhanh và chính xác n ng protein. D a vào 2 thông s th c nghi m là ho t tính enzyme và n ng protein, ta có th xác nh ho t tính riêng c a enzyme t c là t l ho t tính enzyme v i hàm lư ng protein có trong m u th nghi m. Ho t tính riêng càng cao thì quá trình tinh s ch càng hi u qu hay nói cách khác, m c tiêu c a vi c tinh s ch là làm tăng t i a ho t tính riêng. Ly trích protein t t bào III. Khi ã tìm ra th nghi m phù h p và ch n ư c ngu n protein, chúng ta c n phân o n d ch t bào thành nhi u ph n và xác nh xem ph n nào ch a nhi u protein m c tiêu. Quá
trình tìm phân o n m c tiêu ư c phát tri n b ng s mày mò qua t ng thí nghi m. Bư c u tiên là phá v màng t bào, t o thành h n h p ng ch t. Sau ó phân o n h n h p b ng ly tâm, d ch n i ch a phân t có tr ng lư ng th p, nh ng phân t có tr ng lư ng cao hơn l ng xu ng áy ng ly tâm. D ch n i l i ư c ly tâm l n n a v i l c m nh hơn t o c n và d ch n i m i. Ti n trình này, ư c g i là ly tâm phân o n, s t o ư c nhi u phân o n khác nhau v i t tr ng gi m d n, m i phân o n này ch a hàng trăm phân t protein khác nhau, s ư c tinh s ch sau khi ã qua th nghi m ho t tính. Thông thư ng, m t phân o n có ho t tính cao s là ngu n v t li u cho các k thu t tinh s ch hi u qu . IV. Thu nh n protein m c tiêu d a trên hoà tan, kích thư c, i n tích, và liên k t ái l c Hàng ngàn protein ã ư c tinh s ch d ng có ho t tính d a trên nh ng c tính căn b n như hòa tan, kích thư c, i n tích và liên k t ái l c. Thông thư ng, m t h n h p protein s tr i qua nhi u giai o n phân tách, m i giai o n d a trên m t c tính nh t nh, cu i cùng là m t protein tinh s ch. m i bư c phân tách, th nghi m xác nh protein u ư c th c hi n. Lư ng áng k protein tinh ho t tính và xác nh n ng s ch, kho ng vài miligram, có th giúp ta bi t ư c c u trúc không gian ba chi u và cơ ch ph n ng c a nó. Vì v y, s n lư ng toàn ph n là m t i m quan tr ng c a quá trình tinh s ch. Các k thu t tinh s ch thư ng dùng: t a b ng mu i, màng bán d n, s c ký. IV.1 T a b ng mu i mu i cao, ph n l n protein s gi m tính hòa tan, hi n tư ng này g i là t a n ng b ng mu i (salting out). M i lo i protein s k t t a m t n ng mu i nh t nh. Vì v y, hi n tư ng t a b i mu i có th ư c dùng phân o n protein. Ví d như fibrinogen t a n ng mu i ammonium sulfate 0.8 M trong khi ph i n n ng 2.4 M, albumin m i k t t a. Hi n tư ng này ư c s d ng tăng n ng c a m t dung d ch protein loãng ch a các phân o n có ho t tính c a các bư c tinh s ch trư c. N u c n thi t, lư ng mu i có th ư c lo i b b ng s th m tách IV.2 S th m tách Protein có th ư c phân tách b ng s th m tách thông qua màng bán d n, ch ng h n màng cellulose v i nhi u l . Nh ng phân t có c u tr c không gian nh t nh l n hơn dư ng kính c a l s b gi l i bên trong túi th m tách, trong khi ó, nh ng phân t nh hơn và các ion s i qua các l ó ra ngoài túi. K thu t này dùng lo i b mu i hay tách nh ng phân t nh , nhưng v i k thu t này không phân bi t ư c các lo i protein v i nhau. IV.3 S c ký S c ký là m t phương pháp phân tách quan tr ng nh t trong sinh h c phân t vì nó thích h p v i nhi u lo i h p ch t và s n ph m tinh s ch có th ư c s d ng ngay cho vi c nh lư ng và nh danh.
M t h s c ký g m pha tĩnh, pha ng và m u c n phân tách. Trong ó, tùy vào lo i m u c n phân tách ta có th l a ch n lo i s c ký cũng như nguyên li u cho pha c nh và pha di ng. Trong tinh s ch protein, có b n phương pháp ư c ng d ng nhi u nh t là s c ký l c gel d a vào kích thư c c a phân t (size exclusion chromagraphy), s c ký trao i ion d a vào i n tích c a phân t (ion exchange chromagraphy), s c ký ái l c d a vào ái l c c a phân t v i m t lo i phân t khác (affinity chromagraphy) và s c ký l ng cao áp d a vào kích thư c c a phân t nhưng có phân gi i cao nh vào áp su t (high pressure liquid chromagraphy). IV.3.1 S c ký l c gel Phương pháp này t t hơn các phương pháp trên vì nó d a vào kích thư c phân t . M u s ư c n p vào u m t c t ch a nhi u h t có l làm t polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (nh ng d ng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là nh ng lo i gel ph bi n trên th trư ng có s n nh ng h t có l v i ư ng kính chu n là 100µm (0.1mm). Nh ng phân t nh có th c bên trong l n gi a các h t, trong khi ó nh ng phân t l n hơn ch có th bên ngoài các h t. Vì v y, nh ng phân t có kích thư c l n trong c t s ch y nhanh hơn và ra ngoài trư c . Phân t có kích thư c trung bình, có th th nh tho ng vào ư c bên trong h t s r i kh i c t v trí gi a; còn nh ng phân t nh s ph i i qua o n ư ng dài hơn, quanh co nên s ra sau cùng. IV.3.2 S c ký trao i ion T i b t kỳ m t i m pH nào tr i m ng i n, các protein u có mang m t i n tích tương ng v i i m pH ó. D a vào i n tích th c c a chúng t i m t i m pH nh t nh, ta có th phân tách h n h p protein. Phương pháp này g i là phương pháp s c ký trao i ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là nh ng h t mang s n m t i n tích nh t nh, nh ng h t này s tương tác v i các phân t (protein) mang i n tích trái d u v i chúng. C th , n u h t mang i n âm (như c t carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), ti n trình ư c g i là s c ký trao i ion dương, thì s tương tác v i nh ng phân t mang i n tích dương. Ngư c l i, n u h t mang i n tích dương (như c t diethylaminoethyl- cellulose (DEAE-cellulose)), g i là s c ký trao i ion âm, thì tương tác v i phân t mang i n tích âm. Vì th , nh ng protein cùng d u v i c t s ch y ra kh i c t trong khi phóng thích nh ng protein này, ta tăng n ng nh ng protein trái d u b gi l i c t. ion c a pha ng, nh ng ion này s th phân t protein tương tác v i các h t mang i n tích. Ví d , trong s c ký trao i ion dương, ta thêm mu i natri clorua hay mu i khác trong dung d ch tách gi i b i vì ion natri s tranh bám vào c t v i các protein có i n tích dương, do ó, nh ng protein mang i n tích dương ư c phóng thích ra ngoài c t l n lư t theo l n v i n tích.
Hình 1: minh h a s c ký trao i ion
Hình 2: minh h a cơ ch gi a protein trong h s c ký trao i ion (a) Nh ng h t mang i n tích dương s trao i ion âm v i dung d ch m. Protein tích i n âm cũng ion dương tương tác v i nó (b) Khi protein g n v i h t, protein thay th nh ng ion âm tương tác v i h t cũng như h t thay th nh ng ion dương tương tác v i protein IV.3.3 S c ký ái l c ây là m t phương pháp r t hi u qu và ư c ng d ng r ng rãi trong vi c tinh s ch protein. K thu t này d a trên ái l c cao c a nhi u protein v i nh ng nhóm hóa h c chuyên bi t. Ví d , concanavalin A, m t lo i protein th c v t, có th ư c tinh s ch khi cho qua c t mang nh ng phân t glucose b ng liên k t c ng hóa tr . Concanavalin A g n vào c t b i vì nó có ái l c cao v i glucose, trong khi ó nh ng protein khác thì không. Concanavalin A có th ư c tách gi i kh i c t khi ta cho thêm dung d ch glucose m c vào. Phân t ư ng trong dung d ch s g n v i Concanavalin A thay th nh ng phân t glucose n i v i c t.
Hình 3: minh h a cho cơ ch tinh s ch Concanavalin A b ng s c ký ái l c S c ký ái l c còn là m t công c h u hi u trong vi c tách các y u t phiên mã, nh ng protein i u hòa s bi u hi n gen thông qua vi c g n c hi u v i trình t DNA. H n h p protein th m qua c t có ch a nh ng trình t DNA c hi u ư c g n vào th mang; nh ng protein có ái l c cao v i trình t DNA s b t vào các trình t và ư c gi l i. Trong thí d này, y u t phiên mã s ư c phóng thích khi r a c t v i dung d ch có hàm lư ng mu i cao. Ngoài ra, hi n nay ngư i ta d a vào tính c hi u gi a kháng nguyên và kháng th tinh s ch kháng nguyên hay kháng th . Nhìn chung, s c ký ái l c có th ư c dùng tách m t protein v n có kh năng nh n bi t m t nhóm X b ng n i c ng hóa v i nhóm này hay nh ng ch t d n xu t c a nó ư c g n trên m t cái c t, sau ó n p h n h p protein vào c t, c t này s ư c r a l i lo i b nh ng protein không t o ư c n i, cu i cùng là tách gi i protein m c tiêu b ng dung d ch X v i n ng cao hay thay i i u ki n làm gi m l c liên k t. S c ký ái l c là phương pháp tinh s ch hi u qu nh t khi tương tác gi a protein và phân t ư c dùng như m i b t protein có chuyên bi t cao. IV.3.4 S c ký l ng cao áp
K thu t s c ký l ng cao áp là m t d ng m r ng c a k thu t s c ký c t có kh năng phân tách protein ư c c i thi n áng k . B n thân v t li u t o c t v n ã có s phân chia rõ ràng và như th s có nhi u v trí tương tác d n n kh năng phân tách ư c tăng lên áng k . B i vì c t ư c làm t v t li u m n hơn nên ph i có m t áp l c tác ng lên c t có ư c m t t c ch y thích h p. K t qu th c có s phân gi i cao và phân tách nhanh. Phân tách protein b ng i n di trên gel V. ánh giá quá trình tinh s ch protein có hi u qu hay không, ngoài cách xác nh ho t tính c trưng c a protein có tăng lên sau m i bư c tinh s ch, còn m t cách là làm hi n hình các protein hi n di n trong m u sau m i bư c; i u này ư c th c hi n nh k thu t i n di. V.1 i n di m t chi u M t phân t có mang i n tích s di chuy n trong i n trư ng. Hi n tư ng này, ư c t tên là i n di, giúp hư ng t i m t k thu t r t m nh phân tách protein và các i phân t khác như DNA và RNA. V n t c di chuy n (v) c a m t protein (hay b t kỳ phân t nào) trong i n trư ng ph thu c vào l c i n trư ng (E), i n tích th c c a protein (z) và h s ma sát (f) (1) L c i n Ez kéo phân t mang i n tích t i i n c c trái d u b c n tr b i l c kéo c a nh t fv tăng lên do s ma sát gi a phân t ang chuy n ng v i môi trư ng. L c ma sát ph thu c vào c kh i lư ng, hình d ng c a phân t ang di chuy n l n nh t (η) c a môi trư ng. V i m t kh i c u có bán kính là r, ta có (2) i n di luôn ư c th c hi n trên gel (hay trên v t th r n như gi y) b i vì gel gi ng như m t cái ray phân t s làm tăng s phân tách. Nh ng phân t nh hơn kích thư c l gel s có th di chuy n xuyên qua gel, trong khi ó nh ng phân t l n hơn l gel thì g n như không di chuy n. Nh ng phân t có kích thư c trung bình di chuy n trong gel v i nhi u v n t c khác nhau. i n di ư c th c hi n trên m t b ng polyacrylamide m ng, th ng ng. Hư ng c a dòng i n t trên xu ng. Gel polyacrylamide, ư c t o thành t s polymer hóa acrylamide và s liên k t chéo c a methylenebisacrylamide, ư c ch n làm môi trư ng cho i n di vì nó có tính trơ v m t hóa h c và ư c t o hình nhanh chóng. i n di là m t cách l c qua gel mà theo ó t t c các phân t , không xét v kích thư c, s b tác ng m t l c di chuy n trong cùng m t ây có th xem tương ương v i m t h t trong c t l c gel. ch t n n. Gel Các protein có th ư c phân tách d a trên kh i lư ng b ng i n di trên acrylamide dư i i u ki n ã b bi n tính. H n h p protein ư c hòa tan trong dung d ch sodium dodecyl sulfate (SDS), m t ch t t y mang i n tích âm s phá t t c các n i không c ng hóa tr c a protein ban u. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có th ư c thêm vào làm gi m s n i disulfide. Ph c h p SDS v i protein ã b bi n tính có m t i n tích th c âm t l thu n v i kh i lư ng c a protein. i n tích âm có ư c do g n v i SDS l n hơn r t nhi u i n tích c a b n thân protein ban u; vì th , i n tích ban u
c a protein không nh hư ng áng k n i n tích c a ph c h p. Ph c h p SDS-protein sau ó s là m u ch y i n di. Khi i n di k t thúc, nh ng protein trên gel s ư c nhìn th y là m t dãy các băng b ng cách nhu m v i b c hay m t ch t nhu m màu như Coomassie blue. Nh ng ánh d u phóng x có th ư c phát hi n b ng cách t m t t m phim ch p x quang lên mi ng gel, quá trình này g i là phóng x t ghi. Nh ng protein nh di chuy n nhanh trong gel, trong khi nh ng protein l n phía u, g n v trí n p m u. Tính di ng c a ph n l n các chu i polypeptide dư i nh ng i u ki n như th t l v i kh i lư ng c a chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo m i tương quan này. SDS-PAGE có nh y cao. Ch v i lư ng nh kho ng 0.1ug phân tách cao, cho k t qu nhanh và (~2pmol) protein ã cho v ch r t rõ khi nhu m v i Coomassie blue và th m chí ít hơn (~0.02ug) v n có th ư c phát hi n khi nhu m b ng b c. Nh ng protein chênh l ch v kh i lư ng kho ng 2% (ví d : 40 kD và 41 kD hay khác nhau kho ng 10 acid amin) có th phân bi t ư c b ng SDS-PAGE. Vì v y, SDS-PAGE giúp chúng ta ánh giá k t qu c a quá trình tinh s ch. V i nh ng phân o n u tiên, k t qu là dãy g m r t nhi u protein. Nhưng qua m i bư c tinh s ch, s lư ng protein s gi m và s có m t băng ngày càng m. V ch ó tương ng v i protein m c tiêu. V.2 i n di d a vào i m ng i n Các protein còn có th ư c phân tách b ng i n d a vào t l gi a s acid amin có tính acid và s acid amin có tính base c a chúng. i m ng i n c a m t protein (pI) là i m pH mà ó i n tích th c c a nó b ng 0. T i i m pH này, tính di ng c a protein trong i n trư ng cũng b ng 0 b i vì z trong công th c (1) b ng 0. M i m t protein có m t pI riêng; ví d như pI c a cytochrome C, m t protein v n chuy n ion có tính base cao, là 10.6, trong khi pI c a albumin huy t thanh, m t protein có tính acid trong máu, là 4.8. Gi nh cho m t h n h p protein ch y trong i n trư ng trong m t mi ng gel v i m t khuynh pH, không có s hi n di n c a SDS. M i protein s di chuy n cho n khi nó n v trí mà t i ó pH b ng pI c a nó. D a vào hi n tư ng này, ta có phương pháp phân pH, trư c h t là cho tách protein d a vào i m ng i n c a protein. t o Khuynh vào gel m t h n h p polyampholyte (nh ng polymer nh a i n tích) có nhi u giá tr pI, sau ó i n di h n h p này. i n di d a vào i m ng i n phân tách protein nhanh v i kh năng phân bi t ư c s chênh l ch pI kho ng 0.01 hay nh ng protein khác nhau ch m t ơn v i n tích cũng có th ư c phân tách b ng phương pháp này. V.3 i n di hai chi u ây là m t phương pháp có kh năng phân tách cao do sư k t h p SDS-PAGE v i i n di d a vào i m ng i n. M u protein u tiên s ư c ch y i n di d a vào i m ng i n. sau ó, t kho ng gel có ch a protein v a ư c i n di lên t m gel SDS- polyacrylamide theo phương n m ngang. Protein s ch u m t i n trư ng theo chi u d c. K t qu là m t mô hình các i m ư c phân tách hai chi u, chi u ngang theo i m ng i n, chi u d c theo kh i lư ng. Kh năng phân tách c a phương pháp này ư c ch ng minh khi hơn m t ngàn protein c a vi khu n E. coli có th ư c phân tách trong m t l n ch y i n di.
Nh ng protein ư c phân tách t t bào các i u ki n sinh lý khác nhau có th phân tách ư c b ng phương pháp này, sau ó cư ng c a tính hi u s ư c xác nh. V i cách này, nh ng protein c th s ư c th y d ng m nh hay y u tùy vào tình tr ng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có m t h n ch là có r t nhi u protein ư c phân tách nhưng l i phân bi t rõ. kh c ph c h n ch này, ngư i ta k t h p i n di hai chi u v i k thu t kh i ph i. V.4 ánh giá k t qu tinh s ch protein Sau m i bư c tinh s ch, nh ng thông s sau c n ư c ghi nh n có th ánh giá quá trình tinh s ch protein: Protein t ng s : lư ng protein có trong m t phân o n. Thông s này tính b ng cách - nhân n ng m t ph n c a phân o n v i t ng th tích c a phân o n ó. Ho t tính t ng: ho t tính c a enzyme trong phân o n ó. Thông s này ư c tính b ng - cách nhân ho t tính c a enzyme có trong lư ng m u ư c xét nghi m v i t ng th tích c a phân o n ó. - Ho t tính riêng: b ng ho t tính t ng chia cho protein t ng s . Yield: ho t tính còn l i sau m i bư c tinh s ch ư c th hi n b ng ph n trăm ho t tính - c a d ch chi t thô v i ho t tính trong d ch chi t kh i u là 100%. tinh s ch, ư c tính b ng cách chia ho t tính riêng, ư c - M c tinh s ch: ch m c tính sau m i bư c tinh s ch, v i ho t tính riêng c a d ch chi t ban u. Qua theo nghiên c u kh o nghi m, ngư i ta th y r ng sau m i bư c tinh s ch, m c tinh s ch tăng lên trong khi yield l i gi m. Th t v y, v i k thu t SDS-PAGE, n u ta n p m t lư ng m u nh t nh vào m i gi ng trên b n gel ng v i m t bư c tinh s ch, ta s th y s băng s gi m t l v i m c tinh s ch trong khi t l lư ng protein m c tiêu v i t ng s protein hi n di n s tăng . Vì v y, ánh giá quá trình tinh s ch ph i d a c vào 2 thông s m c tinh s ch và yield. M t quá trình tinh s ch t t s có m c tinh s ch cao và ch s yield th p. N u ch tinh s ch th p có nghĩa là còn nhi u t p nhi m trong m u (nhi u s yield cao còn m c protein ngoài protein m c tiêu) và làm ph c t p vi c gi i thích thí nghi m. VI. Xác nh kh i lư ng c a protein Phép ghi ph kh i lư ng là m t k thu t dùng phân tích trong hóa h c h u cơ trong nhi u năm. Tuy nhiên, cho n g n ây, kh năng bay hơi quá th p c a protein ã làm m t tác d ng c a phép ghi ph kh i lư ng trong vi c nghiên c u các phân t này. Khó khăn này ã ư c kh c ph c khi có nh ng k thu t chuy n protein và nh ng i phân t khác thành d ng khí ư c ưa vào ng d ng là matrix-assisted laser desorption- ionization (MALDI) và electrospray spectrometry. ây t p trung vào k thu t MALDI. Trong k thu t này, nh ng ion protein ư c phóng ra và sau ó ư c tăng t c qua m t i n trư ng. Nh ng ion này s di chuy n qua m t ư ng ng dài ư c hút chân không (flight tube), ion nh nh t s di chuy n nhanh nh t và n u c trư c nh t. Vì v y, d a vào th i gian bay (time of flight - TOF) trong i n trư ng ta có th bi t kh i lư ng c a protein (hay chính xác hơn là t l gi a kh i lư ng v i i n tích). V i m t lư ng nh phân t sinh h c, dù nh n kho ng vài picomole n vài femtomole, v n có th phân
tích ư c v i cách này. M t máy ph ghi kh i lư ng d ng MALDI-TOF dư c dùng phân tích h n h p insulin và β-lactoglobulin. k t qu kh i lư ng c a 2 protein này l n lư t là 5733.9 và 18,364, so v i k t qu tính toán la 5733.5 và 18,388. Thí nghi m này cho th y MALDI-TOF th t s là m t k thu t chính xác xác nh kh i lư ng protein. K thu t này còn ư c ng d ng trong vi c xác nh d a vào kh i lư ng c a peptide (peptide mass fingerprinting). k thu t này ã m r ng kh năng ng d ng c a i n di hai chi u. M u c n nghiên c u ư c chi t và phân ra m t cách riêng bi t b ng các phương pháp hóa h c hay enzyme h c. Kh i lư ng c a các phân o n protein ư c xác nh b ng phương pháp kh i ph . Cu i cùng, kh i lư ng c a peptide ư c so v i nh ng s li u ã có ư c tính trên máy vi tính. K thu t này cho k t qu khá t t. Ví d , trong s 150 protein c a n m men ư c phân tách b ng i n di 2 chi u, k thu t này ã giúp xác nh ư c 80% protein. VII. Siêu ly tâm Siêu ly tâm không ch là m t phương pháp có th phân tách m t h n h p thô các thành ph n c a t bào mà còn r t hi u qu trong vi c phân tách và phân tích nh ng phân t sinh h c. V i phương pháp này, chúng ta không ch xác nh ư c kh i lư ng và t tr ng mà còn bi t ư c c hình d ng c a m t phân t cũng như phân tích nh ng tương tác gi a các có ư c nh ng i m này, chúng ta c n m t di n t m t cách toán h c là m t phân t . phân t b tác ng b i l c ly tâm như th nào. Dư i tác ng c a l c ly tâm, m t phân t s di chuy n qua m t môi trư ng l ng. bi t ư c t c di chuy n c a phân t ta c n ph i tính h s l ng (s) theo công th c v i m là kh i lư ng phân t , v là th tích t ng ph n (ngh ch o c a t tr ng phân t ), p là t tr ng c a môi trư ng và f là h ng s l ng thư ng ư c bi u hi n là ơn v Svedberg (S) b ng 10-3 s. Giá tr S càng nh , phân t di chuy n càng ch m. V n t c l ng c a m t phân t ph thu c vào kh i lư ng c a nó. M t phân t có cùng hình d ng cũng như t tr ng v i các phân t khác nhưng n ng hơn s l ng nhanh hơn Hình d ng cũng nh hư ng n v n t c l ng vì nó tác ng n nh t. H s ma sát c a m t phân t cu n l i thì nh hơn nh ng phân t c ng k nh dù chúng có cùng kh i lư ng. Vì v y, m t ph n t d ng th ng l ng ch m hơn nh ng phân t hình c u dù chúng có cùng kh i lư ng. c di chuy n mau hơn m t phân t ít c hơn b i vì ngh ch o c a l c y M t phân t c nh hơn. i v i phân t V n t c l ng còn ph thu c vào t tr ng c a dung d ch (p). các phân t l ng khi p < 1, n i khi p > 1 và không di chuy n khi p = 1. M t k thu t tách protein d a vào h s l ng khác nhau c a các protein là k thu t ly tâm phân o n. u tiên là t o khuynh t tr ng trong m t ng ly tâm b ng cách tr n 2 dung d ch có t tr ng khác nhau, m t có t tr ng cao, m t có t tr ng th p. Ví d , h n h p sucrose 20% và sucrose 5% có khuynh t tr ng t 5% phía trên n 20% áy tube. m t lư ng nh dung d ch h n h p protein ư c n p vào phía trên c a khuynh vt tr ng. khi máy quay, protein s di chuy n theo khuynh và tách ra d a trên h s l ng ly tâm có ư c qua th c nghi m. Ta t o m t l c a chúng. th i gian và t c á y ng ly tâm thu nh n các phân o n c a protein.
Kh i lư ng protein ư c xác nh tr c ti p b ng tr ng thái l ng cân b ng có nghĩa là m u ư c ly tâm v n t c th p s l ng cân b ng v i s khu ch tán. k thu t này xác nh kh i lư ng protein r t chính xác và có th s d ng cho protein không qua bi n tính vì v y c u trúc b c b n c a protein v n ư c b o t n. ây là i m l i th c a phương pháp này so v i SDS-PAGE, ch nh ư c kh i lư ng c a protein khi ã b bi n tính. V i hai phương pháp này, SDS-PAGE cho ta bi t kh i lư ng t ng ơn phân, siêu ly tâm phân o n cho ta bi t kh i lư ng c a d ng a phân, ta có th k t h p bi t có bao nhiêu ơn phân trong m t protein a phân.