Đánh giá đa dạng di truyền lúa chịu hạn Việt Nam bằng chỉ thị SSR: Đề tài nghiên cứu

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thày giáo, cô giáo khoa Sinh

học, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá

trình học tập.

Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân trọng nhất đến TS. Khuất Hữu Trung,

Phó trưởng Bộ môn Kĩ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình

hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp này.

Xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị, các bạn đang làm việc tại Bộ môn

Kĩ thuật di truyền, viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập,

tìm tài liệu, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu, và cho tôi những lời

khuyên quý giá để luận văn có thể hoàn thiện hơn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị em trong gia đình, bạn

bè đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể

toàn tâm, toàn ý cho công việc.

Xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 05 tháng 11 năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Thảo

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA: Axit abcisic

ADN: Acid deoxyribonucleic

AFLP: Amplified fragment length polymorphism

ARN: Acid ribonucleic

CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit

dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat

EtBr: Ethidium Bromide

EDTA: Etylen diamine tetra acetic acid

FAO: The World Food Organization

HSPs: Heat shock protein

IRRI: International Research Rice Institute

LEA: Late embryogenesis abundant protein

NTSYS: Numerial taxonomy system

PCR: Polymerase chain reaction

PIC: Polymorphic Information Content

QTL: Quantitative trait loci

RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA

RE: Restriction enzyme

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

SDS: Sodium dodecyl sunphate

SSR: Simple sequence repeats

STS : Sequence Tagged Site

TAE: Tris-acetat-acid EDTA

TE: Tris EDTA

WUE: Water use efficiency

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1

1. Lí do chọn đề tài ................................................................................................................ 1

2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................................... 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ........................................................................... 2

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................................... 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3

1.1. Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ............................................................................................. 3

1.2. Khái niệm về hạn và phân loại hạn ............................................................................. 5

1.2.1. Khái niệm về hạn .................................................................................................... 5

1.2.2. Phân loại hạn ........................................................................................................... 6

1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ................................................... 7

1.3.1. Ảnh hưởng của hạn đến thực vật ............................................................................ 7

1.3.2. Tác động của hạn đến sản xuất nông nghiệp........................................................... 8

1.4. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu tính chịu hạn ở cây lúa ....................................... 10

1.4.1. Đặc điểm hình thái và sinh lí lúa chịu hạn ............................................................ 10

1.4.2. Cơ sở sinh lí, hóa sinh của tính chịu hạn .............................................................. 11

1.4.3. Cơ sở phân tử của tính chịu hạn ............................................................................ 12

1.4.4. Thể hiện của gen điều khiển tính chống chịu khô hạn .......................................... 14

1.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa .............................................................. 18

1.5.1. Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền .................................................... 18

1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ................................................. 19

1.5.3. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa .................................................. 21

1.6. Chọn tạo giống lúa chịu hạn ...................................................................................... 24

1.6.1. Chọn tạo lúa chịu hạn trên thế giới ....................................................................... 24

1.6.2. Chọn tạo giống lúa chống chịu hạn ở Việt Nam ................................................... 27

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 30

2.1. Vật liệu ......................................................................................................................... 30

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 30

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................ 31

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 35

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch ......................................................... 35

2.2.2. Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR- PCR .................................................................... 36

2.2.3. Kiểm tra kết quả PCR trên gel Agarrose 3,0%. .................................................... 37

2.2.4. Phân tích và xử lí số liệu ....................................................................................... 38

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 39

3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ................................................................................ 39

3.2. Kết quả phân tích đa hình tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị

phân tử SSR ........................................................................................................................ 40

3.2.1. Kết quả phân tích với một số mồi điển hình ......................................................... 40

3.2.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi ................ 43

3.2.3. Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu .............. 45

3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn nghiên cứu ........ 47

3.4. Kết quả xác định các allele hiếm, allele đặc trƣng nhận dạng các giống lúa

trong tập đoàn nghiên cứu ................................................................................................ 52

3.4.1. Kết quả xác định các allele hiếm, nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn

nghiên cứu ....................................................................................................................... 52

3.4.2. Kết quả xác định các allele đặc trưng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn

nghiên cứu ....................................................................................................................... 53

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 57

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể, kiểu gen và

phân bố địa lý .............................................................................................. 4

Bảng 1.2. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa ................. 5

Bảng 2.1. Danh sách, số đăng kí (SĐK) trong ngân hàng gen và kí hiệu các

giống lúa nghiên cứu.................................................................................. 30

Bảng 2.2. Danh sách 50 mồi SSR ............................................................................ 33

Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR ................................ 44

Bảng 3.2. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử dụng ch thị SSR trên

cây lúa đã được công bố ............................................................................ 45

Bảng 3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa

nghiên cứu .................................................................................................. 46

Bảng 3.4. Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu ...................... 49

Bảng 3.5. Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu (tiếp) ............. 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng điều

kiện hạn của các gen ở thực vật .............................................................. 13

Hình 1.2. Vị trí của protein hạn hán trên các nhiễm sắc thể ở cây lúa .................... 16

Hình 3.1. ADN tổng số của 40 giống lúa nghiên cứu ............................................... 39

Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM566 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) ...................................... 40

Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3515 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 40

Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5599 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 41

Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM1364 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 41

Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3431 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 42

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3534 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 42

Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM7003 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 42

Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM25271 (M: 100bp DNA Ladder) .......................................................... 43

Hình 3.10. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM25319 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................. 43

Hình 3.11. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa địa

phương chịu hạn ......................................................................................... 48

Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3467 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 52

Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5811 (M: 100bp DNA Ladder) ............................................................ 53

Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM1155 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 54

Hình 3.15. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3476 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 54

Hình 3.16. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3468 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 55

Hình 3.17. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM6051 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) .................................... 55

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây lương thực có từ rất lâu trên thế giới.

Trải qua hàng ngàn năm, đến nay cây lúa đã trở thành nguồn lương thực chính của

½ dân số trên địa cầu. Nó cung cấp 20% tổng năng lượng hấp thụ hàng ngày của

nhân loại. Ở hầu hết các nước nông nghiệp, ngành sản xuất lúa gạo đem lại giá trị

kinh tế cao và cung cấp việc làm cho hàng triệu lao động.

Việt Nam là một trong những trung tâm phát sinh cây lúa và có tài nguyên di

truyền cây lúa vào loại phong phú nhất trên thế giới. Nghề trồng lúa trở thành nghề

truyền thống, quan trọng hàng đầu trong nền nông nghiệp của nước ta. Trung bình

hàng năm, lúa gạo chiếm trên 60% tổng sản lượng lương thực và được gieo trồng

trên 3,96 triệu ha.

Tuy nhiên, do điều kiện địa hình nhiều đồi núi, đồng bằng sát biển hoặc do

hậu quả của biến đổi khí hậu, 50% diện tích lúa đang được canh tác trong điều kiện

môi trường rất bấp bênh, dễ bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh bất lợi như hạn,

mặn, lạnh... Trong đó, khô hạn là một trong những vấn nạn làm cho năng suất bị

giảm mạnh, sản phẩm nông nghiệp không ổn định. Hậu quả của biến đổi khí hậu

toàn cầu làm cho hạn hán xảy ra thường xuyên trên diện rộng và đã vượt tầm kiểm

soát của con người. Vấn đề hạn hán càng trở nên bức xúc khi hầu hết diện tích đất

canh tác bị hạn nặng lại tập trung ở vùng sâu, vùng xa, vùng nông thôn nghèo, nơi

mà cuộc sống người dân chủ yếu dựa vào sản phẩm nông nghiệp.

Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển bền

vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các nguồn gen

liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật nói chung và ở cây lúa nói riêng để nâng cao

khả năng chịu hạn, ổn định năng suất ở cây trồng trở thành vấn đề thời sự mang tính

cấp bách và cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng

di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”

nhằm tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen lúa chịu hạn bản địa Việt Nam phục vụ

công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn.

1

2. Mục đích nghiên cứu

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa

của Việt Nam ở mức phân tử và xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen

ở các địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có

hiệu quả các nguồn gen lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thêm nhiều dữ liệu, thông tin khoa học hữu ích cho công tác

nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền của giống lúa chịu hạn.

Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chịu hạn tạo cơ sở lý

luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống

lúa chịu hạn trong sản xuất.

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu hạn có ý nghĩa quan trọng

trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các

nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu

thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu hạn ở mức phân tử.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các ch thị phân tử góp phần nâng

cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất

cao, có khả năng chịu hạn, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng khô hạn và cơ

cấu sản xuất lúa vùng khô hạn ở Việt Nam.

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

4.1. Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn 39 giống lúa có đặc tính chịu hạn

được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ, bảo

tồn tại ngân hàng gen Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Lúa đồng bằng sông

Cửu Long và 01 giống lúa tham khảo (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn.

4.2. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gen lúa ở mức phân tử bằng ch thị SSR;

Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di Truyền

Nông nghiệp.

2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vài nét sơ lƣợc về cây lúa

Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Graminae), tộc Oryzae, chi Oryza, có tổng số

nhiễm sắc thể 2n = 24. Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung

Mỹ và một phần ở Châu Úc. Trong đó, ch có 2 loài là lúa trồng, còn lại là lúa

hoang hằng niên và đa niên. Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và

chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L. Loài này hầu như có mặt

ở khắp nơi từ đầm lầy đến sườn núi, từ vùng xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới, từ khắp

vùng phù xa nước ngọt đến vùng đất cát sỏi ven biển nhiễm mặn, phèn… Một loài

lúa trồng khác là Oryza glaberrima Steud, ch được trồng giới hạn ở một số quốc

gia Tây Châu Phi và hiện đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L. [13].

Tateoka (1963) (trong Oka, 1988) lại phân biệt 22 loài, trong đó, cũng thống

nhất 2 loài lúa trồng O. sativa L. và O. glaberrima Steud. Tateoka xem dạng lúa

Châu Phi (O. perennis Moench) như là một loài riêng O. barthii A. Chev., và dạng

lúa Châu Á và Châu Mỹ thuộc về loài O. rufipogon Griff. Tateoka cũng bổ sung 2

loài mới: O. longiglumis Jansen và O. angustifolia Hubbard (Bảng 1.1) [47].

Năm 1928 - 1930, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã phân loại lúa trồng thành

2 nhóm “Indica” và “Japonica” dựa trên cơ sở phân bố địa lý, hình thái cây và hạt,

độ bất dục khi lai tạo và phản ứng huyết thanh (Serological reaction). Các nhà

nghiên cứu Nhật Bản sau đó đã thêm một nhóm thứ 3 “Javanica” để đặt tên cho

giống lúa cổ truyền của Indonesia là “bulu” và “gundil”. Tên gọi của 3 nhóm thể

hiện nguồn gốc xuất phát của các giống lúa từ 3 vùng địa lý khác nhau. Từ

“Janvanica” có gốc từ chữ Java là tên của một đảo của Indonesia. Từ “Japonica” có

lẽ xuất xứ từ chữ Japan là tên nước Nhật Bản. Còn “Indica” có lẽ có nguồn gốc từ

India (Ấn Độ) (Bảng 1.2) [5].

3

Bảng 1.1. Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể,

kiểu gen và phân bố địa lý [47]

Nhóm/loài 2n Kiểu gen Phân bố địa lý

Nhóm Oryzae

Sativa L. AA Khắp thế giới, lúa trồng 24

Rufipogon Griff. AA Châu Á, Châu Mỹ 24

Barthii A. Chev. AA Châu Phi 24

glaberrima Steud. AA Châu Phi, lúa trồng 24

breviligulata A. Chev. et Roehr. AA Châu Phi 24

australiensis Domin EE Châu Úc 24

eichingeri A. Peter CC Châu Phi 24

punctata Kotschy 24, 48 BB, BBCC Châu Phi

officinalis Wall. 24 CC Châu Á

minuta J.S. Presl 48 BBCC Châu Á

latifolia Desv. 48 CCDD Châu Mỹ

alta Swallen 48 CCDD Châu Mỹ

grandiglumis Prod. 48 CCDD Châu Mỹ

Nhóm Schlechterianae

schlechteri Pilger New Guinea

Nhóm Granulatae

meyeriana Baill. 24 Châu Á

Nhóm Ridleyanae

ridleyi Hook. F. 48 Châu Á

longiglumis Jansen 48 New Guinea

Nhóm Angustifoliae

brachyantha A. Chev. et Roehr. 24 FF Châu Phi

angustifolia Hubbard 24 Châu Phi

perrieri A. Camus 24 Malagasy

Tisseranti A. Chev. 24 Châu Phi

Nhóm Coarctatae

Coarctata Roxb. 48 Châu Á

Nguồn: Oka, 1988 [39]

4

Bảng 1.2. Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa

Đặc tính INDICA JAVANICA JAPONICA

Thân -Thân cao -Thân cao trung bình Thân thấp

Chồi -Nở bụi mạnh -Nở bụi thấp Nở bụi trung bình

Lá -Lá rộng, xanh nhạt -Lá rộng, cứng, xanh nhạt Lá hẹp, xanh đậm

Hạt -Hạt thon dài, dẹp -Hạt to, dầy -Hạt tròn, ngắn

-Hạt hầu như không -Hạt không có đuôi hoặc -Hạt không đuôi

có đuôi có đuôi dài tới có đuôi dài

-Trấu ít lông và lông -Trấu có lông dài -Trấu có lông dài

-Ít rụng hạt ngắn và dầy

-Hạt dễ rụng -Ít rụng hạt

Sinh học -Tính quang cảm rất -Tính quang cảm rất yếu -Tính quang cảm

thay đổi rất thay đổi

Nguồn: Chang, 1985 [22].

Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới

và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13

nước thuộc Châu Á. Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích

trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu. Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi

nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước

Mĩ La tinh. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt

Nam, nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2-3 lần.

1.2. Khái niệm về hạn và phân loại hạn

1.2.1. Khái niệm về hạn

Bất cứ một cây trồng nào cũng cần có nước để duy trì sự sống. Mức độ cần

nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai đoạn phát triển của

chúng. Hạn đối với thực vật là khái niệm ch sự thiếu nước do môi trường gây nên

trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến quá trình

sinh trưởng và phát triển. Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có

nhiều mức độ khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường. Những

cây trồng phát triển bình thường trong điều kiện khô hạn gọi là “cây chịu hạn” và

5

khả năng có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính

chịu hạn” [9].

Tuy nhiên, khó có thể xác định được thế nào là trạng thái hạn đặc trưng vì

mức độ khô hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng

vùng địa lý và không thể dự đoán trước được. Mức độ khô hạn do môi trường gây

nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì

có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây, mùa màng [43]…

Dưới tác động các yếu tố gây hạn của môi trường như thành phần thổ

nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng… đã gây nên hiện tượng thiếu

nước của cây, mà nguyên nhân chính là do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây

và môi trường, dẫn đến sự thiếu hụt nước trong tế bào. Trong trường hợp này, tác

động của môi trường bên ngoài rất lớn gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của

cây. Thông thường, hạn được phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và

hạn toàn diện [6].

1.2.2. Phân loại hạn

1.2.2.1. Hạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp

(< 65%). Hiện tượng này thường gặp ở những t nh miền Trung nước ta vào

những đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông. Hiện tượng này còn

xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel; gió Mistral ở miền

nam nước Pháp… đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loài cây trồng như

phong lan, cam, chanh, đậu tương [42]...

Hạn không ch ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây như hoa, lá, chồi

non,… mà còn ảnh hưởng đến quá trình tung phấn của cây. Đối với thực vật nói

chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời

vì nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát hơi nước nhanh vượt qua mức độ

bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, cây lâm vào tình

trạng mất cân bằng về nước. Nước cũng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và giai

đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa hóa sinh, là môi trường để các phản ứng

trao đổi chất xảy ra [50]. Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho cây chính là một biện

6

pháp canh tác quan trọng. Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây

trồng là một trong những mục tiêu của các nhà tạo chọn giống.

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh

trưởng của cây. Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng

sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng quá trình già hóa tế bào. Khi

bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn

thương và chết.

1.2.2.2. Hạn đất

Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả

năng giữ nước của đất. Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến

mức cây không thể lấy nước qua tế bào rễ, vì thế hạn đất có thể gây ra cho cây héo

lâu dài. Hạn đất tác động trực tiếp đến bộ phận rễ làm ảnh hưởng rất lớn đến quá

trình sinh trưởng và phát triển của cây. Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh

hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm. Lượng nước trong đất

không đủ làm co mầm và héo; nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết.

1.2.2.3. Hạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng

một lúc. Trong trường hợp này, cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm

lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút

nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ

cung cấp cho cây. Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây

không có khả năng phục hồi. Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy ra ở các t nh

miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh,…) gây nên thiệt hại đáng kể cây trồng nói chung

và cây lúa nói riêng.

1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp

1.3.1. Ảnh hưởng của hạn đến thực vật

Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của

môi trường như hạn, nóng, lạnh, mặn,... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho

sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học [16]. Đối với thực vật,

khái niệm “hạn” dùng để ch sự thiếu hụt nước do môi trường gây nên trong suốt cả

7

quá trình hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của

cây. Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau

như chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường. Những cây trồng có

khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện

khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức

độ tổn thương do thiếu hụt nước gây nên gọi là tính chịu hạn [9].

Hạn dẫn đến một số biến đổi trong mô và tế bào như làm biến tính và kết tủa

protein, làm tăng độ lỏng của lipit màng, mở xoắn các axit nucleic. Hạn cũng phá

hoại hệ thống quang hóa II trên màng thylacoid. Ảnh hưởng của hạn trước hết là

gây ra sự mất nước của tế bào và mô. Thiếu nước nhẹ làm ảnh hưởng tới quá trình

sinh trưởng, thiếu nước nặng gây biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, già hóa tế bào,

làm cho cây bị héo. Cuối cùng hệ nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào

và mô bị tổn thương và chết. Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm

giảm năng suất gieo trồng [16]. Phản ứng của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng,

giảm tỷ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp và làm tăng tích lũy axit abcisic

(ABA), prolin, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat, glutathione, α-

tocopherol,... và sự tổng hợp protein mới [54].

1.3.2. Tác động của hạn đến sản xuất nông nghiệp

Hạn hán là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây

trồng và làm cho sản lượng nông nghiệp toàn cầu không ổn định. Hàng năm, các

điều kiện bất lợi của môi trường làm giảm 50% năng suất mùa màng, trong đó tính

riêng hạn hán chiếm tới 15%. Thậm chí ở một số nơi có mực nước ngầm thấp, có

năm hạn làm giảm 100% năng suất mùa màng [19].

Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở các t nh

miền Bắc. Tình trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7/2009 đã ảnh hưởng nghiêm

trọng vùng trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu hẹp 60% diện tích

trồng trọt. Đây là trận hạn hán nghiêm trọng nhất quốc gia này trong vòng 60 năm

qua và tác động lên hầu hết các vùng sản xuất lúa mì trong lãnh thổ Cộng hòa

Nhân dân Trung Hoa. Ngoài việc phá hủy vụ mùa lúa mì, hạn hán còn gây ra tình

trạng thiếu nước cho ước tính khoảng 2,31 triệu người và 2,57 triệu gia súc. Trong

8

8 t nh chịu tác động, 20% đất nông nghiệp và 35% tổng diện tích lúa mì đều bị

ảnh hưởng. Đến tháng 2 năm 2011, trận hạn hán ảnh hưởng lên diện tích 7,73 triệu

hécta lúa mì vụ đông sắp được thu hoạch. Theo FAO, thiệt hại vụ thu hoạch lúa mì

của Trung Quốc có khả năng là một yếu tố đã làm tăng giá lúa mì trên toàn thế

giới vào đầu năm 2011 [42].

Ấn Độ cũng đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong vòng

7 năm qua. Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán.

Thiếu hụt lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh tế của quốc gia này giảm

sút 1% trong năm 2006. Đợt hạn hán tồi tệ nhất trong lịch sử gần 20 năm qua tại Thái

Lan vào năm 2002 đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới đối mặt với vụ

mùa thất thu. Và theo thông báo mới nhất của cơ quan ngăn ngừa và giảm thiểu thảm

họa Thái Lan, 354 huyện thuộc 47 trên tổng số 77 t nh, thành của nước này nằm trong

khu vực thảm họa hạn hán [42].

Ở Việt Nam, hạn hán xảy ra ngày càng kéo dài hơn trước và ảnh hưởng ngày

càng trầm trọng hơn đối với sản xuất nông nghiệp. Hạn hán năm 1962 ở Bắc bộ và

Bắc Trung bộ đã phá huỷ 370.000ha hoa màu. Trận hạn hán 1982 đã tàn phá

180.000ha cây màu ở đồng bằng sông Cửu Long. Trong năm 1983, chúng ta đã mất

291.000ha trồng lúa do hạn hán. Vụ Đông Xuân năm 1992 - 1993, sản lượng lúa

của đồng bằng sông Cửu Long giảm 559.000 tấn. Năm 1993 khoảng 175.000ha ở

miền Trung bị hạn, trong đó 35.000ha bị chết hoàn toàn, mất khoảng 150.000 tấn

lương thực. Vụ hạn 1994 - 1995 ở Đăk Lắk được xem là nặng nề nhất trong 50 năm

gần đây, đã làm giảm doanh thu từ cây cà phê khoảng 600 t đồng. Trận hạn hán

khác năm 1995 - 1996 ở Miền Bắc tàn phá hoa màu khoảng 13.380ha của vùng

Trung Du và 100.000ha vùng đồng bằng sông Hồng. Đặc biệt, hạn hán năm 1998

xảy trên toàn lãnh thổ Việt Nam với tổng diện tích bị hạn hán là 734.284ha, trong

đó 276.656ha ở đồng bằng sông Cửu Long. Trận hạn hán này đã ảnh hưởng tới 3,8

triệu dân, gây thiệt hại khoảng 5.000 t đồng. Các t nh từ Khánh Hoà đến Bình

Thuận thường xuyên xảy ra hạn hán với tổng số diện tích hạn hán lên tới 300.000ha.

Tại Bình Thuận, năm 2004, hạn hán xảy ra trầm trọng khiến diện tích trồng trọt

giảm 30 - 50%. Đợt nắng nóng kéo dài cuối năm 2009 khiến ngành nông nghiệp các

9

t nh Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại hàng trăm t đồng. T nh Kiên Giang có

khoảng 13.400ha lúa bị ảnh hưởng, trong đó hơn 3.000ha bị mất trắng hoàn toàn,

thiệt hại gần 80 t đồng. Thiệt hại nặng nhất là huyện Gia Rai, ước tính ch riêng

huyện này đã bị thiệt hại gần 50 t đồng [7].

Theo tính toán của Tổng cục Thủy lợi (CAO), thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn (04/ 2010), nếu tình hình khô hạn, thiếu nước ngọt như hiện nay tiếp

tục kéo dài sẽ ảnh hưởng tới năng suất của khoảng 26.000ha lúa đông xuân ở các

vùng Trung du, đồng bằng Bắc bộ và khoảng 100.000ha ở Nam bộ. Cũng theo Cục

Thuỷ lợi, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, nắng nóng, khô hạn kéo dài tại

các t nh Nam Trung bộ và Tây Nguyên đã làm hơn một triệu người thiếu nước sinh

hoạt. Sơ bộ, tổng thiệt hại do hạn hán tại 2 khu vực này đã lên tới 1.258 tỷ đồng.

1.4. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu tính chịu hạn ở cây lúa

1.4.1. Đặc điểm hình thái và sinh lí lúa chịu hạn

Để nhận biết cây lúa kháng hạn hay khả năng chịu hạn của chúng cần nghiên

cứu đặc điểm hình thái và hoạt động sinh lí của lúa chịu hạn để tạo ra các giống lúa

chịu hạn đạt năng suất cao, mang lại hiệu quả kinh tế lớn và phù hợp với địa hình

của nước ta, đặc biệt là trong bối cảnh biến đổi khí hậu hiện nay. Các đặc điểm hình

thái và sinh lí biểu hiện giống lúa có khả năng chịu hạn là:

Khi gặp điều kiện khô hạn, bộ lá ngừng sinh trưởng hoặc sinh trưởng chậm

lại để hạn chế sự thoát hơi nước. Đồng thời phiến lá mỏng hơn, nhiều lông hơn để

hạn chế sự tích tụ nhiệt, hạn chế sự thoát hơi nước [62].

Một phản ứng thiết thực nhất ở lúa là đóng khí khổng khi gặp điều kiện hạn.

Điều này có tác dụng hạn chế sự thoát hơi nước và đồng thời cũng làm hạn chế khả

năng quang hợp. Vì vậy, đối với lúa chịu khô hạn, một đặc điểm thích nghi của nó là

nâng cao hiệu suất quang hợp trước khi xảy ra hiện tượng đóng khí khổng [62].

Lá có xu hướng cuộn lại và giảm góc độ lá. Điều này có tác dụng giảm

cường độ bức xạ trên bề mặt lá, tăng cường ánh sáng đi xuống phía dưới và giúp

duy trì trạng thái thoát hơi nước ở bề mặt lá ở mức tối thiểu [62].

Khi gặp điều kiện hạn, ABA được tăng cường tổng hợp ở rễ, sau đó vận

chuyển lên lá, đẩy nhanh tốc độ già hóa của lá, đóng khí khổng làm giảm sự thoát hơi

10

nước. Bên cạnh đó, ABA được tăng cường trên lá làm mức độ héo tăng lên giúp cây

tránh bớt được bức xạ mặt trời, giảm sử dụng nước và tăng sử dụng bề mặt lá [8], [62].

Rễ mọc dài hơn, phân bố rộng và sâu hơn vào các lớp đất giúp cây lúa tận

dụng nước dưới sâu. Khi bắt đầu gặp điều kiện hạn ở giai đoạn cây con, khối lượng

rễ và tỷ lệ rễ/thân, sinh nhiều rễ đốt vì rễ đốt có khả năng đâm xuyên vào các lớp

đất tốt hơn để tăng cường khả năng hút nước. Đồng thời theo nghiên cứu của

Muthukuda (2001) cho thấy: khi gặp hạn, tốc độ dài rễ lớn hơn tốc độ dài lá.

Nghiên cứu của Phạm Văn Cường (2009) ch ra rằng: ở các giống lúa chịu hạn

CH5, 103S-R20 và Toitsu thì chiều dài rễ, số rễ/cây, trọng lượng khô của rễ/cây và

tốc độ hút nước của rễ ở các giống chịu hạn cao hơn rất nhiều giống đối chứng khi

có nước trở lại [4], [8], [23], [62].

Khi gặp hạn, cây có phản ứng giảm chiều cao cây để hạn chế nhu cầu sử

dụng nước, đồng thời hạn chế sự tác động của bức xạ mặt trời. Phản ứng thấp cây

cũng làm tăng khả năng chống đổ ở cây lúa [62].

Trổ bông muộn hơn cũng là một phản ứng của lúa chống chịu khô hạn.

Khi gặp hạn hán trong giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng, với những giống không

nhạy cảm với quang chu kỳ có thể trổ bông muộn hơn lúa bình thường 3 đến 4 tuần.

Nhạy cảm nhất là khi cây lúa gặp hạn ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng còn giai

đoạn sinh trưởng sinh thực thì ít mẫn cảm hơn [62].

Trong giai đoạn đẻ nhánh và trổ bông, nếu gặp hạn thì số nhánh và số

bông sẽ giảm. Tuy nhiên, ở lúa chịu hạn điều đó không ảnh hưởng nhiều đến năng

suất do số bông/khóm ít được bù lại bởi sự gia tăng số hặt chắc/bông và sự gia tăng

khối lượng hạt [62].

1.4.2. Cơ sở sinh lí, hóa sinh của tính chịu hạn

Khi môi trường khô hạn, thực vật chống lại sự mất nước và nhanh chóng bù

lại phần nước đã mất nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều ch nh áp suất thẩm thấu

của tế bào. Sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc hình thái của rễ và chồi nhằm giảm

thiểu tối đa sự mất nước hoặc tự điều ch nh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua

tích lũy của các chất hòa tan, các protein và axit amin,... nhằm duy trì lượng nước

tối thiểu trong tế bào. Khả năng thu nhận nước chủ yếu phụ thuộc vào chức năng

11

của bộ rễ. Bộ rễ có hình thái khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở

những vùng sâu. Ngoài ra, cây có hệ mạch dẫn phát triển dẫn nước lên các cơ quan

thoát hơi nước, hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự thoát hơi nước của cây [1], [12].

Khả năng điều ch nh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả

năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện khô hạn, áp

suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi

còn trong đất. Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn

cục bộ. Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều

cho rằng khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm lượng

prolin, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ,... giảm CO2, protein và các

axit nucleic trên cây lúa. Các chất trên có chức năng điều ch nh áp suất thẩm thấu

nhờ khả năng giữ và lấy nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+.

Ngoài ra còn có thể thay thế vị trí của nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương

tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá hủy màng [17].

Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzym trong điều kiện gây hạn đã

được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa

sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét rằng áp

suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ proteaza, kìm hãm sự

phân giải protein dự trữ. Một số nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu

xanh, đậu tương,… cho thấy mối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và

hoạt độ α-amylaza [6], [9]. Đường tan là một trong những chất tham gia điều ch nh

áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự tăng hoạt độ α-amylaza sẽ làm tăng hàm lượng

đường tan do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây

trồng. Một trong các chất liên quan đến thẩm thấu được chú ý là prolin. Prolin là

một amino axit có vai trò quan trọng trong sự điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế

bào. Theo tác giả Chen và Muranta (2002), sức chống chịu của thực vật tăng lên khi

được chuyển các gen mã hóa enzym tham gia vào con đường sinh tổng hợp prolin

trong tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy prolin có thể tăng 10

đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của áp suất thẩm thấu [24].

1.4.3. Cở sở phân tử của tính chịu hạn

12

Phản ứng của thực vật trước tác động của hạn rất đa dạng, phụ thuộc vào

nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của điều kiện

ngoại cảnh. Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất

trong tế bào, một số hoocmon hoặc chất kích thích để giúp cây có khả năng thích

ứng. Khi đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ phân tử của hiện tượng nóng, hạn ở thực

vật người ta đã có những bước tiếp cận khác nhau trên nhiều loài cây trồng ở các

giai đoạn phát triển. Được nghiên cứu nhiều nhất là các protein sản phẩm biểu hiện

gen. Các nhóm protein được đặc biệt quan tâm bao gồm: protein sốc nhiệt, môi giới

phân tử, LEA [2].

Hình 1.1. Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng

điều kiện hạn của các gen ở thực vật

- Protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSPs): HSPs có ở hầu hết các loài

13

thực vật như lúa mì, lúa mạch, lúa gạo, ngô, đậu nành, hành, tỏi,... chúng chiếm

khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. HSP được tổng hợp khi

tế bào gặp điều kiện cực đoan như: nóng, hạn, lạnh, phèn, mặn,... Sự xuất hiện của

HSP có chức năng ngăn chặn hoặc sửa chữa sự phá hủy do stress nóng và mở rộng

giá trị ngưỡng chống chịu nhiệt độ cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập

chung thành các hạt sốc nhiệt (HSG - heat shock granules). Người ta cho rằng các

HSP gắn kết trên các ARN polymeraza để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN

trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng các hạt này phân tán và liên kết dày đặc

với các riboxom hoạt động sinh tổng hợp protein. HSPs được chia thành 6 nhóm dựa

trên cơ sở khối lượng phân tử khác nhau: 110, 90, 70, 60, 20, 8.5 kDa. Trong đó

nhóm HSP 60 và HSP 70 có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (chaperonin).

HSP 8,5 kDa (ubiquitin) có chức năng bảo vệ tế bào nhưng không phải chất môi giới

phân tử. Ubiquitin có hoạt tính proteaza với chức năng phân giải các protein không có

hoạt tính enzym. Ubiquitin ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ cao nên có vai trò tự sửa

chữa khi tế bào gặp điều kiện cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ cao [30].

- LEA (Late embryogenesis abundant protein - protein tích lũy với lượng lớn

ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi): LEA là protein có vai trò bảo vệ

thực vật bậc cao khi môi trường xảy ra stress, đặc biệt là hạn. LEA là một trong

nhóm gen liên quan đến sự mất nước của tế bào thực vật. Protein LEA hạn chế sự

mất nước do điều kiện ngoại cảnh bất lợi và đóng vai trò điều ch nh quá trình mất

nước sinh lý khi hạt chín. Trong tự nhiên, phôi sau khi hình thành trong giai đoạn

chín thường được chuyển sang trạng thái ngủ, lượng nước trong phôi và trong hạt

giảm đến mức tối thiểu. Protein LEA được tạo ra hàng lọat trong giai đoạn muộn

của quá trình hình thành phôi. Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi

ABA, độ mất nước của tế bào và áp suất thẩm thấu trong tế bào. Protein LEA có

những đặc điểm chính sau: Giàu amino axit, ưa nước, không chứa cystein và

tryptophan, có khả năng chịu nhiệt. Protein LEA thực hiện các chức năng như cô

lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều ch nh áp suất

thẩm thấu. Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu và phân lập trên các đối tượng cây

trồng khác nhau [27], [51].

1.4.4. Thể hiện của gen điều khiển tính chống chịu khô hạn

14

Bản đồ QTL (Quantitative Trait Loci) được áp dụng trong trường hợp những

tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu mặn, hạn, lạnh,...). Di

truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt

gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên

kết của nó với những gen khác. Hầu hết các nghiên cứu về marker phân tử đều quan

tâm đến những thành phần rất đặc biệt trong sự kiện chống chịu khô hạn, đó là:

Khả năng của rễ cây phát triển sâu xuống tầng đất bên dưới.

Tính trạng phun râu và tung phấn với thời gian cách quãng được xác định

(ASI = được viết tắt từ chữ anthesis to silking interval).

Sự điều tiết áp suất thẩm thấu (OA = được viết tắt từ chữ osmotic adjustment)

Hiện tượng biến dưỡng ABA (abscisic acid).

Hiện tượng nông học WUE (water use efficiency - có nghĩa là hiệu quả sử

dụng nước).

Số QTL được tìm thấy đối với tính trạng chống chịu khô hạn thường thay đổi

từ 1 đến 4 đối với một tính trạng thuộc thành phần trong sự kiện chống chịu hạn và

những QTL này thường trải rộng trên toàn bộ genome với nhiều nhóm liên kết gen.

Thí dụ, tính trạng WUE được tìm thấy với rất ít QTL, từ 4 đến 5 trong genome cây

đậu nành [35].

Hệ thống rễ phát triển tốt là một tính trạng vô cùng quan trọng giúp cây trồng

chống chịu khô hạn (cơ chế thoát hạn = drought avoidance mechanism). Người ta

đã sử dụng quần thể đơn bội kép (DH) của cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa

Quốc Tế (IRRI).

Sau đó Shen và cộng tác viên (1999) đã phát triển quần thể gần như đẳng gen

của IR64 được du nhập với những QTL chủ lực. Các tác giả đã ghi nhận bốn đoạn

trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 7, và 9 là nơi định vị các QTL chủ lực trong phân tích

chọn lọc từng QTL mục tiêu [43].

15

Hình 1.2. Vị trí của protein hạn hán trên các nhiễm sắc thể ở cây lúa (Theo

Nguyễn Thị Lang và cộng sự, 2010)

Người ta thực hiện nhiều cặp lai giữa các cây BC3F2 mang những đoạn mục

tiêu của vật liệu cho gen điều khiển rễ lúa phát triển tốt, để loại trừ ảnh hưởng di

truyền theo kiểu “genetic drag” và ảnh hưởng các QTL mục tiêu khác nhau chồng

lấp theo hình tháp [42].

Zhikang Li và cộng tác viên (IRRI) đã sử dụng 260 vật liệu (trong đó có

OM1723 của Việt Nam) từ 15 quốc gia để thực hiện hồi giao với IR64 và Teqing.

Họ thanh lọc tính chống chịu khô hạn của 215 quần thể BC1F1, và 4.677 dòng lai

cận giao (Ils) để nghiên cứu sự biến thiên di truyền chưa được biết (CGV: cryptic

genetic variation) của gen chống chịu khô hạn thông qua phân tích QTL [2].

Purwantomo và cộng tác viên (trích theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang,

2003) khai thác vai trò của các gen có tính chất “homeobox” để phát triển giống lúa

chống chịu khô hạn. Trong khi đó, nhóm nghiên cứu của CIRAD, Pháp, tập trung

nghiên cứu đặc tính của rễ lúa thích nghi với sự phát triển (E. Guiderdoni). Sự phát

triển hệ thống rễ lúa tương thích với stress đã được nghiên cứu và so sánh với cây

Arabidopsis thaliana. Một array biểu thị clone có qui mô 22K đối với áp suất thẩm

thấu và stress do mặn (SSH), một receptor đặc biệt và một oligo đóng vai trò

16

chuyển mã đã được xác định. Họ phát hiện ra gen mục tiêu có liên quan đến rễ lúa

trong điều kiện bị stress [2].

Giáo sư Ray Wu, ĐH Cornell, Mỹ, đã phát triển 3 dòng lúa chuyển gen: (1) gen

tổng hợp proline p5cs, (2) gen choline oxidase COX, (3) dung hợp cả hai gen TPS và

TPP trong tổng hợp trehalose. Gorantla và cộng tác viên nghiên cứu phổ thể hiện các

gen điều khiển tính chống chịu khô hạn với nhiều gen mục tiêu đã được phát hiện (trích

theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003) [2].

Toojinda và cộng tác viên thực hiện bản đồ QTL điều khiển tính trạng chống

chịu khô hạn tại Thái Lan, với các tính trạng mục tiêu: năng suất hạt, sinh khối, ch

số thu hoạch HI, số hạt chắc và lép, số hạt / bông, t lệ bất thụ, trọng lượng 1000

hạt, số bông, số chồi, chiều cao, số ngày từ gieo đến trỗ,v.v.. QTL định vị trên các

nhiễm sắc thể 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 đã được phân tích, trên cơ sở quần thể DH của tổ

hợp lai IR62266 / CT9993 tại 3 địa điểm khác nhau trong 3 năm liên tục. Đặc biệt

chú ý nhiễm sắc thể số 3 và số 5, nó tập hợp nhiều QTL có liên quan đến tính chống

chịu khô hạn (trích theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003) [2].

Hiện tượng nông học WUE trong cây lúa đã được Karaba và ctv. (2007)

nghiên cứu khá hệ thống với sự thể hiện của gen HRD chuyển nạp từ

Arabidopsis. Cây lúa chống hạn tiêu thụ nước ít biểu thị sự kiện sinh khối rễ tăng

lên trong điều kiện có tưới trở lại. Gen HDR với yếu tố chuyển mã AP2/ERF,

được phân lập trong dòng đột biến của Arabidopsis (theo kiểu gắn thêm chức

năng) hrd-D, điều khiển tính trạng sức mạnh của rễ, sự phân nhánh, tế bào biểu

bì, độ dầy của lá với tỷ lệ lục lạp tăng cao trong tế bào mesophyll, làm thúc đẩy

hiện tượng đồng hóa quang hợp và hiệu suất quang hợp (trích theo Bùi Chí Bửu,

Nguyễn Thị Lang, 2003) [2].

Đặc biệt, Wang và cộng tác viên (2007) đã so sánh sự thể hiện gen giữa giống

lúa nước và giống lúa cạn trong điều kiện bị stress do khô hạn, sử dụng phương

pháp cDNA microarray. Giống lúa cạn IRAT109, Haogelao, Han 297 và giống lúa

nước Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare đã được sử dụng. Sau khi đọc chuỗi trình tự

ADN, có 64 unique ESTs thể hiện ở mức độ cao ở giống lúa cạn và 79 ở giống lúa

nước. Tác giả dự đoán sự thể hiện của các gen mục tiêu ở mức độ cao trong lúa cạn

17

có thể cải tiến được khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước và những

loài cây trồng có liên quan gần về huyết thống [51].

1.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa

1.5.1. Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học là sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao

gồm các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các hệ sinh thái thủy vực khác,

cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần [63].

Đa dạng loài về số lượng và sự đa dạng của các loài được tìm thấy tại một khu vực

nhất định của một vùng nào đó. Đa dạng loài là tất cả sự khác biệt trong một hay nhiều

quần thể của một loài cũng như đối với quần thể của các loài khác nhau.

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền

trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng

di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành

phần axít nucleic, tạo thành mã di truyền [63].

Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loài mới;

đa dạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về

hệ sinh thái có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời các hệ sinh thái được

duy trì và bảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó. Phần đa

dạng sinh học do con người khai thác sử dụng gọi là đa dạng sinh học nông nghiệp.

Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính [25]:

Giá trị ổn định (Portfolio Value): Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các

hệ thống nông nghiệp ở quy mô toàn cầu, quốc gia và địa phương. Sự thiệt hại của

một giống cây trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống hoặc cây

trồng khác.

Giá trị lựa chọn (Option Value): Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học

cần thiết chống lại những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính

trạng hữu ích như tính kháng sâu bệnh hay tính thích nghi. Giá trị của đa dạng di

truyền được thể hiện thông qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quý, hiếm

của tài nguyên di truyền thực vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng và khả

năng thích nghi.

18

Năm 1946, giống lúa mỳ lùn Nhật Bản Norin 10 được nhập vào Mỹ và đã

góp phần quan trọng trong cải tạo giống và tăng năng suất lúa mỳ. Các giống lúa

trồng có nguồn gốc Đông Bắc Ấn Độ được sử dụng là nguồn kháng sâu, bệnh cho

các vùng khác nhau trên thế giới. Những tính trạng này đã góp phần tăng sản lượng

lúa bình quân của Châu Á lên 30% giữa những năm 1981 và 1986.

Giá trị khai thác (Exploration Value): Đa dạng di truyền được xem là kho dự

trữ tiềm năng các tài nguyên chưa biết đến. Đây cũng là lý do cần phải duy trì cả

các hệ sinh thái hoang dã lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống.

Ngoài ra, đa dạng di truyền còn có giá trị về thẩm mỹ (thưởng thức, giải trí)

và giá trị về đạo đức. Có một số loài có cả giá trị sử dụng, thẩm mỹ và đạo đức;

song về giá trị cũng không phải đều nhau giữa các mặt giá trị và giữa các loài [11].

1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nông

nghiệp. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy

hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ

xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọn các

cặp bố mẹ trong phép lai. Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di

truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau,

mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau. Việc

lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu.

1.5.2.1. Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên ch thị hình thái là phương pháp

đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ

phận). Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng

như quy trình phức tạp. Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến

trên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt

thường. Tuy nhiên, việc sử dụng ch thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền

có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các ch tiêu hình thái có hạn, ch thị hình

thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá

trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thông kê nên cần

19

thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; thứ ba, có nhiều tính trạng

do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có

thể đánh giá được. Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các ch tiêu

hình thái với việc xác định bằng ch thị sinh hoá và ch thị phân tử ADN để đạt

được kết quả chính xác nhất.

1.5.2.2. Chỉ thị sinh hóa

Ch thị sinh hoá là loại ch thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm ch

thị isozyme và các loại protein dự trữ.

Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau,

vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạo

thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phương

pháp nhuộm. Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thông

qua dòng thông tin di truyền từ ADN  ARN  Protein.

Ch thị protein và ch thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao

đồng thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein. Tuy nhiên, do

số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng

và phát triển của cá thể, nên các ch thị protein và isozyme được ứng dụng tương

đối hạn chế.

1.5.2.3. Chỉ thị phân tử ADN

Các ch thị phân tử ADN là những ch thị dựa trên bản chất đa hình ADN.

Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài

hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để

lựa chọn tổ hợp lai.

Ch thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có

tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác cao

mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Ch thị phân tử được chia

làm hai nhóm chính:

Ch thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: ch thị RFLP.

Ch thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP,

SSR,...).

20

Một số chỉ thị phân tử thường dùng: RFLP, RAPD, AFLP, SSR, STS, MAS [2].

RFLP là marker có tính chất đồng trội (co-dominant) và rất đáng tin cậy.

Kỹ thuật này sử dụng cDNA hoặc thể probe, được đánh dấu bằng phóng xạ, và sự

phân cắt hạn chế của enzyme.

RAPD là một dạng marker ADN được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR. Mức

độ khuếch đại cao từ một cặp mồi đơn giản, ngắn, được thiết kế ngẫu nhiên (10

mer). Đây là marker có tính trội (dominant) và mức độ tin cậy thấp.

STS là marker được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20-24 mer), có

tính chất đồng trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đôi khi nó cũng thể hiện tính

trội. Đây là phương pháp có thể phải sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp sự

đa hình không thể hiện rõ. Kết quả có độ tin cậy tốt.

Microsatellite hoặc SSR là marker được thiết kế từ những vệ tinh có chuỗi

ký tự giản đơn, lặp lại nhiều lần. Cặp mồi được thiết kế từ trước và sau những vệ tinh

như vậy marker có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá

nhạy. Do đó, nó đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD với các mô típ “di-

nucleotide” hoặc “tri-nucleotide” (GA, GT, CAT, CTT) trong genome cây lúa.

AFLP là một dạng trong những marker dựa trên cơ sở PCR, theo cách

chọn lọc của hai “adaptor” (là những enzyme phân cắt hạn chế). Nó phối hợp cả hai

tính chất của RFLP và RAPD nên nó có khả năng phát hiện đa hình rất tốt. Nhưng

nó thường có tính chất trội (dominant) nên gặp hạn chế khi thể hiện allele lặn.

Những marker phân tử nói trên đều có thể áp dụng đánh giá biểu hiện gen

để nghiên cứu tính chống chịu mặn của cây lúa. Hướng ưu tiên hiện nay được người

ta quan tâm là sử dụng microsatellite.

1.5.3. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa

1.5.3.1. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa trên thế giới

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của nhiều

loại ch thị ch thị cũng như số lượng của mỗi loại ch thị đã làm tăng hiệu quả

trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng với mục đích khác nhau.

Ch thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân

tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay chọn giống

21

phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả.

Tác giả Virk và cộng sự (1995) tiến hành nghiên cứu 12 giống lúa trồng

ở châu Á đại diện cho các vùng sinh thái, địa lý khác nhau bằng ch thị RAPD.

Kết quả cho thấy 18 trong số 24 mồi cho 83 băng, trong đó có 48 băng đa hình.

Số lượng băng đa hình xuất hiện từ 1- 5 băng/mồi, các băng nằm trong khoảng

300bp - 2700bp [50].

Olufowote và cộng tác viên (1997) nghiên cứu biến động di truyền trong

giống của 71 giống lúa bằng cả hai loại ch thị SSR và RFLP. Kết quả cho thấy các

giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống

lúa cải tiến. Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các allele ở các giống lúa

địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến. Ch thị SSR có khả năng phân biệt

các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các allele cao hơn ch thị

AFLP. Các tác giả cũng ch ra rằng ch cần chọn cẩn thận 4 ch thị SSR là có thể nghiên

cứu các allele dị hợp tử ở lúa [40].

Tác giả Xu và cộng tác viên (2004) sử dụng 113 ch thị RFLP và 60 ch thị

SSR để định lượng đa dạng allele của 125 giống lúa thu từ các Bang miền Tây và

miền Nam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế đang bảo quản tại IRRI.

Các tác giả nhận thấy cơ sở di truyền các giống lúa hiện có ở Mỹ hẹp hơn nhiều so

với các giống lúa từ tập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR allele so với 96% và 92%

RFLP so với 99% AFLP). 31 trong số 236 giống lúa có số lượng các allele cao

(chiếm tới 95% số allele của RFLP và 74% số allele của SSR) có thể được sử dụng

làm tập đoàn hạt nhân. Kết quả cũng cho thấy ch thị SSR sử dụng hữu hiệu hơn

RFLP cả về khả năng phát hiện các allele lẫn chi phí và kỹ thuật [55].

Tác giả Mahmoud và cộng sự (2005) nghiên cứu biến động và quan hệ di

truyền của 7 giống lúa bằng việc kết hợp của 8 mồi RAPD, 6 mồi SSR và 8 mồi

AFLP cho thấy mức độ đa hình của các mồi tương ứng là 72,2%, 90% và 67,9% và

khẳng định các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di

truyền cây lúa [33].

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa bằng ch thị SSR của

tác giả Raj cho thấy hệ số đa dạng gen của các ch thị SSR dao động từ 0 đến

22

0,830 và trong nghiên cứu của Jayamani và cộng tác viên (2007) dao động từ

0,179 đến 0,894 [29].

Tác giả McCouch và cộng sự (2005) khi nghiên cứu quan hệ di truyền giữa

52 giống lúa thơm Basmati và 17 giống lúa khác của Ấn Độ bằng 30 ch thị SSR

cho thấy số allele phát hiện được dao động từ 3 đến 22 và ch số thông tin di truyền

(PIC) dao động từ 0,2 đến 0,9. Trong số 30 ch thị SSR thì 20 ch thị phân biệt được

các giống lúa cổ truyền Basmati, 8 ch thị SSR có thể phân biệt được các giống lúa

Basmati chất lượng cao với các giống Basmati cải tiến và các giống không phải là

Basmati [34].

Quan hệ di truyền giữa các giống lúa Basmati hạt ngắn và Basmati hạt dài

cũng được tác giả Sujatha nghiên cứu bằng ch thị SSR. Kết quả nghiên cứu của 30

giống lúa thơm, bao gồm 22 giống lúa thơm hạt ngắn và 8 giống Basmati dựa trên 6

ch thị SSR cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạt ngắn nằm cùng một nhóm

lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng nhau và tách riêng, 8 giống lúa

Basmati nằm trong cùng một nhóm khác. Tác giả khẳng định ch thị phân tử cung

cấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các ch thị hình thái. Kết quả

nghiên cứu giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích hợp trong công tác

lai tạo giống lúa chất lượng [46].

Tác giả Victoria và cộng sự (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24

giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 ch thị SSR. Trong số 164 ch thị

SSR có 151 ch thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890, trung bình 5,89

allele/locus. Trong đó, có 89 ch thị cho 147 allele hiếm. Hệ số đa dạng di truyền

PIC từ 0,18 - 0,91 đạt trung bình 0,68/ch thị. Theo kết quả phân tích UPGMA, ở

độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm

8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica. Nghiên cứu này cho ta

thấy việc sử dụng ch thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của

lúa, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao

hơn và vì thế chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống [49].

23

1.5.3.2. Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa tại Việt Nam

Việt Nam được xem là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di

truyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng. Những nghiên cứu

về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn

chế. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm

ứng dụng các kỹ thuật ch thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta.

Và những thành tựu dưới đây sẽ cho thấy chúng ta hoàn toàn có khả năng thực

hiện được những nghiên cứu sinh học sử dụng các phương pháp công nghệ tiên

tiến, đẩy mạnh công tác chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi trong nước và hợp tác

quốc tế trên nhiều lĩnh vực sinh học hiện đại.

Tác giả Bùi Chí Bửu và cộng sự (2003) đã sử dụng 20 mồi RAPD để đánh

giá đa dạng di truyền của 72 giống lúa địa phương. Trong 20 mồi thử nghiệm

thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng. Kết quả có hai nhóm

chính bao gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở đồng bằng sông Hồng, lúa nước

sâu của đồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp của Tây Nguyên và lúa nước trời của

Duyên Hải Trung bộ [2].

Tác giả Trần Danh Sửu và cộng sự (2006) sử dụng 48 ch thị SSR để đánh

giá đa dạng di truyền của 17 giống lúa Tám. Hệ số đa dạng gen thu được từ các

giống lúa là 0,35. Số allele thu được trung bình 3,37 allele/mồi. 17 giống lúa này

còn được phân loại Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của ADN lục lạp. Kết

quả 17 giống lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica [13].

Tác giả Phạm Thị Bé Tư và cộng sự (2008) đã đánh giá đa dạng của 90

giống lúa mùa địa phương bằng ch thị SSR. Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung

bình là 0,88. Kết quả thu được từ 90 giống lúa mùa địa phương được phân thành 6

nhóm giống khác nhau [15].

1.6. Chọn tạo giống lúa chịu hạn

1.6.1. Chọn tạo lúa chịu hạn trên thế giới

Khô hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất của lúa (Oryza sativa L.), dưới

điều kiện canh tác nước trời (rainfed) và sự kiện thiếu nước tưới ngày càng nghiêm

trọng hơn ở vùng có nước tưới cũng như vùng lúa rẫy. Người ta tập trung sự chú ý

vào đối tượng khô hạn và mặn, hai dạng gây stress phi sinh học quan trọng đối với

24

sản xuất lúa, và đặt ra mục tiêu hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu.

Chọn giống truyền thống chống chịu khô hạn là cách tiếp cận rất cơ bản

trong một thời gian dài, một vài thành công đã được ghi nhận trên cây ngô, cây lúa,

cây lúa mì [60], [61]. Tuy nhiên, một lỗ hổng lớn giữa các mức độ chống chịu hạn

vẫn chưa được xác định trong hầu hết các loài cây trồng. Đặc biệt là sự ổn định về

năng suất vô cùng nhạy cảm với sự thiếu nước [56]. Đáp ứng lại hiện tượng stress

do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ từ việc nhận tín hiệu đến truyền nó

đi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kích thích hoạt động của gen mục tiêu [54].

Chống chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể

hiện đồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về môi

trường, vật lý, hóa học [45], [48]. Điều này làm cho những tiến bộ nhất định về biến

đổi di truyền tính chống chịu khô hạn xảy ra rất chậm chạp. Chiến lược có hiệu quả

đã được ghi nhận là làm gia tăng lượng đường dễ hòa tan, các hợp chất cần thiết

thông qua tiếp cận với kỹ thuật chuyển nạp gen. Những hợp chất đó là: proline,

trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu

(osmoprotestants); trong vài trường hợp, chúng ổn định được các phân tử chức năng

dưới điều kiện bị stress.

Protein LEA (late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện

bị stress do thiếu nước [56]. Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính trên

cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó và chúng được xét nghiệm lại thông qua

công cụ tin sinh học [19], [25]. Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc

đại phân tử của nó cho thấy vai trò bảo vệ cây chống chịu sự kiện mất nước [29].

Mặc dù chúng ta có nhiều số liệu về cấu trúc và sự thể hiện của protein này, nhưng

rất ít công trình đề cập đến thao tác của các gen LEA nhằm cải tiến tính chống chịu

khô hạn trong điều kiện đồng ruộng [28]. Thí dụ, gen HVA1 mã hóa nhóm protein 3

LEA của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta đã chuyển nạp gen này

thành công vào cây lúa để tăng cường tính chống chịu khô hạn và chống chịu mặn,

ch trong điều kiện ở nhà lưới [56].

Vào những năm gần đây, do sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh

học cùng với sự ra đời của các ch thị phân tử đặc biệt là ở lúa, các nhà khoa học đã

25

thiết lập được một số bản đồ phân tử cho các tính trạng số lượng như chịu hạn, chịu

úng, chịu phèn. Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng ch thị phân tử như

SSR, AFLP, RFLP, SNP,... các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây

trồng khác nhau cũng như cây lúa [53]. Phương pháp phân tích sự đóng góp của các

tính trạng có liên quan, với mô hình QTL (quantitative trait loci). Phương pháp tiếp

cận này phù hợp với hầu hết các loài cây trồng chủ yếu như cây lúa, nhờ bản đồ di

truyền với nhiều marker phân tử ADN phủ kín trên nhiễm sắc thể.

Tại Đại học Texas Tech, Zhang và cộng sự (1999) đã thực hiện bản đồ di

truyền QTL đối với 2 tính trạng quan trọng liên quan đến sự kiện chống chịu khô

hạn, đó là: khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), và những tính trạng hình thái

của rễ lúa. Quần thể lúa đã được sử dụng trước đây để lập bản đồ QTL tính trạng

OA là: Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với

1 QTL; Quẩn thể đơn bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993 / IR62266, với 4 QTL;

Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với 5 QTL;

Quần thể lúa đã được sử dụng để lập bản đồ QTL tính trạng tích lũy ABA là quần

thể F2 của tổ hợp lai IR20 / 63-83, với 10 QTL [32], [41], [59].

Việc ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng

chịu hạn với kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được sử dụng để đánh giá

khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mức độ khác nhau như mức gen, mức tế

bào riêng rẽ, các loại mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập và cây hoàn ch nh. Cho đến

nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá

khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao

trong chọn lọc các giống cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng

miền khác nhau. Mundy và Chua tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa đã nhận thấy

ABA là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước của mô sẹo ở lúa.

Nồng độ ABA thích hợp cho xử lý tiền mô sẹo ở lúa là 10 - 5M và thời gian xử lý là

5 -7 ngày [24].

Nghiên cứu chuyển gen khô hạn ở lúa cũng đã thành công với các công trình

nghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu đều tập chung chuyển gen hrf1 làm tăng ABA

là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước ở cây lúa.

26

1.6.2. Chọn tạo giống lúa chống chịu hạn ở Việt Nam

Sự khan hiếm về nguồn nước tưới cho nông nghiệp hiện nay và trong tương

lai là vấn đề ngày càng trở nên nghiêm trọng có tính chất toàn cầu. Do đó, các dự án

nghiên cứu về cây trồng chống chịu khô hạn đang là hướng ưu tiêu đầu tư của các

dự án quốc tế và quốc gia.

Ở nước ta, việc nghiên cứu, đánh giá chọn tạo các giống lúa chịu hạn đã có

từ những năm thập k 90. Cho đến nay, đã có rất nhiều các giống lúa chịu hạn được

các nhà khoa học chọn tạo ra thông qua chọn tạo giống truyền thống cũng như ứng

dụng công nghệ sinh học. Các kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho

thấy nước ta có nguồn gen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương, các

giống lúa có tiềm năng chịu hạn vùng núi phía Bắc, Trung, Nam [2].

Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự (1992) đã nghiên cứu đặc điểm sinh lý ‎ của các

giống lúa chịu hạn ở Việt Nam và đã đưa ra được các ch tiêu như độ ẩm của cây héo,

hàm lượng nước trong thân lá cũng như cường độ thoát hơi nước trong thân lá [6].

Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường và cộng sự (2003) cho rằng, sự gia tăng

hàm lượng proline của các giống lúa nghiên cứu có mối tương quan thuận với tính

chống chịu lạnh, mặn và hạn. Chu Hoàng Mậu và cộng sự (2005) khi nghiên cứu về

hàm lượng proline ở các giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các

giống lúa cạn có liên quan đến hàm lượng protein và hàm lượng proline [3], [10].

Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng ch thị phân tử như SSR, AFLP,

RFLP, SNP, RAPD,... các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng

khác nhau cũng như cây lúa. Tại Việt Nam, nghiên cứu lập bản đồ QTL kháng hạn ở

giống lúa nương sử dụng ch thị phân tử do tổ chức Rockefeller tài trợ đã được tiến

hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện Công nghệ Sinh học, viện lúa Đồng

bằng Sông Cửu Long, viện Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Nông nghiệp [2].

Nhiều giống lúa chịu hạn từ các t nh miền núi phía Bắc, miền Trung và miền

Nam Việt Nam đã được thu thập, phân tích, đánh giá về mặt sinh lý cũng như đa

dạng di truyền của chúng. Việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các

giống lúa cạn làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn là một

bước quan trọng trong công tác chọn tạo giống. Các nghiên cứu của Chu Hoàng

27

Mậu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 t nh Sơn La, Bắc

Kạn, Cao Bằng và đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền

giữa các giống lúa cạn là 7,69% - 34% và hệ số đa dạng di truyền của hệ gen lúa

cạn Hg = 52,37% [10].

Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai

Thu và cộng sự tiếp tục đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử ADN bằng

kỹ thuật RAPD đã nhân bản được 182 phân đoạn ADN từ hệ gen của 7 giống lúa cạn.

Năm mồi sử dụng cho nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình, tính đa hình cao được thể

hiện ở các mồi M4, M7, M13 (trong đó mồi M13 có 100% phân đoạn đa hình). Trên

cơ sở đó, các tác giả đã chia các giống lúa cạn nghiên cứu thành 2 nhóm chính: nhóm

thứ nhất gồm 3 giống (LC, CB2, SL1) và nhóm thứ 2 gồm 4 giống (CB1, HG, SL2,

LCh) với hệ số khác nhau là 26%. Hai giống HG và SL1 có khả năng chịu hạn tốt

nhất, đồng thời cũng có hệ số tương đồng di truyền cao nhất (97%) được xếp vào

cùng một nhóm (trích theo Phạm Thị Bé Tư và cộng sự, 2008) [15].

Nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Anh Tuấn và cộng sự (2008) đã nghiên

cứu đánh giá khả năng chịu hạn của 50 giống lúa địa phương. Kết quả cho thấy, 12

trong số 50 giống lúa nghiên cứu đã thể hiện khả năng chịu hạn tốt và đều đạt các

ch số độ cuốn lá, độ khô của lá và khả năng phục hồi trong khoảng điểm từ 0-3.

Trong đó, có 5 giống là Blào đóng, Blào cô ném, Chạo lựu, Khẩu cụ và Bièo hồng

súi chịu hạn cao với điểm của 3 ch tiêu đánh giá đều đạt trong khoảng 0-1. Các

giống Q5, CR203 và Khang Dân mẫn cảm với điều kiện khô hạn với mức cấp phản

ứng lần lượt là 9,0, 9,0 và 7,7 với cả 3 ch tiêu đánh giá. Kết quả phân tích đa hình

di truyền đối với 15 giống lúa (gồm 12 giống có kiểu hình chịu hạn tốt và 3 giống

mẫn cảm Khang Dân, Q5, CR203) với 10 cặp mồi SSR cho thấy 4 giống Blào đóng,

Blào cô ném, Khẩu cụ và Bièo hồng súi chịu hạn cao tập trung thành một nhóm; các

giống mẫn cảm liên kết thành một nhóm. Các giống lúa Blào đóng, Blào cô ném,

Khẩu cụ và Bièo hồng súi có thể sử dụng làm nguồn gen chống chịu hạn trong

chương trình chọn tạo giống lúa [15].

Việc lập bản đồ QTL các giống lúa chịu hạn, Nguyen Thi Lang và cộng sự đã

lập được bản đồ QTL khô hạn với các marker liên kết tập trung quần thể với 232

28

markers chiều dài 2.553.70cM phủ trên 12 nhiễm sắc thể, trung bình là 10.97cM [37].

Chương trình tuyển chọn và phát triển giống lúa cạn cải tiến LC93-1 phục vụ

sản xuất lượng thực ở vùng cao của Viện Bảo Vệ Thực Vật Từ Liêm, Hà Nội với

phương pháp chọn lọc từ tập đoàn lúa cạn IRRI nhập nội, năm 1993 đã chọn được

giống LC93-1 có thời gian sinh trưởng 115 - 125 ngày, năng suất 3 - 4 tấn/ha, chịu hạn

khá, chất lượng gạo tốt, thích hợp cho vùng đồng bào dân tộc nghèo ở vùng cao.

Nghiên cứu chọn giống lúa chống chịu khô hạn của Viện Cây lương thực

thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu hạn địa

phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ IRRI với phương pháp lai hữu tính kết

hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và năng suất

cao như CH2, CH3, CH133, CH5 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi phía

Bắc, Trung bộ, Đông Nam bộ và Tây Nguyên.

Ở Việt Nam, cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được

ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như

chịu hạn mang lại hiệu quả cao. Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) bằng các phương

pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được

271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn. Tác giả đã chọn tạo được

giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn

hẳn giống gốc [12].

Nguyễn Thị Thu Hoài (2005) khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các

giống lúa cạn địa phương đã kết luận rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh

trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của các giống nghiên cứu có sự sai khác

rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất so với các giống nghiên cứu [7].

29 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Tổng số có 40 giống lúa (bảng 1), trong đó:

 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt được cung

cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long.

 01 giống lúa tham khảo (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn.

Bảng 2.1. Danh sách, số đăng kí (SĐK) trong ngân hàng gen và kí hiệu các

giống lúa nghiên cứu

TT SĐK Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc

Nếp bồ hóng Hải Dương Hải Dương 1 412 H1

- 930 Lia tón H2

- 1832 Khẩu nuột cung H3

- 1837 Lúa mộ trắng H4

- 2021 Khẩu mèo H5

- 2125 B'le tolo H6

- 2127 Ble blu H7

- 2131 Ble la tong H8

- 2135 Ble lenh xi H9

- 2642 Ble’ la H10

11 3351 Lúa can đỏ H11 Qnam - ĐNẵng

12 3371 Nếp mậm H12 QNam - ĐNẵng

13 7099 Kháu căm pị H13 -

14 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị

15 3483 Lúa muối H15 Quảng Ngãi

16 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định

17 6430 Khẩu kẻn H17 -

30

18 3588 Tan ngần H18 Yên Bái

19 4666 IR64 H19 IRRI

20 3895 Ble mạ mùa H20 Sơn La

21 3935 Mồng lu H21 -

22 3947 Khẩu bò khá H22 Lai Châu

23 3970 Blech cấu H23 -

24 4123 Khẩu lẩy khao H24 -

25 4723 Chăm soóng H25 -

26 4726 Nếp cái cạn H26 -

27 4748 Hang ngụa H27 -

28 4762 Lọ cang H28 -

29 4792 Khẩu mà giàng H29 -

30 4793 Khẩu nón H30 -

31 4794 Khẩu hin H31 -

32 4806 Blào sinh sái H32 -

33 4840 Blào đóng H33 -

34 4843 Blào cô ném H34 -

35 5057 Khẩu cụ H35 -

36 5015 Chạo lựu H36 -

37 5018 Khẩu sán H37 -

38 5020 Khẩu đó đón H38 -

39 # Nàng quớt biển H39 Bạc Liêu

40 # Nàng quớt vàng H40 Bạc Liêu

Ghi chú: (-) chưa rõ nguồn gốc; (#): lúa địa phương miền Nam

2.1.2. Hóa chất

* Hoá chất tách chiết ADN: Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như:

Nito lỏng, Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Ete, Chloroform, isopropanol,

isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan.

31

- Đệm tách chiết ADN của mẫu lá cây chuyển gen: - Đệm TE:

200 mM Tris-HCl pH8 10 mM Tris-HCl pH8

250 mM NaCl 1 mM EDTA

25 mM EDTA

0,5% SDS

- Phenol: chloroform: isoamyl acohol 70% (25:24:1)

- Ethanol 100% (hoặc Isopropanol) và Ethanol 70%

* Hoá chất dùng cho phản ứng PCR:

- Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2, 5 mM KCl) hoặc

đệm PCR 1X của Quiagen hoặc Invitrogen

- MgCl2 của Fermentas, Invitrogen

- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoặc dUTP)) của Fermentas, Invitrogen

- Mồi, của hãng Fermentas, Invitrogen

- Taq polymerase của Fermentas

- Mẫu dò có huỳnh quang của IDT, USA

- Nước cất hai lần khử ion

* Hoá chất chạy dùng để điện di gel agarose:

- Pha TAE 50X (1 lít): 242g Tris base; 57,1ml acetic acid; 100ml 0,5M

EDTA PH=8; Chuẩn nước cất cho đến 1 lít

- TAE 1X: 1 lít TAE 1X được pha 20ml TAE 50X + 980ml nước cất

- Argarose: lấy tùy thể tích gel và nồng độ điện di

- Chất nhuộm màu Ethidium Bromide

- Marker øX17 - Hea III digest DNA, Marker 100bp, Marker λADN

* Các mồi SSR: 50 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các

locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các

thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của

các locus ở trên 12 nhiễm sắc thể khác nhau đã được McCouch và cộng sự công bố

năm 2002 (bảng 2.2) [34].

32

Bảng 2.2. Danh sách 50 mồi SSR

TT

Primer

NST

Trình tự lặp lại

Các cặp mồi nghiên cứu

Kích thƣớc (bp)

(GA)6(GA)16

141

RM13

(GA)18

146

RM25

(GA)31

179-222

RM145

(GGC)10

151

RM152

(AC)20

229

RM162

(CT)23

140

RM210

(CT)18

130

RM237

(CT)17

162

RM259

(GA)21

156

RM267

(GT)3(CG)3(GT)5

118

RM314

(CAT)12

141

RM342B

(CTG)7

159

RM495

(AG)15

239

RM566

(AG)12

216

RM1103

(AG)13

114

RM1153

(AG)13

148

RM1155

(AG)15

175

RM1233

(AG)19

RM1313

(AG)26

158

RM1364

(AG)27

159

RM1367

(AT)16

143

RM1761

(AT)23

237

RM2191

(CT)14

209

RM3288

(CT)13

197

RM3248

3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG -5’ 5’- GGTGGCATTCGATTCCAG -3’ 3’- GGAAAGAATGATCTTTTCATGG -5’ 5’- CTACCATCAAAACCAATGTTC -3’ 3’- CCGGTAGGCGCCCTGCAGTTTC -5’ 5’- CAAGGACCCCATCCTCGGCGTC -3’ 3’- GAAACCACCACACCTCACCG -5’ 5’- CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG -3’ 3’- GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG -5’ 5’- CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG -3’ 3’- TCACATTCGGTGGCATTG -5’ 5’- CGAGGATGGTTGTTCACTTG -3’ 3’- CAAATCCCGACTGCTGTCC -5’ 5’- TGGGAAGAGAGCACTACAGC -3’ 3’- TGGAGTTTGAGAGGAGGG -5’ 5’- CTTGTTGCATGGTGCCATGT -3’ 3’- TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG -5’ 5’- AGCAACAGCACAACTTGATG -3’ 3’- CTAGCAGGAACTCCTTTCAGG -5’ 5’- AACATTCCACACACACACGC -3’ 3’- CCATCCTCCTACTTCAATGAAG -5’ 5’- ACTA-TGCAGTGGTGTCACCC -3’ 3’- AATCCAAGGTGCAGAGATGG -5’ 5’- CAACGATGACGAACACAACC -3’ 3’- ACCCAACTACGATCAGCTCG -5’ 5’- CTCCAGGAACACGCTCTTTC -3’ 3’- CAGCTGCTGCTACTACACCG -5’ 5’- CTACTCCACGTCCATGCATG -3’ 3’- ACCAACGCCAAAAGCTACTG-5’ 5’- TACTCGCCCTGCATGAGC -3’ 3’- AGGGAGTGTGGCAACTATGC-5’ 5’- GGGAGGAGTGAGAAGGGATC -3’ 3’- TTCGTTTTCCTTGGTTAGTG -5’ 5’- ATTGGCTCCTGAAGAAGG -3’ 3’- TGTGTCTGAAAACCAAGGGG -5’ 5’- CGTCCAAGCTGTTCGTTCTC -3’ 3’- AAGAAATTCAAAACACATGA -5’ 5’- AAACATCTACTTTGATCCA -3’ 3’- GTGTGTACGTAGGATCGGAG -5’ 5’- TGCTACTCCTAGCTGCTACC -3’ 3’- ACGCTTAAAGAACATTTGAT -5’ 5’- GCGATTAACTTTTAACCATT -3’ 3’- AATAAGGGAGAGCCAATCTG -5’ 5’- TAGTAGATGGCCGTTCTCTC -3’ 3’- CTCGTACCGTCAAAAGACC -5’ 5’- AATCTGGAGGCACTGTCAC -3’ 3’- AGAAGGTTGCTTTCTTGGCC -5’ 5’- CTTGCAAGGTCTGTTGCATC -3’

33

(CT)18

161

RM3431

(CT)18

184

RM3436

(CT)20

RM3455

(CT)21

123

RM3467

(CT)21

201

RM3468

(CT)22

132

RM3476

(CT)22

174

RM3483

(CT)28

196

RM3515

(GA)12

129

RM3534

(TC)27

135

RM5501

(TG)30

134

RM5586

(AAC)11

141

RM5599

(AAG)13

123

RM5639

(AGA)9

104

RM5766

(AGG)10

RM5811

(CCG)10

136

RM6051

(CTT)11

169

RM6314

(GGA)8

119

RM6570

(GTC)8

207

RM6648

(AAAC)6

101

RM7003

(CTTC)6

148

RM7372

(GGAA)6

146

RM7419

(TTTC)9

193

RM7654

(CT)22

174

RM8214

(TC)17

185

RM25271

(CT)14

179

RM25319

3’- ATCCAAATCCAATGGTGC -5’ 5’- GCGAAAGGGAACATTCTG -3’ 3’- GCATCCCGGTGACTAGTACG -5’ 5’- TGTGCATGTGGTAAGGAACC -3’ 3’- TGAATCCACACTCGCAGATC -5’ 5’- GCCAGTCCACGATTGGTC -3’ 3’- ATAATGGCAGGGTTGTCTCG -5’ 5’- CTCGGTGAGCCTCCTACAAC -3’ 3’- ACTAATTGCATGCAGTCTCC -5’ 5’- GTTAACGGGATCTTGTTCG -3’ 3’- GATTCTCGTCGTAATCAAGA -5’ 5’- ATCCACGGTTAAGATAAATG -3’ 3’- CCTAGCTTTCAGGAGCAAG -5’ 5’- CCCACAATGAGAAACAGTTG -3’ 3’- GGAAAGAAGATATGCCATGC -5’ 5’- AGAGAGAATCAGAAACACCAAC -3’ 3’- TTGAGCTTCGTCTACAAGCG -5’ 5’- CAGCTCCCACCATCTCTCTC -3’ 3’- GCGCTTCTACTTCCACAAGG -5’ 5’- GGTTGGCGTACGTAGAGAGG -3’ 3’- CTCCATAATCAAGGAAGCTA -5’ 5’- ATGAGTTCTTTCGTCAGTGT -3’ 3’- CTCACAATATCACCATCCAC -5’ 5’- AATTTTGTGCTGTTGTTGAA -3’ 3’- GGAAGAACAGAGTTGCTCGG -5’ 5’- GTGCCATTTATTTCCGTCCC -3’ 3’- ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC -5’ 5’- AAGTGGAGGCAGTTCACCAC -3’ 3’- GGATTTGGTCGAACAGGTTG -5’ 5’- TTCGCGCTCTCCAAGCTC -3’ 3’- AGGCTGATCCAAGATCCATG -5’ 5’- CCCGGAGGCTGATTCTTG -3’ 3’- GATTCGTGTCGGTTGTCAAG -5’ 5’- GGTTCAGGGACGAATTTCAG -3’ 3’- CGATCCGCATCTCGAATC -5’ 5’- CCTCCAAGGTCCTCATCCTC -3’ 3’- ACAGCAGGTTGATGAGGACC -5’ 5’- GATCGATCATGGCCAGAGAG -3’ 3’- GGCAGACATACAGCTTATAGGC -5’ 5’- TGCAAATGAACCCCTCTAGC -3’ 3’- GCCCTTGTCTTCTTCACGTC -5’ 5’- CAAAGTCGAGAGTCTGCGTG -3’ 3’- GAGGAGAAGAATGCTGGCTG -5’ 5’- AGTGCTCACCGAGTCACTGG -3’ 3’- CAAAAGTCTGACCGTTTACC -5’ 5’- TAAGAGACGGAAGAGTGAGC -3’ 3’- CCTAGCTTTCAGGAGCAAG -5’ 5’- CCCACAATGAGAAACAGTTG -3’ 3’- AGACGCTACTCCCACCTGTAACC -5’ 5’- ATATCATTGCCGCAACACAAGC -3’ 3’-AGGGTAGAGTATGTCGGTGTTTCC-5’ 5’- CCGTGGCAGTAGCAGTAGGC -3’

34

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch

2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số

Mẫu lá của từng giống được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo

phương pháp của Obara và Kako (1998) [38]. Ưu điểm của phương pháp này là

ADN tách chiết được khá nguyên vẹn do CTAB có khả năng tạo phức với ADN.

Quy trình tách chiết như sau:

1. Nghiền 1,5 – 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.

2. Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết

CTAB (đã được làm nóng đến 650C).

3. Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần.

4. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol

(24:1), đảo đều trong 10 phút.

5. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.

6. Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C

trong 30 phút.

7. Tủa ADN bởi máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa

tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.

8. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase

(10mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h.

9. Chuyển dung dịch ADN vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol- chloroform-

isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000

vòng/phút.

10. Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và

3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.

11. Loại bỏ lớp Ete bên trên. Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới

12. Thêm 3ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút.

Lấy ADN ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.

13. Rửa tủa 3 lần với 1,5 ml ethanol 70%.

35

14. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa.

15. Giữ dung dịch ADN ở - 20°C.

2.2.1.2. Đo độ tinh sạch của ADN

Độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên

gel agarose 1% trong môi trường đệm TAE 1X và dùng marker ADN  chuẩn có

nồng độ (50ng/µl).

* Chuẩn bị gel agarose 1%

- Cân 0,4 gam agarose và đong 40 ml TAE 1X (Tris-acetat-acid EDTA) cho

vào bình tam giác.

- Đun agarose trong lò vi sóng (microwave) cho đến khi tạo thành một dung

dịch đồng nhất (1 phút 15 giây).

- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, dùng pipet lấy 5µl Ethydium Bromide

(0,5µg/ml) cho vào bình rồi lắc đều.

- Chuẩn bị khay và lược. Đổ dung dịch agarose 1% vào khay sao cho không

để lại bọt khí. Để gel đông lại trong khoảng 25-35 phút.

* Điện di sản phẩm ADN được tách chiết

- Rút lược ra khỏi gel, đặt gel vào bể điện di. Pha dung dịch TAE 1X và đổ

TAE ngập mặt gel khoảng 2mm.

- Nạp ADN và λADN vào các giếng trên gel

- Chạy điện di với hiệu điện thế 130V trong khoảng 20-30 phút (thời gian

chạy có thể thay đổi vào kích thước gel và yêu cầu khi nghiên cứu). Để kiểm tra và

đánh giá nồng độ và chất lượng của ADN ta ch cần để cho mẫu chạy ra khỏi giếng

3-5cm là đủ.

- Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của High

performance UV Transilluminator (UVP). Nồng độ ADN được xác định đựa vào độ

sáng của băng ADN so với độ sáng của băng λADN. Độ gọn của băng ADN sẽ cho

biết độ nguyên vẹn của ADN đã tách chiết được.

2.2.2. Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR- PCR

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau:

36

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nước cất hai lần khử ion 3,2

2 1 Đệm PCR 10X + MgCl2 25mM

3 dNTPs 10mM 1,0

4 Taq ADN polymerase 1U/µl 0,8

5 Mồi xuôi 5µM 1,5

6 Mồi ngược 5µM 1,5

7 1 ADN 10g/µl

Tổng thể tích của một phản ứng 10,0

Phản ứng PCR được thực hiện trong ống eppendorf 0,2ml và thực hiện trên

máy eppendorf.

Quy trình phản ứng PCR:

Các bƣớc Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

94 5 phút I 1

94 40 giây II

35-37 55-60 30 giây

72 1 phút

72 5 phút III 1

Giữ mẫu ở 40C

2.2.3. Kiểm tra kết quả PCR trên gel Agarrose 3,0%.

Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, trường Đại học công nghệ

Texas, Mỹ (2002) có cải tiến:

Chuẩn bị gel agarose:

- Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TAE 1X với nồng độ 3,0%.

- Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng (1 phút 30 giây). - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C.

- Bổ sung Ethidium Bromide (EtBr) với nồng độ 0,5µg/ml.

37

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị khay gel và lược.

- Rót hỗn hợp gel agarose và EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ

gel đông là 7 - 10 phút.

- Tra sản phẩm PCR.

- Chuẩn bị dung dịch đệm TAE 1x cho vào bể chạy điện di.

- Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.

2.2.4. Phân tích và xử lí số liệu

Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá

trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất

hiện của các băng ADN nhờ khuếch đại bằng PCR.

- Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN

- Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN

- Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu)

Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi và được

xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1.

Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:

PIC =1 - Pi

(trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i).

Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức:

Trong đó: X: là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR.

M: là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.

Y: là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN.

Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức:

Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng DNA.

M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu.

38 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

Tách chiết axit nucleic là công việc đầu tiên đóng vai trò quan trọng trong

công nghệ ADN. Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết axit nucleic

ngày nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách chiết ADN

tổng số của mẫu thực vật. Tuy nhiên, đối với từng đối tượng mẫu thực vật nhất định

cần có phương pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến phương pháp cho phù

hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan trọng.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và

Kako (1998) (đã được cải tiến) để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa

nghiên cứu [38]. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng cetyl-trimethyl-

amonium-bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ

màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với

các chất khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic.

Hình 3.1. ADN tổng số của 40 giống lúa nghiên cứu

Sau khi thu được ADN, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng ADN bằng

phương pháp điện di trên gel agarose 1%, (dùng 3µl và 5 µl marker ladder ADN

có nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ ADN). Kết quả điện di (hình 3.1) cho

thấy các băng gọn, sắc nét, ADN không bị đứt gẫy, có độ tinh sạch khá cao đảm bảo

cho thực hiện các phản ứng PCR và các thí nghiệm tiếp theo.

39

3.2. Kết quả phân tích đa hình tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị

phân tử SSR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng tổng số 50 ch thị SSR để khảo

sát với 5 mẫu giống lúa ngẫu nhiên, kết quả thu được 23 ch thị SSR cho kết quả tốt.

23 ch thị này tiếp tục được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền của toàn bộ 40

giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu. Sau đây là kết quả phân tích đa hình di truyền

của 40 giống lúa với một số mồi SSR điển hình trên gel agarose 3,0%.

3.2.1. Kết quả phân tích với một số mồi điển hình

* Kết quả phân tích với cặp mồi RM566

Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM566 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM566 (hình 3.2) cho thấy: xuất hiện 4 loại allele khác nhau với kích thước trong

khoảng 234bp - 290bp. Trong đó, duy nhất ở giống Khẩu lẩy khao (H24) không có

sản phẩm PCR. 39 giống còn lại đều cho các băng ADN (allele) rất rõ nét và đều có

kiểu gen đồng hợp tử ở locus RM566.

* Kết quả phân tích với cặp mồi RM3515

Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3515 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

40

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa chịu hạn với cặp mồi

RM3515 (hình 3.3) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau có kích thước các

allele trong khoảng 110bp – 156bp. Trong đó, 2 giống Blào sinh sái (H32) và Blào

đóng (H33) xuất hiện 2 allele (thể hiện trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất

hiện 1 allele duy nhất (đều có kiểu gen đồng hợp tử ở locus RM3515).

* Kết quả phân tích với cặp mồi RM5599

Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5599 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5599 (hình 3.4) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau với kích thước trong

khoảng 120bp - 156bp. Trong đó, duy nhất ở giống Mồng lu (H21) không có sản

phẩm PCR. 39 giống còn lại đều cho các băng ADN (allele) rất rõ nét và đều có

kiểu gen đồng hợp tử ở locus RM5599.

* Ảnh điện di kết quả phân tích với một số cặp mồi khác

Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1364 (M: 100bp DNA Ladder)

41

Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3431 (M: 100bp DNA Ladder)

Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3534 (M: 100bp DNA Ladder)

Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM7003 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

42

Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM25271 (M: 100bp DNA Ladder)

Hình 3.10. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM25319 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

3.2.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi

Phân tích 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu thu được

tổng số 82 loại allele khác nhau, số allele/locus dao động từ 2-5, trung bình 3,57

allele/locus. Trong đó, có 3 cặp mồi thu được 2 allele bao gồm (RM3431, RM7003

và RM25271), 10 cặp mồi thu được 3 allele bao gồm (RM152, RM267, RM3288,

RM3515, RM3534, RM5599, RM5811, RM6051; RM7372 và RM7581), 4 cặp mồi

thu được 4 allele bao gồm (RM566, RM1364, RM3476 và RM25319), 6 cặp mồi

thu được 5 allele bao gồm (RM145, RM1155, RM1367, RM3467, RM3468 và

RM3483) (bảng 3.1).

43

Bảng 3.1. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR

STT

Tên mồi

PIC

Số allele thể hiện

Số allele hiếm

Kích thƣớc sản ph m PCR (bp)

Vị trí trên NST 2

RM145

0,61

RM152

0,51

194-281

RM267

0,59

151-175

RM566

0,72

150-180

RM1155

0,62

234-290

RM1364

0,63

120-190

RM1367

120-194

90-150

0,77

RM3288

0,50

RM3431

0,29

130-190

RM3467

0,70

130-194

RM3468

0,72

95-180

RM3476

0,70

180-234

RM3483

0,72

118-190

RM3515

0,66

150-234

RM3534

0,53

110-156

RM5599

0,53

110-150

RM5811

0,50

120-156

RM6051

0,46

90-130

RM7003

0,46

118-156

RM7372

0,46

100-130

RM7581

100-140

120-220

0,22

RM25271

0,38

RM25319

0,61

156-210

120-200

2

82 12,89

Tổng

Trung bình

3,57

0,56

0,087

44

Theo Smith và cộng sự (1997) [44], hệ số PIC (Polymorphic Information

Content) được coi là thước đo tính đa dạng di truyền của các allele ở từng locus

SSR. Giá trị PIC có thể được hiểu như là sự đa dạng di truyền của gen. Kết quả

nghiên cứu ch ra ở bảng 3.1 cho thấy: tập đoàn lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam

khá đa dạng về thành phần các allele ở những locus gen nghiên cứu. Hệ số PIC thay

đổi từ 0,22 (ở mồi xuất hiện 3 allele - RM7581) đến giá trị PIC cao nhất là 0,77 (ở

mồi xuất hiện 5 allele - RM1367). Hệ số PIC trung bình của 23 cặp mồi nghiên cứu

là 0,56. Những kết quả thu được cũng tương đương với một số kết quả nghiên cứu

trên thế giới (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử d ng chỉ thị SSR trên

cây lúa đ được công bố [18], [21], [26], [36], [52], [57]

Trung bình

TT Tác giả Số giống Số chỉ thị Tổng số allele PIC Số allele hiếm

1 Nagaraju J., 2002 24 19 70 Số allele thể hiện 3,8 - -

2 Yu S. B., 2003 193 101 628 6,2 0,68 -

3 Chakravarthi B.K., 2006 15 30 462 - - -

4 Giarrocco L.E., 2007 69 26 219 8,4 0,69 1,7

5 Alvarez A., 2007 50 10 66 6,6 0,74 1,4

6 Herrera T.H., 2008 18 48 203 4,23 0,52 -

7 Wong S.C., 2009 8 12 31 2,6 0,52 -

8 Nghiên cứu này 40 23 82 3,57 0,56 0,087

(*): allele hiếm là allele có t n số uất hiện dưới 5%

3.2.3. Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu

(được trình bày ở bảng 3.3)

Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) cao nhất ở giống lúa

Nàng quớt biển (H39) là 13,04% (khuyết số liệu ở 3 mồi). Các giống Khẩu lẩy khao

(H24), Blào đóng (H33) và Nàng quớt vàng (H40) có t lệ khuyết số liệu là 8,7%

(khuyết số liệu ở 2 mồi). Các giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1), Lúa mộ trắng

45

(H4), Khẩu mèo (H5), Ble’ la (H10), Mồng lu (H21), Blech cấu (H23), Lọ cang

(H28) và Khẩu sán (H37) có t lệ khuyết số liệu là 4,35% (khuyết số liệu ở 1 mồi).

Các giống còn lại không bị khuyết số liệu (28 giống). Tỷ lệ khuyết số liệu trung

bình của cả tập đoàn là 1,85%; không có giống nào có t lệ khuyết số liệu lớn hơn

15%. Như vậy, cả 40 giống nghiên cứu đều có ý nghĩa thống kê trong phân tích đa

dạng di truyền.

Bảng 3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) và tỷ lệ dị hợp tử (H%) của các

giống lúa nghiên cứu

TT

Tên giống

M% H% TT

Tên giống

M% H%

4,35

0,00

4,35

4,55

1 Nếp bồ hóng Hải Dương

21 Mồng lu

0,00

2 Lia tón

22 Khẩu bò khá

0,00

4,35

9,09

3 Khẩu nuột cung

23 Blech cấu

4,35

6 B'le tolo

0,00

27 Hang ngụa

7 Ble blu

0,00

10 Ble’ la

0,00

4,35

0,00

31 Khẩu hin

11 Lúa can đỏ

0,00

8,70

32 Blào sinh sái

12 Nếp mậm

IR64

39 Nàng quớt biển

13,04

19

0,00

8,70

0,00

20 Ble mạ mùa

40 Nàng quớt vàng

Trung bình

1,85

3,45

46

Tỷ lệ dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác nhau. Tỷ lệ dị hợp tử (H)

cao nhất ở giống lúa Blào đóng (H33) là 14,29%, tiếp theo là giống lúa Blech cấu

(H23) có tỷ lệ dị hợp 9,09%. Các giống lúa Lúa muối (H15), Ba chơ K'tê (H16),

Khẩu kẻn (H17), Blào sinh sái (H32), Chạo lựu (H36) đều có tỷ lệ dị hợp 8,70%.

Giống lúa Nàng quớt biển (H39) có tỷ lệ dị hợp 5,00%. Giống lúa Khẩu lẩy khao

(H24) có tỷ lệ dị hợp 4,76%. Ba giống lúa Mồng lu (H21), Lọ cang (H28) và Khẩu

sán (H37) có tỷ lệ dị hợp 4,55%. Các giống lúa Khẩu nuột cung (H3), B'le tolo

(H6), Ble lenh xi (H9), Lúa can đỏ (H11), Chiêm đỏ (H14), Tan ngần (H18), Chăm

soóng (H25), Nếp cái cạn (H26), Khẩu mà giàng (H29), Khẩu nón (H30), Khẩu cụ

(H35) và Khẩu đó đón (H38) đều có tỷ lệ dị hợp 4,35%. 17 giống còn lại có tỷ lệ dị

hợp 0% có nghĩa là các giống này đều đồng hợp ở cả 23 mồi nghiên cứu (ch có 1

allele duy nhất/locus). T lệ dị hợp trung bình của cả tập đoàn là 3,45%. Kết quả này

cũng phù hợp với những nghiên cứu của Olufowote và cộng tác viên (1997) đã sử

dụng ch thị phân tử SSR và RFLP để nghiên cứu đa dạng di truyền của các giống

lúa địa phương và các giống lúa cải tiến và đã kết luận rằng các giống lúa địa

phương thường có mức độ dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến [40].

3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn nghiên cứu

Số liệu thu được từ bản điện di 23 mồi SSR của tập đoàn 40 giống lúa chịu

hạn được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập bảng

hệ số tương đồng di truyền (bảng 3.4, bảng 3.5) và xây dựng sơ đồ phát sinh chủng

loại (hình 3.11).

47

Hình 3.11. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền gi a 40 giống lúa địa

phươngcó khả năng chịu hạn

Qua kết quả thu được ở bảng 3.4, bảng 3.5 và hình 3.11 cho thấy: hệ số

tương đồng di truyền của 40 giống lúa chịu hạn dao động trong khoảng từ 0,02 đến

0,91. Hai cặp giống lúa Khẩu sán - Khẩu đó đón (H37 - H38) và Ble blu và Ble la

tong (H7 - H8) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,91

48

Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu

H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20

H1 1.00 H2 0.22 1.00 H3 0.18 0.52 1.00 H4 0.38 0.18 0.21 1.00 H5 0.33 0.29 0.21 0.42 1.00 H6 0.15 0.34 0.50 0.10 0.10 1.00 H7 0.10 0.31 0.38 0.07 0.13 0.52 1.00 H8 0.13 0.35 0.38 0.10 0.13 0.52 0.64 1.00 H9 0.29 0.18 0.12 0.41 0.50 0.12 0.10 0.12 1.00 H10 0.26 0.15 0.18 0.38 0.33 0.12 0.13 0.15 0.55 1.00 H11 0.24 0.21 0.20 0.48 0.48 0.09 0.07 0.09 0.68 0.53 1.00 H12 0.15 0.07 0.12 0.41 0.32 0.09 0.10 0.12 0.59 0.50 0.57 1.00 H13 0.18 0.28 0.38 0.18 0.15 0.38 0.44 0.48 0.12 0.25 0.18 0.10 1.00 H14 0.28 0.18 0.12 0.39 0.39 0.17 0.09 0.12 0.74 0.48 0.60 0.57 0.15 1.00 H15 0.24 0.17 0.14 0.38 0.38 0.23 0.12 0.17 0.71 0.42 0.53 0.50 0.20 0.69 1.00 H16 0.12 0.12 0.14 0.15 0.18 0.36 0.33 0.45 0.14 0.09 0.14 0.14 0.33 0.20 0.25 1.00 H17 0.10 0.12 0.23 0.15 0.12 0.33 0.47 0.38 0.09 0.12 0.14 0.15 0.42 0.14 0.14 0.58 1.00 H18 0.15 0.07 0.21 0.18 0.18 0.31 0.39 0.39 0.15 0.13 0.15 0.18 0.39 0.12 0.20 0.50 0.62 1.00 H19 0.15 0.21 0.12 0.32 0.36 0.07 0.07 0.10 0.64 0.41 0.52 0.44 0.10 0.57 0.45 0.17 0.21 0.21 1.00 H20 0.13 0.12 0.24 0.15 0.13 0.34 0.24 0.39 0.15 0.13 0.15 0.15 0.39 0.12 0.23 0.50 0.47 0.64 0.21 1.00 H21 0.22 0.15 0.21 0.25 0.22 0.18 0.18 0.28 0.18 0.15 0.24 0.18 0.24 0.15 0.26 0.37 0.38 0.39 0.24 0.53 H22 0.15 0.15 0.21 0.18 0.15 0.34 0.31 0.35 0.15 0.13 0.15 0.15 0.39 0.12 0.23 0.45 0.52 0.64 0.21 0.70 H23 0.15 0.18 0.14 0.31 0.31 0.07 0.04 0.04 0.42 0.35 0.50 0.34 0.07 0.45 0.32 0.14 0.14 0.15 0.62 0.12 H24 0.13 0.25 0.24 0.33 0.29 0.12 0.13 0.15 0.36 0.29 0.48 0.32 0.10 0.35 0.31 0.24 0.28 0.25 0.61 0.25 H25 0.12 0.07 0.20 0.15 0.15 0.26 0.34 0.31 0.18 0.21 0.17 0.21 0.27 0.14 0.20 0.53 0.60 0.47 0.27 0.52 H26 0.13 0.18 0.24 0.18 0.15 0.31 0.31 0.31 0.21 0.22 0.21 0.21 0.35 0.18 0.26 0.41 0.57 0.48 0.28 0.48 H27 0.10 0.18 0.24 0.15 0.18 0.24 0.28 0.31 0.28 0.22 0.27 0.28 0.31 0.24 0.33 0.37 0.42 0.39 0.35 0.53 H28 0.13 0.12 0.24 0.18 0.15 0.31 0.24 0.24 0.21 0.18 0.21 0.21 0.24 0.21 0.26 0.41 0.52 0.44 0.31 0.48 H29 0.07 0.24 0.33 0.15 0.15 0.37 0.27 0.24 0.21 0.15 0.20 0.21 0.21 0.20 0.29 0.32 0.45 0.42 0.34 0.47 H30 0.07 0.18 0.30 0.15 0.18 0.33 0.27 0.24 0.21 0.15 0.20 0.24 0.18 0.20 0.26 0.32 0.45 0.52 0.31 0.47 H31 0.07 0.18 0.24 0.15 0.13 0.24 0.18 0.21 0.21 0.15 0.21 0.28 0.21 0.21 0.26 0.26 0.27 0.35 0.28 0.59 H32 0.09 0.23 0.23 0.18 0.21 0.32 0.30 0.30 0.23 0.18 0.23 0.26 0.23 0.20 0.32 0.39 0.44 0.45 0.30 0.41 H33 0.15 0.18 0.30 0.21 0.24 0.30 0.24 0.18 0.24 0.18 0.26 0.27 0.21 0.23 0.32 0.29 0.37 0.38 0.24 0.31 H34 0.15 0.15 0.21 0.29 0.32 0.27 0.21 0.21 0.28 0.22 0.27 0.31 0.24 0.27 0.33 0.37 0.38 0.48 0.31 0.39 H35 0.12 0.15 0.17 0.24 0.31 0.17 0.21 0.24 0.31 0.21 0.30 0.31 0.21 0.23 0.29 0.36 0.37 0.47 0.34 0.42 H36 0.18 0.17 0.26 0.31 0.38 0.20 0.17 0.17 0.26 0.18 0.32 0.26 0.20 0.20 0.25 0.35 0.36 0.41 0.26 0.33 H37 0.25 0.18 0.24 0.32 0.32 0.18 0.12 0.12 0.28 0.22 0.34 0.21 0.24 0.27 0.37 0.23 0.27 0.31 0.28 0.31 H38 0.24 0.18 0.26 0.31 0.35 0.17 0.18 0.18 0.24 0.24 0.33 0.31 0.24 0.23 0.29 0.20 0.26 0.34 0.24 0.31 H39 0.26 0.16 0.18 0.30 0.23 0.07 0.07 0.05 0.19 0.23 0.25 0.19 0.10 0.18 0.15 0.02 0.05 0.05 0.13 0.05 H40 0.26 0.16 0.18 0.34 0.23 0.07 0.07 0.05 0.22 0.23 0.25 0.22 0.10 0.22 0.18 0.02 0.05 0.05 0.16 0.05

49

Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu (tiếp)

H21 H22 H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H37 H38 H39 H40

H21 1.00

H22 0.59 1.00

H23 0.21 0.15 1.00

H24 0.36 0.25 0.53 1.00

H25 0.47 0.47 0.20 0.31 1.00

H26 0.39 0.64 0.18 0.32 0.52 1.00

H27 0.39 0.53 0.24 0.36 0.47 0.77 1.00

H28 0.53 0.64 0.21 0.36 0.62 0.64 0.48 1.00

H29 0.38 0.52 0.23 0.39 0.45 0.57 0.47 0.62 1.00

H30 0.31 0.42 0.20 0.35 0.45 0.47 0.38 0.52 0.85 1.00

H31 0.31 0.39 0.21 0.32 0.38 0.44 0.53 0.35 0.57 0.57 1.00

H32 0.37 0.55 0.20 0.34 0.40 0.71 0.60 0.50 0.69 0.63 0.55 1.00

H33 0.34 0.38 0.20 0.31 0.33 0.57 0.47 0.47 0.60 0.60 0.42 0.69 1.00

H34 0.39 0.53 0.24 0.36 0.34 0.44 0.39 0.44 0.47 0.52 0.35 0.55 0.47 1.00

H35 0.38 0.42 0.23 0.44 0.33 0.47 0.47 0.38 0.37 0.45 0.42 0.53 0.45 0.68 1.00

H36 0.37 0.37 0.23 0.38 0.32 0.45 0.37 0.41 0.40 0.48 0.33 0.52 0.58 0.66 0.75 1.00

H37 0.39 0.35 0.27 0.32 0.21 0.39 0.39 0.35 0.38 0.34 0.31 0.41 0.57 0.48 0.52 0.60 1.00

H38 0.38 0.34 0.20 0.35 0.20 0.38 0.38 0.31 0.33 0.30 0.34 0.40 0.45 0.47 0.50 0.53 0.68 1.00

H39 0.13 0.07 0.18 0.19 0.07 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.12 0.18 0.10 0.10 0.12 0.13 0.15 1.00

H40 0.13 0.07 0.18 0.16 0.07 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.12 0.18 0.10 0.07 0.12 0.13 0.15 0.91 1.00

Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 26%, 40 giống lúa được phân thành

4 nhóm cách biệt di truyền:

* Nhóm I gồm 3 giống lúa: Nếp bồ hóng Hải Dương (H1), Nàng quớt biển

(H39) và Nàng quớt vàng (H40). Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong

nhóm dao động trong khoảng 0,26 (giống Nếp bồ hóng Hải Dương - H1 và Nàng

quớt biển - H39); (giống Nếp bồ hóng Hải Dương - H1 và Nàng quớt vàng - H40)

đến 0,91 (giữa giống Nàng quớt biển - H39 và Nàng quớt vàng - H40).

* Nhóm II gồm 11 giống được chia thành 2 phân nhóm:

- Phân nhóm 2.1 gồm 2 giống: Lúa mộ trắng (H4) và Khẩu mèo (H5) có hệ

số tương đồng di truyền với nhau là 0,42.

- Phân nhóm 2.2 gồm 9 giống được chia thành 2 phân nhóm phụ:

+ Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 6 giống: Ble lenh xi (H9), Chiêm đỏ (H14), Lúa

muối (H15), Lúa can đỏ (H11), Nếp mậm (H12) và Ble’ la (H10) có hệ số tương

50

đồng di truyền dao động từ 0,42 (giữa giống Ble’ la - H10 và Lúa muối - H15) đến

0,74 (giữa giống Ble lenh xi - H9 và Chiêm đỏ - H14).

+ Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 3 giống: IR64 (H19), Blech cấu (H23) và Khẩu lẩy khao

(H24). Phân nhóm phụ này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,53 (giữa giống Blech

cấu - H23và Khẩu lẩy khao - H24) đến 0,62 (giữa giống IR64 - H19 và Blech cấu - H23)

* Nhóm III gồm 6 giống: Lia tón (H2), Khẩu nuột cung (H3), B'le tolo (H6),

Ble blu (H7), Ble la tong (H8) và Kháu căm pị (H13). Hệ số tương đồng di truyền

giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,28 (giữa giống Lia tón - H2 và

Khẩu căm pị -H13) đến 0,64 (giữa giống Ble blu - H7 và Ble la tong - H8).

* Nhóm IV gồm 20 giống được chia thành 3 phân nhóm

+ Phân nhóm 4.1 gồm 8 giống Ba chơ K'tê (H16), Khẩu kẻn (H17), Chăm

soóng (H25), Lọ cang (H28), Tan ngần (H18), Ble mạ mùa (H20), Khẩu bò khá

(H22) và Mồng lu (H21) có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,37 (giữa

giống Ba chơ K'tê - H16 và Mồng lu - H21) đến 0,70 (giữa giống Ble mạ mùa - H20

và Khẩu bò khá - H22).

+ Phân nhóm 4.2 gồm 7 giống: Nếp cái cạn (H26), Hang ngụa (H27), Khẩu

mà giàng (H29), Khẩu nón (H30), Blào sinh sái (H32), Blào đóng (H33) và Khẩu

hin (H31). Phân nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,38 (giữa

giống Hang ngụa - H27 và Khẩu nón - H30) đến 0,85 (giữa giống Khẩu mà giàng -

H29 và Khẩu nón - H30).

+ Phân nhóm 4.3 gồm 5 giống Blào cô ném (H34), Khẩu cụ (H35), Chạo lựu

(H36), Khẩu sán (H37) và Khẩu đó đón (H38). Phân nhóm này có hệ số tương đồng

di truyền dao động từ 0,47 (giữa giống Blào cô ném - H34 và Khẩu đó đón - H38)

đến 0,75 (giữa giống Khẩu cụ - H35 và Chạo lựu - H36).

Những kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa thông qua

khoảng cách di truyền và sơ đồ hình cây phân nhóm di truyền đã cho thấy sự đa

dạng khá lớn về mặt di truyền giữa 40 giống lúa địa phương nghiên cứu. Kết hợp

kết quả phân nhóm di truyền bằng ch thị phân tử SSR với những thông tin về khả

năng chịu hạn của các giống lúa cũng như nguồn gốc của các giống lúa, chúng tôi

đã chọn 8 giống lúa đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu hình chịu

51

hạn tốt và có nguồn gốc khác nhau (Phụ lục 1). Những giống này sẽ là nguồn vật

liệu cho nghiên cứu tiếp theo về tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen cây lúa địa

phương Việt Nam.

3.4. Kết quả xác định các allele hiếm, allele đặc trƣng nhận dạng các giống lúa

trong tập đoàn nghiên cứu

3.4.1. Kết quả xác định các allele hiếm, nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn

nghiên cứu

Thông thường, allele hiếm (rare allele) được định nghĩa dựa trên tần số xuất

hiện của chúng. Kimura (1993) đã định nghĩa allele hiếm (allele duy nhất) là allele

có tần số xuất hiện nhỏ hơn q với những giá trị nhỏ xác định của q (như q = 0,01).

Đối với số lượng mẫu lên đến 100 thì một allele sẽ được xem là hiếm nếu nó xuất

hiện không quá hai lần và số lần xuất hiện của một allele hiếm sẽ là không quá 200

lần khi lượng mẫu đạt tới 10.000 [31]. Còn theo Zahida và cộng sự (2009), alelle

hiếm là allele xuất hiện với tần số ≤ 0,05 trong tổng số mẫu nghiên cứu [58].

Kết quả thu được từ bộ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi SSR

với tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu đã thu được tổng số 82 loại allele, trong đó

xuất hiện 2 allele hiếm (allele ch xuất hiện ở duy nhất ở một mẫu giống có tần số

<0,05) (bảng 3.1). 2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 với giống Nếp bồ

hóng Hải Dương (H1) và cặp mồi RM5811 với giống Ba chơ K'tê (H16). Như vậy,

t lệ allele hiếm xuất hiện là 2/82 (2,4%); t lệ allele hiếm trên mỗi locus trung bình

là 2/23 (8,7%).

3.4.1.1. Kết quả nhận dạng giống Nếp bồ hóng Hải Dương

Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3467 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

52

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3467 (hình 3.12) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước

trong khoảng 95bp - 180bp. Trong đó, xuất hiện 1 allele duy nhất ở giống Nếp bồ

hóng Hải Dương (H1) có kích thước khoảng 95bp. Như vậy, khi sử dụng cặp mồi

RM3467 có thể nhận dạng được chính xác giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1)

trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu.

3.4.1.2. Kết quả nhận dạng giống Ba chơ K'tê

Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5811 (M: 100bp DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5811 (hình 3.13) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau với kích thước

trong khoảng 90bp - 130bp. Trong đó, xuất hiện 1 allele duy nhất ở giống Ba chơ

K'tê (H16) có kích thước khoảng 130bp. Đây là giống duy nhất có kiểu gen dị hợp

tử ở locus RM5811. Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM5811có thể nhận dạng được

chính xác giống Ba chơ K'tê (H16) trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu.

3.4.2. Kết quả xác định các allele đặc trưng nhận dạng các giống lúa trong tập

đoàn nghiên cứu

Kết quả thu được từ bộ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi SSR

với tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu đã thu được tổng số 82 loại allele, trong đó

xuất hiện 4 giống có kiểu gen dị hợp tử duy nhất (giống Lúa muối - H15 ở cặp mồi

RM1155; giống Blech cấu - H23 ở cặp mồi RM3476; giống Chạo lựu - H36 ở cặp

mồi RM3468 và giống Blào sinh sái - H32 ở cặp mồi RM6051).

53

3.4.2.1. Kết quả nhận dạng giống Lúa muối

Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1155 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM1155 (hình 3.14) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước

trong khoảng 120bp - 190bp. Trong đó, duy nhất mẫu số 15 (giống Lúa muối - H15)

xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy

nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM1155 có thể nhận

dạng được chính xác giống Lúa muối trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu.

3.4.2.2. Kết quả nhận dạng giống Blech cấu

Hình 3.15. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3476 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3476 (hình 3.15) cho thấy: xuất hiện 4 loại allele khác nhau với kích thước

trong khoảng 118bp - 190bp. Trong đó, duy nhất mẫu số 23 (giống Blech cấu -

H23) xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele

duy nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM3476 có thể

nhận dạng được chính xác giống Blech cấu trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu.

54

3.4.2.3. Kết quả nhận dạng giống Chạo lựu

Hình 3.16. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3468 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3468 (hình 3.16) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước

trong khoảng 180bp - 234bp. Trong đó, duy nhất mẫu số 36 (giống Chạo lựu - H36)

xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy

nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM3468 có thể nhận

dạng được chính xác giống Chạo lựu trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu.

3.4.2.4. Kết quả nhận dạng giống Blào sinh sái

Hình 3.17. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM6051 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder)

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa chịu hạn với cặp mồi

RM6501 (hình 3.17) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau có kích thước các

allele trong khoảng 118bp - 156bp. Trong đó, duy nhất giống Blào sinh sái (H32)

xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy

nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM6051 có thể nhận

dạng được chính xác giống Blào sinh sái trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu.

55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam khá đa dạng về các

thành phần allele. Kết quả phân tích 23 ch thị phân tử SSR với 39 giống lúa chịu

hạn và giống IR64 thu được tổng số 82 loại allele trung bình 3,57 allele/locus. Hệ

số PIC dao động từ 0,22 đến 0,77 (trung bình 0,56).

2. Các giống chịu hạn có độ thuần di truyền khác nhau, tỷ lệ dị hợp của các

giống lúa nghiên cứu dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là 3,45%). Mức độ đa

dạng di truyền giữa các giống lúa chịu hạn rất cao. Hệ số tương đồng di truyền giữa

các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống

nghiên cứu được phân thành 4 nhóm cách biệt di truyền.

3. Trong số 23 cặp mồi SSR nghiên cứu có 2 cặp mồi xác định được 2

allele hiếm (trung bình 0,087). Cặp mồi RM3467 xác định được 1 allele hiếm

nhận dạng được giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1). Cặp mồi RM5811 xác

định được 1 allele hiếm nhận dạng được giống Ba chơ K'tê (H16). Dựa vào các

allele đặc trưng có thể nhận dạng chính xác một số giống trong tập đoàn: cặp

mồi RM1155 nhận dạng được giống giống Lúa muối (H15); cặp mồi RM3476

nhận dạng được giống giống Blech cấu (H23); cặp mồi RM3468 nhận dạng được

giống giống Chạo lựu (H23) và cặp mồi RM6501 nhận dạng được giống Blào

sinh sái (H32). Các kết quả thu được rất hữu ích trong việc nhận dạng chính xác

các nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả

trong các chương trình chọn tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam.

2. Đề nghị

Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn ở

mức hình thái nông sinh học kết hợp với đánh giá bằng ch thị SSR nhằm xác định các

marker liên kết với tính trạng chống chịu khô hạn để phục vụ cho công tác chọn tạo

giống lúa chịu hạn.

Tiếp tục nghiên xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính

xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công

tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu hạn ở mức phân tử.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu

ngoại cảnh bất lợi ở lúa, NXB Đại học quốc gia HN.

2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với

thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nxb Nông Nghiệp TP Hồ chí Minh, tr. 65-

223.

3. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê

Trần Bình (2003), Mối tương quan giữa làm lượng proline và tính chống chịu

hạn ở cây lúa, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr. 85-95.

4. Phạm Văn Cường (2009), Các đặc tính quang hợp và rễ liên quan đến khả

năng chịu hạn ở cây lúa, Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

5. Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình cây lúa, Trường Đại học Cần Thơ.

6. Vũ Tuyên Hoàng, Nguyễn Ngọc Ngân (1992), "Một số kết quả nghiên cứu lúa

chịu hạn", Kết quả nghiên cứu cây lương thực, thực phẩm (86-90), Viện Cây

lương thực và Cây thực phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 47-57.

7. Nguyễn Thị Thu Hoài (2005), “Nghiên cứu khả năng chịu hạn và mối quan hệ

di truyền của một số giống lúa cạn địa phương”, Luận văn Thạc sỹ sinh học,

trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

8. Nguyễn Thế Hùng (2007), Bài giảng dành cho học viên cao học chuyên đề cây

ngô, Đại học Nông nghiệp Hà Nội

9. Trần Thị Phương Liên, (1999), “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân

tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam”,

Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, tr. 18-36.

10. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn

Thị Vân Anh (2007), “Sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình chịu hạn của một số

giống lúa cạn địa phương miền núi”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong

khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, tr. 759-762.

11. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1999), Bảo tồn đa dạng sinh học, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội.

12. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở

lúa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ

Sinh học.

57

13. Trần Danh Sửu, Lưu Ngọc Trình, Bùi Bá Bổng (2006), “Nghiên cứu đa dạng di

truyền lúa Tám bằng ch thị microsatellite”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn (12), tr. 15-18.

14. Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Lan Hoa, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Bá

Ngọc, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Thanh Thuỷ (2008), Đánh giá đặc

tính chịu hạn của một số giống lúa địa phương Việt Nam thông qua phương

pháp kiểu hình và ứng dụng ch thị phân tử, Tạp chí Nông nghiệp và Phát Triển

Nông Thôn, tr. 28-35.

15. Phạm Thị Bé Tư, Bùi Thị Dương Khuyều, Nguyễn Thị Lang, Celsa Quinio,

Bùi Chí Bửu (2008), “Phân tích đa dạng di truyền của 90 giống lúa mùa địa

phương lưu trữ trong ngân hàng gen Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long”,

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (4), tr. 12-18.

16. Vũ Văn Vụ (1996), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo Dục, 120 trang.

Tài liệu tiếng Anh

17. Adkind S. W., Kunanuvatchaidach R., Godwin I. D., (1995), “Somacional

variation in rice% drought tolerant and other agronomic chacracters”,

Australian journal of Botany 4 (2), pp. 201-209.

18. Alvarez A., Fuentes J. L., Puldón V., Gómez P. J., Mora L., Duque M. C.,

Gallego G. and Tohme J. M. (2007), Genetic diversity analysis of Cuban

traditional rice (Oryza sativa L.) varieties based on microsatellite markers.

Genetics and Molecular Biology, 30 (4), pp. 1109-1117.

19. Bake J., C. Steele, Dure L. I. (1988), Sequence and characterization of 6 LEA

proteins and their genes from cotton, Plant Mol Biol 11, pp. 277-291.

20. Bohnert H. L., Jesen R. G. (1996), “Strategies of engineering water stress

tolerance in plants”, Tibtech, 14, pp. 89-97.

21. Chakravarthi B. K., and Naravaneni R. (2006), SSR marker based DNA

fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa. L), African Journal of

Biotechnology, 5 (9), pp. 684-688.

22. Chang T. T. (1985), "Crop history and genetic conservation. Rice, A case

study. In: Iwova state", Journal of research vol. 59, pp. 4.

58

23. Cheng C. Y., Motohashi R., Tsuchimoto S., Fukuta Y., Ohtsubo H. (2003),

"Polyphyletic origin of cultivated rice: based on the interspersion pattern of

SINEs", Mol. Biol. Evol. 20, pp. 67-75.

24. Chen T. H., Muranta N. (2002), “Ehancement of tolerance of a family of plant

dehydrin protein”, Physiol plant, pp. 795-803.

25. F.A.O., AGL (2000), Extent and causes of salt-affected soils in participating

countries. Global network on intergrated soil management for sustainable use

of salt-affected soils, Land and plant nutrition management service.

26. Giarrocco L.E., Marassi M. A. and Salerno G. L. (2007), Assessment of the

genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers, Crop Science,

47 (2), pp. 853-860.

27. Goyal K., Walton L. J., Tunnacliffe A. 9 (2005), LEA proteins prevent protein

aggrevation due to water stress, Biochem J. 388, pp.151-157.

28. Hoisington D., Jiang C., Khairallah M., Ribault J. M., Bohn M., Melchinger A.,

Willcox M., Gonzalez-de-Leon D. (1996), QTL for insect resistance and

drought tolerance in tropical maize: prospects for markerassisted selection,

Sym Soc Exp Biol 50, pp. 39-44.

29. Ingram J., Bartels D. (1996), The molecular basis of dehydration tolerance in

plants, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47, pp. 377-403.

30. Jayamani P., Negraxo S., Martins M., Maçãs B. and Oliveira M. M. (2007),

"Genetic Relatedness of Portuguese Rice Accessions from Diverse Origins as

Assessed by Microsatellite Markers", Crop Sci 47, pp. 879-884

31. Kimura M. (1983), Rare variant alleles in the light of the neutral theory, Mol.

Biol. Evol., 1, pp. 84-93.

32. Lilley J. M., Ludlow M. M., McCouch S. R., O’Toole J. C. (1996), Locating QTL for

osmotic adjustment and dehydration tolerance in rice, J. Exp Bot 47, pp. 1427-1436.

33. Mahmoud M. S., Sawsan S. Y., Naglaa A. A., Hany S. A. and Ahmed M. E. S.

(2005), "Genetic analysis of some Egyptian rice genotypes using RAPD, SSR

and AFLP", African Journal of Biotechnology Vol. 4 (9), pp. 882-890.

59

34. McCouch S. R., Sunita J., Jain R. K (2005), "Genetic analysis of Indian aromatic and

quality rice (Oryza sativa L.) germplasm using panels of fluorescently-labeled

microsatellite markers", Theoretical and Applied Genetics, (Vol. 109) (No. 5), pp.

965-977.

35. McCouch S. R. et al. (2002), “Development and mapping of 2240 new SSR

markers for rice (Oryza sativa L.)”, DNA Res. 9, pp. 199 - 207.

36. Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E. A., and Hasnain S. E.,

(2002), Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati

rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers, PNAS,

99 (9), pp. 5836-5841.

37. Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu, (2008), Fine mapping for drought

tolerance in Rice (Oryza sativa L.), Omonrice 16, pp. 9-15.

38. Obara-Okeyo P. and Kako S., (1998), Genetic diversity and identiﬁ cation of

Cymbidium cultivars as measured by random ampliﬁ ed polymorphic DNA

(RAPD) markers, Euphytica, 99, pp. 95-101.

39. Oka H. I. (1988), "Origin of cultivated rice", J. Sci. Societies press, Tokyo,

pp. 129.

40. Olufowote J. O., Xu Y., Chen X., Park W. D., Beachell H. M., Dilday R. H.,

Goto M., and McCouch S. R. (1997), "Comparative evaluation of within-

cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP

markers", Genome 38, pp. 1170-1176.

41. Quarries S., V. Lazic -J., Ivanovic M., Pekic C., Heyl A., Landi P., Lebreton

C., Steed A. (1997), “Molecular marker methods to dissect drought tolerance in

maize”, In: Tsaftaris A, editor. Genetics, biotechnology and breeding of maize

and sorghum, Cambridge (UK): The Royal Society of Chemistry, pp. 52-58.

42. Sakuma Y., Maruyama K., Qin F., Osakabe Y., Shinozaki K., and Yamaguchi

S., K. (2006), “Dual function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A

in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene expression”, Proc.

Natl, Acad. Sci. USA, 103, pp. 18822-18827.

60

43. Shen L., Courtois B., McNally K., McCouch S. R., Li Z. (1999), “Developing

nera-isogenic lines of IR64 introgressed with QTLs for deeper and thicker roots

through marker-aided selection”, In: Genetic Improvement of Rice for Water-

Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy, IRRI, Philippines,

pp. 275-289.

44. Smith J. S. C., Chin C. L., Shu H., Smith O. S., Wall S. J., Senior M. L.,

Michell S. C., Kresovick S., Ziegle J. (1997), "An evaluation of the utility of

SSR loci as Molecular markers in maize (Zea Mays L.): Comparison with data

from RFLP and pedigrees", Theor Appl Genet 100, pp. 697-712.

45. Soltis D. E., Soltis P. S. (2003), “The role of phylogenetics in comparative

genomics”, Plant Physiol 132, pp. 1790-1800.

46. Sujatha K., Upadhyay R., Kaladhar K., Rani N. S. and Sarla N. (2004),

"Genetic relationship among aromatic short grain and Basmati rice based on

ISSR and SSR markers", Rice Genetic Newsletter, vol. 21.

47. Tateoka T. (1963), “Taxononic Studies of Oryza III. Key to the species and

their enumeration”, Bot. Mag. Tokyo 76, pp. 165-173.

48. Thomashow M. F. (1999), “Plant Cold Acclimation: freezing tolerance genes and

regulatory mechanisms”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, pp. 571-599.

49. Victoria C. L., Darshan S. B., Toshinori A., Edilberto D. R. (2007),

“Assessment of Genetic Diversity of Philippine Rice Cultivars Carring Good

Quality trait using SSR marker”, Breeding Science (57), pp. 263-270.

50. Virk P. S., Fork B. V, Jakson M. T., New B. H. J. (1995), “Use of RADP for

the study of diversity within plant Germplasm collection”, Heridity (74), pp.

170-179.

51. Wang H., Zhang H., Gao F., Li J., Li Z. (2007), “Comparision of gene

expression between upland rice cultivars under water stress using cDNA

microarray”, TAG 115, pp.1109-1126.

52. Wong S. C., Yiu P. H., Bong S. T. W., Lee H. H., Neoh P. N. P. and Rajan A.,

(2009), Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using Microsatellite Markers,

American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 4 (4), pp. 298-304.

61

53. Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L. (2007), Over-expression of a LEA gene in

rice improves drought resistance under the field conditions”, TAG 115, pp. 35-46.

54. Xiong L., Schumaker K. S., Zhu J. K. (2002), Cell signaling during cold,

drought, and salt stress”, Plant Cell 14 (Suppl), pp. 165-183.

55. Xu Y., Henry B., Mc Couch S. R. (2004), “A marker approach to broading the

genetic base of rice in the USA”, Crop Sci (44), pp. 1847-1959.

56. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T., Wu R. (1996), Expression of a late

embyogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to

water deficit and salt stress in transgenic rice”, Plant Physiol 110, pp. 249-257.

57. Yu S. B., Xu W. J., Vijayakumar C. H., Ali J., Fu B. Y., Xu J. L., Jiang Y. Z.,

Marghirang R., Domingo J., Aquino C., Virmani S.S., and Li Z. K., (2003),

Molecular diversity and multilocus organization of the parental lines used in the

International Rice Molecular Breeding Program, Theor. Appl. Genet, 108, pp.

131-140.

58. Zahida H. P., Malik A. R., Stephen R. P. and Salman A. M. (2009),

“Determination of genetic variability of Asian rice (Oryza sativa L.) varieties

using microsatellite markers”, African Journal of Biotechnology Vol. 8 (21),

pp. 5641-5651.

59. Zhang J., Zheng H. G., Ali M. L., Triparthu J. N., Aarti A., Pathan M. S., Sarial

A. K., Robin S., Thuy T. N., Babu R. C., Bay D. N., Sarkarung S., Blum A.,

Henry T. N. (1999), “Progress on the molecular mapping of osmotic

adjustment and root traits in rice”, In: Genetic Improvement of Rice for Water-

Limited Environments, (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy, IRRI,

Philippines, pp. 307- 317.

60. Zhang X., Zhou S, Fu Y., Su Z., Wang X., Sun C. (2006), “Identification of a

drought tolerant introgression line derived from Dongxiang common wild rice

(O. rufipogon Griff.)”, Plant Mol Biol 62: pp. 247-259.

61. Zhao S. H., Wang F. Z., Lu L., Zhang H. Y., Zhang X.Y. (2000), “Breeding

and selection of drought resistant and salt tolerant wheat variety Cang 6001”,

Acta Agric Boreall Sin 15, pp. 113-117.

62

Tài liệu Internet

62. www.knowledgebank.irri.org

63. www.nea.gov.vn/html/DDSH/dulieu1/khainiem/

63

PHỤ LỤC

1. Phụ lục 1. Danh sách giống lúa sử dụng để giải trình tự ADN

Danh sách những giống lúa sử dụng để giải trình tự ADN

Ký

Nguồn

Năng

Ph m

Kháng

Bạc

Đạo

Chịu

Đặc điểm

TT SĐK

Tên giống

TGST

hiệu

gốc

suất

chất

rầy

lá

ôn

hạn

mặn

rét

ngập

chính

Nếp bồ hóng

Cứng cây yếu,

412

H1 Hải Dương

145

39,47 Kthơm NC Ktb K

Tốt

Hải Dương

đẻ nhánh mạnh

Cây trung bình,

930

Lia tón

123

47,04 Kthơm NC

N NC Tốt

đẻ nhánh mạnh

3429

Chiêm đỏ

H14 Quảng Trị

3525

Ba chơ K'tê

H16 Bình Định

3588

Tan ngần

H18

Yên Bái

ngon

4806

Blào sinh sái

H32

5018

Khẩu sán

H37

Nàng quớt biển H39

64 2. Phụ lục 2: Bài báo: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa

chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” đã đƣợc gửi đăng trên Tạp chí

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

ĐÁNH GIÁ ĐA D NG DI TRU ỀN TẬP ĐOÀN L A CHỊU H N

CỦA VIỆT NAM B NG CHỈ THỊ PH N T SSR

Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, Nguyễn Thị Nhài1, Nguyễn Thị Thanh Thủy2, Nguyễn Thúy Điệp1, Kiều Thị Dung1, Nguyễn Thị Thảo3, Khuất Hữu Trung1

TÓM TẮT

Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam (bao

gồm 39 giống lúa địa phương có khả năng chịu hạn tốt và giống lúa tham

khảo - IR64 mẫn cảm với khô hạn) bằng ch thị SSR cho thấy: các giống lúa

nghiên cứu rất đa dạng về các thành phần allele. Kết quả phân tích 23 locus

SSR thu được tổng số 82 loại allele, trung bình 3,57 allele/locus. T lệ allele

hiếm xuất hiện là 8,7% (2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 và

RM5811). Hệ số PIC dao động từ 0,22 - 0,77 (trung bình là 0,56). T lệ dị hợp

ở các giống lúa nghiên cứu rất khác nhau dao động từ 0 đến 14,29% (trung

bình là 3,45%). Tập đoàn giống lúa nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền

rất cao, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến

0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống lúa nghiên cứu được chia

thành 4 nhóm lớn. Kết hợp kết quả phân nhóm cách biệt di truyền và những

thông tin về kiểu hình chịu hạn, 8 giống lúa điển hình có nguồn gốc khác

1 Viện Di truyền Nông nghiệp Địa ch liên hệ: Tel: 84-4- 37540764; Fax: 84-4-37543196; Email: khuathuutrung@yahoo.com 2 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 3. Đại học Sư phạm Hà Nội

65 nhau đã được chọn để giải trình tự, tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen phục vụ

công tác chọn, tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam.

Từ khóa: Chỉ thị SSR, chịu hạn, đa dạng di truyền, lúa địa phương.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực có khả

năng chịu hạn kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài. Tính chịu

hạn của lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: khả năng đâm xuyên của

rễ, khả năng điều ch nh áp suất thẩm thấu của tế bào lá, cơ chế điều khiển

thoát hơi nước ở khí khổng. Những nghiên cứu về sinh lý và di truyền học

đã ch ra rằng: có khoảng 200 gen tham gia vào cơ chế kháng hạn ở cây

trồng, nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định. Vì vậy, khả

năng và mức độ kháng hạn rất khác nhau phụ thuộc vào sự có mặt và biểu

hiện của các gen khác nhau.

Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển

bền vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các

nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lúa để nâng cao khả năng chịu

hạn, ổn định năng suất trở thành vấn đề thời sự mang tính cấp bách và cần

thiết. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền

tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” nhằm tạo lập cơ sở

dữ liệu cho nguồn gen lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam phục vụ công tác

nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn bao gồm 39 giống lúa có đặc tính chịu

hạn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được

lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài

nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long

và giống lúa tham khảo - IR64 mẫn cảm với khô hạn (bảng 1). 23 cặp mồi

66 SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240

cặp mồi, do hãng IDT (Mỹ) cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích

thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12

nhiễm sắc thể khác nhau đã được công bố (bảng 2) (McCouch et all., 2002).

2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Tách chiết ADN tổng số: mẫu lá của từng mẫu giống được thu thập

riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và

Kako có cải tiến (Obara và Kako, 1998).

Chạy PCR: các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 940C (5 phút), 35-37 chu kỳ [940C (40s); 55-600C (30s), 720C (30s - 1 phút)] và kết thúc ở 720C (5 phút).

Phân tích và xử lý số liệu: kết quả được thống kê dựa vào sự xuất

hiện hay không xuất hiện của các băng ADN (các allele). Số liệu được xử

lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc

2.1 (Rohlf, 1997).

Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công

thức sau:

PIC = 1 - Pi

2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i).

Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức:

;

trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR; M là tổng số mồi

sử dụng trong nghiên cứu; Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN.

Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức:

; trong đó:

Z là tổng số mồi không xuất hiện băng ADN; M là tổng số mồi sử dụng trong

nghiên cứu.

67 Bảng 1. Danh sách, tên, kí hiệu và số đăng kí của các giống lúa nghiên cứu

TT SĐK

Tên giống

Nguồn gốc TT

SĐK

Tên giống

Ký hiệu

Nguồn gốc

Ký hiệu

412 Nếp bồ hóng

Hải Dương

3935 Mồng lu

H21

Hải Dương

930 Lia tón

3947 Khẩu bò khá H22

Lai

Châu

3970 Blech cấu

H23

3 1832 Khẩu nuột cung H3

4123 Khẩu

lẩy

H24

4 1837 Lúa mộ trắng

khao

4723 Chăm soóng H25

5 2021 Khẩu mèo

4726 Nếp cái cạn H26

6 2125 B'le tolo

4748 Hang ngụa

H27

7 2127 Ble blu

4762

Lọ cang

H28

8 2131 Ble la tong

4792 Khẩu mà

H29

9 2135 Ble lenh xi

giàng

H30

10 2642 Ble’ la

H10

4793 Khẩu nón

H31

11 3351 Lúa can đỏ

H11 Quảng Nam 31

4794 Khẩu hin

12 3371 Nếp mậm

H12 Quảng Nam 32

4806 Blào sinh sái H32

H13

13 7099 Kháu căm pị

4840 Blào đóng

H33

H14

14 3429 Chiêm đỏ

Quảng Trị

4843 Blào cô ném H34

H35

15 3483 Lúa muối

H15 Quảng Ngãi 35

5057 Khẩu cụ

H36

16 3525 Ba chơ K'tê

H16

Bình Định

5015 Chạo lựu

H37

H17

17 6430 Khẩu kẻn

5018 Khẩu sán

H18

18 3588 Tan ngần

Yên Bái

5020 Khẩu đó đón H38

H19

19 4666 IR64

IRRI

Nàng quớt

H39

biển

20 3895 Ble mạ mùa

H20

Sơn La

Nàng quớt

H40

vàng

Ghi chú: SĐK: số đăng kí ở ngân hàng gen;(-) chưa rõ nguồn gốc;

(*): Giống lúa mùa địa phương miền Nam

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR

Kết quả phân tích 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên

68 cứu thu được tổng số 82 loại allele khác nhau, số allele/locus dao động từ 2 -

5, trung bình 3,57 allele/locus. Cả 23 cặp mồi đều cho các locus đa hình,

trong đó có 3 cặp mồi thu được 2 allele, 10 cặp mồi thu được 3 allele, 4 cặp

mồi thu được 4 allele và 6 cặp mồi thu được 5 allele (bảng 2).

69 Bảng 2. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR

Vị trí

Kích thƣớc sản

Số alen

Số allele

STT

Tên mồi

trên

PIC

thể hiện

hiếm

ph m PCR (bp)

NST

RM145

0,61

RM152

0,51

194-281

RM267

0,59

151-175

RM566

0,72

150-180

RM1155

0,62

234-290

RM1364

0,63

120-190

RM1367

120-194

90-150

0,77

RM3288

0,50

RM3431

0,29

130-190

RM3467

0,70

130-194

RM3468

0,72

95-180

RM3476

0,70

180-234

RM3483

0,72

118-190

RM3515

0,66

150-234

RM3534

0,53

110-156

RM5599

0,53

110-150

RM5811

0,50

120-156

RM6051

0,46

90-130

RM7003

0,46

118-156

RM7372

0,46

100-130

RM7581

100-140

120-220

0,22

RM25271

0,38

RM25319

0,61

156-210

120-200

2

82 12,89

Tổng

Trung bình

3,57

0,56

0,087

Ghi chú: NST: nhiễm sắc thể; PIC: Polymorphic Information Content

70 Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo

tính đa hình của các allele ở từng locus SSR. Qua kết quả thu được ở bảng 2

cho thấy rằng, giá trị PIC của 23 marker thay đổi từ 0,22 (ở mồi xuất hiện 3

allen – RM7581) đến giá trị PIC cao nhất là 0,77 (ở mồi xuất hiện 5 allele-

RM1367). Hệ số PIC trung bình của 23 cặp mồi nghiên cứu là 0,56. Có 2

allen hiếm xuất hiện (allele có tần số xuất hiện nhỏ hơn 5%) ở các cặp mồi

RM145, RM3467 và RM5811 (chiếm t lệ 8,7%). Những kết quả thu được

cũng tương đương với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới (bảng 3).

Bảng 3. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử d ng chỉ thị SSR

trên cây lúa đ được công bố

Trung bình

TT

Tác giả

Số giống

Số chỉ thị

Tổng số allele

PIC

Số allele hiếm/locus

1 Nagaraju J., 2002

Số allele thể hiện/locus 3,8

2 Yu S. B., 2003

193

101

628

0,68

6,2

3 Chakravarthi B.K., 2006

462

4 Giarrocco L.E., 2007

219

0,69

1,7

8,4

5 Alvarez A., 2007

0,74

1,4

6,6

6 Herrera T.H., 2008

203

0,52

4,23

7 Wong S.C., 2009

0,52

2,6

8 Nghiên cứu này

40

23

82 0,56

0,087

3,57

Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 40 giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3468

(M: øX17- Hea III digest DNA ladder)

71 3.2. Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa

nghiên cứu

Bảng 4.Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%)

của 40 giống lúa nghiên cứu

TT

Tên giống

M% H% TT

Tên giống

M% H%

1 Nếp bồ hóng Hải Dương

4,35

0,00

21 Mồng lu

4,35

4,55

2 Lia tón

0,00

22 Khẩu bò khá

0,00

3 Khẩu nuột cung

0,00

4,35

23 Blech cấu

4,35

9,09

4 Lúa mộ trắng

4,35

0,00

24 Khẩu lẩy khao

8,70

4,76

5 Khẩu mèo

4,35

0,00

25 Chăm soóng

0,00

4,35

6 B'le tolo

0,00

4,35

26 Nếp cái cạn

0,00

4,35

7 Ble blu

0,00

27 Hang ngụa

0,00

8 Ble la tong

0,00

28 Lọ cang

4,35

4,55

9 Ble lenh xi

0,00

29 Khẩu mà giàng

0,00

4,35

10 Ble’ la

4,35

0,00

30 Khẩu nón

0,00

4,35

11 Lúa can đỏ

0,00

4,35

31 Khẩu hin

0,00

12 Nếp mậm

0,00

32 Blào sinh sái

0,00

8,70

13 Kháu căm pị

0,00

33 Blào đóng

8,70

14,29

14 Chiêm đỏ

0,00

4,35

34 Blào cô ném

0,00

15 Lúa muối

0,00

8,70

35 Khẩu cụ

0,00

4,35

16 Ba chơ K'tê

0,00

8,70

36 Chạo lựu

0,00

8,70

17 Khẩu kẻn

0,00

8,70

37 Khẩu sán

4,35

4,55

18 Tan ngần

0,00

4,35

38 Khẩu đó đón

0,00

4,35

IR64

0,00

39 Nàng quớt biển

13,04

5,00

20 Ble mạ mùa

0,00

40 Nàng quớt vàng

8,70

0,00

Trung bình

1,85

3,45

Qua kết quả thu được ở bảng 4 cho thấy, tỷ lệ dị hợp ở các giống lúa

nghiên cứu rất khác nhau. Tỷ lệ dị hợp (H%) cao nhất ở giống lúa Blào đóng

với tỷ lệ 14,29%, tiếp theo là giống lúa Blech cấu có tỷ lệ dị hợp 9,09%. Các

72 giống lúa Ba chơ K'tê, Lúa muối, Khẩu kẻn, Blào sinh sái và Chạo lựu đều có

tỷ lệ dị hợp 8,70%. Giống lúa Nàng quớt biển có tỷ lệ dị hợp 5,00%. Giống lúa

Khẩu lẩy khao có tỷ lệ dị hợp 4,76%. Ba giống lúa Mồng lu, Lọ cang và Khẩu

sán có tỷ lệ dị hợp 4,55%. Các giống lúa Khẩu nuột cung, B'le tolo, Lúa can đỏ,

Chiêm đỏ, Tan ngần, Chăm soóng, Nếp cái cạn, Khẩu mà giàng, Khẩu nón,

Khẩu cụ và Khẩu đó đón đều có tỷ lệ dị hợp 4,35%. 17 giống còn lại có tỷ lệ dị

hợp 0% có nghĩa là các dòng này đều đồng hợp ở cả 23 mồi nghiên cứu (ch có

1 allele duy nhất/locus). T lệ dị hợp trung bình của cả tập đoàn là 3,45%.

Tỷ lệ số liệu khuyết (M%) cao nhất ở giống lúa Nàng quớt biển với t lệ

14,29% (khuyết số liệu ở 3 mồi). Các giống Khẩu lẩy khao, Blào đóng và

Nàng quớt vàng có t lệ khuyết số liệu là 8,7% (khuyết số liệu ở 2 mồi). Các

giống Nếp bồ hóng Hải Dương, Lúa mộ trắng, Khẩu mèo, Ble’ la, Mồng lu,

Blech cấu. Lọ cang, Khẩu sán có t lệ khuyết số liệu là 4,35% (khuyết số liệu

ở 1 mồi). Còn lại 28 giống không bị khuyết số liệu ở tất cả các mồi. Tỷ lệ

khuyết số liệu trung bình của cả tập đoàn là 1,85%, không có giống nào có t

lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 40 giống nghiên cứu đều có ý

nghĩa thống kê trong phân tích đa dạng di truyền.

3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa nghiên cứu

Số liệu thu được từ kết quả điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi

SSR với tập đoàn 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu được thống kê và

phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số

tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các

giống lúa chịu hạn (hình 2).

73 Hình 2. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền gi a các giống lúa chịu

hạn nghiên cứu

Qua bảng hệ số tương đồng và sơ đồ về mối quan hệ di truyền giữa các

giống nghiên cứu (hình 2) cho thấy: hệ số tương đồng di truyền của 40 giống

lúa chịu hạn nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,02 đến 0,91. Ở mức

tương đồng di truyền 26%, 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu được chia thành

4 nhóm cách biệt di truyền.

* Nhóm I gồm 3 giống lúa: Nếp bồ hóng Hải Dương, Nàng quớt biển

và Nàng quớt vàng. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm

dao động trong khoảng 0,26 (giống Nếp bồ hóng Hải Dương và Nàng quớt

biển; giống Nếp bồ hóng Hải Dương và Nàng quớt vàng) đến 0,91 (giữa

giống Nàng quớt biển và Nàng quớt vàng).

* Nhóm II gồm 11 giống được chia thành 2 phân nhóm:

- Phân nhóm 2.1 gồm 2 giống: Lúa mộ trắng và Khẩu mèo có hệ số

tương đồng di truyền là 0,42.

- Phân nhóm 2.2 gồm 9 giống được chia thành 2 phân nhóm phụ

+ Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 6 giống: Ble lenh xi, Chiêm đỏ, Lúa muối,

74 Lúa can đỏ, Nếp mậm và Ble’ la, có hệ số tương đồng di truyền dao động từ

0,42 (giữa giống Ble’ la và Lúa muối) đến 0,74 (giữa giống Ble lenh xi và

Chiêm đỏ).

+ Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 3 giống: IR64, Blech cấu và Khẩu lẩy

khao, có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,53 (giữa giống Blech cấu

và Khẩu lẩy khao) đến 0,62 (giữa giống IR64 và Blech cấu).

* Nhóm III gồm 6 giống: Lia tón, Khẩu nuột cung, B'le tolo, Ble blu,

Ble la tong và Kháu căm pị. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong

nhóm dao động trong khoảng 0,28 (giữa giống Lia tón và Khẩu nuột cung)

đến 0,64 (giữa giống Ble blu và Ble la tong).

* Nhóm IV gồm 20 giống được chia thành 3 phân nhóm:

+ Phân nhóm 4.1 gồm 8 giống Ba chơ K'tê, Khẩu kẻn, Chăm soóng, Lọ

cang, Tan ngần, Ble mạ mùa, Khẩu bò khá và Mồng lu có hệ số tương đồng

dao động từ 0,37 (giữa giống Ba chơ K'tê và Mồng lu) đến 0,70 (giữa giống

Ble mạ mùa và Khẩu bò khá).

+ Phân nhóm 4.2 gồm 7 giống: Nếp cái cạn, Hang ngụa, Khẩu mà

giàng, Khẩu nón, Blào sinh sái, Blào đóng và Khẩu hin. Phân nhóm này có hệ

số tương đồng dao động từ 0,38 (giữa giống Hang ngụa và Khẩu nón) đến

0,85 (giữa giống Khẩu mà giàng và Khẩu nón).

+ Phân nhóm 4.3 gồm 5 giống Blào cô ném, Khẩu cụ, Chạo lựu, Khẩu

sán và Khẩu đó đón, Phân nhóm này có hệ số tương đồng dao động từ 0,47

(giữa giống Blào cô ném và Khẩu đó đón) đến 0,75 (giữa giống Khẩu cụ và

Chạo lựu).

IV. KẾT LUẬN

Tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam khá đa dạng về các

thành phần allele. Kết quả phân tích 23 ch thị phân tử SSR với 39 giống lúa

chịu hạn và giống IR64 thu được tổng số 82 loại allele, trung bình 3,57

allele/locus. Hệ số PIC dao động từ 0,22 đến 0,77 (trung bình 0,56). T lệ

75 allele hiếm xuất hiện là 8,7% (2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467

và RM5811).

Các giống lúa chịu hạn có độ thuần di truyền khác nhau, tỷ lệ dị hợp

của các giống lúa nghiên cứu dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là

3,45%). Mức độ đa dạng di truyền giữa các giống lúa chịu hạn rất cao. Hệ số

tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào

khoảng cách di truyền, 40 giống nghiên cứu được phân thành 4 nhóm cách

biệt di truyền.

Đã chọn được 8 giống lúa điển hình có độ đa dạng cao và có nguồn gốc

khác nhau để giải trình tự, tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen phục vụ công tác

chọn, tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam.

Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài

Nghị định thư hợp tác với Vương Quốc Anh:“Nghiên cứu giải mã genome

một số giống lúa địa phương của Việt Nam”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Alvarez A., Fuentes J. L., Puldón V., Gómez P. J., Mora L., Duque M. C.,

Gallego G. and Tohme J. M. (2007). Genetic diversity analysis of Cuban

traditional rice (Oryza sativa L.) varieties based on microsatellite

markers. Genetics and Molecular Biology, 30 (4): 1109-1117.

2. Chakravarthi B. K., and Naravaneni R. (2006). SSR marker based DNA

fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa. L). African

Journal of Biotechnology, 5 (9): 684-688.

3. Giarrocco L.E., Marassi M. A. and Salerno G. L. (2007). Assessment of

the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers. Crop

Science, 47 (2): 853-860.

4. McCouch S. R., Leonid T.2, Y. Xu, K. B. Lobos, K. Clare, M. Walton, B.

Fu, R. Maghirang, Z. Li, Y. Xing, Q. Zhang, I. Kono, M. Yano, R.

Fjellstrom, G. DeClerck, D. Schneider, S. Cartinhour, D. Ware, L. Stein.

(2002), "Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice

(Oryza sativa L.)”, DNA Res. 9:199-207.

76 5. Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E. A., and Hasnain

S. E., (2002). Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and

non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and

SSR markers. PNAS, 99 (9): 5836-5841.

6. Nguyen Thi Thanh Thuy, Nguyen Duy Bay, Nguyen Quang Xu, Vu Duc

Quang, Tran Duy Quy, Bui Chi Buu, Varapong Chamarerk, Surapong

Sarkarung and Henry T. Nguyen, (2000). Genetic evaluation of several

characteristics of drought resistance in selected rice line. Proceedings of

18th Conference of Asian Federation of engineering organizations.

ASEAN Engineering Cooperation for the Development of the New

Millennium: 458-462.

7. Obara O. P. and S. Kako (1998). Genetic diversity and identification of

Cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic

DNA (RAPD) markers. Euphytica, 99: 95-1001.

8. Rohlf F., (1997). NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate

analysis system, 2.1 edn. Department of Ecology and Evolution, State

University of NY, Stony Brook.

9. Wong S. C., Yiu P. H., Bong S. T. W., Lee H. H., Neoh P. N. P. and

Rajan A., (2009). Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using

Microsatellite Markers. American Journal of Agricultural and Biological

Sciences, 4 (4): 298-304.

10. Yu S. B., Xu W. J., Vijayakumar C. H., Ali J., Fu B. Y., Xu J. L., Jiang

Y. Z., Marghirang R., Domingo J., Aquino C., Virmani S.S., and Li Z. K.,

(2003). Molecular diversity and multilocus organization of the parental

lines used in the International Rice Molecular Breeding Program. Theor.

Appl. Genet, 108: 131-140.

77 ANALYZING GENETIC DIVERSITY OF NATIVE DROUGHT

TOLERANT RICE VARIETIES IN VIETNAM BY

MICROSATELLITE MARKERS

Nguyen Thi Minh Nguyet1, Nguyen Thi Nhai1, Nguyen Thi Thanh Thuy2, Nguyen Thuy Diep1, Kieu Thi Dung1, Nguyen Thi Thao3, Khuat Huu Trung1

SUMMARY

Analyzing genetic diversity of native drought tolerant rice varieties in

Vietnam (including 39 local rice varieties tolerant to drought and IR64-

reference variety which is sensitive to drought) by SSR markers showed that:

These drought tolerant rice varieties have diversity about allele components.

The results using 23 SSR markers for analyzing genetic diversity of 40

varieties have obtained 82 differences alleles, with an average of 3.57 alleles

per SSR loci. The ratio of rare allele is 8.7% (2 rare alleles occur at RM3467

and RM5811). PIC value changed from 0.22 to 0.77 (with a mean of 0.56)

which showed high diversity of the studied SSR loci. The ratio of

homozygosity of native drought tolerant rice varieties are very different in 23

SSR loci. The heterozygosity changed from 0-14.29% (with an average of

3,45%). The genetic similarity coefficients of 40 varieties were ranging from

0.02 to 0.91. Genetic similarity was determined using Jaccard’s similarity

coefficients and final dedrogram construction using a UPGMA clustering

methods showed that 40 varieties were divided into four major groups, which

shows great diversity among varieties. Based on genetic clustering result,

1 Agricultural Genetics Institute Author for correspondence: Tel: 84-4- 37540764; Fax: 84-4-37543196; Email: khuathuutrung@yahoo.com 2 Ministry of Agriculture and Rural Development 3 Hanoi National University of Education

Đề tài: Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR

Chủ đề:

Tiểu luận môi trường nông nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA: Axit abcisic

ADN: Acid deoxyribonucleic

AFLP: Amplified fragment length polymorphism

ARN: Acid ribonucleic

CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit

dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat

EtBr: Ethidium Bromide

EDTA: Etylen diamine tetra acetic acid

FAO: The World Food Organization

HSPs: Heat shock protein

IRRI: International Research Rice Institute

LEA: Late embryogenesis abundant protein

NTSYS: Numerial taxonomy system

PCR: Polymerase chain reaction

PIC: Polymorphic Information Content

QTL: Quantitative trait loci

RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA

RE: Restriction enzyme

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

SDS: Sodium dodecyl sunphate

SSR: Simple sequence repeats

STS : Sequence Tagged Site

TAE: Tris-acetat-acid EDTA

TE: Tris EDTA

WUE: Water use efficiency

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3

1.1. Vài nét sơ lƣợc về cây lúa ............................................................................................. 3

1.2. Khái niệm về hạn và phân loại hạn ............................................................................. 5

1.3. Ảnh hƣởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp ................................................... 7

1.4. Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu tính chịu hạn ở cây lúa ....................................... 10

1.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa .............................................................. 18

1.6. Chọn tạo giống lúa chịu hạn ...................................................................................... 24

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 30

2.1. Vật liệu ......................................................................................................................... 30

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 35

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 39

3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ................................................................................ 39

3.2. Kết quả phân tích đa hình tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị

phân tử SSR ........................................................................................................................ 40

3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn nghiên cứu ........ 47

3.4. Kết quả xác định các allele hiếm, allele đặc trƣng nhận dạng các giống lúa

trong tập đoàn nghiên cứu ................................................................................................ 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 57

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU

1

2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26