CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014)
1
BM CNSH TV – Khoa CNSH
CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)
Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
2
8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Khái niệm thư viện DNA
•Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin •Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân tử DNA
Thư viện DNA là tập hợp ngẫu nhiên các đoạn DNA (có tính đại diện đặc thù cho hệ gen của một sinh vật) được chèn vào các vector nhân dòng
Có hai loại thư viện mẫu chính đó là:
1. Thư viện genome (Genomic library): chứa toàn bộ các đoạn DNA có trong nhân của một tổ chức hay cơ thể. Genomic library có thể được nhân dòng bằng plasmid hoặc genome của thực khuẩn thể.
2. Thư viện cDNA (cDNA library): chứa các đoạn cDNA có tính đại diện đặc thù cho toàn bộ mARN của một mô. Thư viện cDNA được tạo ra bằng cách tổng hợp nên cDNA từ mRNA.
Các bước trong tạo thư viện mẫu đã nhân dòng
1. Tạo các đoạn DNA ngẫu nhiên từ hệ gen hay
cDNA
2. Chèn các đoạn DNA vào vector nhân dòng thích
hợp.
3. Nhân các đoạn DNA tạo ra trong hệ thống tế bào
chủ (chứa vector nhân dòng tương ứng)
4. Chọn lọc các dòng có chứa vector mang đoạn
DNA mục tiêu.
Thiết kế thư viện mẫu cho đọc trình tự.
• Mỗi một đoạn DNA cài trong một vector biến nạp trong 1 tế
bào vi khuẩn Sách (Book)
• Tập hợp tất các các dòng vi khuẩn Thư viện
Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng
Kích thước của đoạn DNA tùy thuộc vào mục đích sử dụng thư viện
• Để lập bản đồ, xác định các gen hay tách dòng gen từ hệ gen có kích thước lớncần các đoạn DNA lớn và sử dụng các vectơ như phage, cosmid, BAC hay YAC • Để xác định trình tự, lập bản đồ chi tiết… cần các đoạn DNA có kích thước nhỏ, sử dụng vectơ nhân dòng là plasmid • Các đoạn DNA phải có tính ngẫu nhiên để đảm bảo tính đại diện cho hệ gen.
Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng
• Làm gãy nhiễm sắc thể • Cắt bằng RE • Ở genom người dựng RE có vùng nhận biết gồm 8 Nu (NotI, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn
• Thông thường dùng RE có vùng nhận biết gồm 4
Nu (AluI, HaeIII)
• Cắt không hoàn toàn (partial digest) bằng cách sử
dụng phối hợp nhiều RE
Bảng. Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số vector nhân dòng
Stt
Vector
Plasmit
Khả năng chứa đoạn DNA(kb) <10kb
Bacteriophage
9-20kb
Cosmit
33-47kb
BAC
100-300kb
YAC
100-1000kb
1. 2. 3. 4. 5.
Trong một thư viện sẽ chứa bao nhiêu dòng ?
• Theo lý thuyết:
Số dòng tối thiểu cần thiết để tạo thư viện(n) = độ lớn của hệ gen (b) độ lớn TB của đoạn ADN (a)
Ví dụ: thiết kế thư viện hệ gen của người, dùng các vector khác nhau: Kích thước genome : 3 x 109 bp
• Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases)---> Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human)
• Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb ---> Average insert of 17,000 bases
= 1.8 x 105 clones required to cover one human genome
• Cosmid = Take inserts of 35-50 kb ---> Average insert of 50,000 bases =
60,000 clones required to cover one human genome
• BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb --->
Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome
• YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater --> Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genome
Trên thực tế, số dòng sẽ lớn hơn bởi quá trình cắt và ghép vào vector là ngẫu nhiên.
• Một số dòng sẽ có mặt hơn một lần trong thư viện do hiện
tượng lặp đoạn
• Một số trình tự nào đó sẽ bị mất nếu chỉ sử dụng số dòng
tối thiểu.
• Clarke and Carbon (1976) đề nghị công thức tính mới nhằm tính xác suất để một đoạn DNA được nhân dòng trong một thư viện mẫu. N = ln(1-P) ln(1-a/b)
• Trong đó: P: xác xuất nhân dòng một đoạn DNA bất kỳ; a: kích thước đoạn DNA cần nhân (bp), b : độ lớn hệ gen (bp)
Câu hỏi
• Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn trình tự có mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector?
Học thuyết trung tâm
exon
DNA
Double-stranded
intron
AAAAAAAAAAn
Precursor RNA
mRNA
Single-stranded
AAAAAAAAAAn
Reverse transcription
Protein
AAAAAAAAAAn
double-stranded
cDNA
cDNA
Một cDNA (complementary DNA) là một bản DNA copy của một RNA, thường là mRNA.
mRNA
cDNA
Mạch kép
Mạch đơn
Ổn định
Không ổn định
Dễ dàng thao tác
Khó thao tác hơn
Có thể được sử dụng trực tiếp để tổng hợp protein
Cần được phiên mã thành RNA để tổng hợp protein
KỸ THUẬT TẠO THƯ VIỆN cDNA
Khái niệm
Tại sao phải lập ngân hàng cDNA
• Gene chỉ chiếm một trong nhỏ
phần genome
• Ở các mô khác nhau và giai đoạn sinh trưởng khác nhau chỉ có một số gene nhất định hoạt động
• DNA ở sinh vật nhân chuẩn có chứa intron
Quá trình phiên mã và dịch mã ở sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote)
• cDNA (complementary DNA, copy DNA) là phân tử DNA được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ sợi RNA (chủ yếu là mRNA) khuôn, nhờ enzyme sao chép ngược reverse transcriptase.
Thư viện cDNA
Tập hợp tất cả các mRNA thu được từ một loại tế bào, ở các giai đoạn phát triển khác nhau tạo nên tập hợp cDNA được tách dòng gọi là ngân hàng cDNA của tế bào
Tổng hợp các ngân hàng cDNA của từng loại tế bào và mô
của một sơ quan ngân hàng cDNA của cơ quan đó
Vì không phải tất cả các gene của một cơ thể đều hoạt động trong một tế bào tại thời điểm chiết xuất mRNA, do vậy, thư viện cDNA luôn luôn nhỏ hơn thư viện genome. Nếu biết loại tế bào nào sinh ra protein nghiên cứu thì việc tách gene đó thông qua khảo sát thư việc cDNA sẽ dễ dàng hơn nhiều so với việc khảo sát thư viện genome.
NHÂN TẾ BÀO
Nguyên lý tạo cDNA
Đoạn DNA của gene TB nhân chuẩn
Phiên mã
mRNA sơ cấp
Loại bỏ intron
mRNA
từ
ỐNG NGHIỆM
tổng
tế Tách mRNA bào và bổ sung reverse transcriptase; hợp mạch DNA
Mạch cDNA
ngược
Phân hủy mRNA Tổng hợp mạch DNA thứ 2
Như theo định nghĩa, là phân tử DNA được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ sợi RNA (chủ yếu là mRNA) khuôn, nhờ enzyme sao chép ngược transcriptase. reverse Như vậy, muốn tổng hợp được cDNA cần phải tách được mRNA khỏi RNA tổng số và cần có sự tham gia của enzyme sao chép reverse transcriptase.
cDNA của gene (không có intron)
Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA
• Bước 1: Chuẩn bị mRNA • Bước 2: Tổng hợp cDNA • Bước 3: Tạo thư viện
cDNA
Các bước cơ bản ngân hàng cDNA (tiếp…)
dụng
sử
• Bước 1: Chuẩn bị mRNA: – Tách chiết RNA tổng số – Tách mRNA ra khỏi hỗn hợp RNA tổng số dựa vào đặc điểm của mRNA trưởng thành ở sinh vật nhân chuẩn là có đuôi polyA ở đầu 3’.Có nhiều phương pháp để tách mRNA ra khỏi tổng số. VD: sử dụng sắc mang RNA cellulose-oligo(dT), hạt Mg- oligo(dT)…(hình)
Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA tổng số sử dụng sắc ký cột mang cellulose-oligo(dT)
Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA tổng số sử dụng hạt Mg-oligo(dT)
Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA (tiếp…)
• Bước 2: Tổng hợp cDNA với sự tham gia của enzyme sao chép ngược reverse transciptase và các nguyên liệu và hóa chất cần thiết khác. Bước này gồm 2 giai đoạn: (1) tổng hợp cDNA mạch đơn, (2) tổng hợp cDNA mạch kép.
Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA (tiếp…)
• Bước 3: Nhân dòng các cDNA Các cDNA được nhân dòng và tập hợp thành
các thư viện cDNA (xem lại bài nhân dòng gene)
Một số phương pháp tạo cDNA
Phương pháp tạo cấu trúc kẹp tóc
• Dùng các mRNA làm khuôn với sự có mặt của enzym sao chép ngược (inverse transcriptase) cùng với các nguyên liệu (dNTP) để tổng hợp nên DNA bổ sung hay cDNA sợi đơn có cấu trúc kẹp tóc.
• Dùng enzyme RNase H (hoặc alkali) phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA
• Bổ sung DNA polymerase và các nucleotid tự do để tổng hơp sợ cDNA thứ 2 (phần móc cong trở thành primer cho DNA polymerase)
thu được phân
• Xử lý với S1 nuclease để cắt bỏ đoạn có cấu trúc kẹp tóc tử cDNA có cấu trúc xoắn kép
Phương pháp RACE
• RACE (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA • Quá trình sao chép ngược được thực hiện nhờ PCR (RT-PCR) nhân nhanh trình tự RNA thành dạng cDNA.
• Gồm 2 quy trình:
– Nhân nhanh đầu 5’ (5’ RACE) – Nhân nhanh đầu 3’ (3’ RACE)
3’ RACE
• mRNA được phiên mã ngược sử dụng mồi (dT17) c ó gắn neo ở đầu 5’ của nó. Neo này mang trình tự cắt giới hạn để phục vụ cho nhân dòng. • Quá trình nhân nhanh được thực hiện nhờ (dT17) c ó gắn neo và mồi đặc hiệu cho cDNA mục tiêu.
5’ RACE
• mRNA được phiên mã ngược
sử dụng mồi đặc hiệu.
tạo
nhờ để
• Sản phẩm cDNA sau đó được terminal đuôi
(oligo
dài kéo transferase poly(dA) ở đầu 3’ của cDNA. • Quá trình nhân nhanh được thực hiện nhờ mồi dT17 có gắn (dT17)/anchor neo system) tương tự như trong quy trình đối với 3’RACE và mồi đặc hiệu
So sánh thư viện genome và thư viện cDNA
1. Thư viện cDNA chỉ chứa trình tự được phiên mã ở mRNA chứ không phải toàn bộ bộ gene
DNA nhiễm sắc thể
Phiên mã
mRNA sơ cấp
Cắt bằng enzyme giới hạn
2. Thư viện cDNA có thể không chứa toàn bộ gene của cơ thể. Thư viện genome cần chứa tất cả các gene của cơ thể.
Các đoạn DNA
mRNA
Tạo mRNA trưởng thành
Phiên mã ngược và nhân dòng cDNA
3. Nếu gen được biểu hiện mạnh ở một mô, thư viện cDNA có thể chứa nhiều bản sao của gen đó. Các gen không biểu hiện hoặc biểu hiện ở mức thấp có thể không có mặt trong thư viện cDNA. Thư viện genom thường chứa tất cả các dòng của gen nếu như gen đó xuất hiện nhiều trong hệ gen sinh vật.
Nhân dòng DNA
Các dòng đoạn DNA trong thư viện genome Các dòng cDNA trong thư viện cDNA
Ứng dụng của thư viện cDNA
• Cung cấp các trình tự cho phân tích, khuếch đại, nhân dòng và thể hiện gen • Thiết kế các mẫu dò, mồi khi đã biết trình tự để cung cấp cho các nghiên cứu, chuẩn đoán tiếp theo (lai, blot, PCR, trị liệu gen..) • Tổng hợp hoạt chất thông qua điều khiển sự thể hiện của một gen nào đó trong tế bào chủ đặc thù.
Ứng dụng của thư viện cDNA
• Xác định trình tự các base và phân tích
gene
• Thiết kế các mẫu dò cho các gene mục
tiêu trên nhiễm sắc thể
• Nghiên cứu sự biểu hiện của gene
• Tổng hợp protein nhân tạo
