Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của một số cao chiết từ Podocarpus sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ CAO CHIẾT TỪ PODOCARPUS SP.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th S. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Hồng Vân

MSSV: 1151110422 Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong đồ án này do tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt. Mọi tham khảo dùng trong đồ án này đều

được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố. Mọi

sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo, hay gian trá, tôi xin chịu hoàn toàn

trách nhiệm.

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Vân

LỜI CẢM ƠN

Tôi chân thành cảm ơn Ban Gíam Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ

Chí Minh, thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi trường

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Phạm Minh Nhựt đã tận

tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói

chuyện, thảo luận về lĩnh vực sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, định hướng

nghiên cứu. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy.

Cuối cùng em xin cảm ơn thầy cô ở phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh

học- Thực phẩm- Môi trường, cùng bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để

em hoàn thành đồ án của mình.

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Vân

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. 1

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ 2

MỤC LỤC .............................................................................................................................. i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................... v

DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ vi

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 1

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2

4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................. 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................. 3

1.1. Giới thiệu Podocarpus sp. .................................................................................. 3

1.1.1. Phân loại ...................................................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái học ............................................................ 3

1.1.4. Công dụng của Podocarpus sp. .................................................................. 4

1.2. Thành phần hóa học của thực vật .................................................................... 5

1.2.1. Carbohydrate ............................................................................................... 5

1.2.2. Amino acid ................................................................................................... 5

1.2.3. Alkaloid ........................................................................................................ 6

1.2.4. Glycoside ...................................................................................................... 7

1.2.5. Steroid .......................................................................................................... 8

1.2.6. Tannin .......................................................................................................... 8

1.2.7. Isoprenoid (Terpene) ................................................................................... 9

1.3. Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật ............................................. 10

1.3.1. Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn ....................................... 10

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn ................................................................................. 10

1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật ................................................... 11

1.3.4. Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC ................................................. 13

1.4. Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình ........................................................... 14

Đồ án tốt nghiệp

1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy ........................................................ 14

1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da ................................................ 19

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................... 22

2.1. Địa điểm và thời gian ...................................................................................... 22

2.1.1. Địa diểm ..................................................................................................... 22

2.1.2. Thời gian.................................................................................................... 22

2.2. Vật liệu .............................................................................................................. 22

2.2.1. Nguồn mẫu ................................................................................................ 22

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ...................................................................................... 22

2.2.3. Hóa chất, môi trường ................................................................................ 22

2.2.4. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................ 23

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 24

2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu..................................................... 24

2.3.2. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn ...................... 24

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống ....................................................... 25

2.3.4. Phương pháp ngâm mẫu .......................................................................... 25

2.3.5. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)

2.3.6. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC ............................ 26

2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học ........................................... 27

2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 27

2.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 28

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao ................................................................................................................... 29

2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau ......................................................................................... 33

2.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) ........................................................................ 36

2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp. ................ 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 46

3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao .. 46

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp. với các dung môi khác nhau ............................................................................................ 47

3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. ............................................................................................................ 54

3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp. ................................. 56

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 58

Đồ án tốt nghiệp

4.1. Kết luận ............................................................................................................ 58

4.2. Đề nghị .............................................................................................................. 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 60

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ETEC: Enterotoxigenic Escherichia coli

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

MIC: Minimal Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

DMSO: dimethysulfoside

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng vi sinh vật .................................................................................................................... 52 Bảng 3. 2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. ........................................................................................................... 54 Bảng 3. 3. Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. ...... 56

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH Hình 1. 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus .......................................................... 4 Hình 1. 2. Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi ............................................ 14 Hình 1. 3. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân ....................................... 15 Hình 1. 4. Hình ảnh của Salmonella .......................................................................... 16 Hình 1. 5. Hình ảnh Vibrio cholerae .......................................................................... 17 Hình 1. 6. Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử ................. 18 Hình 1. 7. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa ......................................................... 19 Hình 1. 8. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus ................................................... 20 Hình 1. 9. Hình ảnh Enterococcus feacalis ............................................................... 21 Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu .................................................................................... 24

Hình 2. 2.Quy trình chung .......................................................................................... 28 Hình 2. 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao ..................................................................................................................................... 29 Hình 2. 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o ...................................................... 30 Hình 2. 5 .Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o ..................................................... 31 Hình 2. 6. Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o ..................................................... 31 Hình 2. 7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn ........... 33 Hình 2. 8 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ................................................. 35 Hình 2. 9. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. ........................................................................................................... 36 Hình 2. 10. Kết quả MIC của ETEC .......................................................................... 38 Hình 2. 11 . Kết quả MIC của E.coli O157:H7 ......................................................... 38 Hình 2. 12. Quy trình xác định thành phần hóa học .................................................. 39 Hình 2. 13. Thử nghiệm carbohydrate và saponin ..................................................... 40 Hình 2. 15 Thử nghiệm flavonoid .............................................................................. 42 Hình 2. 16 . Thử nghiệm phenolic ............................................................................. 43 Hình 2. 17 . Thử nghiệm tannin ................................................................................. 44 Hình 2. 18 . Thử nghiệm steroid ................................................................................ 45 Hình 3. 1. Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp. của một số dung môi ................... 46

Hình 3. 2. Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml............................................................. 47 Hình 3. 3 . Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml .................................................................... 48 Hình 3. 4. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml............................................................ 49 Hình 3. 5 . Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml ................................................................ 50 Hình 3. 6. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml .... 51

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Từ ngày xưa, con người đã biết tận dụng các loại cây cỏ trong tự nhiên để

phục vụ vào cuộc sống hằng ngày như làm thực phẩm,… và đặc biệt là trong chữa

bệnh. Tài nguyên cây thuốc là một trong số những tài sản vô giá mà thiên nhiên ban

tặng cho con người. Những thầy thuốc giỏi chữa được nhiều căn bệnh hiểm nghèo

thường có một kiến thức rất uyên thâm về cây thuốc và các công dụng của chúng,

cây thuốc sau khi được đem về sẽ được phơi khô và chủ yếu ngâm với nước sắc làm

thuốc uống, thuốc này trị được nhiều bệnh và như một bài thuốc dân gian nó vẫn

tồn tại cho tới ngày nay.

Xã hội ngày càng phát triển thì tỷ lệ dịch bệnh ngày càng tăng và đa dạng thì

việc tạo ra loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên có hiệu quả cao đồng thời không có tác

dụng phụ là điều hết sức cần thiết. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam có nhiều nhà

khoa học nghiên cứu về cây thuốc, đi sâu tìm hiểu từng hoạt chất có trong cây cỏ có

trong các bài thuốc dân gian. Bên cạnh đó, các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa

trở nên rất phổ biến và phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng

sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng

thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn

giúp ta tạo ra một phương pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số

bệnh thông thường.

Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và bước đầu xác định thành phần hóa học của

một số cao chiết từ Podocarpus sp.”

2. Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây Podocarpus sp. với nhiều dung môi

khác nhau

Đồ án tốt nghiệp

Xác định thành phần hóa học của cây Podocarpus sp. với nhiều dung môi

khác nhau.

3. Nội dung nghiên cứu

Đánh giá ảnh hưởng của một số dung môi đến hiệu suất thu hồi từ

Podocarpus sp.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số dung môi từ Podocarpus sp.

Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC của Podocarpus sp.

Xác định thành phần hóa học của một số dung môi từ Podocarpus sp.

4. Phạm vi nghiên cứu

Các khảo sát thực hiện trên dung môi ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol

90%, nước, methanol 75%.

Chỉ khảo sát cây thuốc với mức độ chi Podocarpus sp.

Giới hạn khảo sát chỉ trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu Podocarpus sp.

1.1.1. Phân loại

Giới : Plantae

Ngành : Pinophyta

Lớp : Pinopsida

Bộ : Pinales

Họ : Podocarpaceae

Chi : Podocarpus

Tên tiếng Việt: Thông lông gà; Thông nàng; Bạch tùng; Mạy hương; Savat;

Songo; Nori; Tran; Ngo ri; Sri; Vra panh; Ca do; O ri

Có khoảng 105 loài trong chi này. Dạng sống chủ yếu của thực vật trong chi

này là cây gỗ thường xanh và cây bụi. Chi này có 2 phân chi là là Podocarpus và

Foliolatus.

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Bạch tùng là loài cây gỗ có kích thước lớn, thân tròn đều, dáng thân thẳng

đẹp, cao đến 30 m và đường kính 50 - 60 cm. Vỏ thân xám trắng, vỏ bên trong màu

đỏ sáng với nhựa nâu, dát gỗ màu kem. Thân cành lan rộng và các nhánh thấp hơn

thường rủ xuống. Nhựa màu đỏ-cam, thơm, trên cây non, lá mọc xếp thành hai dãy

như lông chim, dài khoảng trên dưới 1 cm, còn trên cây già, lá hình vẩy nhỏ, đầu

nhọn. Tán rậm màu xanh đậm. Hạt hình trứng, dài 0,5-0,6 cm, bóng.( Vũ Văn

Dũng).

1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái học

Chi này có 2 phân chi là Podocarpus và Foliolatus

Phân chi Podocarpus thường thấy ở các khu rừng thuộc Tasmania, New

Zealand, nam Chile, một vài loài (nhưng hiếm thấy) ở vùng cao nguyên nhiệt đới

Đồ án tốt nghiệp

châu Phi và châu Mỹ. Phân chi Foliolatus thường thấy phân bố tự nhiên ở châu Á

và châu Úc. Ở Việt Nam, cây mọc ở rừng nhiệt đới ẩm thường xanh, giữa các độ

cao 300 - 2400 m. Phân bố rải rác ở một số nơi, như đã gặp ở vùng Quảng Ninh

(Hoành Bồ), Lào Cai (Sa Pa), Nghệ An (Pù Mát), Quảng Bình, Quảng Trị, Khánh

Hoà và Lâm Đồng. Cây còn mọc ở một số nơi vùng Tây Nguyên như Gia Lai, Kon

Tum và Đắc Lắc. Phân bố của loài rất thưa thớt, không tìm thấy cây mọc thành

quần thụ hoặc thành đám, tái sinh tự nhiên chủ yếu ở chỗ trống, ven đường đi. Gây

trồng khó và sinh trưởng chậm. Bạch tùng đã được trồng thử tại Đà Lạt, song sắc lá

màu vàng chứng tỏ sinh trưởng kém. Một số cây con cũng đã được trồng thử tại

Mang Linh trong những năm vừa qua. Cây mọc chậm, sống lâu, ưa sáng, lúc nhỏ

cần che bóng (Vũ Văn Dũng, 1996).

Hình 1. 1.Hình ảnh cây Podocarpus imbricatus

1.1.4. Công dụng của Podocarpus sp.

Một số loài Podocarpus được sử dụng trong y học cổ truyền cho các bệnh

như sốt, ho, viêm khớp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục. Một loại thuốc hóa

trị liệu được sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu được làm từ Podocarpus. Một số

loài Podocarpus được trồng làm cây vườn, hoặc hàng rào, thường cho tán lá xanh,

bao gồm P.macrophyllus, dương xỉ, hoặc P.kusamaki, P. salignus từ Chile,

và P. nivalis, cây bụi đỏ cho trái nhỏ hơn. Gỗ bạch tùng đẹp, màu vàng nhạt hay

màu nghệ, thớ mịn, có giá trị, dễ gia công chế biến, được khai thác mạnh ở khắp nơi

Đồ án tốt nghiệp

để dùng làm gỗ xây dựng và trần nhà, sàn nhà. Tỷ trọng đạt 0,56. Không thuộc loại

gỗ bền, tốt nhưng đẹp và hiếm nên vẫn được ưa dùng.

1.2. Thành phần hóa học của thực vật

1.2.1. Carbohydrate

1.2.1.1. Khái niệm

Carbohydrate là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O.

Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong

bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở

thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ.

1.2.1.2. Tính chất

Carbohydrate có thể chia thành 3 nhóm:

- Monosaccharide: glucose, fructose

- Disaccharide: saccharose, lactose, maltose

- Polysaccharide: tinh bột, cellulose

Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng

nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt, khi vào cơ thể

xuất hiện tương đối nhanh trong máu.

1.2.1.3. Vai trò

- Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật

- Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose,…)

- Bảo vệ (Mucopolysaccharide)

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể).

1.2.2. Amino acid

1.2.2.1. Khái niệm

Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức

chung: (H2N)x – R – (COOH)y

1.2.2.2. Tính chất

Đồ án tốt nghiệp

Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ

tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ

200 – 3000C.

1.2.2.3. Vai trò

Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α-amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các

loại protein của cơ thể sống

Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật

Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật

Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013).

1.2.3. Alkaloid

1.2.3.1. Khái niệm

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino

acid, đa số có nhân dị vòng

1.2.3.2. Tính chất

Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như

base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất

yếu như caffein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có

phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản

ứng acid yếu như arecaidin, guvacin.

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alcaloid ra khỏi muối của nó bằng

những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi

định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để

lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp.

Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.

1.2.3.3. Vai trò

Đồ án tốt nghiệp

- Alkaloid co tác dụng diệt khuẩn

- Tác động lên hệ thần kinh

- Hạ huyết áp

- Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011)

1.2.4. Glycoside

1.2.4.1. Khái niệm

Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên, cấu trúc của các hợp

chất này gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường. Phần đường của

glycoside gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin.

Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường

1.2.4.2. Tính chất

Glycoside là dạng tinh thể không màu.

Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì

vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme

(men) có chứa trong cây. Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid

hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose. Trong thành phần của

một số glycoside có đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong

glycoside tim). Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ

khác nhau ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen…đôi khi có các

aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa cacbon, hydro, oxy. Do đặc tính

dễ bị phân huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường

gặp nhiều khó khăn.

Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác

dụng của chúng.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.5. Steroid

1.2.5.1. Khái niệm

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của

bốn vòng cycloalkane được nối với nhau

1.2.5.2. Tính chất

Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

hợp

Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocacbon Diel.

1.2.5.3. Vai trò

Steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Cho đến nay,

người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được

sử dụng trong y học.

Thường dùng làm các thuốc kích thích (Pedro Aqueveque và ctv, 2005).

1.2.6. Tannin

1.2.6.1. Khái niệm

Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết

bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino axit và

alkaloid)

1.2.6.2. Đặc điểm

Tannin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn,

glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.

Tannin kết hợp với protein không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng

chiết ra được bằng dung dịch kiềm. Tannin tủa bông trắng với dung dịch gelatin.

Tannin tủa với alkaloid, muối kim loại nặng như ch́ì, thuỷ ngân, kẽm, sắt.

Với muối sắt những tannin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với đậm độ

Đồ án tốt nghiệp

khác nhau. (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu - nhỏ

muối sắt III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tannin).

1.2.6.3. Vai trò

Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu

Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng

Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Katie E. Ferrell và ctv, 2006).

1.2.7. Isoprenoid (Terpene)

1.2.7.1. Khái niệm

Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo

thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8. Ngoài các hydrocacbon không no, các dẫn

xuất của chúng như ancol, andehyd, ceton, cacboxylic acid cũng được gọi là tecpen.

Tuỳ theo số nguyên tử cacbon trong mạch hydrocacbon, người ta phân chúng thành

các nhóm: monoterpen, secpuiterpen, diterpen, triterpen, tetraterpen, polyterpen.

Trong đó monoterpen là quan trọng nhất trong terpenoid. Nó có cấu trúc mạch hở,

mạch vòng.

Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo

mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh.

1.2.7.2. Tính chất

Terpene hường nhẹ hơn nước, chất lỏng không màu có mùi thơm. Không hòa

tan hoặc ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol.

1.2.7.3. Vai trò

Terpene là thành phần chính của các loại tinh dầu của nhiều loại cây và hoa.

Tinh dầu được sử dụng rộng rãi như là chất phụ gia hương vị tự nhiên cho thực

phẩm, như nước hoa nước hoa, và trong y học và thuốc thay thế như hương liệu .

Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoid đa dạng của

Đồ án tốt nghiệp

các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các

chất phụ gia thực phẩm. Vitamin A là một terpene. (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.3. Tổng quan về hợp chất kháng khuẩn thực vật

1.3.1. Khái niệm hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn

Hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật

có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, bằng cách tác động ở

mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của

vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng, thường có tác dụng đặc

hiệu với một nồng độ rất nhỏ.

Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid,

flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu (Nguyễn Thị Hiền và ctv, 2010).

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn

Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: tác động lên quá trình

tổng hợp vách tế bào làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp

suất thẩm thấu.

Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): cơ chế làm

mất chức năng của màng, các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với

receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính

xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn

cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm

refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành

mRNA (RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA

gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình

Đồ án tốt nghiệp

nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic

acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm

ức chế quá trình tạo acid nucleic (Amoros và ctv, 1992).

1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật

1.3.3.1. Alkaloid

a. Solamargine

Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum

khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung chống lại sự lây

nhiễm khi đã mắc phải HIV.

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên

quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy.

b. Berberine

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella, tụ cầu khuẩn,

nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn axit. Ngoài ra có còn chống

lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng

khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do

khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các

nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi

khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số

thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra

bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột.

1.3.3.2. Terpenoid và tinh dầu

Các loại terpenoid tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng

hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic. Phá vỡ vách tế

bào. Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động

vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu

Đồ án tốt nghiệp

có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. Các acid

betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được

HIV. Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện

diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria

monocytogenes.

1.3.3.3. Phenol đơn và acid phenolic

Phenolic được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp

chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự

tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein.

a. Quinone

Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân

trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó

khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn.

Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở

thành tế bào và các enzyme trên màng.

b. Tannin

Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein

chức năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin

(Hisanori Akiyama và ctv, 2001).

c. Flavonoid

Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức

với thành tế bào vi khuẩn. Các flavonoid càng ưa béo có khả năng phá vỡ màng tế

bào vi sinh vật. Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn

khi có mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố

đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng

hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của

vi khuẩn (Cushnie T. P và Lamb A. J, 2006).

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.4. Lectin và polypeptide

Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh

vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật

chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi

chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất.

1.3.3.5. Saponin

Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae.

Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn (Michał

Arabski và ctv, 2012).

1.3.4. Khái niệm nồng độ ức chế tối thiểu MIC

1.3.4.1. Khái niệm

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimal Inhibitory concentration) là nồng độ

thấp nhất của một kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nồng

độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định.

1.3.4.2. Cách xác định

Muốn biết vi khuẩn nhạy với kháng sinh ở nồng độ chính xác là bao nhiêu, ta

phải làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp. Kháng sinh có thể

được pha loãng với phương pháp:

- Agar well diffusion method

- Disc diffusion method

Ta có thể xác định MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự

tăng trưởng của vi khuẩn, quan sát được bằng mắt trần

Đồ án tốt nghiệp

1.3.4.3. Ý nghĩa

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất

của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi

trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).

Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt

đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng

mắt thường đã có thể xác định được điều này.

1.4. Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình

1.4.1. Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.4.1.1. Escherichia coli

a. Đặc điểm

Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống

ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi

trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường

glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.

Hình 1. 2. Hình ảnh Escherichia coli dưới kính hiển vi

b. Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli

EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột.

EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở

trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ.

ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột.

EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào.

Đồ án tốt nghiệp

EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột (Cao

Minh Nga, 2014).

1.4.1.2. Shigella

a. Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh

ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường

nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và

chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.

Hình 1. 3. Ảnh chụp của Shigella sp. trong một mẫu phân

b. Khả năng gây bệnh của một số Shigella

Gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm:

Nhóm A: S. dysenteriae: tiết độc tố shiga

Nhóm B: S. flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga- like- toxin)

Nhóm C: S. boydii: không tiết độc tố

Nhóm D: S. sonnei: tiết độc tố giống shiga. (Cao Minh Nga, 2014)

1.4.1.3. Salmonella

a. Đặc điểm

Đồ án tốt nghiệp

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường

tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân tạo

thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và chuyển

hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.

Hình 1. 4. Hình ảnh của Salmonella

b. Khả năng gây bệnh của một số Salmonella

S. typhi: gây sốt thương hàn

S. choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp- xe khu trú ở các cơ quan nội

tạng

S.enteridis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014)

1.4.1.4. Vibrio

a. Đặc điểm

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose

trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1. 5. Hình ảnh Vibrio cholerae

b. Khả năng gây bệnh của một số Vibrio

Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh. Hầu hết các chủng gây

bệnh có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết

thương hở và gây nhiễm trùng huyết. Tiếu biểu như Vibrio alginolyticu gây nhiễm

trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ quan của động vật như cá nóc. V.

cholera là tác nhân gây bệnh tả. V. harveyi là một tác nhân gây bệnh của một số loài

động vật thủy sinh. Vibrio parahaemolyticus ăn phải vi khuẩn có trong hải sản sống

hoặc nấu chưa chín, thường là hàu, là nguyên nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính,

nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra, nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản

gây ra.

1.4.1.5. Listeria

a. Đặc điểm

Listeria là một vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Có

thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau sống, trái

cây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1. 6. Hình chụp Listeria monocytogenes bằng kính hiển vi điện tử

b. Khả năng gây bệnh

Các bệnh của người trong chi Listeria thường do Listeria monocytogenes gây

ra. Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên

bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong. Một số triệu chứng liên quan với bệnh listeriosis

bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn. Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh,

người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh listeriosis.

c. Một số Listeria

Listeria innocua

L. monocytogenes

L. welshimeri… (Jemmi và Stephan, 2006)

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.4.2.1. Pseudomonas aeruginosa

a. Đặc điểm

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều

môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số

những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong

công nghệ sinh học.

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không

có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng,

không quang hợp hoặc cố định nitrogen.

Hình 1. 7. Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa

b. Khả năng gây bệnh

Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và

con người. Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ

thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của

Đồ án tốt nghiệp

người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông

thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các

cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử

vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ

thể. Bên cậnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao

gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên

nhân gây ra viêm chân lông.

1.4.2.2. Staphylococcus aureus

a. Đặc điểm

Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi.

Hình 1. 8. Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus

b. Khả năng gây bệnh

Staphylococcus aureus là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm

khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da

được tìm thấy ở cả mũi và da. (Ogston A, 1984)

1.4.2.3. Enterococcus feacalis

a. Đặc điểm

Đồ án tốt nghiệp

Enterococcus feacalis: Gram dương,lên men glucose, sinh acid làm giảm pH

môi trường. Không tạo độc tố, và không tạo ra một phản ứng catalase với hydrogen

peroxide. Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase nếu trên môi trường thạch

máu.

Hình 1. 9. Hình ảnh Enterococcus feacalis

b. Khả năng gây bệnh

E. faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm

trùng đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian

2.1.1. Địa diểm

Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam

Rông, tỉnh Lâm Đồng.

Thí nghiệm: Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học- Thực phẩm- Môi

trường, Trường Đại học Công nghệ TpHCM.

2.1.2. Thời gian

Từ tháng 3/2015 đến 8/2015

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn mẫu

Cây thuốc dân gian (tự nhiên) thu ở Lâm Đồng gồm lá, thân, cành của cây

Podocarpus sp.

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị

- 4 chủng Escherichia coli spp.

- 4 chủng Salmonella spp.

- 4 chủng Vibrio spp.

- 3 chủng Shigella spp.

- Pseudomonas aeruginosa

- Staphylococcus aureus

- Enterococcus feacalis

2.2.3. Hóa chất, môi trường

Dung môi DMSO (dimethysulfoside) (Trung Quốc)

Methanol (Trung Quốc)

Ethanol (Trung Quốc)

Cồn (Việt Nam)

Đồ án tốt nghiệp

Nước cất (Việt Nam)

NaCl (Đức)

Môi trường TSA, TSB (Trung Quốc)

Agar (Việt Nam)

2.2.4. Dụng cụ, thiết bị

Tủ cấy vô khuẩn

Autoclave

Tủ ấm, Tủ lạnh

Tủ sấy

Máy lắc

Máy đo OD

Cân điện tử, Cân phân tích

Bếp điện

Phễu

Giấy lọc

Bình tam giác

Pipette loại 100 – 1000 μl.Đầu típ loại 100- 1000 μl

Ống nghiệm

Que cấy trang, que cấy vòng

Đèn cồn, đĩa petri

Parafilm.

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu

Lá, thân, cành cây Podocarpus sp.

Rửa sạch

Phơi khô đến trọng lượng không đổi

Xay mẫu thành bột mịn

Hình 2. 1. Quy trình xử lý mẫu

Lá, thân, cành của Podocarpus sp. được thu thập từ vùng Lâm Đồng rửa sạch

và phơi khô trong không khí tới khi có trọng lượng không đổi. Các mẫu phơi khô

được cắt thành miếng nhỏ và sau đó nghiền thành bột. Bột mẫu được đựng trong túi

nhựa và được lưu trữ trong một nơi kín khí chuẩn bị cho công việc tiếp theo

(Moses, A.G, 2013).

2.3.2. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi khuẩn

Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt

hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo

quản.

Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp.

Môi trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật

phát triển, đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với

môi trường.

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành:

- Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh

- Lấy sinh khối vi sinh vật cho vào chai môi trường

- Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên

làm đục môi trường nuôi cấy)

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống

Hiện nay có 3 cách giữ giống:

- Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho

VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử

dụng cho sản xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày.

- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh,

hút vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch

và giữ cặn. Bổ sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ

-40C. Giống này được sử dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian

sử dụng từ 1 – 3 tháng.

- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ - 180C: cách làm tương tự như trên

nhưng bảo quản ở nhiệt độ - 180C. Giống này khi sử dụng để chuyển về -40C

trước khi cấy sang thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 6 tháng – 1 năm.

2.3.4. Phương pháp ngâm mẫu

Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu

Nguyên tắc: sử dụng dung môi để tách chiết các hợp chất trong thực vật nhờ

lực liên kết hóa học

Tiến hành:

- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi cho vào erlen, ngâm 24h, lọc, thu dịch

lần 1

- Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

Đồ án tốt nghiệp

2.3.5. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết dựa trên phương

pháp khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) các hợp chất kháng khuẩn

có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn

chỉ thị. Nếu các hợp chất trong cây có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện

vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.

Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ

106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút

đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng

kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ.

Dùng 100 µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa

tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm.

Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng

kháng khuẩn.

2.3.6. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất

của kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi

trường nuôi cấy (phương pháp định lượng).

Nguyên lý: Nồng độ kháng sinh tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt

đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, và bằng

mắt thường đã có thể xác định được điều này.

Phương pháp xác định chỉ số MIC của cao chiết dựa trên phương pháp

khuếch tán trên đĩa thạch của (Aibinu và ctv, 2007) tại các nồng độ cao chiết khác

nhau, các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết khuếch tán vào trong môi trường

agar cũng khác nhau và cùng tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nồng độ cao chiết thấp

nhất mà tại đó chúng bắt đầu có khả năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng

kháng khuẩn xung quanh giếng thạch gọi là nồng độ ức chế tối thiểu.

Đồ án tốt nghiệp

Phương pháp được thực hiện như sau: Hút dịch vi khuẩn chỉ thị có mật độ

106 cfu/ml để trang trên đĩa TSA. Sau khi trang đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút

đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng

kim đã hấp tiệt trùng ghim các khối thạch ra bỏ.

Hút 100µl dịch cao chiết với nồng độ khác nhau, nhỏ vào các lỗ trên đĩa

thạch vừa tráng vi khuẩn chỉ thị, tiến hành dán parafilm để tránh nhiễm.

Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24 giờ và đo đường kính vòng

kháng khuẩn.

2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ

Podocarpus sp. bằng các phản ứng hóa học với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính

chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm

đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất.

Phương pháp xác định thành phần hóa học dựa theo phương pháp của Moses

A.G, 2013 và Phani Deepthi Yadav, 2013 bao gồm xác định thành phần hóa học

nhóm Carbohydrate bằng các thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Flehling, thử

nghiệm Barfoed; định tính Alkaloid bằng thử nghiệm Mayer, thử nghiệm

Dragendroff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Wagner; Saponin thử nghiệm Foam;

Cardiac glycoside gồm thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani;

Anthraquinone glycoside thử nghiệm Bontrager; Flavonoid gồm thử nghiệm

alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm ferric chloride; Phenolic gồm thử nghiệm

lead acetate, thử nghiệm gelatin; Tannin gồm thử nghiệm ferric chloride, thử

nghiệm lead acetate; Steroid gồm thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann

Burchard; Amino acid thử nghiệm Ninhydrin.

2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu

Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm

Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu.

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu Podocapus sp.

Xử lý mẫu

Cao chiết với các dung môi khác nhau

Xác định thành phần hóa học

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Xác định chỉ số MIC

Đọc kết quả

2.4. Bố trí thí nghiệm

Hình 2. 2.Quy trình chung

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết

Mẫu Podocapus sp.

Phơi khô, xay mịn

Ngâm methanol 75% (tỉ lệ 1:15, w/v)

Ngâm trong các dung môi (tỉ lệ 1:20, w/v)

Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90% Nước

Lọc

Ly tâm 4000 v/p

Cô quay 500C

Cô cách thủy(70 0C)

Thu cao

Cao methanol

Ethanol 50

Ethanol 70

Ethanol 90

Cao nước

cao

Hình 2. 3. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao

Cây Podocarpus sp. thu thập từ Lâm Đồng được đem chọn lựa, rửa sạch,

phơi khô trong không khí đến khi trọng lượng không đổi. Sau đó, mẫu cây được cắt

nhỏ, xay nhuyễn thành bột mịn. Bột cây tiếp tục được ngâm với các dung môi

ethanol, nước, methanol.

Đối với dung môi ethanol (50 %, 70 %, 90 %):

Đồ án tốt nghiệp

- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi ethanol (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen,

ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 1

- Bã + 100ml dung môi ngâm 24h, lọc, thu dịch lần 2

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

- Cô cách thủy ở 700C, thu cao.

Đối với dung môi nước:

- Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20,w/v) cho vào erlen,

ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 1

- Bã + 100ml dung môi ngâm 4h, lọc, thu dịch lần 2

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần

- Cô cách thủy ở 700C, thu cao

Hình 2. 4.Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 50o

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. 5 .Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 70o

Hình 2. 6. Dịch lọc qua các lần ngâm ethanol 90o

Đồ án tốt nghiệp

Đối với dung môi methanol (tỉ lệ 1:15, w/v) ngâm trong vòng 24 giờ. Sau đó

ly tâm 4000 v/p trong 10 phút thu được dịch lần 1, bã còn lại tiếp tục được ngâm

với methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 trong 24 giờ và ly tâm được dịch lần 2, làm tương

tự thu được dịch lần 3. Dịch ở cả 3 lần được thu hồi và đưa đến trường đại học

Khoa Học Tự Nhiên cơ sở Linh Trung quận Thủ Đức để tiến hành cô quay chân

không ở 500C tới khi thu được thể tích không đổi. Lượng dịch này sau đó được

đông khô ở -200C trong 3 ngày thu được cao chiết methanol. Mỗi nghiệm thức lặp

lại 3 lần.

Tiến hành đánh giá hiệu suất tách chiết cao ở mỗi nghiệm thức bằng công

thức:

H(%) = M1−M x 100 %

M1 (g): khối lượng cốc sau khi cô mẫu

M (g): khối lượng cốc ban đầu

m (g): khối lượng bột cao ban đầu

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Podocarpus sp. với

các dung môi khác nhau

Vi sinh vật chỉ thị

Tăng sinh trong TSB/ TSB+NaCl 1.5%

Lắc 150 vòng/phút,nhiệt độ phòng 18-24h

Đo OD 600nm

Pha loãng vi sinh vật đạt 106 cfu/ml Nước muối sinh lý

Hút 100µl vào đĩa petri chứa TSA/ TSA+NaCl 1.5%, trang đều

Đục lỗ trên môi trường TSA

Cao+DMSO 1%

Dịch cao (100 mg/ml) Nhỏ 100l dịch chiết vào giếng trên môi trường TSA

Ủ 370C, 24h

Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng đường kính vòng kháng Hình 2. 7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường tăng sinh:

- Môi trường TSB: 3g/100ml

- Môi trường dùng cho chủng Vibro: 3g TSB+ 1,5% NaCl

2.4.2.2. Tiến hành

Chuẩn bị 20 chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh.

Cấy 20 chủng vi khuẩn vào 20 chai môi trường

Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng và thu dịch

Dịch vi sinh vật sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm

Pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’

Trong đó:

C: mật độ vi sinh vật sau tăng sinh (đo OD)

V: thể tích cần cấy giống

C’: mật độ vi sinh vật 106 cfu/ml

V’: thể tích tăng sinh 10ml

 Tính V

Hút V vào ống nước muối sinh lý 10ml

Hút 1ml từ ống trên cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý

Hút 100l cho vào đĩa petri (chứa môi trường TSA), trang đều đĩa cho khô

Đục lỗ (d = 8 mm) trên đĩa petri đã cấy trang

Hút 100l dịch cao (cao+DMSO 1%) nồng độ 100- 200 mg/ml cho vào từng

giếng thạch

Ủ 37oC, 24h

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.3. Đọc kết quả

Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao (20 chủng vi khuẩn)

So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh

Nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn

chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn này tiếp tục thử nghiệm xác định

nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).

Hình 2. 8 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

a) cao chiết ethanol 70% với ETEC

b) cao chiết ethanol 70% với Listeria monocytogenes

c) cao chiết methanol 75% và nước với Vibrio harveyi

d) cao chiết ethanol 50% với Vibrio cholera

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao

chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng

thạch (agar well diffusion method)

Hình 2. 9. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp.

2.4.3.1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường tăng sinh:

- Môi trường TSB: 3g/100ml

- Môi trường dùng cho chủng Vibro: 3g TSB+ 1,5% NaCl

2.4.3.2. Tiến hành

Chuẩn bị chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh.

Cấy các chủng vi khuẩn vào chai môi trường

Đồ án tốt nghiệp

Lắc 150 vòng/phút, 18- 24h ở nhiệt độ phòng và thu dịch

Dịch vi sinh vật sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm

Pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’

Trong đó:

C: mật độ vi sinh vật sau tăng sinh (đo OD)

V: thể tích cần cấy giống

C’: mật độ vi sinh vật 106 cfu/ml

V’: thể tích tăng sinh 10ml

 Tính V

Hút V vào ống nước muối sinh lý 10ml

Hút 1ml từ ống trên cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý

Hút 100l cho vào đĩa petri (chứa môi trường TSA), trang đều đĩa cho khô

Dùng ống kim loại đục lỗ (d = 8 mm) trên đĩa petri đã cấy trang

Cao chiết ethanol 70 % được cân và pha loãng trong DMSO 1% theo dãy

nồng độ 100, 50, 25, 12.5 mg/ml

Hút 100l dịch cao (cao+DMSO 1%) cho vào từng giếng thạch. Mỗi nồng

độ được lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị

Ủ 37oC, 24h.

2.4.3.3. Đọc kết quả

Đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao

Đọc kết quả lần lượt từ đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp đến cao. Nồng độ

MIC được xác định ở đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp nhất xuất hiện vòng

kháng khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. 10. Kết quả MIC của ETEC

Hình 2. 11 . Kết quả MIC của E.coli O157:H7

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu Podocapus sp.

Ngâm trong H2SO4 10%

Ngâm trong DMSO 1%

Lọc

Alkaloid

Carbohydrate

Steroid, amino acid

Saponnin, cardiac glycoside, althraquinone

Flavonoid, phenolic compound, tannin

2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định thành phần hóa học Podocarpus sp.

Hình 2. 12. Quy trình xác định thành phần hóa học

Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong

khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong

để tiến hành thử nghiệm.

Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan

hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến

hành thử nghiệm.

2.4.4.1. Carbohydrate

Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm vào 5-6

giọt thuốc thử Molisch. Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm. Kết

quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm Feling: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Cho lần lượt 1 ml

thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100 mg cao chiết. Đun cách thủy trong 5

phút và đọc kết quả. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của CuO

Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml thuốc

thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả: Hình

thành kết tủa màu đỏ gạch

Hình 2. 13. Thử nghiệm carbohydrate và saponin

2.4.4.2. Alkaloid

Thử nghiệm Mayer: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm. Cho vài giọt

thuốc thử Meyer. Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành.

Thử nghiệm Dragendroff: Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm. Nhỏ vài

giọt thuốc thử Dragendroff. Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam.

Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml thuốc thử

Hager. Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng.

Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml thuốc

thử Wagner. Kết quả: Hình thành kết tủa màu nâu đỏ.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.4.3. Saponin

Thử nghiệm Foam: Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm, lắc mạnh. Kết quả:

Hình thành bọt ổn định.

2.4.4.4. Anthaquinone glycoside (thử nghiệm Bontrager)

Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm 2 ml H2SO4 loãng thêm H2O2 hoặc

FeCl3 và đun sôi 30 phút. Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc rồi thêm 3 ml

benzene và lắc đều rồi để yên. Tách lấy lớp benzene và thêm 2 ml ammonia 10% và

quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả: Xuất hiện màu đỏ.

2.4.4.5. Flavonoid

Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào

vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và

nước cất để so sánh. Thêm vài giọt HCl loãng  mất màu chứng tỏ có sự hiện diện

của flavonoid. Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho

HCl.

Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó cho dịch

mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm, bổ sung 5 ml

cồn 95%. Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện

của flavonoid.

Thử nghiệm Ferric chloride: Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt

thuốc thử Ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. 14 Thử nghiệm flavonoid

2.4.4.6. Phenolic

Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho 1,5 ml

Chì acetate 10%. Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.

Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm thêm một vài gelatin

1% . Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. 15 . Thử nghiệm phenolic

2.4.4.7. Tannin

Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và

thêm 2 ml NaCl 10%, cho vào 4 giọt ferric chloride 10%. Kết quả: Xuất hiện màu

xanh.

Thử nghiệm Lead acetate: Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm

2 ml NaCl 10%, cho vào 4 giọt Chì acetate. Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. 16 . Thử nghiệm tannin

2.4.4.8. Steroid

Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc. Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2

lớp. Đọc kết quả ở mặt phân cách:

- Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol

- Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid

Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm

2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc

theo thành ống nghiệm.Kết quả:

- Xuất hiện vòng màu xanh dương đậm hoặc xanh lá cây ở mặt phân cách:

steroid

- Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. 17 . Thử nghiệm steroid

2.4.4.9. Amino acid

Hút 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin rồi đun

sôi cách thủy trong 5 phút. Kết quả: Xuất hiện màu tím.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao

)

%

( t ấ u s u ệ i H

Ethanol 50 Ethanol 70 Ethanol 90

Nước Methanol

Hình 3. 1. Hiệu suất tách chiết từ Podocarpus sp. của một số dung môi

Dựa vào hình 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng hiệu suất tách chiết ở các dung

môi khác nhau có sự khác biệt. Hiệu suất tách chiết ethanol 50%, 70%, 90% không

có sự khác biệt, nhưng cao hơn hiệu suất tách chiết của nước, methanol 75% một

cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Kết quả tách chiết cao từ cây Podocarpus sp. cho thấy rằng sử dụng dung

môi ethanol 90% cho hiệu suất tách chiết cao nhất trong số 5 dung môi, hiệu suất

trung bình là 16,99%, kế đến hiệu suất tách chiết ethanol 50% là 16,33%, hiệu suất

tách chiết ethanol 70% là 15,82%, hiệu suất tách chiết nước là 11,99%. Cuối cùng,

hiệu suất tách chiết methanol 75% thấp nhất 11,56%.

Qua kết quả trên có thể thấy hiệu suất tách chiết của dung môi ethanol là tối

ưu. Điều này cho thấy dung môi ethanol hòa tan được nhiều hoạt chất của cây

Podocarpus sp. hơn các dung môi khác.

Đồ án tốt nghiệp

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Podocarpus sp.

với các dung môi khác nhau

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ Podocarpus

sp. được trình bày ở hình 3.2.

3.2.1. Nhóm Escherichia coli spp.

)

m m

( ế h c c ứ g n ù v

b b

í

h n k g n ờ ư Đ

Ethanol 50

Ethanol 70

Ethanol 90

Methanol Ciprofloxacin

Nước

Escherichia coli O157:H7

Escherichia coli 0208

Escherichia coli

Enterotoxigenic E.coil-ETEC

Hình 3. 2. Hoạt tính kháng khuẩn của Echerichia coli spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500g/ml

Dựa vào hình 3.2. chúng tôi nhận thấy rằng trong 5 loại cao chiết từ các dung

môi khảo sát chỉ có 2 loại cao chiết từ dung môi ethanol 70%, 90% có thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn trong nhóm E.coli khảo sát.

Đối với cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. phổ kháng khuẩn của

chúng khá rộng đối với nhóm E.coli spp., chúng kháng được 3/4 chủng E.coli khảo

sát. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện thông qua đường kính

vòng kháng khuẩn cũng mạnh nhất trong các loại cao chiết khảo sát (đường kính từ

8,5 mm đến 13,7 mm). Trong khi đó đối với cao chiết ethanol 90% chỉ kháng 1/4

chủng là Echerichia coli với đường kính vùng ức chế 8,67 mm.

Qua kết quả khảo sát trên chúng tôi nhận thấy đối với nhóm E.coli spp. cao

chiết ethanol 70% kháng tốt nhất so với các cao chiết bằng các loại dung môi khác.

Đồ án tốt nghiệp

Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có

ý nghĩa so với hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin nồng độ

500g/ml (P < 0,05).

3.2.2. Nhóm Salmonella spp.

)

m m

( ế h c c ứ g n ù v

í

h n k g n ờ ư Đ

Ethanol 50% Ethanol 70% Ethanol 90%

Methanol Ciprofloxacin

Nước

500mg/ml

Salmonella dublin

Salmonella enteritidis

Salmonella typhii

Salmonella typhimurium

Hình 3. 3 . Hoạt tính kháng khuẩn của Salmonella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml

Dựa vào hình 3.3. chúng tôi thấy rằng tất cả các dung môi đều có hoạt tính

kháng khuẩn với 4 chủng Salmonella spp., tuy nhiên các dung môi kháng với mức

độ khác nhau.

Kết quả này cho thấy cao chiết ethanol 50 % có phổ kháng khuẩn khá rộng

3/4 chủng gồm S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, đường kính vùng ức chế 9

mm. Cao chiết ethanol 70% kháng 2/4 chủng Salmonella khảo sát với đường kính

vùng ức chế 7,5 – 8,5 mm. Đối với cao chiết ethanol 90% cũng có phổ kháng khuẩn

rộng 3/4 chủng Salmonella thể hiện qua đường kính vùng ức chế từ 8,33 mm đến 9

mm. Trong khi đó cao chiết nước chỉ ức chế 1 chủng là S.typhii, đường kính vùng

ức chế 8,83 mm. Cao chiết methanol 75% ức chế S.enteritidis, S.typhii,

S.typhimurium, đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các loại cao chiết (10

mm).

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy nhóm Samonella spp. dung môi

methanol 75 % là ức chế tốt nhất so với các dung môi khác. Mặc dù vậy khi so sánh

với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 g/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết methanol 75% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

3.2.3. Nhóm Shigella spp.

)

m m

( ế h c c ứ g n ù v

í

h n k g n ờ ư Đ

Ethanol 50

Ethanol 70

Ethanol 90

Methanol

Nước

Ciprofloxacin 500mg/ml

Shigella boydii

Shigella flexneri

Shigella sonnei

Hình 3. 4. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Shigella spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml

Dựa vào hình 3.4. chúng tôi thấy rằng tất cả các dung môi đều có hoạt tính

kháng khuẩn với nhóm Shigella spp., đặc biệt Shi.boydii, Shi.flexneri bị ức chế bởi

cao chiết dung môi ethanol 50%, 90%, methanol 75%.

Đối với cao chiết ethanol 50% phổ kháng khuẩn rộng đối với nhóm Shigella

spp., ức chế 2/3 chủng Shigella với đường kính vùng ức chế từ 8,83 mm đến 9,83

mm. Cao chiết ethanol 70% chỉ ức chế Shi.flexneri với đường kính vùng ức chế

10,17 mm. Ngoài ra, cao chiết ethanol 90% ức chế 2/3 chủng Shigella khảo sát và

đường kính vùng ức chế 8,5 - 9,67 mm. Cao chiết nước chỉ ức chế một chủng duy

nhất là Shi.sonnei với đường kính vùng ức chế 10 mm. Cuối cùng, cao chiết

methanol 75% cũng có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế 2/3 chủng thể hiện qua đường

kính vùng ức chế 9,83 - 10,83 mm.

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả trên cho thấy rằng đối với nhóm Shigella spp., cao chiết ethanol

50%, 90%, methanol 75% đều ức chế tốt, 2/3 chủng Shigella khảo sát. Tuy nhiên,

khi so sánh với kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của

các cao chiết đều thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

3.2.4. Nhóm Vibrio spp.

)

m m

( ế h c c ứ g n ù v

í

h n k g n ờ ư Đ

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Ethanol 50

Ethanol 70

Ethanol 90

Methanol Ciprofloxacin

Nước

8mg/ml

Vibrio alginolyticus

Vibrio cholerae

Vibrio harveyi

Vibrio parahaemolyticus

Hình 3. 5 . Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Vibrio spp. với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml

Dựa vào hình 3.5., chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết từ Podocarpus sp.

kháng tất cả các chủng Vibrio khảo sát, đặc biệt chủng Vibrio cholerae bị ức chế

bởi cao chiết ethanol 50%, 70%, methanol 75% và Vibrio parahaemolyticus bị ức

chế bởi cao chiết ethanol 50%, 90%, methanol 75%.

Kết quả này cho thấy cao chiết 50% kháng Vibrio cholera với đường kính

vùng ức chế 8,33 mm, V. parahaemolyticus với đường kính vùng ức chế 8,33 mm.

Đặc biệt, cao chiết ethanol 70% phổ kháng khuẩn khá rộng với nhóm Vibrio, chúng

kháng được 3/4 chủng. Đồng thời hoạt tính kháng khuẩn của chúng thể hiện qua

đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các dung môi khảo sát (đường kính từ

8,17 mm đến 10,17 mm). Cao chiết ethanol 90% chỉ kháng V. parahaemolyticus với

đường kính vùng ức chế 8,17 mm. Cao chiết nước kháng V.harveyi với đường kính

Đồ án tốt nghiệp

vùng ức chế 14 mm. Đối với cao chiết methanol 75% kháng 2/3 chủng Vibrio khảo

sát, với đường kính vùng ức chế 9,33 mm.

Kết quả này cho thấy đối với nhóm Vibrio spp. hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết ethanol 70% tốt nhất gồm Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae , Vibrio

harveyi. Mặc khác, hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% thấp hơn một

cách có ý nghĩa so với kháng sinh Ciprofloxacin 8 g/ml (p < 0,05).

c c c

3.2.5. Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác

)

m m

( ế h c c ứ g n ù v

í

h n k g n ờ ư Đ

Ethanol 50

Ethanol 70

Ethanol 90

Methanol Ciprofloxacin

Nước

500mg/ml

Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus

Enterococcus feacalis

Listeria innicua

Listeria monocytogenes

Hình 3. 6. Hoạt tính kháng khuẩn của nhóm Listeria spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác với các dung môi khác nhau và kháng sinh Ciprofloxacin 500 g/ml

Dựa vào hình 3.6. nhận thấy tất cả dung môi đều có hoạt tính kháng khuẩn

với các vi sinh vật khảo sát, tuy nhiên mức độ kháng khuẩn của từng dung môi thì

khác nhau. Đặc biệt Pseudomonass aeruginosa, S.aureus đều bị ức chế bởi cao

chiết dung môi ethanol 50%, 90%, methanol 75%.

Đối với cao chiết ethanol 50% từ Podocarpus sp. kháng 2/5 chủng vi sinh vật

khảo sát với đường kính vùng ức chế 8 - 8,5 mm. Cao chiết ethanol 70% cũng

kháng 2/5 chủng vi sinh vật thể hiện qua đường kính vùng ức chế 8,33 - 9,33 mm.

Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, cao chiết ethanol 90% cũng kháng 2/5 chủng vi sinh vật khảo sát với

đường kính vùng ức chế 8 - 8,67 mm. Trong khi cao chiết nước chỉ kháng 1 chủng

là S.aureus với đường kính vùng ức chế 8,17 mm. Cuối cùng, cao chiết methanol

75% kháng đực 2 chủng với đường kính vùng ức chế mạnh nhất trong các loại cao

chiết (đường kính 9 - 9,5 mm).

Kết quả trên cho thấy đối với các vi sinh vật khảo sát, hoạt tính kháng khuẩn

của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp. tốt nhất so với các dung môi khác.

Nhưng khi so với kháng sinh Ciprofloxacin thì hoạt tính kháng khuẩn của các cao

chiết ethanol 70% thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Ethanol

STT

Chủng

Ethanol 50 %

Ethanol 70 %

90 % Nước

Methanol 75 %

8.83

1 2 3

8.50

8.67

13.17

9.33 7.50

4 5 6 7 8 9

8.50

8.33 9.00

8.33

10.00 10.00

9.00 9.00

10.17

8.67 9.67 8.50

10.00 10.83 9.83

9.00 9.83 8.83

9.33

8.33

10 11 12 13 14 15 16

8.17 9.50 10.17

10.00 14.00

8.17

9.33

8.33

8.67 8.00

8.17

9.50 9.00

8.50 8.00

18 19 20

Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coil- ETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis Đường kính giếng d = 8 mm

Bảng 3. 1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi trên 20 chủng vi sinh vật

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào bảng 3.1. chúng tôi nhận thấy Podocarpus sp. có phổ hoạt động

rộng (4 - 11 chủng), đặc biệt là cao chiết ở dung môi ethanol 70% kháng 11/20

chủng. Tuy nhiên đường kính vòng kháng khuẩn của Podocarpus sp. tương đối hẹp

(8 – 14 mm).

Podocarpus sp. có khả năng kháng đều trên các vi sinh vật.

Cao chiết ethanol 50% phổ kháng khuẩn rộng, kháng được 9/20 chủng vi

sinh vật chỉ thị, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella

boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass

aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Tiêu biểu là cao chiết ethanol 70% phổ kháng khuẩn rộng nhất 11/20 chủng

vi sinh vật và hoạt tính kháng khuẩn thể hiện qua đường kính vùng ức chế lớn, ức

chế Escherichia coli, ETEC, Listeria monocytogenes, Salmonella dublin, S.typhii,

Shigella flexneri, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus.

Cao chiết ethanol 90% ức chế Escherichia coli, Salmonella enteritidis,

S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio parahaemolyticus,

Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Trong khi đó, cao chiết nước có phổ kháng khuẩn hẹp nhất 4/20 chủng vi

sinh vật khảo sát, ức chế Salmonella typhii, Shigella sonnei, Vibrio harveyi,

Staphylococcus aureus.

Cuối cùng, cao chiết methanol có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, kháng

9/20 chủng vi sinh vật, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium,

Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass

aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Cao chiết từ cây Podocarpus sp. tập trung kháng nhóm Salmonella spp.,

Shigella spp., Vibrio spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác. Vì những lý do trên

Podocarpus sp. ứng dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột.

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ cây

Podocarpus sp. bằng các dung môi môi khác nhau thì cao chiết ethanol 70% có hoạt

tính sinh học khá cao so với một số loại thực vật khác khi đánh giá hoạt tính kháng

khuẩn đối với cùng một số chủng vi sinh vật chỉ thị. Như vậy, dung môi ethanol

70% được sử dụng để tách chiết cao từ Podocarpus sp. để xác định chỉ số MIC và

xác định thành phần hóa học.

3.3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ

Podocarpus sp.

Sử dụng kết quả kháng khuẩn ở thử nghiệm trên làm cơ sở cho việc lựa chọn

chủng nào tiếp tục khảo sát nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).

Bảng 3. 2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp.

Chủng MIC(mg/ml)

Escherichia coli O157:H7 50

Escherichia coli 100

Enterotoxigenic E.coil - ETEC 12.5

Listeria monocytogenes 50

Salmonella dublin 100

Salmonella typhii 50

Shigella flexneri 25

Vibrio alginolyticus 50

Vibrio cholerae 50

Vibrio harveyi 12.5

Pseudomonass aeruginosa 50

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào bảng 3.2. nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết

ethanol 70% có giá trị khác nhau. Đầu tiên, nhóm Escherichia coli spp. nhạy hơn

các nhóm vi sinh vật khác, nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 - 100 mg/ml, trong đó

Escherichia coli O157:H7 12,5 mg/ml. Listeria monocytogenes nồng độ ức chế tối

thiểu là 50 mg/ml. Nhóm Salmonella spp. nồng độ ức chế tối thiểu 50 -100 mg/ml.

Shigella flexneri nồng độ ức chế tối thiểu 25 mg/ml. Nhóm Vibrio spp. nhạy hơn

các nhóm vi sinh vật khác, nồng độ ức chế tối thiểu 12,5 - 50 mg/ml, trong đó

Vibrio harveyi 12,5 mg/ml. Pseudomonass aeruginosa nồng độ ức chế tối thiểu 50

mg/ml.

Từ đó thấy rằng cao chiết ethanol 70% kháng tốt với chủng Escherichia coli

O157:H7, Vibrio harveyi.

Theo nghiên cứu của cây Rosmarinus officinalis L. đối với chủng

Lis.monocytogenes của Rozman (2009) là 2,5 mg/ml, trong khi đó giá trị cao chiết

ethanol 70% từ Podocarpus sp. là 50 mg/ml. Ngoài ra trong nghiên cứu của Salem

(2014) về ethanol 70% của cây Sycomorus đối với Shi.flexneri là 30 mg/ml, còn với

Podocarpus sp. là 25 mg/ml. Nghiên cứu của Mon (2011) về giá trị MIC của cây

A.Japonica với V.cholerae là 5 mg/ml, còn giá trị cao chiết ethanol 70% từ

Podocarpus sp. là 50 mg/ml.

Từ kết quả khảo sát trên có thể thấy chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70%

trên 11 chủng vi sinh vật cao hơn so với nghiên cứu khác. Nguyên nhân do dung

môi tách chiết khác nhau, phương pháp khác nhau và một số yếu tố khách quan

khác nên giá trị MIC khác nhau.

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học Podocarpus sp.

Bảng 3. 3. Thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ Podocarpus sp.

Thành phần hóa học

Carbohydrate

Alkaloid

Saponin Anthraquinone

Flavonoid

Phenolic compound

Tannin

Steroid

Amino acid Thử nghiệm Molisch Fehling Benedict Mayer Dragendroff Hager Wagner Foam test Bontrager Alkaline Shinoda Ferric clorid Lead aceate Gelatin Ferric clorid Lead acetate Salkowski Libermann Ninhydrin Ethanol 70% + + + - - - - + - + + + + + + + Sterol Sterol -

(+): dương tính

(-): âm tính

Dựa vào bảng 3.3. chúng tôi nhận thấy rằng thành phần hóa học Podocarpus

sp. bao gồm carbohydrate, saponin, flavonoid, phenolic, tannin, steroid.

Các thử nghiệm alkaloid, anthraquinone, amino acid đều cho kết quả âm tính

Những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn thực vật gồm alkaloid, saponin,

flavonoid, phenolic, tannin. Steroid phá vỡ vách tế bào của vi sinh vật. Hợp chất

phenolic, flavonoid, tannin có chức năng phá vỡ tế bào của vi sinh vật, tạo phức hợp

với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và có khả năng tương tác với DNA nhân

Đồ án tốt nghiệp

thực của vi sinh vật. Hợp chất alkaloid có khả năng xen vào thành tế bào hoặc DNA

của vi sinh vật và ức chế chúng. Podocarpus sp. gồm các hợp chất kháng khuẩn

flavonoid, phenolic, tannin, các hợp chất này giúp ức chế một số vi sinh vật gây

bệnh.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Cao chiết ethanol 50% từ cây Podocarpus sp. có hoạt tính kháng khuẩn 9/20

chủng vi sinh vật khảo sát gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium,

Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass

aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli, ETEC,

Listeria monocytogenes, Salmonella dublin, S.typhii, Shigella flexneri, Vibrio

alginolyticus, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus.

Cao chiết ethanol 90% ức chế Escherichia coli, Salmonella enteritidis,

S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii, Shi.flexneri, Vibrio parahaemolyticus,

Pseudomonass aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Cao chiết nước có phổ kháng khuẩn hẹp nhất 4/20 chủng vi sinh vật khảo sát,

ức chế Salmonella typhii, Shigella sonnei, Vibrio harveyi, Staphylococcus aureus.

Cao chiết methanol có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, kháng 9/20 chủng vi

sinh vật, gồm Salmonella enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, Shigella boydii,

Shi.flexneri, Vibrio cholera, V.parahaemolyticus, Pseudomonass aeruginosa,

Staphylococcus aureus.

Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của dịch chiết ethanol 70% từ cây

Podocarpus sp. từ 25 mg/ml đến 100 mg/ml.

Thành phần hóa học Podocarpus sp. bao gồm carbohydrate, saponin, cardiac

glycosides, flavonoid, phenolic, tannin, steroid.

4.2. Đề nghị

Tôi đề nghị tiến hành thử nghiệm xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

(MBC- minimal bactericidal concentration) của Podocarpus sp. với các dung môi

khác nhau.

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thay thế phương pháp

khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) bằng phương pháp MIC

trong môi trường lỏng (ống nghiệm) để có thể chia nhỏ nồng độ, thu hẹp, dể xác

định chính xác giá trị MIC hơn.

Định danh xác định loài Podocarpus

Định lượng thành phần hóa học chứa trong cây Podocarpus sp.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Vũ Văn Dũng. 1996. Cây rừng Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà

Nội, Việt Nam

Cao Minh Nga, 2014. Thực tập vi sinh học. Nhà xuất bản giáo dục,67,68

Bài giảng Dược liệu Tập I, 1998, Trường đại học y dược TPHCM

Ngô Văn Thu, 2011. Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà

Nội

Phạm Thanh Kỳ và cs, 1998. Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học

Dược Hà Nội

Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y

học

Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I.

Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật

Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam”, tập II,

Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

Trumbo P, Schlicker S, Yates AA, Poos M; Food and Nutrition Board of the

Institute of Medicine, The National Academies. Dietary reference intakes for

energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids.J

Am Diet Assoc

Nguyen Tien Hiep, Pan Ke Loc, Nguyen Duc To Luu, PI Thomas, A. Farjon,

L. Averyanov & J. Regalado Jr. 2004. Vietnam Conifers: Conservation Status

Review 2004. Fauna & Flora International, Vietnam Programme, Hanoi.

Đồ án tốt nghiệp

Abdillahi, HS, et al. (2011). Anti-inflammatory, antioxidant, anti-tyrosinase

and phenolic contents of four Podocarpus species used in traditional medicine in

South Africa. Journal of Ethnopharmacology 136(3), 496-503.

Jean BRUNETON Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants -

Technique & Documentation - Lavoisier, 1995 (Translated by Caroline K. Hatton)

Austin, B. & D.A. Austin. 1993. Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed

and wild fish, 2nd edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester

Jemmi, T., and Stephan, R.,2006, Listeria monocytogenes: food-borne

pathogen and hygiene indicator. Science Magazine Vol (25):571-580

Katie E. Ferrell; Thorington, Richard W. (2006). Squirrels: the animal

answer guide. Baltimore: Johns Hopkins University Press. 91.

Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre, and M. Cormier (1992), In vitro antiviral

activity of propolis. Apidologie 23:231–240.

Pedro Aqueveque và ctv, (2005). Favolon B, a New Triterpenoid Isolated

from the Chilean Mycena sp. Strain 96180, The Journal of Antibiotics 58, 61–64.

Hisanori Akiyama và ctv, (2001). Antibacterial action of several tannins

against Staphylococcus aureus, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 487-

491.

Cushnie T. P và Lamb A. J; (2006). Antimicrobial activity of flavonoids, Int

J Antimicrob Agents; 26(5):343-56.

Michał Arabski và ctv, (2012). Effects of Saponins against Clinical E. coli

Strains and Eukaryotic Cell Line, Journal of Biomedicine and Biotechnology

Mon M. M.,Maw S. S. and Oo Z. K. (2011), Screening of antioxidant, anti-

tumor and antimicrobial herbal drugs/diets from some Myanmar traditional herbs,

International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics.

Đồ án tốt nghiệp

Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity ò rosemary extracts

(Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae

Slovenica.

Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014),

Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some

pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology.

Aibinu và ctv (2007). “In vitro antimicrobial activity of crude extracts from

plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata”. Afr. J. Traditional,

Complementary and Alternative Medicines, 4 (3): 338 - 344.

Moses A.G., Erastus G., Leonard G. and Henry R., Preliminary

Phytochemical screening of eight selected medicinal herbs used for the treatment of

diabetes, Malaria and Pneumonia in Kisii Region, Southwest Kenya. Euroean

Journal of Applied Sciences Vol(5):01-06, 2013

Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in

sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of

Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia.

Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D. (2012), Evaluation of selected

medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial

activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG

KHUẨN CỦA PODOCARPUS SP. VỚI CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

A.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 50%

Chủng

Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Ethanol 50% Lần 1 Lần 2 Lần 3 9.5 8.5 9 9.5 9.5 8.5 8 8.5 8 8.5 9.5 9.5 10 9 8.5 8 8.5 8 9 9 8.5 10 8 8 9 8.5 8

A.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70%

Chủng

Ethanol 70% Lần 1 Lần 2 Lần 3 9 8.5 13.5 8.5 8.5 11 9 8.5 15

Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli (K) Enterotoxigenic E.coil- ETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 10 7.5 9 10.5 9 9 10.5 8 9.5 7.5 7.5 10 8 10 10.5 8.5 8.5 7.5 9 10 7.5 9.5 9.5 8.5

Đồ án tốt nghiệp

A.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 90%

từ Podocarpus sp.

Chủng

Escherichia coli (K) Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Ethanol 90% Lần 1 Lần 2 Lần 3 8.5 8 9 9 9 9 8 8.5 8 8.5 9 9 8.5 10 8.5 8.5 9 8 9 8 9 8.5 10 8 8 8.5 8

A.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước từ

Podocarpus sp.

Chủng

Salmonella typhii(K) Shigella sonnei Vibrio harveyi Staphylococcus aureus Cao nước Lần 1 Lần 2 Lần 3 8.5 10 14.5 8.5 8.5 10 13.5 8.5 8 10 14 7.5

A.5. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol

75% từ Podocarpus sp.

STT Chủng

1 Lần 1 Lần 2 Lần 3 - - -

2 3 4 - - - - - - - - -

5 6 - - - - - -

7 8 9 10 Escherichia coli 0157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli (K) Enterotoxigenic E.coil-ETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella 9.5 10.5 10.5 10.5 9.5 10.0 10.0 10.0 9.5

Đồ án tốt nghiệp

11 12 13 14 15 16 17 11.0 10.0 - 9.5 9.0 10.5 10.5 - 9.5 9.0 11.0 9.0 - 9.0 10.0

18 9.5 9.5 9.5

19 20 typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 9.0 - 9.0 - 9.0 -

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÍ SỐ LIỆU BẰNG PHẦN MỀM

STATGRAPHIC

B.1. Kết quả xử lí số liệu hiệu suất tách chiết cao của các dung môi

B.2. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Escherichia coli spp.

B.3. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Shigella spp.

B.4. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm Vibrio spp.

Đồ án tốt nghiệp

B.5. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với nhóm vi sinh vật gây bệnh khác

B.6. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Listeria monocytogenes

B.7. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella enteritidis

Đồ án tốt nghiệp

B.8. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella typhimurium

B.9. Kết quả xử lí số liệu của các dung môi khác nhau với Salmonella typhii (K)

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI

THIỂU CỦA PODOCARPUS SP.

C.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ

Podocarpus sp. (nồng độ 50,100 mg/ml)

STT Chủng

100 mg/ml Lần 2 Lần 1 Lần 3 50mg/ml Lần 2 Lần 3 Lần 1

1 2 3 13 10.5 15 11 15 10.5 11 10 10

4 5 13 14 13.5 11 10 11

6 7 8 9 11 9 11 10 11 11.5 10 11 11.5 8.5 10 9 10 9 9

10 11 12 13 14 15 16 11 11 10.5 11 12 11 10.5 12 11 11 10.5 11 10 9.5 9 9 10 11.5 9 8.5 9 10 8

Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coil- ETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes Salmonella Dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 18 19 20 8.5 11 11 8

8.5 11 C.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% từ

Podocarpus sp. (nồng độ 12,5, 25 mg/ml)

STT Chủng 25 mg/ml 12.5 mg/ml

Đồ án tốt nghiệp

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3

2 3

4 5 11 12 11 9.5 9 9

6 7

8 9

10 11 12 13 14 15 16 8 10 9 9 10 8 10 9.5

20 Escherichia coli 0157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli (K) Enterotoxigenic E.coil-ETEC Listeria innicua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhii(K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonass aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D: HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CIPROFLOXACIN

D.1. Hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin nồng độ 500 g/ml, nhóm Vibrio

spp. nồng độ 8 g/ml

STT Chủng TB TB Ciprofloxacin 500 g/ml Ciprofloxacin 8 g/ml Lần 1 Lần 3 Lần 3 Lần 2 Lần 1 Lần 2

1 13 13 13.5 13.17

2 12.5 12 12.5 12.33

3 13 13 13.5 13.17

4 Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli (K) Enterotoxigenic E.coli-ETEC

5 30.5 Listeria innocua 11.5 31 12 31.5 31.00 12.5 12.00

6 12 12 12.5 12.17

7 12 11.5 13 12.17

8 13.5 13 12.5 13.00

9 13 12 12.5 12.50

11 12 13 11 0 13 33.5 11 0 13 33 11 11.00 0.00 0 13.5 13.17 32.5 33.00

15 16 16 16.17 16.5 16 13 14 13.33 13 17.5 18 18.5 18.00

17 Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhi (K) Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus 11.5 11.5 11 11.33

18 Pseudomonas (K) 12.5 11.5 12.5 12.17

19 12 12 12.5 12.17

20 Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 12 11.5 12.5 12.00

Đồ án tốt nghiệp