Tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa Protein Antivirus liên quan đến cơ chế kháng virus ở Tôm sú (Penaeus Monodon)

Hoàng Thị Thu Yến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 85(09)/2: 161 - 164<br /> <br /> TẠO DÕNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ cDNA MÃ HÓA PROTEIN<br /> ANTIVIRUS LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ KHÁNG VIRUS Ở TÔM SÖ<br /> (PENAEUS MONODON)<br /> Hoàng Thị Thu Yến1, Kim Thị Phương Oanh2,<br /> Phạm Anh Tuấn3, Nông Văn Hải2<br /> 1<br /> <br /> Đại học Thái nguyên; 2 Viện Công nghệ sinh học - Viện KHCN Việt Nam<br /> Tổng Cục Thủy Sản - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam<br /> <br /> 3<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Các bệnh gây ra do virus là thách thức lớn nhất đối với nghề nuôi tôm trên toàn thế giới, đặc biệt<br /> là bệnh do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spots Syndrome Virus- WSSV). Hiện nay vẫn<br /> chƣa có biện pháp để kiểm soát WSSV khi dịch bệnh tôm xảy ra. Do đó, các gen thực hiện chức<br /> năng liên quan đến khả năng miễn dịch của tôm đƣợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Trong đó<br /> antivirus là gen đầu tiên liên quan đến khả năng kháng virus gây hội chứng đốm trắng đã đƣợc<br /> công bố ở tôm sú (PmAV). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tạo dòng và xác định<br /> trình tự cDNA đầy đủ mã hóa protein antivirus PmAV. Gen antivirus có chiều dài 513 bp, mã hóa<br /> cho 170 amino acid. Kết quả so sánh trình nucleotide của gen antivirus cho thấy không có sự sai<br /> khác về trình tự nucleotide so với trình tự gen PmAV đã công bố trên GenBank (mã số GenBank<br /> tƣơng ứng: AY302750, DQ641258 và HM034318). Trình tự gen PmAV của chúng tôi phân lập đã<br /> đƣợc đăng ký trên GenBank với mã số HQ662559. Đoạn cDNA mã hóa antivirus mà chúng tôi<br /> phân lập đƣợc là nguyên liệu có thể phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm làm sáng tỏ<br /> chức năng của protein này.<br /> Từ khóa: Tôm sú, gen liên quan đến virus gây bệnh đốm trắng, gen liên quan đến miễn dịch, gen<br /> liên quan đến kháng khuẩn, antivirus gen, hội chứng đốm trắng.<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Nƣớc ta có diện tích mặt nƣớc ngọt, lợ và<br /> biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao hồ<br /> và gần 2000 km bờ biển với thành phần giống<br /> loài thủy sản phóng phú là tiềm năng to lớn<br /> để phát triển nuôi trồng thủy sản. Tôm sú là<br /> đối tƣợng nuôi phổ biến ở các vùng nƣớc lợ,<br /> mặn trên toàn quốc. Nghề nuôi tôm ở nƣớc ta<br /> là một thế mạnh của thuỷ sản. Theo Hiệp hội<br /> Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam<br /> (VASEP), năm 2010 lần đầu tiên xuất khẩu<br /> tôm của Việt Nam vƣợt con số 2 tỷ USD, với<br /> 241.000 tấn, tăng 13,4% về khối lƣợng và<br /> 24,4% về giá trị so với 209.567 tấn và 1,675<br /> tỷ USD của năm 2009, diện tích nuôi tôm sú<br /> cả nƣớc đạt 613.718 ha, giá trị xuất khẩu tôm<br /> sú ƣớc đạt 1,45 tỷ USD. Việt Nam đã trở<br /> thành một trong năm quốc gia xuất khẩu tôm<br /> lớn nhất thế giới.<br /> Tuy nhiên, nghề nuôi tôm ở nƣớc ta cũng nhƣ<br /> các nƣớc trên thế giới đã gặp nhiều khó khăn<br /> do tôm bị nhiễm vi khuẩn và virus. Đặc biệt,<br /> bệnh do WSSV đã gây nên sự thiệt hại lớn về<br /> kinh tế [1], [5]. Hiện nay vẫn chƣa có biện<br /> phát để kiểm soát WSSV khi dịch bệnh tôm<br /> *<br /> <br /> xảy ra. Do đó, nghiên cứu khả năng miễn dịch<br /> của tôm đƣợc đặc biệt quan tâm. Gần đây, đã<br /> có một số nghiên cứu về các protein/gen có<br /> liên quan đến các phản ứng của vật chủ đối<br /> với một số loại virus phổ biến nhƣ: virus gây<br /> bệnh đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh đầu<br /> vàng (YHV) và Taura virus [2]. Tuy nhiên, cơ<br /> chế phân tử của các phản ứng miễn dịch ở<br /> tôm đối với virus thì vẫn chƣa đƣợc sáng tỏ.<br /> Năm 2003, Luo và đồng tác giả đã phân lập<br /> gen kháng virus đầu tiên từ tôm sú nhiễm<br /> WSSV (kí hiệu PmAV). cDNA của gen này<br /> có chiều dài 513 bp, mã hóa cho 170 amino<br /> acid. PmAV tái tổ hợp đƣợc tạo ra ở E. coli<br /> và cũng đƣợc chứng minh có chức năng<br /> kháng virus [4]. Sau đó, cấu trúc genome,<br /> hoạt tính promoter của gen PmAV và sơ lƣợc<br /> sự biểu hiện của gen này ở cả tôm thƣờng và<br /> tôm nhiễm virus đã đƣợc nghiên cứu [3].<br /> Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành<br /> phân lập gen AV từ tôm sú Việt Nam nhiễm<br /> WSSV phục vụ cho việc nghiên cứu cấu trúc<br /> và chức năng của protein này.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> Nguyên liệu<br /> <br /> Email: yenhtt79@gmail.com<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 161<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Hoàng Thị Thu Yến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tôm bị<br /> bệnh đốm trắng tại Trạm Nghiên cứu thủy sản<br /> nƣớc lợ, km10 đƣờng cao tốc Hải Phòng - Đồ<br /> Sơn và các đầm nuôi tƣ nhân vùng lân cận.<br /> Ngay sau khi nhận tôm nguyên con, mô gan<br /> đã đƣợc tách riêng và bảo quản trong dung<br /> dịch nitơ lỏng.<br /> Phương pháp<br /> Tách chiết RNA tổng số và tinh sạch mRNA<br /> RNA tổng số đƣợc tách chiết từ mẫu mô gan<br /> tôm sú bằng phƣơng pháp sử dụng trizol<br /> (Invitrogen) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất.<br /> Trizol là một loại dung dịch hóa chất hỗn hợp<br /> của phenol và guadinine isothiocyanate đƣợc<br /> pha sẵn chuyên dùng để tách chiết RNA tổng<br /> số từ tế bào và mô. Mẫu mô đƣợc nghiền<br /> trong trizol thành dạng đồng nhất bằng dụng<br /> cụ nghiền chuyên dụng. Trong quá trình<br /> nghiền mẫu, sự có mặt của trizol giúp bảo<br /> toàn cấu trúc của RNA trong khi phá vỡ tế<br /> bào và phân giải những thành phần khác của<br /> tế bào. Sau đó, RNA tổng số đƣợc phân tách<br /> bằng cách bổ sung chloroform và kết tủa bằng<br /> 2-propanol (isopropyl alcohol). Mẫu RNA<br /> đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên<br /> gel agarose. Sau đó, mRNA đƣợc tinh sạch từ<br /> RNA tổng số bằng kit “PolyATract mRNA<br /> Isolation System III” (Promega) theo hƣớng<br /> dẫn của nhà sản xuất.<br /> Tổng hợp cDNA<br /> Để chuẩn bị cho phản ứng RT-PCR, mRNA<br /> tinh sạch đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp<br /> cDNA bằng mồi Oligo(dT) và enzyme<br /> Reverse Transcriptase theo kit “SuperScript.<br /> First-Strand Synthesis System for RT-PCR”<br /> (Invitrogen).<br /> Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR<br /> Cặp mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại đoạn<br /> gen antivirus dựa trên trình tự gen đã đƣợc<br /> đăng ký trong ngân hàng Genbank với mã số<br /> AY302750. Để phục vụ cho những nghiên<br /> cứu tiếp theo, chúng tôi thiết kế thêm đoạn<br /> nhận biết của emzym giới hạn SpeI- NdeI vào<br /> đầu 5’ mồi xuôi:<br /> <br /> 85(09)/2: 161 - 164<br /> <br /> để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.<br /> Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện bằng<br /> enzyme Dream Taq DNA Polymerase<br /> (Fermentas) với chu trình nhiệt nhƣ sau: 95oC<br /> -3 phút; (95oC -1 phút; 55oC -45 giây; 72oC 45 giây) x 30 chu kỳ; 72o, 10 phút; kết thúc và<br /> giữ ở 4oC.<br /> Tách dòng gen<br /> Các đoạn DNA đƣợc khuếch đại bằng kỹ<br /> thuật RT-PCR đƣợc tinh sạch và gắn vào<br /> vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen), sau đó<br /> đƣợc biến nạp vào chủng E. coli DH10b và<br /> chọn lọc trên môi trƣờng nuôi cấy có kháng<br /> sinh Ampicillin, X-gal. Plasmid tái tổ hợp<br /> đƣợc kiểm tra bằng enzyme giới hạn nằm trên<br /> vector.<br /> Xác định trình tự gen<br /> Trình tự nucleotide của gen đƣợc xác định<br /> trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic<br /> Anlalyzer (Applied Biosystems). Gen<br /> antivirus đƣợc phân lập từ mô gan tôm sú bị<br /> nhiễm bệnh đốm trắng. Trình tự của gen đƣợc<br /> đọc ở 1 dòng plasmid tái tổ hợp và đọc lặp lại<br /> 2 lần. Kết quả trình tự gen đƣợc phân tích, so<br /> sánh bằng phần mềm sinh học chuyên dụng<br /> (Sequence Scanner, BLAST, Bioedit).<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Phân lập gen antivirus<br /> Dựa trên cơ sở trình tự đoạn gen antivirus đã<br /> công bố trên GenBank (AY302750), chúng<br /> tôi thiết kế mồi để nhân gen antivirus hoàn<br /> chỉnh. Mẫu mRNA tách chiết và tinh sạch từ<br /> mô gan của tôm sú bị bệnh đốm trắng đƣợc<br /> dùng làm khuôn tổng hợp sợi cDNA thứ nhất<br /> bằng cách sử dụng mồi Oligo(dT). Phản ứng<br /> RT-PCR sau đó đƣợc tiến hành với cDNA thu<br /> đƣợc. Sản phẩm RT-PCR đƣợc điện di kiểm<br /> tra trên gel agarose 0,8% (Hình 1).<br /> <br /> AntVr-F1:5’-ACTAGTCATATGCGTCATACAATCC-3’<br /> <br /> và XhoI-BamHI vào đầu 3’ mồi ngƣợc:<br /> AntVr-R513:5’-CTCGAGGGATCCTTAATGTGTCCTGC-3’<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 162<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Hoàng Thị Thu Yến và Đtg<br /> kb<br /> <br /> M<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> 1<br /> <br /> 6,0<br /> 3,0<br /> <br /> 85(09)/2: 161 - 164<br /> <br /> lớn có kích thƣớc tƣơng ứng với vector<br /> pCR2.1 (~3,9 kb) và một đoạn nhỏ hơn có<br /> kích thƣớc 0,5 kb tƣơng ứng với sản phẩm<br /> RT-PCR (Hình 2). Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng<br /> tôi khẳng định các dòng plasmid này đã có<br /> gắn gen antivirus.<br /> kb<br /> <br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 1,0<br /> 0,5<br /> <br /> 6,0<br /> <br /> 0,25<br /> <br /> 3,0<br /> <br /> Hình 1. Sản phẩm nhân gen antivirus bằng kỹ<br /> thuật RT-PCR<br /> M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm RT-PCR nhân gen<br /> antivirus<br /> <br /> Kết quả ở hình 1 cho thấy sản phẩm RT-PCR<br /> nhân gen antivirus có kích thƣớc khoảng 0,5<br /> kb đúng với tính toán lý thuyết. Sản phẩm này<br /> đƣợc tinh sạch từ gel agarose để phục vụ cho<br /> nghiên cứu tiếp theo.<br /> Tạo dòng gen antivirus<br /> Sản phẩm nhân gen antivirus tinh sạch đƣợc<br /> gắn vào vector pCR2.1 (Invitrogen) và biến nạp<br /> vào E.coli DH10b. Để kiểm tra các plasmid tái<br /> tổ hợp chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn<br /> EcoRI, cho phép cắt gen antivirus (nếu có) ra<br /> khỏi vector. Kết quả phân tích các dòng plasmid<br /> tái tổ hợp đƣợc thể hiện ở hình 2.<br /> Sau khi phân tích các dòng plasmid tái tổ hợp<br /> bằng enzyme EcoRI, kết quả điện di cho thấy<br /> mỗi plasmid bị cắt thành hai đoạn: một đoạn<br /> <br /> 1,0<br /> 0,5<br /> 0,25<br /> <br /> Hình 2. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm RTPCR trong vector tái tổ hợp. M: Marker 1 kb; 1-4:<br /> Plasmid pCR2.1 mang gen antivirus.<br /> <br /> Phân tích trình tự gen antivirus<br /> Chúng tôi đã xác định trình tự của gen<br /> antivirus đầy đủ đã đƣợc gắn với vector<br /> pCR2.1. Sau khi phân tích trình tự, chúng tôi<br /> đã khẳng định đƣợc chắc chắn đoạn cDNA<br /> phân lập đƣợc là trình tự ORF hoàn chỉnh mã<br /> hóa antivirus. Gen antivirus có kích thƣớc<br /> 513 bp, mã hóa 170 amino acid và mã kết<br /> thúc là TAA (hình 3).<br /> <br /> ATGCGTCATACAATCCTAGTTTTCCTTTCCCTCGGTGTTGTTGGGTCGGCTGTGGCAACATCATACGAGAAAAGTGCCAA 80<br /> M R H T I L V F L S L G V V G S A V A T S Y E K S A N<br /> TGATTCCAAGGCTGTCTGCTATAGCCCCTATACTGCCATTGCGGATCGCTGTTTGTTTGTCGATCACCAGACAGATGGAA 160<br /> D S K A V C Y S P Y T A I A D R C L F V D H Q T D G<br /> GCTGGTATGACATGCGAGAGTACTGTAACCTTATAAATGGAGACTTTCTCAAGCTGGATGACGCTAATCTCCTTACTGAT 240<br /> S W Y D M R E Y C N L I N G D F L K L D D A N L L T D<br /> ATCGTTGAGTACATTACTTACCAAGTGGGTGTGAACAGAGACTACTGGATCGGGGGGAGTGACGAGAACCACGAGGGTCT 320<br /> I V E Y I T Y Q V G V N R D Y W I G G S D E N H E G L<br /> TTGGCTGTGGACGGACGGAACTCTCATGCGGACAGGTGTTCCCTTGTGGTACCATTGCACCTCCATCTCTCAACAACCAG 400<br /> W L W T D G T L M R T G V P L W Y H C T S I S Q Q P<br /> ATGGTGGCTCCTCAGAGAACTGTGCCGTCATGCGCTGGGACTCATTTTACCATATCCATGATGTGTCTTGCTACACTTCT 480<br /> D G G S S E N C A V M R W D S F Y H I H D V S C Y T S<br /> CGGTCTGTCATTTGTGAAAGCAGGACACATTAA 513<br /> R S V I C E S R T H *<br /> <br /> Hình 3. Trình tự gen và amino acid suy diễn của antivirus<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 163<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Hoàng Thị Thu Yến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Khi so sánh trình tự nucleotide của gen antivirus<br /> phân lập từ tôm sú Việt Nam với trình tự gen<br /> PmAV phân lập từ tôm sú Trung Quốc và Ấn<br /> Độ (mã số GenBank tƣơng ứng: AY302750,<br /> DQ641258 và HM034318), chúng tôi thấy<br /> không có sự sai khác về trình tự nucleotide. Nhƣ<br /> vậy, trình tự gen antivirus có tính bảo thủ cao<br /> trong loài. Đoạn cDNA mã hóa antivirus mà<br /> chúng tôi phân lập đƣợc là nguyên liệu có thể<br /> phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm<br /> làm sáng tỏ chức năng của protein này.<br /> KẾT LUẬN<br /> Chúng tôi đã tiến hành tạo dòng và xác định<br /> trình tự gen antivirus từ mô gan của tôm sú<br /> nhiễm bệnh đốm trắng. Gen này có kích thƣớc<br /> 513 bp mã hóa cho 170 amino acid. Trình tự gen<br /> antivirus đã đƣợc đăng ký trên Genbank với mã<br /> số HQ662559.<br /> Lời cảm ơn: Công trình đƣợc thực hiện với kinh<br /> phí của đề tài “Nghiên cứu giải trình tự một<br /> phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu genome<br /> tôm sú (P. monodon)” thuộc Chƣơng trình Công<br /> nghệ sinh học thủy sản 2008-2010, Bộ Nông<br /> <br /> 85(09)/2: 161 - 164<br /> <br /> nghiệp và Phát triển nông thôn và trang thiết bị<br /> của phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ<br /> gen.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Lightner DV, Redman RM (1998) Shrimp<br /> diseases and current diagnostic methods. Aquaculture<br /> 164: 201-220.<br /> [2]. Liu H, Soderhall K, Jiravanichpaisal P (2009)<br /> Antiviral immunity in crustaceans. Fish Shellfish<br /> Immunol 27(2): 79-88.<br /> [3]. Luo T, Li F, Lei K, Xu X (2007) Genomic<br /> organization,<br /> promoter<br /> characterization<br /> and<br /> expression profiles of an antiviral gene PmAV from<br /> the shrimp Penaeus monodon. Mol Immunol 44(7):<br /> 1516-1523.<br /> [4]. Luo T, Zhang X, Shao Z, Xu X (2003) PmAV, a<br /> novel gene involved in virus resistance of shrimp<br /> Penaeus monodon. FEBS Lett 551(1-3): 53-57.<br /> [5]. Zhan WB, Wang YH (1998) White spot<br /> syndrome virus infection of cultured shrimp in china.<br /> J Aquat Anim Health 10: 405-410.<br /> <br /> SUMMARY<br /> CLONING AND SEQUENCING OF cDNA ENCODING ANTIVIRUS ASSOCIATED<br /> WITH IMMUNE RESPONSE TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN SHRIMP<br /> (PENAEUS MONODON)<br /> Hoang Thi Thu Yen1*, Kim Thi Phuong Oanh2,<br /> Pham Anh Tuan3, Nong Van Hai2<br /> 1<br /> <br /> Thai Nguyen University<br /> Institute of Biotechnology - Vietnam Academy of Science and Technology<br /> 3<br /> Ministry of Agriculture & Rural Development<br /> <br /> 2<br /> <br /> Diseases caused by viruses especially by white spot syndrome virus (White Spots Syndrome Virus -WSSV)<br /> are the greatest challenge to worldwide shrimp aquaculture. The current hasn’t got methods to control<br /> WSSV when shrimp disease occurred. Thus, the gene perform functions related to immunity of shrimp are<br /> particularly interested in research. Antivirrus is the first gene that related to resistance to WSSV have been<br /> studied in Penaeus monodon (PmAV). In this study, we cloned and sequenced full length cDNA encoding<br /> antivirus from WSSS infected black tiger shrimp. The ORF of antivirus gene was 513 bp in length, and was<br /> predicted to encode a 170 amino acid in protein. Alignment of the newly determined sequence and that of<br /> the GenBank (AY302750, DQ641258 and HM034318) showed that aren’t nucleotides sequence different.<br /> Our sequence was submitted to GenBank with accession number HQ662559. The isolated cDNA is a good<br /> starting material for further elucidating the function of antivirus.<br /> Key words: Black tiger shrimp, Penaeus monodon, immune ralated gene, antivirus, WSSV, WSSV related<br /> gene, white spots syndrome.<br /> <br /> *<br /> <br /> Email: yenhtt79@gmail.com<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 164<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />