4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 1
Câu hỏi
Ông Đại bị bệnh thoái hoá khớp gối cấp độ nặng, các thuốc truyền thống không thể điều trị được. Ông Đại tìm hiểu và thấy ghép tế bào gốc có thể điều trị được căn bệnh này.
Bạn là chuyên gia và tế bào gốc, bạn tư vấn cho bệnh nhân nên thu mô nào nào trong các mô sau để phân lập được tế bào gốc?
Mô dây rốn
Mô mỡ
Mô tuỷ xương
Mô sụn
Tại sao?
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 2
Nuôi cấy sơ cấp
Lấy tế bào khỏi cơ thể động vật và giúp tế bào tăng trưởng trong môi trường nhân tạo
Nuôi cấy tế bào là gì?
Nuôi cấy thứ cấp
vbngoc@hcmus.edu.vn 3 4/27/20
KHÁI NIỆM NUÔI CẤY SƠ CẤP
• NUÔI CẤY SƠ CẤP (PRIMARY CULTURE) LÀ QUÁ TRÌNH NUÔI TẾ BÀO TRỰC TIẾP TỪ MÔ TRƯỚC LẦN CẤY CHUYỀN ĐẦU TIÊN (SUBCULTURE).
TRONG NUÔI CẤY SƠ CẤP, CÁC
• TẾ BÀO BAN ĐẦU THƯỜNG LÀ MỘT HỖN HỢP CÁC DÒNG TẾ BÀO KHÁC NHAU, HOẶC CHỨA MỘT KIỂU KẾ BÀO TRỘI NHẤT, TRONG ĐÓ CÓ NHỮNG TẾ BÀO QUAN TÂM VÀ NHỮNG TẾ BÀO KHÁC (ĐƯỢC COI LÀ TẾ BÀO TẠP NHIỄM
SAU ĐÓ, VIỆC NUÔI CẤY ĐƯỢC
vbngoc@hcmus.edu.vn
4/27/20
4
• GỌI LÀ THỨ CẤP (SECONDARY CULTURE)
Tế bào sơ cấp
Nuôi mô
Thu nhận cơ quan
Cấy chuyền
Cắt nhỏ Thành tế bào đơn
Cấy chuyền
Tế bào thứ cấp
Tế bào sơ cấp
5 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn
–
Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp • Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy
Nuôi cấy thứ cấp
– –
–
Thường chứa kiểu tế bào đơn Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy: • •
Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục
6 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn
Dòng tế bào
Dòng tế bào liên tục
Một số khái niệm dòng tế bào
Nuôi cấy sơ cấp-Tế bào sơ cấp
Nuôi cấy thứ cấp-Tế bào thứ cấp
4/27/20
vbngoc@hcmus.edu.vn
7
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 8
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 9
Tăng sinh
(Regenerative Medicine, 2006)
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 10
– Có đời sống hạn định, lão hóa
sau một số lần cấy chuyền nhất định (khoảng 30 lần phần chia) – Thường là lưỡng bội và duy trì
một số mức độ biệt hóa – Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng TB mẹ (Master bank) và ngân hàng TB làm việc (working bank) để duy trì những dòng này trong thời gian dài
Dòng tế bào
1 1
vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20
Dòng tế bào liên tục
(CHO, COS1, hela, Vero…: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổi đặc tính
Chúng thường là những tế bào chuyển dạng (transformation)
Tế bào từ khối u. Nhiễm với các viral oncogenes Xử lí hóa chất (chemical treatments).
Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo.
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 12
• Chuyển dạng
– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua sự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen
• Tốc độ phát triển • Kiểu phát triển (loss of contact
inhibition)
• Hình thành sản phẩm chuyên biệt • Kéo dài tuổi thọ • Mất khả năng bám dính
• Chuyển nhiễm
– Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA)
Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection)
1 3
vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20
Thuận lợi
Bất lợi:
Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo.
Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast
Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức
Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 14
Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp
KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP
KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN
Là việc nuôi cấy các mảnh mô in vitro. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô trung tâm.
Là việc nuôi cấy các tế bào đơn được tách ra từ mảnh mô. Trong quá trình nuôi, từng mỗi tế bào triển tăng sinh thành sẽ phát nhiều tế bào mới.
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 15
THU NHẬN MẪU MÔ
CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)
Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi)
Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép)
Tách tế bào bằng enzym (ủ…)
Trypsin lạnh
Trypsin ấm
Collagenase
NUÔI SƠ CẤP
Nuôi mẫu mô sơ cấp
Ly tâm
Tái huyền phù
Cấy chuyền
Thu nhận tế bào mới
DÒNG TẾ BÀO
Thu mảnh mô thứ cấp
16 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn
Quy trình nuôi cấy sơ cấp
Thu nhận –bảo quản mẫu
Xử lí mẫu
Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn
Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô
Nuôi cấy
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 17
Thu nhận mẫu
• Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kì mô
sống nào của cơ thể.
• Phải làm sạch mô tại vị trí lấy mẫu bằng cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh chóng chuyển về PTN.
• Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 18
Thu nhận mảnh mô
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 19
Thu nhận- Bảo quản mẫu
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 20
Thu nhận - Bảo quản mẫu
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 21
•
röûa nhieàu laàn baèng dung dòch PBS coù boå sung khaùng sinh (thöôøng laø gentamicin hay penicillin vaø streptomicin), khaùng naám • caét boû caùc phaàn moâ cheát,
phaàn thöøa (nhö môõ…) • caét nhoû moâ thaønh töøng
Xöû lyù sô boä maãu moâ
maûnh 2-3 mm2. Caùc maãu naøy coù theå ñöôïc söû duïng ñeå – nuoâi (phaùt trieån sô caáp maûnh moâ–primary explant tissue culture), hoaëc
– söû duïng ñeå taùch rôøi caùc
teá baøo sau ñoù.
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 22
Thu nhận - Bảo quản mẫu
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 23
Xử lý mẫu
Cắt nhuyễn
Ép nhuyễn
Biện pháp tách mô bằng cơ học
Tách bằng màng lọc
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 24
Phương pháp cắt nhuyễn
Sử dụng lực cơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mô. Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch trong
Phöông phaùp naøy cho hieäu quaû khoâng cao, soá löôïng teá baøo ñôn thu nhaän ít, vì vaäy, thöôøng aùp duïng cho nhöõng maãu moâ coù kích thöôùc lôùn vaø khoâng khan hieám. Tuy nhieân, vieäc taùch baèng phöông phaùp cô hoïc luoân cho khaû naêng soáng cuûa teá baøo cao.
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 25
Phương pháp ép nhuyễn
Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame ép chặt mảnh mô để thu tế bào đơn đối với những mô có liên kết yếu.
Có thể dùng pittong của syringe
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 26
Phương pháp tách bằng màng lọc
lỗ
thước
Tách bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): trên kích màng từ 70–100 µm, chỉ cho những tế bào đơn có kích thước tương ứng qua màng.
Ñaët maãu moâ leân treân maøng loïc, söû duïng pittong cuûa syringe ñeå chaø saùt maïnh maûnh moâ, khi ñoù, nhöõng teá baøo seõ va chaïm vaøo löôùi loïc vaø taùch rôøi. Nhöõng teá baøo ñôn coù ñöôøng kính nhoû hôn loã loïc seõ loït qua.
27 4/27/20
vbngoc@hcmus.edu.vn
Tách rời tế bào đơn
Tách bằng enzym
Trypsin
Collagenase
Papain
Elastase
Trypsin ấm
Caùc teá baøo ñoäng vaät trong khoái moâ lieân keát chaët cheõ vôùi nhau vaø vôùi ECM nhôø caùc caáu noái protein hình thaønh giöõa caùc teá baøo vôùi nhau. Ñeå taùch rôøi caùc teá baøo trong khoái moâ, ngöôøi ta thöôøng duøng caùc enzyme protease nhö trypsin, pronase…
Trypsin lạnh
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 28
Quy trình trypsin ấm
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 29
Quy trình trypsin lạnh
Cắt mẫu mô [2 – 3mm], rửa nhiều lần với PBS vô trùng
Thêm môi trường, sục nhẹ nhành cho đến khi mô rời ra
Nếu các mảnh mô chưa rời ra có thể thêm môi trường để dễ huyền phù hoặc dùng màng lọc
Thay PBS bằng trypsin 0.25%
ủ ống chứa mẫu mô trong 36,50C, 20 – 30 phút
Thu dịch huyền phù tế bào, xác định mật độ, tiến hành nuôi
Ủ trong 40C, 6- 18 giờ
Loại bỏ trypsin
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 30
Tách bằng enzyme
Trypsin:
Chymotrypsin
Collagenase
Papain
Elastase
• pH 7-9, thích hợp
• Hoạt động
• pH6-9, tối ưu 8-9 • Nồng độ dùng: 0,01%-
8-9
0,5%
• Cắt liên kết
tốt: pH7-8, < 450C
peptide tạo bởi – COOH acid amin thơm với –NH2
• Tính đặc hiệu
• Phân huỷ elastin • Sử dụng kết hợp với enzyme khác
• Ca2+ được xem như chất bảo vệ Trypsin • Bị kìm hãm bởi FBS hoặc Di-Isopropyl- Fluorophosphat(DFP)
• pH 4,5- 8,5 • Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá
kém hơn trypsin • Bị ức chế bởi DFB •
• Không đặc hiệu cho loại protein: Cắt liên kết –COOH của lysin/arginin và –NH2 à có thể gây hư hai cho tế bào
• Cắt liên kết peptide dạng poly-L prolin; gồm 4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên biệtè ít làm hư hại tế bào
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 31
Hạn chế tối đa thời gian tiếp xúc của enzyme với tế bào
Chọn nồng độ tối thiểu enzyme phân tách tuỳ loại tế bào
Sử dụng các chất ức chế hoạt tính enzym ngay sau khi phân tách (FBS, protease inhibitor)
4/27/20
vbngoc@hcmus.edu.vn
32
Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng
Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt
Tách tế bào bằng phương pháp khác
vbngoc@hcmus.edu.vn
4/27/20
33
Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 34
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 35
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 36
Phöôngphaùptaùchteábaøodöïavaøomarkerbeàmaët:
laø nhöõng
-Bao phuû beà maët moãi teá baøo trong cô theå protein ñaëc bieät goïi laø receptor.
-Receptor coù khaû naêng lieân keát hay ñính moät caùch ñaëc hieäu vôùi nhöõng phaân töû tín hieäu.
-Coù raát nhieàu receptor, chuùng khaùc nhau ôû caáu truùc vaø aùi löïc vôùi nhöõng phaân töû tín hieäu.
-Bình thöôøng, teá baøo söû duïng nhöõng receptor vaø nhöõng phaân töû tín hieäu nhö laø caùch ñeå truyeàn ñaït thoâng tin vôùi nhöõng teá baøo khaùc, vaø tieán haønh nhöõng chöùc naêng rieâng cuûa chuùng trong cô theå.
-Trong phöông phaùp naøy, nhöõng receptor beà maët teá baøo ñoùng vai troø laø marker cuûa noù.
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 37
Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 38
Nuôi cấy mảnh mô
Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi
Mảnh mô nổi
Cố định mảnh mô
Mảnh mô sống
Thành công
vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 39
Lammel
Huyết thanh
Phương pháp cố định mảnh mô
Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi
vbngoc@hcmus.edu.vn
4/27/20
40
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 41
NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú)
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 42
Nuôi cấy
Sau khi cố định mảnh mô, bổ sung môi trường nuôi cấy
(1) Ly tâm thu tế bào đơn (2) Tái huyền phù trong môi trường nuôi (3) Cho vào bình nuôi cấy
(1)ủ trong tủ nuôi cấy, 370C (2) môi Thay trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 43
Thu nhận mô dạng lỏng – thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 44
Thu nhận mô dạng lỏng – thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột
TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TUỶ XƯƠNG
TẾ BÀO ĐÃ QUA NUÔI CẤY
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 45
NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 46
Quan sát tế bào
Kính hiển vi
Sự đổi màu môi trường nuôi tế bào
- Đánh giá sức khoẻ tế bào - Hình thái tế bào - Định danh tế bào - …..
4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 47
4/15/21 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 48
