Tăng hệ số nhân nhanh chồi cây hoa salem tím bằng cách sử dụng kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và adenine trong nuôi cấy in vitro

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> TĂNG HỆ SỐ NHÂN NHANH CHỒI CÂY HOA SALEM TÍM<br /> (Limonium sinuatum L. Mill) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG KẾT HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU<br /> HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ADENINE TRONG NUÔI CẤY IN VITRO<br /> Nguyễn Thị Huyền Trang*, Lê Thị Thủy Tiên<br /> Trường Đại học bách khoa, ĐHQG tp Hồ Chí Minh, nguyenthihuyentrang171@gmail.com<br /> TÓM TẮT: Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím<br /> (Limonium sinuatum L. Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích<br /> hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân<br /> chồi. Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l<br /> sucrose và 6 g/l agar. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng<br /> 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6<br /> tuần tuổi. Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4<br /> mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp giữa<br /> kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo<br /> chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn. Sự hiện diện của GA3/adenine<br /> giúp tăng hiệu quả tạo chồi. Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10<br /> mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt<br /> là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy.<br /> Từ khóa: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Salem có tên khoa học là Limonium<br /> sinuatum L. Mill, thuộc họ Bạch hoa đan<br /> (Plumbaginaceae). Chi Limonium có khoảng<br /> 150 loài hoang dã [3]. Salem xuất xứ từ Địa<br /> Trung Hải và đã có mặt ở Đà Lạt từ trước năm<br /> 1975. Vùng trồng hoa salem phổ biến tại Đà Lạt<br /> là Đa Thiện, Thái Phiên và nhiều nơi khác. Trên<br /> thế giới, đã có nhiều tác giả tiến hành nghiên<br /> cứu đối tượng này như nuôi cấy tế bào để khảo<br /> sát khả năng tái sinh [3], loại bỏ vi khuẩn ký<br /> sinh gây hoại tử ở lá trong vi nhân giống [9] hay<br /> tạo cây lai giữa 2 loại Limonium perezii và<br /> Limonium sinuatum [5]. Trong vài năm gần đây,<br /> một bộ phận nông dân tại Đà Lạt sử dụng các<br /> giống hoa đã bị thoái hóa, trong đó có salem,<br /> dẫn đến sản lượng thấp, màu sắc và độ bền kém.<br /> Bên cạnh đó, nguồn giống chưa được chủ động,<br /> cho nên, khi thị trường cần số lượng lớn thì sản<br /> xuất không đáp ứng được [8]. Phương pháp vi<br /> nhân giống là phương pháp hiệu quả không<br /> những tạo số lượng cây giống lớn, không những<br /> ổn định về mặt di truyền, mà còn nâng cao chất<br /> lượng cây giống. Xuất phát từ yêu cầu thực tế<br /> nhằm sản xuất một lượng lớn cây giống salem<br /> có chất lượng cao và ổn định, đề tài được thực<br /> hiện với mục đích khảo sát ảnh hưởng của một<br /> <br /> số yếu tố lên sự nhân chồi của cây salem in<br /> vitro, là giai đoạn quan trọng trong công tác vi<br /> nhân giống.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Chồi của cây con in vitro được sử dụng để<br /> làm vật liệu thí nghiệm. Hạt giống tạo cây con<br /> là hạt giống hoa salem thương mại được cung<br /> cấp bởi công ty TNHH Hạt Giống Hoa Việt<br /> Nam, mã số: FVN STA011 Golf Dark Blue,<br /> Hoa Kỳ.<br /> Phương pháp<br /> Môi trường nhân chồi là môi trường<br /> Murashige và Skoog (1962) (MS) [6] bổ sung<br /> 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose, 6 g/l agar<br /> và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác<br /> nhau. Các môi trường này được chỉnh về pH 5,8<br /> trước khi hấp tiệt trùng ở 121ºC, 1 atm trong<br /> thời gian 15 phút.<br /> Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện<br /> chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng<br /> 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC.<br /> Khử trùng hạt<br /> Hạt được khử trùng với dung dịch Javel<br /> thương mại 50% trong thời gian 7 phút. Môi<br /> 219<br /> <br /> Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> <br /> trường gieo hạt là môi trường MS bổ sung 100<br /> mg/l myo-inositol, 20 g/l sucrose và 6 g/l agar.<br /> <br /> chất được khảo sát là: GA3 nồng độ 3; 5; 7 và 10<br /> mg/l và Adenine nồng độ 5; 10; 15 và 20 mg/l.<br /> <br /> Khảo sát tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy<br /> cho sự tạo chồi<br /> Chồi của cây con 4; 6 và 8 tuần tuổi được<br /> nuôi cấy trên môi trường nhân chồi là môi<br /> trường MS bổ sung 4 mg/l kinetin, 100 mg/l<br /> myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Kết<br /> quả về độ tuổi sinh lý thích hợp nhất cho sự tạo<br /> chồi sẽ được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm<br /> khảo sát nhân chồi trong báo cáo này.<br /> <br /> Phân tích và xử lý số liệu<br /> Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mẫu tạo chồi, số<br /> lượng chồi hình thành và hình thái chồi sau 4; 6<br /> và 8 tuần nuôi cấy.<br /> <br /> Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi<br /> Mẫu cấy là chồi của cây con có tuổi sinh lý<br /> thích hợp là kết quả ở thí nghiệm trước được<br /> nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA (0; 0,2;<br /> 0,5; 1; 2; 3; 4 mg/l) hoặc kinetin (0,5; 1; 2; 3; 4;<br /> 5 mg/l) nhằm tìm ra loại và nồng độ cytokinin<br /> thích hợp cho việc nhân chồi cây salem. Kết quả<br /> cytokinin thích hợp cho sự cảm ứng tạo chồi<br /> cây salem sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm<br /> tiếp theo.<br /> Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và<br /> auxin lên sự tạo chồi<br /> Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực<br /> vật được sử dụng trong thí nghiệm này là IBA;<br /> 2,4-D và NAA ở các nồng độ 0,05; 0,1 và 0,2<br /> mg/l kết hợp với loại cytokinin có nồng độ cảm<br /> ứng tạo chồi hiệu quả nhất thu được từ thí<br /> nghiệm khảo sát ảnh hưởng của cytokinin. So<br /> sánh hiệu quả tạo chồi trên các môi trường khảo<br /> sát với môi trường chỉ bổ sung cytokinin riêng<br /> lẻ. Môi trường có kết quả tạo chồi cao nhất sẽ<br /> được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.<br /> Ảnh hưởng của GA3, adenine lên sự tạo chồi<br /> GA3 và adenine được bổ sung riêng lẻ vào<br /> môi trường MS có sự hiện diện của chất điều hòa<br /> sinh trưởng thực vật cảm ứng tạo chồi hiệu quả<br /> nhất từ các thí nghiệm trước. Nồng độ của các<br /> <br /> Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 5 bình,<br /> mỗi bình chứa 3 mẫu cấy.<br /> Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần<br /> mềm SPSS theo phương pháp Duncan ở mức ý<br /> nghĩa 0,05.<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu<br /> cấy cho sự tạo chồi<br /> Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nhân<br /> giống in vitro thường được nhắc đến như thành<br /> phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, mẫu cấy.<br /> Trong đó, yếu tố mẫu cấy có thể chia làm hai<br /> nhóm: lựa chọn mẫu cấy và xử lý mẫu cấy. Các<br /> nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ<br /> quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn<br /> sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.<br /> Trong báo cáo này, chúng tôi tiến hành khảo sát<br /> trên nguồn mẫu là hạt, do đó độ tuổi sinh lý của<br /> mẫu cấy có thể sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả nhân<br /> chồi khi nuôi cấy.<br /> Ba độ tuổi sinh lý khác nhau được khảo sát<br /> và ghi nhận kết quả sau 4; 6 và 8 tuần nuôi cấy<br /> trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin được<br /> trình bày trong bảng 1. Kết quả cho thấy, có sự<br /> khác biệt rõ rệt về khả năng tạo chồi giữa những<br /> mẫu cấy có độ tuổi khác nhau. Mẫu cấy 6 tuần<br /> tuổi có khả năng tạo chồi cao nhất với số lượng<br /> chồi trên một mẫu cấy ban đầu là 5,87 chồi sau<br /> 8 tuần nuôi cấy (hình 1b). Tỷ lệ tạo chồi của<br /> mẫu cấy 6 tuần tuổi cũng cao hơn so với mẫu<br /> cấy 4 và 8 tuần tuổi.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu cấy đến hiệu quả nhân chồi<br /> Sau 4 tuần<br /> Sau 6 tuần<br /> Tuổi của<br /> mẫu cấy<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> (tuần)<br /> chồi (%)<br /> chồi/mẫu<br /> chồi (%)<br /> chồi/mẫu<br /> 4 tuần<br /> 13,33a*<br /> 1,13a<br /> 66,67a<br /> 2,53a<br /> 6 tuần<br /> 80,00b<br /> 2,67b<br /> 93,33b<br /> 4,20b<br /> 8 tuần<br /> 6,67a<br /> 1,07a<br /> 13,33c<br /> 1,33c<br /> <br /> Sau 8 tuần<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> chồi (%)<br /> chồi/mẫu<br /> 80,00a<br /> 5,27a<br /> 100,00b<br /> 5,87a<br /> 40,00c<br /> 2,13b<br /> <br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> 220<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> Quan sát hình thái mẫu cấy sau 4 tuần nuôi<br /> cấy trên môi trường có bổ sung 4 mg/l kinetin,<br /> chúng tôi nhận thấy mẫu cấy ban đầu không có<br /> sự gia tăng kích thước, các lá mới hình thành có<br /> kích thước đều nhau, chiều dài dưới 1 cm. Chồi<br /> mới xuất hiện ở nách lá và gốc của chồi ban đầu<br /> (hình 1a). Điều này chứng minh sự hiện diện<br /> của kinetin trong môi trường nuôi cấy có tác<br /> động ức chế hiện tượng ưu tính ngọn để kích<br /> thích sự hình thành và tăng trưởng của các chồi<br /> mới, tạo cụm chồi.<br /> Ở các mẫu cấy 8 tuần tuổi sau 8 tuần nuôi<br /> cấy, chồi ban đầu tiếp tục gia tăng chiều cao và<br /> tạo lá mới (hình 1c). Như vậy, ở nhóm mẫu cấy<br /> <br /> này hiện tượng ưu tính ngọn của chồi ban đầu<br /> không bị ức chế hoàn toàn, chồi mới hình thành<br /> chủ yếu ở nách lá. Đây có lẽ là nguyên nhân<br /> làm cho số lượng chồi mới hình thành thấp hơn<br /> so với mẫu cấy 4 và 6 tuần tuổi.<br /> Như vậy, mẫu cấy chồi từ cây con 6 tuần<br /> tuổi có tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi cao, số lượng chồi<br /> mới hình thành cũng cao hơn mẫu cấy 4 tuần và<br /> 8 tuần tuổi (hình 1a, b, c) nên được lựa chọn để<br /> tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nhằm tìm ra<br /> môi trường hiệu quả cho việc nhân giống cây<br /> hoa salem.<br /> Ảnh hưởng của cytokinin lên sự tạo chồi<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Cytokinin<br /> Sau 4 tuần<br /> Sau 6 tuần<br /> Sau 8 tuần<br /> BA<br /> Kinetin Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> (mg/l) (mg/l)<br /> chồi (%)<br /> chồi/mẫu<br /> chồi (%)<br /> chồi/mẫu<br /> chồi (%)<br /> chồi/mẫu<br /> 0,00a*<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,2<br /> 20,00b<br /> 1,20a<br /> 20,00b<br /> 1,27a<br /> 20,00c<br /> 1,27a<br /> 0,5<br /> 6,67a<br /> 1,07a<br /> 20,00b<br /> 1,20a<br /> 20,00c<br /> 1,20a<br /> 1<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 6,67a<br /> 1,07a<br /> 6,67ab<br /> 1,07a<br /> 2<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 3<br /> 6,67a<br /> 1,07a<br /> 6,67a<br /> 1,07a<br /> 6,67ab<br /> 1,07a<br /> 4<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,2<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,5<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 1<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 0,00a<br /> 1,00a<br /> 13,33bc<br /> 1,13a<br /> 2<br /> 46,67de<br /> 2,13b<br /> 66,67c<br /> 3,00b<br /> 93,33d<br /> 3,93b<br /> 3<br /> 53,33e<br /> 2,13b<br /> 73,33c<br /> 3,07b<br /> 93,33d<br /> 4,80bc<br /> 4<br /> 86,67f<br /> 2,27b<br /> 86,67d<br /> 3,73b<br /> 100,00d<br /> 5,60c<br /> 5<br /> 33,33c<br /> 2,07b<br /> 93,33d<br /> 3,60b<br /> 100,00d<br /> 5,73c<br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> Sau 8 tuần khảo sát trên môi trường bổ sung<br /> chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA cảm<br /> ứng tạo chồi không hiệu quả. Tỷ lệ mẫu cấy tạo<br /> chồi và số lượng chồi trên một mẫu cấy cao<br /> nhất ở các môi trường có bổ sung 0,2 mg/l BA<br /> nhưng với tỷ lệ tạo chồi và số lượng chồi trung<br /> bình đều thấp (20,00% và 1,27 chồi/mẫu cấy),<br /> không có sự khác biệt về mặt thống kê so với<br /> mẫu đối chứng (hình 1i).<br /> Kết quả thể hiện ở bảng 2 cho thấy, kinetin<br /> có hiệu quả cao trong sự tạo chồi cây hoa salem.<br /> Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số lượng chồi tăng<br /> <br /> dần khi nồng độ kinetin tăng, đặc biệt trong<br /> khoảng nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Nghiệm thức bổ<br /> sung 1 mg/l kinetin cho kết quả tạo chồi thấp và<br /> tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi chỉ đạt 13,33%. Các nồng<br /> độ còn lại có hiệu quả tạo chồi cao hơn đặc biệt<br /> là kinetin nồng độ 5 mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và<br /> tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi 100% sau 8 tuần nuôi cấy.<br /> Tuy nhiên nồng độ kinetin 5 mg/l là nồng độ cao,<br /> có thể gây ra những biến dị không mong muốn,<br /> khi quan sát mẫu cấy cũng phát hiện có những<br /> biểu hiện bất thường về hình thái. Ở nghiệm thức<br /> sử dụng 4 mg/l kinetin, số lượng chồi tạo thành<br /> 221<br /> <br /> Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien<br /> <br /> trên một mẫu cấy ban đầu là 5,60 chồi/mẫu cấy,<br /> khác biệt không có ý nghĩa với kinetin nồng độ 5<br /> mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) và tỉ lệ tạo chồi cũng<br /> đạt 100%.<br /> Trong nghiên cứu về nhân giống cây<br /> Limonium cavanillesii Erben của Amo-Marco et<br /> al. (1998) [1], kinetin là loại cytokinin có kết<br /> quả nhân chồi tốt nhất với khoảng nồng độ từ 2<br /> đến 5 mg/l. Trong báo cáo này, tác giả cũng<br /> khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi<br /> của mẫu cấy và cho kết quả cao nhất trong<br /> khoảng nồng độ BA là 0,1 đến 0,5 mg/l nhưng<br /> kết quả này thấp hơn trên môi trường bổ sung<br /> kinetin nồng độ từ 2 đến 5 mg/l. Ở các nồng độ<br /> BA cao hơn mà tác giả khảo sát (1; 2; 5 mg/l)<br /> cho tỷ lệ tạo chồi và số chồi trung bình giảm.<br /> Tomoko Igawa et al. (2002) [3] cũng sử dụng<br /> BA trong nghiên cứu tái sinh cây từ nuôi cấy tế<br /> bào cây Limonium sinuatum Mill ở nồng độ 0,1<br /> và 1,0 mg/l nhưng chồi chỉ hình thành mới trên<br /> môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA với tỷ lệ tạo<br /> chồi chỉ đạt 3,3% và số chồi mới hình thành<br /> trung bình là 0,3 chồi. Trong kết quả của Jeong<br /> et al. (2001) [4] khi khảo sát ảnh hưởng của một<br /> <br /> số cytokinin riêng lẻ và kết hợp với auxin lên sự<br /> tạo chồi của cây Limonium sinuatum cũng cho<br /> thấy BA riêng lẻ cảm ứng tốt hơn ở nồng độ<br /> thấp 1,11 µM (tương ứng 0,25 mg/l) và giảm<br /> dần khi tăng nồng độ BA lên. Ở nồng độ 8,88<br /> µM BA (tương ứng 2 mg/l) thì không có chồi<br /> mới được hình thành. Báo cáo này cũng cho<br /> thấy BA không hiệu quả trong cảm ứng sự nhân<br /> chồi trên đối tượng này.<br /> Như vậy các báo cáo trên đều cho thấy với<br /> đối tượng là Limonium sinuatum thì BA riêng lẻ<br /> chỉ có thể cảm ứng tạo chồi ở nồng độ thấp<br /> nhưng không hiệu quả vì tỷ lệ tạo chồi và số<br /> lượng chồi hình thành đều ít và thấp hơn các<br /> chất cảm ứng khác cùng khảo sát. Điều này phù<br /> hợp với số liệu mà chúng tôi đã thu nhận được<br /> là BA không thích hợp để cảm ứng với đối<br /> tượng này, kinetin cảm ứng tạo chồi hiệu quả ở<br /> nồng độ 4 và 5 mg/l. Do đó chúng tôi chọn<br /> kinetin nồng độ 4 mg/l để tiếp tục các thí<br /> nghiệm tiếp theo.<br /> Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa cytokinin và<br /> auxin lên sự tạo chồi<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa auxin và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là<br /> chồi từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Auxin (mg/l)<br /> Kinetin<br /> (mg/l)<br /> <br /> IBA<br /> <br /> 2,4-D<br /> <br /> NAA<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> Sau 4 tuần<br /> Số<br /> Tỉ lệ tạo<br /> lượng<br /> chồi<br /> chồi/<br /> (%)<br /> mẫu<br /> 86,67a* 2,27ab<br /> <br /> Sau 6 tuần<br /> Số<br /> Tỉ lệ tạo<br /> lượng<br /> chồi (%)<br /> chồi/<br /> mẫu<br /> 86,67bc<br /> 3,73c<br /> <br /> Sau 8 tuần<br /> Số<br /> Tỉ lệ tạo lượng<br /> chồi (%)<br /> chồi/<br /> mẫu<br /> 100,00a<br /> 5,60d<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 66,67b<br /> <br /> 2,67a<br /> <br /> 100,00a<br /> <br /> 4,07c<br /> <br /> 100,00a<br /> <br /> 5,27d<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 66,67b<br /> <br /> 1,93ab<br /> <br /> 86,67bc<br /> <br /> 3,33c<br /> <br /> 100,00a<br /> <br /> 5,07d<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 60,00bc<br /> <br /> 2,20ab<br /> <br /> 86,67bc<br /> <br /> 3,73c<br /> <br /> 93,33ab<br /> <br /> 4,93d<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> 53,33cd<br /> <br /> 1,80ab<br /> <br /> 80,00cd<br /> <br /> 3,47c<br /> <br /> 93,33ab<br /> <br /> 5,20d<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> -<br /> <br /> 40,00ef<br /> <br /> 1,53b<br /> <br /> 73,33d<br /> <br /> 2,80c<br /> <br /> 86,67b<br /> <br /> 4,67d<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> -<br /> <br /> 33,33f<br /> <br /> 1,47b<br /> <br /> 80,00cd<br /> <br /> 2,80c<br /> <br /> 86,67b<br /> <br /> 4,53d<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> 46,67de<br /> <br /> 1,67b<br /> <br /> 86,67bc<br /> <br /> 3,87c<br /> <br /> 86,67b<br /> <br /> 4,20d<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 53,33cd<br /> <br /> 1,87ab<br /> <br /> 93,33ab<br /> <br /> 3,40c<br /> <br /> 100,00a<br /> <br /> 4,73d<br /> <br /> 4<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 60,00bc<br /> <br /> 2,20ab<br /> <br /> 80,00cd<br /> <br /> 3,40c<br /> <br /> 100,00a<br /> <br /> 4,47d<br /> <br /> Các chữ cái a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> 222<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226<br /> <br /> Auxin khi kết hợp với cytokinin sẽ giúp sự<br /> tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới<br /> mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Gaspar et<br /> al. (2003) [2] cho rằng các thí nghiệm tạo chồi<br /> bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng<br /> cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ từ thấp<br /> đến trung bình. Do đó, các auxin trong thí<br /> nghiệm này được sử dụng ở nồng độ thấp nhằm<br /> khảo sát tác động của sự phối hợp giữa auxin và<br /> kinetin trên sự tạo chồi cây hoa salem.<br /> Sau 8 tuần khảo sát trên các môi trường bổ<br /> sung auxin với loại và nồng độ khác nhau, hiệu<br /> quả tạo chồi cao nhất lần lượt ở các nghiệm<br /> thức có 0,05 mg/l IBA (5,27 chồi/mẫu cấy),<br /> 0,05 mg/l 2,4-D (5,20 chồi/mẫu cấy) và 0,1<br /> mg/l NAA (4,73 chồi/mẫu cấy) (bảng 3). Tuy<br /> nhiên, số lượng chồi tạo thành trung bình trên<br /> một mẫu cấy ban đầu ở các môi trường này đều<br /> thấp hơn môi trường chỉ bổ sung kinetin riêng lẻ<br /> và các sự khác biệt này là không có ý nghĩa.<br /> Như vậy, khi kết hợp với 4 mg/l kinetin thì sự<br /> hiện diện của auxin không giúp nâng cao hiệu<br /> quả tạo chồi của cây hoa salem.<br /> IBA là loại auxin có độ bền không cao, sau<br /> 30 ngày ngoài sáng nồng độ IBA có thể giảm đi<br /> 60% [7]. Trong khi đó, khi quan sát nhận thấy<br /> mẫu cấy chồi cây salem có biểu hiện đáp ứng<br /> tạo chồi dưới tác động của chất điều hòa sinh<br /> trưởng thực vật sau 3 tuần nuôi cấy. Như vậy,<br /> mẫu cấy cần thời gian cảm ứng dài và trong<br /> <br /> khoảng thời gian này IBA có thể đã bị giảm<br /> hoạt tính nên tác động của IBA đến mẫu cấy<br /> không rõ rệt.<br /> Trên môi trường có sự hiện diện của 2,4-D,<br /> có sự hình thành các mô sẹo nhỏ ở cuống lá, nơi<br /> tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (hình 1e). Mô<br /> sẹo khi mới xuất hiện có màu trắng, sau đó bị<br /> nâu hóa. 2,4-D là một loại auxin mạnh, có vai<br /> trò quan trọng trong sự kích thích sự phân chia<br /> của tế bào tạo mô sẹo. Tuy vậy, số lượng mô<br /> sẹo hình thành trong thí nghiệm này ít do 2,4-D<br /> chỉ được sử dụng với nồng độ thấp.<br /> Về hình thái mẫu cấy, các chồi mới tạo thành<br /> ở tất cả các môi trường bổ sung auxin đều có<br /> kích thước lớn hơn các chồi được tạo thành trên<br /> môi trường chỉ bổ sung 4 mg/l kinetin. Trong đó,<br /> chiều cao của chồi mới hình thành trên môi<br /> trường bổ sung NAA lớn hơn chồi trên môi<br /> trường có bổ sung IBA hay 2,4-D (Hình 1d, e, f).<br /> Ở nhiều loài thực vật, việc kết hợp auxin ở nồng<br /> độ thấp với cytokinin giúp nâng cao hiệu quả tạo<br /> chồi. Nhưng trong nghiên cứu này, với cả 3 loại<br /> auxin đã được tiến hành khảo sát là 2,4-D, NAA<br /> và IBA thì kết quả đều không có sự khác biệt<br /> hoặc thấp hơn so với khi sử dụng kinetin riêng lẻ.<br /> Tuy nhiên, việc sử dụng auxin kết hợp với<br /> kinetin giúp các chồi mới hình thành có kích<br /> thước lớn, dễ tách ra thành từng chồi riêng biệt<br /> để chuyển sang môi trường tạo rễ.<br /> Ảnh hưởng của GA3 lên sự tạo chồi<br /> <br /> Bảng 4. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa GA3 và 4 mg/l kinetin lên sự tạo chồi của mẫu cấy là chồi<br /> từ cây con 6 tuần tuổi<br /> Kinetin<br /> (mg/l)<br /> <br /> GA3<br /> (mg/l)<br /> <br /> 4<br /> 4<br /> 4<br /> 4<br /> 4<br /> <br /> 3<br /> 5<br /> 7<br /> 10<br /> <br /> Sau 4 tuần<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> chồi (%)<br /> chồi/ mẫu<br /> 86,67a*<br /> 2,27a<br /> 26,67b<br /> 1,40b<br /> 33,33bc<br /> 1,53b<br /> 53,33d<br /> 1,73ab<br /> 40,00cd<br /> 1,60ab<br /> <br /> Sau 6 tuần<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> chồi (%) chồi/ mẫu<br /> 86,67a<br /> 3,73c<br /> 100,00b<br /> 4,13c<br /> 100,00b<br /> 4,27c<br /> 93,33ab<br /> 4,00c<br /> 100,00b<br /> 4,73c<br /> <br /> Sau 8 tuần<br /> Tỉ lệ tạo<br /> Số lượng<br /> chồi (%)<br /> chồi/ mẫu<br /> 100,00a<br /> 5,60d<br /> 100,00a<br /> 5,87d<br /> 100,00a<br /> 6,27de<br /> 100,00a<br /> 6,53de<br /> 100,00a<br /> 7,80e<br /> <br /> Các chữ cái a,b,c… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 05 theo phương pháp Duncan.<br /> <br /> Có nhiều kết quả khác nhau về tác động của<br /> GA3 trên các đối tượng mẫu cấy khác nhau.<br /> Mẫu cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát<br /> triển không cần đến sự hiện diện của gibberellin<br /> <br /> trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, sự tăng<br /> trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và chồi bên<br /> cũng có thể gia tăng khi bổ sung thêm<br /> gibberellin. Ở một số loài thực vật, acid<br /> 223<br /> <br />