HỘI NGHỊ KHOA HỌC TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC VIỆT NAM LẦN 8
820
BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG DI TRUYỀN GEN TP53
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI KINH DÒNG LYMPHO
TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG
Lê Quốc Anh1,3, Nguyễn Thanh Ngọc Bình1, Nguyễn Quốc Nhật1,
Nguyễn Quang Tùng1,3, Dương Quốc Chính1,2
TÓM TẮT99
Vấn đề nghiên cứu: Bất thường di truyền
gen TP53 ở bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng
lympho (CLL). Mục tiêu: Xác định các biến thể
di truyền trên gen TP53 ở bệnh nhân CLL bằng
kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS); mô
tả đặc điểm của các biến thể đó. Đối tượng và
phương pháp: Nghiên cứu mô tả loạt ca, sử
dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để
phân tích gen TP53 từ mẫu máu ngoại vi của
bệnh nhân. Kết quả: Thu thập được mẫu máu
ngoại vi của 22 bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng
lympho và tiến hành giải trình tự gen TP53 thành
công. Đã phát hiện 4 biến thể gây bệnh gồm
c.536A>G, c.584T>C, c.824G>T và c.844C>T.
Biến thể di truyền gen TP53 lành tính phát hiện
được nhiều nhất là c.215C>G. Kết luận: Chúng
tôi đã giải trình tự thành công gen TP53 của bệnh
nhân lơ xê mi kinh dòng lympho bằng kỹ thuật
NGS và xác định được một số bất thường di
truyền gây bệnh.
1Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương
2Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà
Nội
3Trường Đại học Y Hà Nội
Chịu trách nhiệm chính: Dương Quốc Chính
SĐT: 0962168505
Email: chinhdq.ump@vnu.edu.vn
Ngày nhận bài: 30/04/2025
Ngày phản biện khoa học: 15/06/2025
Ngày duyệt bài: 30/07/2025
Từ khoá: Lơ xê mi kinh dòng lympho, CLL,
TP53, NGS, giải trình tự gen thế hệ mới.
SUMMARY
INVESTIGATION OF TP53 GENETIC
ABNORMALITIES BY NEXT
GENERATION SEQUENCING IN
PATIENTS WITH CHRONIC
LYMPHOCYTIC LEUKEMIA AT THE
NATIONAL INSTITUTE OF
HEMATOLOGY AND BLOOD
TRANSFUSION
Background: Genetic abnormalities of TP53
gene in patients with chronic lymphocytic
leukemia (CLL) at the National Institute of
Hematology and Blood Transfusion. Objectives:
Identification of genetic abnormalities in the
TP53 gene in CLL patients using next-generation
sequencing (NGS) technology; analysis of
characteristics and clinical significance of these
abnormalities. Subjects and methods: Cases
series, employing NGS to analyze TP53 gene
mutations from peripheral blood samples.
Results: Peripheral blood samples were collected
from 22 patients. Detected 4 pathogenic TP53
variants, including c.536A>G, c.584T>C,
c.824G>T and c.844C>T. The most commonly
benign TP53 variant was c.215C>G.
Conclusions: We successfully sequenced the
TP53 gene in patients with chronic lymphocytic
leukemia by NGS and detected pathogenic
genetic abnormalities.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 552 - THÁNG 7 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2025
821
Keywords: Chronic lymphocytic leukemia,
CLL, TP53, NGS, next-generation sequencing.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi kinh dòng lympho (chronic
lymphocytic leukemia - CLL) là một bệnh ác
tính thuộc nhóm bệnh tân sinh tế bào lympho
B trưởng thành theo phân loại của Tổ chức Y
tế Thế giới [1], với đặc trưng là sự gia tăng
của một dòng lympho B bất thường bộc lộ
các kháng nguyên bề mặt là CD19, CD20,
CD23 và CD5 trong máu ngoại vi [2]. Diễn
biến lâm sàng của CLL có thể rất khác nhau
giữa các bệnh nhân nên cần sử dụng các
thang điểm phân loại tiên lượng để quyết
định thời điểm điều trị cũng như lựa chọn
phương pháp điều trị [3]. Trong đó, thông tin
về bất thường di truyền gen TP53 là một
trong những yếu tố quan trọng để tiên lượng
bệnh nhân.
Gen TP53 nằm trên nhánh ngắn của
nhiễm sắc thể 17 (17p13.1), bao gồm 11
exon, 10 intron, mã hóa protein p53 có vai
trò quan trọng trong cơ chế ức chế ung thư ở
người. Trong bệnh CLL, bất thường di
truyền gen TP53 bao gồm 2 dạng chính: đột
biến mất đoạn nhánh ngắn nhiễm sắc thể 17
(tương ứng mất gen TP53) và đột biến của
gen TP53; hai dạng này có vai trò tiên lượng
độc lập với nhau và đều cho phép dự đoán
tiên lượng xấu [4, 5]. Với đột biến mất đoạn
nhánh ngắn nhiễm sắc thể 17, viết tắt:
del(17p), kỹ thuật được sử dụng để phát hiện
là lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in
situ hybridization - FISH) và hiện đang được
thực hiện thường quy tại Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương. Trong khi đó, để
phát hiện những đột biến trên gen TP53, kỹ
thuật giải trình tự gen thế hệ mới (next-
generation sequencing - NGS) được khuyến
cáo [6]. NGS là một kỹ thuật kết hợp giữa
sinh học và tin học, có khả năng giải trình tự
đồng thời hàng triệu đoạn gen, nên rất phù
hợp để giải trình tự gen và phát hiện bất
thường di truyền cho các mẫu bệnh phẩm
chứa cả tế bào ung thư mang bất thường di
truyền và tế bào lành như trong bệnh CLL.
Những bất thường di truyền của gen TP53
mà NGS có thể phát hiện được bao gồm đột
biến thay thế nucleotid và đột biến thêm/mất
nucleotid (đặc biệt chính xác với những đột
biến thêm/mất dưới 10 nucleotid).
Tại Việt Nam, cho tới nay vẫn còn rất ít
nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật NGS để phát
hiện bất thường di truyền của gen TP53 trên
bệnh nhân CLL, và kỹ thuật này cũng chưa
được triển khai thường quy trong thực hành
lâm sàng ở nhiều cơ sở điều trị chuyên khoa
huyết học. Vì vậy, chúng tôi thực hiện
nghiên cứu này với mục tiêu:
(01) Xác định các biến thể di truyền
của gen TP53 ở bệnh nhân CLL bằng kỹ
thuật NGS
(02) Bước đầu mô tả đặc điểm các biến
thể di truyền của gen TP53 ở bệnh nhân
CLL.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu: 22 bệnh
nhân CLL đã được chẩn đoán và điều trị tại
Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: mô tả loạt ca.
Tiêu chuẩn chọn đối tượng: Bệnh nhân
đã được chẩn đoán xác định CLL tại Viện
Huyết học – Truyền máu Trung ương. Tại
thời điểm giải trình tự, số lượng bạch cầu
lympho máu ngoại vi phải lớn hơn 10 G/l.
Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu
thuận tiện từ những bệnh nhân đến khám
hoặc điều trị nội trú tại Viện trong thời gian
từ tháng 2/2024 đến tháng 5/2024.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC VIỆT NAM LẦN 8
822
Phương pháp tiến hành:
Mẫu bệnh phẩm được sử dụng là máu
ngoại vi chống đông bằng EDTA với số
lượng bạch cầu lympho máu ngoại vi > 10
G/l theo khuyến cáo của Nhóm sáng kiến
nghiên cứu châu Âu về CLL (European
Research Initiative on CLL - ERIC) [6]. Vật
liệu di truyền (RNA) từ mẫu bệnh phẩm
được tách chiết bằng bộ sinh phẩm Invisorb
Spin Universal kit (Invitek, Đức), sau đó
tổng hợp DNA bổ sung (cDNA) bằng bộ sinh
phẩm qScript Flex cDNA Synthesis kit
(Quantabio, Hoa Kỳ). Tiếp theo gen TP53
được khuếch đại bằng PCR, sử dụng bộ sinh
phẩm Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master
Mix (New England Biolabs, Hoa Kỳ) với cặp
mồi đặc hiệu (Bảng 1). Thư viện DNA của
gen TP53 sẽ được chuẩn bị bằng bộ sinh
phẩm Nextera XT sample Prep kit (Illumina,
Hoa Kỳ). Sản phẩm thư viện DNA sau đó
được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm Agencourt
Ampure XP (Beckman Coulter, Hoa Kỳ) và
được kiểm tra nồng độ bằng máy đo Qubit
2.0 cùng bộ sinh phẩm Qubit dsDNA HS
Assay kit (Thermo Fisher, Hoa Kỳ). Cuối
cùng, thư viện DNA gen TP53 được giải
trình tự trên máy Illumina Miseq với bộ hóa
chất Miseq Reagent Kits v2 300 (Illumina,
Hoa Kỳ). Dữ liệu giải trình tự gen được phân
tích bằng phần mềm CLC Genomic
Workbench (Qiagen, Đức), sử dụng gen
tham chiếu RefGene NM_000546.5 để phát
hiện các biến thể của gen TP53.
Bảng 1. Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại gen TP53
Tên mồi
Trình tự mồi (5’-3’)
TP53 F1
GAGCCGCAGTCAGATCCTAG
TP53_R1
ACCGTACTAACCAGGGAAGC
Tiêu chí đánh giá biến thể di truyền:
- Ngưỡng đánh giá (cut-off): Chỉ ghi
nhận các biến thể có tần số xuất hiện (variant
allele frequency - VAF) ≥ 5%.
- Mô tả biến thể: Sử dụng danh pháp của
Hiệp hội về Biến thể của Hệ gen Người
(Human Genome Variation Society - HGVS)
[7].
- Phân loại biến thể theo tác động lên sự
tổng hợp protein: sai nghĩa (thay thế 1
nucleotid dẫn tới thay thế acid amin), vô
nghĩa (thay thế 1 nucleotid dẫn tới mã kết
thúc), dịch khung (thêm/mất nucleotid gây
thay đổi khung đọc và làm thay đổi toàn bộ
acid amin từ vị trí xảy ra đột biến).
- Đánh giá mức độ ảnh hưởng của biến
thể theo Trường môn Di truyền Y học và Hệ
gen Hoa Kỳ (American College of Medical
Genetics and Genomics - ACMG) với 5
mức:
+ Gây bệnh (pathogenic): biến thể có
bằng chứng rõ ràng cho thấy gây ra bệnh.
+ Có khả năng gây bệnh (likely
pathogenic): biến thể này có nhiều bằng
chứng hỗ trợ rằng nó gây bệnh, nhưng chưa
đủ để khẳng định chắc chắn.
+ Chưa rõ ý nghĩa (variant of uncertain
significance, viết tắt: VUS): hiện chưa có đủ
dữ liệu để xác định biến thể này có gây bệnh
hay không.
+ Có khả năng lành tính (likely benign):
biến thể có bằng chứng cho thấy không gây
bệnh, nhưng chưa đủ để khẳng định hoàn toàn.
+ Lành tính (benign): biến thể có bằng
chứng rõ ràng rằng không liên quan đến
bệnh.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 552 - THÁNG 7 - SỐ ĐẶC BIỆT - 2025
823
- Cơ sở dữ liệu được sử dụng để đối
chiếu: trang web The TP53 (UMD database)
(http://p53.fr) [8], The TP53 Database
(https://tp53.cancer.gov) [9], ClinGen TP53
Variant Curation Expert Panel (https://erepo.
clinicalgenome.org/evrepo/ui/classifications?
matchMode=exact&gene=TP53) [10],
ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
clinvar) [11], công cụ Seshat (công cụ phân
tích ý nghĩa biến thể TP53) (http://
vps338341.ovh.net) [12].
Xử lý số liệu: Dữ liệu được phân tích
bằng phần mềm Microsoft Excel 2019.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân
Từ tháng 2/2025 đến tháng 5/2025 chúng
tôi đã thu được mẫu bệnh phẩm máu ngoại vi
của 26 bệnh nhân CLL, trong đó có 4 mẫu
không đủ số lượng bạch cầu lympho máu
ngoại vi (<10 G/l). Trong 22 bệnh nhân còn
lại, có 10 bệnh nhân nam và 12 bệnh nhân
nữ. Độ tuổi trung bình khi chẩn đoán CLL
của các bệnh nhân là 61,410,0, bệnh nhân ít
tuổi nhất là 32 tuổi (và cũng là bệnh nhân
duy nhất dưới 40 tuổi), bệnh nhân nhiều tuổi
nhất là 75 tuổi.
Bảng 2. Đặc điểm chung của bệnh nhân trong nghiên cứu (n=22)
Giới
Nam
10 (45,5%)
Nữ
12 (54,5%)
Tuổi khi chẩn đoán (năm)
Trung bình (XSD)
61,410,0
Ít tuổi nhất
32
Lớn tuổi nhất
75
Số lượng lympho máu ngoại vi (thời điểm giải trình tự gen, G/l)
Trung bình (XSD)
43,640,2
Thấp nhất
11,5
Cao nhất
160,0
Tỷ lệ lympho máu ngoại vi (%)
Trung bình (XSD)
84,17,68
Thấp nhất
66
Cao nhất
94
Ghi chú: n: cỡ mẫu, X: giá trị trung
bình, SD: độ lệch chuẩn
3.2. Kết quả xác định các biến thể di
truyền của gen TP53 ở bệnh nhân CLL
bằng kỹ thuật NGS
Cả 22 bệnh nhân đều được giải trình tự
thành công, với thông số Q30 > 90%.
Có 3 bệnh nhân (13,6%) phát hiện được
2 biến thể, 14 bệnh nhân phát hiện được 1
biến thể (63,6%) và 5 bệnh nhân không phát
hiện biến thể nào so với gen tham chiếu
(22,7%).
Kết quả xác định biến thể di truyền gen
TP53 được thể hiện ở Bảng 3:
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC VIỆT NAM LẦN 8
824
Bảng 3. Kết quả xác định biến thể di truyền gen TP53 trên bệnh nhân CLL (n=22)
Số biến thể trên mỗi bệnh nhân
Số lượng bệnh nhân (tỷ lệ %)
2 biến thể
3 (13,6%)
1 biến thể
14 (63,6%)
Không phát hiện biến thể
5 (22,7%)
Số lượng biến thể phát hiện được: 6 biến thể
Loại biến thể
Tỷ lệ (%)
Sai nghĩa
100
Vô nghĩa
0
Dịch khung
0
Danh sách các biến thể phát hiện được
Tên biến thể (thay đổi nucleotid*)
Số lượng bệnh nhân (tỷ lệ %)
c.188C>T
2 (9,1%)
c.215C>G
14 (63,6%)
c.536A>G
1 (4,5%)
c.584T>C
1 (4,5%)
c.824G>T
1 (4,5%)
c.844C>T
1 (4,5%)
Ghi chú: n: cỡ mẫu; * Gen TP53 tham
chiếu: NM_000546.5;
VAF: tần số xuất hiện của biến thể ở mỗi
bệnh nhân
a: VAF của c.188C>T ở hai bệnh nhân
mang biến thể này lần lượt là 44.9% và
48.6%
b: VAF của c.215C>G ở những bệnh
nhân mang biến thể này nằm trong khoảng
từ 57,1% đến 99,7%
3.3. Đặc điểm các biến thể di truyền
gen TP53
Biến thể di truyền lành tính phát hiện
nhiều nhất là c.215C>G với 14 trường hợp,
chiếm 63,6%, tiếp theo là c.188C>T với 2
trường hợp, chiếm 9,1% (một trong hai
trường hợp này cũng mang biến thể
c.215C>G).
Biến thể di truyền gây bệnh bao gồm:
c.584T>C (phát hiện trên 1 bệnh nhân, chiếm
4,5%, trường hợp này cũng mang biến thể
c.215C>G), c.536A>G (1 bệnh nhân, chiếm
4,5%), c.824G>T (1 bệnh nhân, chiếm 4,5%)
và c.844C>T (phát hiện trên cùng bệnh nhân
mang biến thể c.824G>T, chiếm 4,5%).
Bảng 4. Đặc điểm các biến thể di truyền gen TP53 phát hiện trong nghiên cứu
TT
Biến thể (thay
đổi nucleotide*)
Thay đổi acid
amin**
Exon
Domain
(trên protein p53)
Phân loại tác động
theo ACMG
5
c.188C>T
p.(Ala63Val)
4
Transactivation TAD2
Lành tính
6
c.215C>G
p.(Pro72Arg)
4
Proline rich
Lành tính
2
c.536A>G
p.(His179Arg)
5
HCD III – DNA binding
Gây bệnh
1
c.584T>C
p.(Ile195Thr)
6
DNA binding
Gây bệnh
3
c.824G>T
p.(Cys275Phe)
8
HCD V – DNA binding
Gây bệnh
4
c.844C>T
p.(Arg282Trp)
8
HCD V – DNA binding
Gây bệnh
Ghi chú: * Gen TP53 tham chiếu: NM_000546.5; ** Protein p53 tham chiếu: NP_000537.3