123
Virus giải trình tự gen
I. NGUYÊN LÝ
Định danh virus bằng kỹ thuật xác định trình tự nucleotide c a gen đ c trưng.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c
chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh ho c chuyên ngành tương đương (và/ho c
sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học
ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
2. Phươngtiện, hóachất
2.3 Trangthiếtbị
- T an toàn sinh học cấp 2
- T thao tác PCR (PCR Workstation)
- Máy PCR
- Hệ thống điện di
- Máy giải trình tự gen
- Máy ly tâm 25000 x g
- Máy nhiệt
- Máy vortex
- Pipette
- T đông sâu (-20oCvà -70oC)
- Máy vi tính và phần m m phân tích trình tự
2.4 Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơnvị
1
Bông
kg
2
Cồn
ml
3
Bơm kim tiêm
Cái
4
Panh
Cái
5
Khay đựng bệnh phẩm
Cái
6
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Test
7
Tube đựng bệnh phẩm
Cái
8
Găng không có bột (DNase-RNase free)
Cái
9
PCR master mix
Test
10
Men Polymerase ho cTaq Polymerase
ml
124
11
Khấu hao sinh phẩm cho chẩn đoán và kiểm tra chất
lượng
Test
12
Kit táchchiết ADN/ARN
Test
13
Kit tinh sạch DNA sau PCR
Test
14
Kit tinh sach sản phẩm sau nhuộm màu (sau PCR
sequencing)
Test
15
DNA marker
Bộ
16
Primer 1 (primer đ chiệu)
ml
17
Primer 2 (primer đ chiệu)
ml
18
Primer 3 (primer đ chiệu)
ml
19
Primer 4 (primer đ chiệu)
ml
20
Kit nhuộm màu trình tự (Big dye) – PCR sequencing
Test
21
Plate/tube cho máy đọc trình tự
Cái
22
Gel điện di cho máy đọc trình tự
Gram
23
Cartrigde cho máy đọc trình tự
Test
24
Ống Eppendorf 1,5 ml
Tube
25
Ống Eppendorf 0,2 ml
Tube
26
Đầu côn 10 ul có lọc
Cái
27
Đầu côn 30 ul có lọc
Cái
28
Đầu côn 200 ul có lọc
Cái
29
Đầu côn 1 ml có lọc
Cái
30
Ethanol BDH
ml
31
Water-DEPC Treated
ml
32
Giấy thấm
Cuộn
33
Giấy xét nghiệm
Tờ
34
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Tờ
35
Bút viết kính
Cái
36
Bút bi
Cái
37
Mũ
Cái
38
Khẩu trang
Cái
39
Găng tay
Đôi
40
Găng tay xử lý dụng cụ
Đôi
125
41
Quần áo
Bộ
42
Dung dịch nước rửa tay
ml
43
Cồn sát trùng tay nhanh
ml
44
Dung dịch khử trùng
ml
45
Khăn lau tay
cái
3. Bệnhphẩm
Bệnh phẩm cơ thể có chứa căn nguyên virus nghi ngờ
4. Phiếuxétnghiệm
Đi n đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấybệnhphẩm
Theo đúng quy địnhc a chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục).
2. Tiếnhànhkỹthuật
2.1 Tách chiết DNA/RNA tổng số
2.2 Thực hiện PCR
2.3 Điện di kiểm tra sản phẩm
2.4Giải trình tự gen
2.5 Kiểm tra và so sánh trình tự gen trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế
3. Thời gian thực hiện: 2 - 5 ngày
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có một băng đ c hiệu duy nhất, rõ nét và không bị
đứt gẫy. Trình tự ADN c a gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥
90 % mới có thể kết luận được.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Trong trường hợp không cósản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá
trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng c a primers và master mix, và thực
hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
- Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đ c hiệu c a sản
phẩm PCR ho c quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.