TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ THỦY SẢN TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
NGUYỄN HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG TRÀ VINH - 2010
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
LỜI CẢM TẠ
Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Khoa Nông nghiệp và Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh và Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Phòng Khoa học công nghệ và đào tạo sau đại học, Ban lãnh đạo Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, Trung tâm Thí nghiệm, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu.
Thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để thực hiện và hoàn chỉnh nội dung nghiên cứu.
Qúy Thầy, Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học và các Cán bộ phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm, bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện đề tài.
Quý Thầy, Cô trong Hội đồng báo cáo nghiệm thu đề tài, đặc biệt là Giáo viên phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến quí báo để nghiên cứu được hoàn chỉnh.
Cảm ơn quý Thầy, Cô Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch đã đóng góp ý kiến, thảo luận và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm.
Xin chân thành cảm ơn!
Trà vinh, ngày 4 tháng 09 năm 2010
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch i
Nguyễn Hoàng Anh
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
TÓM TẮT
Ở Việt Nam, rượu nếp chủ yếu sản xuất theo lối thủ công với chất lượng sản phẩm không ổn định. Đến nay, phương pháp truyền thống vẫn là phương pháp chủ yếu để sản xuất rượu mặc dù vẫn còn giới hạn do thời gian sản xuất kéo dài, khó kiểm soát chất lượng của sản phẩm cuối. Trong nghiên cứu: “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” được thực hiện để cải thiện công nghệ sản xuất rượu nếp, nâng cao chất lượng sản phẩm, cũng như dễ dàng để kiểm soát dây chuyền chế biến đặc biệt là trong giai đoạn dịch hóa, đường hóa, thủy phân protein và lên men. Vì vậy, những ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme, tỉ lệ cơ chất và thời gian thủy phân đến hoạt tính các loại enzyme α- amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột để tạo ra đường khử và papain hoặc bromelain thủy phân protein để tăng thêm acid amin tự do cho nấm men phát triển sinh khối và chuyển hóa thành rượu làm tăng hiệu suất lên men trong quy trình sản xuất đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xác định điều kiện tối ưu cho 4 loại enzyme trên với nguyên liệu nếp trắng khi sử dụng α-amylase 0,3%, 31 phút tại pH 6,5, nhiệt độ 870C để thủy phân tinh bột nếp, nồng độ đường khử thu được khoảng 6,46% và khi sử dụng tiếp glucoamylase 0,6%, 39 phút ở nhiệt độ 610C, pH 4,0 hàm lượng đường khử sinh ra lên đến 16,10%. Tiếp theo sử dụng papain với nồng độ 0,35%, thời gian thủy phân 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C thu được hàm lượng nitơ amin 0,081%, cùng các thông số động học Vmax= 0,1065 ± 0,0036; km= 4,7822 ± 0,7705 hoặc bromelain nồng độ là 0,5%, 55 phút tại pH 5,7, nhiệt độ 550C lượng nitơ amin thu được 0,054 % cùng các thông số động học Vmax= 0,0622 ± 0,0013; km= 3,5652 ± 0,4280. Dịch nếp sau khi thủy phân được lọc, điều chỉnh pH 4,9 và lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,2%, sản phẩm rượu vang được so sánh rượu lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc. Kết quả chỉ ra rằng việc ứng dụng các enzyme thủy phân tinh bột, protein và nấm men thuần chủng trong quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng có thể giảm thời gian lên men chính còn 6 ngày, tăng độ rượu tạo thành đến 12,6% và sẽ đảm bảo các chỉ tiêu hóa lí, vi sinh theo TCVN 7045: 2009, từng bước cải thiện quy trình sản xuất truyền thống theo phương pháp cổ truyền, có thể sản xuất công nghiệp tạo ra rượu đạt chất lượng cảm quan cao và đảm bảo an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm.
Từ khóa: rượu vang nếp, α–amylase, glucoamylase, dịch hóa, đường hóa, papain, bromelain, saccharomyces cerevisiae, bánh men thuốc bắc, lên men rượu.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch ii
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
ABSTRACT
starch
In Vietnam, glutinous rice wine has mainly manufactured by manual work and the quality is not settled. Up to now, traditional method is still the main method to produce rice wine even though they have a limitation due to taking time for production, difficult to control the quality of final product. In this study: “The improvement of white glutinous rice wine production using hydrolysis enzymes and purebred yeast” was used to improving technological production line of glutinous rice wine, make the quality of product better as well as make easy to control processing line especially during liquefaction, saccharification, protein hydrolysis and alcoholic fermentation stage. Therefore, the effect of pH, temperature, enzyme concentration, substrate ratio and the time of activation on the activity of four kinds of to make commercial enzyme α-amylase, glucoamylase hydrolyze transformation of glucose and papain or bromelain hydrolyze protein to increases the content of amin acid for the yeast to develop biomass and transform into wine, to increase the fermentation performance of glutinous rice wine were done. The results showed that optimum conditions four kinds of enzyme were studied directly to white glutinous rice material established. When using α-amylase 0.3%, 31 minutes at pH 6.5 and 870C to hydrolyze raw material glutinous rice starch, transformation of glucose was established about 6.46%, and when using glucoamylase 0.6%, 39 minutes at pH 4.0 and 610C directly to glutinous rice material, transformation of glucose was produced upto 16.10 %. Next, using papain to hydrolyze protein of glutinous rice raw material with 0.35% concentration, hydrolysis time 45 minutes at pH 5.9, temperature 500C, nitrogen amin produced content 0.081%, kinetic parameters of papain on glutinous rice starch was Vmax= 0.1065 ± 0.0036; km= 4.7822 ± 0.7705 or using bromelain with 0.5%, 55 minutes at pH 5.7 and 550C, nitrogen amin produced 0.054%, kinetic parameters of bromelain with substrate as protein of glutinous rice was calculated as Vmax= 0.0622 ± 0.0013; km= 3.5652 ± 0.4280. Finally, glutinous rice solution after hydrolysis, filter, adjustment of pH 4.9 are fermented with yeast Saccharomyces cerevisiae 0.2%, wine product fermented compared to product is wine fermented in a traditional method using alcoholic starter. Results indicated that the application of α-amylase, glucoamylase, bromelain and purebred yeast of glutinous rice wine making can reduce the time for alcohol fermentation shorter 6 days, higher alcohol level up to 12.6% and will ensure physical-chemical and microorganism standard criteria TCVN7045: 2009, step by step improving traditional glutinous rice wine production for industrial production and high-quality sensory produce, hygienic and safe.
Keyword: glutinous rice wine, α-amylase, glucoamylase, liquefaction, saccharification, papain, bromelain, alcoholic starter, Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch iii
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................... i
TÓM TẮT .................................................................................................... ii
ABSTRACT ............................................................................................... iii
MỤC LỤC ................................................................................................... iv
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................. xi
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ......................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 1
1.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................... 3
2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu ............................................................. 3
2.2 Enzyme amylase ......................................................................................... 4
2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)............................................................ 4
2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3) ...................................................... 7
2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase ............................................................... 8
2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2) .................................................................. 13
2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain ................................................................ 13
2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain .............................................................. 13
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain .......................... 14
2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32) .......................................................... 16
2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain ............................................................ 16
2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain ................................................................ 17
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain ..................... 17
2.5 Nấm men ................................................................................................... 18
2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men.................................................. 18
2.5.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men ......................................... 19
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch iv
2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang ...................................... 19
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
2.6 Bánh men thuốc bắc ................................................................................. 21
2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp ............................. 22
2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột .................................................................... 22
2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp .......................... 23
2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp ............................... 23
2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu .................................................... 24
2.7.5 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu ......................................... 25
2.7.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu ............................................... 25
2.7.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu ............................. 26
2.8 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men
rượu 27
2.8.1 Sự tạo thành methalnol ...................................................................... 28
2.8.2 Sự tạo thành aldehyde ........................................................................ 28
2.8.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao .......................................................... 28
2.8.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ ............................................................. 29
2.8.5 Sự tạo thành các ester ........................................................................ 29
2.8.6 Sự tạo thành furfurol ........................................................................... 29
2.9 Quy trình sản xuất rượu vang nếp ......................................................... 30
2.9.1 Sơ đồ quy trình .................................................................................... 30
2.9.2 Thuyết minh quy trình ......................................................................... 31
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 32
3.1.1 Thời gian và địa điểm ......................................................................... 32
3.1.2 Nguyên vật liệu ................................................................................... 32
3.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 32
3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................ 32
3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 34
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu ......................................................................... 34
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch v
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 34
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
3.2.3 Phương pháp phân tích ....................................................................... 34
3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm ................................................................. 35
3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá
trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng. ........................................ 35
3.3.1.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp. ..................................................... 35
3.3.1.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp. ............................................................................ 36
3.3.1.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. ....................................... 37
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong
quá trình đường hóa dịch nếp trắng. ................................................................... 37
3.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp. .............................................................. 37
3.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme
glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng. .......................................... 38
3.3.2.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân. .................................. 39
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase. .................................................................................................. 39
3.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ..................................................... 40
3.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp. .......................................................................... 40
3.3.3.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ................................ 41
3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase. .................................................................................................. 42
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch vi
3.3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp................................................. 42
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
3.3.4.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein nếp. ...................................................................... 42
3.3.4.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp. ........................... 43
3.3.5 Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. ................ 44
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 46
4.1 Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng .............................................. 46
4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình
dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng. ............................................ 46
4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp trắng. ...................................................................... 46
4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp. ........................................................................................................ 49
4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của
enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. ..................................................... 51
4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình
đường hóa dịch nếp trắng. ................................................................................ 52
4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase
trong thủy phân dịch nếp trắng. ........................................................................... 53
4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian
thủy phân dịch nếp trắng. .................................................................................... 55
4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của
enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân ................................................ 57
4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase và glucoamylase. ................................................................................................. 58
4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ................................................................................. 59
4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch vii
phân protein nếp. ................................................................................................. 60
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp ................................................................. 62
4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase .................................................................................................. 64
4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp ........................................................................... 64
4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein dịch nếp. ......................................................................................... 66
4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme
bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp ............................................... 68
4.6 Kết quả theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. ......... 70
4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp. .............................................................................................................. 71
4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp. ...................................................................................... 72
4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men
chính của các loại rượu nếp................................................................................. 74
4.6.4 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp. .............................................................................................................. 75
4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men
chính của các loại rượu nếp................................................................................. 77
4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp .......................................................................................... 79
4.6.7 Kết quả định tính fufurol trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp ........................................................................................................ 80
4.6.8 Kết quả theo dõi chất lượng sản phẩm rượu nếp trong thời gian ổn định 3 tháng. ................................................................................................... 80
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch viii
4.6.9 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang nếp ........................................................................................................................ 82
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.6.10 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009 ....................................................................................... 83
4.6.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu sử dụng
bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009 ....................................................................................... 84
CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THỰC TẾ NGHIÊN CỨU, KHẢ NĂNG
ỨNG DỤNG VÀ ĐỊA CHỈ ÁP DỤNG, GIÁ THÀNH SẢN PHẨM ... 85
5. 1 Thực tế nghiên cứu so với bố trí thí nghiệm theo thuyết minh
phê duyệt ............................................................................................................. 85
5. 2 Khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng ................................................ 86
5.3 Hạch toán giá thành 1 lít rượu vang nếp sản xuất ở quy mô
phòng thí nghiệm ................................................................................................ 86
6.1 Kết luận ..................................................................................................... 87
6.2 Đề nghị ...................................................................................................... 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 90
PHỤ LỤC ..................................................................................................... I
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU Ở TRUNG TÂM PHÂN
TÍCH THÍ NGHIỆM, SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ, TP.HCM.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch ix
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
DANH SÁCH KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam
HTX: Hợp tác xã
DNTN SXTM: Doanh nghiệp tư nhân sản xuất thương mại
TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh
Sở KH&CN: Sở Khoa Học và Công Nghệ
w/w (weight/weight): tỉ lệ khối lượng trên khối lượng
w/v (weight/volume): tỉ lệ khối lượng trên thể tích
v/v (volume/volume): tỉ lệ thể tích trên thể tích
KPH: Không phát hiện
TB: Rượu nếp sử dụng bánh men thuốc bắc để lên men
ĐC: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase và bổ sung nấm men thuần chủng để lên men
PA: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase, papain và bổ sung nấm men thuần chủng để lên men
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch x
BR: Rượu nếp sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase, bromelain và bổ sung nấm men thuần chủng để lên men
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nếp trắng ............................................................. 3
Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau ................... 5
Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau ..... 5
Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men .................................................. 19
Bảng 2.5 Tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống ..................................................... 22
Bảng 4.1 Thành phần chính của nguyên liệu nếp trắng ............................................ 46
Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng enzyme α-amylase ....................................... 47
Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân tinh bột nếp đến lượng đường khử tạo thành .................................................................... 49
Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase ........................................................... 51
Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme glucoamylase ....................................................... 53
Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra ............................................................. 55
Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase ................................................................ 57
Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain ...................................... 59
Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng ............................... 61
Bảng 4.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính enzyme papain ............................................................................................................ 63
Bảng 4.11 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein bằng enzyme papain. .................................................................... 64
Bảng 4.12 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain ....................................................... 65
Bảng 4.13 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng ........................ 67
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xi
Bảng 4.14 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính của
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
enzyme bromelain ...................................................................................................... 69
Bảng 4.15 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein bằng enzyme bromelain................................................................ 70
Bảng 4.16 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại rượu ............................................................................................................................. 71
Bảng 4.17 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính của các loại rượu............................................................................................... 73
Bảng 4.18 Kết quả thay đổi độ rượu trong quá trình lên men chính của các loại rượu ............................................................................................................................. 74
Bảng 4.19 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu ... 76
Bảng 4.20 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của các loại rượu ............................................................................................................... 78
Bảng 4.21 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu ............................................................................................................... 79
Bảng 4.22 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 1 tháng ...... 81
Bảng 4.23 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 2 tháng ...... 81
Bảng 4.24 Chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau 3 tháng ...... 82
Bảng 4.25 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của các sản phẩm rượu vang nếp (TCVN 3217-79) ................................................................................................. 82
Bảng 4.26 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí trong sản phẩm rượu TB và BR so với TCVN7045: 2009 ............................................................................................ 83
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xii
Bảng 4.27 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong sản phẩm rượu TB và BR so với TCVN7045: 2009 ................................................................................................. 84
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Hạt nếp trắng ................................................................................................ 3
Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột ......................... 4
Hình 2.3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase ............................................... 6
Hình 2.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylpectin ..................... 6
Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme glucoamylase .......................................... 7
Hình 2.6 Tác dụng của glucoamylase lên phân tử tinh bột ........................................ 7
Hình 2.7 Đồ thị Michaelis-Menten ............................................................................. 10
Hình 2.8 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase ....... 10
Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme amylase ...................... 11
Hình 2.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase ............................. 11
Hình 2.11 Cấu trúc không gian của enzyme papain ................................................... 13
Hình 2.12 Cấu trúc không gian của enzyme bromelain ............................................. 16
Hình 2.13 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men ........................... 19
Hình 2.14 Nấm men Saccharomyces cerevisae .......................................................... 20
Hình 2.15 Men thuốc bắc Hải Anh Quang ................................................................. 22
Hình 2.16 Quá trình trao đổi chất tế bào nấm men phụ thuộc hiện diện Oxy có thể hô hấp hiếu khí hoặc lên men yếm khí ................................................................. 24
Hình 2.17 Sơ đồ đường phân trong tế bào nấm men .................................................. 26
Hình 2.18 Sơ đồ tổng quát của quá trình hình thành sản phẩm phụ ........................... 28
Hình 2.19 Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến 4 loại rượu vang nếp ............................. 30
Hình 3.1 Máy nghiền nguyên liệu .............................................................................. 33
Hình 3.2 Máy đo pH ................................................................................................... 33
Hình 3.3 Cân phân tích ............................................................................................... 33
Hình 3.4 Chiết quang kế ............................................................................................. 33
Hình 3.5 Chuẩn độ đường ........................................................................................... 33
Hình 3.6 Nấm men ...................................................................................................... 33
Hình 3.7 Nếp trắng ...................................................................................................... 33
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xiii
Hình 3.8 Water bath ................................................................................................... 33
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Hình 3.9 Máy chuẩn độ điện thế ................................................................................. 33
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bột nếp bằng enzyme α-amylase ................................... 47
Hình 4.2 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành .................................................................................. 49
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp đến lượng đường khử tạo thành ..................................................... 50
Hình 4.4 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase và thời gian thủy phân đến lượng đường khử tạo thành ........................ 51
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase ...................................................... 52
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase ................ 54
Hình 4.7 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase ....................................................................................................... 55
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thuỷ phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra ............................................... 56
Hình 4.9 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành 57
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân với enzyme glucoamylase ......................................................... 58
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp bằng enzyme papain.................. 59
Hình 4.12 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme papain. . 60
Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian đến hàm lượng nitơ amin tạo khi thủy phân protein dịch nếp trắng ............ 61
Hình 4.14 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành . 62
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xiv
Hình 4.15 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp sử dụng đến hoạt tính enzyme papain ...................................................................... 63
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain ..................................... 65
Hình 4.17 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp với bromelain. ..... 66
Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp trắng ...... 67
Hình 4.19 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến lượng nitơ amin sinh ra. ................................. 68
Hình 4.20 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp đến hoạt tính bromelain ..................................................................................................... 69
Hình 4.21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men chính của các loại ruợu ......................................................................................................... 72
Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo thời gian lên men chính của các loại ruợu ................................................................................. 73
Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính của các loại rượu ......................................................................................................... 75
Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian lên men chính của các loại rượu................................................................................................................ 77
Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi acid tổng theo thời gian lên men chính của các loại rượu ......................................................................................................... 78
Hình 4.26 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi ester theo thời gian lên men chính của các loại rượu................................................................................................................ 80
Hình 4.27 Các sản phẩm rượu vang nếp trắng .......................................................... 84
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch xv
Hình 5.1 Quy trình sản xuất 4 loại rượu vang nếp trắng ............................................ 86
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Rượu vang là loại thức uống được lên men từ nhiều nguồn liệu: nho, khóm, chuối, nếp… mang đậm đà bản sắc văn hóa dân tộc của từng địa phương. Từ xưa đến nay, rượu thường xuất hiện trong các lễ hội, đình đám, các cuộc gặp gỡ của người thân, bạn bè. Rượu được sử dụng với nhiều mục đích ý nghĩa khác nhau như để chúc mừng, nâng cao sức khỏe hay để giải bày tâm sự… Rượu trở thành một trong những thức uống không thể thiếu trong văn hóa ẩm thực cũng như trong đời sống hằng ngày.
Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt quy trình sản xuất, hiện nay ở các nước trong khu vực đã nghiên cứu, cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền và được áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc, rượu Shochu ở Hàn Quốc. Ở Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng từ: rượu nho, rượu Cần ở các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu nếp của người Kinh, nhiều địa phương đã sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu Làng Vân ở miền Bắc và rượu Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng. Trong các loại rượu cổ truyền kể trên thì rượu nếp là một loại khá đặc biệt, sản phẩm là kết quả của quá trình lên men từ những hạt nếp mà thành.
Tuy nhiên, phương pháp sản xuất rượu ở một số địa phương vẫn còn theo phương pháp cổ truyền, tức là quá trình đường hóa và lên men được thực hiện bởi nấm mốc và nấm men trong bánh men thuốc bắc và thiết bị sản xuất thô sơ, nên năng suất chưa cao và chất lượng chưa an toàn vì chứa nhiều độc tố, tạp chất ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, để nâng cao hơn nữa chất lượng sản phẩm truyền thống này chúng tôi đề ra quy trình sản xuất rượu theo phương pháp mới, thông qua kết hợp hài hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại. Với việc ứng dụng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hóa, thủy phân protein và lên men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như ổn định được chi phí sản xuất, đảm bảo chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm rượu vang nếp.
Từ những lý do trên việc nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” có ý nghĩa rất quan trọng.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 1
Xây dựng qui trình sản xuất rượu nếp sạch theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm TCVN 7045: 2009.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Cải thiện quy trình sản xuất rượu nếp truyền thống theo phương pháp cổ truyền có thể sản xuất công nghiệp và cho ra sản phẩm chất lượng cao và an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Từ những mục tiêu trên, đề tài tiến hành các khảo sát sau:
- Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần hồ tinh bột nếp trắng.
- Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.
- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng.
- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng.
- Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.
- Đánh giá chất lượng sản phẩm (cảm quan, hóa lí và vi sinh vật)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 2
- Phân tích kết quả và tìm ra qui trình sản xuất tối ưu cho sản phẩm rượu vang nếp.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu
Tên khoa học của nếp là Oryza Sativa thuộc nhóm ngũ cốc, là loại nguyên liệu chứa tinh bột rất cao phù hợp với công nghệ lên men, trong đó nếp trắng với hàm lượng tinh bột lên đến hơn 70%, vì vậy nếp trắng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất rượu.
Hình 2.1 Hạt nếp trắng
Trong tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin, 2cấu tử này khác hẳn về tính chất hoá học và tính chất vật lý. Phân tử amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho m àu tím đỏ, amylose và amylopectin cũng khác nhau về tính hoà tan, amylose dễ hoà tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao. Trong phân tử tinh bột tỉ lệ giữa amylose và amylopectin thay đổi tuỳ thuộc vào nguồn nguyên liệu, trong hạt gạo chủ yếu là amylose, còn trong hạt nếp là amylopectin.
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu nếp trắng
Thành phần
Hàm lượng (%)
Nước
14,0
Protein
8,2
Lipid
1,5
Glucid
74,9
Acid hữu cơ
0,6
Tro
0,8
(Nguyễn Đức Lượng, 2003)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 3
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
+ Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh.
+ Amylopectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo thành mạch phân nhánh.
2.2 Enzyme amylase
Enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác, amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các polysaccharides. Enzyme amylase sẽ thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin mạch dài thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn.
Dựa vào đặc tính và cơ chế tác dụng lên phân tử tinh bột của enzyme amylase, người ta phân biệt chia enzyme amylase thành hai nhóm:
- Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử mạch nhánh.
- Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm có β-amylase, γ-amylase (glucoamylase).
Hình 2.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột
2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 4
Đặc tính: Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn sản
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
xuất có thành phần amino acid khác nhau. Điều kiện hoạt động và độ bền của các enzyme α-amylase tùy thuộc vào nguồn chiết suất.
Bảng 2.2 Điều kiện hoạt động của enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau
Nguồn gốc
pH tối thích
Nhiệt độ tối thích (0C)
Malt
5,5 ÷ 5,7
72 ÷ 75
Vi khuẩn
5,0 ÷ 6,0
50 ÷ 60
Nấm mốc
6,0 ÷ 7,0
60 ÷ 70
(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)
Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase, đồng thời nó còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein, nếu α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion đơn hóa trị như: Cl- > Br- > I-. Đồng thời chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+ (Shahina Naz, 2002).
Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền ở môi trường nhiệt
Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau
Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu)
Nhiệt độ (0C)
Nấm mốc
Vi khuẩn
Malt
65
100
100
100
70
100
52
100
75
58
3
100
80
25
-
92
85
1
-
58
90
-
-
52
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 5
* Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội phân (endo).
Hình 2.3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase
Giai đoạn dextrin hóa (dịch hóa): Dưới tác dụng của α-amylase, phân tử amylose bị phân cắt thành các oligosaccharides (6 ÷7 gốc glucose), độ nhớt của hồ tinh bột rất giảm nhanh.
Giai đoạn đường hóa: Các oligosaccharides lại tiếp tục bị phân cắt tạo thành maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân α- amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của enzyme α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19% glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không cắt được liên kết 1, 6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.
Hình 2.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylopectin
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 6
Đề tài nghiên cứu sẽ đề cập đến việc sử dụng Chế phẩm enzyme Termamyl 120L: ở dạng lỏng, chứa enzyme có khả năng chịu nhiệt ổn định α-amylase, được sản xuất từ một chủng loại vi sinh vật chọn lọc tên là Bacillus licheniformis. Enzyme α-amylase nội bào phân cắt các liên kết α-1, 4-glucoside nằm ở bên trong phân tử cho ra dextrin và các oligosaccharides.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Trong dịch tinh bột hòa tan Termamyl 120L có hoạt tính 120 KNU/g (Kilo Novo α- amylase unit). Hoạt tính có thể bị hủy bằng xử lý nhiệt dung dịch ở pH thấp. Sản phẩm này không dễ bắt lửa, tan hoàn toàn trong nước và an toàn khi sử dụng theo như chỉ dẫn, sản phẩm Termamyl 120L có thể gây dị ứng đối với người nhạy cảm (Novo Nordisk, 2007).
2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3)
là một exoamylase, còn được gọi là γ-amylase
Đặc tính: Glucoamylase amyloglucosidae, có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột (Shahina Naz, 2002).
So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của ethylic, acetone, không bền với ion Cu2+, Hg2+… Glucoamylase có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn, hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5.
Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin
Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharides, là enzyme ngoại phân (exo enzyme). Enzyme glucoamylase thủy phân polysaccharides từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một nhưng không thủy phân được các dextrin vòng (Lý Nguyễn Bình, 1997).
Hình 2.5 Cấu trúc không gian của enzyme glucoamylase
Amylose
Amylopectin
Khi phân cắt phân tử tinh bột, cùng với việc tạo thành phân tử glucose còn có thể tạo thành oligosaccharides, ngoài ra γ-amylase có thể phân cắt cả liên kết α-1,2 và 1,3 glycoside (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Hình 2.6 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 7
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Đề tài nghiên cứu sử dụng chế phẩm AMG 300L: AMG–Amyloglucosidase Novo là một exo–D–glucosidase–1,4–alpha được sản xuất từ một chủng vi sinh vật tên là Aspergillus niger bằng sự lên men chìm. Tên theo hệ thống là 1,4 alpha–D–glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.3). Enzyme này thủy phân các cầu nối α-1,4 và α-1,6 trong tinh bột.
Trong khi thủy phân, các đơn vị glucose bị tách rời theo thứ tự từ đầu không khử của phân tử cơ chất nền. Mức độ thủy phân phụ thuộc vào mối nối cũng như chiều dài chuỗi các mối nối 1,4 alpha dễ dàng bị thủy phân hơn các mối nối 1,6 alpha, trong khi maltotriose và đặc biệt maltose bị thủy phân ở mức độ thấp hơn các phân tử lớn của oligosaccharides. Sản phẩm AMG đều không nhiễm hoạt tính transglucosidase bằng cách chuyển các phân tử của glucose từ vị trí 1,4 alpha qua 1,6 alpha.
Chế phẩm lỏng là những chế phẩm màu nâu, có độ đặc chung 1,2g/ml. Khi AMG tồn trữ ở nhiệt độ 250C hoạt tính phổ biến được duy trì trong 6 tháng, khi bảo quản ở 50C, sản phẩm sẽ giữ lại hoạt tính phổ biến ít nhất 1 năm. Hoạt tính có thể bị hủy bằng cách đun dung dịch chứa enzyme đến 800C trong 5 phút hoặc đến 750C trong khoảng 40 phút (Novo Nordisk, 2007).
2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase
Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Các chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase, để xác định hoạt độ của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:
- Đo sự biến thiên độ nhớt của dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch giảm dần.
- Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod
- Đo lượng maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất.
- Hoạt độ của α-amylase dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong chế phẩm tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của α-amylase là lượng enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 8
- Hoạt độ của glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến glucose. Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 300C và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucose oxydase).
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase
- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng: khi có lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme, có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ enzyme bằng biểu thức: v = k[E].
Trong đó v: vận tốc phản ứng
k: hằng số tốc độ phản ứng
[E]: nồng độ enzyme sử dụng
Nồng độ của enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều, tuy nhiên khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng bị chậm lại.
- Ảnh hưởng của cơ chất: cơ chất của enzyme amylase là tinh bột, thuộc nhóm carbohydrate thực vật có chủ yếu trong các loại ngũ cốc như: gạo tẻ, gạo nếp, ngô, trong các loại củ: khoai lang, khoai mì (sắn)… Công thức tổng quát của tinh bột là (C6H11O5)n. Tinh bột được cấu tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin.
Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 850C. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian dextrin, sau đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và glucose
Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành phần amylose và amylopectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Phản ứng khi có enzyme xảy ra theo ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.
Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.
K1
K3
Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do, hiện tượng này được xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất.
K2
E + S ES P + E (1)
Trong đó:
K1: Hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES
K2: Hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại cơ chất ban đầu và enzyme
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 9
K3: Hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
E: Enzyme
S: Cơ chất
P: Sản phẩm
ES: phức hợp trung gian enzyme-cơ chất.
Vận tốc phản ứng tỷ lệ với nồng độ phức hợp ES, nồng độ ES càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn. Sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất theo chiều hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian thuỷ phân của amylase.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng được biểu diễn theo phương trình Michaelis-Menten như sau:
V =
Trong đó V: vận tốc phản ứng (hoạt tính enzyme)
km: hằng số Michaelis-Menten (hằng số nhạy cảm enzyme với cơ chất)
Vmax: vận tốc phản ứng cực đại (hoạt tính cực đại của enzyme)
[S]: nồng độ cơ chất
Đồ thị Michaelis-Menten có dạng nhánh hyperbol vuông góc, với V là hàm số của [S]
V
Vmax
Vmax
[S] 0 km
Hình 2.7 Đồ thị Michaelis-Menten
) t ú h p ( n â h p y ủ h t n a i g
Nồng độ cơ chất (%)
i ờ h T
Hình 2.8 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 10
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
-Ảnh hưởng của nhiệt độ: cũng như các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng khi đến nhiệt độ nhất định, vượt qua nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng bị giảm và enzyme có thể bị vô hoạt. Nhiệt độ vô hoạt tùy thuộc vào loại và nguồn chiết xuất do enzyme amylase có bản chất là protein nên nó kém bền với nhiệt.
e m y z n e a ủ c h n í t t a ọ H
Nhiệt độ (oC)
Hình 2.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme amylase
Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, mỗi loại enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng, nhiệt độ tối thích của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt các ion kim loại, pH và chất bảo vệ. Thông thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng theo yêu cầu của chế biến.
- Ảnh hưởng của pH: enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường, do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp enzyme–cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme.
Mỗi loại enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích, đa số pH của enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ một ít enzyme có pH tối thích nằm trong vùng acid hay kiềm mạnh
e m y z n e h n
í t t a ọ H
pH tối thích
Hình 2.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 11
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Thay đổi pH tối ưu sẽ làm giảm hoạt tính enzyme vì thay đổi sự ion hóa các nhóm tại trung tâm hoạt động, các biến đổi lớn của pH làm biến tính protein của enzyme, do sự can thiệp vào liên kết phi cộng hóa trị yếu giữ vai trò ổn định cấu trúc không gian. Tốc độ phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó giảm dần. Đa số các enzyme bền trong giới hạn pH từ 5,0 ÷ 9,0 và độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như Ca2+,… (Lê Ngọc Tú et al…, 2005).
- Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động mạnh, chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt độ enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp.
Chất hoạt hóa thực: ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của enzyme. Nhiều enzyme được hoạt hóa bởi các ion Na+, K+, Mg2+, Zn2+, Mn2+…
Chất chống kìm hãm: là chất có khả năng làm mất tác dụng kìm hãm của các chất khác, như CN- có thể làm mất tác dụng kìm hãm của muối đồng đến enzyme urease.
Chất tác nhân bảo vệ: là các chất có tác dụng bảo vệ các nhóm chức hoạt động của các trung tâm hoạt động enzyme. Ví dụ như cystein có tác dụng bảo vệ các nhóm thiol của các tâm hoạt động của nhiều enzyme.
Chất hoạt hóa tiền enzyme: như enterokinase của dịch ruột có khả năng chuyển trypsinogen không hoạt động thành trypsin hoạt động (Đặng Thị Thu et al…, 2003).
Khả năng làm tăng hoạt tính của các chất này có một giới hạn nhất định, vượt quá giới hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
- Ảnh hưởng của chất kìm hãm: Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme, các chất kìm hãm có thể là ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein... các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch và không thuận nghịch. Trong chất kìm hãm thuận nghịch, ta có thể phân biệt hai dạng kìm hãm cạnh tranh và không cạnh tranh.
Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối, trong trường hợp này chất kìm hãm có cấu tạo tương tự cơ chất thật, nó kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme làm giảm hiệu lực xúc tác của enzyme.
Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme làm giảm hoạt động xúc tác của nó dẫn đến giảm tốc độ phản ứng.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 12
Kìm hãm bởi sản phẩm phản ứng: các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể tạo thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu:
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
S1 + S2 P1 + P2
Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có áp lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2 (Lê Ngọc Tú et al…, 2005)
Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng:
E + S ES E + P
Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này coi như chất kìm hãm.
ES + S ESS
Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu2+, Ag+.
2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2)
2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain
Enzyme papain dạng bột màu vàng nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan trong H2O hay glycerine.
Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các acid amin là: Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Hình 2.11 Cấu trúc không gian của enzyme papain
2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 13
Papain là một chất endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S. Papain là một protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L. Smith, papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 ÷ 8,0. Nhiệt độ tối thích để hoạt động tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 600C. Một điều cần lưu ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain.
So với các protease có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là endopeptidase vừa là exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành peptide
R R R R
(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (-NH-CH-COOH)i + (NH2-CH-CO-)k
Trong đó: i + k = n
Các exopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành acid amin
R R R R
(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH) (H2N-CH-COOH)i’ + (H2N-CH-COOH)k’
Trong đó: i’ + k’ = n
Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với protein và với glutamic acid có nhóm carboxyl tự do.
Thông tin về enzyme papain sử dụng trong nghiên cứu đề tài: Enzyme papain được chiết suất từ đu đủ, là một protease cysteine thủy phân được peptide, amides và ester, đặc biệt là liên kết các acid cơ bản, glycine hay leucine. Chất ức chế bao gồm Leupeptin và PMSF, có khoảng pH tối ưu 6,0 ÷ 7,0 và pI 8,75.
Enzyme papain thương mại dạng bột màu vàng nâu có khối lượng phân tử 21.000, hoạt tính >30.000 USP units/mg trên cơ chất casein, ở pH 6,0 và nhiệt độ 400C, ngoài ra còn thể hiện hoạt tính ở đơn vị khác như: 1 MCU (milk clotting unit)= 9 HDU (hemoglobin digestion units)= 6 GU (gelatin units)= 30 USP units.
Độ hòa tan dung dịch nước đệm (1mg/ml H2O ở 250C), lưu trữ 20C đến 80C, dạng hòa tan có thể ổn định cho đến 2 tháng ở nhiệt độ -200C
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 14
- Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,50C và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 1000C thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúc tâm hoạt động của enzym bị phá hủy hoàn toàn.
Đáng chú ý khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt độ thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, bởi lẽ trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó, papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, enzyme mất hoạt tính của nó mỗi ngày 1÷ 2% do sự tự phân hoặc oxy hóa.
Khi thủy phân protein tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ tối ưu cho papain cũng khác nhau, đối với cơ chất casein topt là 37oC, papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2h mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.
- pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 ÷ 8,2 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH >12, khi phản ứng với các cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 ÷ 7,5 với albumin ở pH tối ưu 4,5 ÷ 7,1 và với gelatin lại có pH tối ưu 5,2 ÷ 6,4, điểm đẳng điện pI = 9.
Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có thể chịu được các pH=1,5 và pH= 8,5 trong 90 phút. Người ta nhận thấy rằng, sự thay đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme-cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
- Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% và cũng không thay đổi độ nhớt trong methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh: TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain.
- Chất hoạt hóa: Papain cần nhóm sulfhyryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Chất hoạt hóa có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay papain nói riêng. Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm nhóm cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain là các chất có tính khử như: cysteine, glutation, acid hydrocyanic, hydrogensulfite... trong đó cysteine là chất thường được sử dụng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi làm tăng hoạt tính papain.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 15
Để thu được papain hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò hoạt chất hóa papain còn EDTA đóng vai trò liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
- Chất kìm hãm: Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobenzoate, cystine và các hoạt chất disulfur khác. Đặc biệt papain rất dễ bị mất hoạt tính khi có mặt hydrogen peroxide, các chất này ức chế papain bằng phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, khi cysteine ở nồng độ thấp, các ion kim loại nặng: Cd+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Fe2+ và các tác nhân gây ức chế papain.
Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ hai kể từ đầu mạch C là chất ức chế cạnh tranh mạnh của papain do chiếm một phần trung tâm hoạt động.
Chế phẩm papain bảo quản vài tháng có độ hoạt động khoảng 30%, ngay cả khi hoạt hóa, lượng sulfuhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1 mol papain và thường không quá 0,5 mol/mol. Nguyên nhân do nhóm sulfuhydryl đã bị khóa bất thuận nghịch một phần và bản chất hóa học của hiện tượng này hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu hết.
2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32)
2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain
Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây khóm, chủ yếu là các protease cysteine, enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có chứa cysteine, đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là –SH (sulfuhydryl), phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amin thay đổi khác nhau, bromelain thân có khoảng 144÷321 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 161÷283 acid amin, Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở đầu carbonyl là glycine, bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine.
Hình 2.12 Cấu trúc không gian của enzyme bromelain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 16
Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31kDa, bromelain quả có điểm đẳng điện pI= 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
pI=9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985).
2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain
Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase. Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác, chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme-cơ chất, chúng tham gia vào nhiều biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển điện tích.
Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và amino acid
Thông tin về enzyme Bromelain sử dụng trong nghiên cứu đề tài: Bromelain được sử dụng để thủy phân protein, peptide, amides và ester của các axit amin. Bromelain được chiết xuất từ thân cây dứa
Enzyme bromelain thương mại dạng bột màu nâu, hoạt tính ≥ 2,0 mAnsonU/mg trên cơ chất là hemoglobine, ở pH 6,0 và nhiệt độ 35,5°C.
Độ hòa tan dung dịch nước đệm (50g/l H2O ở 20oC), lưu trữ ở nhiệt độ dưới 15°C.
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain
Giống như các chất xúc tác sinh học, bromelain chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: loại cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh chế… Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa.
- Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác nhau, nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain.
- Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme, enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 700C (Lê Ngọc Tú, 2004).
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 17
Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 ÷ 600C, nhiệt độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
không gian của nhóm -SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất, Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999).
Nhiệt độ phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.
Ở dịch chiết quả pH= 3,5 khi tăng nhiệt độ đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính. Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn, ở 50C, pH 4 ÷ 10 bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24 giờ; ở 550C, pH= 6,1 bromelain bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút, quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính.
- Ảnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme, hoạt tính enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH tối thích của bromelain không ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt. Enzyme bromelain đã tinh sạch chỉ còn lại 60÷70% hoạt tính, bromelain có biên độ pH rộng (3÷10) nhưng pH tối thích của enzyme là 5 ÷ 8 tùy thuộc vào cơ chất.
pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme do đó hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc thậm chí mất hẳn (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
- Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ của muối. Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelain do chúng kết hợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzyme.
2.5 Nấm men
2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 18
Nấm men có cấu tạo đơn bào, tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, elip, trứng… kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 8 ÷ 15µm.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 2.4 Thành phần hóa học của tế bào nấm men
STT Thành phần Hàm lượng (%) STT Thành phần
Hàm lượng (%)
1
Carbon
49,80
6
0,04
K2O
2
CaO
12,40
7
0,42
SO3
3 Nitro
6,70
8 MgO
0,38
4 Hydro
3,54
9
0,04
Fe2O3
5
2,34
10
SiO
0,09
P2O5
(Nguyễn Đức Lượng, 1996)
2.5.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men
Tế bào nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nẩy chồi, tế bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình này xảy ra sau 2 giờ qua các giai đoạn:
Giai đoạn tiền phát: tế bào nấm men làm quen với môi trường, sinh khối tăng nhiều.
Giai đoạn phát triển logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh của tế bào nấm men, tốc độ sinh khối của tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân. Trong giai đoạn này có sự thay đổi mạnh mẽ thành phần của dịch lên men.
Giai đoạn phát triển chậm dần: tốc độ sinh trưởng của tế bào nấm men chậm dần, thành phần dinh dưỡng trong môi trường dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều.
Giai đoạn ổn định: tế bào nấm men không tăng, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết.
Giai đoạn chết: tế bào nấm men giảm dần do tốc độ chết tăng, tốc độ sinh sản chậm.
Hình 2.13 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 19
2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Saccharomyces ellipsodues, Saccharomyces oriformis, chủng nấm men này có tốc độ lên men nhanh, tạo ra sản phẩm chứa 18 ÷ 20% ethanol, đặc trưng của nấm men vang là có hình elip hoặc elip kéo dài. Trong điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sản bằng cách nẩy chồi, trong điều kiện không thuận lợi chúng sinh sản bằng cách tạo bào tử.
Saccharomyces vini: trước đây người ta gọi là Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus, theo Lodder là Saccharomyces cerevisiae Hansen. Trong quá trình lên men nước quả, nấm men này sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon là đường, acid hữu cơ và các tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinzit, tiamin, piridoxin... Ngoài ra chúng còn có các đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp cho rượu vang có mùi đặc trưng riêng biệt. Nhiều loài nấm men này trong quá trình lên men rượu tạo được một lượng rượu chỉ đạt 8 ÷ 10% so với thể tích, ở giai đoạn cuối của quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong rượu, sau đó chúng thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh.
Saccharomyces oviformic: Nấm men này được tách từ nước nho tự lên men, có khả năng chịu được lượng đường và cồn cao, lên men kiệt đường và tạo ra lượng rượu tới 18 độ. Giống này lên men được glucose, fructose, manose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose và không lên men được lactose, pentose (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Loại nấm men thường được sử dụng sản xuất rượu vang nếp là Saccharomyces cerevisiae, loại này có khả năng lên men nhiều loại đường như glucose, fructose, saccharose, maltose, galactose từ nhiều loại nguyên liệu như gạo, nếp, ngô, sắn... Nấm men này có thể lên men tốt với lượng đường từ 12 ÷ 14% có khi từ 16 ÷ 18%, nồng độ rượu trong dịch lên men từ 10 ÷ 12%, nhiệt độ lên men thích hợp là 28 ÷ 320C.
Hình 2.14 Nấm men Saccharomyces cerevisae
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 20
Yêu cầu đối với nấm men rượu vang: Khả năng lên men cao, chịu được nhiệt độ, bền với ethanol và nồng độ đường cao.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Đặc điểm của lên men nổi là trong giai đoạn lên men chính chúng tạo trên bề mặt một lớp bọt tương đối dày, trạng thái này được duy trì cho đến khi lên men gần kết thúc, theo cấu trúc thì nấm men nổi thuộc dạng hạt, chúng ít liên kết nhau thành chuỗi. Đối với lên men nổi thì nhiệt độ lên men thích hợp ở 20 ÷ 280C.
Đặc điểm của lên men chìm chỉ phát triển ở lơ lửng và ở đáy môi trường, chúng không tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men xít, bám chắc ở đáy thùng, nhiệt độ thích hợp cho nấm men loại này là 5 ÷ 100C.
Đặc điểm nổi bật của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme α-galactosidase lên men hoàn toàn đường rafinose, còn nấm men nổi thì chỉ có một số ít chủng có khả năng chuyển hóa được 1/3 đường rifanose thành rượu và CO2.
Ngoài tính chất chung là nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành rượu và CO2 thì trong mỗi ngành sản xuất đều có những đòi hỏi đặc thù. Ví dụ: nấm men dùng trong sản xuất bia và rượu vang phải cho sản phẩm mùi đặc trưng thơm ngon; đồng thời phải lắng tốt và giúp cho dịch lên men nhanh chóng.
Các loài nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường có khoảng nhiệt độ thích hợp 18 ÷ 250C, ở 350C sinh sản của chúng bị ức chế, ở 400C sinh sản bị ngừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 160C sinh sản và lên men bị kéo dài. Các điều kiện lý hóa, thành phần và chất liệu dịch quả cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm men.
2.6 Bánh men thuốc bắc
Loại bánh men Hải Anh Quang có tính năng hòa men với nước ngâm trực tiếp vào cơm, là loại men rượu được sản xuất trên dây chuyền tiên tiến của DNTN SXTM Hải Anh Quang phân phối và cung cấp các đại lý trên toàn quốc.
Cách sử dụng: Một gói men nhỏ 100g dùng cho 10 kg (gạo, tấm, ngô) đã nấu chín để nguội hẳn. Dùng một gói men nhỏ hòa tan với 20 lít nước đựng trực tiếp trong lu, khạp. Bỏ cơm đã nguội hẳn vào lu, khạp đảo nhẹ rồi đậy kín. Ủ lên men ở nhiệt độ 280C đến 350C, sau khi ngâm được 24 giờ, đảo nhẹ đều lại lần nữa rồi đậy nắp kín ủ thêm 8 đến 10 ngày thì chưng cất. Rượu sẽ đạt từ 16 lít đến 18 lít rượu 450 (trước khi chưng cất rượu chan thêm 15 lít nước).
Thành phần men thuốc bắc: Gạo, lúa mạch, ngô, khoai mì, thuốc bắc, giống men (vi khuẩn, nấm men và nấm mốc), chất tạo xốp. Loại men này khi lên men chìm cơm, khi nấu không bao giờ bị khê, khét
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 21
Thời gian sử dụng: 6 tháng, bảo quản nơi khô ráo thoáng mát, tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 2.5 Tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống
Thành phần
Hàm lượng (%)
Độ ẩm
≤ 8
Glucid
≥ 80
Protein
≥ 8,5
≥ 107
Tổng tế bào nấm men
Nấm mốc độc hại
Không có
Hình 2.15 Men thuốc bắc Hải Anh Quang
2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp
2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột
Hồ hóa tinh bột nhằm mục đích giúp quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra dễ dàng hơn, đầu tiên hạt tinh bột sẽ hút nước và trương lên, tăng khối lượng và thể tích, khi gia nhiệt tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C tinh bột bắt đầu trương nở. Nếu tiếp tục tăng nhiệt thì hạt tinh bột sẽ tiếp tục trương nở đến khi tạo thành một thể đồng nhất gọi là sự trương nở vô hạn. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của hạt tinh bột tăng 50 ÷ 100 lần. Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh bột tan ra gọi là sự hồ hoá tinh bột. Ở trạng thái này chỉ mới một phần nhỏ tinh bột bị phá vỡ, điều này chứng tỏ rằng sự cấu tạo bền vững của tinh bột là do sự kết hợp giữa các phân tử lớn của các chuỗi tinh bột giữa các mạch chính và nhánh thành những mạng, giữa các mạng là amylose và amylopectin.
Các mạch thẳng trong hạt tinh bột liên kết với nhau bằng lực hút tĩnh điện và liên kết hydro, ngoài ra trong tinh bột còn có các liên kết khác chắc chắn hơn (do sự xoắn mạch của amylose làm cho chúng siết chặt lấy nhau), chính hiện tượng này làm cho quá trình hồ hoá muốn phá vỡ chúng cần phải tiêu tốn một nhiệt lượng cần thiết.
Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu, người ta thường bổ sung một lượng nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 22
Khi làm nguội, dung dịch amylopectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 550C chúng biến thành keo làm cho enzyme amylase không thể tác dụng, đối với dung dịch amylose thì rất không bền vững, nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được. Do đó làm giảm khả năng đường hoá. Vì vậy, trong sản xuất rượu người ta thường làm nguội nhanh đến nhiệt độ 60 ÷ 620C và đường hoá, một biện pháp kỹ thuật thường dùng là
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
sử dụng enzyme amylase dịch hoá trước hay sau khi nấu nguyên liệu (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004).
2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp
Nguồn tinh bột trong nguyên liệu nếp không thể trực tiếp lên men được, mà cần phải qua giai đoạn đường hoá, tác nhân xúc tác thường dùng là enzyme amylase, enzyme này sẽ thủy phân tinh bột tạo thành đường để nấm men sử dụng trong quá trình lên men. Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố:
- Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme amylase chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ. Tốc độ thủy phân cao nhất ở nhiệt độ tối thích của enzyme, nếu vượt quá nhịêt độ này thì chúng sẽ bị biến tính và sẽ trở nên trơ đối với cơ chất, nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần của sản phẩm đường hóa, khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dexrtin tạo ra nhiều hơn so với đường khử. Mặt khác, trong nấm men không có hoặc rất ít α-amylase và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường nên giảm hiệu suất quá trình phân cắt tinh bột.
- pH: Bản chất của enzyme là protein do vậy tính chất của nó cũng giống như protein, những nhóm hoá học cơ bản của enzyme có khả năng ion hoá. Sự hiện diện của ion H+ làm giảm khả năng ion hoá của các nhóm này, nếu nhóm này là trung tâm hoạt động của enzyme thì sẽ kìm hãm hay kích thích enzyme tùy theo nồng độ.
- Thời gian đường hóa: Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, phụ thuộc vào khả năng làm nguội dịch nấu và phương pháp đường hoá. Thời gian đường hoá quyết định năng suất của thiết bị, chất lượng dịch đường hoá và hiệu suất thu hồi.
Thời gian đường hoá ảnh hưởng đến sự hoà tan tinh bột không đường hoá. Khi đường hoá khối nấu ở 55 ÷ 580C trong thời gian 15 ÷ 150 phút hầu như đường lên men không tăng, nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hoà tan tinh bột không đường hoá.
- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện không thay đổi về chủng loại enzyme, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme tăng thì tốc độ đường hóa tăng. Trong sản xuất tốc độ của quá trình thủy phân là một hàm số, là sự tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme- cơ chất, nếu có sự khác nhau về loại, lượng, hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau.
2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 23
Lên men rượu là quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men) tùy theo sản phẩm sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau là lên men yếm khí và lên men hiếu khí.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện của O2 như quá trình lên men acid accetic, citric…
Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic… lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men. Nấm men chuyển hóa đường thành rượu C2H5OH và CO2, người ta còn gọi quá trình này là quá trình rượu hóa:
Lên men yếm khí Hô hấp hiếu khí
Glucose 6-phosphate Sugar Glucose 6-phosphate Sugar
Glycerol Triose phosphate NADH
Pyruvate Pyruvate CO2
O2 Citric acid cycle and Oxidative phosphorylation Ethanol
Oxaloacetat e CO2 Ethanol + CO2
CO2 ATP CO2 Succinat e
Succinate
Nấm men phát triển sinh khối Nấm men lên men rượu
Hình 2.16 Quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men phụ thuộc hiện diện Oxygen có thể hô hấp hiếu khí hoặc lên men yếm khí (Walker, 1998)
2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu
Để lên men rượu, người ta cho vào môi trường một lượng nấm men nhất định, tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau, thông thường số lượng tế bào nấm men phải lớn hơn 107 ÷ 108 cfu/ml. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đường khử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men và sau đó khuyếch tán qua màng vào bên trong tế bào
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 24
Rượu ethylic tạo thành khuyếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men, rượu tan vô hạn trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào trong môi trường, CO2 cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hòa tan không lớn, ở áp suất 800mmHg nhiệt độ 25 ÷ 300C là 0,856 ÷ 0,873 lít CO2 trong 1 lít nước, vì thế CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuyếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
thái bão hòa, khi bão hòa phân tử CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị phá vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài, lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên nấm men luôn ở trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ tăng nhanh quá trình lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004)
2.7.5 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu
- Giai đoạn 1: Khoảng 60 giờ kể khi cho nấm men tiếp xúc với dịch men, sự lên men xảy ra rất chậm.
- Giai đoạn 2: Đây là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 ÷ 120 giờ sau thời kỳ đầu. Sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến cực đại.
- Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau.
Giai đoạn lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men và ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men rượu, giai đoạn này trong điều kiện lên men bình thường, nồng độ đường trong dung dịch lên men sẽ giảm đi, mức độ giảm tùy theo sản phẩm và công nghệ sản xuất, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, chu kì lên men cuối phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme. Rất nhiều thí nghiệm cho thấy rằng, càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình, tuỳ theo sản phẩm, nồng độ đường của dịch đường hoá, phương pháp lên men, nhà sản xuất sẽ tạo ra quy trình sản xuất riêng biệt với chất lượng, thành phần mong muốn của họ.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 25
2.7.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
(Glucose)
ATP
ADP
Glucose-6- P
Fructose-6- P
ATP ADP
Fructose-1,6-di P
CHO
CH2 – OH
CH – OH
C = O
CH – O P
(Aldehyde - 3 P - glyceride)
CH – O P (DioxyKeton P )
NAD H3PO4
NADH + H+
CH2 – O P
CH – OH
COO P
(Acid 1,3 di P - glyceride)
ADP
CH3CH2OH
ATP
(Rượu ethanol) NAD
CH2 – O P
NADH + H+
CH – OH
CH3CHO
(Aldehyd acetic)
COOH
(Acid 3 P - glyceride)
CO2
(I)
CH3
CH2
ADP
CH2 – OH
ATP
– H2O
CHO P
C = O
CO P
Piruvatkinase
COOH
COOH (Acid pyruvic)
COOH (Acid P - enolpiruvic)
(Acid 2 P - glyceride)
Hình 2.17 Sơ đồ đường phân trong tế bào nấm men
2.7.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống của tế bào nấm men, do đó ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men và chất lượng rượu thành phẩm. Nấm men phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 ÷ 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C, nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 ÷ 220C có năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 ÷ 450C, nếu nhiệt độ quá 500C thì nấm men sẽ chết.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 26
- Ảnh hưởng của pH: pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, mỗi loại nấm men phát triển tốt ở một pH nhất định gọi là pH tối thích, nấm men trong sản xuất rượu
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
vang có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH từ 2 ÷ 8 nhưng thích hợp nhất là 4 ÷ 5,0. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH= 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH khoảng 3,8 ÷ 4,0. Khi pH= 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH= 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường lên men người ta thường bổ sung acid vào môi trường.
- Nồng độ đường: Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 ÷ 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 ÷ 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men.
- Ảnh hưởng của nồng độ rượu: Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, nồng độ rượu phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào nấm men, nguyên liệu và chuẩn bị cho môi trường lên men.
- Ảnh hưởng của nồng độ Oxy: Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành C2H5OH và CO2, còn trong điều kiện có đầy đủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và H2O và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pasteur” kìm hãm sự lên men bằng Oxy là thành phần không thể thiếu trong quá trình tăng sinh khối. Tuy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại, với sự có mặt của oxy, nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối, trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ, gây thối cho sản phẩm theo thời gian bảo quản. Còn thiếu oxy trong giai đoạn đầu quá trình lên men diễn ra chậm do không đủ oxy cho quá trình tăng sinh khối làm cho không đủ tế bào lên men ảnh hưởng chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất.
2.8 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 27
Cũng tương tự như trên, quá trình phosphoryl hóa fructose, manose có thể tạo thành các ester hexose-6-phosphate tương ứng, song song với quá trình chuyển hóa đường thành rượu, các sản phẩm phụ khác: aldehyde, rượu bậc cao, ester, acid hữu cơ, methanol (Trần Thị Luyến, 2004).
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Nấm men
Glucose Alanin Acid pyruvic
Acid hữu cơ Acid amin Rượu cao
Hình 2.18 Sơ đồ tổng quát của quá trình hình thành sản phẩm phụ
2.8.1 Sự tạo thành methalnol
Trong thành phần nguyên liệu có chứa các pectin, ester của acid polygalacturovic và rượu methylic, nên sau khi nấu nguyên liệu thì ester này bị phân hủy thành methylic
Ester của acid polygalacturovic Acid pectic + Methy lic
Tạo thành methylic có thể do hoạt động của nấm mốc: vì trong chế phẩm enzyme amylase thu nhận từ nấm mốc luôn chiếm một lượng pectinase và hemixenlulose. Do đó khi đường hóa có một lượng pectin bị thủy phân thành acid pectic và methalnol.
2.8.2 Sự tạo thành aldehyde
Aldehyde là sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể tạo thành qua con đường oxy hóa các loại rượu. Decacboxyl hóa Acid pyruvic Acetaldehyde
Chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde, có thể giảm rất nhiều trong quá trình lên men phụ: do các aldehyde này ngưng tụ lại với nhau để tạo thành các aldol hoặc tác dụng với ethanol tạo thành dietylacetate, 2-cetaldehyde tác dụng với nhau tạo thành acetone tiếp tục chuyển thành diacetyl sau cùng chuyển thành 2, 3 butanol.
2.8.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 28
Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các loại rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn 2, các alcohol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào ethylic sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, đó là các loại alcohol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic… Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 ÷ 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcohol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo phản ứng:
R-CH(NH2)-COOH + H2O RCH2OH + NH3 + CO2.
Như vậy việc tạo thành alcohol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin xảy ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu.
2.8.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ
Là sản phẩm bậc hai thường trực của quá tr ình lên men rượu chủ yếu là acid lactic và acid acetic được tạo thành từ acid pyruvic:
Acid lactic Acid pyruvic
Oxy hóa Acetaldehyde Acid acetic
Acid lactic được tạo thành từ phosphordioxyaceton H2O Acid lactic + H3PO4 Phosphordioxyaceton
Ngoài ra acid succinic cũng được tạo thành từ hai con đường: Dehydrogen và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehydeacetic và Deamin glutamic.
2.8.5 Sự tạo thành các ester
Song song với việc tạo ra acid và alcohol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcohol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng.
Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. Phương trình tổng quát tạo thành ester:
R-CH2 OH + R2-COOH → RCH2OO-CH2R2 + H2O
Dựa vào những kết quả thu được trong các phòng thí nghiệm cũng như trên thực tế sản xuất, người ta nhận thấy rằng, lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo pH, nhiệt độ, nấm men, nguyên liệu... (Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
2.8.6 Sự tạo thành furfurol
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 29
Các loại đường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccharose, glucose, fructose và một ít maltose được tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt độ cao các đường sẽ bị phân hủy và mất nước để tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin. Đường pentose bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
2.9 Quy trình sản xuất rượu vang nếp
2.9.1 Sơ đồ quy trình
Gạo nếp
Ngâm Nghiền
Hấp Pha loãng 1: 4
Làm nguội Men Thuốc Bắc Nước Hồ hóa
Enzyme α-amylase Dịch hóa
Enzyme γ-amylase Đường hóa
Làm nguội
Enzyme papain Thủy phân protein Enzyme bromelain
Làm nguội Làm nguội
Lọc Lọc Lọc
Thanh trùng Thanh trùng Thanh trùng
PA BR
TB ĐC Lên men
Lọc
Lên men phụ
Ổn định
Sản phẩm
Hình 2.19 Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến 4 loại rượu vang nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 30
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
2.9.2 Thuyết minh quy trình
- Nghiền: Việc nghiền nhỏ nguyên liệu là khâu rất quan trọng quyết định đến hiệu quả của quá trình hồ hóa tinh bột và quá trình đường hóa bằng sự thủy phân của enzyme. Nghiền nhằm tạo điều kiện để tăng tốc độ quá trình lý học và hóa sinh học trong khi hòa thấm nước vào hạt tinh bột. Đồng thời nghiền nhỏ còn có tác dụng làm tăng cường tiếp xúc giữa nước và bột nếp giúp các chất hòa tan dễ dàng vào nước khi nấu, việc nghiền nhỏ nguyên liệu được thực hiện bằng máy nghiền búa.
- Hồ hóa: Mục đích của quá trình hồ hóa là phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hòa tan trong nước nhằm tạo điều kiện cho enzyme amylase dễ dàng thủy phân hồ tinh bột.
- Dịch hóa: Quá trình dịch hóa với tác dụng của enzyme α-amylase sẽ phân cắt tinh bột đã được hồ hóa từ dạng rắn sang dạng lỏng để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đường hóa triệt để hơn với sự xúc tác của enzyme glucoamylase.
- Đường hóa Quá trình đường hóa với tác dụng đầu tiên của enzyme α-amylase tinh bột sẽ được thủy phân tạo thành dextrin mạch ngắn và một ít đường khử (glucose), với hàm lượng đường khử thấp nên hiệu suất lên men thấp. Dưới tác dụng tiếp theo của enzyme glucoamylase sẽ thủy phân tinh bột sót lại và các loại đường sau khi dịch nếp đã được phân cắt bằng α-amylase thành đường khử triệt để hơn cho nấm men sử dụng để chuyển hóa thành rượu.
- Thủy phân protein: Sau khi đường hóa, dịch nếp được bổ sung enzyme papain hoặc bromelain để thực hiện quá trình thủy phân protein thành peptide mạch ngắn và acid amin tự do nhằm cải thiện độ trong, màu sắc và mùi vị của sản phẩm rượu vang.
- Làm nguội: Sản phẩm sau khi thủy phân xong dịch nếp có nhiệt độ khá cao nên cần làm nguội đến nhiệt độ phòng để tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men phát triển và lên men rượu.
- Lên men: Quá trình lên men được tiến hành ở nhiệt độ phòng, trong thời gian lên men có hai quá trình xảy ra song song ở mức độ khác nhau đó là quá trình phát triển sinh khối của nấm men và quá trình rượu hóa. Với 4 sản phẩm rượu được lên men với 2 nguồn: bánh men thuốc bắc và enzyme, nấm men thuần chủng để tiến hành lên men.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 31
Lên men phụ: Rượu vang nếp được lên men và không qua chưng cất nên sau khi lên men xong sẽ còn nhiều sản phẩm phụ có thể ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm và gây độc cho người tiêu dùng. Vì vậy, cần có thời gian lên men phụ để chuyển hóa và ổn định rượu làm cho chất lượng rượu tốt hơn, thời gian lên men phụ và ổn định chất lượng rượu vang thường là 6 tháng.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: Từ ngày 01/06/2009 đến 01/08/2010
Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Trung tâm Thí Nghiệm – Khoa Nông Nghiệp Thủy Sản – Trường Đại học Trà Vinh.
3.1.2 Nguyên vật liệu
- Nếp thơm trắng được mua tại siêu thị Coop Mart-Cần Thơ.
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae.
- Enzyme α-amylase, glucoamylase, papain, bromelain
3.1.3 Hóa chất
- NaOH 30%, 10%, NaOH 0,1N.
- Pb(CH3COO)2 30%.
- Na2SO4 bão hoà.
- Metyl xanh 1% trong nước.
- Fehling A (69,28g CuSO4 trong 1 lít nước cất).
- Fehling B (346g Kalinatritartrate và 100g NaOH trong 1 lít nước cất).
- Phenolphtalein 1% trong cồn.
- Acid citric, sorbic
- Na2CO3 khan.
- NaHSO3 khan 98%.
- H2SO4 đậm đặc 98%, H2SO4 0,1N.
- Anilin C6H5NH2, formol.
3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Máy nghiền nguyên liệu (JIYU MILL, Nhật).
- Máy đo pH (pH meter HANNA-12P, Nhật).
- Chiết quang kế cầm tay (ATAGO, Nhật).
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 32
- Rượu kế (thang đo 0 ÷ 30 độ, Trung Quốc).
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
- Cân phân tích (OHAUS, độ chính xác d = 0,0001, Nhật)
- Bếp điện, nhiệt kế
- Bình thủy tinh lên men.
- Hệ thống chưng cất rượu.
- Pipet 20ml, 10 ml, 5ml, micropipet 10 – 100µl, 100 – 1000µl.
Cùng một số thiết bị dụng cụ cần thiết khác trong phòng thí nghiệm thực phẩm…
Hình 3.1 Máy nghiền nguyên liệu
Hình 3.2 Máy đo pH
Hình 3.3 Cân phân tích
Hình 3.4 Chiết quang kế
Hình 3.5 Chuẩn độ đường Hình 3.6 Nấm men
Hình 3.7 Nếp trắng
Hình 3.8 Water bath
Hình 3.9 Máy chuẩn độ điện thế
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 33
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
Nếp thơm trắng được mua ở siêu thị Coop Mart-Cần Thơ, đóng gói nhỏ với trọng lượng 1 kg, chất lượng đồng nhất và nghiền mịn bằng máy nghiền.
Các loại enzyme amylase (Termamyl 120L, AMG 300L), protease (Papain, Bromelain) được mua ở dạng thương mại.
Nấm men: Sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và theo thể thức thừa số với cùng một nguồn dữ liệu, 2- 3 lần lặp lại. Kết quả được tính toán thống kê và phân tích phương sai, kiểm định LSD, vẽ đồ thị bằng chương trình Stagraphics plus 4.0, Excel, SAS 9.1.
3.2.3 Phương pháp phân tích
- Xác định pH bằng máy đo pH.
- Phân tích hàm lượng chất khô (độ Brix) bằng chiết quang kế.
- Xác định hàm lượng đường tạo thành theo phương pháp Lane-Eynon (Bộ môn Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng-Trường Đại học Cần Thơ).
- Xác định nồng độ rượu tạo thành bằng phương pháp chưng cất (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
- Xác định hàm lượng acid toàn phần theo bằng phương pháp định phân (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
- Xác định hàm lượng ester theo bằng phương pháp định phân (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
- Định tính furfurol dựa vào phản ứng màu giữa furfurol với anilin trong môi trường acid có màu hồng-da cam (Lê Thanh Mai et al, 2005).
- Xác định hàm lượng nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ formol theo phương pháp Sorensen (Nguyễn Văn Mùi, 2001).
- Đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm (Ngô Thị Hồng Thư, 1998).
- Xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu nếp theo Ref AOAC 992.23,2002 (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 34
- Xác định hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu và dịch nếp theo TCVN 4594-1988 (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
- Xác định hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp bằng phương pháp GC-EZ faast (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).
hàm định aldehyde phương lượng bằng
pháp GC-AOAC - Xác 968:09,972:10,983:13,984:14 1990 (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).
- Xác đinh hàm lượng methanol (CH3OH) bằng phương pháp GC-AOAC 968:09,972:10, 983:13, 984:14 1990 (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).
- Kiểm nghiệm vi sinh vật: Clostridium perfringens (ISO 7937:2004), Coliform (Ref.ISO 4831: 2006), Ecoli (Ref.NF V08-017: 1980), Staphylococcus aureus (Ref .ISO 6888-3: 2003), Tổng số nấm men nấm mốc (ISO 7954: 1987), Tổng số vi khuẩn hiếu khí (ISO 4833: 2003) (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM).
3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm
3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng.
3.3.1.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp.
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme α-amylase.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.
Nhân tố A: pH dịch nếp A1: 5,5 A2: 6,0 A3: 6,5 A4: 7,0
Nhân tố B: nhiệt độ thủy phân B1: 750C B2: 800C B3: 850C B4: 900C
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố B (oC)
Nhân tố A
B1
B2
B3
B4
A1B1
A1B2
A1B3
A1B4
A1
A2B1
A2B2
A2B3
A2B4
A2
A3B1
A3B2
A3B3
A3B4
A3
A4B1
A4B2
A4B3
A4B4
A4
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 35
- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
d. Chuẩn bị mẫu: Cho mg nguyên liệu nếp xay nhuyễn vào bình tam giác định mức bằng nước cất. Chỉnh pH và nhiệt độ theo các mức cần khảo sát rồi bổ sung enzyme α- amylase vào tỉ lệ enzyme sử dụng là 0,3% (v/v), giữ nhiệt 30 phút để enzyme hoạt động, sau thời gian thủy phân làm nguội nhanh bằng nước lạnh.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử trong dịch nếp sau khi thủy phân.
Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân của enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp.
3.3.1.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp.
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme và thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp.
b. Bố trí thí nghiệm: kế thừa các thông số như tỉ lệ 1 nếp: 4 nước, pH, nhiệt độ của α- amylase trong quá trình dịch hóa để khảo sát ảnh hưởng của các mức nồng độ enzyme và thời gian thủy phân.
Thí nghiệm được bố trí 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.
C1: 0,1 % C2: 0,2 % C4:0,3 % C4: 0,4 % Nhân tố C: nồng độ α- amylase
D1: 10phút D2: 20phút D3: 30phút D4: 40phút Nhân tố D: thời gian thủy phân
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố D (phút)
Nhân tố C (%)
D1
D2
D3
D4
C1
C1D1
C1D2
C1D3
C1D4
C2
C2D1
C2D2
C2D3
C2D4
C3
C3D1
C3D2
C3D3
C3D4
C4
C4D1
C4D2
C4D3
C4D4
- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 36
d. Chuẩn bị mẫu: Cân mg nếp xay nhuyễn cho vào bình tam giác và định mức bằng nước. Điều chỉnh pH và nhiệt độ theo thông số tối ưu ở thí nghiệm 3.3.1.1. Nồng độ
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
α-amylase và thời gian thủy phân lần lượt thay đổi theo mức bố trí, sau khi thủy phân tiến hành làm nguội nhanh bằng nước lạnh.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử sinh ra trong dịch nếp sau khi thủy phân.
Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân của α- amylase tối ưu để ứng dụng cho thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.
3.3.1.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α- amylase trong quá trình thủy phân.
a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp lên hoạt tính của enzyme α-amylase.
b. Bố trí thí nghiệm: gồm 1 nhân tố tỉ lệ bột nếp và lặp lại 3 lần.
- Nhân tố E: E1:5%; E2:10%; C3:15%; C4:20%; C5:25%; C6:30%; C7:35%, C8:40%.
- Tổng nghiệm thức: 8 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24 đơn vị.
c. Chuẩn bị mẫu: Cho vào bình tam giác gồm nước và bột nếp với tỉ lệ lần lượt thay đổi theo 8 mức độ khảo sát. Sử dụng các thông số tối ưu pH, nhiệt độ, nồng độ α- amylase và thời gian thủy phân từ thí nghiệm 3.3.1.1 và 3.3.1.2, sau thời gian thủy phân mẫu được làm nguội nhanh bằng nước lạnh.
d. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử tạo thành.
Kết quả thí nghiệm: Xác định mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và hoạt tính enzyme α-amylase.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.
3.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp.
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nhiệt độ và pH thích hợp cho enzyme glucoamylase.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.
Nhân tố F: pH của dịch nếp F1: 3,5 F2: 4,0 F3: 4,5 F4: 5,0
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 37
Nhân tố G: nhiệt độ thủy phân G1: 550C G2: 600C G3: 650C G4: 700C
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố G (oC)
Nhân tố F
G1
G2
G3
G4
F1G1
F1G2
F1G3
F1G4
F1
F1G1
F2G2
F2G3
F2G4
F2
F1G1
F3G2
F3G3
F3G4
F3
F1G1
F4G2
F4G3
F4G4
F4
- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị
d. Chuẩn bị mẫu: Tương tự như thí nghiệm 3.3.1, sau khi thủy phân bằng α- amylase, dịch nếp được thay đổi pH và nhiệt độ theo các mức khảo sát rồi bổ sung tiếp enzyme glucoamylase, kết thúc quá trình thủy phân dịch nếp được tiến hành làm nguội nhanh bằng nước lạnh.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử sinh ra.
Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình đường hóa bằng glucoamylase.
3.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng.
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình đường hóa.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.
H1: 0,4 % H2: 0,5 % H3:0,6 % H4: 0,7 % Nhân tố H: nồng độ glucoamylase
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 38
I1:10phút I2: 20phút I3: 30phút I4: 40phút Nhân tốI: thời gian thủy phân
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố I (phút)
Nhân tố H (%)
I2
I3
I4
I1
H1
H1I2
H1I3
H1I4
H1I1
H2
H2I2
H2I3
H2I4
H2I1
H3
H3I2
H3I3
H3I4
H3I1
H4
H4I2
H4I3
H4I4
H4I1
- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị
d. Chuẩn bị mẫu: Tiến hành dịch hóa theo các thông số tối ưu của các thí nghiệm 3.3.1, chỉnh pH và nhiệt độ theo thông số tối ưu của thí nghiệm 3.3.2.1, bổ sung enzyme glucoamylase với nồng độ thay đổi theo 4 mức độ và thời gian thủy phân điều chỉnh theo các mức khảo sát, kết thúc quá trình thủy phân tiến hành làm nguội nhanh dịch nếp bằng nước lạnh.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử tạo thành.
Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ glucoamylase và thời gian thủy phân thích hợp cho quá trình đường hóa, áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân.
a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất đến lên hoạt tính của enzyme glucoamylase.
b. Bố trí thí nghiệm: gồm 1 nhân tố, lặp lại 3 lần.
Nhân tố J: tỉ lệ bột nếp (%): J1: 5, J2: 10, J3: 15, J4: 20, J5: 25, J6: 30, J7: 35, J8:40
- Tổng nghiệm thức: 8 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24 đơn vị.
c. Chuẩn bị mẫu: Cho bột nếp vào bình tam giác với tỉ lệ thay đổi theo 8 mức cần khảo sát. Tiến hành tương tự như các thí nghiệm 3.3.1; 3.3.2.1 và 3.3.2.2.
d. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng đường khử sinh ra.
Kết quả thí nghiệm: xác định ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucosamylase.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 39
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
3.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp.
a. Mục đích: Xác định được pH, nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của enzyme papain.
b. Bố trí thí nghiệm: gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.
Nhân tố K: pH của dịch nếp K1: 5,0 K2: 5,5 K3: 6,0 K4: 6,5
Nhân tố L: nhiệt độ thủy phân L1: 400C L2: 450C L3: 500C L4: 550C
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố L (oC)
Nhân tố K
L1
L2
L3
L4
K1L1
K1L2
K1L3
K1L4
K1
K2L1
K2L2
K2L3
K2L4
K2
K3L1
K3L2
K3L3
K3L4
K3
K4L1
K4L2
K4L3
K4L4
K4
- Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16, số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị.
d. Chuẩn bị mẫu: Dịch nếp sau khi được thủy phân bằng enzyme α-amylase, glucoamylase được điều chỉnh pH theo các mức vừa khảo sát và sau đó nâng nhiệt lên các mức bố trí rồi bổ sung enzyme papain vào, sau khi thủy phân dịch nếp được tiến hành làm nguội nhanh bằng nước lạnh.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin sinh ra sau khi thủy phân bằng papain
Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH tối thích cho enzyme papain để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.
3.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp.
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme và thời gian thủy phân của enzyme papain thích hợp cho sản phẩm rượu có mùi vị, màu sắc, độ trong tốt nhất.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 40
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
M1: 0,1 % M2: 0,2 % M3: 0,3 % M4: 0,4 % Nhân tố M: nồng độ papain
N1: 20phút N2: 30phút N3: 40phút N4: 50phút Nhân tố N: thời gian thủy phân
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố N (phút)
Nhân tố M (%)
N1
N2
N3
N4
M1
M1N1
M1N2
M1N3
M1N4
M2
M2N1
M2N2
M2N3
M2N4
M3
M3N1
M3N2
M3N3
M3N4
M4
M4N1
M4N2
M4N3
M4N4
Tổng số nghiệm thức: 4 x 4= 16, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị.
d. Chuẩn bị mẫu: Sau khi xác định được pH và nhiệt độ tối thích của enzyme papain ở thí nghiệm 3.3.3.1, tiến hành quá trình thủy phân protein ở các nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân khác nhau.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin tạo thành sau khi thủy phân bằng papain
Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ và thời gian thủy phân của enzyme papain tối ưu để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.
3.3.3.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp.
a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme papain thông qua hằng số Vmax và km
b. Bố trí thí nghiệm: gồm 1 nhân tố, lặp lại 3 lần.
Nhân tố O: tỉ lệ bột nếp (%) O1:5, O2: 10, O3: 15, O4: 20, O5: 25, O6: 30, O7: 35, O8:40
- Tổng nghiệm thức: 8 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24 đơn vị.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 41
c. Chuẩn bị mẫu: Cho bột nếp vào bình tam giác với tỉ lệ thay đổi theo 8 mức cần khảo sát. Tiến hành tương tự như các thí nghiệm 3.3.1; 3.3.2; 3.3.3.1 và 3.3.3.2
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
d. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng nitơ amin tạo thành sau khi thủy phân.
Kết quả thí nghiệm: xác định km, Vmax của enzyme papain.
3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase.
3.3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp.
a. Mục đích: Xác định được điều kiện tối thích về pH và nhiệt độ cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.
Nhân tố P: pH của dịch nếp P1: 5,0 P2: 5,5 P3: 6,0 P4: 6,5
Nhân tố Q: nhiệt độ thủy phân Q1: 450C Q2: 500C Q3: 550C Q4: 600C
c. Các nghiệm thức:
Nhân tố Q (oC)
Nhân tố P
Q1
Q2
Q3
Q4
P1Q1
P1Q2
P1Q3
P1Q4
P1
P2Q1
P2Q2
P2Q3
P2Q4
P2
P3Q1
P3Q2
P3Q3
P3Q4
P3
P4Q1
P4Q2
P4Q3
P4Q4
P4
Tổng nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị
d. Chuẩn bị mẫu: Dịch nếp sau khi được thủy phân bằng enzyme α-amylase, glucoamylase được điều chỉnh thông số pH và nhiệt độ theo các mức bố trí rồi bổ sung tiếp enzyme bromelain để phân cắt protein dịch nếp.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin sau khi thủy phân bằng enzyme bromelain
Kết quả thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và pH của enzyme bromelain thích hợp nhất để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.
3.3.4.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein nếp.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 42
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân thích hợp cho sản phẩm rượu có màu sắc, mùi vị và độ trong tốt nhất.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 2 nhân tố và lặp lại 3 lần.
Nhân tố R: nồng độ bromelain R1: 0,3 % R2: 0,4 % R3:0,5 % R4: 0,6 %
Nhân tố S: thời gian thủy phân S1:30phút S2:40phút S3:50phút S4:60phút
c. Các nghiệm thức:
Thời gian thủy phân (phút)
Nồng độ enzyme (%)
S1
S2
S3
S4
R1S1
R1S2
R1S3
R1S4
R1
R2S1
R2S2
R2S3
R2S4
R2
R3S1
R3S2
R3S3
R3S4
R3
R4S1
R4S2
R4S3
R4S4
R4
Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 = 16, Số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48 đơn vị.
d. Chuẩn bị mẫu: Sau khi xác định pH và nhiệt độ tối thích của enzyme bromelain ở thí nghiệm 3.3.4.1, tiến hành quá trình thủy phân protein ở các nồng độ enzyme và thời gian khác nhau để thu được nitơ amin thích hợp cho quá trình lên men.
e. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng nitơ amin sau khi thủy phân bằng enzyme bromelain.
Kết quả thí nghiệm: Xác định nồng độ và thời gian thủy phân của bromelain thích hợp nhất để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong quy trình sản xuất rượu.
3.3.4.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp.
a. Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến lên hoạt tính của enzyme bromelain thông qua hằng số Vmax, km.
b. Bố trí thí nghiệm: gồm 1 nhân tố, lặp lại 3 lần.
Nhân tố T : tỉ lệ bột nếp (%): T1: 5, T2: 10, T3: 15, T4: 20, T5: 25, T6: 30, T7: 35, T8: 40
- Tổng nghiệm thức: 8 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24 đơn vị.
d. Chuẩn bị mẫu: Cho bột nếp vào bình tam giác với tỉ lệ thay đổi theo 8 mức cần khảo sát. Tiến hành tương tự như các thí nghiệm 3.3.1; 3.3.2; 3.3.4.1 và 3.3.4.2.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 43
e. Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng nitơ amin tạo thành sau khi thủy phân bằng bromelain.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Kết quả thí nghiệm: xác định Vmax, km của enzyme bromelain.
3.3.5 Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.
a. Mục đích thí nghiệm: Tìm ra quy trình sản xuất sản phẩm rượu theo tiêu chuẩn an toàn chất lượng vệ sinh thực phẩm và đạt giá trị cảm quan tốt nhất.
b. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí 1 nhân tố các loại rượu, lặp lại 3 lần:
U1: Rượu lên men bằng bánh men thuốc bắc, ký hiệu: (TB)
U2: Rượu sử dụng enzyme α- amylase, glucoamylase và sử dụng nấm men thuần chủng lên men, ký hiệu: (ĐC)
U3: Rượu sử dụng enzyme α- amylase, glucoamylase, papain và sử dụng nấm men thuần chủng lên men, ký hiệu: (PA)
U3: Rượu sử dụng enzyme α- amylase, glucoamylase, bromelain và sử dụng nấm men thuần chủng lên men, ký hiệu: (BR)
- Tổng nghiệm thức: 1x 4 = 4 nghiệm thức, Số đơn vị thí nghiệm: 4 x 3 = 12 đơn vị
c. Chuẩn bị mẫu:
Loại rượu lên men theo phương pháp cổ truyền sử dụng bánh men thuốc: Nguyên liệu nếp được hấp chín, để nguội và bổ sung bánh men thuốc bắc được hòa tan trực tiếp với nước để lên men.
Các loại rượu sử dụng enzyme và nấm men thuần chủng: Dung dịch nếp được dịch hóa, đường hóa và thủy phân protein theo kết quả tối ưu thu được ở các thí nghiệm trước, tiến hành lọc, điều chỉnh pH và bổ sung nấm men thuần chủng để lên men.
d. Chỉ tiêu theo dõi: Các chỉ tiêu chất lượng rượu được phân tích trong suốt thời gian lên men chính 7÷8 ngày và lên men phụ, ổn định, bảo quản trong 3 tháng.
Chỉ tiêu hóa lý:
- Hàm lượng chất khô hòa tan (Brix) bằng chiết quang kế.
- Chỉ số pH.
- Hàm lượng đường khử còn sót lại.
- Nồng độ Ethanol bằng cồn kế.
- Hàm lượng acid tổng (Acid acetic).
- Hàm lượng Ester (Etyl acetate).
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 44
- Hàm lượng Aldehyde (Aldehyde acetic).
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
- Hàm lượng cồn bậc cao (Isobutanol, Isopentanol 1:3).
- Hàm lượng Furfurol.
- Hàm lượng Methanol.
Chỉ tiêu cảm quan:
- Độ trong và màu sắc.
- Mùi.
- Vị.
Chỉ tiêu vi sinh vật:
- Clostridium perfringens (cfu/ml).
- Coliform (cfu/ml).
- Ecoli (MPN/ml).
- Staphylococcus aureus (cfu/ml).
- Tổng số nấm men nấm mốc (cfu/ml).
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí (cfu/ml).
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 45
Kết quả thí nghiệm: Xác định quy trình sản xuất rượu theo tiêu chuẩn chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm và đạt giá trị cảm quan tốt nhất để sản xuất thực nghiệm.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng
Nguyên liệu nếp trắng thơm chọn để thực hiện thí nghiệm được mua từ Liên hiệp
HTX thương mại TP.HCM (SAIGON CO.OP), thành phần chính của hạt nếp thể hiện
ở bảng 4.1
Bảng 4.1 Thành phần chính của nguyên liệu nếp trắng thơm
Chỉ tiêu
Giá trị (%)
Độ ẩm
10,92
Tinh bột
77,16
Protein
7,93
(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010)
Theo kết quả phân tích thành phần chính của nguyên liệu ở bảng 4.1, cho thấy nếp trắng có hàm lượng tinh bột 77,16 % là rất cao. Vì thế khi thực hiện tiến trình hồ hóa tinh bột sẽ làm độ nhớt của dịch nếp tăng cao gây cản trở cho quá trình đường hóa sau này, chính vì vậy với việc sử dụng enzyme α-amylase để phân cắt hồ tinh bột nhằm làm giảm độ nhớt trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần là rất cần thiết.
4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng.
4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp trắng.
Dựa trên những tài liệu tham khảo cho thấy, hoạt động xúc tác phản ứng của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào pH và nhiệt độ, mỗi loại enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở mỗi giá trị pH và nhiệt độ tối thích, cho nên thí nghiệm được thực hiện với mục tiêu là xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho enzyme α-amylase để tiến hành quá trình dịch hóa, đường hóa một phần hồ tinh bột nguyên liệu nếp.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 46
Thí nghiệm tiến hành với enzyme α-amylase được sử dụng ở nồng độ 0,3% (v/v) và thời gian thủy phân là 30 phút, dung dịch sau khi thủy phân được phân tích hàm lượng đường khử sinh ra, kết quả được thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.1.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng enzyme α-amylase, (g/100ml)
Nhiệt độ thuỷ phân (oC)
pH dịch nếp
Trung bình (pH)
75
80
85
90
4,64
5,48
5,65
5,33c
5,54
5,5
4,89
5,60
5,90
5,53b
5,72
6,0
5,48
5,84
6,18
5,88a
6,04
6,5
5,12
5,22
6,04
5,59b
5,97
7,0
5,03D
5,53C
5,94A
5,82B
Trung bình (Nhiệt độ)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.2 cho thấy pH và nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính xúc tác của enzyme α-amylase khi thủy phân tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp trắng bằng enzyme α-amylase
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 47
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Theo kết quả những nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, các nhà khoa học nhận thấy hiện tượng: nếu tăng hoặc giảm giá trị pH tới một điểm xác định nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt đến điểm cực đại, giá trị pH mà ở đó vận tốc enzyme đạt cực đại gọi là pH tối ưu, vượt quá giới hạn pH này hoạt động xúc tác của enzyme sẽ giảm (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Thí nghiệm tiến hành bằng cách điều chỉnh pH của dịch tinh bột nếp từ 5,5 đến 7,0 ở nhiệt độ từ 75oC đến 90oC để khảo sát hoạt tính của enzyme, kết quả cho thấy hoạt động của enzyme α-amylase có những ảnh hưởng.
Qua kết quả thí nghiệm ở bảng 4.2 và hình 4.1 nhận thấy pH tối thích cho α- amylase hoạt động trên nguyên liệu nếp trắng với pH 6,5 thì lượng đường khử sinh ra cao nhất. Với pH 5,5 lượng đường khử thu được thấp nhất. Ở giá trị pH 6,0 và 7,0 lượng đường khử tạo thành không có khác biệt ý nghĩa. Hàm lượng đường khử thu được khi thủy phân ở các mức giá trị pH còn lại có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với mức 5%.
Số liệu thí nghiệm còn cho thấy, pH cao hoặc thấp hơn pH tối ưu, hàm lượng đường khử sinh ra đều giảm, do đó có thể nói rằng pH có ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme. Có thể vì khi thay đổi pH môi trường sẽ làm thay đổi khả năng ion hóa của enzyme và cơ chất, do đó sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng tạo phức hợp ES làm giảm vận tốc phản ứng, vì thế phải chọn pH tối thích cho enzyme hoạt động để đạt được hiệu quả cao nhất.
Bên cạnh ảnh hưởng của pH thì nhân tố nhiệt độ cũng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme α-amylase, trong các phản ứng sinh học khi nhiệt độ tăng thì khả năng xúc tác của enzyme sẽ tăng nhưng tốc độ phản ứng không phải lúc nào cũng tăng tỷ lệ thuận với nhiệt độ, khả năng tăng nhiệt độ có một giới hạn nhất định nếu quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.1 cho thấy hàm lượng đường khử sinh ra sẽ tăng khi tăng nhiệt độ từ 75oC, 80oC đến 85oC và sẽ giảm nếu tiếp tục tăng nhiệt độ đến 900C, giữa các mức nhiệt độ ảnh hưởng đến lượng khử tạo thành đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 48
Số liệu thí nghiệm đạt được hoàn toàn phù hợp với lý thuyết vì bản chất của enzyme là protein thường không bền ở nhiệt độ cao, vì thế khi tăng nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu trúc không gian ES của enzyme cho phù hợp với cơ chất, khi vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt tính của enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến triệt tiêu (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Điều này cũng phù hợp với đặc tính của enzyme α- amylase sử dụng trong nghiên cứu của đề tài có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis là loài có thể chịu được nhiệt độ cao.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
(b)
(a)
Z = -60,7044 +1,07437*X +6,18554*Y-0,498333*Y2-0,0063*X2+0,00327467*X*Y; R2= 99,81%
Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng đường khử (%)
Hình 4.2 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử
Theo đồ thị không gian 3D hình 4.2.a thể hiện sự phụ thuộc của lượng đường khử theo pH và nhiệt độ khi thủy phân tinh bột nếp để tiến hành dịch hóa, đường hóa một phần. Đồng thời đồ thị Contour hình 4.2.b cho phép chọn điểm pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình thủy phân để thu được hàm lượng đường khử tạo thành cao nhất.
Từ các số liệu ở bảng 4.2 và hình 4.1; 4.2.a, 4.2.b nhận thấy đường khử thu được khi thủy phân tinh bột trong nếp trắng có giá trị cao nhất ở pH 6,5 và nhiệt độ 870C là 2 thông số tối ưu để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần tinh bột cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp.
Tiến hành thí nghiệm với α-amylase để dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp với nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau, số liệu được thể hiện ở bảng 4.3
Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân tinh bột nếp đến lượng đường khử tạo thành, (g/100ml)
Thời gian (phút)
Nồng độ enzyme (%)
Trung bình (Nồng độ)
10
20
30
40
0,1
4,65
5,16
5,12
5,31
5,06c
0,2
5,06
5,42
5,65
5,84
5,49b
0,3
5,22
5,60
6,11
6,18
5,78a
0,4
5,06
5,48
6,32
6,32
5,80a
5,00C
5,42B
5,80A
5,91A
Trung bình (Thời gian)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 49
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Để quá trình dịch hóa, đường hóa xảy ra nhanh và hiệu quả, các thông số pH tối ưu pH 6,5 và nhiệt độ tối thích 870C được kế thừa từ thí nghiệm 4.2.1. Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.3 cho thấy nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme khi phân cắt tinh bột nếp
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp đến lượng đường khử tạo thành
Tiến hành dịch hóa, đường hóa tinh bột là công đoạn không thể thiếu đối với công nghệ sản xuất rượu, trong giai đoạn này enzyme sẽ phân cắt tinh bột thành những phân tử dextrin mạch ngắn và đường khử, vì vậy chỉ tiêu được quan tâm nhiều nhất trong thí nghiệm là lượng đường khử sinh ra, loại đường chủ yếu được nấm men sử dụng để phát triển sinh khối và lên men rượu.
Qua kết quả thống kê bảng 4.3 và hình 4.3 nhận thấy với cùng nồng độ tinh bột nếp, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân, chỉ có thay đổi nồng độ enzyme α-amylase thì lượng đường khử tạo thành cũng khác nhau, hàm lượng đường khử sẽ tăng nếu tăng nồng độ enzyme sử dụng nhưng không đều. Hàm lượng đường khử tăng nhiều khi nồng độ enzyme α-amylase tăng từ 0,1%, 0,2%, 0,3% có sự khác biệt ý nghĩa thống kê và tăng chậm khi nồng độ enzyme tăng từ 0,3% đến 0,4% không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 50
Bên cạnh ảnh hưởng nhân tố nồng độ enzyme, theo số liệu thể hiện ở bảng 4.3 và hình 4.3 còn cho thấy lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo thời gian thủy phân, lượng đường khử tăng nhanh trong khoảng thời gian 10 phút đến 30 phút và tăng chậm trong khoảng thời gian 30 phút đến 40 phút. Kết quả thống kê cho thấy, ở các mức thời gian thủy phân 10, 20, 30 phút thì lượng đường khử sinh ra có sự khác biệt ý nghĩa nhưng
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
ở khoảng 30 và 40 phút thì lượng đường khử sinh ra không có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
(a)
(b)
Z= 0,209885*Y + 21,6977*X – 0,0864364*X*Y – 32,3212*X2- 0,00296129*Y2; R 2 = 99,41%
Ghi chú X: Nồng độ enzyme α-amylase (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng đường khử (%)
Hình 4.4 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân đến lượng đường khử tạo thành.
Theo đồ thị 3D hình 4.4.a thể hiện sự phụ thuộc của hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme và thời gian dịch hóa, đường hóa một phần. Đường khử sinh ra tăng theo nồng độ enzyme và thời gian thủy phân. Đồng thời đồ thị Contour hình 4.4.b còn cho phép chọn điểm tối ưu về nồng độ enzyme và thời gian cho quá trình thủy phân tinh bột nếp trắng.
Từ các số liệu ở bảng 4.3 và hình 4.3 cùng hình 4.4.a, 4.4.b đồng thời xét về mặt hiệu quả kinh tế mang lại, có thể nhận thấy rằng nồng độ enzyme α-amylase 0,3 % và thời gian thủy phân 31 phút với lượng đường khử thu được 6,46% là 2 thông số tối ưu để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân.
Thí nghiệm tiến hành trên cơ chất là tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng với mục tiêu là xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.4
Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân với enzyme α-amylase
Cơ chất bột nếp (%)
5
10
15
20
25
30
35
40
Đường khử (%)
1,80f
3,05e
4,61c
6,11d
7,06c
8,13b
9,42a
9,59a
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 51
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ enzyme sử dụng là 0,3%, thời gian thủy phân là 31 phút, ở pH 6,5 và nhiệt độ 87oC với tỉ lệ bột nếp thay đổi từ 5 đến 40%
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng enzyme α-amylase
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.4 và hình 4.5 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột nếp thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột nếp từ 5% đến 30%. Khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước. Điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tinh bột thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất và đạt đến điểm cực đại nghĩa là toàn bộ enzyme kết hợp được với cơ chất. Khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lớn hơn nữa thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ không tăng đáng kể do nồng độ tinh bột quá cao sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch gây khó khăn cho hoạt động xúc tác của enzyme nên hàm lượng đường khử sinh ra không tăng nhiều.
4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 52
Trong quá trình lên men rượu, nấm men sử dụng các loại đường và dextrin để tạo thành C2H5OH và CO2, để thực hiện được điều đó thì phải trải qua từng công đoạn: hồ hóa, dịch hóa và đường hóa để tạo thành đường khử. Tuy nhiên nếu chỉ đơn thuần sử dụng α-amylase thì lượng đường khử tạo thành không cao thể hiện ở kết quả thí nghiệm 4.2.2 (Đường khử: 6,11% ở pH: 6,5, nhiệt độ: 85oC, nồng độ enzyme: 0,3%, Thời gian: 30 phút, tỉ lệ 1 nếp: 4 nước). Bên cạnh đó lượng tinh bột còn sót lại 1,95% trong dịch nếp sau khi thủy phân (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010). Nguyên nhân là do khi chỉ sử dụng enzyme α-amylase phân cắt các phân tử amylose và amylopectin trong tinh bột sẽ tạo thành nhiều sản phẩm:
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
oligosaccharides, disaccharides và monosaccharide (Đường khử). Trong đó đường khử do α-amylase đã cắt gần hết các liên kết 1,4 glycoside, phần còn lại là các phân tử dextrin mạch nhánh có liên kết 1,6 glycoside mà enzyme α-amylase thì không cắt được liên kết 1,6 glycoside.
Với hàm lượng đường khử như thế, quá trình lên men diễn ra không tốt do không đủ lượng đường khử cho nấm men sử dụng, thể hiện ở độ rượu thu được khi lên men chỉ khoảng 3% (Trần Thị Hồng Chúc, 2008), chính vì thế để tăng thêm hàm lượng đường khử cho nấm men hoạt động tốt hơn, năng suất rượu cao hơn, vấn đề đặt ra là làm sao nâng cao hiệu suất lên men? Khi đó một trong những giải pháp hiệu quả được đặt ra là sử dụng kết hợp tiếp theo sau glucoamylase để thủy phân các polysaccharides, oligosaccharides, disaccharides còn lại vì enzyme này có khả năng phân cắt được liên kết 1,4 glycoside và cả liên kết 1,6 glycoside.
4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp trắng.
Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 những thông số: pH, nhiệt độ, thời gian, nồng độ enzyme α-amylase được cố định sử dụng tiếp theo để tiến hành khảo sát ảnh hưởng các mức pH và nhiệt độ của dịch nếp để thủy phân tiếp bằng enzyme glucoamylase đến lượng đường khử sinh ra, số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme glucoamylase, (g/100ml)
Nhiệt độ thuỷ phân (oC)
pH dịch nếp
Trung bình (pH)
55
60
65
70
3,5
14,36
14,56
14,36
13,28
14,14b
4,0
14,56
15,88
14,97
14,56
14,93a
4,5
14,16
14,75
14,36
14,16
14,36b
5,0
13,43
13,79
13,60
13,62
13,61c
14,13BC
14,68A
14,32B
13,91C
Trung bình (Nhiệt độ)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 53
Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.5 cho thấy hai nhân tố pH và nhiệt độ đều có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân tinh bột nếp đã được dịch hóa và đường hóa một phần trước bằng enzyme α-amylase
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase
Theo kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.5 và hình 4.6 cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 55oC đến 60oC lượng đường khử sinh ra tăng nhưng từ 65oC đến 70oC thì lượng đường khử tạo thành không tăng nữa mà lại còn giảm. Trong 4 mức nhiệt độ trên thì lượng đường khử sinh ra khi thủy phân tinh bột nếp với nhiệt độ 60oC là cao nhất và thấp nhất ở 70oC và 55oC, về mặt thống kê cho thấy lượng đường khử sinh ra 4 mức nhiệt độ có khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.
Theo số liệu thí nghiệm cho thấy bên cạnh ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme thì giá trị pH cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme glucoamylase, khi thủy phân dịch nếp với giá trị pH 4,0 thì hàm lượng đường khử sinh ra cao nhất và ở pH 5,0 lượng đường khử tạo thành là nhỏ nhất. Xét về mặt thống kê cho thấy hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở pH 3,5 và 4,5 là không có khác biệt ý nghĩa. Hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở các mức giá trị pH có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 54
Số liệu thí nghiệm đạt được hoàn toàn phù hợp với thông tin cung cấp từ nhà sản xuất enzyme (Novo Nordisk, 2007) vì glucoamylase được sản xuất từ Aspergillus niger có khoảng pH hoạt động tối thích từ 3,5 ÷ 4,5 và với giá trị pH càng cao thì hoạt tính enzyme glucoamylase càng giảm. Điều này còn phù hợp với lý thuyết vì hầu hết các enzyme glucoamylase có tính acid và hoạt động thích hợp ở pH thấp (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
(a)
(b)
Z = 0,135225*X + 5,73466*Y + 0,0725998*Y*X -1,26061*Y2 - 0.00372956*X2; R2 = 99,92 %
Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (oC), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng đường khử (%)
Hình 4.7 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân dịch nếp với enzyme glucoamylase
Với kết quả thí nghiệm ở bảng 4.5 và hình 4.6 cùng đồ thị 3D hình 4.7.a và đồ thị Contour hình 4.7.b nhận thấy có ảnh hưởng lớn của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân dịch nếp tiếp bằng enzyme glucoamylase có giá trị cao nhất ở pH 4 và nhiệt độ 61oC là 2 thông số tối ưu để tiến hành đường hóa cho các thí nghiệm tiếp theo sau.
4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng.
Khi bổ sung enzyme glucoamylase vào dịch nếp trong quá trình đường hóa thì hàm lượng đường khử tăng lên đáng kể. Số liệu thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.6
Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra, (g/100ml)
Thời gian (phút)
Nồng độ enzyme (%)
Trung bình (Nồng độ)
10
20
30
40
0,4
13,11
13,79
14,16
14,36
13,85c
0,5
13,60
14,36
14,97
15,18
14,52b
0,6
14,36
14,75
15,88
16,13
15,28a
0,7
14,16
14,56
15,88
16,13
15,18a
13,81C
14,36B
15,22A
15,45A
Trung bình (Thời gian)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 55
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.6 cho thấy: nồng độ enzyme và thời gian thủy phân có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của glucoamylase trong quá trình đường hóa.
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ glucoamylase và thời gian thuỷ phân dịch nếp đến lượng đường khử sinh ra
Từ kết quả thống kê ở bảng 4.6 và hình 4.8 thể hiện hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase ở nồng độ 0,4% và 0,5% có khác biệt thống kê, nhưng giữa nồng độ 0,6% và 0,7% thì lượng đường khử sinh ra tăng không đáng kể, không có khác biệt thống kê ở ý nghĩa 5%. Điều này có thể giải thích ứng với nồng độ glucoamylase thấp thì chưa đủ lượng enzyme để phân cắt hết các cơ chất như: polysaccharides, oligosaccharides, disaccharides sau khi được thủy phân bởi enzyme α-amylase. Nhưng khi tăng nồng độ enzyme glucoamylase sử dụng thì tốc độ phản ứng thủy phân sẽ tăng vì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn, nhưng tăng đến một giới hạn nhất định thì sự tăng này không có khác biệt ý nghĩa thống kê. Ở nồng độ enzyme glucoamylase 0,6% cho thấy lượng tinh bột còn sót lại là 1,86% (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM,2010) vì tinh bột vẫn tiếp tục được phân cắt nếu sử dụng tiếp glucoamylase nhằm tăng thêm lượng đường khử.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 56
Đối với yếu tố thời gian thủy phân, khi đường hóa dịch nếp thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo thời gian hoạt động của enzyme glucoamylase. Điều này có thể lý giải, khi thời gian thủy phân đủ dài thì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn và hiệu quả phân cắt các liên kết trong chuỗi polysaccharides, oligosaccharides và disaccharides triệt để hơn, nên lượng đường khử thu được sẽ cao hơn. Tuy nhiên, về mặt thống kê thì hàm lượng đường khử thu nhận được không có sự khác biệt ý nghĩa khi thủy phân ở 30 phút và 40 phút vì khi kéo dài thời gian nhưng
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
lượng cơ chất còn lại không nhiều nên lượng đường khử sinh ra tăng lên không đáng kể. Đường khử thu được khi thủy phân ở 10 phút, 20 phút so với 30 phút và 40 phút thì có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
(a)
(b)
Z = 44,0201*X+ 0,0865722*Y + 0,052097*Y*X-0,00112331*Y2-36,6521*X2; R2 = 99,94 %
Ghi chú X: Nồng độ enzyme glucoamylase (v/v), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng đường khử (%)
Hình 4.9 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành
Số liệu thể hiện ở bảng 4.6 và hình 4.8 cùng đồ thị 3D hình 4.9.a với đồ thị Countour hình 4.9.b đồng thời xét về mặt hiệu quả kinh tế mang lại, cho thấy nồng độ enzyme glucoamylase 0,6% và thời gian 39 phút lượng đường khử thu được 16,10% là 2 thông số tối ưu để tiến hành quá trình đường hóa cho các thí nghiệm sau.
4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân
Thí nghiệm tiến hành trên cơ chất là tinh bột trong nguyên liệu nếp trắng đã được thuỷ phân trước bằng enzyme α-amylase với mục tiêu là xác định ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme glucoamylase, thực hiện thí nghiệm với các nồng độ bột nếp thay đổi từ 5% đến 40% (w/v) cùng với các thông số tối ưu đạt được từ thí nghiệm 4.3.1, 4.3.2 như nồng độ enzyme được sử dụng là 0,6% và thời gian thủy phân là 39 phút, pH 4, nhiệt độ 61oC. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.7
Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase
Tỉ lệ bột nếp (%)
5
10
15
20
25
30
35
40
Đường khử (%)
4,03g 7,94f 11,67e 15,88d 18,52c 22,45b 26,18a 26,59a
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 57
Số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.7 và hình 4.10 cho thấy khi tăng nồng độ tinh bột thì hàm lượng đường khử sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Nhưng vận tốc phản ứng chỉ tăng nhanh khi tăng nồng độ tinh bột từ 5% đến 30%,
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
cho đến khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng, song tốc độ tăng chậm hơn so với trước có thể do lượng enzyme đã liên kết với cơ chất gần hết nếu tiếp tục tăng tỉ lệ bột nếp thì tốc độ phản ứng vẫn không tăng nữa.
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ bột nếp đến lượng đường khử sinh ra khi thủy phân với enzyme glucoamylase
Sau khi khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột trong nguyên liệu nếp, tiến hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm men với nồng độ 0,2% (Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm rượu (ĐC) sẽ được so sánh với rượu lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng men thuốc bắc (TB) và rượu lên men từ dịch nếp có bổ sung thêm papain (PA) hoặc bromelain (BR), kết quả được thể hiện ở thí nghiệm 4.6.
4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase và glucoamylase.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 58
Nấm men Saccharomyces cerevesiae chỉ có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin tự do, peptide), vitamin và các nguyên tố vi lượng… qua màng tế bào trong quá trình phát triển sinh khối và lên men rượu. Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển sinh khối và chuyển hoá thành rượu của nấm men được tiến hành. Nhưng nấm men cần phải được cung cấp thêm từ môi trường nguồn nitơ ở dạng hòa tan có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Nguồn nitơ dạng hữu cơ thường dùng là acid amin tự do, pepton, amid, urê, đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Chính vì thế thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu thủy phân protein trong nguyên liệu nếp 7,93% (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM) để tăng thêm lượng acid amin tự do và peptide mạch ngắn cho
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
nấm men phát triển tốt hơn và tạo ra sản phẩm rượu chất lượng cao hơn với màu vàng nhạt (phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin), độ trong và mùi, vị đặc trưng cho rượu vang nếp.
4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp.
Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 và 4.3 các thông số được cố định sử dụng tiếp để tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ thủy phân của enzyme papain đến lượng nitơ amin tạo thành. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.8 như sau:
Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain, (g/100g).
Nhiệt độ thuỷ phân (oC)
Trung bình
pH dịch nếp
(pH)
40
45
50
55
5,0
0,0636
0,0702
0,0724
0,0714
0,0694c
5,5
0,0687
0,0747
0,0796
0,0743
0,0743b
6,0
0,0719
0,0780
0,0826
0,0781
0,0777a
6,5
0,0680
0,0736
0,0758
0,0747
0,0730b
0,0681C
0,0741B
0,0776A
0,0746B
Trung bình (Nhiệt độ)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp bằng enzyme papain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 59
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.8 và đồ thị hình 4.11 cho thấy nhiệt độ thủy phân và pH dịch nếp có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme papain.
Đối với nhân tố nhiệt độ: Khi tiến hành thủy phân protein trong dịch nếp ở nhiệt độ 50oC thì lượng nitơ amin sinh ra là cao nhất và thấp nhất ở nhiệt độ 40oC, giữa các mức nhiệt độ 40oC, 45oC, 50oC và 55oC lượng nitơ amin sinh ra đều có khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Bên cạnh thông số nhiệt độ thì yếu tố pH dịch nếp cũng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme papain, ở pH 6,0 lượng nitơ amin tạo thành là cao nhất và pH 5,0 là thấp nhất, giữa các mức pH 5,0, 5,5, 6,0 và 6,5 cho thấy lượng nitơ amin tạo thành đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
(a)
(b)
Z = -0,487917 + 0,00928307*X + 0,113975*Y -0,0000366*Y*X – 0,0095125*Y2 – 0,000090625*X2; R2 = 99,75 %
Ghi chú X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng nitơ amin (%)
Hình 4.12 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme papain.
Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.8 và hình 4.11 cùng đồ thị 3D hình 4.12.a, với đồ thị Contour hình 4.12.b cho thấy hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi phân cắt protein trong dịch nếp có giá trị cao nhất ở pH 5,9 và nhiệt độ 500C điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết về điều kiện tối thích cho enzyme papain có nguồn gốc từ đu đủ. Do đó, chế độ nhiệt độ 500C và pH 5,9 là 2 thông số tối ưu để enzyme papain thủy phân protein trong dịch nếp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 60
Kế thừa số liệu pH và nhiệt độ tối ưu đạt từ thí nghiệm 4.4.1 tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các mức nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân đến khả năng phân cắt protein trong dịch nếp trắng thông qua hàm lượng nitơ amin sinh ra. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.9:
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng, (g/100g).
Thời gian thủy phân (phút)
Nồng độ enzyme (%)
Trung bình (Nồng độ)
20
30
40
50
0,1
0,0568
0,0651
0,0690
0,0695
0,0651c
0,2
0,0641
0,0675
0,0718
0,0747
0,0695b
0,3
0,0668
0,0684
0,0812
0,0816
0,0745a
0,4
0,0671
0,0704
0,0819
0,0820
0,0754a
0,0637C
0,0678B
0,0760A
0,0769A
Trung bình (Thời gian)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.9 cho thấy nồng độ enzyme và thời gian thủy phân có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme papain
Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian đến hàm lượng nitơ amin tạo khi thủy phân protein dịch nếp trắng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 61
Theo số liệu thống kê được thể hiện ở bảng 4.9 và hình 4.13 cho thấy khi cùng nồng độ cơ chất bột nếp, nhiệt độ, pH và thời gian thủy phân với các mức nồng độ papain khác nhau thì lượng nitơ amin tạo thành cũng sẽ khác nhau. Ở nồng độ enzyme papain
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
0,3% lượng nitơ amin sinh ra cao hơn nhiều so với nồng độ 0,1% và 0,2 %, tuy nhiên ở 2 mức 0,3% và 0,4% thì lượng nitơ amin sinh ra không có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy thời gian thủy phân có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình phân cắt protein trong dịch nếp, hàm lượng nitơ amin sinh ra tăng theo thời gian thủy phân từ 10 phút đến 30 phút, nhưng khi tăng thời gian cao hơn 30 phút thì lượng nitơ amin tạo thành tăng lên không đáng kể. Kết quả thống kê cho thấy ở các mức thời gian thủy phân 10 phút, 20 phút và 30 phút thì lượng nitơ amin sinh ra có khác biệt ý nghĩa, nhưng ở 30 phút và 40 phút không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
(a)
(b)
Ghi chú X: Nồng độ enzyme papain (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng nitơ amin (%)
Z= 0,141952*X+0,00255603*Y-0,000370731*Y*X-0,0000276501*Y2 – 0,179262*X2; R2= 99,69 %
Hình 4.14 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành
Từ các số liệu thể hiện ở bảng 4.9, hình 4.13 và đồ thị 3D cùng đồ thị Contour hình 4.14.a; 4.14.b cho thấy nồng độ enzyme papain 0,35% (v/v) và thời gian thủy phân 45 phút hàm lượng nitơ amin thu được 0,0809% là 2 thông số tối ưu để thủy phân protein trong dịch nếp cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 62
Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất là protein trong nguyên liệu nếp trắng đã được dịch hóa và đường hóa trước bằng α-amylase, glucoamylase với mục tiêu là xác định độ nhạy km và vận tốc cực đại Vmax của enzyme papain trong quá trình thủy phân. Trong thí nghiệm này, nồng độ enzyme được sử dụng là 0,35% và thời gian thủy phân là 45 phút, pH 5,9, nhiệt độ 500C. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.10
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.10 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính enzyme papain
5
10
15
20
25
30
35
40
Tỉ lệ bột nếp (%)
Nitơ amin 0,0602g
0,0680f 0,0776e 0,0834cd 0,0885cd 0,0904cb 0,0968a
0,0989a
0,0544
0,0720
0,0808
0,0859
0,0894
0,0919
0,0937
0,0951
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Hình 4.15 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp sử dụng đến hoạt tính enzyme papain
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.10 và hình 4.15 cho thấy khi tăng nồng độ bột nếp đồng nghĩa việc tăng hàm lượng protein thì hàm lượng nitơ amin sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột nếp từ 5% đến 30%. Khi tiếp tục tăng nồng độ bột nếp lên 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước có thể do lượng enzyme đã liên kết với cơ chất gần hết nếu tiếp tục tăng cơ chất thì phản ứng vẫn không tăng nữa.
Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1 để xác định giá trị Vmax và km của enzyme papain khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng như sau:
Vmax= 0,1065 ± 0,00362 (g/100g/45phút); km= 4,7822 ± 0,7705 (g/100g)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 63
Với các thông số tối ưu: nồng độ enzyme, tỉ lệ bột nếp, thời gian, pH và nhiệt độ thủy phân kế thừa từ thí nghiệm 4.4.1, 4.4.2 và 4.4.3 được ứng dụng để thủy phân protein trong dịch nếp với mục tiêu là thu được những acid amin tự do thể hiện ở bảng 4.11 nhằm để cải thiện màu sắc, mùi vị đặc trưng cho sản phẩm rượu vang nếp.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.11 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein bằng enzyme papain, (mg/kg)
STT Acid amin mg/kg STT
mg/kg STT
Acid amin mg/kg
Phenylalanine
1 2
Histidine Tyrosine
2,4 1,9
Acid amin 8 Glycine 9 Valine
0,8 1,1
15 16 Hydroxylysine
0,0 0,0
3
Cystine
0,0
10 Leucine
0,7
17
Tryptophan
4,3
4
Lysine
1,3
Isolecine
11
0,5
18 Asparticacid
7,5
5
Threonine
0,0
Serine
12
0,0
19 Methionine
4,7
6
Arginine
KPH
13
Proline
16,1
7
Alanine
0,7
14 Glutamic
0,0
(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010)
Sau khi khảo sát động học và ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột và papain trong quá trình phân cắt protein trong nguyên liệu. Bột nếp được pha với tỉ lệ 1 nếp: 4 nước để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bằng 0,3% α–amylase trong 31 phút ở pH 6,5, nhiệt độ 870C và kết hợp với 0,6% glucoamylase trong 39 phút ở pH 4, nhiệt độ 610C cho quá trình đường hóa, tiếp theo là thủy phân protein trong dịch nếp bằng papain với nồng độ enzyme 0,35 %, thời gian 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C. Quá trình thủy phân bằng enzyme kết thúc tiến hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm men với nồng độ 0,2 % w/v để lên men rượu (Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm lên men này được so sánh với sản phẩm lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc (TB), sản phẩm lên men từ dịch nếp không sử dụng protease (ĐC) và sản phẩm lên men từ dịch nếp có bổ sung bromelain (BR), kết quả được thể hiện thí nghiệm 4.6.
4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase
4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 64
Từ kết quả tối ưu đạt được của các thí nghiệm 4.2 và 4.3 các thông số được cố định sử dụng tiếp để tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ thủy phân của enzyme bromelain đến lượng nitơ amin tạo thành. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.12 như sau:
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.12 Kết quả ảnh hưởng mức pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain, (g/100g)
Nhiệt độ thuỷ phân (oC)
pH
Trung bình (pH)
45
50
55
60
5,0
0,0460
0,0462
0,0508
0,0465
0,0474b
5,5
0,0466
0,0509
0,0551
0,0532
0,0515a
6,0
0,0465
0,0504
0,0514
0,0503
0,0496a
6,5
0,0463
0,0478
0,0493
0,0468
0,0475b
0,0464C
0,0488B
0,0517A
0,0492B
Trung bình (Nhiệt độ)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.12 cho thấy pH và nhiệt độ thủy phân có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme bromelain
Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 65
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Dựa trên những số liệu thể hiện ở bảng 4.12 và hình 4.16 cho thấy pH và nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein trong dịch nếp của enzyme bromelain
Đối với nhân tố nhiệt độ ở 550C lượng nitơ amin sinh ra cao nhất, ở 450C là thấp nhất, giữa các mức nhiệt độ 450C, 500C, 550C và 600C lượng nitơ amin sinh ra đều có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%.
Bên cạnh ảnh hưởng của nhiệt độ thì pH cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme bromelain, ở pH 5,5 và 6 lượng nitơ amin tạo thành cao nhất và thấp nhất ở pH 5,0 và 6,5. Hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi thủy phân ở pH 5,5 và 6 không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Hàm lượng nitơ amin thu được khi thủy phân ở mức pH 5,0 và 6,5 có sự khác biệt thống kê ý nghĩa ở mức 5%.
(a)
(b)
Z= -0,325421 + 0,00592317*X + 0,07557*Y - 0,0000866667*X*Y - 0,0000495*X2 - 0,0062*Y2;
R2= 99,68 %
Ghi chú: X: Nhiệt độ thủy phân (0C), Y: pH dịch nếp, Z: Hàm lượng nitơ amin (%)
Hình 4.17 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp với enzyme bromelain.
Theo số liệu thí nghiệm cho thấy hàm lượng nitơ amin tạo thành sẽ giảm khi thay đổi pH và nhiệt độ thủy phân đều này có nghĩa là enzyme bromelain chỉ thủy phân protein tốt nhất ở mỗi giá trị pH và nhiệt độ tối thích, điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết về điều kiện tối thích cho enzyme bromelain có nguồn gốc từ khóm. Thông qua kết quả ở bảng 4.12 và hình 4.16, đồ thị không gian 3D hình 4.17.a và đồ thị Countour hình 4.17.b cho thấy hàm lượng nitơ amin thu nhận được khi thủy phân protein trong dịch nếp có giá trị cao nhất ở pH 5,7 và nhiệt độ 550C. Do đó, chế độ nhiệt độ 550C và pH 5,7 là 2 thông số tối ưu để bromelain thủy phân protein trong dịch nếp khi tiến hành các thí nghiệm sau.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 66
4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein dịch nếp.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân protein trong dịch nếp trắng thể hiện ở bảng 4.13
Bảng 4.13 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng, (g/100g).
Thời gian (phút)
Nồng độ enzyme (%)
Trung bình (Nồng độ)
30
40
50
60
0,3
0,0443
0,0476
0,0461
0,0492
0,0468c
0,4
0,0445
0,0483
0,0519
0,0521
0,0492b
0,5
0,0474
0,0513
0,0535
0,0537
0,0515a
0,6
0,0478
0,0522
0,0536
0,0538
0,0519a
0,0460C
0,0499B
0,0513AB
0,0522A
Trung bình (Thời gian)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian đến hàm lượng nitơ amin sinh ra khi thủy phân protein dịch nếp trắng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 67
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.13 và hình 4.18 cho thấy khi nồng độ bromelain tăng thì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme cơ chất sẽ tăng lên, từ đó tốc độ phản ứng thủy phân sẽ tăng. Ở nồng độ enyzme 0,5% và 0,6% lượng nitơ amin sinh ra cao nhất và không có
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
khác biệt ý nghĩa thống kê nhưng lượng nitơ amin tạo thành khi sử dụng nồng độ enzyme 0,3% và 0,4% so với 0,5% và 0,6% thì có sự khác biệt thống kê ở mức độ ý nghĩa 5%.
Số liệu thí nghiệm ở bảng 4.13 và đồ thị hình 4.18 cũng cho thấy thời gian thủy phân có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt động của bromelain khi phân cắt protein trong dịch nếp trắng, điều này có thể giải thích khi thời gian thủy phân đủ dài thì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất nhiều hơn và hiệu quả phân cắt các liên kết trong chuỗi peptide triệt để hơn nên lượng nitơ amin tạo thành tăng cao hơn. Hàm lượng nitơ amin sinh ra tăng theo thời gian thủy phân từ 30 đến 50 phút, nhưng khi tăng thời gian thủy phân cao hơn 50 phút thì lượng nitơ amin sinh ra tăng lên không nhiều. Kết quả thống kê cho thấy ở các mức thời gian thủy phân 30, 40, 50 phút thì lượng nitơ amin sinh ra có khác biệt ở mức ý nghĩa 5%, nhưng 50 và 60 phút thì lượng nitơ amin tạo thành không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
(a)
(b)
Z = 0,0804055*X+ 0,00112547*Y-0,0000102213*Y*X – 0,0000102604*Y2-0,0688545*X2;
R2 = 99,79%
Ghi chú X: Nồng độ enzyme bromelain (%), Y: Thời gian thủy phân (phút), Z: Hàm lượng nitơ amin (%)
Hình 4.19 Đồ thị 3D và Contour biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân đến lượng nitơ amin sinh ra
Theo số liệu ở bảng 4.13, hình 4.18 và hình 4.19.a, 4.19.b đồng thời xét về mặt hiệu quả kinh tế mang lại, cho thấy nồng độ enzyme bromelain 0,5 % và thời gian 55 phút với hàm lượng nitơ amin sinh ra 0,054 % là thông số tối ưu để tiến hành quá trình thủy phân protein trong dịch nếp cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 68
Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất là protein trong nguyên liệu nếp trắng đã được dịch hóa và đường hóa trước bằng enzyme α-amylase, glucoamylase với mục tiêu là xác định độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Trong thí nghiệm này, nồng độ enzyme được sử dụng là 0,5% và thời gian thủy phân là 55 phút ở pH 5,7 và nhiệt độ 55oC kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.14.
Bảng 4.14 Kết quả ảnh hưởng của các tỉ lệ bột nếp trắng đến hoạt tính của enzyme bromelain, (g/100g).
5
10
15
20
25
30
35
40
Tỉ lệ bột nếp (%)
Nitơ amin
0,0376e 0,0458d 0,0467d 0,0535c 0,0548bc 0,0563ab 0,0564ab 0,0578a
0,0362
0,0458
0,0503
0,0529
0,0546
0,0558
0,0567
0,0574
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c… trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Hình 4.20 Đồ thị Michaelis- Menten biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ cơ chất nếp đến hoạt tính enzyme bromelain
Số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.14 và hình 4.20 cho thấy khi tăng nồng độ protein trong bột nếp thì hàm lượng nitơ amin sinh ra cũng tăng theo nghĩa là vận tốc phản ứng tăng. Vận tốc phản ứng tăng nhanh khi tăng nồng độ bột nếp từ 5% đến 25%. Khi tiếp tục tăng nồng độ lên 30%, 35% và 40% thì vận tốc phản ứng cũng tiếp tục tăng song tốc độ tăng chậm hơn so với trước.
Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SAS 9.1 xác định được các giá trị Vmax và km của enzyme bromelain khi phân cắt protein trong dịch nếp trắng ứng với nồng độ enzyme 0,5% và thời gian thủy phân 55 phút, pH 5,7 và nhiệt độ 550C như sau:
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 69
Vmax = 0,0622 ± 0,00132 (g/100g/55phút); km = 3,5652 ± 0,4280 (g/100g)
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Với các thông số tối ưu như nồng độ bromelain, tỉ lệ bột nếp, thời gian, pH và nhiệt độ thủy phân được kế thừa từ thí nghiệm 4.5.1, 4.5.2 và 4.5.3 được ứng dụng để thủy phân protein trong dịch nếp với mục tiêu là thu được những acid amin tự do thể hiện ở bảng 4.15 nhằm để cải thiện màu sắc, mùi vị đặc trưng cho sản phẩm rượu vang nếp.
Bảng 4.15 Hàm lượng acid amin tự do trong dịch nếp trắng thu được sau khi thủy phân protein bằng enzyme bromelain, (mg/kg)
STT Acid amin mg/kg STT
mg/kg STT
Acid amin mg/kg
Phenylalanine
1 Histidine Tyrosine 2
1,8 2,2
Acid amin 8 Glycine 9 Valine
1,7 1,5
15 16 Hydroxylysine
0,8 0,0
3
Cystine
0,0
10 Leucine
1,3
17 Tryptophan
3,3
4
Lysine
1,3
11
Isolecine
0,5
18 Asparticacid
6,5
5
Threonine
0,0
12
Serine
0,0
19 Methionine
6,9
6 Arginine
KPH
13
Proline
19,5
7 Alanine
1,2
14 Glutamic
1,4
(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010)
Sau khi khảo sát động học và ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột và bromelain trong quá trình phân cắt protein nguyên liệu. Nếp được pha với nước tỉ lệ 1: 4 để tiến hành quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bằng 0,3% α–amylase trong 31 phút ở pH 6,5, nhiệt độ 870C và kết hợp với 0,6% glucoamylase trong 39 phút ở pH 4, nhiệt độ 610C cho quá trình đường hóa, tiếp theo là thủy phân protein trong dịch nếp bằng bromelain với nồng độ enzyme 0,5%, thời gian 55 phút ở pH 5,7, nhiệt độ 550C. Quá trình thủy phân bằng enzyme kết thúc tiến hành lọc dịch nếp, điều chỉnh pH về 4,9 và bổ sung nấm men với nồng độ 0,2 % w/v (Hà Thị Thụy Vy, 2009). Khi đó sản phẩm lên men này được so sánh với sản phẩm lên men bằng phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc (TB), sản phẩm lên men từ dịch nếp không sử dụng protease (ĐC) và sản phẩm lên men từ dịch nếp có bổ sung enzyme papain (PA), kết quả được thể hiện thí nghiệm 4.6.
4.6 Kết quả theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 70
Sản phẩm rượu lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng nguyên liệu nếp trắng với men thuốc bắc Hải Anh Quang, loại men được sử dụng rất phổ biến trên thị trường vì đây là loại men này có tính năng hòa men với nước ngâm trực tiếp cơm. Quy trình sản xuất tiến hành theo hướng dẫn sử dụng được in trên bao bì của nhà sản xuất. Với phương châm là tạo ra rượu nếp có hương thơm cổ truyền dân tộc, rượu êm
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
dịu, không nhức đầu không khát nước, năng suất cao, dễ sử dụng, không hư hỏng, phù hợp với mọi nguồn nước và mọi khí hậu.
Sản phẩm thứ nhất là rượu lên men truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc (TB), thứ 2 là rượu sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase thủy phân tinh bột thành đường khử rồi bổ sung nấm men thuần chủng để lên men rượu (ĐC), thứ 3 là rượu dùng enzyme α-amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột và papain thủy phân protein thành acid amin rồi chủng nấm men để lên men rượu (PA), loại rượu thứ 4 dùng enzyme α-amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột và bromelain phân cắt protein thành acid amin rồi chủng nấm men để lên men rượu (BR).
Các sản phẩm rượu nếp được tiến hành khảo sát sự biến đổi các chỉ tiêu chất lượng về hóa lí: độ Brix, đường khử, độ rượu, pH, acid, ester, furfurol, methanol, aldehyde… về cảm quan và vi sinh vật theo TCVN 7045: 2009 trong suốt quá trình lên men chính 7÷8 ngày, lên men phụ và ổn định trong 3 tháng.
4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp.
Sự thay đổi độ Brix dịch lên men được xem một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá quá trình lên men rượu nhanh hay chậm
Bảng 4.16 Kết quả khảo sát thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại rượu
Độ Brix
Thời gian lên men (ngày)
Trung bình (Thời gian)
Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain
16,3
14,0
12,3
9,7
13,1a
1
14,4
10,8
8,8
6,6
10,2b
2
11,0
8,8
7,5
6,3
8,4c
3
10,4
6,9
5,9
5,6
7,2cd
4
7,2
6,1
5,4
5,3
6,0de
5
7,0
5,8
5,2
5,1
5,8f
6
6,4
4,8
5,2
4,9
5,3f
7
10,4A
8,2B
7,2BC
6,2C
Trung bình (Loại rượu)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 71
Kết quả thống kê ở bảng 4.16 và hình 4.21 cho thấy độ Brix dịch lên men đều giảm theo thời gian. Trong 4 ngày đầu lên men độ Brix giảm rất nhanh có sự khác biệt
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
thống kê ở mức ý nghĩa 5% vì ở giai đoạn nấm men sử dụng rất nhiều chất dinh dưỡng hòa tan để phát triển sinh khối và lên men nhưng từ ngày 6 đến 7 thì độ Brix thay đổi nhỏ, không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê do lúc này trong dịch lên men lượng đường còn lại không nhiều, quá trình lên men gần đến thời điểm kết thúc.
Hình 4.21 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men chính của các loại ruợu
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.16 cho thấy độ Brix của 4 loại rượu có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%, rượu loại 1 sử dụng bánh men thuốc bắc độ Brix sau quá trình lên men cao hơn 3 loại rượu sử dụng trực tiếp enzyme amylase, protease thương mại để phân cắt tinh bột và protein vì những sản phẩm được tạo thành sau quá trình thủy phân dễ dàng được nấm men sử dụng để phát triển sinh khối và chuyển hóa thành rượu.
4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp.
Trong quá trình lên men rượu để kiểm soát chính xác hơn tốc độ tiến trình nhanh hay chậm có thể thông qua hàm lượng đường khử còn lại. Kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.17 cho thấy đường khử của 4 loại rượu giảm dần theo thời gian lên men rượu.
Dựa vào bảng 4.17 và hình 4.22 cho thấy hàm lượng đường khử giảm mạnh nhất trong 5 ÷ 6 ngày đầu của quá trình ủ. Trong thời gian này nấm men sử dụng rất nhiều đường khử để phát triển sinh khối và chuyển hóa thành rượu. Những ngày tiếp theo lượng đường khử còn lại rất ít và giảm dần rất chậm.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 72
Theo kết quả thống kê nhận thấy vào các ngày 5, 6 hàm lượng đường khử còn lại không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% nên có thể dựa vào thông số hàm lượng đường khử còn lại làm yếu tố để xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men chính chuyển qua tiến trình lên men phụ và ổn định sản phẩm.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.17 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính của các loại rượu
Hàm lượng đường khử, (g/100ml)
Thời gian lên men (ngày)
Trung bình (Thời gian)
Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain
13,75
11,99
11,04
6,25
10,76a
1
12,73
7,69
4,88
3,31
7,15b
2
9,95
4,91
3,30
1,57
4,93c
3
6,66
2,02
0,72
0,54
2,49d
4
3,17
1,29
0,44
0,41
1,33de
5
2,02
0,58
0,41
0,29
0,83de
6
0,46
0,42
0,37
0,23
0,37f
7
6,96A
4,13B
3,02BC
1,80C
Trung bình (Loại rượu)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử theo thời gian lên men chính của các loại rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 73
Lượng đường khử còn lại sau khi lên men ở 4 loại rượu cũng khác biệt có ý nghĩa ở mức 5%, loại rượu 3, 4 có sử dụng enzyme papain và bromelain hàm lượng đường khử còn sót lại thấp hơn rượu loại 2 không sử dụng protease và loại rượu dùng bánh men thuốc bắc nên nồng độ rượu trong 2 sản phẩm này sẽ cao hơn vì nấm men sử dụng đường chuyển thành rượu.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp.
Chất lượng rượu vang cao hay thấp thể hiện qua rất nhiều chỉ tiêu trong đó độ rượu là một trong những tiêu chí để đánh giá và quyết định, chính vì thế thông số nồng độ rượu được phân tích trong suốt thời gian lên men chính, lên men phụ và ổn định. Thông thường phân loại rượu dựa theo độ rượu là chủ yếu, có ba loại chính: rượu vang: 8 ÷ 18% độ cồn, thường vào khoảng 12 %; rượu mùi: khoảng 15 ÷ 75% độ cồn, thông thường dưới 30%; rượu mạnh: thường vào khoảng 30 ÷ 55% độ rượu.
Bảng 4.18 Kết quả thay đổi độ rượu trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
Độ rượu, (v/v)
Thời gian lên men (ngày)
Trung bình (Thời gian)
Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain
1
1,5
2,5
4,3
5,5
3,5f
2
2,5
5,8
7,8
8,8
6,3e
3
3,7
7,8
8,8
9,5
7,5d
4
4,5
9,8
10,3
10,7
8,8c
5
5,0
10,8
11,5
11,5
9,7b
6
6,5
11,5
11,7
11,8
10,4ab
7
8,3
11,5
11,8
12,0
10,9a
4,6C
8,5B
9,5A
10,0A
Trung bình (Loại rượu)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 74
Từ kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.16 và hình 4.23 cho thấy độ rượu tăng khá nhanh trong 5 ngày đầu của tiến trình và sau đó ổn định, điều này được giải thích là trong giai đoạn đầu nấm men phát triển nhanh vì trong dịch lên men hàm lượng đường khử còn cao, quá trình lên men diễn ra khá mạnh nên lượng rượu sinh ra nhiều. Độ rượu tăng chậm trong những ngày còn lại do quá trình lên men yếu dần vì lượng đường khử ở bảng 4.15 còn lại rất ít và độ cồn tăng dần sẽ ức chế hoạt động nấm men vì ở nồng độ rượu 2÷ 5 % có tác dụng kìm hãm nấm men phát triển và ở nồng độ rượu 5÷ 6% làm nấm men đình chỉ sinh sản mặc dù lên men vẫn tiếp tục (Lương Đức Phẩm, 2002). Độ rượu đạt tối đa 11÷12 % vào khoảng 6, 7 ngày, không có sự khác biệt ý nghĩa thông kê ở mức 5 % nên có thể kết thúc quá trình lên men chính vào ngày thứ 6 để chuyển sang công đoạn lên men phụ và ổn định sản phẩm.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính của các loại rượu
Theo số liệu thể hiện ở bảng 4.18 và hình 4.23 cho thấy ở rượu loại 1 sử dụng bánh men thuốc bắc hòa với nước chan trực tiếp vào cơm nếp có độ rượu sinh ra thấp nhất do trong bánh men thuốc bắc nấm mốc sinh ra enzyme có hoạt tính không cao như enzyme thương mại và nấm men lên men hoạt động không tốt bằng nấm men thuần chủng. Tiếp theo là rượu loại 2 dùng enzyme α-amylase và glucoamylase thương mại để dịch hóa và đường hóa nhằm chuyển tinh bột thành đường và bổ sung nấm men thuần chủng lên men thu được độ rượu cao hơn loại 1. Cuối cùng là 2 loại rượu với việc sau khi sử dụng hệ enzyme amylase tiếp tục thủy phân protein bằng enzyme papain hoặc bromelain để tăng cường thêm lượng acid amin tự do và peptide mạch ngắn cung cấp cho hoạt động phát triển sinh khối và lên men của nấm men được tốt hơn, kết quả là rượu loại 3 và 4 có độ rượu tạo thành cao hơn loại 1, 2.
Theo kết quả thí nghiệm cho thấy rượu loại 3 sử dụng thêm enzyme papain và loại 4 bổ sung thêm enzyme bromelain thu được độ rượu sinh ra cao nhất và không có sự khác biệt giữa 2 mẫu. Rượu loại 1 sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu loại 2 chỉ sử dụng hệ enzyme amylase có hàm độ rượu sinh ra thấp hơn và có sự khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 mẫu rượu loại 3, 4. Do đó để sản xuất rượu vang nếp có độ rượu cao có thể chọn mẫu có bổ sung enzyme protease vì độ rượu là một trong những yếu tố chính quyết định chất lượng và thời gian bảo quản lâu dài sản phẩm rượu vang.
4.6.4 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp.
Theo những kết quả nghiên cứu cho thấy pH 4,5 ÷ 5 là khoảng tối thích cho nấm men Saccharomyces cerevesiae phát triển. Cùng với nghiên cứu (Hà Thị Thụy Vy, 2009) giá trị pH 4,9 là thông số tối thích cho nấm men hoạt động trong sản xuất rượu vang nếp. Cho nên dịch nếp trước khi bổ sung nấm men được điều chỉnh về pH 4,9. Trong quá trình lên men rượu, sự biến đổi của pH theo thời gian ở các mẫu phản ánh quá trình tạo thành các acid hữu cơ, sản phẩm phụ của quá trình lên men ethanol.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 75
Một trong những nguyên nhân làm pH giảm trong quá trình lên men rượu tương ứng với việc tăng acid tổng số. Giá trị pH giảm trong quá trình lên men rượu là do:
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
+ Trong quá trình phát triển của nấm men sẽ sinh ra acid oxalic di chuyển ra khỏi tế
bào nấm men vào canh trường.
+ Trong quá trình phát triển nấm men làm phá vỡ hệ đệm phosphate (do nấm men
sử dụng phosphate trong quá trình thủy phân) làm cho pH giảm.
+ Trong quá trình lên men sẽ sinh ra CO2 sẽ hòa tan vào canh trường làm pH giảm
(Bùi Thị Huỳnh Hoa, 2004).
Theo kết quả thống kê thể hiện ở bảng 4.19 và hình 4.24 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% về pH của 4 loại rượu và sự thay đổi của pH của từng mẫu theo thời gian lên men.
Bảng 4.19 Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
Giá trị pH
Thời gian lên men (ngày)
Trung bình (Thời gian)
Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain
3,75
3,82
4,13
3,79
3,87a
1
3,59
3,74
3,52
3,86
3,68c
2
3,66
3,85
3,50
3,88
3,72bc
3
3,72
3,86
3,46
3,92
3,74bc
4
3,70
3,91
3,49
3,97
3,77abc
5
3,72
3,94
3,58
3,98
3,80ab
6
3,75
3,96
3,66
3,99
3,84ab
7
3,62B
3,70B
3,87A
3,91A
Trung bình (Loại rượu)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 76
Trong những ngày đầu, pH của 4 mẫu có giảm là do quá trình lên men rượu xảy ra tạo ra khí CO2 và C2H5OH, lượng CO2 hòa tan vào nước tạo ra H2CO3 là acid yếu làm giảm pH. Từ ngày thứ 3 trở đi pH tăng trở lại, do H2CO3 là acid không bền nó phân ly tạo ra khí CO2 và nước làm cho pH tăng trở lại sau đó ổn định trong giai đoạn cuối của quá trình lên men rượu.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian lên men chính của các loại rượu
Kết quả thí nghiệm còn cho thấy, ở giai đoạn nấm men hô hấp hiếu khí để phát triển sinh khối trong giai đoạn đầu, quá trình lên men diễn ra nhanh hơn, acid hữu cơ tạo thành nhiều hơn nên giá trị pH giảm nhanh hơn. Vào giai đoạn cuối của quá trình lên men, pH có xu hướng tăng nhẹ trong cả 4 trường hợp. Có lẽ do những acid tạo thành đã phản ứng với các cấu tử khác trong dịch lên men như các loại rượu để tạo thành các ester. Thật ra, ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, phản ứng ester hóa cũng có thể xảy ra nhưng do lượng acid tạo thành nhanh và hàm lượng rượu còn ít nên pH giảm.
Ngoài ra pH giảm trong thời gian đầu có thể vì nấm men chuyển hóa đường sinh ra rượu có tính acid yếu, bên cạnh đó còn có sự hiện diện của vi khuẩn khác có thể tạo thành một số acid khác: lactic, acetic, citric… dựa vào giá trị pH có thể dự đoán quá trình lên men rượu đạt hay không.
4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 77
Hàm lượng acid trong quá trình lên men rượu chủ yếu là acetic, loại acid dễ bay hơi và quyết định đến độ chua của rượu. Chỉ cần một lượng nhỏ acid acetic cũng có thể làm tăng hương vị đặc trưng của rượu vang.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.20 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của các loại rượu
Hàm lượng acid tổng, (g/l)
Thời gian lên men (ngày)
Trung bình (Thời gian)
Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain
0,411
1,355
1,836
1,957
1,390c
1
0,800
1,767
2,023
2,268
1,715b
2
1,206
1,915
2,246
2,246
1,903b
3
1,641
2,138
2,334
2,368
2,123a
4
1,869
2,062
2,354
2,256
2,134a
5
2,049
2.088
2,372
2,326
2,210a
6
2,145
2,141
2,403
2,404
2,270a
7
1,446C
1,924B
2,224A
2,261A
Trung bình (Loại rượu)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Trong quá trình lên men rượu lượng acid sinh ra có khuynh hướng tăng theo thời gian, điều này có thể do trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm: acetic, lactic, citric, pyruvic và succinic nhưng nhiều hơn cả là acetic và lactic.
Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi acid tổng theo thời gian lên men chính của các loại rượu nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 78
Theo số liệu thí nghiệm thể hiện ở bảng 4.20 và hình 4.25 cho thấy hàm lượng acid tổng tăng dần theo thời gian trong giai đoạn lên men chính. Điều này được lý giải là do trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các sản phẩm phụ song hành là các acid
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
hữu cơ như: acetic, lactic, pyruvic… Trong những ngày đầu lên men hàm lượng acid tăng nhanh và dần dần ổn định vào cuối tiến trình, mặc dù vậy không phải hàm lượng acid cao thì rượu có chất lượng tốt, với hàm lượng này quá cao thì ảnh hưởng tới vị và khả năng tồn trữ sản phẩm. Dựa vào lượng acid tổng ứng với thời gian lên men có thể biết được chất lượng men và sản phẩm lên men có bị nhiễm vi sinh vật hay không.
Quá trình lên men tạo ra rượu thì bên cạnh đó cũng tạo ra acid hữu cơ và CO2 làm pH giảm thấp tương ứng với việc tăng acid tổng số, khi độ rượu cao nấm men lên men chậm nhưng một số vi khuẩn sinh acid chịu được độ cồn cao vẫn phát triển làm tăng lượng acid vào giai đoạn cuối của quá trình lên men.
Trong bốn mẫu rượu sau khi lên men chính thì rượu loại 3, 4 có hàm lượng acid cao nhất và có sự khác biệt ý nghĩa thống kê so với loại 1, 2 vì cơ chất nền trong dịch nếp trước khi lên men của các mẫu không giống nhau
4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
Song song với việc tạo thành acid và ethanol dưới tác dụng của enzyme esterase của nấm men sẽ sản sinh ra các hợp chất ester tương ứng góp phần tạo nên hương vị đặc trưng cho từng loại rượu vang nếp
Bảng 4.21 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu
Hàm lượng ester, (g/l)
Thời gian lên men (ngày)
Trung bình (Thời gian)
Bánh men TB Đối chứng Papain Bromelain
1
0,754
0,686
0,817
0,809
0,767d
2
0,770
0,732
0,783
0,747
0,758d
3
0,842
0,736
0,687
0,648
0,728cd
4
0,780
0,751
0,663
0,641
0,709c
5
0,744
0,685
0,628
0,587
0,661b
6
0,717
0,654
0,582
0,563
0,629b
7
0,660
0,546
0,544
0,544
0,573a
0,752A
0,684B
0,672B
0,648B
Trung bình (Loại rượu)
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 79
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Hình 4.26 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi ester theo thời gian lên men chính của các loại rượu
Trong quá trình lên men khoảng 2 ngày đầu thì lượng ester gia tăng là do nấm men bắt đầu hoạt động mạnh và ester sinh ra theo 2 con đường: Thứ nhất là do acid béo no tác dụng với rượu bậc cao thành ester (phản ứng này xãy ra trong tế bào nấm men), thứ hai acid hữu cơ tác dụng với rượu sinh ra ester (phản ứng này xãy ra bên ngoài tế bào nấm men) (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004).
4.6.7 Kết quả định tính fufurol trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
Tất cả sản phẩm rượu vang nếp được định tính furfurol trong suốt thời gian lên men, kết quả thí nghiệm cho thấy cả 4 mẫu rượu đều không phát hiện furfurol, do furfurol (C5H4O2) có nhiệt độ sôi rất cao (161,7oC). Nguyên nhân hình thành furfurol trong quá trình sản xuất rượu là do quá trình nấu nguyên liệu và chưng cất làm cháy dịch lên men tạo ra.
Sự tạo thành furfurol và oxymetyl furfurol do đường mất nước. Kết quả thí nghiệm cho thấy chỉ tiêu furfurol đã không hình thành trong giai đoạn lên men chính, cho nên trong giai ổn định rượu với điều kiện bảo quản ở 100C sẽ khó làm biến đổi hàm lượng furfurol. Thêm vào đó sản phẩm rượu vang nếp không qua chưng cất nên chỉ tiêu này không phát hiện là hoàn toàn hợp lý.
4.6.8 Kết quả theo dõi chất lượng sản phẩm rượu nếp trong thời gian ổn định 3 tháng.
Sau giai đoạn lên men chính các sản phẩm rượu nếp tiếp tục được lên men phụ sau đó được lọc và ổn định ở điều kiện nhiệt độ 100C. Trong thời gian ổn định và bảo quản các chỉ tiêu chất lượng rượu về hóa lí, vi sinh và cảm quan được theo dõi suốt trong 3 tháng. Kết quả chỉ tiêu hóa lí rượu được thể hiện ở bảng 4.22, bảng 4.23 và bảng 4.24
Bảng 4.22 Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau thời gian 1 tháng
Loại rượu
Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 80
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Độ
Brix
pH
Acid (g/l)
Ester (g/l)
Furfurol (g/l)
Đường khử (g/100ml)
rượu (v/v)
TB
KPH
4,8c
0,10c
10,5b
3,61b
2,121a
0,440b
ĐC
KPH
5,6a
0,89a
11,3ab
3,76ab
2,334a
0,625a
PA
KPH
5,1bc
0,56b
11,5ab
3,87a
2,187a
0,620a
BR
KPH
5,5ab
0,58b
12,0a
3,85a
2,370a
0,634a
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
KPK: Không phát hiện
Bảng 4.23 Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau thời gian 2 tháng
Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí
Độ
Loại rượu
Brix
pH
Acid (g/l)
Ester (g/l)
Furfurol (g/l)
Đường khử (g/100ml)
rượu (v/v)
TB
KPH
4,6d
0,09c
10,3b
3,71a
2,103c
0,464d
ĐC
KPH
5,2b
0,89a
11,5a
3,76a
2,327a
0,623c
PA
KPH
5,0c
0,56b
11,8a
3,84a
2,229b
0,636b
BR
KPH
5,5a
0,58b
12,0a
3,85a
2,352a
0,660a
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự
khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 81
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 4.24 Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí các sản phẩm rượu vang nếp sau thời gian 3 tháng
Các chỉ tiêu chất lượng hóa lí
Độ
Loại rượu
pH
Brix
Acid (g/l)
Ester (g/l)
Furfurol (g/l)
Đường khử (g/100ml)
rượu (v/v)
TB
KPH
4,6d
0,09c
10,5a
3,66a
2,040b
0,471c
ĐC
KPH
5,2b
0,89a
11,8a
3,78a
2,304a
0,629b
PA
KPH
5,0c
0,56b
11,8a
3,86a
2,214a
0,638b
BR
KPH
5,4a
0,58b
12,0a
3,85a
2,328a
0,662a
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm A, B, C… (a, b, c…) trong cùng một hàng hoặc một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Sau thời gian 3 tháng ổn định và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 100C, các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm rượu dần dần ổn định, theo kết quả thể hiện ở bảng 4.22, 4.23, 4.24 cho thấy: độ Brix, đường khử sót lại, độ rượu, pH không có biến đổi nhiều có thể do quá trình lên men rượu gần đến giai đoạn kết thúc tiến trình. Ngoài ra, trong giai đoạn lên men phụ và ổn định, chỉ tiêu không kém phần quan trọng quyết định chất lượng đó là chỉ số ester, tăng dần theo thời gian tạo nên hương vị đặc trưng cho từng sản phẩm rượu vang, chính vì thế giá trị của rượu còn tùy thuộc vào “độ tuổi” của rượu.
4.6.9 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang nếp
Các sản phẩm rượu sau thời gian ổn định và bảo quản 3 tháng được mã hóa và thông qua hội đồng gồm 10 thành viên để tiến hành đánh giá chỉ tiêu chất lượng cảm quan.
Bảng 4.25 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan của các sản phẩm rượu vang nếp (TCVN 3217-79)
Các chỉ tiêu chất lượng cảm quan
Loại
rượu
Độ trong & màu sắc (0,8) Mùi (1,2) Vị (2,0)
Điểm đã được hiệu chỉnh
TB
4,3b 4,0a 3,8a 15,8
ĐC
4,6a 3,0b 3,1c 13,4
PA
4,6a 3,3b 3,3b 14,3
BR
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 82
4,7a 3,8a 3,8a 15,9
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Ghi chú: Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm (a, b, c…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5%. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại
Dựa theo những kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, các sản phẩm rượu sử dụng enzyme α-amylase, glucoamylase và papain hoặc bromelain và nấm men thuần chủng đạt kết quả tốt hơn rượu sử dụng bánh men thuốc bắc về mặt thời gian lên men, độ rượu, chỉ số ester… kết hợp với kết quả đánh giá cảm quan ở bảng 4.25 có thể nhận thấy sản phẩm rượu ĐC, PA và BR đạt chất lượng về màu sắc và độ trong cao hơn so với rượu TB. Tuy nhiên sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc cho kết quả về mặt mùi, vị tốt hơn rượu sử dụng enzyme amylase, papain nên chọn 2 loại rượu TB và BR gửi phân tích các chỉ tiêu về hóa lí và vi sinh theo TCVN 7045: 2009 để đánh giá. Đồng thời xét về điểm trung bình đã hiệu chỉnh nhân với các hệ số thì rượu BR, TB đạt loại khá (15,2 ÷ 18,5) còn rượu ĐC và PA chỉ đạt loại trung bình (11,2÷15,1).
4.6.10 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009
Dựa trên những kết quả tối ưu đã đạt được, tiến hành phân tích các chỉ tiêu hóa lí và vi sinh của sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc (TB) và rượu sử dụng enzyme: α-amylase, glucoamylase, bromelain và nấm men thuần chủng (BR) so với các mức giới hạn quy định trong TCVN 7045: 2009 để kiểm tra mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm của các sản phẩm rượu nghiên cứu.
Bảng 4.26 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí rượu TB và BR so với TCVN 7045: 2009
Loại rượu
Các chỉ tiêu hóa lí
TB
BR
TCVN
Aldehyde (mg/l)
275,7
346
-
Ester (mg/l)
146
119,1
-
Ethanol (%, v/v)
11,1
12,6
8 18
Furfurol (mg/l)
Không phát hiện
Không phát hiện
-
Methanol (%, v/v)
0,004
0,003
0,05
Rượu bậc cao (mg/l)
Không phát hiện
Không phát hiện
-
(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 83
Theo kết quả thể hiện bảng 4.26 cho thấy hầu hết các chỉ tiêu chất lượng hóa lí của 2 loại rượu TB và BR đều trong phạm vi giới hạn cho phép, đặc biệt chỉ tiêu methanol trong 2 sản phẩm rượu TB và BR đều thấp hơn rất nhiều so với mức cho phép trong
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
ruợu vang. Tuy nhiên, chỉ tiêu aldehyde còn cao nhưng hàm lượng này sẽ giảm khi ổn định và bảo quản sản phẩm thời gian dài hơn (Nguyễn Thị Giang Thanh, 2008).
4.6.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009
Bảng 4.27 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu TB và BR so với TCVN 7045: 2009
Loại rượu
Các chỉ tiêu vi sinh vật
TB
BR
TCVN
Clostridium perfringens (cfu/ml)
0
0
0
Coliform (cfu/ml)
0
0
10
Ecoli (MPN/ml)
0
0
0
Staphylococcus aureus (cfu/ml)
0
0
0
10
Tổng số nấm men, mốc (cfu/ml)
1,0.104
1,6.101
102
Tổng số vi khuẩn hiếu khí (cfu/ml)
9,4.104
2,5.101
(Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN TP.HCM, 2010)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 84
Dựa trên số liệu phân tích thể hiện ở bảng 4.27 cho thấy các loài: Clostridium perfringens, Coliform, Ecoli, Staphylococcus aureus gây bệnh cho người tiêu dùng đều không có hiện diện trong 2 sản phẩm TB và BR. Bên cạnh đó chỉ tiêu tổng số nấm men, mốc và tổng số vi khuẩn hiếu khí của sản phẩm rượu (BR) gần đạt mức giới hạn tiêu chuẩn cho phép. Đối với sản phẩm rượu (TB) lên men theo phương pháp cổ truyền do sử dụng bánh men thuốc bắc chất lượng không ổn định, có thể đã bị nhiễm trong quá trình sản xuất men nên chỉ tiêu tổng số nấm men, mốc và tổng số vi khuẩn hiếu khí cao hơn gấp nhiều lần so với giới hạn cho phép trong TCVN 7045: 2009 cho sản phẩm rượu vang.
Hình 4.27 Các sản phẩm rượu vang nếp trắng
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THỰC TẾ NGHIÊN CỨU, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VÀ ĐỊA CHỈ ÁP DỤNG, GIÁ THÀNH SẢN PHẨM
5. 1 Thực tế nghiên cứu so với bố trí thí nghiệm theo thuyết minh phê duyệt
BỐ TRÍ TN ĐỀ CƯƠNG PHÊ DUYỆT THỰC TẾ THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU
- Khảo sát nồng độ enzyme α-amylase, glucoamylase và thời gian thủy phân đến hiệu suất đường hóa
- TN 1,2: Khảo sát pH, nhiệt độ, nồng độ nếp, nồng độ của enzyme α-amylase, glucoamylase và thời gian thủy phân dịch hóa, đường hóa bột nếp.
- Khảo sát nồng độ enzyme protease và thời gian thủy phân đến mùi vị sản phẩm.
- TN 3,4: Khảo sát pH, nhiệt độ, nồng độ nếp, xác định Vmax, Km, nồng độ 2 enzyme papain, bromelain và thời gian thủy phân đến màu sắc, độ trong, mùi, vị.
- Khảo sát nồng độ nấm men và thời gian lên men đến nồng độ sản phẩm và tạp chất sinh ra.
- Khảo sát nhiệt độ và pH của quá trình lên men - TN 5: Theo dõi, so sánh và đánh giá chất lượng 4 sản phẩm rượu: TB, ĐC, PA, BR trong suốt thời gian lên men chính 7÷8 ngày và ổn định trong 3 tháng ở 100C. Ghi chú: Kế thừa và thử nghiệm: pH, nồng độ nấm men (Hà Thị Thụy Vy, 2009)
- Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ lọc để đạt chất lượng cảm quan tốt nhất.
- Tiến hành lọc rượu: Bằng cột ép cotton kích thước lỗ lọc 1µm, 0,1µm cho chất lượng sản phẩm tốt nhưng giá thành cao vì lỗi lọc chỉ sử dụng một lần; cột than hoạt tính 5µm làm mất màu, mùi và vị sản phẩm; bột trợ lọc thời gian lọc dài; giấy lọc, bông gòn thu được sản phẩm trong tốt.
- Đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79
- Đánh giá chất lượng sản phẩm rượu (cảm quan, hóa lí và vi sinh)
- Phân tích hóa lí, vi sinh theo TCVN 7045: 2009 (Trung tâm phân tích thí nghiệm, Sở KH&CN Tp.HCM, 2010)
- Tìm ra quy trình sản xuất. - Đề ra quy trình theo TCVN 7045:2009
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 85
- Hạch toán kinh tế sản xuất rượu nếp. - Hạch toán kinh tế, giá thành sản phẩm
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
5. 2 Khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng
Ứng dụng nghiên cứu sản xuất: nước giải khát từ dịch đường gluocse thu được sau khi thủy phân tinh bột bằng enzyme amylase; nước uống có độ cồn thấp gồm (đường, rượu, CO2); rượu vang từ nguồn tinh bột: Khoai lang, khoai mì, bắp, nếp than, gạo, tấm…; trái cây: chuối, mít, quách...; sản xuất cồn sinh học từ cellulose (rơm, cỏ) để pha với xăng E95.
Hộ gia đình sản xuất rượu đế truyền thống ở Trà Vinh đạt độ rượu 8 90 (PTN 160) Bổ sung enzyme glucoamylase ở công đoạn đường hóa sau 1 ngày ủ mốc. Kết quả cho thấy đã tăng lượng đường khử tạo thành và độ rượu thu được cũng cao hơn 7,30 và 10,70 đồng thời hiệu suất thu hồi sản phẩm: 2,8 lít và 3,7 lít (Đàm Thị Hải Yến, 2008).
Công ty TNHH SXTM HUY VIỆT TÂY ĐÔ, Địa chỉ: Quận Thốt Nốt, TP. Cần Thơ. Ứng dụng α-amylase và β-amylase vào quá trình đường hóa nên lượng đường khử chưa cao so với tỷ lệ 1 cơ chất (gạo, tấm, sắn): 3 nước. Quá trình lên men đạt độ rượu chỉ khoảng 8 90, sau đó tiến hành chưng cất và chưng luyện để thu được sản phẩm chính cồn tuyệt đối và sản phẩm phụ từ quá trình lên men là CO2 để bổ sung vào nước giải khát có gas, nước đá khô, công nghệ lạnh, hàn…
- Đáp ứng nhu cầu sử dụng rượu vang từ đặc sản quê hương Việt Nam (gạo, nếp, khoai) cho đối tượng khách hàng: Việt Kiều, người già, phụ nữ…
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 86
5.3 Hạch toán giá thành 1 lít rượu vang nếp sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
CHƯƠNG 6 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
6.1 Kết luận
Qua quá trình thực hiện thí nghiệm tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm- Trường Đại học Cần Thơ và Trung Tâm Thí Nghiệm; Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch- Trường Đại học Trà Vinh cho thấy khi sử dụng enzyme α–amylase, glucoamylase, papain hoặc bromelain và nấm men thuần chủng trong quá trình sản xuất rượu nếp có thể rút ngắn thời gian đường hóa và thủy phân protein chỉ khoảng 2÷3 giờ, so với quy trình sản xuất rượu theo phương pháp cổ truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc mất 2÷3 ngày. Bên cạnh độ cồn của sản phẩm ứng dụng enzyme và nấm men thuần chủng đạt 12,60 sau 6 ngày lên men, trong khi đó rượu sử dụng bánh men thuốc bắc để lên men chỉ khoảng 110 trong thời gian 8 ngày lên men. Kết quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tối ưu cho 4 loại enzyme trên với nguyên liệu nếp trắng và phương pháp lên men rượu như sau:
- Enzyme α-amylase với nồng độ 0,3%, thời gian thủy phân 31 phút tại pH 6,5, nhiệt độ 870C để dịch hóa và đường hóa một phần tinh bột nếp, nồng độ đường khử thu được khoảng 6,46%, hàm lượng tinh bột còn sót lại 1,95%.
- Enzyme glucoamylase với nồng độ sử dụng 0,6% để đường hóa tinh bột, thời gian thủy phân 39 phút ở nhiệt độ 610C, pH 4,0 hàm lượng đường khử sinh ra lên đến 16,10%, hàm lượng tinh bột còn soát lại 1,86%.
- Enzyme papain với nồng độ 0,35% để phân cắt protein, thời gian thủy phân 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C thu được hàm lượng nitơ amin 0,081%, cùng các thông số động học Vmax= 0,1065 ± 0,0036; km= 4,7822 ± 0,7705.
- Enzyme bromelain nồng độ là 0,5% để phân cắt protein, 55 phút tại pH 5,7, nhiệt độ 550C lượng nitơ amin thu được 0,054 % cùng các thông số động học Vmax= 0,0622 ± 0,0013; km= 3,5652 ± 0,4280.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 87
- Dịch nếp sau khi thủy phân bằng enzyme được lọc, điều chỉnh pH 4,9 và lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,2%, sản phẩm rượu vang được so sánh rượu lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc. Kết quả chỉ ra rằng việc ứng dụng các enzyme α-amylase, glucoamylase để thủy phân tinh bột, bromelain phân cắt protein và nấm men thuần chủng lên men cho ra sản phẩm rượu đạt chất lượng cảm quan cao và đảm bảo các chỉ tiêu hóa lí, vi sinh theo TCVN 7045: 2009.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Do đó để sản xuất rượu vang nếp theo tiêu chuẩn chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm và đạt giá trị cảm quan cao có thể tiến hành theo quy trình công nghệ như sau:
Gạo nếp
Nghiền Ngâm
Hấp Pha loãng 1: 4
Làm nguội
Tỉ lệ 1kg Nếp : 10g Men: 3,5 lít Nước
Hồ hóa
Dịch hóa
Nồng độ α-amylase 0,3%; 31 phút ở pH 6,5; nhiệt độ 870C
Đường hóa
Nồng độ γ-amylase 0,6%; 39 phút ở pH 4,0; nhiệt độ 610C
Làm nguội
Thủy phân protein
Nồng độ papain 0,35%; 45 phút ở pH 5,9; nhiệt độ 500C
Nồng độ bromelain 0,5%; 55 phút ở pH 5,7; nhiệt độ 550C
Làm nguội Làm nguội
Thanh trùng Thanh trùng Thanh trùng
Lọc Lọc Lọc BR PA
TB ĐC
Lên men chính pH: 4,9, Nấm men: 0,2 % Thời gian: 6 ngày
Lên men phụ
Chiết, Lọc
Ổn định ở 100C
Sản phẩm rượu BR
Hình 5.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 88
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
6.2 Đề nghị
Để qui trình sản xuất rượu được hoàn chỉnh hơn chúng tôi có các đề nghị sau:
- Tuyển chọn, phân lập giống nấm men đặc trưng cho lên men rượu vang nếp.
- Trang bị thiết bị lên men kiểm soát nhiệt độ và áp suất và thiết bị lọc vi sinh
- Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm mới từ dịch glucose thu được sau khi thủy phân
- Tiến hành bảo quản rượu ở các nhiệt độ và kết hợp các chất bảo quản khác nhau.
- Khảo sát thay đổi màu sắc theo thời gian ổn định và bảo quản rượu.
- Khảo sát sử dụng enzyme protease có nguồn gốc từ vi sinh vật có hoạt tính exo- protase như neutrase.
- Khảo sát sự ảnh hưởng hàm lượng acid amin tự do trong dịch lên men đến khả năng tạo màu vàng, mùi, vị đặc trưng riêng cho từng sản phẩm.
- Nghiên cứu sản xuất hỗn hợp enzyme có hoạt tính amylase và protease từ vi sinh vật.
- Nghiên cứu sản xuất rượu nếp chưng cất theo TCVN 7043: 2009.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 89
- Nghiên cứu thực nghiệm ở quy mô xưởng sản xuất.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Ái, (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Bùi Thị Quỳnh Hoa, (2004), Bài giảng Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải khát, Đại học Cần Thơ.
Lê Ngọc Tú, (2004), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội.
Lê Ngọc Tú, (2003), Hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
Lê Ngọc Tú, Lưu Dzuẩn, Đặng Thị Thu, Lâm Xuân Thanh, Phạm Thu Thủy, (2000), Biến hình sinh học các sản phẩm từ hạt, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên, (2005), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Lý Nguyễn Bình, (1997), Giáo trình Kỹ thuật lên men, Trường Đại học Cần Thơ.
Lương Đức Phẩm, (2002), Vi sinh Vật Học & An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
Ngô Thị Hồng Thư, (1989), Kiểm nghiệm thực phẩm bằng phương pháp cảm quan, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng, (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đình Thưởng &Nguyễn Thanh Hằng, (2007), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Đức Lượng, (2002), Công nghệ vi sinh vật (tập 2), NXB Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng, (2006), Công nghệ vi sinh - tập 3-Thực phẩm lên men truyền thống, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Phạm Thu Cúc, (1999), Giáo trình sinh hóa I, Tủ sách Đại Học Cần Thơ.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 90
Trần Thị Luyến, (2004), Bài giảng các quá trình cơ bản và biến đổi của thực phẩm, Đại học Thủy sản Nha Trang.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Tiếng Anh
Dung, N.T.P, (2004), Defined fungal starer granules for purple glutious rice wine Wageningen, The Netherland
Ota S., H. Umi, E. Muta and Y. Okamoto, (1975), Chemical odification of Stem Bromelain I-1 and Fruit Bromelain A with 2-Hydroxy-5-nitrobenzyl Bromide, Tetranitromethane, and Hydrogen Peroxide, Journal of Biochem, Vol. 78, No. 3 627- 635_© 1975 Japanese Biochemical Society.
Novo Nordish Ferment Ltd. B296, B194, B552e – GB (2007).
Shahina Naz, (2002), Enzyme and food,
Walker, G.M., (1998), Yeasts physiology and biotechnology, Jonhn Wiley & sons, Chichester 350p.
http://www.merck-chemicals.com/papain/MDA_CHEM- 107144/p_9dWb.s1L7V4AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=papain& BackButtonText=search+results
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 91
http://www.merck-chemicals.com/bromelain/MDA_CHEM-101651/p_uuid
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
PHỤ LỤC
Phụ lục A: Các phương pháp phân tích
A.1 Xác định độ ẩm
Theo nguyên tắc áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng sản phẩm không đổi.
- Tiến hành: Sấy cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân m0 (g). Cho nếp vào cốc khoảng 2 – 3g, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng lượng cốc cân và mẫu là m1(g). Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050C, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy. Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng m2 (g). Kết quả tính độ ẩm: (W)
W = (m1 – m2)*100/ (m1 – m0) (%)
Trong đó:
m0: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy .
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi.
A.2 Đo pH của mẫu
Chọn chức năng đo pH trên máy.
Chuẩn bị cốc chứa mẫu. Nhúng điện cực sạch và khô vào cốc. Ấn START và đọc giá trị pH trên màn hình. Trong quá trình đo pH, nên khuấy thật nhẹ mẫu bằng cá từ để đảm bảo đồng nhất mẫu. Lấy điện cực ra, rửa sạch bằng nước cất và ngâm nó trong dung dịch bảo quản.
A.3 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix) bằng chiết quang kế
Phương pháp xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng khúc xạ kế dựa trên độ khúc xạ ánh sáng của đường và một số hợp chất hữu cơ khác quy ra đường. Dễ dàng hoạt động cho giá trị đo chính xác và ổn định. Chỉ cần dùng 2 đến 3 giọt mẫu đo, thang đo: từ 0 đến 30% ,thang đo nhỏ nhất 0,1%, độ phân giải: 6,5 giây, nhiệt độ làm việc: 5 – 400C tự động bù nhiệt.
A.4 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Lane - Eynon
Nguyên tắc
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch I
Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose, mantose, …) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ Cu+), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khử.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
* Hoá chất:
- NaOH 10%, 1N; Pb(CH3COO)2 30%; Na2SO4 bão hòa (30%).
- Dung dịch fehling A: CuSO4 tinh thể 69,28g, thêm nước cất đến 1000ml.
- Dung dịch fehling B: Kali, Natri tartrate 346g, NaOH 100g, thêm nước cất đến 1000ml.
- Metyl xanh 1% trong cồn.
Dụng cụ;
- Bình tam giác 200ml; Buret; Giấy lọc; Phễu lọc.
- Bếp điện.
Tiến hành:
- Cân mg mẫu cho vào bình tam giác 100ml.
- Cho thêm vào bình 50ml nước cất, dùng dung dịch Na2CO3 10% để trung hòa dung dịch về pH= 7 (dùng giấy quì tím làm chỉ thị màu).
- Tiến hành đun sôi cách thủy trong 15 phút, sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy.
- Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml. Kết tủa protein với 3ml dung dịch acetate chì 30%. Loại bỏ acetate chì bằng 10- 15ml dung dịch Na2SO4 bão hoà. Thêm nước cất với vạch định mức, lắc đều và lọc.
- Định lượng đường khử trong dịch lọc theo phương pháp sau:
Cho vào bình tam giác 100ml hỗn hợp 5ml fehling A + 5ml fehling B, lắc đều, sau đó cho vào 15ml dịch lọc. Đem đun sôi trên bếp và quan sát màu của dung dịch:
+ Nếu màu xanh của dung dịch Fehling biến mất, nghĩa là đường dư, cần pha loãng dịch lọc và định phân lại.
+ Nếu màu xanh của dung dịch Fehling chưa mất, thêm từ từ từng ml dung dịch lọc (dịch đường) vào bình tam giác, đun sôi và quan sát cho đến khi có kết tủa màu đỏ gạch, dung dịch không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt xanh metylen vào dung dịch đang sôi thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc thể tích và tra bảng tính ra hàm lượng đường.
Công thức tính toán:
Số tra bảng * HSPL * 100
Hàm lượng đường khử = (%)
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch II
Khối lượng mẫu * 1000
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
mg đường khử mg đường khử mg đường khử mg đường khử
ml dung dịch chuẩn đường 15 16 17 18 19 20 21 22 23 336,0 316,0 298,0 282,0 267,0 254,5 242,9 231,8 222,2 ml dung dịch chuẩn đường 24 25 26 27 28 29 30 31 32 213,3 204,8 197,4 190,4 183,7 177,6 171,7 166,3 161,2 ml dung dịch chuẩn đường 33 34 35 36 37 38 39 40 41 156,0 152,2 147,1 143,9 140,2 136,6 133,3 130,1 127,1 ml dung dịch chuẩn đường 42 43 44 45 46 47 48 49 50 124,2 121,4 118,7 116,1 113,7 111,4 109,2 107,1 105,1
A.5 Định lượng nitơ amino bằng phương pháp định lượng nitơ formon
* Nguyên lý: Các acid amin trong dung dịch nước thì trung tính, không những do 2 nhóm hoá chức acid (-COOH) và amin (-NH2) trung hoà lẫn nhau, mà còn do cả 2 nhóm hoá chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formon, nhóm -NH2 kết hợp với formon thành nhóm metylenic N=CH2 mất tính chất kiềm, do đó tính chất acid của nhóm -COOH nổi bật lên và có thể định lượng bằng một chất kiềm với phenolphtalein làm chỉ thị màu.
R - CH - COOH
+ H2O R - CH - COOH NH2 N = CH2 + OCH2
* Chú ý: Các muối amoni, ví dụ NH4Cl ở dung dịch trung tính, khi gặp formon cũng làm cho dung dịch trở thành acid, do hình thành hexmetylen tetramin và HCl theo phản ứng: 4NH4Cl + 6CH2O (CH2)6N4 + 6H2O + 4HCl
- Do đó cũng định lượng được bằng một chất kiềm.
Tóm lại:
- Nếu trong chất thử chỉ có acid amin thì nitơ formon là nitơ amin.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch III
- Nếu trong chất thử có cả acid amin lẫn muối amoni thì nitơ formon là tổng của nitơ acid amin và nitơ amoni. Muốn có nitơ acid amin, phải lấy nitơ formon trừ đi nitơ amoni.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
- Đây là trường hợp một acid yếu được định lượng bằng một chất kiềm mạnh, nên điểm tương đương phải ở pH kiềm (pH 9 ÷ 9,5) do đó phản ứng kết thúc khi phenolphtalein chuyển màu đỏ tươi (chứ không phải màu hồng như thông thường).
* Tiến hành:
- Đo pH ban đầu (pH0) của dung dịch cần chuẩn nitơ amin.
- Điều chỉnh pH đến khoảng pH cần cho hoạt động thuỷ phân (pHt), Đo pHt.
- Cân chính xác P (g) hoặc V (ml) chất cần đo, cho vào bình định mức 100 ml, cho tiếp 50 ml nước cất, lắc mạnh trong 10 phút để hoà tan, cho tiếp nước cất vừa đủ 100 ml, lắc đều và lọc.
- Điều chỉnh pH hiện tại (pHt) về mức pH = 7,0.
- Lấy 25 ml dịch lọc, cho vào bình nón với 20 ml formon trung tính, cho thêm vài giọt phenolptalein, sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,01N cho đến màu đỏ tươi (pH 9 ÷ 9,5).
* Tính lượng nitơ amin theo công thức: (g/100 g)
(g/l)
Trong đó:
0,00014 = số g nitơ tương ứng với 1 ml NaOH 0,01N.
n = số ml NaOH 0,01N sử dụng.
V hoặc P = số ml hoặc số g chất thử.
A.6 Đo độ rượu bằng phương pháp chưng cất
Lấy 100 ml mẫu cho vào bình định mức 100 ml sau đó rót vào bình cất 1 rồi tráng bình bằng 100ml nước cất rồi cũng đỗ vào bình 1 có dung tích khoảng 500 ml.
Nối với hệ thống chưng cất, lấy bình định mức 100 ml để thu nước ngưng sau chưng cất, tiến hành chưng cất cho tới khi nước ngưng đầy tới ngấn 100 ml. Cất xong đậy kín và đem làm lạnh tới nhiệt độ 200C, sau đó dùng cồn kế để đo độ rượu.
A.7 Xác định acid toàn phần của rượu
* Nguyên tắc:
Trong rượu vang chứa rất nhiều loại acid khác nhau và được tạo thành trong quá trình lên men hoặc được sử dụng trong quá trình điều chỉnh pH của dịch lên men nhưng chủ yếu là acid acetic. Vì thế, người ta thường biểu diễn độ acid trong rượu vang theo acid acetic.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch IV
* Dụng cụ:
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Ống sinh hàn; Ống đong; Bình tam giác; Pipet; Buret.
* Hóa chất:
NaOH 0,1N; Phenolphtalein 0,5%; H2SO4 0,1N.
* Tiến hành thử:
Lấy 100 ml rượu cho vào bình tam giác 250 ml. Nối với hệ thống ống sinh hàn, đun sôi 15 phút để đuổi hết CO2 rồi sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng, cho vào 3 ÷ 4 giọt phenolphthalein rồi dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn đến màu hồng nhạt.
* Kết quả
(mg/l)
Trong đó:
V: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân.
v: số ml rượu lấy để chuẩn độ.
6: số mg acid acetic tương ứng với 1ml NaOH 0,1N.
1000: hệ số chuyển đổi thành lít.
A. 8 Xác định hàm lượng ester của rượu
*Nguyên tắc:
Sau khi xác định xong acid tiếp tục xác định hàm lượng ester trên cơ sở:
CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5OH
Xác định NaOH tác dụng với ester ta suy ra được lượng ester trong rượu.
* Dụng cụ:
Ống sinh hàn; Ống đong; Bình tam giác; Pipet; Buret.
* Hóa chất:
NaOH 0,1N; Phenolphtalein 0,5%; H2SO4 0,1N.
* Tiến hành thử:
Lấy 100 ml rượu cho vào bình tam giác 250ml.
Trung hòa rượu bằng NaOH 0,1N (tiến hành giống như chuẩn acid).
Sau khi chuẩn xong ta thêm vào hốn hợp 5ml NaOH 0,1N rồi nối bình tam giác với hệ thống ống sinh hàn và đun sôi trong 1 giờ để tạo điều kiện cho phản ứng:
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch V
CH3COOC2H5 + NaOH → CH3COONa + C2H5OH
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Đun xong đem làm nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó cho đúng 5ml H2SO4 0,1N vào bình và lắc đều, tiếp đó chuẩn lại lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N tới xuất hiện màu hồng nhạt.
* Kết quả:
Hàm lượng ester (tính theo ester của acid acetic) trong rượu được tính:
(mg/l)
Trong đó:
V: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân.
v: số ml rượu lấy để chuẩn độ.
8,8: số mg ester etylic tương ứng với 1ml NaOH 0,1N.
1000: hệ số chuyển đổi thành lít.
A.9 Định tính fufurol
* Nguyên tắc:
Nếu trong rượu chứa fufurol thì khi phản ứng với aniline (C6H5NH2) trong môi trường acid có màu hồng-da cam. Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng fufurol.
* Dụng cụ:
Ống đong, pipet.
* Hóa chất:
Dung dịch HCl (d = 1,19).
Anilin tinh khiết.
* Tiến hành:
Lấy ống nghiệm hoặc ống đong 25ml có nút nhám, dùng ống hút nhỏ 10 giọt aniline tinh khiết vào ống đong và 3 giọt HCl (d = 1,19). Tiếp đó cho 10ml rượu lắc đều và để yên. Nếu sau 10 phút hỗn hợp phản ứng vẫn không màu thì xem như đạt yêu cầu, nếu có xuất hiện màu hồng thì xem như rượu có chứa fufurol.
A.10 Phương pháp đánh giá cảm quan
Dựa vào khả năng cảm giác của từng thành viên đối với từng chỉ tiêu. Số diểm chưa có trọng lượng là số điểm cho tương ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lượng và được quy định trong bảng 1:
Bảng 1 Bảng điểm mô tả đánh giá các chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 3217-79
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch VI
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Tên Chỉ
Điểm chưa có
Yêu cầu
tiêu
trọng lượng
5
Chất lỏng trong suốt, không có vẩn đục và vật thể lạ nhỏ,
màu hoàn toàn đặc trưng cho cho rượu vang nếp.
4
Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ,
màu đặc trưng cho cho rượu vang nếp.
3
Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi
khác với màu đặc trưng cho rượu vang nếp.
Độ trong và màu sắc
2
Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ, thô trầm
trọng, màu khác nhiều với màu đặc trưng của rượu vang nếp.
1
Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm
trọng, thô, màu không đặc trưng cho rượu vang nếp.
0
Vẩn đục, sản phẩm bị hỏng
5
Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho rượu vang nếp
4
Chưa hòa hợp, thơm đặc trưng cho cho rượu vang nếp, hơi
khó nhận thấy
Mùi
3
Hơi nồng, thoáng mùi phụ, ít đặc trưng cho rượu vang nếp
2
Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho rượu vang nếp
1
Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho rượu vang nếp
5
Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho rượu vang
nếp
4
Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho rượu
vang nếp
Vị
3
Chưa hòa hợp, hơi gắt và hậu yếu, ít đặc trưng cho rượu
vang nếp
2
Đắng, sốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho rượu vang nếp
1
Có vị lạ, khó chịu của sản phẩm hỏng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch VII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu
STT Chỉ tiêu Hệ số quan trọng
Độ trong và màu sắc
0,8 1
Mùi
1,2 2
Vị
2,0 3
Tổng cộng: 4,0
Bảng 3 Đánh giá mức chất lượng
STT Mức chất Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình
lượng Số điểm chung chưa có trọng điểm hội đồng cảm quan
Mùi: 4,8 Loại tốt 18,6-20,0 1
Vị: 4,8
Mùi: 3,8 Loại khá 15,2-18,5 2
Vị: 3,8
3 11,2-15,1 Mỗi chỉ tiêu: 2,8
Loại trung bình
4 Loại kém 7,2-11,1 Mỗi chỉ tiêu: 1,8
5 Loại rất kém 4,0-7,1 Mỗi chỉ tiêu: 1,0
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch VIII
6 Loại hỏng 0-3,9 Mỗi chỉ tiêu: 1,0
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Phụ Lục B: Tiêu Chuẩn Việt Nam (TCVN 7045 : 2009) TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7045 : 2009
Rượu vang – Quy định kỹ thuật
Wine – Specification
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này áp dụng cho các sản phẩm rượu vang.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.
TCVN 7087: 2008 (CODEX STAN 1-2005), Ghi nhãn thực phẩm bao gói sẵn.
TCVN 8007: 2009 Rượu- Chuẩn bị mẫu và kiểm tra cảm quan.
TCVN 8010: 2009 Rượu chưng cất xác định ethanol.
TCVN 8012: 2009 Rượu xác định độ axit.
AOAC 940.20, Sulfurous aicd in wine (Axit sulfurơ trong rượu vang).
AOAC 973.20, Cyanide in wine (Xyanua trong rượu vang).
AOAC 983.13, Alcohol in wine – Gas chromatographic method (Cồn trong rượu vang- Phương pháp sắc ký khí).
AOAC 988.07, Carbon dioxide in wine – Titrimetric method (Cacbon dioxit trong rượu vang- Phương pháp chuẩn độ).
3. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau đây:
3.1 Rượu vang (Wine): Đồ uống có cồn được chế biến bằng phương pháp lên men từ trái cây và không qua chưng cất.
4 Yêu cầu kỹ thuật
4.1 Yêu cầu cảm quan
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch IX
Các chỉ tiêu cảm quan đối với rượu vang được quy định trong Bảng 1.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 1 Yêu cầu cảm quan
Tên chỉ tiêu Yêu cầu
Màu sắc Đặc trưng cho từng loại sản phẩm
Mùi Thơm đặc trưng của nguyên liệu và sản phẩm lên men, không có mùi lạ
Vị Đặc trưng cho từng loại sản phẩm, không có vị lạ
Trạng thái Trong, không vẩn đục
4.2 Chỉ tiêu hoá học
Các chỉ tiêu hóa học của rượu vang được quy định trong Bảng 2
Bảng 2 Các chỉ tiêu hoá học của rượu vang
Tên chỉ tiêu Mức
1. Hàm lượng etanol (cồn) ở 200C, % (thể tích) Từ 8 đến 18
0,05 2. Hàm lượng metanol trong 1 l etanol 1000, % thể tích, không lớn hơn
3. Độ acid
Nhà sản xuất tự công bố
350 4. Hàm lượng SO2, mg/l etanol 1000, không lớn hơn
6. Hàm lượng CO2
Nhà sản xuất tự công bố
5. Hàm lượng xyanua, mg/l etanol 1000, không lớn hơn 0,1
5 Phụ gia thực phẩm
Phụ gia thực phẩm sử dụng cho rượu vang: theo quy định hiện hành
6 Yêu cầu vệ sinh
6.1 Kim loại nặng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch X
Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng đối với rượu vang được: theo quy định hiện hành
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
6.2 Vi sinh vật
Các chỉ tiêu vi sinh vật của rượu vang: theo quy định hiện hành
7 Phương pháp thử
Xác định các chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 8007:2009.
Xác định hàm lượng etanol, theo AOAC 983.13.
Xác định hàm lượng metanol, theo TCVN 8010:2009.
Xác định hàm lượng axit, theo TCVN 8012:2009.
Xác định hàm lượng CO2, theo AOAC 988.07.
Xác định hàm lượng SO2, theo AOAC 940.20.
Xác định hàm lượng cyanua, theo AOAC 973.20.
8 Bao gói, ghi nhãn, bảo quản và vận chuyển
8.1 Bao gói
Rượu vang phải được đựng trong các bao bì kín, chuyên dùng cho thực phẩm và không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
8.2 Ghi nhãn
Ghi nhãn sản phẩm theo theo quy định hiện hành và TCVN 7087: 2008 (CODEX STAN 1-2005).
8.3 Bảo quản
Bảo quản rượu vang nơi khô, mát, tránh ánh nắng mặt trời và không ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
8.4 Vận chuyển
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XI
Phương tiện vận chuyển rượu vang phải khô, sạch, không có mùi lạ và không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Phụ lục C: Kết quả xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic 4.0
4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng.
4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ cuả enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp trắng
Bảng 1 Phân tích phương sai ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng α-amylase
Bảng 2 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng α-amylase
Bảng 3 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp bằng α-amylase
4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp.
Bảng 4 Phân tích phương sai ảnh hưởng nồng độ α-amylase và thời gian thủy phân đến lượng đường khử tạo thành
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 5 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nồng độ α-amylase đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột nếp
Bảng 6 Kiểm định LSD về ảnh hưởng thời gian thủy phân của α-amylase đến lượng đường khử tạo thành
4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân
Bảng 7 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ bột nếp lượng đường khử tạo thành
Bảng 8 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến lượng đường khử tạo thành
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XIII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.
4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp.
Bảng 9 Phân tích phương sai ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng glucoamylase
Bảng 10 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của pH đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng glucoamylase
Bảng 11 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng glucoamylase
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XIV
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng.
Bảng 12 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành
Bảng 13 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của độ enzyme glucoamylase đến lượng đường khử tạo thành
Bảng 14 Kiểm định LSD về ảnh hưởng của thời gian thủy phân dịch nếp đến lượng đường khử tạo thành
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XV
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.3.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme glucoamylase.
Bảng 15 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ nếp đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng glucoamylase
Bảng 16 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến lượng đường khử tạo thành khi thủy phân bằng glucoamylase
4.4 Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase
4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp.
Bảng 17 Phân tích phương sai ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain.
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XVI
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 18 Kiểm định LSD ảnh hưởng của pH dịch nếp đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein bằng enzyme papain
Bảng 19 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp bằng enzyme papain
4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp
Bảng 20 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain và thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp trắng
Bảng 21 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ enzyme papain đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein dịch nếp trắng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XVII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 22 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng
4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp
Bảng 23 Phân tích phương sai ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain
Bảng 24 Kiểm định LSD ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XVIII
4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase.
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
Bảng 25 Phân tích phương sai ảnh hưởng của các mức pH và nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain
Bảng 26 Kiểm định LSD ảnh hưởng của pH đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain
Bảng 27 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nhiệt độ đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân dịch nếp bằng enzyme bromelain
4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein nếp.
Bảng 28 Phân tích phương sai ảnh hưởng của mức nồng độ enzyme và thời gian đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XIX
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 29 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ enzyme bromelain đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp trắng
Bảng 30 Kiểm định LSD ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến lượng nitơ amin tạo thành khi thủy phân protein trong dịch nếp
4.5.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
Bảng 31 Phân tích phương sai ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XX
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 32 Kiểm định LSD ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain
4.6 Kết quả theo dõi và đánh giá chất lượng rượu lên men truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.
4.6.1 Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại rượu
Bảng 33 Phân tích phương sai thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính của các loại rượu
Bảng 34 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix của các loại rượu trong quá trình lên men chính
Bảng 35 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix trong thời gian lên men chính của các loại rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXI
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.6.2 Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính các loại rượu
Bảng 36 Phân tích phương sai thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men của các loại rượu
Bảng 37 Kiểm định LSD thay đổi đường khử của các loại rượu trong quá trình lên men chính
Bảng 38 Kiểm định LSD thay đổi đường khử theo thời gian lên men chính của các loại rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.6.3 Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men của các loại rượu.
Bảng 39 Phân tích phương sai thay đổi độ rượu trong quá trình lên men của các loại rượu
Bảng 40 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu của các loại rượu trong quá trình lên men chính
Bảng 41 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu theo thời gian lên men chính của các loại rượu
4.6.4 Kết quả thay đổi pH dịch nếp trong quá trình lên men của các loại rượu
Bảng 42 Phân tích phương sai thay đổi pH trong quá trình lên men của các loại rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXIII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 43 Kiểm định LSD thay đổi pH của các loại rượu trong quá trình lên men chính
Bảng 44 Kiểm định LSD thay đổi pH theo thời gian lên men chính của các loại rượu
4.6.5 Kết quả thay đổi hàm lượng acid trong quá trình lên men chính của các loại rượu
Bảng 45 Phân tích phương sai thay đổi acid trong quá trình lên men của các loại rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXIV
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 46 Kiểm định LSD thay đổi acid của các loại rượu trong quá trình lên men chính
Bảng 47 Kiểm định LSD thay đổi acid theo thời gian lên men chính của các loại rượu
4.6.6 Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu Bảng 48 Phân tích phương sai thay đổi ester trong quá trình lên men của các loại rượu
Bảng 49 Kiểm định LSD thay đổi ester của các loại rượu trong quá trình lên men chính
Bảng 50 Kiểm định LSD thay đổi ester theo thời gian lên men chính của các loại rượu
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXV
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
4.6.8 Kết quả thay đổi chất lượng sản phẩm rượu vang nếp trong thời gian ổn định
Bảng 51 Phân tích phương sai sự thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 52 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 53 Phân tích phương sai sự thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 54 Kiểm định LSD thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 55 Phân tích phương sai sự thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 1 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXVI
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 56 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 57 Phân tích phương sai sự thay đổi pH các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 58 Kiểm định LSD thay đổi pH các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 59 Phân tích phương sai sự thay đổi acid các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 60 Kiểm định LSD thay đổi acid các loại rượu nếp sau 1 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXVII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 61 Phân tích phương sai sự thay đổi ester các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 62 Kiểm định LSD thay đổi ester các loại rượu nếp sau 1 tháng
Bảng 63 Phân tích phương sai sự thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 64 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 65 Phân tích phương sai sự thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 2 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXVIII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 66 Kiểm định LSD thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 67 Phân tích phương sai sự thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 68 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 69 Phân tích phương sai sự thay đổi pH các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 70 Kiểm định LSD thay đổi pH các loại rượu nếp sau 2 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXIX
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 71 Phân tích phương sai sự thay đổi acid các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 72 Kiểm định LSD thay đổi acid các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 73 Phân tích phương sai sự thay đổi ester các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 74 Kiểm định LSD thay đổi ester các loại rượu nếp sau 2 tháng
Bảng 75 Phân tích phương sai sự thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 3 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXX
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 76 Kiểm định LSD thay đổi độ Brix các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 77 Phân tích phương sai sự thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 78 Kiểm định LSD thay đổi đường khử các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 79 Phân tích phương sai sự thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 80 Kiểm định LSD thay đổi độ rượu các loại rượu nếp sau 3 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXI
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 81 Phân tích phương sai sự thay đổi pH các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 82 Kiểm định LSD thay đổi pH các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 83 Phân tích phương sai sự thay đổi acid các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 84 Kiểm định LSD thay đổi acid các loại rượu nếp sau 3 tháng
Bảng 85 Phân tích phương sai sự thay đổi ester các loại rượu nếp sau 3 tháng
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 86 Kiểm định LSD thay đổi ester các loại rượu nếp sau 3 tháng
4.6.9 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang nếp
Bảng 87 Phân tích phương sai độ trong và màu sắc của các loại rượu nếp
Bảng 88 Kiểm định LSD độ trong độ trong và màu sắc của các loại rượu nếp
Bảng 89 Phân tích phương sai về mùi của các loại rượu nếp
Bảng 90 Kiểm định LSD về mùi của các loại rượu nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXIII
Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh
Bảng 91 Phân tích phương sai về vị của các loại rượu nếp
Bảng 92 Kiểm định LSD về vị của các loại rượu nếp
Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch XXXIV
