Polymerase Chain Reaction

Tp. Hồ Chí Minh 24-9-2014

Taq polymerase

nhiệt

• DNA polymerase chịu nhiệt, dễ tinh sạch bằng

• Tổng hợp DNA theo chiều 5’  3’ • Exonuclease 5’  3’ • Tổng hợp 50 – 60 nu/s

Taq polymerase

– Tổng hợp sai 1/10.000 nu – Tạo sản phẩm PCR sai trình tự

• Không có hoạt tính sửa sai (proof-reading)

– Có ích khi tạo dòng bằng TA kit

• Sản phẩm dài 2 – 4 kb • Bền nhiệt: 40 phút/95 oC, • Gắn thêm adenine (A) ở đầu 3’ của sản phẩm

Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai

– Bền ở 95 oC. Giữ hoạt tính sau 1h ở 95 oC

• Tli : Thermococcus litoralis

• Pfu: Pyrococcus furiosus

Thiết kế primer

– Ngắn: dễ bắt cặp  không chuyên biệt – Dài : Khó bắt cặp  chuyên biệt – 20 – 30 nu

• Bắt cặp sai (mismatches)

– Đầu 3’ của primer phải bắt cặp hoàn toàn với nu trên khuôn mẫu, thường sử dụng C/G (why ?) – Đầu 5’ của primer không cần bắt cặp hoàn toàn

với khuôn mẫu  chèn trình tự nhận biết của RE

• Chiều dài

Thiết kế primer

– 2 mồi có nhiệt độ nóng chảy tương tự nhau 

thành phần ATGC tương đương nhau

• Nhiệt độ nóng chảy (Tm)

– Tránh tự bắt cặp

• Cấu trúc thứ cấp nội tại

• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau

Thiết kế primer

• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau

Thiết kế primer

hoặc amino acid liên quan – Tránh tự bắt cặp ( sử dụng trong cloning gene tương đồng) • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau

• Tránh thiết kế primer từ trình tự amino acid  why? • Tránh thiết kế primer từ các trình tự nucleotid

Ứng dụng

- Xác định tính trạng di truyền - Phát hiện sinh vật gây bệnh - Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm

1. Giải trình tự DNA 2. Chẩn đoán 3. Pháp y 4. Đa dạng di truyền quần thể 5. Khảo cổ học và tiến hóa

Cần quan tâm

• Kích thước sản phẩm

– Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước

sản phẩm khoảng 10 kb. (Long-rang PCR) – Cần kéo dài thời gian cho long-rang PCR – Tuổi mẫu (chất lượng mẫu) tỉ lệ nghịch với kích thước

khuếch đại của sản phẩm.

• Khuếch đại sản phẩm sai trình tự

– Primer bắt cặp khuếch đại đoạn không mong muốn (không

đặc hiệu, nồng độ muối, nhiệt độ,…)

– Sử dụng primer đặc hiệu, tăng nhiệt độ bắt cặp, tăng Mg

ion

Cần quan tâm

– Vật dụng, thao tác, tác nhân sinh học trong phòng

thí nghiệm

– Thao tác cẩn thận, giữ sạch nơi thí nghiệm

• Nhiễm lẫn

– Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác

nhau hoặc bị suy thoái (degradation)

– Hiệu quả của enzyme polymerase

• Sản phẩm không đồng nhất

Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy

– Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt

nhiệt độ bắt cặp tối thích.

– Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp – Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu.

• Hot-start PCR

Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy

– Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không đặc hiệu xảy ra, sau đó sẽ giảm đến nhiệt độ bắt cặp tối thích

• Touch-down PCR

Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy

• Nested-PCR Tăng độ chuyên

biệt.

Hard- copies

Hard-copies

Hard- copies

Inverse PCR

Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)

RT-PCR

Quantitative PCR (qPCR)

– Kết quả khuếch đại DNA thể hiện qua từng chu kỳ

nhiệt

– Sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang khi chèn

vào trong sợi đôi DNA (ex: SYBER Green)

– Hoặc sử dụng các đoạn đầu dò đặc hiệu mang chất phát huỳnh quang (ex: Taq man probe)

Quantitative PCR (qPCR)

Hệ thống SYBER Green

Quantitative PCR (qPCR)

Hệ thống Taqman probe

PCR mỏ neo (anchored PCR)

Các loại PCR khác

• Multiplex – PCR • Mutagenesis • Asymmetric PCR • Isothermic amplification (Loop mediated

isothermal amplification)