9/18/2020

CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYME

PROTEIN-ENZYME TECHNOLOGY

• Giảng viên: TS. Nguyễn Xuân Cảnh

• Email:

nxcanh@vnua.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH

•

Hóa sinh học. Phạm Thị Chân Châu, Trần Thị Áng. Nhà xuất bản Giáo dục.

2005.

•

Hóa sinh công nghiệp. Lê Ngọc Tú. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

2004.

•

Enzyme ứng dụng. Phạm Thị Chân Châu, Phan Tuấn Nghĩa. Nhà xuất bản

Đại học Quốc gia Hà Nội. 2007.

•

Biochemistry (Fifth edition). Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert

Stryer. W. H. Freeman and Company. 2001

•

Biochemistry : The chemical reaction of living cells (Fifth edition). David

E. Metzler. ELSEVIER. 2003

•

Enzyme in Industry: Production and Applications. Wolfgang Aehle.

WILLEY-BLACKWELL. 2004.

1

9/18/2020

NỘI DUNG CHÍNH

• Protein

• Enzyme

• Các phương pháp nghiên cứu protein và enzyme

• Ứng dụng của protein và enzyme

• Công nghệ trong nghiên cứu và sản xuất protein/

enzyme

• Công nghệ AND tái tổ hợp trong sản xuất và cải

biến protein/ enzyme

• Enzyme cố định

Chương 1.Protein

1.1. Khái niệm protein 1.2. Phân loại protein 1.3. Cấu trúc phân tử protein 1.4. Các liên kết hóa học trong phân tử protein 1.5. Tính chất của protein 1.6. Phương pháp định tính và định lượng protein

2

9/18/2020

1.1. Khái niệm chung

• Protein là những đại phân tử sinh học, được tìm thấy trong tất cả

các tế bào sống

• Protein tham gia vào tất các các quá trình và chức năng sống của

cơ thể

• Protein được tạo bởi các amino acid (chuỗi polypeptide), chúng liên

kết với nhau bởi liên kết peptide –CO-NH-

• Chỉ có 20 amino acid tiêu chuẩn tồn tại trong các sinh vật sống.

• 20 amino acid  vô vàn các protein khác nhau dựa vào các tổ hợp

sắp xếp của các amino acid  số lượng vô cùng lớn các cấu trúc

khác nhau.

• Trình tự các amino acid được xác định bởi ADN

Đơn vị Dalton ?

Nhà hóa học, vật lý học, thiên văn học người Anh Tiên phong trong thuyết nguyên tử hiện đại Nghiên cứu bệnh mù màu

Da là đơn vị khối lượng được định nghĩa là 1/12 khối lượng của một nguyên tử C (ở trạng thái cơ bản).

1 Da có giá trị =1.660538782(83)×10−27 kg

1 Da xấp xỉ bằng khối lượng của 1 proton hoặc 1 neutron.

3

John Dalton (1766-1844)

9/18/2020

Thành phần cấu tạo

Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố:

C: 50-55%

H:

6,5-7,3%

O: 21-24%

N: 15-18%

S: 0-0,24% (chỉ có mặt ở một số protein)

Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất nhỏ

các nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca

Lịch sử nghiên cứu protein

• PROTEIN, tiếng Hy Lạp (prota) có nghĩa là “quan trọng trước tiên”. • Năm 1838, Jons Jakob Berzelius đã sử dụng để mô tả những phân tử hữu cơ có khối lượng phân tử lớn. Protein được sử dụng để mô tả những hợp chất hữu cơ có tầm quan trọng trong dinh dưỡng động vật

• 1926, James B. Sumner chứng minh các enzyme có thể được

phân lập và kết tinh.

• 1955, Sir Frederick Sanger xác định trình tự insulin. Đây là bằng

chứng chứng tỏ rằng các protein có cấu trúc đặc thù.

• 1958, cấu trúc 3 chiều của haemoglobin và myoglobin được làm sáng tỏ bởi Max Perutz và Sir John Cowdery Kendrew bằng phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X.

4

9/18/2020

Thành tựu nghiên cứu Protein

Đến nay hơn 10.000 cấu trúc protein đã được làm sáng tỏ ở mức

độ nguyên tử.

Hàng triệu đột biến cho phép nghiên cứu phương thức các

protein thay đổi các đặc điểm.

Mô phỏng bằng máy tính cho phép mô hình hóa các đặc điểm

của protein.

 Vấn đề tồn đọng?

Protein problems !!!

1. Protein structure or folding of protein Amino acid sequence  folding  3 D structure  Dự đoán cấu trúc dựa vào trình tự amino acid? 2. Protein evolution Bao nhiêu protein được hình thành trong suốt quá trình tiến

hóa?

3. Protein crystallisation Dự đoán cấu trúc trong các điều kiện khi mà protein được kết

tinh?

5

9/18/2020

1.2. Phân loại Protein

• Vi khuẩn E.coli nhỏ bé, mỗi tế bào cũng có khoảng 3000 protein khác

nhau.

• Cho đến nay không thể dự đoán được tổng số các protein khác nhau

có mặt trong tự nhiên

• Phân loại protein?

Phân loại protein dựa vào chức năng

• Enzymes:

•

• Hormones: insulin, lipotropin, prolactin, nọc độc rắn

Protein vận chuyển: cytochrome C, haemoglobin và myoglobin, albumin vận

chuyển axit béo trong máu, các protein đóng vai trò vận chuyển ion (bơm, kênh)

• Immunoglobulin hoặc kháng thể

• Điều hòa hoạt động gen (transcription factor)

• Protein cấu trúc: duy trì cấu trúc của các thành phần sinh học: Collagen, elastin, α-

keratin, sklerotin, fibroin, peptidoglican (vi khuẩn)

• Protein vận động: Chuyển năng lượng hóa học thành năng lượng cơ học (Actin và

•

myosin), tubulin.

Thụ thể

(receptors): Nhận tín hiệu và truyền tín hiệu

(glycoprotein,

transmembrane protein)

• Protein tín hiệu: Các protein này thay đôi cấu hình khi có mặt của các phân tử tín

hiệu (GTPases)

6

• Protein dự trữ: ovalbumin trứng, casein sữa

9/18/2020

Phân loại protein dựa vào sự cải biến sau dịch mã

• Native proteins: Không có sự thay đổi sau dịch mã

• Glico-proteins: gắn với các oligosaccharide mạch thẳng hay mạch nhánh

• Cleaved proteins: sau dịch mã sẽ bị cắt thành 2 hay nhiều mảnh

• Proteins with disulphide bonds: các cặp amino acid cysteins được nối với nhau

qua cầu S-S

• Protein complexes: tồn tại ở dạng homo hoặc hetero

• Chemically modified proteins: gốc amino acid bị cải biến hóa học (gắn cộng hóa trị

với các hợp chất hóa học)

• Prions: bị cuộn gấp nếp theo một cách khác thường hoặc thay đổi cấu hình ngay

khi được dịch mã

Phân loại protein dựa vào cấu trúc và khả năng hòa tan

Protein dạng sợi (fibrous protein) Protein hình cầu (Globular proteins)

Dựa vào hình dạng và khả năng hòa tan

Dựa vào tính phức tạp và khả năng kết hợp với các thành phần khác

7

Protein phức hợp (protein kết hợp với các thành phần khác)

9/18/2020

Protein dạng sợi và dạng cầu

Protein khung tế bào (Cytoskeletal proteins) Actin Arp2/3 (Actin related protein 2, 3) Coronin Dystrophin FtsZ % (Filamenting temperature-sensitive mutant Z) Keratin Myosin Spectrin Tau (protein) Tubulin

1.3. Cấu trúc của protein

Cấu trúc 3-D của phân tử Myoglobin

8

9/18/2020

Các bậc cấu trúc của protein

9

Bậc I Bậc II Bậc III Bậc IV

9/18/2020

Tên Acid Amin Ký hiệu Ký hiệu Tên Acid Amin Ký hiệu Ký hiệu

03 ký tự 01 ký tự 03 ký tự 01 ký tự

Alanine Ala A Leucine Leu L

Arginine Arg R Lysine Lys K

Asparagine Asn N Methionine Met M

Aspartic acid Asp D Phenylalanine Phe F

Cysteine Cys C Proline Pro P

Glutamine Gln Q Serine Ser S

Glutamic Acid Glu E Threonine Thr T

Glycine Gly G Tryptophan Trp W

Histidine His H Tyrosine Tyr Y

Isoleucine Ile I Valine Val V

Đặc điểm cấu tạo và phân loại amino acid

L-isomer là dạng axit amin phổ biến tìm thấy trong các protein

10

9/18/2020

Các amino acid dạng Nonionic và Zwitterion

Zwitterion = Lưỡng tính

Axit yếu

Base yếu

Các amino acid không phân cực (Nonpolar)/ kỵ nước (Hydrophobic)

Methionine (Met)

Phenylalanine (Phe)

Proline (Pro)

Glycine (Gly) Alanine (Ala) Valine (Val) Leucine (Leu) Isoleucine (Ile)

11

Tryptophan (Trp)

9/18/2020

Các amino acid phân cực (Polar)/ ưa nước (Hydrophilic)

Serine (Ser) Cysteine (cys)

Threonine (Thr) Asparagine (Asn)

Glutamine (Gln) Tyrosine (Tyr)

Các amino acid mang điện âm

Aspartic acid (Asp) Glutamic acid (Glu)

Các amino acid mang điện dương

His đóng vai trò quan trọng trong chức năng xúc tác của enzyme, thường thấy ở trung tâm hoạt động

12

Lysine (Lys) Arginine (Arg) Histidine (His)

9/18/2020

Các amino acid cần thiết ở người Essential Amino Acids in Humans

Trong số 20 axit amin thường gặp trong phân tử protein có một số axit

amin mà cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được mà phải

amin không thay thế.

Arginine* Histidine* Isoleucine Leucine Valine

Lysine Methionine Threonine Phenylalanine Tryptophan

* Cần thiết ở trẻ em, nhưng không cần thiết ở cơ thể trưởng thành

đưa từ ngoài vào qua thức ăn được gọi là axit amin cần thiết hoặc axit

Đồng phân của các amino acid

Tồn tại ở dạng đồng phân lập thể (dạng D hay dạng L)

L: quay trái (levorotatory); D: quay phải (dextrorotatory)

13

9/18/2020

Một số amino acid không phổ biến tìm thấy trong protein

Cấu trúc bậc I

1. Là thành phần và trình tự sắp xếp các gốc amino acid trong mạch

polypeptide. Cấu trúc này được giữ bền vững dựa vào liên kết cộng

hóa trị.

2. Liên kết peptide được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm

alpha carboxyl của một amino acid này và một nhóm alpha amine

của một amino acid khác. Phản ứng loại đi một phân tử nước.

3. Sản phẩm của phản ứng giữa 2 amino acid gọi là dipeptide...nhiều

hơn được gọi là tri-, tetra-, penta-peptide và polypeptide.

14

9/18/2020

Sự hình thành liên kết peptide

NH3

+ Ca

Ca COO-

amino acid 1

amino acid 2

Cấu trúc bậc 2

• Các cấu trúc không gian (bậc 2, 3, 4) hình thành nên các cấu trúc gọi

là motifs và domains.

• Cấu trúc bậc 2 thường xảy ra ở những vùng cục bộ, được duy trì chủ yếu nhờ các liên kết hydro giữa các nguyên tử trong mạch peptide. • Những cấu trúc gọi là: xoắn ngẫu nhiên (random coil), xoắn thòng

lọng (loop) thường không có cấu trúc bậc 2 ổn định. • Có 2 cấu trúc xoắn bậc 2 ổn định: Xoắn alpha (a-Helix) và phiến gấp

nếp beta (-sheet).

15

• Hai cấu trúc xoắn này thường thấy ở trong lõi của các protein, điều đó giải thích tại sao các xoắn lòng lọng thường nhìn thấy ở vùng bên ngoài của phân tử.

9/18/2020

Phiến gấp nếp Beta (-Sheet)

Đặc điểm phiến β

• β-sheets được hình thành bởi 2 hoặc nhiều vùng kéo dài (5  10

• Sự gấp nếp và sắp xếp 2 phía của các vùng trình tự kéo dài hình thành

amino acid)

nên phiến beta.

• Cấu trúc được giữ ổn định nhờ các liên kết H

• Các β-sheet có thể hoặc là song song hoặc đối song

• Song song: các chuỗi peptide cạnh nhau cùng sắp xếp theo 1 chiều

(cùng đầu N  C hoặc từ C  N)

16

• Đối song: Ngược lại.

9/18/2020

anti-parallel

loop or turn

N  C

N  C

C  N

parallel

C  N

N  C

crossover

N  C

N  C N  C

Ví dụ một phiến β gồm 4 sợi đối song trong cấu trúc tinh thể của enzym catalase

17

a: Nhìn mặt đứng: các liên kết hydro hình thành dạng đối song giữa các nhóm NH và CO trên các sợi kế cận nhau. Nguyên tử O (đỏ), N (xanh). b: Nhìn mặt bên: Có 2 phiến β nằm gần như chồng lên nhau. Dạng gấp nếp được quan sát rõ.

9/18/2020

Cấu trúc xoắn alpha (a-Helix)

• Một vòng xoắn gồm 3,6 gốc amino acid • Các gốc bên (R) hướng ra ngoài • Cấu trúc α-helix thường gặp ở các protein hình cầu (nhóm hòa tan). • Các liên kết hidro giữa các nhóm carboxyl của amino acid n và nhóm amin của amino acid n + 4

Các amino acid và xoắn alpha

• Không phải tất cả các amino acid có xu hướng hình thành xoắn alpha

• Các amino acid A, D, E, I, L và M có xu hướng hình thành xoắn alpha

• Các amino acid G, P có xu hướng phá vỡ xoắn alpha

• Proline hạn chế khả năng quay xung quanh trục (liên kết peptide) dẫn

• Sự phá vỡ xoắn alpha  tạo ra những kiểu gấp nếp khác góp phần

đến không thể kéo dài cấu trúc xoắn).

18

hình thành nên cấu trúc hình cầu.

9/18/2020

myoglobin

Bacteriorhodopsin

Anti-parallel -sheets of lectin

37

Parallel -sheets carbonic anhydrase

Super-Secondary Structure

• Một số protein có những kiểu sắp xếp cấu trúc bậc 2 tạo ra các vùng

domain hoặc cấu trúc motif.

• Chẳng hạn như các cấu trúc helix-turn-helix (domain) có vai trò điều

hòa phiên mã ở vi khuẩn. Cấu trúc leucine zipper, helix-loop-helix và

19

zinc finger (domain) có vai trò điều hòa phiên mã ở eukaryote

9/18/2020

Motif và domain

• Motif và domain là sự tổ hợp của các cấu trúc bậc 2.

• Motif: chỉ bao gồm một vài cấu trúc bậc 2, không nhất thiết phải

thực hiện chức năng

• Domain: gồm nhiều cấu trúc bậc 2, phức tạp hơn và thường

được định nghĩa như một đơn vị chức năng nhất định

20

• Trong một số trường hợp motif và domain có ý nghĩa như nhau

9/18/2020

Cấu trúc bậc 3

• Cấu trúc bậc 3  coi như cấu trúc 3 chiều hoàn thiện của các chuỗi

polypeptide

• Trong các cấu trúc bậc 2 của protein thường có các vùng cấu trúc

• Cấu trúc bậc 3 gồm các vùng cấu trúc bậc 2 gấp nếp tiếp theo

(domain) nhất định

• Sự tương tác của các vùng (domain) được duy trì bởi một số liên

kết và lực liên kết

• Các aminoacid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide tương tác với

nhau nhờ các liên kết như; liên kết hydro, tương tác kị nước,

tương tác tĩnh điện và các lực van der Waals

GFP (Green fluorescent protein)

21

- Aequorea victoria - Protein gồm 238 Aminoacid, 26,9kDa - 11 chuỗi Beta, 01 chuỗi anpha trong vùng chromophore, 05 chuỗi alpha ngắn (alpha helice)

9/18/2020

Năm 1996 cấu trúc kết tinh của GFP được làm sáng tỏ. Xoắn alpha (đỏ), phiến beta (xanh lá cây), các vùng nối (loops) màu xanh đậm. 11 phiến beta tạo nên một hàng rào beta 1 chuỗi xoắn alpha chạy xuyên qua trung tâm Chất phát quang (chromophore) định vị ở giữa hàng rào beta Tháng 6 năm 2003, trong ngân hàng cấu trúc protein PDB, GFP được xếp vào cấu trúc protein của tháng

Các nhóm R cấu tạo nên cấu trúc chromophore

bao gồm các amino acid từ vị trí 64 đến 170.

Trong đó Arg96 đóng vai trò quan trọng

22

9/18/2020

Cấu trúc bậc 4

• Rất nhiều protein có chứa từ 02 chuỗi polypeptide trở lên, chúng liên kết với

nhau nhờ lực hút không cộng hóa trị (non-covalent) để cho cấu trúc bậc ba trở

nên ổn định hơn.

• Các protein được tạo bởi nhiều chuỗi polypeptide đó được gọi là protein

oligomeric.

• Cấu trúc được hình thành nhờ tương tác monomer-monomer trong protein

oligomeric được xác định là cấu trúc bậc 4 của protein.

• Các protein oligomeric có thể gồm nhiều chuỗi polypeptide giống nhau

(multiple identical polypeptide chains) được gọi là homo-oligomers hoặc riêng

biệt (multiple distinct polypeptide chains) được gọi là hetero-oligomers

23

Heamoglobin là một hetero-oligomeric protein, bao gồm 02 chuỗi alpha và 02 chuỗi beta tạo ra cấu trúc bậc 4 là α2β2

9/18/2020

Các liên kết duy trì cấu trúc phân tử protein

• Liên kết cộng hoá trị chủ yếu là liên kết peptide nối các gốc axit amin tạo chuỗi

polypeptide.

• Liên kết disulfide (-S-S-) do 2 nhóm SH của gốc systein phản ứng với nhau tạo

thành góp phần đáng kể làm cuộn phân tử protein làm bền cấu trúc bậc III.

Có rất nhiều các liên kết không cộng hóa trị (non-covalent interaction), mặc dù

yếu nhưng đóng vai trò rất quan trọng trong việc ổn định cấu trúc không gian, đảm

• Tương tác ion (Ionic interactions)

bảo chức năng sinh học của các phân tử protein.

• Tương tác hấp dẫn Van der waals (Van der waals interactions)

• Liên kết Hydro (Hydrogen bonds)

• Tương tác kỵ nước (Hydrophobic interactions)

Liên kết hydro

• Liên kết Hydro là 1 liên kết rất yếu được hình thành bởi lực hút tĩnh điện giữa

Hydro (đã liên kết trong 1 phân tử) với 1 nguyên tử có độ âm điện mạnh có kích

thước bé (N,O, F...) ở 1 phân tử khác hoặc trong cùng 1 phân tử

• Liên kết Hydro được biểu diễn bằng ba chấm (...).

24

9/18/2020

25

9/18/2020

Năng lượng liên kết của một số dạng liên kết hydro

•F—H...:F (155 kJ/mol or 40 kcal/mol) •O—H...:N (29 kJ/mol or 6.9 kcal/mol) •O—H...:O (21 kJ/mol or 5.0 kcal/mol) •N—H...:N (13 kJ/mol or 3.1 kcal/mol) •N—H...:O (8 kJ/mol or 1.9 kcal/mol)

Chiều dài liên kết H

26

9/18/2020

Thế tĩnh điện (Electrostatic Potential): Chỉ thị cho độ phân cực

tiềm

• Thế tĩnh điện phân tử là năng tàng của một lượng proton ở một vị trí nhất định gần một phân tử

• Thế tích điện âm (đỏ): Hấp dẫn của proton bởi các mật độ điện tử trong phân tử

• Thế điện tích dương (xanh): Sự đẩy proton bởi các nhân nguyên tử trong vùng có mật độ điện tử thấp

Liên kết hấp dẫn (van der Waals)

Là một lực liên kết nội phân tử hoặc nội nguyên tử gây ra một lực hút

tạm thời giữa các lưỡng cực trong các phân tử không phân cực và các

nguyên tử do sự phân bố bất đối xứng các electron nhờ sự di chuyển

của chúng. van der Waals là tổng của lực hấp dẫn và lực đẩy giữa các

phân tử hoặc giữa các phần của một phân tử.

Phân loại:

1. Lực giữa 2 phân tử lưỡng cực (trạng thái lưỡng cực tồn tại lâu)

(Keesom force)

2. Lực giữa 1 phân tử lưỡng cực lâu và 1 phân tử cảm ứng (Debye

force)

3. Lực giữa 2 phân tử lưỡng cực cảm ứng tạm thời (London dispersion

force)

27

9/18/2020

Van der Waals force + lực tương tác giữa các bề mặt

28

9/18/2020

Các liên kết kị nước

• Các phân tử không phân cực (không chứa nhóm ion + liên kết phân cực) -> không hòa tan trong nước -> phân tử kỵ nước.

• Lực thúc đẩy các phân tử hay các vùng không phân cực của các phân tử liên kết với nhau gọi là liên kết kỵ nước.

• Vai trò: ổn định các Pr, phức hợp Pr với các ptử khác cũng như sự phân bố các Pr trong các màng sinh học.

Protein được cấu tạo bởi các amino acid chứa các gốc ưa nước và kị

nước

•

Khi các protein gấp nếp, các amino acid có gốc kị nước: alanine,

valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan và methionine sẽ

có xu hướng co cụm bên trong phân tử protein.

•

Cấu trúc của các protein hòa tan trong nước có một lõi kị nước ở bên

trong, lõi kị nước này chủ yếu là các gốc kị nước của các amino acid.

•

Các gốc kị nước có xu hướng giảm thiểu phạm vi tiếp xúc với nước 

tạo ra lực lôi kéo trong quá trình gấp nếp.

29

9/18/2020

Một số tính chất của protein

Dung dịch keo protein, sự kết tủa protein • Khi hòa tan, protein tạo thành dung dịch keo • Trên bề mặt protein có các nhóm phân cực, khi hòa tan, nước sẽ bao quanh tạo thành lớp vỏ hydrat

• Độ bền của dung dịch keo phụ thuộc vào nhiều yếu tố: sự tích điện của các phân tử protein, mức độ hydrat hóa, nhiệt độ…Khi thay đổi các yếu tố này protein có thể kết tụ lại với nhau, gọi là hiện tượng kết tủa protein

• Hiện tượng kết tủa có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Khả năng hấp thụ tia tử ngoại của protein • Dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở 02 vùng bước sóng • 180-220 nm: là vùng hấp thụ của các liên kết peptide, cực đại ở 190 nm. • 250-300 nm: là vùng hấp thụ của các aminoacid thơm (Phe, Tyr, Trp), cực đại ở 280 nm

Sự kết tinh của protein

• Là dạng không hòa tan của protein trong dung dịch, ở một số điều kiện nhất

định. Các phần của protein liên kết lại với nhau nhờ các liên kết không tĩnh

điện tạo thành phân tử kết tinh.

• Một số protein tinh thể có thể gặp trong tự nhiên, số khác có thể tạo thành

30

trong điều kiện thí nghiệm.

9/18/2020

Tính chất lưỡng tính của protein

• Axit amin và protein có tính chất lưỡng tính, có nghĩa là vừa có tính acid

vừa có tính base

• Khái niệm pH đẳng điện (pHi hay pI): Ở một giá trị pH, tổng điện tích (+) và

(-) của phân tử protein = 0. Phân tử protein sẽ không di chuyển trong điện

trường, giá trị pH đó được gọi là pHi

• Như vậy nếu protein có chứa nhiều Asp, Glu (axit amin axit) thì pHi sẽ nằm

trong vùng axit và ngược lại, nếu protein chứa nhiều axit amin kiềm (Lys,

Arg, His) thì pHi của nó sẽ ở vùng kiềm.

Giá trị pHi của một số protein thường gặp

31

Trong điều kiện pH=pHi của protein, các protein dễ dàng kết tụ lại với nhau

9/18/2020

Khối lượng (MW) và cấu trúc phân tử của một số protein

Protein = protein đơn giản + protein phức tạp

Một số phản ứng thường dùng để định tính, định lượng protein

Phản ứng biure (Biuret assay)

• Là phản ứng đặc trưng cho liên kết peptide, trong môi trường kiềm mạnh,

liên kết peptide trong protein phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím. Cực đại hấp thụ của phức chất ở 540 nm

32

• Các aminoacid và dipeptide không có phản ứng này.

9/18/2020

Phản ứng Folin-Ciocalteu (Lowry assay)

• Là phản ứng kết hợp giữa phản ứng biure và oxi hóa các aminoacid thơm

(Tyr, Trp) bằng thuốc thử folin-ciocalteu (hỗn hợp của phosphotungstic acid

and phosphomolybdic acid).

• Phức hợp tạo thành có màu xanh da trời, hấp thụ cực đại ở 750 nm.

• Phương pháp này khá nhạy, có thể định lượng tới 0,01mg/ml

Phản ứng với Ninhydrin

•

Tất cả các a-amino acid đều phản ứng với Ninhydrin tạo phức chất màu xanh tím,

riêng prolin tạo phức chất màu vàng.

• Dưới tác dụng của Ninhydrin ở nhiệt độ cao Aminoacid tạo thành NH3, CO2 và aldehit

tương ứng có mạch cacbon ngắn hơn Aa 01 Cacbon. Ninhydrin chuyển thành

Hydrindatin. Hydrindatin, NH3 mới tạo ra phản ứng với Ninhydrin khác tạo phức chất

có màu

• Có thể so màu hoặc đo thể tích NH3, CO2 tạo ra để định lượng Aminoacid

33

9/18/2020

Phản ứng Bradford (Bradford assay)

• Đây là phương pháp phổ biến để định lượng protein tổng số, có thể định lượng ở

ngưỡng 1-10 µg/ml.

• Cơ chế thực hiện dựa trên sự thay đổi màu của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant

Blue G-250, trong điều kiện axit thuốc nhuộm sẽ chuyển từ màu nâu đỏ sang màu

xanh khi có mặt của protein.

• Cực đại hấp thụ của phức hợp ở 595 nm.

Các phản ứng màu đặc trưng khác của protein

Những phản ứng này có được là do sự có mặt của các nhóm định chức hóa học xác

định trong phân tử protein. Có thể sử dụng chúng để phát hiện amino acid, protein trong

dung dịch.

Phản ứng xanthproteic: các gốc amino acid Tyr, Trp, Phe trong protein tác dụng với

•

HNO3 đặc tạo thành màu vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành da cam.

Phản ứng Pauli: các gốc Tyr, His trong protein tác dụng với diazobenzosulfonic acid

•

tạo thành màu đỏ anh đào.

•

Phản ứng Millon: gốc Tyr tác dụng với thuỷ ngân nitrate trong HNO3 đặc tạo thành

kết tủa màu nâu đất.

Phản ứng Saccaguichi: gốc Arg tác dụng với dung dịch kiềm của α-naphtol và

•

hypobromitecho màu đỏ anh đào.

•

Phản ứng Adamkievich: gốc Trp tác dụng với glyoxylic acid và H2SO4 đặc tạo

thành vòng tím đỏ ở mặt phân cách

34