Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hoá học: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án "Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin" nhằm tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin được thu nhận từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia; Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hoá học: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… NGUYỄN TRỌNG DÂN TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT CỦA INDIRUBIN Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Hà Nội - 2021
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Lưu Văn Chính Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Tô Đạo Cường Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Các hợp chất thiên nhiên được tạo thành từ quá trình sinh tổng hợp trong thực động vật, vi sinh vật thường có các hoạt tính sinh học rất đặc biệt, chọn lọc, dễ dung nạp vào cơ thể và ít tác dụng phụ. Vì thế, nhiều chất trong số chúng đã được sử dụng rộng rãi trong thực tế để làm thuốc điều trị bệnh như: ung thư, nhiễm khuẩn… mà tác dụng điều trị các bệnh này được quyết định bởi cấu trúc hóa học của chúng. Cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên thường rất phức tạp mà bằng con đường tổng hợp toàn phần sẽ không kinh tế vì phải qua nhiều bước phản ứng, hiệu suất thấp, chi phí xử lý môi trường cao, thời gian phản ứng dài. Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ thiên nhiên để tổng hợp, phân lập các chất dẫn đường, sau đó chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt hơn chất dẫn đường đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Gần đây, các nhà khoa học đã khám phá nhiều hoạt tính sinh học của hợp chất indirubin và dẫn xuất, một bisindole alkaloid có thể được thu nhận với lượng lớn từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia có nhiều ở Việt Nam hoặc bằng phản ứng giữa isatin và indoxyl acetate. Hoạt chất này và dẫn xuất của nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quí như gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư, có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tác dụng kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, kháng nấm, chống vảy nến với cơ chế rõ ràng, đến thời điểm hiện tại các công bố về các hoạt tính này vẫn đang tiếp tục. Tuy nhiên, để ứng dụng hợp chất này vào thực tế vẫn còn khó khăn do độ tan kém trong nước, một số công trình đã và đang nghiên cứu sử dụng hướng thứ nhất để cải thiện độ tan của indirubin, theo hướng thứ hai một số dẫn xuất cũng đã được tổng hợp tuy nhiên các công bố vẫn chưa nhiều. Theo hướng này, đề tài của luận án đề cập tới tổng hợp một số dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất dị vòng chứa S, N, O; các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine, sau đó đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro, giải thích hoạt tính để bổ sung các dữ liệu về hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong việc tìm 1
kiếm các thuốc mới để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có trong nước. Vì thế, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin được thu nhận từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia. - Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án Từ mục tiêu trên chúng tôi đã thực hiện nội dung nghiên cứu của luận án như sau: + Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6- mercaptopurin, các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine; + Xác định cấu trúc của các dẫn xuất mới tổng hợp được bằng các phương pháp phổ hiện đại; + Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro ( ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60 ) của các dẫn xuất mới tổng hợp được; + Nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống ung thư của một số dẫn xuất mới tổng hợp được sử dụng phần mềm AutoDock 4.2. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu là tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Giới thiệu về indirubin và các đồng phân 1.2. Thu nhận, tổng hợp indirubin 1.3. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 1.4. Hoạt tính sinh học của indirubin và các dẫn xuất 1.5. Khái quát về các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin 1.6. Giới thiệu về chalcone 2
1.7. Giới thiệu về mô phỏng tương tác phân tử (molecular docking) 1.8. Enzyme glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phần này nói về nguồn gốc của hợp chất indirubin dùng cho nghiên cứu, các phản ứng được sử dụng trong luận án, các kỹ thuật hiện đại sử dụng để phân tích cấu trúc, các hóa chất, trang thiết bị, dòng tế bào sử dụng cho nghiên cứu, các phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học, việc chuẩn bị phối tử và protein mục tiêu, mô phỏng tương tác sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6. 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là hợp chất indirubin được thu nhận từ cây Chàm mèo Strobilanthes cusia. Indirubin: Được cung cấp bởi PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện HLKH-CN Việt Nam, có độ sạch trên 95%. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp sử dụng trong luận án bao gồm ba phần chính: Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất của indirubin sử dụng các kỹ thuật hiện đại như NMR-1D, NMR-2D, HR-MS(ESI) để xác định cấu trúc các chất nhận được, phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (gây độc và chống tăng sinh tế bào) và phương pháp mô phỏng tương tác của các chất trên đích enzyme GSK-3β sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6. 2.3. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu Các hóa chất, bản mỏng sử dụng cho nghiên cứu được mua từ các hãng hóa chất như Sigma-Aldrich, Scharlau, Prolabo. Các thiết bị Bruker ADVANCE 500 MHz được dùng để ghi phổ NMR; Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS được dùng để ghi phổ HR-MS(ESI); Bruker D8 QUEST ở 273 K với bức xạ MoKα (λ = 0.71073 Å) sử dụng máy đơn sắc TRIUMPH được dùng để ghi phổ nhiễu xạ tia X; Buchi 530 được dùng để đo điểm chảy. 2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 3
Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào áp dụng đối với các dòng tế bào Hep-G2 (ATCC-HB-8065), LU-1 (ACTT-HTB-57), SW480 (ATCC-CCL-228), HEK-293 (ATCC-CRL-1573). Phương pháp xác định hoạt tính chống tăng sinh áp dụng đối với dòng tế bào HL-60 (ATCC-CCL-240). 2.5. Chuẩn bị các phối tử và protein Cấu trúc hai chiều của các hợp chất nghiên cứu được xây dựng bằng phần mềm Chemdraw19.1 (ChemOffice 2019) sau đó được chuyển sang dạng ba chiều bằng phần mềm Chem3D 19.1. Các hợp chất được tối ưu hóa cấu hình không gian sử dụng phần mềm Gabedit 2.5.0. Việc xác định mạch chính của hợp chất được thực hiện tự động bởi phần mềm AutoDockTools (MGLTools) Cấu trúc 3D của protein GSK-3β được lấy từ ngân hàng cơ sở dữ liệu protein (Protein Data Bank - PDB) và được chuẩn hóa sử dụng phần mềm AutoDockTools. 2.6. Mô phỏng tương tác sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 Sử dụng phần mềm AutoDock Tools (MGLTools) để chuẩn bị dữ liệu đầu vào cho quá trình mô phỏng tương tác. Vị trí và kích thước của hộp lưới dùng cho mô phỏng được xác định để đảm bảo không gian mô phỏng sẽ bao gồm các amino axit đã tham gia tương tác tạo liên kết với các phối tử mẫu indirubin-3′-oxime, CHIR-98014 và BIO- acetoxime. Các thông số quan tâm sau quá trình mô phỏng tính toán là giá trị năng lượng liên kết (ái lực) giữa các chất với enzyme, số liên kết hydro giữa các chất với amino axít ở tâm hoạt động. CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM Phần này mô tả thực nghiệm tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin theo các sơ đồ phản ứng và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các dẫn xuất mới tạo ra. 3.1.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) 4
Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.1. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) Bảng 3.1. Cấu trúc của các thiol 41a-41i STT Hợp RSH STT Hợp RSH chất chất 1 41a 6 41f 2 41b 7 41g 3 41c 8 41h 4 41d 9 41i 5 41e 5
3.2.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol- 1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các tổ hợp của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) 3.3.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol- 1,3-propylen (chuyển hóa ở N-1) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết propan-2-ol (chuyển hóa ở N-1) 6
3.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) 3.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) Sơ đồ phản ứng: 7
Sơ đồ 3.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) 3.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) Sơ đồ phản ứng: Sơ đồ 3.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) 3.7. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của indirubin 8
Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành theo phương pháp của Monks (1991) Thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh được tiến hành theo Tim Mosmann (1983) CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phần này mô tả kết quả tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin, kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học, kết quả mô phỏng tương tác của các chất sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 và thảo luận các kết quả đạt được. 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin 4.1.1.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) Các dẫn xuất mới của indirubin 42a-42i được tổng hợp từ indirubin qua 3 bước (sơ đồ 3.1). Trước hết hợp chất 25 được tạo thành bằng phản ứng ngưng tụ của indirubin với hydroxylamine hydrochloride trong dung môi pyridine, hồi lưu 3 giờ. Tiếp theo, 25 được O-alkyl hóa với 1,3-dibromopropane trong dung môi DMF, xúc tác triethylamine nhận được hợp chất trung gian chìa khóa 26. Bước cuối cùng, cho các thiol 41a-41i (bảng 3.1) phản ứng thế nucleophin SN2 với chất trung gian chìa khóa 26 trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, xúc tác triethylamine, thời gian 20 giờ. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải chloroform/ethyl acetate (2/1) nhận được chín chất đích 42a-42i với hiệu suất 39÷63%. Cấu trúc của các chất được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR -1D, 2D và HR-MS(ESI). 4.1.2.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3- propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) Các dẫn xuất mới của indirubin 43a-43i được tổng hợp từ indirubin qua 3 bước (sơ đồ 3.2). Trước hết hợp chất 25 được tạo thành 9
bằng phản ứng ngưng tụ của indirubin với hydroxylamine hydrochloride trong dung môi pyridine, hồi lưu 3 giờ. Tiếp theo, nó được O-alkyl hóa với epibromohydrin trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, xúc tác triethylamine nhận được hợp chất trung gian chìa khóa 27. Bước cuối cùng, cho các thiol 41a-41i phản ứng thế mở vòng epoxy với chất trung gian chìa khóa 27 trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, xúc tác triethylamine, thời gian 40 giờ. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl acetate (2/1) nhận được chín chất đích 43a-43i với hiệu suất 59,2÷75,0%. Cấu trúc của các chất được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR -1D, 2D và HR- MS(ESI). 4.1.3.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4- oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3- propylen (chuyển hóa ở N-1) Các dẫn xuất mới của indirubin 45a-45h được tổng hợp từ indirubin qua 2 bước (sơ đồ 3.3). Đầu tiên phản ứng giữa indirubin 1 với epichlorohydrin được tiến hành trong dung môi DMF ở nhiệt độ 45oC, xúc tác K2CO3, KI, xúc tác chuyển pha (1- butyl)triethylammonium bromide, thời gian 4 ngày. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/slica gel, hệ dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl acetate (10/1) nhận được chất trung gian chìa khóa 44 với hiệu suất 40%. Bước tiếp theo, các thiol 41a-41h được tham gia phản ứng thế mở vòng epoxy hợp chất trung gian chìa khóa 44 trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, xúc tác triethylamine, thời gian 40 giờ. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải chloroform/ethyl acetate (2/1) nhận được tám chất đích 45a-45h với hiệu suất 63,1÷77,0%. Cấu trúc của các chất được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR -1D, 2D và HR-MS(ESI). 4.1.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 10
hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) Các hợp chất 53a-53i được tổng hợp theo sơ đồ 3.4, trong đó phản ứng Click được sử dụng để ghép các 4-(2-azidoethoxy)-2- hydroxychalcone 51a-51l với indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime] 52 trong sự có mặt của CuI. Trước hết, các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l được tổng hợp từ chất đầu 2,4-dihydroxyacetophenone 47 bằng một qui trình 3 bước với hiệu suất tốt như sau: Ketone 47 được O-alkyl hóa chọn lọc nhóm -OH ở vị trí 4 với 1,2-dichloroethane trong dung môi DMF ở nhiệt độ 55oC, xúc tác K2CO3, thời gian 10 giờ. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/1) nhận được hợp chất trung gian 4-(2-chloroethoxy)-2-hydroxyacetophenone 48 với hiệu suất 61%, ở đây nhóm -OH ở vị trí 2 không tham gia phản ứng O-alkyl hóa do sự tạo thành liên kết hydro nội phân tử giữa nguyên tử H của nhóm này với nguyên tử O của nhóm C=O trong nhóm 1-acetyl. Tiếp theo, dẫn xuất alkylchloride này được cho phản ứng với NaN3 trong dung môi DMSO ở nhiệt độ 60oC, 24 giờ cho chất trung gian 4-(2- azidoethoxy)-2-hydroxyacetophenone 49 với hiệu suất 81%. Cuối cùng, hợp phần ketone này được ngưng tụ Claisen-Schmidt với các aldehyde gồm benzaldehyde 50a, 3,4,5-trimethoxybenzaldehyde 50b, 2-methoxybenzaldehyde 50c, 3-methoxybenzaldehyde 50d, 4- methoxybenzaldehyde 50e, 2-ethoxybenzaldehyde 50f, 3- ethoxybenzaldehyde 50g, 4-ethoxybenzaldehyde 50h, 2- propoxybenzaldehyde 50i, 3-propoxybenzaldehyde 50k và 4- propoxybenzaldehyde 50l trong MeOH xúc tác bởi KOH để tạo thành các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l với hiệu suất 78÷87%. Trong đó có 7 chalcone mới gồm 51a, 51f, 51g, 51h, 51i, 51k, 51l và 4 chalcone cũ 51b, 51c, 51d, 51f được mô tả trong tài liệu trước đó. Các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone nhận được là 11
những chất rắn, màu vàng đặc trưng của các chalcone. Cấu trúc của các chất trung gian 48, 49 và các (2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone được xác định bằng các phương pháp phổ NMR và HR-MS(ESI). Tiếp theo, chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[O-(prop-2- ynyl)oxime] 52 được điều chế từ indirubin qua hai bước. Trước hết indirubin-3ʹ-oxime 25 được tạo thành bởi phản ứng ngưng tụ của indirubin với hydroxylamine chlohydric trong dung môi pyridine, hồi lưu 3 giờ. Tiếp theo, hợp chất này được O-alkyl hóa với propargyl bromide trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, xúc tác triethylamine, 48 giờ. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/1) nhận được hợp chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime 52 với hiệu suất 79% tính theo indirubin-3ʹ-oxime. Cấu trúc của hợp chất 52 được xác định bằng các phương pháp phổ NMR và HR-MS(ESI). Bước cuối cùng trong tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole là cho từng 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone ở trên phản ứng với hợp chất indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime 52 trong dung môi DMF ở nhiệt độ phòng, xúc tác CuI, 24 giờ. Tiến trình phản ứng được kiểm soát bằng TLC, khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được pha loãng với ethyl acetate, sau đó rửa bằng nước, làm khô bằng Na2SO4 khan, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silicagel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/2) nhận được mười một dẫn xuất mới của indirubin 53a-53l với hiệu suất 54÷67%. Cấu trúc của các chất được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR -1D, 2D và HR- MS(ESI). 4.1.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) Theo sơ đồ 3.5, các tổ hợp lai 56a-56l của indirubin-3ʹ-oxime với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole 12
nhận được qua ba bước phản ứng. Trước hết, thực hiện phản ứng N- alkyl hóa giữa indirubin 1 với propargyl bromide trong dung môi DMF khan ở nhiệt độ phòng, sử dụng hệ xúc tác K2CO3, KI, 1- (butyl)triethylammonium bromide, 48 giờ. Kết thúc phản ứng, sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (4/1) nhận được hợp chất 54 với hiệu suất 59%. Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng phổ NMR, HR- MS(ESI). Tương tự như phản ứng N-alkyl hóa indirubin bằng epichlorohydrin, phản ứng N-propargyl hóa indirubin chỉ xảy ra ở vị trí N-1. Tiếp theo, chất trung gian chìa khóa 55 được tạo thành với hiệu suất 79% bởi phản ứng ngưng tụ giữa 54 với hydroxylamine hydrochloride trong dung môi pyridine. Đơn tinh thể hợp chất 55 dễ dàng được tạo thành trong hệ dung môi n-hexan/acetone (2/1) và được dùng để đo phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể. Cấu trúc của 55 được xác định bằng phổ NMR, HR-MS(ESI) kết hợp với phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể. Dữ liệu tinh thể học của hợp chất này đã được gửi đến trung tâm dữ liệu tinh thể học của Anh và được cấp mã số CCDC 1917485, khẳng định cấu trúc của hợp chất 55 tổng hợp được là chính xác và có cấu hình tuyệt đối là (2ʹZindirubin, 3ʹEoxime) (Hình 4.27). Từ cấu trúc đơn tinh thể của hợp chất 55 khẳng định chất đầu indirubin 1 có cấu hình tuyệt đối 2ʹZ và oxime 25 tạo thành có cấu hình 3ʹE. Cuối cùng, thực hiện phản ứng đóng vòng 1,2,3-triazole giữa hợp chất 55 với từng 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l trong dung môi DMSO ở nhiệt độ phòng, xúc tác CuI, 24 giờ. Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký cột/silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/2) nhận được mười một chất đích 56a-56l với hiệu suất 57÷70%. Cấu trúc của các chất đích này được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR -1D, 2D và HR-MS(ESI). 13
Hình 4.27. Cấu trúc đơn tinh thể của hợp chất 55 4.1.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) Indirubin và các dẫn xuất có độ tan trong nước rất kém dẫn đến sinh khả dụng thấp. Để cải thiện tính tan các dẫn xuất của indirubin, hợp chất này có thể được ghép với các amine qua cầu liên kết methyl 1,2,3-triazole nhờ phản ứng click chemistry (sơ đồ 3.6). Hợp phần amine được lựa chọn bắt đầu từ các dẫn xuất halogen: 2- chloroethyldimethylamine, 1-(2-chloroethyl)piperidine, 1-(2- chloroethyl)imidazole và N-(2-chloroethyl)morpholine. Các dẫn xuất chloro amine này được chuyển thành các azido của các amine tương ứng bằng NaN3/K2CO3 trong DMSO ở 60 oC. Sau khi ly tâm loại bỏ chất rắn, từng dung dịch azido của các amine thu được cho phản ứng click chemistry với (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin-3ʹ-oxime 55 trong sự có mặt của xúc tác CuI ở nhiệt độ phòng để nhận được các sản phẩm click 56m-56p. Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc kí cột/silica gel rửa giải bằng hệ n-hexane/aceton (1/1) thu các sản phẩm đích 56m-56p với hiệu suất từ 56÷68%. Cấu trúc của các sản phẩm đích được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại như: NMR- 1D, 2D và HR-MS(ESI). 4.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 4.2.1. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 42a-42i 14
Bảng 4.13. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 42a-42i và các chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất SW480 LU-1 HepG2 HL-60 1 42a >20 >20 >20 >20 2 42b >20 >20 >20 >20 3 42c >20 >20 >20 >20 4 42d >20 >20 >20 >20 5 42e 2,56 2,92 3,69 2,54 6 42f >20 >20 >20 >20 7 42g >20 >20 >20 >20 8 42h >20 >20 >20 >20 9 42i 4,82 5,19 4,70 5,94 10 6-mercaptopurin 19,10 18,75 19,72 16,04 11 Indirubin >20 >20 >20 >20 12 Indirubin-3ʹ-oxime 14,26 13,11 15,87 14,90 13 Ellipticine 2,19 1,91 1,79 2,40 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào ung thư trên bảng cho thấy hai dẫn xuất 42e và 42i có hoạt tính trên cả bốn dòng tế bào thử nghiệm, giá trị IC50 dao động từ 2,54÷5,94 µM. Bảy dẫn xuất còn lại không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu. 4.2.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 43a-43i Bảng 4.14. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 43a-43i và các chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất SW480 LU-1 HepG2 HL-60 1 43a 19,24 19,00 >20 >20 2 43b >20 >20 >20 >20 3 43c >20 >20 >20 >20 4 43d >20 >20 >20 >20 5 43e >20 >20 >20 >20 6 43f 16,38 16,90 17,67 9,52 15
7 43g 15,96 19,11 15,34 12,03 8 43h >20 19,20 >20 16,40 9 43i >20 >20 >20 >20 10 6-mercaptopurin 19,10 18,75 19,72 16,04 11 Indirubin >20 >20 >20 >20 12 Indirubin-3ʹ-oxime 14,26 13,11 15,87 14,90 13 Ellipticine 2,19 1,91 1,79 2,40 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào ung thư trên bảng cho thấy hai dẫn xuất 43f và 43g có hoạt tính trên cả bốn dòng tế bào thử nghiệm, giá trị IC50 dao động từ 9,52÷19,11 µM. Hai hợp chất 43a và 43h thể hiện hoạt tính gây độc yếu trên hai dòng tế bào ung thư. Năm dẫn xuất còn lại không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu. 4.2.3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 45a-45h Bảng 4.15. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 45a-45h và các chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất SW480 LU-1 HepG2 HL-60 1 45a >20 >20 >20 >20 2 45b >20 >20 >20 >20 3 45c >20 >20 >20 >20 4 45d >20 >20 >20 >20 5 45e >20 >20 >20 >20 6 45f 1,65 2,21 1,90 1,35 7 45g >20 >20 >20 >20 8 45h 4,19 4,53 4,47 4,28 9 6-mercaptopurin 19,10 18,75 19,72 16,04 10 Indirubin >20 >20 >20 >20 Indirubin-3ʹ- 14,26 13,11 15,87 11 14,90 oxime 12 Ellipticine 2,19 1,91 1,79 2,40 16
Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào ung thư trên bảng cho thấy hai dẫn xuất 45f và 45h có hoạt tính trên cả bốn dòng tế bào thử nghiệm, giá trị IC50 dao động từ 1,35÷4,53 µM. Sáu dẫn xuất còn lại không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu. 4.2.4. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 53a-53l Bảng 4.16. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 53a-53l và các chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất SW480 LU-1 HepG2 HL-60 1 53a >20 >20 >20 >20 2 53b >20 >20 >20 >20 3 53c >20 >20 >20 >20 4 53d >20 >20 >20 >20 5 53e >20 >20 >20 >20 6 53f >20 >20 >20 >20 7 53g >20 >20 >20 >20 8 53h >20 >20 >20 >20 9 53i >20 >20 >20 >20 10 53k >20 >20 >20 >20 11 53l >20 >20 >20 >20 12 Indirubin >20 >20 >20 >20 Indirubin-3ʹ- 14,26 13,11 15,87 13 14,90 oxime 14 Ellipticine 2,19 1,91 1,79 2,40 Kết quả thử nghiệm trên bảng cho thấy tất cả các dẫn xuất 53a- 53l đều không thể hiện hoạt tính gây độc và chống tăng sinh trên cả bốn dòng tế bào ung thư ở nồng độ nghiên cứu. 4.2.5. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 56a-56p 17
Bảng 4.17. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 54, 55, 56a-56p và các chất đối chứng dương IC50 (μM) TT Hợp chất SW480 LU-1 HepG2 HL-60 HEK-293 1 54 >20 >20 >20 >20 >20 2 55 18,58 19,55 >20 15,27 16,22 3 56a 3,36 2,26 3,56 2,39 3,21 4 56b >20 >20 >20 >20 >20 5 56c 3,80 2,99 3,38 1,43 1,19 6 56d 4,46 2,85 3,76 3,40 2,01 7 56e 4,66 3,28 4,62 3,27 6,98 8 56f 2,54 1,30 2,01 0,98 1,03 9 56g 4,10 3,96 5,68 4,82 1,80 10 56h 14,13 8,74 14,23 6,50 9,74 11 56i 3,43 2,07 2,28 1,28 0,85 12 56k 2,91 2,50 2,95 1,29 1,92 13 56l 3,03 2,07 3,28 1,28 7,12 14 56m 14,36 8,74 15,31 15,96 11,93 15 56n 12,54 10,08 11,70 10,44 9,52 16 56o 11,16 8,80 11,68 9,39 5,89 17 56p 11,71 8,61 10,61 11,25 7,72 18 Indirubin >20 >20 >20 >20 >20 Indirubin- 15,65 16,36 16,00 14,16 19 16,50 3ʹ-oxime 20 Ellipticine 1,76 2,50 1,93 2,19 0,32 Dựa vào kết quả ở Bảng 4.17 nhận thấy hợp chất trung gian 55 thể hiện hoạt tính ở mức yếu với các dòng SW-480, LU-1 và HL-60. Các tổ hợp lai của indirubin với hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole 56a-56l thể hiện hoạt tính mạnh hơn rõ rệt so với các tiền chất, ngoại trừ hợp chất 56b với sự có mặt đồng thời của 3 nhóm methoxy (CH3O-) ở các vị trí R2, R3, R4 không thể hiện hoạt 18