Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật kĩ thuật và ứng dụng: Bài 1

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn

STT Ngày NỘI DUNG

1 10/9 Bài 1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật (TS. Vũ Bích Ngọc)

2 17/9 Bài 2. Sinh học tế bào nuôi cấy (TS. Vũ Bích Ngọc)

3 24/9 Bài 3. Kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp (TS. Vũ Bích Ngọc)

4 1/10 Bài 4. Kĩ thuật cấy chuyền và tạo dòng (ThS. Trương Châu Nhật )

5 8/10 Bải 5. Kĩ thuật bảo quản tế bào (Cô. Lê Thị Ngân Hà)

6 15/10 Bài 6. Kỹ thuật nhận diện tế bào (ThS. Phan Lữ Chính Nhân)

7 22/10 Bài 7. Kĩ thuật phân tách tế bào (ThS. Phan Lữ Chính Nhân)

8 29/10 Bài 8. Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (ThS. Lê Thị Hạnh )

9 5/11 Bài 9. Kĩ thuật biến đổi gen trên tế bào (ThS. Đào Thị Thanh Thuỷ)

Bài 10. Ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy tế bào trong y học và nông nghiệp- Ôn

10 12/11

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn

tập (TS. Vũ Bích Ngọc)

• thi giữa kì (40%): trắc nghiệm • thi cuối kì (60%): Trắc nghiệm

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn

Mục tiêu môn học

• Sau khi học xong môn học này, sinh viên:

– Hiểu được cấu trúc và chức năng và đặc tính của tế

bào

– Hiểu được các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật, công nghệ tế bào gốc như kỹ thuật, quy trình, các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tế bào trước, trong và sau quá trình phân lập, nuôi cấy, tăng sinh, bảo quản, định danh, phân tách tế bào

– Liên hệ được các kiến thức về công nghệ nuôi cấy tế bào sự phát triển của lĩnh vực chăn nuôi và y học

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn

PTN

Ứng dụng của tế bào động vật

Sinh học của tế bào động vật

Một số kỹ thuật liên quan

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

PHÒNG THÍ NGHIỆM

NGUYÊN TẮC VÀ TIÊU CHUẨN

NHÀ XƯỞNG

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TBĐV

THIẾT BỊ

ĐIỀU KIỆN LÝ-HOÁ TRONG KTNC

9/24/18

DỤNG CỤ TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Nguyên tắc

• Phải là phòng sạch (clean room, sterile room),

vệ sinh tốt…

• Phải đảm bảo an toàn cho người làm việc,

tránh lây nhiễm bệnh tật.

• Phải đảm bảo tinh sạch cho các mẫu vật, hóa

chất hữu cơ.

• Phải đảm bảo tính chính xác các kết quả thí

nghiệm.

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn

Một số tiêu chuẩn của một phòng thí nghiệm sạch

(1) Ap lực trong phòng cao hơn bên ngoài không khí. (2) Độ vô trùng (có 5 cấp bậc 1, 2, 3, 4, 5 - tương ứng với các mức độ vô khuẩn từ 99; 99,9; 99,99; 99,999; 99,9999%). (3) Độ ẩm (30-45%), hạn chế tối đa đưa nước vào phòng. (4) Độ rung. (5) Độ sạch bụi. (6) Nhiệt độ (điều khiển được). (7) Luồng không khí lưu thông (400m3/giờ). (8) Độ sáng. (9) Mật độ nhân sự làm việc có giới hạn. (10) Không gian hợp lý. (11) Có đủ hệ thống xử lý vệ sinh, hệ thống an toàn.

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn

Khu vực phòng đệm

Khu vực hành lang

Khu vực sản xuất tế bào

Panel và hệ thống khí

Lối đi

THIẾT BỊ

Water bath

Autoclave

Kính hiển vi

Tủ ATSH

Máy li tâm góc

Máy li tâm văng

THIẾT BỊ

Cân phân tích

Máy đo ASTT

Máy pH

Máy khuấy từ

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

THIẾT BỊ

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

THIẾT BỊ

pipet bán tự động

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

9/24/18

Dụng cụ nuôi cấy

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Đĩa 35-60-100mm, bình Flask, đĩa nhiều giếng (4-6-24 giếng), bình quay, spinner… Ống ly tâm, pipette

Dụng cụ thủy tinh

• Becher • Chai trung tính • Cá khuấy từ • Pipette thủy tinh

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Một số dụng cụ thủy tinh

Bình định mức Bercher Erlen

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Lam và lamelle

Pipet

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Điều kiện Lý - Hoá

Chỉ tiêu Điều kiện

Nhiệt độ

Hầu hêt là 370C (ĐV có vú, người; trừ tinh trùng-330C); 38,50C (chim); 25-280C (côn trùng) >20C so với điều kiện tối ưu từng loại TB Có thể chịu đến -1960C; Sử dụng tủ ấm (incubator) trong nuôi in vitro

Duy trì cân bằng Ion, chức năng enzym nội bào, gắn kết hormone với GF lên receptor Có thể làm thay đổi chuyển hoá tế bào gây apoptosis, sản xuất protein shock nhiệt Ngưỡng: 6,5-7,8, thường được điều chỉnh 7-7,4

Áp suất thẩm thấu

Tác nhân chính: muối, glucose Tác động đến sự tăng trưởng và chức năng tế bào Thích hợp 290-310 mOsm

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Các loại khí CO2 (5%-10%), O2, N2

Môi trường nuôi cấy TBĐV

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Thành phần môi trường

Thành phần Vai trò

Muối vô cơ

Cân bằng ASTT, điều hoà điện thế màng Cần trong nền chất tế bào (bám gắn và hoạt độngnhư cofactor

Hệ đệm Bicarbonat/phosphat/hepes

Carbonhydrate Glucose, galactose, maltose, fructose (1-4,5 g/l)

Vitamin

Cơ chất cho nhiều cofactor Thường là riboflavin,thiamin, biotin

Protein và peptide Albumin, transferrin, fibronectin, fetuin

Acid béo và lipid

Dạng: cholesterol và steroid Cần trong môi trường không huyết thanh

Yêu tố vi lượng Kẽm, đồng, selenium, tricarrboxylic acid trung gian

Huyết thành

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Cung cấp chất dinh dưỡng, GF, chống oxy hoá, cải thiện tính dính của tế bào

Đặc điểm của tế bào động vật

SINH HỌC CỦA TBĐV

Một số khái niệm dòng tế bào

Các cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Chu kì tế bào

Metaphase check point • chromosome align on spindle

M Mitosis

G2 check point • DNA replicated • cell big • environment suitable

G2 Gap2

G1 Gap1

S Synthesis

G1 check point • cell big • environment suitable

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Chu kì tế bào

•

Checkpoint

• S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra • Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2

Checkpoint

Interphase: – Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú – Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước • Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia • Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1

– Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng – Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau. – Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ – Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo

• Mitosis hay M Phase:

tế bào hoàn thành xong sự phân chia.

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

SỰ TĂNG SINH IN VITRO

• Sự TĂNG SINH của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc:

– Trạng thái tự nhiên của tế bào:

• •

Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick Vai trò của sự biểu hiện gen

– Môi trường nuôi cấy • Cơ chất tế bào bám • Thành sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi • Thành phần của phase khí • Nhiệt độ nuôi • Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tính cơ học yếu (dễ vỡ)

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tính chất cần giá đỡ -TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia - Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Dung hợp, biến nạp, tải nạp… tế bào à Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tính cơ học yếu

Tăng trưởng và phân chia chậm

Cơ chế kìm hãm ngược

Tính chất cần giá đỡ

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Một số khái niệm dòng tế bào

• Dòng tế bào • Dòng tế bào liên tục • Dòng tế bào tạm thời • Tế bào sơ cấp • Tế bào thứ cấp

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Tăng sinh

(Regenerative Medicine, 2006)

Tế bào sơ cấp

Nuôi mô

Thu nhận cơ quan

Cấy chuyền

Cắt nhỏ Thành tế bào đơn

Cấy chuyền

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Tế bào sơ cấp

Tế bào thứ cấp

Các kiểu nuôi cấy tế bàoàLoại tế bào

1. Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)

– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như

• •

Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)

– Thuận lợi:

•

Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo.

– Bất lợi:

• Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các

fibroblast

• Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức • Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

Các kiểu nuôi cấy tế bào

2. Nuôi cấy thứ cấp

– Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp

• Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy

– Thường chứa kiểu êế bào đơn – Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ – Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:

• Dòng tế bào • Dòng tế bào liên tục

Các kiểu nuôi cấy tế bào

1) Dòng tế bào

•

Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia) Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài

Dòng tế bào liên tục

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

(CHO, Schneider-2, COS1, hela. Vero…: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổi đặc tính

2) Dòng tế bào liên tục

• •

Có thể tăng sinh không hạn định Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:

•

– Tế bào từ khối u. – Nhiễm với các viral oncogenes – Xử lí hóa chất (chemical treatments). Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo.

Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection)

• Chuyển dạng

– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA

và sự biểu hiện gen

• Tốc độ phát triển • Kiểu phát triển (loss of contact inhibition) • Hình thành sản phẩm chuyên biệt • Kéo dài tuổi thọ • Mất khả năng bám dính

• Chuyển nhiễm

– Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA)

*

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Tại sao cần nuôi cấy mô/tế bào?

• Nghiên cứu

– Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như:

• Các tác động của các mô xung quanh • Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật

– Giảm các động vật sử dụng

• Sản xuất các sản phẩm thương mại

– vaccine, antibody, hormone – Tế bào sử dụng cho cấy ghép

*

NUÔI TẾ BÀO SƠ CẤP

NUÔI CẤY PHÁT TRIỂN MẢNH MÔ SƠ CẤP

CẤY CHUYỀN

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi)

Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép)

Tách tế bào bằng enzym (ủ…)

Trypsin lạnh

Trypsin ấm

Collagenase

NUÔI SƠ CẤP

Nuôi mẫu mô sơ cấp

Ly tâm

Tái huyền phù

Cấy chuyền

Thu nhận tế bào mới

DÒNG TẾ BÀO

Thu mảnh mô thứ cấp

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Nuôi sơ cấp

Nuôi mô

Thu nhận cơ quan

Cấy chuyền

Cắt nhỏ Thành tế bào đơn

Cấy chuyền

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Nuôi sơ cấp

Cell line

Tách tế bào bằng phương pháp khác

Ly tâm đẳng tỷ trọng

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Dựa vào marker bề mặt

TẠO DÒNG TẾ BÀO

CÁC PHƯƠNG PHÁP

KỸ THUẬT CHỌN DÒNG TẾ BÀO

XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO

MÔI TRƯỜNG HUYẾT THANH MÔI TRƯỜNG KHÔNG HUYẾT THANH

Bổ sung hormone, GF

Cung cấp hormone và GF cần thiết cho chức năng tế bào

Cung cấp các nhân tố bám dính (fibronectin, vitronectin…) Phủ đĩa với các nhân tố bám dính hay polylysine

Hoạt động như một đệm pH Sử dụng các hệ đệm hữu cơ…

Gắn, bất hoạt hay tách ra các chất độc (hợp chất hữu cơ gắn kim loại…) Sử dụng nước tinh sạch, chuẩn bị môi trường tươi, bổ sung albumine…

Bổ sung các protein bám như transferrin, eruloplasm…

Chứa các protein bám làm ổn định và/hay giúp vận chuyển các hormone, chất dinh dưỡng và tế bào

Cung cấp các chất dinh dưỡng Sử dụng các môi trường phức tạp

Chứa các chất ức chế protease

Sử dụng chất ức chế trypsin khi cấy chuyền và thêm các chất ức chế protease thích hợp

Chứa các nhân tố biệt hoá

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Bổ sung hay không, để điều hoà sự phát triển tế bào và biệt hoá

Chứa các nhân tố gây sự lão hoá trong các tế bào chuột bình thường Không có tác dụng lên sự già yếu tế bào, các tế bào phát triển liên tục

MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN

KỸ THUẬT VÔ TRÙNG

QUAN SÁT TẾ BÀO

KIỂM SOÁT NHIỄM

ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Kỹ thuật vô trùng

¤ Khử trùng bằng hoá chất: ethanol

– Khử trùng bằng nhiệt ẩm (nồi autoclave)

¤ Một số phương pháp vô trùng

70%; formaldehyde…

Ø Chiếu tia UV: sử dụng cho tủ thao tác

thường dùng khác

Ø Chiếu tia Gamma: dùng để vô trùng

• Áp suất autoclave và nhiệt độ 1070C • 1100C • 1150C • 1210C • 1260C • hoặc phòng thao tác 5 psi 7 psi 10 psi 15 psi 20 psi – Khử trùng bằng nhiệt khô

các dụng cụ nhựa

Ø Lọc vô trùng: sử dụng phin lọc với đường kính lỗ lớn nhất là 1 nm, thường dùng cho các môi trường hoặc chất lỏng dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

9/24/18

• Nhiệt độ và thời gian khử trùng • • • • 8 giờ 3 giờ 1 giờ 20 phút 1200C 1400C 1600C 1800C

Quan sát tế bào

Kính hiên vi

Sự đổi màu môi trường nuôi tế bào

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

- Đánh giá sức khoẻ tế bào - Hình thái tế bào - Định danh tế bào - …..

Kiểm soát nhiễm

Phát hiện nhiễm Ngăn ngừa nhiễm

Nguồn: nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus, tế bào Nhận biết: độ acid bất thường, môi trường đục, xuất hiện quả cầu, dây, quan sát dưới KHV, nhuộm huỳnh quang, kháng thể, phân tích PCR

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Nấm

Vệ sinh dụng cụ, khu vực thao tác Thao tác độc lập trên mỗi dòng tế bào Loại bỏ nhiễm: - bỏ vật dụng/mẫu đã bị nhiễm - Dùng kháng sinh/nấm - Tái thiết lập bằng PP pha loãng tới hạn - Ly tâm percoll (nấm mốc/men)

Vi khuẩn Mycoplasma

Đông lạnh – giải đông tế bào

Đông lạnh Giải đông

Giữ tế bào ở trạng thái ngủ (Lưu trữ tế bào sống trong thời gian dài) Đưa tế bào về trạng thái sinh lý bình thường (hoạt hoá tế bào)

Cần có môi trường dinh dưỡng

Cần có chất bảo quản đông lạnh (DMSO, glycerol, PEG, trehalo, dextro…)

Nên giải đông nhanh (370C)

9/24/18

TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Nên đông lạnh chậm: T0 mát (2-80C) à âm (- 15- -800C)à âm sâu (-1960C)

MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH

SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC