BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Thị Kim Thoa
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI
Vitex limonifolia WALL. EX C.B.CLARK VÀ Vitex trifolia L.
Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số : 9.44.01.14
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Hà Nội - 2019
Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Nguyễn Xuân Nhiệm
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Ninh Khắc Bản
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học
viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2019.
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Hà Nội
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Trong vài thập kỉ trở lại đây, xu hướng đi sâu nghiên cứu các cây
thuốc và động vật làm thuốc để tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt
tính sinh học cao nhằm sản xuất các loại thuốc có giá trị cao phục vụ
cuộc sống ngày càng được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm.
Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Đẻn (Vitex)
có công dụng chữa các bệnh như: cảm mạo, sốt rét, chóng mặt, nhức đầu,
viêm ruột, rối loạn tiêu hóa, ho, hen suyễn, trị bệnh ngoài da,... [1]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học các loài thuộc chi Vitex cho thấy chi
này chứa đa dạng các lớp chất như: terpenoid, flavonoid, ecdysteroid,
lignan,... Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết
và các hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi này có các hoạt tính đáng
quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn, ....
Tuy vậy, những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của các loài thuộc chi Vitex ở Việt Nam còn rất hạn chế. Tính
đến nay, ở Việt Nam mới chỉ có khoảng 5 công trình nghiên cứu về thành
phần hóa học một số loài thuộc chi Vitex [2-6], chưa có công bố nào về
hoạt tính sinh học các loài thuộc chi này.
Chính vì vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Vitex ở Việt Nam tạo cơ sở khoa
học trong việc sử dụng bền vững tài nguyên cây thuốc này, đồng thời tạo
tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chế phẩm có
hoạt tính sinh học cao phục vụ công tác bảo vệ, chăm sóc sức khỏe cộng
đồng, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall. Ex C.B.Clark và Vitex
trifolia L.”.
2
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Xác định thành phần hóa học chủ yếu của lá hai loài Vitex
limonifolia Wall. ex C.B.Clarke và Vitex trifolia L. ở Việt Nam. Đánh giá
hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất
phân lập được.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:
1. Phân lập các hợp chất từ lá loài V. limonifolia và V. trifolia ở Việt
Nam bằng các phương pháp sắc ký;
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các
phương pháp vật lý, hóa học;
3. Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập
được từ loài V. limonifolia;
4. Đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất phân lập
được từ loài V. limonifolia và V. trifolia.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về chi Vitex
Chi Vitex trên thế giới có khoảng 250 loài, phân bố chủ yếu ở các
quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới, đa dạng từ cây bụi tới cây gỗ trung
bình [7]. Ở Việt Nam, chi Vitex đã ghi nhận được 20 loài. Từ thời cổ đại,
con người đã sử dụng nhiều loài thuộc chi Vitex để chữa nhiều bệnh khác
nhau như đau khớp, co giật, giảm sốt, các bệnh về đường hô hấp, kháng
lao, kháng u,.... Ở Việt Nam, nhiều loài Vitex được sử dụng trong các bài
thuốc dân gian để chữa trị một số bệnh thông dụng như trị cảm sốt, giảm
đau, trúng phong,...
Các nghiên cứu cho thấy, thành phần hóa học của các loài trong chi
Vitex đa dạng, chủ yếu là các hợp chất terpenoid, flavonoid, ecdysteroid,
lignan, iridoid,... Các loài thuộc chi này cũng có nhiều hoạt tính sinh học
3
đáng quan tâm như : gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, giảm đau,
kháng virus, vi sinh vật và một số hoạt tính khác.
Ở Việt Nam, mới có 5 công bố nghiên cứu về thành phần hóa học
một số loài thuộc chi Vitex, chưa có công bố nào về hoạt tính sinh học.
1.2. Giới thiệu về viêm: Giới thiệu về viêm, thuốc kháng viêm, vai trò
của NO trong bệnh lý viêm.
1.3. Giới thiệu về kháng virus: Giới thiệu về virus, thuốc kháng virus
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu lá loài Vitex limonifolia Wall. ex C.B.Clarke và loài Vitex
trifolia L. thu tại Vườn quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế, Việt Nam
vào tháng 9/2015.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC) và
sắc ký cột (CC).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là
kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao
gồm: phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), độ quay cực ([]D).
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính kháng viêm in vitro được đánh giá qua tác dụng ức chế sự
sản sinh NO trong tế bào BV2, kích thích bởi LPS.
4
Xét nghiệm về hoạt tính kháng virus in vitro được thực hiện với
phương pháp SRB.
2.3. Phân lập các hợp chất
2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia
Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. limonifolia
2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. trifolia
5
2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập
2.4.1. Thông số vật lí của các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 12 hợp chất
phân lập được từ loài V. limonifolia.
2.4.2. Thông số vật lí của các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia
Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 16 hợp chất
phân lập được từ loài V. trifolia.
2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
2.5.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ
loài V. limonifolia.
- 12 hợp chất (VL1-VL12) được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa
trên sự ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2, kích thích bởi LPS. Kết
quả đánh giá hoạt tính ở nồng độ 20 µM được thể hiện như bảng dưới.
Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của các
hợp chất VL1-VL12 trên tế bào BV2
% tế bào sống sót 87,062,43 120,757,80 147,828,55 87,1211,28 104,519,50 86,633,23 96,935,10 104,519,50 141,198,73 119,536,65 59,045,83 80,503,25
Hợp chất VL1 VL2 VL3 VL4 VL5 VL6 VL7 VL8 VL9 VL10 VL11 VL12 L-NMMA
IC50 (µM) >50 2,500,34 7,130,87 24,701,52 39,673,14 19,161,09 45,315,31 >50 44,232,48 15,881,17 - >50 22,101,20
(-) Không đánh giá hoạt tính kháng viêm ở các nồng độ do tỉ lệ % sống sót nhỏ (< 80%)
6
2.5.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất
Từ loài V. limonifolia: Các hợp chất VL1-VL12 được tiến hành đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71) theo phương pháp thử nghiệm SRB.
Bảng 2.2. Hoạt tính kháng virus CVB3, HRV1B và EV71 của một
số hợp chất từ loài V. limonifolia.
CC50 (M)
IC50 (M)
Coxsackievirus B3 (CVB3)
>50 >50 >50
0,21±0,06 1,86±0,18 0,12±0,06 Human rhinovirus 1B (HRV1B) 0,61±0,21 48,07±1,46
>50 >50
Enterovirus 71 (EV71)
>50 >50
32,05±0,94 0,11±0,05
Kí hiệu VL4 VL6 Rupuntrivir VL4 Ribavirin VL4 Rupuntrivir
Từ loài V. trifolia: Các hợp chất VT1-VT16 được đánh giá sàng lọc
hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B
và enterovirus 71 ở nồng độ 10 M.
Bảng 2.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng một số chủng virus của
các hợp chất từ loài V. trifolia
% tế bào sống sót
Hợp chất
Coxsackievirus B3 2,38 3,52 4,99 13,27 1,94 -2,31 4,20 1,85
Human rhinovirus 1B 5,41 4,23 -1,51 0,71 -0,12 -1,87 -3,10 -0,68
Enterovirus 71 1,30 5,97 -4,34 3,37 2,29 -5,16 6,44 1,42
VT1 VT2 VT3 VT4 VT5 VT6 VT7 VT8
7
77,14 -5,98 3,44 1,89 6,23 -0,63 -0,19 1,32
80,20 -1,75 1,03 -3,34 -0,95 -0,20 -2,30 -1,79
43,35 -4,99 -4,94 -1,17 -1,87 1,53 -0,19 -8,83
VT9 VT10 VT11 VT12 VT13 VT14 VT15 VT16
CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được: 28 hợp chất
* 12 hợp chất từ loài V. limonifolia:
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. limonifolia
3 hợp chất mới gồm: vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 9 hợp chất đã biết gồm: flavonoid, 5,4′- dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), vitecetin (VL5), 5,4′-dihydroxy-
7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxyurs-12-
8
en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-
18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maslinic acid
(VL11), maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12), trong đó, các hợp chất
VL4, VL6, VL7, VL10 và VL12 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex.
* 16 hợp chất từ loài V. trifolia:
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. trifolia
9
2 hợp chất mới gồm: 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid
(VT1), matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); 14 hợp chất đã
biết gồm: ecdysone (VT3), 20- hydroxyecdysone (VT4), 20-
hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5), turkesterone (VT6),
polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'-
dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin (VT11), orientin
(VT13), 2-O-rhamnosylvitexin
(VT12), homoorientin (VT14), euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16). Trong đó, hợp chất VT5 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex, các hợp chất VT3, VT4, VT6 lần
đầu tiên phân lập từ loài V. trifolia.
3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V.
limonifolia
Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 12 hợp
chất được phân lập từ loài V. limonifolia.
3.1.1.1. Hợp chất VL1: Vitexlimolide A (hợp chất mới)
Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo
Hợp chất VL1 phân lập được dưới dạng chất bột vô định hình, màu
trắng. Công thức phân tử của VL1 được xác định là C20H30O4 dựa vào kết
quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion tại m/z 369,1830 [M+Cl]‒ (tính toán lý thuyết cho công thức [C20H30O4Cl]‒,
369,1838).
10
Hình 3.4. Các tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất VL1
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL1 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu của ba nhóm methyl liên kết trực tiếp với carbon bậc bốn tại δH
0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s) và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại
δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz), ba proton olefin tại δH 4,65 (s), 5,13 (s) và 6,01 (d, J = 2,0 Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VL1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong đó có ba
carbon methyl tại δC 14,3, 22,0 và 33,8, bảy methylene tại δC 20,4, 32,0,
32,5, 39,8, 43,3, 67,2 và 110,0, năm methine tại δC 47,6, 48,8, 67,2, 74,7
và 114,4, bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5,
150,6 và 177,5 và một carbon carbonyl tại δC 176,5. Tất cả các dữ liệu
phổ trên gợi ý cấu trúc của VL1 là một diterpene khung labdane [42].
Thêm vào đó, số liệu phổ NMR của VL1 tương tự với hợp chất
vitexolide E (VL1a), được phân lập từ V. vestita [42], ngoại trừ việc xuất
hiện thêm nhóm hydroxy tại C-7. Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên
kết đôi tại C-8/C-17 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-
17 (δH 4,65 và 5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC 150,6)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC 48,8)/C-6 (δC 32,5)/C9 (δC 47,6). Trên phổ 1H- NMR của VL1, hằng số tương tác của H-6 và H-7 nhỏ, J = 3,0 Hz [H-7:
δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz)], gợi ý cấu hình của nhóm hydroxy tại C-7 là axial
(α). Điều này được khẳng định thêm dựa trên sự so sánh với hằng số
tương tác của H-6 và H-7 của hợp chất có nhóm 7β-hydroxy, J = 11,5 Hz
11
[7β-hydroxyisocupressic acid: δH 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 11,5 Hz), H-7, đo
trong CD3OD)] [120] và hợp chất có nhóm 7α-hydroxy, J 0 Hz [7α-
hydroxylabd-8(17)-en-15,18-dioic acid-15-methyl ester: δH 4,38 (br s),
H-7, đo trong CDCl3] [121]. Các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 6,01)
và C-12 (δC 67,2)/C-13 (δC 177,5)/C-15 (δC 176,5)/C-16 (δC 73,0); giữa
H-16 (δH 5,01) và C-14 (δC 114,4)/C-15 (δC 176,5); giữa H-12 (δH 4,58)
và C-9 (δC 47,6)/C-11 (δC 32,0)/C-13 (δC 177,5)/C-14 (δC 114,4)/C-16 (δC
73,0) khẳng định sự có mặt của vòng γ-lactone chưa bão hòa tại carbon β
(C-13) và vị trí nhóm hydroxy tại C-12. Bằng so sánh độ bội của H-12
(δH 4,58, dd, J = 4,0, 8,0 Hz) của VL1 với các hợp chất có nhóm 12α-
hydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz, H-12), đo trong
acetone-d6] [42] và hợp chất có nhóm 12β-hydroxy [12-epivitexolide A:
δH (4,61 br s, H-12), đo trong acetone-d6] [42], đã gợi ý nhóm hydroxy tại
C-12 có cấu hình α.
Hình 3.5. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất VL1 và tính toán CD theo lý thuyết của hai epimer 1a và 1b.
Để xác định chính xác cấu hình tuyệt đối của C-12, hợp chất VL1
được tiến hành đo phổ CD. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất này được
so sánh với các tính toán theo lí thuyết (phương pháp TDDFT) [122] của
hai epimer 1a (7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide) và 1b
(7α,12β-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide)-cấu trúc chỉ khác
nhau ở cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12. Kết quả cho thấy, phổ CD
12
của VL1 có hiệu ứng Cotton dương tại max = 218 nm khi đo ở bước sóng 200-244 nm (nồng độ 10-4 M), và hiệu ứng Cotton âm tại max = 251 nm khi đo ở bước sóng 245-280 nm (nồng độ 10-2 M). So sánh với phổ CD của hợp chất 1a (có hiệu ứng Cotton dương tại max = 221 nm và hiệu
ứng Cotton âm tại max = 249 nm) và hợp chất 1b (có hiệu ứng Cotton âm
tại max = 221 nm). Như vậy, phổ CD của hợp chất VL1 có giống với của
1a, do đó có cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12 được chứng minh là α
(tức cấu hình R). Từ những phân tích trên, cấu trúc của hợp chất VL1
được xác định là 7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide. Đây
là một hợp chất mới và được đặt tên là vitexlimolide A.
Bảng 3.1. Số liệu NMR của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo a,c (J = Hz)
a,b DEPT δH
δC 39,8 CH2 20,4 CH2 43,3 CH2 34,1 C 48,8 CH 32,5 CH2 74,7 CH
47,6 CH 40,5 C 32,0 CH2 67,2 CH
#C của vitexolide E (VL1a, đo trong acetone-d6) [41], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.
1,19 (ddd, 3,0, 12,5, 13,0, α)/1,74 (m, β) 1,54 (m, α)/1,64 (m, β) 1,30 (m, α)/1,45 (brd, 13,0, β) - 1,75 (m) 1,60 (m, α)/1,91 (ddd, 2,5, 3,0, 14,0, β) 4,38 (t, 3,0) - 2,60 (dd, 4,0, 9,0) - 1,76 (m) 4,58 (dd, 4,0, 8,0) - 6,01 (d, 2,0) - 5,01 (m) 4,65 (s)/5,13 (s) 0,92 (s) 0,86 (s) 0,74 (s) C δC 39,7 1 20,1 2 43,0 3 34,3 4 56,4 5 25,3 6 39,0 7 149,5 150,6 C 8 9 52,8 10 40,1 11 32,1 12 67,3 13 176,3 177,5 C 14 114,2 114,4 CH 15 174,1 176,5 C 16 71,8 73,0 CH2 17 107,1 110,0 CH2 33,8 CH3 18 22,1 22,0 CH3 19 34,0 14,3 CH3 20 15,2
13
3.1.1.2. Hợp chất VL2: Vitexlimolide B (hợp chất mới)
Hình 3.14. Cấu trúc hóa học VL2 và hợp chất tham khảo (VL1)
Hợp chất VL2 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng.
Công thức phân tử của VL2 được xác định là C20H30O5 dựa vào kết quả
phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 385,1772 [M+Cl] ̶ (tính toán lý thuyết cho công thức [C20H30O5Cl] ̶ : 385,1787).
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL2 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu proton của ba nhóm methyl liên kết với carbon bậc bốn tại δH
0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s) và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại
δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (br s), ba proton olefin tại δH 4,78 (s), 5,13 (s) và 6,04 (s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VL2 xuất hiện tín hiệu
của 20 nguyên tử carbon, trong đó có ba carbon methyl tại δC 14,2, 22,0
và 33,8, sáu methylene tại δC 20,3, 31,2, 32,4, 39,8, 43,3 và 110,5, sáu
methine tại δC 66,9, 47,6, 49,0, 74,7, 100,2 và 117,1, bốn carbon không
liên kết trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5, 150,0 và 173,1 và một
carbon carbonyl tại δC 173,1. Số liệu phổ NMR của VL2 khá giống với
hợp chất VL1 gợi ý đây cũng là một hợp chất khung labdane. Tuy nhiên,
so sánh số liệu phổ NMR của hai hợp chất trên có điểm khác biệt lớn, đó
là tín hiệu của nhóm oxymethylene (δH 5,01 và δC 73,0) ở hợp chất VL1
14
được thay thế bằng nhóm hemiacetal (δH 6,23 và δC 100,2) trong hợp chất
VL2. Tín hiệu cộng hưởng của các proton trong vòng γ-hydroxy-γ- lactone trên phổ 1H-NMR của VL2 rộng và thấp, cũng như tín hiệu cộng hưởng của C-14 (δC 117,1) và C-16 (δC 100,2) rất khó quan sát trên phổ 13C-NMR gợi ý tồn tại một cân bằng giữa hai đồng phân epimer tại C-16.
Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL2
Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên kết đôi tại C-8/C-17 được
xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,78 và 5,13) đến C-7
(δC 74,7)/C-8 (δC 150,0)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC
49,0)/C-6 (δC 32,4)/C-9 (δC 47,6). Vị trí của nhóm hydroxy tại C-12 được
xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-11 (δH 1,65 và 1,73)/H-14
(δH 6,04) đến C-12 (δC 66,9) và tương tác COSY giữa H-9 (δH 2,62)/H-11
(δH 1,65 và 1,73)/H-12 (δH 4,58). Cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12
được xác định là β dựa trên sự so sánh độ bội của H-12 (δH 4,58, br s) của
VL2 với các hợp chất có nhóm 12α-hydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d,
J = 10,6 Hz), H-12, đo trong acetone-d6] [42] và hợp chất có nhóm 12β-
hydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s), H-12, đo trong acetone-d6]
[42]. Từ những phân tích trên, cấu trúc của hợp chất VL2 được xác định
là 7α,12β,16-trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide. Đây là hợp chất
mới và được đặt tên là vitexlimolide B.
15
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL2 và hợp chất tham khảo
a,c (J = Hz)
a,b DEPT δH
δC 39,8 CH2 20,3 CH2 43,3 CH2 34,1 C 49,0 CH 32,4 CH2 74,7 CH 150,0 C
47,6 CH 40,5 C 31,2 CH2 66,9 CH
#C của vitexlimolide A (VL1, đo trong CD3OD), ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 δC 39,8 20,4 43,3 34,1 48,8 32,5 74,7 150,6 47,6 40,5 32,0 67,2 177,5 114,4 176,5 73,0 110,0 33,8 22,0 14,3 1,19 (ddd, 3,0, 13,0, 13,0)/1,71 (m) 1,53 (m)/1,63 (m) 1,26 (m)/1,45 (brd, 13,0) - 1,75 (m) 1,61 (dd, 3,0, 13,0)/1,90 (m) 4,38 (t, 3,0) - 2,62 (br d, 12,0) - 1,65 (m)/ 1,73 (m) 4,58 (br s) - 6,04 (s) - 6,23 (s) 4,78 (s)/5,13 (s) 0,92 (s) 0,86 (s) 0,74 (s) 173,1 C 117,1 CH 173,1 C 100,2 CH 110,5 CH2 33,8 CH3 22,0 CH3 14,2 CH3
3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia
Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 16 hợp
chất được phân lập từ loài V. trifolia.
3.1.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4’-O-β-D-glucopyranoside (hợp
chất mới)
Hợp chất VT2 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng.
VT2 có công thức phân tử là C26H32O11 dựa vào phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại tại m/z 521,2009 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H33O11]+, 521,2017).
16
Hình 3.51. Cấu trúc hóa học của VT2 và hợp chất tham khảo
Trên phổ 1H-NMR của VT2 xuất hiện tín hiệu của các proton thuộc 2 vòng thơm hệ ABX tại δH 6,49 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,55 (d, J = 1,6
Hz), và 6,66 (d, J = 8,0 Hz); 6,64 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,73 (d, J = 1,6
Hz), và 7,04 (d, J = 8,0 Hz), hai nhóm methoxy tại δH 3,75 (s) và 3,79 (s), một proton anome tại δH 4,84 (d, J = 8,0 Hz). Phổ 13C-NMR của VT2 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử carbon, trong đó 18 carbon thuộc
khung lignan, hai methoxy và sáu carbon thuộc một đơn vị đường. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của VT2 tương tự với số liệu đã công bố của hợp chất VT2a (matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside) [134], ngoại trừ
sự thay đổi vị trí của đơn vị đường glucopyranosyl với khung lignan từ vị
trí C-4 chuyển sang vị trí C-4′.
Hình 3.52. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của VT2
17
Các tương tác HMBC giữa H-9 (δH 3,91 và 4,16) và C-9′ (δC 181,5);
tương tác COSY giữa H-8′ (δH 2,66)/H-8 (δH 2,47)/H-9 (δH 3,91 và 4,16)
VT2. Các tương tác HMBC giữa H-7 (δH
proton nhóm methoxy (δH 3,75) và C-3 (δC 149,0); giữa H-7′ (δH
đã gợi ý sự có mặt của vòng butanolide trong cấu trúc phân tử hợp chất 2,52) và C-1 (δC 131,3)/C-2 (δC 113,3)/C-6 (δC 122,2)/C-8 (δC 42,6)/C-9 (δC 72,9)/C-8′ (δC 47,6); giữa 2,85) và C-1′ (δC 134,2)/C-2′ (δC 114,8)/C-6′ (δC 123,0)/C-8′ (δC 47,6)/C-9′ (δC
181,5)/C-8 (δC 42,6); giữa proton nhóm methoxy (δH 3,79) và C-3′ (δC
150,6) đã khẳng định vị trí của hai nhóm 3-methoxy-4-hydroxyphenyl tại vị trí C-7 và C-7′. Hằng số tương tác proton giữa H-1 và H-2 của hợp phần đường, JH-1″/H-2″ = 8,0 Hz và độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của các nguyên tử carbon trong phân tử đường: C-1′′ (δC 102,9), C-2′′ (δC
74,9), C-3′′ (δC 77,8), C-4′′ (δC 71,3), C-5′′ (δC 78,1) và C-6′′ (δC 62,5) đã
gợi ý sự có mặt của phân tử đường β-D-glucopyranosyl. Thêm vào đó,
các tương tác HMBC giữa glc H-1″ (δH 4,84) và C-4′ (δC 146,8) xác định
vị trí của đường tại C-4′.
Cấu hình tuyệt đối của aglycone được xác định nhờ phổ NOESY và
phổ CD. Các tương tác NOE giữa H-8′ (δH 2,66) và Hα-9 (δH 3,91); giữa
H-8 (δH 2,48) và Hβ-9 (δH 4,16)/H-7 (δH 2,52); giữa H-7 (δH 2,52) và Hα-9
(δH 3,91), gợi ý cấu hình của H-8 và H-8′ là cấu hình trans. Trên phổ CD,
VT2 cho hiệu ứng Cotton âm tại bước sóng 226 và 275 nm xác định cấu
hình (8R,8′R) trong hợp phần matairesinol [134]. Từ những phân tích
trên, cấu trúc của VT2 được xác định là matairesinol 4′-O-β-D-
glucopyranoside. Tra cứu cấu trúc của VT2 trên Scifinder cho thấy chưa
có công bố/công trình nào liên quan đến hợp chất này, chứng tỏ đây là
hợp chất mới.
18
Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT2 và hợp chất tham khảo
a,c (J = Hz)
a,b δH -
- -
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9
δC 132,6 112,9 148,8 145,1 115,3 120,5 36,9 40,8 70,8
δC 131,3 113,3 6,55 (d, 1,6) 149,0 146,2 116,2 6,66 (d, 8,0) 122,2 6,49 (dd, 1,6, 8,0) 38,9 2,52 (m) 42,6 2,47 (m) 72,9 3,91 (dd, 8,0, 8,8, α) 4,16 (dd, 7,2, 8,8, β)
- -
56,4 3,75 (s) - 134,2 114,8 6,73 (d, 1,6) 150,6 146,8 117,8 7,04 (d, 8,0) 123,0 6,64 (dd, 1,6, 8,0) 35,3 2,85 (dd, 6,8, 12,8) 47,6 2,66 (m) - 181,5 56,7 3,79 (s)
102,9 4,84 (d, 8,0) 74,9 3,46 (dd, 8,0, 9,2) 77,8 3,45 (m) 71,3 3,38 (m) 78,1 3,38 (m) 62,5 3,67 (dd, 4,0, 10,8)
55,6 129,0 113,5 147,5 145,1 115,4 121,6 33,8 45,7 178,6 55,6 100,2 73,3 77,1 69,7 76,9 60,7
3-OMe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3-OMe 4-O-glc 1 2 3 4 5 6
3,85 (br d, 10,8)
#C của matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside (đo trong DMSO-d6) [134], ađo trong
CD3OD, b100MHz, c400MHz.
19
3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
3.2.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập từ loài V.
limonifolia
Đầu tiên 12 hợp chất (VL1-VL12) từ loài V. limonifolia được đánh
giá độ độc trên dòng tế bào BV2 ở nồng độ 20 M. Kết quả sàng lọc cho
thấy hợp chất VL11 có độc tính mạnh (tỉ lệ sống sót 59,04% < 80%),
không được lựa chọn đánh giá hoạt tính kháng viêm. Các hợp chất còn lại
không gây độc dòng tế bào BV2 (tỉ lệ sống sót > 80%).
Tiếp đó, các hợp chất VL1-VL10, VL12 được đánh giá sàng lọc ức
chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở 50 µM.
Kết quả sàng lọc cho thấy tất cả các hợp chất được đánh giá đều thể hiện
tác dụng ức chế sự sản sinh NO mạnh (% ức chế > 50%) vì thế được
đánh giá ở các nồng độ nhỏ hơn: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị
IC50. Các hợp chất VL2 và VL3 gây ức chế mạnh sự sản sinh NO mạnh
nhất với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34 và 7,130,87 M. Các hợp chất
VL6 và VL10 thể hiện khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2
với giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17 M, mạnh hơn chất
đối chứng dương L-NMMA (IC50 22,101,20 M). Bốn hợp chất VL4,
VL5, VL7 và VL9 cũng gây ức chế đáng kể sự sản sinh NO với các giá
trị IC50 nằm trong khoảng 24,70 đến 45,31 M (Thấp hơn chất đối chứng
dương, L-NMMA).
Các kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trên tế bào
BV2 của các hợp chất từ loài V. limonifolia đã gợi ý một số nhận định
ban đầu về mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng viêm của
các hợp chất này như sau:
- Trong số các hợp chất labdane phân lập được (VL1-VL3), hợp chất
VL2, VL3 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự sản sinh NO trên tế bào
20
BV2 (giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34, 7,130,87 M) trong cấu trúc
phân tử có nhóm hydroxy tại C-16, trong khi hợp chất VL1 (hoạt tính
yếu) không có nhóm hydroxy ở vị trí trên; đặc biệt hợp chất VL2 có thêm
nhóm hydroxy tại C-12 so với hợp chất VL3 thì thể hiện hoạt tính ức chế
NO mạnh hơn.
- Các hợp chất flavonoid phân lập được (VL4, VL5 và VL6) thể hiện
hoạt tính ức sự sản sinh NO ở mức độ trung bình (giá trị IC50 từ 19,16
đến 39,67 M).
3.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất
3.2.2.1. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V.
limonifolia
Các hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ loài V. limonifolia được
tiến hành đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3
(CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71). Kết
quả cho thấy, hai hợp chất flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng
virus mạnh đối với tế bào nhiễm virus CVB3 với các giá trị IC50 lần lượt là
0,21 ± 0,06, 1,86 ± 0,18 μM và đều có giá trị CC50 >50 µM (chất đối chứng
dương rupintrivir có IC50 là 0,12 ± 0,06 μM). Đồng thời, hợp chất VL4 còn
thể hiện tác dụng ức chế virus HVR1B (với giá trị IC50 là 0,61±0,21 μM và
CC50 >50 µM) mạnh hơn so với chất đối chứng dương ribavirin (IC50 là
48,07±1,46 μM). Hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính kháng virus EV71 ở
mức độ trung bình (với giá trị IC50 là 32,05±0,94 μM). Kết quả này cho
thấy phạm vi kháng virus của hợp chất VL4 đối với các chủng entrovirus
khá rộng
Các kết quả về hoạt tính kháng virus enterovirus của các hợp chất từ
loài V. limonifolia cho thấy 2 hợp chất khung flavonoid (VL4 và VL6) thể
hiện hoạt tính kháng virus mạnh. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố
21
cũng cho thấy khả năng kháng một số chủng enterovirus của các hợp chất
flavonoid. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng virus in vitro từ các hợp
chất phân lập từ loài V. limonifolia đã góp phần gợi mở mối liên hệ về khả
năng kháng các chủng enterovirus của hợp chất flavonoid.
3.2.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. trifolia
Các hợp chất VT1-VT16 đã được phân lập từ loài V. trifolia đã được
đánh giá khả năng ức chế đối với ba chủng entrovirus là CVB3, HRV1B,
và EV71 ở nồng độ 10 M.
Qua đánh giá sơ bộ về hoạt tính kháng một số chủng entrovirus, hợp
chất VT9 cho thấy hiệu quả tác dụng chống lại các chủng virus CVB3/
HRV1B/ EV71 ở nồng độ 10 M với giá trị tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót
lần lượt là 77,14%, 80,20%, 43,35%. Các hợp chất còn lại không thể hiện
hoạt tính kháng các chủng virus thử nghiệm.
KẾT LUẬN
Từ lá của 2 loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia, chúng tôi đã phân
lập và xác định cấu trúc 28 hợp chất và nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính
sinh học của các hợp chất này.
1. Từ loài Vitex limonifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp
chất. Trong đó, có 3 hợp chất mới là vitexlimolide A (VL1),
vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 5 hợp chất lần đầu
tiên phân lập được từ chi Vitex là 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone
(VL4), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7),
2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid
(VL10) và maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12); và 4 hợp chất đã biết
khác là vitecetin (VL5), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8),
euscaphic acid (VL9) và maslinic acid (VL11).
22
2. Từ loài Vitex trifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 16 hợp
chất. Trong đó, có 2 hợp chất mới là 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-
oic acid (VT1) và matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); 1 hợp
chất lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex là 20-hydroxyecdysone 2,3-
monoacetonide (VT5); 3 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài V.
trifolia là ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) và turkesterone
(VT6); và 10 hợp chất đã biết là polypodine B (VT7), rubrosterone
(VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10),
vitexin (VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O-
rhamnosylvitexin (VT14), euscaphic acid (VT15) và tormentic acid
(VT16).
3. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế sự
sản sinh NO trên tế bào BV2 của 12 hợp chất (VL1 - VL12) phân lập
được từ loài Vitex limonifolia. Kết quả cho thấy, các hợp chất VL2, VL3
thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34,
7,130,87 M; hợp chất VL6, VL10 thể hiện hoạt tính kháng viêm với
giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17M, giá trị này nhỏ hơn so
với chất đối chứng dương được sử dụng là L-NMMA (IC50 là 22,101,20
M). Các hợp chất VL4, VL5, VL7 và VL9 thể hiện hoạt tính kháng
viêm trung bình với các giá trị IC50 từ 15,88 đến 72,50 M.
4. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng virus in vitro đối với ba chủng
virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71 của 12
hợp chất (VL1-VL12) phân lập từ loài Vitex limonifolia và 16 hợp chất
(VT1-VT16) phân lập được từ loài Vitex trifolia. Kết quả cho thấy, hợp
chất VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh đối với tế bào
nhiễm virus coxsackievirus B3 với các giá trị IC50 lần lượt là 0,21 ± 0,06
và 1,86 ± 0,18 μM. Hợp chất VL4 còn thể hiện hoạt tính kháng virus
trong thử nghiệm kháng virus human rhinovirus 1B (với giá trị IC50 là
23
0,61±0,21 μM) và kháng virus enterovirus 71 (với giá trị IC50 là
32,05±0,94 μM). Các hợp chất VT1-VT16 trong sàng lọc về hoạt tính
kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và
enterovirus 71, chỉ có hợp chất VT9 cho kết quả khả quan, ở nồng độ 10
μM, với giá trị tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót lần lượt là 77,14%,
80,20%, 43,35%.
KIẾN NGHỊ
Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
hai loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia đã bổ sung thêm những hợp chất
mới vào thành phần hóa học của 2 loài này. Đặc biệt thử nghiệm hoạt tính
sinh học của hợp chất labdane VL2 và VL3 thể hiện hoạt tính ức chế NO trên
tế bào BV2, kích thích bởi LPS rất mạnh. Vì thế, có thể tiến hành các thử
nghiệm hoạt tính kháng viêm in vivo, từ đó định hướng về khả năng ứng dụng
của các hợp chất VL2, VL3.
Hợp chất VL4 và VT9 thể hiện phạm vi hoạt tính kháng virus đối với
các chủng entrovirus trong phạm vi khá rộng (bao gồm các chủng CVB3,
HRV1B và EV71). Vì thế cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn nữa hoạt tính
của hơp chất VL4 và VT9.
24 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đã phân lập và xác định cấu trúc 28 hợp chất từ các loài V. limonifolia
và V. trifolia. Trong đó:
- 5 hợp chất mới từ tự nhiên, trong đó có 3 hợp chất từ loài V.
limonifolia là vitexlimolide A-C (VL1-VL3); 2 hợp chất từ loài V. trifolia
là 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (VT1) và matairesinol 4′-O-
β-D-glucopyranoside (VT2).
- 6 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex là : 5,4′-dihydroxy-
3,7-dimethoxyflavone (VL4), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone
(VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-
11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maltol O-β-D-glucopyranoside
(VL12) và 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5).
- 3 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài V. trifolia là
ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) và turkesterone (VT6).
2. Lần đầu tiên 12 hợp chất từ loài V. limonifolia ở Việt Nam được đánh
giá hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sự sản sinh NO trong tế bào
BV2 được kích thích bởi LPS. Kết quả cho thấy các hợp chất
vitexlimolide B-C (VL2-VL3), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone
(VL6), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic
acid (VL10) thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 từ 2,50
µM đến 19,16 µM.
3. Lần đầu tiên 28 hợp chất từ loài V. limonifolia và V. trifolia ở Việt
Nam được thử hoạt tính kháng virus in vitro đối với chủng virus
coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và
enterovirus 71 (EV71). Kết quả cho thấy, hợp chất 5,4′-dihydroxy-3,7-
dimethoxyflavone (VL4) thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh đối với
virus CVB3/HRV1B/EV71 với giá trị IC50 lần lượt là 0,21, 0,61, 32,05
μM. Hợp chất 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6) thể hiện hoạt
tính kháng chủng virus CVB3 với giá trị IC50 là 1,86 μM.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Ninh Khac Ban, Nguyen Thi Kim Thoa, Tran My Linh, Do Thi Trang,
Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Jae-
Hyoung Song, Hyun-Jeong Ko, Seung Hyun Kim. Labdane-type
diterpenoids from Vitex limonifolia and their antivirus activities. Journal
Natural Medicine, 2018, 72, 290-297.
2. Ninh Khac Ban, Nguyen Thi Kim Thoa, Tran My Linh, Vu Huong
Giang, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Tran Hong
Quang, Pham Hai Yen, Chau Van Minh, Phan Van Kiem. Chemical
constituents of Vitex trifolia leaves. Natural Product Communications.
2018, 13 (2), 129-130.
3. Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh,
Vu Huong Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem. Triterpenes from
Vitex limonifolia. Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55(6), 715 -719.
4. Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh,
Vu Huong Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem. Flavonoid and
other compounds from Vitex limonifolia. Vietnam Journal of Chemistry,
2018, 56(6),679-683.
5. Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh,
Vu Huong Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem. Ecdysteroids from
leaves of Vitex trifolia. Vietnam Journal of Chemistry, 2018, 56(2), 127-261.
6. Nguyễn Thị Kim Thoa, Vũ Kim Thư, Ninh Khắc Bản, Đỗ Thị Trang,
Phan Văn Kiệm. Các hợp chất triterpenoid và ecdysteroid từ lá loài mạn
kinh. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học và công nghệ quân sự, 2018, Số đặc san
CBES2, 83-87.
7. Nguyễn Thị Kim Thoa, Nguyễn Thị Thu Hiền, Ninh Khắc Bản, Nguyễn
Xuân Nhiệm, Đỗ Thị Trang. Các hợp chất triterpene và lignan phân lập từ lá
loài Vitex limonifolia. Kỷ yếu Hội nghị Gắn kết khoa học cơ bản với khoa
học trái đất lần thứ hai (CBES2), 2018, 17-22.
