1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI TIỂU LUẬN MÔN CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG KỸ
THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
CHỦ ĐỀ :
CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC TYPE PRRS
Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Nga MSSV : 06126084
Lớp : DH06SH
2
MỤC LỤC
Phần I : Đặt vấn đề……………………………………………………3
Phần II : Tổng quan……………………………………………………4
II.1 : Giới thiệu về virus PRRS……………………………………..4
II.2 : Giới thiệu về phương pháp phát hiện…………………………5
II.3 : Vật liệu và phương pháp………………………………………6
3.1 : Dòng tế bào nuôi cấy và virus……………………………….6
3.2 : Thiết kế primer và probe…………………………………….6
3.3 : Ly trích RNA và các mẫu định lượng……………………….7
3.4 : RT-PCR định lượng…………………………………………7
3.5 : Tính chuyên biệt và tính nhạy của TaqMan® RT-PCR……...9
3.6 : Các yếu tố cản trở……………………………………………9
II.4 Kết quả…………………………………………………………..10
Phần III : Kết luận…………………………………………………………16
Phần IV : Tài liệu tham khảo
3
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
PRRS : hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (Porcine Reproductive And
Respiratory Syndrome).Bệnh này xảy ra với các biểu hiện rối loạn sinh sản trên
heo nái và hô hấp trên heo thịt, gây thiệt hại đáng kể cho nhà chăn nuôi.
Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Bắc mỹ vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện
ở Châu Âu và Châu Á.Và ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn
lợn nhập từ Mỹ.
Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo nhiều lần đã bùng phát thành dịch ở
nhiều nơi trên thế giới
Khi phân tích về mặt di truyền người ta xác định được các dòng virus PRRS :
dòng châu Âu (chủ yếu là Lelystad) , dòng châu Mỹ (chủ yếu là VR-2332).Và
trong những năm gần đây thì còn phát hiện thêm dòng virus có nguồn gốc từ Trung
Quốc với mức độ gây bệnh khá nguy hiểm.
Vì vậy viêc chuẩn đoán phân biệt được các type là điều rất cần thiết vì như vậy thì
ta có thể áp dụng được việc sử dụng nguồn vaccine có hiệu quả, sử dụng phương
pháp phòng chống bệnh thích hợp.
Phát hiện kháng thể, phân lập virus trên môi trường nuôi cấy tế bào, và RT-PCR là
các phương pháp phổ biến sử dụng để chuẩn đoán PRRS. Tùy thuộc vào thời gian
nhiễm bệnh và mẫu thí nghiệm có sẵn mà lựa chọn phương pháp chuẩn đoán thích
hợp nhất.
Để chẩn đoán phân biệt được các type virus PRRS thì ta có thể dùng kỹ thuật RT-
PCR , nested PCR , cắt phân đoạn đa hình (RFLP), ELISA.
Với các kỹ thuật trên, kỹ thuật RT-PCR định lượng với thuốc nhuộm TaqMan
được xem là thành công nhất cho việc nghiên cứu chuẩn đoán bệnh .Kỹ thuật này
có thể phát hiện và cho thấy sự khác nhau của 2 dòng PRRSV EU và US.
4
II. TỔNG QUAN
II.1 Giới thiệu về virus PRRS
Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo được xác định là do 1 loại virus
ARN sợi dương có vỏ envelope thuộc họ Arteriviridae.
Bộ gen của virus gây hội chứng PRRS gồm có 8 khung đọc mở (ORF : Open
Reading Frame ) mã hóa cho các thành phần khác nhau của virus.Tuy nhiên chỉ có
3 khung ORF có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus đó là ORF 7, 6 và 5 quy
định tổng hợp các protein tương ứng là : nucleocapsid (N) 15-kda , matrix (M)
19-kda và glycoprotein envelope (E) 25-kda. Các ORF 7 và ORF 6 có tính ổn định
rất cao trong từng dòng và sự khác biệt 2 ORF này ở 2 dòng châu Âu và châu Mỹ
cũng rõ rệt.
Giữa các dòng virus khi xét ở mức độ nucleotide thì có sự tương đồng khoảng
55%- 80% , sự khác nhau chủ yếu về yếu tố kháng nguyên.
Hình 1: Các Protein cấu trúc PRRSV
5
II.2 Giới thiệu về phương pháp phát hiện
Trong các phương pháp dùng để phát hiện PRRSV thì phương pháp thành
công nhất để phát hiện acid nucleic đặc trưng của PRRSV là RT-PCR (Reverse
Transcription Polymerase chain reaction).
Một số phương pháp RT-PCR được thiết lập để phát hiện PRRSV, nhưng có một
vài trong số này không thể phân biệt được dòng virus PRRS EU và US. Và chỉ có
RT-PCR định lượng là có thể phát hiện được.
RT-PCR thông thường tốn thời gian hơn TaqMan® RT-PCR (định lượng) và dễ bị
nhiễm DNA từ lần PCR trước.Hơn nữa, nó đòi hỏi 1 số bước trước và sau khi
khuếch đại. Sự phát triển của công nghệ TaqMan là 1 sự cải tiến đáng kể trong
phương pháp phát hiện bằng cách cho phép phân tích định lượng.
Nguyên tắc hoạt động của TaqMan® là cắt probe (sợi đôi) được đánh dấu huỳnh
quang ở đầu 5’ và chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’ nhờ hoạt động 5’- 3’
exonuclease của các Taq DNA polymerase (chịu nhiệt).
Không chỉ các primer mà các probe đều có thể gắn đặc hiệu với trình tự đích, do
đó, ngay cả khi sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu được tạo ra thì sẽ không thu
được tín hiệu TaqMan dương tính vì các probe không gắn vào các phân tử DNA.
Khi 2 primer được chọn chỉ để khuếch đại 1 đoạn DNA ngắn có chứa probe có các
vị trí gắn kết thì hiệu quả khuếch đại sẽ được nâng cao.Nhiều thí nghiệm có thể
được phát triển dễ dàng bởi vì có thể đánh dấu các probe với các thuốc nhuộm
huỳnh quang khác nhau. Do sự khác biệt lớn về chiều dài bước sóng để phát ra tín
hiệu của thuốc nhuộm huỳnh quang VIC và FAM , Sequence Detector SDS 7700
có thể phân biệt đồng thời được các tín hiệu của probe đánh dấu VIC –FAM cùng
trong 1 ống.