Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia Bidoup Núi Bà, tı̉nh Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ

LOẠI CAO CHIẾT NƯỚC TỪ THỰC VẬT TẠI VƯỜN QUỐC GIA

BIDOUP NÚI BÀ, TỈNH LÂM ĐỒNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Pha ̣m Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

MSSV: 1211100244

: Trần Thi ̣ Tú Vy Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan những nội dung tôi viết trong đồ án này đều do tôi thực hiện

dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Phạm Minh Nhựt khoa Công nghệ sinh học –

Thực phẩm – Môi trường. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là

trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu

trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được thu thập từ

các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.

Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu

của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội

dung luận văn của mình.

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Tú Vy

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời tri ân đến thầy Phạm Minh Nhựt

đã tận tình chỉ dạy em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin cảm ơn thầy về

những buổi học trên lớp, những buổi nói chuyện, thảo luận, nhờ đó em đã củng cố

thêm sự đam mê và định hướng được nghiên cứu khoa học của mình.

Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Công nghệ sinh

học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho

em trong suốt quãng thời gian học tập tại Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.

Những kiến thức và kinh nghiệm này không chỉ giúp em thực hiện đồ án tốt nghiệp

mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này.

Em cũng xin cảm ơn thật nhiều những giúp đỡ và hỗ trợ từ các bạn cùng thực hiện

đề tài trong phòng thí nghiệm – những người luôn sát cánh, động viên em hoàn

thành đồ án tốt nghiệp.

Cuối cùng, em xin cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian

đọc và nhận xét đồ án. Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến thầy cô.

Do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp của em sẽ có nhiều

sơ sót, mong thầy cô chỉ bảo để em được hoàn thiện đồ án này thật tốt cũng như

củng cố kiến thức cho công việc sau này.

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Tú Vy

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

1. Đă ̣t vấ n đề ........................................................................................................ 1 2. Tı̀nh hı̀nh nghiên cứ u ...................................................................................... 2 3. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 4. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 3 5. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................ 3 6. Kết cấ u củ a Đồ á n tố t nghiê ̣p.......................................................................... 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 4

1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống ........................................ 4 1.1.1 Vai trò củ a cây thuố c nam trong đờ i sống ................................................ 4 1.1.2 Lơ ̣i ı́ch củ a viê ̣c sử du ̣ng thuố c ................................................................. 5 1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử du ̣ng cây thuốc nam ............................................................ 6 1.2 Thành phần hóa học của thực vật ............................................................ 7 1.2.1 Carbohydrate ........................................................................................... 7 1.2.1.1 Khái niệm ......................................................................................... 7

1.2.1.2 Tính chất .......................................................................................... 7

1.2.1.3 Vai trò .............................................................................................. 8

1.2.2 Amino acid .............................................................................................. 8 1.2.2.1 Khái niệm ......................................................................................... 8

1.2.2.2 Tính chất .......................................................................................... 9

1.2.2.3 Vai trò .............................................................................................. 9

1.2.3 Glycosides ............................................................................................... 9 1.2.3.1 Khái niệm ......................................................................................... 9

1.2.3.2 Tính chất ........................................................................................ 10

1.2.3.3 Tác du ̣ng ......................................................................................... 11 1.2.4 Alkaloid ................................................................................................. 11 1.2.4.1 Khái niệm ....................................................................................... 11

1.2.4.2 Tính chất ........................................................................................ 11

1.2.4.3 Vai trò ............................................................................................ 12

1.2.5 Steroids .................................................................................................. 12

1.2.5.1 Khái niệm ....................................................................................... 12

Đồ án tốt nghiệp

1.2.5.2 Tính chất ........................................................................................ 12

1.2.5.3 Vai trò ............................................................................................ 12

1.2.6 Tannin ................................................................................................... 14 1.2.6.1 Khái niệm ....................................................................................... 14

1.2.6.2 Tı́nh chất ........................................................................................ 14 1.2.6.3 Vai trò ............................................................................................ 15

1.2.7 Isoprenoid (Terpene) .............................................................................. 15

1.2.7.1 Khái niệm ....................................................................................... 15

1.2.7.2 Tính chất ........................................................................................ 16

1.2.7.3 Vai trò ............................................................................................ 16

1.3 Tổng quan về kháng khuẩn thực vật ...................................................... 16 1.3.1 Khái niệm .............................................................................................. 16 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn............................................................................... 16 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật .................................................. 18 1.3.3.1 Alkaloids ........................................................................................ 18

1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu ................................................................... 20

1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic ........................................................... 21

1.3.3.4 Saponin .......................................................................................... 24

1.3.3.5 Lectin và polypeptide ..................................................................... 25

1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình .................................................... 25 1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy ..................................................... 25 1.4.1.1 Escherichia coli .............................................................................. 25

1.4.1.2 Shigella .......................................................................................... 26

1.4.1.3 Salmonella ...................................................................................... 27

1.4.1.4 Vibrio ............................................................................................. 28

1.4.1.5 Listeria ........................................................................................... 29

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da .............................................. 30 1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa ................................................................ 30

1.4.2.2 Staphylococcus aureus .................................................................... 32

1.4.2.3 Enterococcus feacalis ..................................................................... 33

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 34

Đồ án tốt nghiệp

2.1 Địa điểm và thời gian .............................................................................. 34 2.1.1 Địa diểm ................................................................................................ 34

2.1.2 Thời gian ............................................................................................... 34

2.2 Vật liệu ..................................................................................................... 34 2.2.1 Nguồn mẫu phân tích ............................................................................. 34 2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị ................................................................................... 35 2.2.3 Hóa chất, môi trường ............................................................................. 36 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 37 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu .................................................... 37 2.3.1 Phương pháp tăng sinh VSV chı̉ thi ̣ ....................................................... 37 2.3.2 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo OD ... 38 2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống ...................................................... 39 2.3.4 2.3.5 Phương pháp tách chiết cao.................................................................... 39 2.3.6 Chuẩn bi ̣ dung di ̣ch cao thuố c kháng sinh .............................................. 39 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) . 39 2.3.7 Phương pháp xác định thành phần hóa học ............................................ 41 2.3.8

2.3.8.1 Carbohydrate .................................................................................. 41

2.3.8.2 Alkaloid.......................................................................................... 41

2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam) ........................................................... 42

2.3.8.4 Cardiac glycosides .......................................................................... 42

2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager) .......................... 43

2.3.8.6 Flavonoid ....................................................................................... 43

2.3.8.7 Phenolic.......................................................................................... 43

2.3.8.8 Tannin ............................................................................................ 45

2.3.8.9 Steroid ............................................................................................ 45

2.3.8.10 Amino acid .................................................................................. 45

Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 46 2.3.9 2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiê ̣m tổ ng quá t ........................................................... 47 2.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiê ̣u quả chiết cao chủ a dung môi nướ c đố i vớ i

các mẫu cây .................................................................................................... 48 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết nước .. 50

iii

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.1 Thuyết minh quy trình .................................................................... 51

2.4.2.2 Đọc kết quả .................................................................................... 51

2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học của các cao chiết. .............. 52

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 54

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao 54

3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cá c mẫu cao chiết nướ c 55 3.2.1 Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn E. coli . 55 3.2.2 Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn Listeria 37 3.2.3 Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn Salmonella ...................................................................................................... 39

3.2.4 Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn

Shigella ........................................................................................................... 40 3.2.5 Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn Vibrio . 42 3.2.6 Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn gây

bệnh cơ hô ̣i trên da .......................................................................................... 44 3.2.7 Tổ ng hơ ̣p kết quả các kết quả kháng khuẩn ............................................ 45 3.3 Kết quả thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh xác định thành phần hóa học củ a cá c mẫu cao chiết nướ c ....................................................................................... 48

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 52

4.1 Kết luận ................................................................................................... 52 4.2 Đề nghị ..................................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 53

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Aco: cây thuốc Acorus sp.

Cal: cây thuố c Calamus sp.

CIP 8: kháng sinh Cirproflaxacin 8mg/ml

CIP 500: kháng sinh Cirproflaxacin 500mg/ml cây thuốc Elephatopus sp. Ele:

Euo: cây thuốc Euodia sp.

cây Eupatorium sp. Eup:

Lan: cây thuốc Lantana sp.

Med: cây thuốc Medinilla sp.

Pod: cây thuốc Podocarpus sp.

cây thuốc Polygala sp. Pol:

Ste: cây thuốc Streptocaulon sp.

Xid: cây thuố c Xidi klung

VSV: vi sinh vâ ̣t

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Mô ̣t số Glycoside phổ biến ....................................................................... 9

Bảng 3.1 Kết quả kháng khuẩn của các cao chiết khác nhau trên tổng số 20 chủng vi

sinh vật khảo sát .................................................................................................... 47

Bảng 3.2 Bảng kết quả thành phần hó a ho ̣c củ a các mẫu cao chiết nướ c ................ 49

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THI ̣

Hình 1.1 Một số cây thuốc nam phổ biến ................................................................. 4

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate ............................................ 8 Hı̀nh 1.3 Alanine – Mô ̣t amino acid ......................................................................... 8 Hı̀nh 1.4 Cardenolic và Bufadiennolid ................................................................... 11 Hı̀nh 1.5 Ephedrin và Hyoscyamin ....................................................................... 11 Hı̀nh 1.6Testosteron .............................................................................................. 12 Hı̀nh 1.7 Mô ̣t số tannin .......................................................................................... 14 Hı̀nh 1.8 Limonene và Ocimene ............................................................................ 15 Hình 1.9 Các cơ chế kháng sinh ............................................................................. 17 Hình 1.10 Solamargine .......................................................................................... 19

Hình 1.11 Berberine .............................................................................................. 20

Hình 1.12 Một số Terpenenes và Terpenoid .......................................................... 21

Hình 1.13 Một số Quinones thông thường ............................................................. 22 Hình 1.14 Gallotannin và Gallic acid ..................................................................... 23 Hình 1.15 Một số Flavonoid .................................................................................. 24 Hı̀nh 1.16 Saponin ................................................................................................. 24 Hı̀nh 1.17 Các cấu trú c củ a peptide........................................................................ 25 Hình 1.18 Hình ảnh Escherichia coli O157: H7 dưới kính hiển vi ......................... 26 Hình 1.19 Hı̀nh ảnh củ a Shigella sp. ...................................................................... 27 Hình 1.20 Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium ................ 28 Hình 1.21 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio cholerae và Vibrio harveyi ........................... 29 Hình 1.22 Hình ảnh củ a Listeria monocytogenes ................................................... 30 Hình 1.23 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa ...................................................... 31

Hình 1.24 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus ................................................ 32 Hı̀nh 2.1 Mô ̣t số du ̣ng cu ̣ và thiết bi ̣ thı́ nghiê ̣m ..................................................... 36 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu ............................................................................... 37 Hı̀nh 2.3 Hı̀nh ảnh về kết quả kháng khuẩn củ a mô ̣t mẫu vi khuẩn chı̉ thi ̣ (bên trái là không có kết quả kháng khuẩn và và bên phải là có kết quả kháng khuẩn) ............ 41 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................ 47

vii

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.5. Quy trình khảo đánh giá hiê ̣u quả chiết cao củ a dung môi nướ c đố i vớ i các mẫu cây. .......................................................................................................... 49 Hình 2.6. Dịch lọc qua các lần ngâm củ a các mẫu cây Xidi klung ......................... 49 Hình 2.7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn ........... 50

Hình 2.8. Quy trình xác định thành phần hóa học .................................................. 52 Hı̀nh 3.1. Hiê ̣u suất tách chiết các cao chiết nướ c .................................................. 54 Hı̀nh 3.2. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Escherichia coli. ................................................................................ 37 Hı̀nh 3.3. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Listeria spp. ...................................................................................... 38 Hı̀nh 3.4. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Salmonella spp. ................................................................................. 39 Hı̀nh 3.5. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Shigella spp. ...................................................................................... 41 Hı̀nh 3.6. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Vibrio spp. ......................................................................................... 43 Hı̀nh 3.7. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết nướ c đố i vớ i các vi khuẩn gây bê ̣nh về da ............................................................................................ 44

viii

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đă ̣t vấ n đề

Được đánh giá là bước ngoặc trong lịch sử Y học về điều trị các bệnh nhiễm

khuẩn, kháng sinh ra đời không chỉ được sử dụng trong y học mà còn được sử dụng

rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản nhằm mục đích tăng

trưởng. Việc sử dụng kháng sinh là hết sức cần thiết để điều trị cho người bệnh.

Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý, lạm dụng kháng sinh, điều

trị kháng sinh khi không mắc bệnh lý nhiễm khuẩn… đã làm gia tăng tình trạng

kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Viê ̣c la ̣m du ̣ng thuố c kháng sinh để la ̣i các tác ha ̣i rất lớ n. Mô ̣t trong những tác ha ̣i lớ n nhất đó là các VSV không cò n nha ̣y cảm vớ i thuố c, dẫn đến viê ̣c điều tri ̣ ngày càng khó khăn hơn. Ngoài ra, viê ̣c sử du ̣ng kháng sinh liều cao trong mô ̣t thờ i gian dài sẽ làm ảnh hưở ng đến chứ c năng củ a các cơ quan trong cơ thể, chẳng ha ̣n như sử du ̣ng chloraphicol vớ i liều cao sẽ gây suy tủ y. Thực tế, kháng sinh có phổ rộng tiêu diệt cả vi khuẩn xấu và tốt vì vậy nếu

dùng không đúng hướng dẫn, lạm dụng sẽ tiêu diệt cả khuẩn có lợi có trong đường

ruột, làm mất cân bằng mang tính tự nhiên của cơ thể. Một khi bị mất cân bằng,

khuẩn xấu hoành hành, dễ phát sinh nhiều bệnh nan y, như rối loạn dạ dày, làm cho

các chứng bệnh nghiêm trọng hơn và làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh.

Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi

trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những

chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt

tiền. Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua

đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc

và tỉ lệ tử vong cao ở các nước đang phát triển. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã

và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng

kháng sinh của vi khuẩn. Có thể nói rằng, vi khuẩn càng phơi nhiễm nhiều với

kháng sinh thì “sức ép về thuốc” càng lớn các chủng kháng thuốc càng có nhiều cơ

hội để phát triển và lây lan. Đă ̣c biê ̣t ở Viê ̣t Nam, tình trạng kháng thuốc diễn ra

Đồ án tốt nghiệp

trầm trọng hơn do việc sử dụng kháng sinh tùy tiện khi không có đơn của bác sỹ,

người dân có thể tự ý mua kháng sinh ở các hiệu thuốc. Không ít dược sỹ bán thuốc

không đúng quy định, các bác sỹ điều trị kê đơn thuốc lạm dụng kháng sinh, chỉ

định kháng sinh không phù hợp.

Do đó việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn mới có nguồn gốc tự nhiên

để thay thế kháng sinh tổ ng hơ ̣p trở thành một hướng nghiên cứu rất đáng quan tâm. Vận dụng điều đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng

khuẩn của một số loại cao chiết nước từ thực vật tại vườn quốc gia Bidoup Núi

Bà, tı̉nh Lâm Đồng”.

2. Tı̀nh hı̀nh nghiên cứ u

Từ thờ i xa xưa, cao chiết nướ c đã đươ ̣c ngườ i dân sử du ̣ng rô ̣ng rãi trong các bài thuố c tri ̣ bê ̣nh dân gian. Tuy nhiên, những bài thuố c dân gian đó chı̉ dư ̣a trên

kinh nghiê ̣m trải qua nhiều đờ i, chưa đươ ̣c chứ ng minh bằ ng thực nghiê ̣m khoa ho ̣c. Thờ i gian gần đây, nhu cầu tı̀m kiếm về mô ̣t hơ ̣p chất kháng sinh mớ i đã thú c đẩy sư ̣ nghiên cứ u về các công du ̣ng củ a các cây thuố c dân gian ngày càng nhiều hơn. Đã có rất nhiều công trı̀nh nghiên cứ u về tác du ̣ng ứ c chế VSV củ a các cao chiết nướ c. Parekh và ctv (2006) đã thực hiê ̣n công trı̀nh nghiên cứ u về tiềm năng củ a mô ̣t số mẫu cao chiết nướ c từ cây thuố c truyền thống ở Ấ n Đô ̣ để làm thuố c kháng khuẩn và từ kết quả nghiên cứ u đã cho ̣n ra đươ ̣c cây Bauhinia variegata tiếp tu ̣c nghiên cứ u ta ̣o thành chế phẩm thuố c.

Bassam Abu-Shanneb và ctv (2006) đã cũng đã nghiên cứ u về khả năng ứ c chế chủ ng Staphylococcus aureus kháng methicillin củ a cao chiết nướ c từ 4 cây thuố c dân gian ở Palestine. Ngoài ra, mô ̣t số công trı̀nh nghiên cứ u khác về khả năng kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c củ a Antara Sen và Amila Batra (2012); Akinvemi và ctv (2006),…

3. Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số cây thuốc dân gian với dung môi

là nước.

Đồ án tốt nghiệp

- Xác định thành phần hóa học có trong một số loại cao chiết nước từ các cây

thuốc dân gian.

4. Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của dung môi nước đến hiệu suất thu hồi từ các cây

thuốc dân gian.

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước của các cây thuốc dân

gian.

- Xác định thành phần hóa học của cao chiết nước của một số cây thuốc dân

gian.

5. Phạm vi nghiên cứu

Tiến hành thử nghiệm và khảo sát một số mẫu cây thuốc dân gian đươ ̣c lấy

từ vườ n quố c gia Bidoup, Nú i Bà, tı̉nh Lâm Đồ ng.

6. Nô ̣i dung Đồ á n tố t nghiê ̣p

Nô ̣i dung Đồ án tố t nghiê ̣p gồ m có 4 chương:

Chương 1: Tổng quan – Tó m tắ t tà i liê ̣u có liên quan đến đồ á n tốt nghiê ̣p. Chương 2: Phương phá p và nội dung nghiên cứ u Chương 3: Kết quả và thả o luận Chương 4: Kết luận và đề nghi ̣

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Vai trò của cây thuốc dân gian trong đời sống

1.1.1 Vai trò củ a cây thuố c nam trong đờ i số ng

Thuốc nam được coi như những di sản quý báu của dân tộc Việt Nam, danh y

Tuệ Tĩnh từng nói “Nam dược trị nam nhân” (thuốc nam chữa bệnh cho người

Nam). Từ xa xưa, cây thuốc nam gắn liền với cuộc sống của các gia đình người Việt

và có giá trị quý báu trong điều trị bệnh. Chỉ là những cỏ cây gần gũi thân quen

xung quanh con người cũng được sử dụng làm bài thuốc chữa bệnh đơn giản, thông

thường cho người Việt Nam. Ví dụ, ban đầu củ gừng, củ tỏi... chỉ được dùng với

mục đích nấu nướng để làm thay đổi và đa dạng hóa mùi vị, tạo ra những thức ăn

ngon miệng, nhưng dần dần về sau người ta nhận thấy chúng còn có khả năng làm

ấm bụng và dễ tiêu, làm hết đi lỏng do ăn phải những đồ sống lạnh...,

Hình 1.1 Một số cây thuốc nam phổ biến (từ trái sáng, trên xuống: lô hội, atiso, tía

tô, mã đề)

Đồ án tốt nghiệp

Trong dân gian thuốc nam có từ hơn 3.000 năm trước, cùng với sự phát triển

của y học cổ truyền. Nước ta có nhiều dược liệu, kể cả cỏ cây, động vật và khoáng

vật, trong đó có những thứ rất quý, cần được sưu tầm nghiên cứu và sử dụng để

phòng bệnh, chữa bệnh cho nhân dân. Trải qua kinh nghiệm quý báu của cha ông,

những bài thuốc nam có tác dụng trong chữa bệnh được lưu truyền từ đời này sang

đời khác và được áp dụng hiệu quả.

1.1.2 Lợi ı́ch củ a viê ̣c sử dụng thuố c

Trái với Tây y, Đông y xem toàn bộ thân thể người là một hệ thống hoàn

chỉnh. Học thuyết về kinh lạc, tử ngọ lưu chú đồ, học thuyết âm dương ngũ hành,

đều nhấn mạnh vào chỉnh thể. Từ góc nhìn ấy, Đông y tinh vi hơn Tây y.

Tất cả được khái quát lại bằng 7 lợi ích trọng yếu như sau:

- Trị bệnh theo các bài thuốc Đông y, tuy thời gian khỏi bệnh có tiến triển

chậm hơn, nhưng khi khỏi bệnh thì tỷ lệ tái phát rất thấp hơn so với những phương

pháp khác.

- Chữa bệnh Đông y trị bệnh từ gốc, Tây y trị bệnh ở ngọn.

- Tây y dùng chiết xuất từ dược liệu tự nhiên nhưng thành phần chủ yếu là tinh

chất và hàm lượng rất lớn nguyên liệu. Trong khi đó, các hoạt chất tồn tại trong mỗi

cây thuốc Đông y là phức hợp và liều lượng phù hợp. Vì vậy, khi dùng thuốc từ cây

cỏ hoa lá tự nhiên ngoài tác dụng chữa bệnh sẽ ít những phản ứng phụ gây hại cho

con người.

- Không gây tổn hại gan, thận như thuốc Tây bởi thuốc Đông y không sản sinh

độc tố nên ít gây tổn hại cho cơ thể.

- Nền y học phương Tây mặc dù có nhiều tiến bộ hơn châu Á và châu Phi,

nhưng khả năng đề kháng với các loại bệnh tật của họ lại yếu hơn người ở hai châu

lục này. Điều này chứng tỏ thói quen dùng thuốc Tây làm giảm đi khả năng miễn

dịch của cơ thể. Còn dùng thuốc từ cỏ cây hoa lá giúp cho hệ miễn dịch tốt hơn.

Đồ án tốt nghiệp

- Người dùng thuốc Tây nhiều có khả năng bị ung thư cao hơn gần 10 lần so

với người có thói quen dùng thuốc Đông y.

- Thuốc Tây tuy tiện lợi nhưng thời gian sử dụng là hữu hạn. Thuốc Đông y dễ

trồng, dễ tìm: Xung quanh chúng ta đâu đâu cũng là cây thuốc, vị thuốc hữu ích.

1.1.3 Tı̀nh hı̀nh sử dụng cây thuố c nam

Ngay từ thời xa xưa khi con người còn sống trong xã hội nguyên thủy, người

ta đã biết lựa chọn và sử dụng các loại cây cỏ sẵn có để làm thuốc chữa bệnh và bảo

vệ sức khỏe. Vốn kinh nghiệm này ngày càng được tích lũy, sàng lọc và bổ sung

thêm để tạo dựng nên một nền Y – Dược học cổ truyền có bản sắc riêng trong cộng

đồng các dân tộc Việt Nam. Và trên thực tế, nền Y học cổ truyền (YHCT) đó đã

đảm nhận vai trò chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của nhân dân và đồng hành cho đến

khi có Y học hiện đại (YHHĐ) du nhập vào nước ta.

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sự phát triển

của cây trồng nói chung. Một số vùng cao lại có khí hậu á nhiệt đới, phù hợp với

việc trồng cây thuốc ưa khí hậu mát. Đất đai ở miền núi nước ta, đặc biệt trên dãy

Trường Sơn rộng lớn, còn rất nhiều đất hoang chưa được khai thác sử dụng để phát

triển kinh tế. Theo N.B. Hoạt (2002), đất chưa sử dụng ở huyện Sa Pa (Lào Cai) còn

40.463 ha (chiếm 59,7% diện tích), trong đó có 8.874 ha đất có độ dốc dưới 200 có

thể khai thác cho sản xuất nông nghiệp, và 25.766 ha đất đồi núi chưa sử dụng. Từ

trước đến nay, nhiều địa phương trong nước ta đã có truyền thống trồng cây thuốc,

như Quế (ở Yên Bái, Thanh Hoá, Quảng Nam, Quảng Ngãi…), Hồi (ở Lạng Sơn,

Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu), Hoè (ở Thái Bình). Có những làng chuyên trồng

cây thuốc như Đại Yên (Hà Nội), Nghĩa Trai (Văn Lâm, Hưng Yên). Gần đây,

nhiều loài cây thuốc ngắn ngày cũng được trồng thành công trên quy mô lớn như Ác

ti sô, Bạc hà, Cúc hoa, Địa liền, Gấc, Hương nhu, Ích mẫu, Kim tiền thảo, Mã đề,

Sả, Thanh cao hoa vàng, Ý dĩ, vv.

Những số liệu trên cho thấy việc phát triển trồng cây thuốc ở nước ta có nhiều

tiềm năng và cho hiệu quả kinh tế cao. Cần giúp cho người dân biết cách chuyển đổi

Đồ án tốt nghiệp

cơ cấu cây trồng, kết hợp trồng rừng với trồng cây thuốc ở những nơi có khí hậu và

đất đai phù hợp, để nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống, góp phần tích cực trong

việc xoá đói giảm nghèo cho người dân ở vùng núi. Theo kinh nghiệm ở Sa Pa, thu

nhập từ trồng cây thuốc đạt 14-24 triệu đồng/ha/năm, trong khi thu nhập từ cây

lương thực chỉ đạt 2,4-4,8 triệu đồng/ha/năm (N.B. Hoạt, 2002).

1.2 Thành phần hóa học của thực vật

1.2.1 Carbohydrate

1.2.1.1 Khái niệm

Carbohydrate là một phân tử sinh học gồm các nguyên tử carbon (C), hydro

(H) và oxy (O), thường tỷ lệ nguyên tử hydro-oxy trong phân tử carbonhydrate là

2:1, công thức thực nghiệm Cm(H2O)n (thườ ng m = n). Một số trường hợp ngoại lệ tồn tại; ví dụ, deoxyribose, một thành phần đường của DNA, có công thức C5H10O4.

(John M. Coulter, C. R. Barnes, H. C. Cowles, 1930)

Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô

dự trữ.

Carbohydrate có thể chia thành 4 nhóm:

- Monosaccharide: glucose, fructose

- Disaccharide: saccharose, lactose, maltose

- Oligosaccharide: raffinose, kestose,, stachyose

- Polysaccharide: tinh bột, cellulose.

1.2.1.2 Tính chất

Chúng có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nước, đồng hoá và sử dụng nhanh

để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản đều có vị ngọt, khi vào cơ thể xuất hiện

tương đối nhanh trong máu.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của các loại Carbonhydrate

1.2.1.3 Vai trò

- Cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể thực vật

- Vai trò cấu trúc, tạo hình (Cellulose,…).

- Bảo vệ (Mucopolysaccharide).

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể).

1.2.2 Amino acid

1.2.2.1 Khái niệm

Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate. Công thức

chung: (H2N)x – R – (COOH)y.

Hı̀nh 1.3 Alanine – Mô ̣t amino acid

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2.2 Tính chất

Các amino acid là những chất rắn ở dạng tinh thể không màu, vị hơi ngọt, dễ

tan trong nước (do tồn tại kiểu muối nội phân tử). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ

200 – 3000C.

1.2.2.3 Vai trò

- Amino acid thiên nhiên (hầu hết là α-amino acid) là cơ sở để kiến tạo nên các

loại protein của cơ thể sống.

- Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất ở thực vật.

- Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật.

- Tăng khả năng ra hoa và quả (Trumbo P, 2013)

1.2.3 Glycosides

1.2.3.1 Khái niệm

Glycoside là dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên.

Glycoside là những hơ ̣p chất hữu cơ ta ̣o thành do sự ngưng tu ̣ giữa mô ̣t phân tử đườ ng vớ i mô ̣t phẩn tử không đườ ng khác như rươ ̣u, aicd, aldehide. Phenol,… Phần đường của glycosid gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc

genin.

Bả ng 1.1 Mô ̣t số Glycoside phổ biến

Glycoside Phân bố Tính chất

Không có vị đắng. Thủy phân tạo ra Hesperidin Cùi cam, chanh, đường rhamnose, glucose, quýt, bưởi C50H60O27 hssperiten.

Cà chua xanh, Solanin Vị đắng. Khi vào cơ thể bị thủy cà tím, khoai phân tạo HCN rất độc C45H17015 tây

Đồ án tốt nghiệp

Hạt mơ, hạt Amygdadin Vị đắng. Trong cơ thể người bị thủy hạnh nhân phân cho HCN gây độc C20H27O11 đắng, mận

Manihotin Vỏ, cùi củ sắn Khi thủy phân tạo HCN gây độc

1.2.3.2 Tính chất

Glycoside là dạng tinh thể không màu.

Phần đường và phần không đường liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy

phân tử glycosid dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men)

có chứa trong cây.

Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid,

thường là glucose, rhamnose, galactose. Trong thành phần của một số glycoside có

đường đặc biệt không có trong các glycoside khác (ví dụ trong glycosid tim).

Phần aglycon của các glycoside có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau

ví dụ cồn, andehyd, acid, phenol, dẫn chất anthracen…đôi khi có các aglycon có

chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa carbon, hydro, oxy. Do đặc tính dễ bị phân

huỷ, khó thu được ở dạng tinh khiết nên việc nghiên cứu cấu trúc thường gặp nhiều

khó khăn.

Tác dụng phụ thuộc vào phần aglycon, phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác

dụng của chúng.

Đồ án tốt nghiệp

Hı̀nh 1.4 Cardenolic và Bufadiennolid

1.2.3.3 Tá c dụng

- Hỗ trơ ̣ tim

- Hỗ trơ ̣ hê ̣ thần kinh

- Hỗ trơ ̣ các cơ quan trong cơ thể: gan, thân, cơ tim, các cơ.

1.2.4 Alkaloid

1.2.4.1 Khái niệm

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino

acid, đa số có nhân dị vòng. Alkaloid thườ ng đươ ̣c tı̀m thấy trong thực vâ ̣t và đôi khi còn tı̀m thấy trong cơ thể đô ̣ng vâ ̣t.

Một số dược liệu chứa alkaloid: cà độc dược, cà phê, chè, trinh nữ hoàng cung, vàng đắng,…

Hı̀nh 1.5 Ephedrin và Hyoscyamin

1.2.4.2 Tính chất

Đa số các alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như

base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin và cũng có chất tính base rất yếu như caffein, piperin… Vài trường hợp ngoại lệ có những allcaloid không có

phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromine và cá biệt cũng có chất có phản

ứng acid yếu như arecaidin, guvacin.

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng

những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, carbonate kiềm, NaOH…

Đồ án tốt nghiệp

Khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào

độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp.

Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.

1.2.4.3 Vai trò

- Alkaloid có tác dụng diệt khuẩn. - Tác động lên hệ thần kinh trung ương: morphin, codein, strychnin, cafein

- Hạ huyết áp: ajmalin, quinidlin

- Chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011)

1.2.5 Steroids

1.2.5.1 Khái niệm

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn

vòng cycloalkane được nối với nhau.

Hı̀nh 1.6Testosteron

1.2.5.2 Tính chất

Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

hợp.

Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocarbon Diel.

1.2.5.3 Vai trò

Đồ án tốt nghiệp

Steroid tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Cho đến nay,

người ta đã biết đến hàng chục nghìn steroid và trong số đó có hàng trăm chất được

sử dụng trong y học.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.6 Tannin

1.2.6.1 Khái niệm

Tannin là một hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết

bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và

alkaloid).

Hı̀nh 1.7 Mô ̣t số tannin

1.2.6.2 Tı́nh chất

Tannin thườ ng là bô ̣t vô đi ̣nh hı̀nh từ màu ngà vàng cho đến màu nâu sáng,

không mù i hoă ̣c mù i rất nhe ̣, vi ̣ rất chát, gây săn se niêm ma ̣c.

Tanin thườ ng là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung môi phân cư ̣c như nướ c, aceton, glycol, methanol, glycerin etylacetat,… không tan trong các dung môi kém phân cực hoă ̣c không phân cực như hexan, benzene, dầu hỏ a, diethyl ether,…

Tanin kết hợp với protein không tan trong nước và dung môi hữu cơ nhưng

chiết ra được bằng dung dịch kiềm. Tanin tủa bông trắng với dung dịch gelatin.

Đồ án tốt nghiệp

Tanin tủa với alcaloid, muối kim loại nặng như ch́ ì, thuỷ ngân, kẽm, sắt. Với

muối sắt những tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với đậm độ khác

nhau. (Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu - nhỏ muối sắt

III, kalibicromat 10%, tạo thành tủa nâu trên tế bào chứa tanin).

1.2.6.3 Vai trò

- Tannin bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu.

- Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng.

- Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy. (Katie E. Ferrell và Thorington và

Richard W, 2006).

1.2.7 Isoprenoid (Terpene)

1.2.7.1 Khái niệm

Isoprenoid là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo thành

từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8. Ngoài các hydrocarbon không no, các dẫn xuất của

chúng như alcol, andehyde, cetone, cacboxylic acid cũng được gọi là terpene.

Tuỳ theo số nguyên tử carbon trong mạch hydrocarbon, người ta phân chúng

thành các nhóm: monoterpene, secpuiterpene, diterpene, triterpene, tetraterpene,

polyterpene. Trong đó monoterpene là quan trọng nhất trong terpenoid. Nó có cấu

trúc mạch hở, mạch vòng.

Isoprenoid có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông và trong tinh dầu thảo

mộc như tinh dầu xả, quế, cam, chanh.

Hı̀nh 1.8 Limonene và Ocimene

Đồ án tốt nghiệp

1.2.7.2 Tính chất

Terpene thường nhẹ hơn nước, chất lỏng không màu có mùi thơm. Không hòa

tan hoặc ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol.

1.2.7.3 Vai trò

Terpene là thành phần chính của các loại tinh dầu của nhiều loại cây và hoa.

Tinh dầu được sử dụng rộng rãi như là chất phụ gia hương vị tự nhiên cho thực

phẩm, như nước hoa nước hoa, và trong y học và thuốc thay thế như hương liệu .

Biến thể tổng hợp và các dẫn xuất của tecpen thiên nhiên và terpenoids đa dạng của

các hương liệu được sử dụng trong nước hoa và hương vị được sử dụng trong các

chất phụ gia thực phẩm. Vitamin A là một terpene (Đỗ Tất Lợi, 2004).

1.3 Tổng quan về kháng khuẩn thực vật

1.3.1 Khái niệm

Kháng khuẩn thư ̣c vâ ̣t là tên go ̣i chung chı̉ các hơ ̣p chất hữu cơ có trong thực vâ ̣t có tác du ̣ng tiêu diê ̣t hay kı̀m hãm sư ̣ phát triển củ a VSV. Các chất kháng khuẩn thườ ng có tác du ̣ng đă ̣c hiê ̣u lên các loài VSV khác nhau ở mô ̣t nồ ng đô ̣ thương rất nhỏ .

Những tı́nh chất này có thể thuô ̣c nhiều cấu trú c hó a ho ̣c khác nhau như

alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu,…

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.9 Các cơ chế kháng sinh

Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn: vách tế bào của vi khuẩn

(đặc biệt là các vi khuẩn Gram dương) được cấu tạo bởi các phức hợp

peptidoglycan, phức hợp này được trùng hợp bởi các enzyme transpeptidases.

Các kháng sinh nhóm b - actamin gắn chọn lọc vào các transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn bị tan rã khiến vi khuẩn bị tiêu diệt.

Ức chế chức năng của màng tế bào (tổn thương màng tế bào): kháng sinh gắn lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn lọc khiến một số chất cần thiết cho vi khuẩn (nucleotid, pyrimidin, purin…) lọt ra ngoài, làm tổn hại và chết vi

khuẩn. Các KS nhóm polymycin, aminosid..

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với

receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính

xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.

Đồ án tốt nghiệp

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn

cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.

Tạo protein bất thường, vô dụng: Tetracyclin và aminoside có khả năng gắn

vào phần 30S của ribosom vi khuẩn, gây nên đọc sai mã của ARN - thông tin khiến

protein được tạo ra bất thường, vô dụng đối với đời sống của vi khuẩn.

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: bất hoạt RNA, DNA: Nhóm refampin

gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA

(RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm

cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xo ắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi

của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (ρ-aminobenzoic acid) có tác

dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm

trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế

quá trình tạo acid nucleic. (Amoros, M., F. Sauvager, L. Girre và M. Cormier,

1992).

Cạnh tranh đố i khá ng: Đây là kiểu tác dụng của các sunfonamit. Acid folic giữ vai trò cần thiết trong quá trình tổng hợp acid nucleic. Để tổng hợp ra acid folic,

một số vi khuẩn phải sử dụng acid paraaminobenzoic (PAB) có trong môi trường.

Sunfonamit có cấu trúc hóa học tương tự PAB nên đã cạnh tranh thay thế PAB, dẫn

đến ngừng tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn.

1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn thực vật

1.3.3.1 Alkaloids

Một số Alkaloid có hoạt tı́nh khá ng khuẩn

 Solamargine

Solamargine là một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác du ̣ng chống lại sự lây

nhiễm khi đã mắc phải HIV.

Đồ án tốt nghiệp

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan

trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy.

Hình 1.10 Solamargine

 Berberine

Berberine có trong cây hoàng liên chân gà, hoàng đằng, hoàng bá,…

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella, tụ cầu khuẩn, nhiều

vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại

một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn

hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn Berberine là do khả

năng gây đột biến RNA của vi khuẩn.

Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh

hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu

gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với

berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi

sinh vật đường ruột.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.11 Berberine

1.3.3.2 Terpenoids và tinh dầu

Tinh dầu thuô ̣c nhó m chất isoprenoid, là sản phẩm trao đổ i chất bâ ̣c 2. Các chất thuô ̣c nhó m ispronoid có đă ̣c tı́nh chung là không hò a tan trong các dung môi hữu cơ. Tinh dầu rất ı́t hòa tan trong nướ c và hòa tan nhiều trong rươ ̣u đâ ̣m đă ̣c. Dướ i tác du ̣ng củ a oxy, mô ̣t phần củ a tinh dầu chủ yếu là hơ ̣p chất không no bi ̣ oxy hó a và có thể ta ̣o thành Terpenoid. Nó i chung mù i thơm củ a tinh dầu chủ yếu do ester, aldehide, cetone và những chất hữu cơ khác quyết đi ̣nh. Tổ ng lươ ̣ng củ a những chất này chı̉ chiếm 10% lươ ̣ng tinh dầu, 90% cò n la ̣i là những chất đê ̣m.

Về bản chất hó a ho ̣c, tinh dầu thườ ng là hỗn hơ ̣p các chất khác nhau: hydrocarbon, rươ ̣u, phenol, aldehide, acid, ester,… tuy nhiên, quan tro ̣ng và thườ ng

gă ̣p hơn cả là trong hơ ̣p phần củ a tinh dầu là terpen và các dẫn xuất chứ a oxy củ a terpen.

 Hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn

Các loại terpenoids tinh dầu cũng có khả năng kháng khuẩn nhờ các khả năng

hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn bởi các hợp chất lipophilic phá vỡ vách tế

bào.

Terpenenes và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, virus và động

vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu

có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

Các acid betulinic triterpenoid chỉ là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức

chế được HIV. Gần đây các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các

terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát vi

khuẩn Listeria monocytogenes.

Hình 1.12 Một số Terpenenes và Terpenoid

1.3.3.3 Phenol đơn và acid phenolic

Các hơ ̣p chất phenolic ta ̣o ra hương vi ̣ và màu sắc cho các loa ̣i cây trồ ng, rau trái. Ngoài ra chú ng cò n bảo vê ̣ cho cây trồng chố ng là sư ̣ tấn công củ a các VSV, côn trù ng và đô ̣ng vâ ̣t ăn cỏ . Vai trò củ a phenol trong sinh lý ho ̣c thư ̣c vâ ̣t đã đươ ̣c toàn diê ̣n xem xét la ̣i trong những năm gần đây. Sư ̣ tı́ch lũy các hơ ̣p chất phenolic phu ̣ thuô ̣c vào loài và/hoă ̣c giố ng, tra ̣ng thái sinh lý, và vi ̣ trı́ đi ̣a lý củ a các loài cây (Lattanzio, 1988; Mueller Harvey và Dhanoa, 1991).

Trong rau quả, sự tổ ng hơ ̣p các hơ ̣p chất phenolic đươ ̣c diễn ra trong suố t quá trı̀nh sinh trưở ng. Các hơ ̣p chất phenolic mà có khả năng ứ c chế sự phát triển củ a nấm sơ ̣i có thể có mă ̣t trong các loa ̣i rau trái không bi ̣ hư hỏ ng hoă ̣c cac mô quả bi ̣ nhiễm mầm bê ̣nh. Các hơ ̣p chất phenolic này có sẵn trong các loa ̣i rau trái có vai trò ngăn ngừ a các bê ̣nh xảy ra trong quá trı̀nh bảo quản sau thu hoa ̣ch.

Đồ án tốt nghiệp

Phenolics được xem là nguyên nhân dẫn đến sự ức chế enzyme bởi các hợp

chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự

tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein.

Một số hợp chấ t phenolic có hoạt tı́nh khá ng khuẩn

 Quinones

Quinone là những vò ng thơm vớ i hai nhó m thể ketone.

Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân

trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó

khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn.

Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành

tế bào và các enzyme trên màng.

Hình 1.13 Một số Quinones thông thường

 Tannin

Tannin là những hơ ̣p chất polyphenol có trong thực vâ ̣t có vi ̣ chát, đươ ̣c tı̀m

thấy chủ yếu trong thực vâ ̣t bâ ̣c cao ở những cây hai lá mầm.

Tannin có khả năng liên kết với protein làm mất hoạt tính của các protein chức

năng, ức chế enzyme được xem là cơ chế chung của các hợp chất tannin.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.14 Gallotannin và Gallic acid

 Flavonoid

Flavonoid là mô ̣t nhóm hơ ̣p chất lớ n thườ ng gă ̣p trong thực vâ ̣t. Hơn mô ̣t nử a rau quả thườ ng dù ng có chứ a flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần thườ ng hay gă ̣p trong dươ ̣c liê ̣u nguồn gố c từ thực vâ ̣t.

Flavonoid có khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào và tạo phức với

thành tế bào vi khuẩn. Các flavonoid càng ưa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Chúng có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn

khi có mặt glucose. Flavonoid ức chế transpeptidaza làm cho mucopeptit – yếu tố

đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được, ức chế tổng

hợp axit nucleic của vi khuẩn, tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của

vi khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.15 Một số Flavonoid

1.3.3.4 Saponin

Nhóm saponin, chủ yếu là asiaticosid có tác dụng lên Mycobacterium leprae.

Tác dụng được giải thích do asiaticosid làm tan màng sáp của vi khuẩn.

Hı̀nh 1.16 Saponin

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.5 Lectin và polypeptide

Peptides đươ ̣c dù ng để ứ c chế VSV đươ ̣c nghiên cứ u và công bố đầu tiên vào

năm 1942.

Peptides đươ ̣c tı́ch điê ̣n dương và có chứ a liên kết disulfua. Cơ chế kháng khuẩn là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh

tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật chủ ở vi sinh vật.

Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng

tới các thành phần tế bào chất.

Hı̀nh 1.17 Các cấu trú c củ a peptide

1.4 Một số vi sinh vật gây bệnh điển hình

1.4.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy

1.4.1.1 Escherichia coli

 Đặc điểm

Escherichia coli là mô ̣t trong những loài vi khuẩn chı́nh kı́ sinh trong đườ ng ruô ̣t củ a đô ̣ng vâ ̣t máu nó ng. E.coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên

các môi trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men

đường glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.18 Hình ảnh Escherichia coli O157: H7 dưới kính hiển vi

 Phần lớn các vi khuẩn E.coli không có ảnh hưởng gì đáng kể đến sức khỏe

trừ một số có thể gây tiêu chảy và tùy vào địa phương, độ tuổi người bệnh

mà các vi khuẩn trên đây có những ảnh hưởng khác nhau.

 Khả năng gây bệnh của một số Escherichia coli:

- E O15:H7: sản xuất ra đô ̣c tố ma ̣nh gây tổ n thương niê ̣m ma ̣c ruô ̣t non, gây

tiêu chảy ra máu.

- EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): gây xuất huyết ở ruột.

- EPEC (Enteropathogenic E.coli): gây bệnh đường ruột, chủ yếu gây bệnh ở

trẻ em, cơ chế gây bệnh chưa rõ.

- ETEC (Enterotoxigenic E.coli): sinh độc tố ruột.

- EIEC (Enteroinvasive E.coli ): gây bệnh do xâm lấn tế bào.

- EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli kết tập ở ruột. (Cao

Minh Nga, 2014).

1.4.1.2 Shigella

 Đặc điểm

Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,sống ký sinh ở

đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi trường nhân

tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường glucose và

chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.19 Hı̀nh ảnh củ a Shigella sp.

Shigella gây bệnh ở động vật linh trưởng, nhưng không gây bê ̣nh ở động vật

có vú khác. Nó chỉ được tìm thấy tự nhiên trong cơ thể người và khỉ đột. Shigella là

một trong những nguyên nhân hàng đầu của vi khuẩn tiêu chảy trên toàn thế giới,

gây ra một ước tính 80-165,000,000 trường hợp và 600.000 ca tử vong mỗi năm.

 Khả năng gây bệnh của một số Shigella: gây bệnh lỵ trực trùng, có 4 nhóm:

- Nhóm A: S. dysenteriae: tiết độc tố shiga, là nguyên nhân chủ yếu gây ra

bê ̣nh kiết li ̣ ở những nơi tâ ̣p trung như các tra ̣i ti ̣ na ̣n trên thế giớ i.

- Nhóm B: S. flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga- like- toxin), là chủ ng phổ biến nhất trên thế giớ i, gây ra 60% ca bê ̣nh ở các nướ c đang phát triển.

- Nhóm C: S. boydii: không tiết độc tố.

- Nhóm D: S. sonnei: tiết độc tố giống shiga, là nguyên nhân gây ra 77% số ca

bê ̣nh kiết li ̣ ở những nướ c phát triển.

Nhó m A – C về mă ̣t sinh lý tương tự nhau, S.sonnei có thể khác biê ̣t trên cơ sở

xét nghiê ̣m chuyển hó a sinh hó a.

1.4.1.3 Salmonella

 Đặc điểm

Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, không sinh bào tử , sống ký sinh ở đường tiêu hoá của người và động vật, chúng phát triển tốt trên các môi

Đồ án tốt nghiệp

trường nhân tạo thông thường, không sinh nha bào, có khả năng lên men đường

glucose và chuyển hoá nitrate thành nitrite, phản ứng oxidase âm tính.

Hình 1.20 Hình ảnh của Salmonella typhii và Salmonella typhimurium

Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và

động vật máu nóng, và trong môi trường. Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các

bệnh như thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thực phẩm.

 Khả năng gây bệnh của một số Salmonella

- S. typhi: gây sốt thương hàn.

- S. choleraesuis: gây nhiễm trùng máu và áp-xe khu trú ở các cơ quan nội

tạng.

- S.enteridis: gây viêm ruột (Cao Minh Nga, 2014).

1.4.1.4 Vibrio

 Đặc điểm

Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và

catalase dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose

trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrite từ nitrate.

Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh. Hầu hết các chủng gây bệnh

có liên quan với viêm dạ dày ruột, nhưng cũng có thể lây nhiễm các vết thương hở

và gây nhiễm trùng huyết.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.21 Hình ảnh vi khuẩn Vibrio cholerae và Vibrio harveyi

 Khả năng gây bệnh của một số Vibrio:

- V. alginolyticu: gây nhiễm trùng vết thương, chúng cũng có mặt trong các cơ

quan của động vật như cá nóc.

- V. cholera : tác nhân gây bệnh tả.

- V. harveyi : tác nhân gây bệnh của một số loài động vật thủy sinh.

- Vibrio parahaemolyticus (có trong hải sản sống hoặc nấu chưa chín): nguyên

nhân chủ yếu là viêm dạ dày cấp tính, nhiễm trùng vết thương cũng xảy ra,

nhưng ít phổ biến hơn so với bệnh thủy sản gây ra.

1.4.1.5 Listeria

 Đặc điểm

Listeria là một vi khuẩn hı̀nh que, Gram dương, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Có thể được tìm thấy trong đất, nước, trong các loại thịt chưa nấu chín, rau

sống, trái cây, thực phẩm làm từ sữa, và thực phẩm chế biến.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.22 Hình ảnh củ a Listeria monocytogenes

 Một số Listeria

- Listeria innocua

- L. monocytogenes

- L. welshimeri

- L. aquatica

- L. ivanovii

- L. marthii… (Jemmi và Stephan, 2006)

 Khả năng gây bệnh

Các bệnh của người trong chi Listeria thường do Listeria monocytogenes gây

ra. Đây là loại vi khuẩn gây độc, với 20% đến 30% số ca nhiễm lâm sàng gây nên

bệnh Listeriosis dẫn đến tử vong. Một số triệu chứng liên quan với bệnh listeriosis

bao gồm sốt, đau cơ, tiêu chảy, nôn và buồn nôn. Phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh,

người già và những người có hệ miễn dịch kém là dễ bị bệnh listeriosis.

1.4.2 Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da

1.4.2.1 Pseudomonas aeruginosa

 Đặc điểm

Pseudomonas aeruginosa là một vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và

con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi

Đồ án tốt nghiệp

trường nhân tạo trên khắp thế giới. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của

chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên

cây và trong các động vật. Pseudomonas aeruginosa không chỉ phát triển trong môi

trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy,

và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo.

Hình 1.23 Hình ảnh Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có

bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng,

không quang hợp hoặc cố định nitrogen.

 Khả năng gây bệnh

Pseudomonas là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và

con người. Vi khuẩn này phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ

thể, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của

người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông

thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các

cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử

vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên trong cơ

thể. Bên cậnh đó, vi khuẩn này cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao

gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên

nhân gây ra viêm chân lông.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2.2 Staphylococcus aureus

 Đặc điểm

Staphylococcus aureus là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi.

người là nguồn chứa chính của tụ cầu vàng, chủ yếu là ở vùng mũi họng (30%),

nách, âm đạo, mụn nước trên da, các vùng da trầy xướt và tầng sinh môn. Tỷ lệ

mang vi khuẩn cao hơn ở các nhân viên y tế, bệnh nhân lọc máu, có bệnh tiểu

đường type 1, nhiễm HIV, mắc bệnh da mãn tính.

S. aureus có rải rác trong tự nhiên như trong đất, nước, không khí, đặc biệt

Hình 1.24 Cấu trúc hiển vi Staphylococcus aureus

 Khả năng gây bệnh

Trong đa số trường hợp, tụ cầu khuẩn không gây ra vấn đề gì hoặc chỉ gây

nhiễm khuẩn nhẹ như nổi mụn hoặc bóng nước. Nhưng trong một số trường hợp, tụ

cầu khuẩn có thể gây nhiễm khuẩn trầm trọng hơn. Staphylococcus aureus là

nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một

phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. (Ogston

A, 1984).

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2.3 Enterococcus feacalis

 Đặc điểm

Enterococcus feacalis là vi khuẩn Gram dương, lên men glucose, sinh acid

làm giảm pH môi trường. E. feacalis không sinh độc tố, không tạo ra phản ứng

catalase với hydrogen peroxide. Nó có thể tạo ra một phản ứng pseudocatalase trên

môi trường thạch máu.

Hình 1.9. Hình ảnh Enterococcus feacalis

 Khả năng gây bệnh

E. faecalis có thể gây ra viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng

đường tiết niệu, viêm màng não và nhiễm trùng khác ở người.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian

2.1.1 Địa diểm

- Thu mẫu: vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà, địa bàn huyện Lạc Dương, Đam

Rông, tỉnh Lâm Đồng

- Thí nghiệm: phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học- Thực phẩm- Môi

trường, trường Đại học Công nghệ TpHCM.

2.1.2 Thời gian

Tháng 11/2015 đến tháng 07/2016.

2.2 Vật liệu

2.2.1 Nguồn mẫu phân tích

Cao chiết nước từ 10 mẫu cây thuốc dân gian thu tại vườn quốc gia Bidoup,

Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng, bao gồm:

- Podocarpus sp.

- Polygala sp.

- Medinilla sp.

- Eupatorium sp.

- Elephantopus sp.

- Lantana sp.

- Acorus sp.

- Euodia sp.

- Calamus sp.

- Streptocaulon sp.

- Xidi klung (tên go ̣i dân gian thương go ̣i, chưa có đươ ̣c đi ̣nh danh)

Đồ án tốt nghiệp

Hı̀nh 2.1 Hı̀nh ả nh mô ̣t số cây thuố c: Lantana sp., Medimilla sp., Elephamtopus sp., Podocarpus sp. (từ trá i qua, trên xuố ng)

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị

- 4 chủng Escherichia: Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli –

ETEC, Escherichia coli 0517:H7, Escherichia 0208

- 4 chủng Salmonella: Salmonella typhii, Salmonella typhimurium, Salmonella

dublin, Salmonella enteritidis

- 4 chủng Vibrio: Vibrio alginolyticus, Vibrio cholera, Vibrio harveyi, Vibrio

parahaemolyticus

- 3 chủng Shigella: Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii,

Shigella sonnei

- 2 chủng Listeria: Listeria monocytogenes, Listeria innocua

- Pseudomonas aeruginosa

- Staphylococcus aureus

- Enterococcus feacalis

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3 Hóa chất, môi trường

- Dung môi Dimethysulfoside - Nước cất

(DMSO) - NaCl

- Methanol - Môi trường TSA, TSB

- Ethanol - Agar

- Cồn

2.2.4 Dụng cụ, thiết bị

- Tủ cấy vô khuẩn - Giấy lọc

- Autoclave - Bình tam giác

- Tủ ấm, Tủ lạnh - Pipette loại 100 – 1000 μl.

- Tủ sấy - Đầu típ loại 100- 1000 μl

- Máy lắc - Ống nghiệm

- Máy đo OD - Que cấy trang, que cấy vòng

- Cân điện tử, Cân phân tích - Đèn cồn, đĩa petri

- Bếp điện - Parafilm

- Phễu

Hı̀nh 2.1 Mô ̣t số du ̣ng cu ̣ và thiết bi ̣ thı́ nghiê ̣m

Đồ án tốt nghiệp

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu

Mẫu cây

Rửa sạch

Phơi khô đến trọng lượng không đổi

Xay mẫu thành bột mịn

Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu

Lá, thân, cành của các cây sau khi được thu thập sẽ được đem về phòng thí

nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công

Nghệ Tp.HCM. Mẫu cây được rửa sạch và phơi khô trong phòng thí nghiệm tới khi

trọng lượng không đổi. Các mẫu phơi khô được nghiền thành bột mịn. Bột mẫu được

đựng trong túi nhựa và được bảo quản ở 400C.

2.3.2 Phương pháp tăng sinh VSV chı̉ thi ̣

 Mục đích: tăng sinh khối vi sinh vật chỉ thị đến số lượng cần thiết, giúp hoạt

hóa vi khuẩn trở về trạng thái bình thường sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản.

 Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi

trường dinh dưỡng phải chứa thành phần đa lượng và vi lượng để vi sinh vật phát triển,

đảm bảo có đủ điều kiện lý hóa thích hợp để vi sinh vật trao đổi chất với môi trường.

 Tiến hành:

Đồ án tốt nghiệp

- Chuẩn bị chai chứa 10ml môi trường tăng sinh (môi trườ ng TSB). - Dù ng pipette hú t 100µl sinh khối vi sinh vật từ ố ng eppendort cho vào chai môi

trường.

- Lắc 150 vòng/phút, 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng (sinh khối vi sinh vật tăng lên

làm đục môi trường nuôi cấy).

2.3.3 Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo OD

 Nguyên tắc:

- Đô ̣ đu ̣c củ a huyền phù tỷ lê ̣ thuâ ̣n vớ i số lươ ̣ng VSV hiê ̣n diê ̣n trong môi trườ ng. Trong mô ̣t thờ i gian nhất đi ̣nh, mố i quan hê ̣ giữa số lươ ̣ng VSV trong nướ c tı̉ lê ̣ tuyến tı́nh vớ i đô ̣ đu ̣c môi trườ ng.

- Đi ̣nh lươ ̣ng VSV trong môi trườ ng bằ ng máy đo đô ̣ đu ̣c hay máy so mà u ở bướ c

sóng 550 – 610nm.

- Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tı́nh giữa đô ̣

đu ̣c và số lươ ̣ng VSV trong môi trườ ng bằ ng phương pháp đếm trư ̣c tiếp.

 Tiến hành:

- Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào:

 Pha loãng một huyền phù tế bào cần kiểm định có mật độ tế bào bất kì thành

các huyền phù khác nhau có độ đục ở OD 600nm đạt các giá trị lân cận 0.1;

0.2; 0.3; 0.4; 0.5. Đo OD ở 600nm của các huyền phù vừa pha được, ghi

nhận các số liệu.

 Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kinh hiển vi (buồng đếm hồng cầu)

xác định mật độ tế bào (cfu/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log

(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục. vẽ đường biển

diễn của log (N/ml) theo OD ở 600nm.

- Xác định mật độ tế bào theo độ đục: đo độ đục của một huyền phù tế bào cần

xác định mật độ. Từ giá trị OD ở bước sóng 600nm đo được, suy ra số log (N/ml) và

trị số mật độ (cfu/ml) từ đường chuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống

- Giữ giống thạch nghiêng: lấy giống VSV cấy vào ống thạch nghiêng, ủ cho

VSV phát triển, đem trữ lạnh ở nhiệt độ 40C. Giống này thường được sử dụng cho sản

xuất. Thời gian sử dụng từ 7 – 10 ngày.

- Giữ giống trong glycerol 20% ở nhiệt độ -40C: vi khuẩn sau khi tăng sinh, hút

vào eppendorf và ly tâm 5000 v/p trong thời gian 15 phút. Loại bỏ dịch và giữ cặn. Bổ

sung 1 ml glycerol 20% và đồng nhất rồi bảo quản ở nhiệt độ -40C. Giống này được sử

dụng để cấy chuyển qua thạch nghiêng. Thời gian sử dụng từ 1 – 3 tháng.

2.3.5 Phương pháp tách chiết cao

 Mục đích: tách chiết hợp chất kháng khuẩn thực vật để nghiên cứu

 Nguyên tắc: sử dụng dung môi nước để tách chiết các hợp chất trong thực vật

nhờ lực liên kết hóa học.

 Tiến hành:

- Cân 50g mẫu cao + 1000ml dung môi cho vào erlen, ngâm 4 giờ, lọc, thu

dịch lần 1.

- Bã + 1000ml dung môi ngâm 4 giờ, lọc, thu dịch lần 2.

- Ngâm tiếp tục cho đến khi dịch trong, lặp lại khoảng 3 lần.

2.3.6 Chuẩn bi ̣ dung di ̣ch cao thuố c khá ng sinh

Cao thuố c khô: cân 1,5g cao thuố c khô, hò a tan vớ i 13,5ml dung di ̣ch DMSO 1%

và nướ c cất (nồ ng đô ̣ DMSO 1% không vươ ̣t quá 10%. Thu đươ ̣c di ̣ch cao chiết nồng đô ̣ cao thuốc đa ̣t 100mg/ml.

Di ̣ch cao chiết nồ ng độ 100mg/ml (cao khô đã hò a tan sẵn trong dung môi

DMSO 1%): hò a tan 1ml cao vớ i 9ml nướ c cất. Thu đươ ̣c di ̣ch cao chiết nồ ng đô ̣

2.3.7 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method)

 Nguyên tắc

Đồ án tốt nghiệp

Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của cao chiết với vi khuẩn chỉ thị

trên môi trường nuôi cấy. Cao chiết có khả năng khuếch tán trong môi trường agar và

tác động lên vi khuẩn. Khi kháng được vi khuẩn sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung

quanh giếng thạch.

 Tiến hành

- Các chủng vi khuẩn sau khi đã tăng sinh được tiến hành pha loãng bằng nước

muối sinh lý. Pha loãng đến nồng độ 106 cfu/ml.

- Hút 100 µl từ dịch pha loãng vào đĩa petri chứa sẵn môi trường TSA. Tiến hành

cấy trang.

- Sau đó, tạo những giếng nhỏ có đường kính 8 mm với thanh kim loại vô trùng.

Mỗi đĩa thạch trung bình từ 6 – 9 giếng thạch.

- Nhỏ 100l dung dịch cao chiết (nồng độ 100 mg/ml) vào mỗi giếng của đĩa

thạch đã ấy trang.

- Để yên đĩa trong vòng 2 giờ.

- Ủ 37oC trong 24 giờ cho vi khuẩn phát triển.

- Đọc kết quả

 Hoạt tính kháng khuẩn được tính bằng vòng kháng khuẩn quanh miệng

giếng trên đĩa:

- Không có vòng kháng khuẩn: không có hoạt tính kháng khuẩn.

- Đường kính vòng kháng khuẩn từ 8 đến 10mm: tính kháng trung bình.

- Đường kính vòng kháng khuẩn > 10mm: tính kháng mạnh.

Đồ án tốt nghiệp

Hı̀nh 2.3 Hı̀nh ảnh về kết quả kháng khuẩn củ a mô ̣t mẫu vi khuẩn chı̉ thi ̣ (bên trái là không có kết quả kháng khuẩn và và bên phải là có kết quả kháng khuẩn)

2.3.8 Phương pháp xác định thành phần hóa học

2.3.8.1 Carbohydrate

a. Thí nghiệm Molisch

- Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm vào 5-6 giọt thuốc thử Molisch.

- Nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm.

- Kết quả: Hình thành phức hợp màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách.

b. Thí nghiệm Feling

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào 100mg cao chiết.

- Đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả.

- Kết quả: Quan sát kết tủa màu đỏ của CuO.

c. Barfoed

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2 ml thuốc thử Barfoed.

- Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả.

 Kết quả: Hình thành kết tủa màu đỏ gạch.

2.3.8.2 Alkaloid

a. Mayer

- Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm

- Cho vài giọt thuốc thử Meyer.

 Kết quả: Quan sát kết tủa màu đục tạo thành.

b. Dragendroff

- Hút 2 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm.

- Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff.

- Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng cam.

Đồ án tốt nghiệp

c. Hager

Tiến -

hành:

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2 ml thuốc thử Hager.

- Kết quả: Hình thành kết tủa màu vàng.

d. Wagner

Hút 2 ml -

mẫu cho vào ống nghiệm.

Thêm 2 -

ml thuốc thử Wagner.

Kết quả: -

Hình thành kết tủa màu nâu đỏ.

2.3.8.3 Saponin (thử nghiệm Foam)

- Hút 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Lắc mạnh.

- Kết quả: Hình thành bọt ổn định.

2.3.8.4 Cardiac glycosides

a. Legal

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside.

- Nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10%.

- Kết quả: Xuất hiện màu đỏ đậm.

b. Keller Killiani

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3.

- Cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm.

- Kết quả: Xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.8.5 Anthaquinone glycosides (thử nghiệm Bontrager)

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi.

- Tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc.

- Thêm 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên.

- Tách lấy lớp benzene.

- Thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia.

- Kết quả: Xuất hiện màu đỏ.

2.3.8.6 Flavonoid

a. Alkaline

- Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy

xuất hiện màu vàng. Thực hiện với đối chứng là mẫu và nước cất để so sánh.

- Thêm vài giọt HCl loãng  mất màu chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid

- Kết quả: Xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl.

b. Shinoda

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Cho dịch mẫu bột Magnesium và một vài giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm.

- Bổ sung 5 ml cồn 95%.

- Kết quả: Nếu mẫu có màu cam, hồng, đỏ đến tím chứng tỏ có sự hiện diện của

flavonoid.

c. Ferric chloride

- Lấy 2 ml cho vào ống nghiệm.

- Thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10%.

- Kết quả: Xuất hiện màu xanh hoặc tím.

2.3.8.7 Phenolic

a. Lead acetate

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm

- Cho 1,5 ml Chì acetate 10%

Đồ án tốt nghiệp

- Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.

b. Gelatin

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm

- Thêm một vài gelatin 1%

- Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.8.8 Tannin

a. Ferric chloride

- Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%.

- Cho vào 4 giọt ferric chloride 10%.

- Kết quả: Xuất hiện màu xanh.

b. Lead acetate

- Hút 2 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%.

- Cho vào 4 giọt Chì acetate.

- Kết quả: Xuất hiện kết tủa màu vàng.

2.3.8.9 Steroid

a. Salkowski

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc.

- Lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp.

- Đọc kết quả ở mặt phân cách.

- Kết quả:

 Xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới: sterol.

 Hình thành màu vàng ở lớp dưới: triterpenoid.

b. Libermann Burchard

- Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm.

- Thêm 2 ml acetic anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh.

- Nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm.

- Kết quả:

 Xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách: steroid.

 Hình thành vòng màu nâu đỏ đậm: triterpenoid.

2.3.8.10 Amino acid

Đồ án tốt nghiệp

- 1 ml dịch chiết, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin.

- Đun sôi cách thủy trong 5 phút.

- Kết quả: Xuất hiện màu tím.

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu

Sừ dụng phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 và phần mềm

Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu.

Đồ án tốt nghiệp

2.4 Sơ đồ bố trı́ thı́ nghiê ̣m tổ ng quá t

Nguồ n mẫu

Ngâm trong dung môi nước (tỉ lệ 1:20 w/v)

Chiết và cô cao

Cao chiết nước

Xác định thành phần hóa học

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Xác định chỉ số MIC

Đọc kết quả

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1 Thí nghiệm 1: Đá nh giá hiê ̣u quả chiết cao chủ a dung môi nướ c đố i vớ i cá c

Mẫu cây

Phơi khô, xay nhuyễn

Poly- gala sp.

Medi- nilla sp.

Aco- rus sp.

Eupa- toriu m sp.

Lan- tana sp.

Cala -mus sp.

Strep- tocaul on sp.

Xidi klun g

Euo- dia sp.

mẫu cây

Podo- carpus sp.

Ele- phant opus sp.

Ngâm trong nước (tỉ lệ 1:20 w/v) trong 4 giờ

Lọc chân không

Ngâm lần 2, lo ̣c

Ngânm lần 3, lo ̣c

Bã

Cô cách thủy 700C

Thu cao

Cao chiết từ nước

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.5. Quy trình khảo đánh giá hiê ̣u quả chiết cao củ a dung môi nướ c đố i vớ i các mẫu cây.

 Tiến hành:

Cân 5g mẫu cao + 100ml dung môi nước (tỉ lệ 1:20, w/v) cho vào erlen, ngâm

trong 4 giờ, lọc, thu dịch lần 1. Bã lo ̣c sau đó sẽ đươ ̣c đổ thêm 100ml nướ c cất vào, tiếp tu ̣c ngâm 4 giờ , sau đó tiến hành lo ̣c, thu di ̣ch lo ̣c lần 2. Tiếp tu ̣c tiến hành ngâm bã và lo ̣c khoảng 3,4 lần cho đến khi di ̣ch lo ̣c trong. Sau đó toàn bô ̣ di ̣ch lo ̣c cao sẽ đươ ̣c cô cách thủ y ở nhiê ̣t đô ̣ 700C đến khi thu đươ ̣c cao khô hoàn toàn.

 Hiệu suất tách chiết cao:

mcao thu được (g): khối lượng cao thu được sau khi cô cách thủy

mcao ban đầu (g): khối lượng bột cao ban đầu

Hình 2.6. Dịch lọc qua các lần ngâm củ a các mẫu cây Xidi klung

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết nước

Giống vi khuẩn

Tăng sinh trong TSB và TSB+NaCl 1.5%

Lắc 150 v/p,nhiệt độ phòng, 18 – 24 giờ

Đo OD 600nm

Pha loãng vi sinh vật nồng độ 106 cfu/ml Nước muối sinh lý

Hút 100µl vào đĩa petri chứa TSA/TSA+NaCl 1.5%, trang đều

Đục lỗ(d=6mm) trên môi trường TSA

Cao chiết

DMSO 1% Dịch cao (100mg/ml)

Nhỏ 100l dịch chiết vào giếng trên môi trường TSA

Ủ 370C, 24h

Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng đường kính vòng kháng

Hình 2.7. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính kháng khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

2.4.2.1 Thuyết minh quy trình

Chuẩn bị 20 chai có chứa 10ml môi trường tăng sinh, sau đó tiến hành thao tác cấy các chủng VSV chı̉ thi ̣ vào chai môi trường đã chuẩn bi ̣. Sau khi tăng sinh, lắc các chai môi trườ ng trên khoảng 150 vòng/phút trong 18- 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Thu di ̣ch chứ a VSV. Dịch VSV sau khi được tăng sinh, tiến hành đo OD ở 600 nm để xác đi ̣nh mâ ̣t đô ̣ VSV trong di ̣ch chiết. Khi đã xác đi ̣nh đươ ̣c mâ ̣t đô ̣ vi khuẩn, tiến hành pha loãng các chủng vi sinh vật theo công thức: C.V=C’.V’ để được mật độ 106

cfu/ml. Dù ng pipette hút 1ml từ di ̣ch VSV đã pha loãng cho vào ống chứa 9ml nước muối sinh lý, lắc ma ̣nh. Tiếp theo, dù ng pippete hút 100l cho vào đĩa petri (chứa sẵn môi trường TSA vô trùng), trang đều đĩa cho đến khi khô hoàn toàn thı̀ đục lỗ trên đĩa. Dù ng pippêt hút 100l dịch cao (cao + DMSO 1%) nồng độ 100 mg/ml cho vào từng giếng thạch, để đĩa yên trong 2 giờ. Ủ các đı̃a petri ở 37oC trong 24 giờ . Đọc kết quả, đo vòng kháng khuẩn.

2.4.2.2 Đọc kết quả

Tiến hành đo vòng kháng khuẩn của mẫu cao trong các đı̃a petri đã ủ . So sánh vòng kháng khuẩn của mẫu cao và kháng sinh. Nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung

quanh chứng tỏ cao có kháng khuẩn chủng vi khuẩn đó. Ta sử dụng chủng vi khuẩn

này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu cao chiết nước

Ngâm trong DMSO 1%

Ngâm trong H2SO4 10%

Lọc

Alkloid

Carbon- hydrate

Steroid, acid amin

Saponnin, althraquinone, cardiac glycoside

Flavonoid, phenolic compound, tannin

2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định thành phần hóa học của các cao chiết.

Hình 2.8. Quy trình xác định thành phần hóa học

Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao được ngâm trong H2SO4 10% trong khoảng 30

phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc. Thu phần dịch trong để tiến hành

thử nghiệm.

Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được pha trong DMSO cho đến khi tan

hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng và lọc qua giấy lọc để thu dịch trong để tiến

hành thử nghiệm.

 Tiến hành các thử nghiệm để xác định thành phần hóa học trong cây thuốc gồm:

 Carbohydrate: thử nghiệm Molisch, thử nghiệm Feling, thử nghiệm Barfoed.

 Alkaloid: thử nghiệm Mayer, Dragendorff, thử nghiệm Hager, thử nghiệm

Wagner.

 Saponin: thử nghiệm Foam.

 Cardiac glycosides: thử nghiệm Legal, thử nghiệm Keller Killiani.

Đồ án tốt nghiệp

 Anthaquinone glycosides: thử nghiệm Bontrager.

 Flavonoid: thử nghiệm Alkaline, thử nghiệm Shinoda, thử nghiệm Ferric

chloride.

 Phenolic: thử nghiệm Lead acetate, thử nghiệm Gelatin.

 Tannin: thử nghiệm Ferric chloride, thử nghiệm Lead acetate.

 Steroid: thử nghiệm Salkowski, thử nghiệm Libermann Burchard.

 Amino acid: thử nghiệm xác định Amino acid.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết cao

Để có thể đánh giá hiệu quả tách chiết cao của dung môi nướ c đối với các mẫu cây thuốc thì hiệu suất tách chiết là một trong những tiêu chí cần xác định. Kết quả đánh giá hiệu suất tách chiết cao củ a cao chiết nướ c từ các cây thuố c đươ ̣c thử nghiê ̣m đươ ̣c trı̀nh bày trong hı̀nh 3.1

Hı̀nh 3.1. Hiê ̣u suất tách chiết các cao chiết nướ c

Hı̀nh 3.1 thể hiê ̣n kết quả hiê ̣u suất tách chiết cao từ dung môi nướ c từ các cây thuố c. Kết quả trên cho thấy rằ ng hiệu suất tách chiết cao nướ c từ các cây thuố c khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả tách chiết cao củ a cây

Euodia sp. cho hiệu suất trung bình cao nhất 30%, kế đến là các cây Arcorus sp.,

Đồ án tốt nghiệp

Eupatoriium sp., Xidi klung, Calamus sp., Polygala sp., Medinilla sp. vớ i hiệu suất tách chiết trung bình lần lượt là 26%; 25,46%; 21%, 21% 20,53% và 20,18%. Bên ca ̣nh đó , các cao nướ c cây Streptocaulon sp., Elephatorium sp., Podocarpus sp., cho hiê ̣u suất tách chiết tương đố i thấp (< 20%) vớ i hiê ̣u suất thu hồ i trung bı̀nh lần lươ ̣t là 16%, 15,15%, 11,99% và cuố i cù ng cây Lantana sp. cho hiê ̣u suất thu hồ i thấp nhất vớ i giá tri ̣ trung bı̀nh 11%.

Kết quả đánh giá hiê ̣u suất thu hồ i củ a các mẫu cao chiết nướ c từ các loa ̣i cây cho thấy rằ ng nướ c là mô ̣t dung môi có thể sử du ̣ng đươ ̣c trong quá trı̀nh tách chiết các hợp chất có trong thực vâ ̣t do hiê ̣u suất thu hồ i tố t. Trong cao chiết có khả năng thu nhâ ̣n đươ ̣c các hơ ̣p chất có hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c như alkaloid, flavonoid, tannin và các hợp chất phenolic. Hơn nữa, viê ̣c sử du ̣ng nướ c là dung môi tách chiết cũng phù hơ ̣p vớ i cách sử du ̣ng cây thuố c trong các bài thuố c dân gian, đồ ng thờ i nó cũng là dung môi phổ biến, rẻ tiền và nhất là không đô ̣c ha ̣i đố i vớ i ngườ i sử du ̣ng. Tuy nhiên, để đánh giá nướ c có thư ̣c sư ̣ là mô ̣t dung môi tách chiết tố t hay không thı̀ ngoài hiê ̣u suất tách chiết, hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c cũng đó ng mô ̣t vai trò quan tro ̣ng. Do đó , cần phải khảo sát hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c mà trong đề tài này là hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn để có thể đánh giá chı́nh xác nướ c có phải là dung môi tách chiết tố t nhất hay không.

3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cá c mẫu cao chiết nướ c

Các mẫu cao chiết nướ c sau khi đươ ̣c pha loãng ở nồ ng đô ̣ 100mg/ml đươ ̣c tiến hành đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i 20 chủ ng vi khuẩn gây bê ̣nh bao gồ m 4 chủ ng E. coli, 2 chủ ng Listeria, 4 chủ ng Salmonella, 3 chủ ng Shigella, 4 chủ ng Vibrio và các vi khuẩn gây bê ̣nh cơ hô ̣i trên da bao gồ m Pseudomonas aerusginosa, Staphylococcus

aureus, Enterococcus feacalis.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.1 Kết quả đá nh giá hoa ̣t tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Escherichia

coli

Kết quả đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a 11 loa ̣i cao chiết nướ c đố i vớ i nhó m vi khuẩn Escherichia coli đươ ̣c thể hiê ̣n trong hı̀nh 3.2.

Hı̀nh 3.2. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Escherichia coli.

Dựa vào hı̀nh 3.2 nhận thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây thuố c Medinilla sp., Xidi klung, Polygala sp., và Streptocaulon sp. có khả năng kháng la ̣i sư ̣ phát triển củ a nhó m vi khuẩn E. coli khảo sát, trong đó cao chiết nướ c cây Medinilla sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t nhất khi kháng cả 4 chủ ng vi khuẩn E. coli khảo sát vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,83mm đến 11mm. Cao chiết nướ c từ cây Xidi klung cũng thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn ở 3/4 chủ ng vi khuẩn nhó m E. coli

Đồ án tốt nghiệp

là E. coli O157:H7, E. coli và ETEC vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,17mm đến 11,67mm. Thêm vào đó, cao chiết nướ c Polygala sp. cũng thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn ở 2/4 chủ ng vi khuẩn E. coli là E. coli và ETEC vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươ ̣t là 8,17mm và 8,75mm. Ngoài ra, cao chiết nướ c cây Streptocaulon sp. cũng thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn ở vi khuẩ n E. coli O157:H7 vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,2mm. Các cao chiết nướ c cò n la ̣i không thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩn nhó m E. coli.

Kết quả trên cho thấy rằng cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. và cây Xidi klung có khả năng ứ c chế nhó m vi khuẩn E. coli tố t hơn so vớ i các loa ̣i cao chiết nướ c từ các cây thuố c cò n la ̣i trong đề tài. Tuy nhiên, kết quả kháng khuẩn E. coli củ a 2 mẫu này khi so sánh vớ i Ciprofloxacin nồ ng đô ̣ 500mg/ml thı̀ vẫn cò n thấp hơn mô ̣t cách có ý nghı̃a thố ng kê (p < 0,05).

Thử nghiê ̣m củ a Thilza và ctv (2010) về hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c cây Moringa oleifera vớ i nồ ng đô ̣ 200mg/ml trên chủ ng E. coli cho kết quả vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh là 7mm. Trong thử nghiê ̣m này, mẫu cao nướ c nồ ng đô ̣ 100mg/ml củ a cây Medinilla sp. cho vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh là 10,17mm và mẫu cao nướ c nồ ng đô ̣ 100mg/ml củ a cây Xidi klung cho vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,33mm, cao hơn vò ng kháng củ a nghiên cứ u nêu trên.

3.2.2 Kết quả đá nh giá hoa ̣t tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Listeria spp.

Sau khi tiến hành thử nghiê ̣m đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a 11 loa ̣i cao chiết nướ c đối vớ i nhó m vi khuẩn Listeria, kết quả thu đươ ̣c từ thử nghiê ̣m đươ ̣c thể hiê ̣n trong hı̀nh 3.3.

Đồ án tốt nghiệp

Hı̀nh 3.3. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Listeria spp.

Từ kết quả thu đươ ̣c ở hı̀nh 3.3, nhận thấy rằng cao chiết nướ c từ các cây thuố c khác nhau thể hiện hoạt tính ứ c chế khác nhau đố i với 2 chủng vi khuẩn Listeria khảo sát. Cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t nhất vớ i cả 2 chủ ng vi khuẩn Listeria khảo sát, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươ ̣t là 10,2mm và 12,8mm. Đố i vớ i chủ ng L. monocytogenes, cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. và cây Streptocaulon sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t tương đương vớ i kháng sinh đố i chứ ng Ciprofloxacin ở nồ ng đô ̣ 500mg/ml, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn lần lượt là 10mm và 11,3mm. Đố i vớ i chủ ng L. innocua, cao chiết từ cây Xidi klung thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh tố t nhất và tương đương vớ i kháng sinh đố i chứ ng Ciprofloxacin ở nồ ng đô ̣ 500mg/ml, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh 10mm.

Đồ án tốt nghiệp

Các kết quả trên cho thấy rằng nhóm vi khuẩn nhó m Listeria khảo sát bi ̣ ứ c chế sư ̣ phát triển bở i cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cao hơn so với các loại cao chiết nướ c từ các cây thuố c khác trong đề tài. Khi so sánh vớ i hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a đố i chứ ng Ciprofloxacin 500mg/ml, hoa ̣t tı́nh ứ c chế vi khuẩn nhó m Listeria củ a cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. tốt tương đương về phương diê ̣n thố ng kê (p < 0,05).

3.2.3 Kết quả đá nh giá hoa ̣t tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Salmonella

spp.

Kết quả quả thử nghiê ̣m đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a 11 loa ̣i cao chiết nướ c từ các cây thuốc đố i vớ i nhó m vi khuẩn Salmonella đươ ̣c thể hiê ̣n trong hı̀nh 3.4.

Hı̀nh 3.4. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Salmonella spp.

Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn thu đươ ̣c ở hı̀nh 3.4 cho thấy rằng 7/11 loa ̣i cao chiết nướ c từ các cây thuố c không kháng la ̣i sự phát triển củ a vi khuẩn nhó m Salmonella

Đồ án tốt nghiệp

khảo sát, trong khi đó các cao chiết nướ c từ các cây cò n la ̣i là Medinilla sp., Xidi klung, Polygala sp., Podocarpus sp. có khả năng kháng la ̣i vi khuẩn nhó m Salmonella. Cao chiết nướ c cây Medinilla sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t nhất khi kháng cả 4 chủ ng vi khuẩn Salmonella khảo sát, đườ ng kı́nh vòng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,7mm đến 11mm và cao thuố c nướ c cây Xidi klung cũng thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t ở 2 chủ ng vi khuẩn S. typhii và S. typhimurium vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh củ a 2 chủ ng vi khuẩn lần lươ ̣t là 11mm và 11,5mm. Cao chiết nướ c cây Podocarpus sp. và cây Polygala sp., ứ c chế vi khuẩn S. typhii vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh là 9,8mm và 3,8mm.

Từ kết quả trên nhâ ̣n thấy rằng cao chiết nướ c cây Medinilla sp. ứ c chế sự phát triển củ a nhó m vi khuẩn Salmonella tố t hơn các loại cao chiết nướ c từ các cây thuố c khác khi kháng đươ ̣c 4/4 chủ ng vi khuẩn Salmonella. Khi so sánh hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn vớ i Ciprofloxacin 500mg/ml, hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cho kết quả tố t tương đương mô ̣t cách có ý nghı̃a thống kê (p < 0,05).

Khi so sánh vớ i thử nghiê ̣m củ a Adebolu và Oladimeji về hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c từ lá cây Ocimum gratissimum đươ ̣c chần nướ c sôi, kết quả thử nghiê ̣m này la ̣i thấp hơn khi vò ng kháng khuẩn trong thử củ a Adebolu và Oladimeji đố i vớ i vi khuẩn S. typhii là 30mm và đố i vớ i vi khuẩn S. typhimurim là 39mm. Tương tự, trong mô ̣t thı́ nghiê ̣m củ a Doughari (2006) về hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao nướ c chiết xuất từ vỏ cây Tamarindus indica Linn, vớ i nồ ng đô ̣ 100mg/ml, vò ng kháng khuẩn ghi nhâ ̣n được 24mm, cao hơn so vớ i trong kết quả trong thử nghiê ̣m này.

3.2.4 Kết quả đá nh giá hoa ̣t tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Shigella spp.

Tiến hành thử nghiê ̣m đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i nhó m vi khuẩn Shigella củ a 11 loa ̣i cao chiết nướ c, kết quả thu đươ ̣c từ thử nghiê ̣m đươ ̣c thể hiê ̣n trong hı̀nh 3.5.

Đồ án tốt nghiệp

Hı̀nh 3.5. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Shigella spp.

Dựa vào kết quả từ hı̀nh 3.5 nhận thấy rằ ng 5/11 mẫu cao chiết nướ c gồ m Pococarpus sp., Eupatorium sp., Medinilla và Xidi klung có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn Shigella, trong đó cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t nhất khi cho kết quả vòng kháng khuẩn ở cả 3 chủ ng vi khuẩn vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,3mm đến 11,3mm Bên ca ̣nh đó, cao chiết nướ c cây Xidi klung cũng thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn ở 2 chủ ng vi khuân Shi. flexneri và Shi. sonnei, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh đố i vớ i 2 chủ ng vi khuẩn lần lươ ̣t là 9,3mm và 8,5mm. Đố i vớ i vi khuẩn Shi. flexneri, cao thuố c nướ c từ cây Elephatopus sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t nhất vớ i vò ng kháng khuẩn 11,2mm, tương đương vớ i hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a Ciprofloxacin ở nồng độ 500mg/ml. Đố i vớ i vi khuẩn Shi. boydii, cao chiết từ cây Eupatorium sp. cho kết quả tố t nhất, đườ ng kı́nh vò ng kháng 13,2mm trong khi đố i chứ ng dương Ciprofloxacin 500mg/ml la ̣i không thể

Đồ án tốt nghiệp

hiê ̣n kết quả kháng. Ở vi khuẩn Shi. sonnei, cao thuố c từ cây Medinilla sp. cho kết quả tố t nhất, tuy nhiên la ̣i thấp hơn so vớ i đố i chứ ng dương Ciprofloxacin 500mg/ml.

Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn Shigella bi ̣ ứ c chế bở i cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cao nhất khi kháng đươ ̣c cả 3 chủ ng vi khuẩn Shigella và cho kết quả vò ng phân giải lớ n nhất so vớ i các cao chiết nướ c từ các mẫu cây khác trong thı́ nghiê ̣m. Hơn nữa, hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. cũng thể hiê ̣n kết quả tố t tương đương vớ i đối chứ ng Ciprofloxacin 500mg/ml.

Trong mô ̣t thử nghiê ̣m tương tự củ a Doughari (2006) về cao nướ c chiết xuất từ vỏ cây và lá cây Tamarindus indica Linn, cao chiết từ vỏ cây vớ i nồ ng đô ̣ 100mg/ml cho kết quả vò ng kháng khuẩn trên vi khuẩn Shi. flexneri là 18mm, cao hơn so vớ i trong kết quả trong thử nghiê ̣m này. Tuy nhiên, kết quả vò ng kháng khuẩn củ a mẫu cao chiết từ lá cây la ̣i ghi nhâ ̣n kết quả thấp hơn vớ i vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh chı̉ 3mm.

3.2.5 Kết quả đá nh giá hoa ̣t tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

Kết quả ghi nhâ ̣n đươ ̣c trong quá trı̀nh thực hiê ̣n thử nghiê ̣m đánh giá hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c từ 11 mẫu cây đố i vớ i nhó m vi khuẩn Vibrio trên da đươ ̣c thể hiê ̣n ở bảng 3.6

Đồ án tốt nghiệp

Hı̀nh 3.6. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết đố i vớ i nhó m vi khuẩn nhó m Vibrio spp.

Kết quả ở hı̀nh 3.6 cho thấy rằng nhó m Vibrio khảo sát bi ̣ ứ c chế bở i 4 loa ̣i cao chiết nướ c từ các cây Medinilla sp., Xidi klung, Eupatorium sp., Podocarpus sp.. Kết quả hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t nhất đươ ̣c thể hiê ̣n ở cao chiết nướ c từ cây Medinilla sp. khi kháng đươ ̣c cả 4 chủ ng Vibrio vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,8mm đến 10,7mm, tiếp theo là hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. khi kháng khuẩn ở 3 chủ ng vi khuân củ a nhó m là V. alginolyticus, V. harveyi và V. parahaemolyticus, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 5,5mm đến 9,2mm. Ngoài ra, cao chiết nướ c cây Eupatorium sp. và cây Podocarpus sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn đố i vớ i chủ ng vi khuẩn V. harveyi, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh lần lươ ̣t là 10mm và 15,8mm.

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả ghi nhâ ̣n đươ ̣c ở trên, nhâ ̣n thấy rằng cao chiết nướ c cây Medinilla sp. và cây Polygala sp. kháng la ̣i sự sinh trưở ng củ a nhóm vi khuẩn Vibrio khảo sát tố t với hơn so với các loại cao chiết nướ c từ các cây thuố c khác. Tuy nhiên, khi so sánh với hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 8 mg/ml thì phổ kháng khuẩn và hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c từ 2 cây này la ̣i thấp hơn mô ̣t cách có ý nghı̃a thố ng kê (p < 0,05).

3.2.6 Kết quả đá nh giá hoa ̣t tı́nh khá ng khuẩn đố i vớ i nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ

hội trên da

Ngoài hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩn gây bê ̣nh tiêu chảy, hoa ̣t tı́nh kháng vi khuẩn gây bê ̣nh trên da cũng đươ ̣c tiến hành đánh giá và ghi nhâ ̣n kết quả. Kết quả ghi nhâ ̣n đươ ̣c thể hiê ̣n ở bảng 3.7

Hı̀nh 3.7. Kết quả kháng khuẩn củ a các loa ̣i cao chiết nướ c đố i vớ i các vi khuẩn gây bê ̣nh về da

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào hı̀nh 3.7 nhận thấy rằng ngoài cao chiết nướ c từ các cây Medinilla sp., Podocarpus sp., Eupatorium sp., và Polygala sp., các cao chiết từ các cây thuố c khác đều không có hoạt tính kháng khuẩn đố i với các chủng vi khuẩn cơ hô ̣i gây bê ̣nh trên da ngoài mô ̣t cách khác nhau, trong đó cao thuố c nướ c từ cây Medinilla sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn tố t ở cả 3 chủ ng vi khuẩn, đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh từ 9,5mm đến 9,8mm. Ngoài ra, vi khuẩn S. aureus cũng bi ̣ ứ c chế bở i cao chiết từ cây Podocarpus sp. và Eupatorium sp. vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn lần lươ ̣t là 9,7mm và 6,2mm. Thêm vào đó , vi khuẩn E. feacalis cũng bi ̣ kháng la ̣i bở i cao chiết nướ c từ cây Polygala sp. thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh là 11,5mm.

Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn gây bê ̣nh trên da đươ ̣c khảo sát bi ̣ ứ c chế bở i hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cao hơn các loại cao chiết nướ c từ các cây thuố c khác khi cao chiết nướ c từ cây này kháng đươ ̣c cả 3 chủ ng vi khuẩn vớ i đườ ng kı́nh vò ng kháng khuẩn lớ n nhất. Tuy nhiên, hoa ̣t tı́nh này vẫn cò n thấp hơn theo mứ c ý nghı̃a thố ng kê ( p < 0,05) khi so sánh vớ i Ciprofloxacin ở nồng độ 500mg/ml.

Thử nghiê ̣m củ a Thilza và ctv (2010) về hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c cây Moringa oleifera vớ i nồ ng đô ̣ 200mg/ml trên chủng Pseudomonas và S. aureus không ghi nhâ ̣n đươ ̣c kết quả vò ng kháng khuẩn. Dư ̣a trên kết quả củ a thử nghiê ̣m trên, ta có thể thấy đươ ̣c hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cây Medinilla sp. trong thử nghiê ̣m này là tố t hơn khi ghi nhâ ̣n đươ ̣c kết quả kháng khuẩn trên cả 2 chủ ng vi khuẩn trên.

3.2.7 Tổng hợp kết quả cá c kết quả khá ng khuẩn củ a cá c loại cao chiết nướ c đố i

vớ i cá c chủ ng vi khuẩn chı̉ thi ̣

Từ các kết quả thu nhâ ̣n đươ ̣c, ta nhâ ̣n thấy cao chiết nướ c từ các cây hầu hết đều không thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn vớ i các chủ ng vi khuẩn chı̉ thi ̣ hoă ̣c chı̉ thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn vớ i mô ̣t vài chủ ng vi khuẩn.

Tuy nhiên, trong thử nghiê ̣m này, cao chiết nướ c cây Medinilla sp. cây Polygala sp. cây Xidi klung la ̣i cho kết quả kháng đươ ̣c mô ̣t số vi khuẩn khảo sát. Kết quả

Đồ án tốt nghiệp

kháng khuẩn củ a cao chiết nướ c cây Medinilla sp., Polygala sp. và Xidi klung đươ ̣c thể hiê ̣n ở Bả ng 3.1

t á s o ả h k t ậ v h n i s i v g n ủ h c 0 2 ố s g n ổ t n ê r t u a h n c á h k t ế i h c o a c c á c a ủ c n ẩ u h k g n á h k

ả u q

Đồ án tốt nghiệp

.

t ế K 1 3 g n ả B

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào bảng 3.1, ta có thể thấy đươ ̣c cao chiết nướ c cây Medinilla sp. có phổ kháng khuẩn rô ̣ng nhất, khảng đươ ̣c tất cả các chủ ng vi khuẩn khảo sát, vò ng kháng khuẩn trung bı̀nh 9,3mm – 12,83mm. Trong khi đó , cao chiết nướ c cây Polygala sp. có hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn vớ i 8/20 chủ ng vi khuẩn khảo sát, vò ng kháng khuẩn từ 3,0mm – 11,5mm. Cao chiết nướ c cây Xidi klung cũng cho hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn vớ i 8/20 chủ ng vi khuẩn khảo sát, vò ng kháng khuẩn từ 8,2mm – 11,5mm. Từ các kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết nướ c, cao chiết từ cây Medinilla sp, Pogygaly sp. và Xidi klung có hoạt tính sinh học khá tố t so với một số loại thực vật, đă ̣c biê ̣t là cây Medinilla sp. cho kết quả kháng tất cả chủ ng vi khuẩn khảo sát và hiê ̣u suất thu hồ i cao tố t.

3.3 Kết quả thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh xác định thành phần hóa học củ a cá c mẫu cao

chiế t nướ c

Kết quả thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh thành phần hó a ho ̣c củ a các mẫu cao chiết nướ c từ các cây thuốc đươ ̣c thể hiê ̣n ở bả ng 3.2

Đồ án tốt nghiệp

c ớ ư n t ế i h c o a c ̃u â m c á c a ủ c ̣c o h a ó h n ầ h p h n à h t ả u q t ế k g n ả B 2 . 3

g n ả B

Từ kết quả đi ̣nh tı́nh sơ bô ̣ thành phần hó a ho ̣c củ a các mẫu cao nướ c từ các cây, chúng tôi nhận thấy rằng nướ c là dung môi có khả năng tách chiết được rất nhiều hợp

Đồ án tốt nghiệp

chất từ các cây thuố c bao gồm các hợp chất thông thường và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thường được tìm thấy trong các mẫu cao chiết nướ c hầu hết các nhóm carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dương tính), nhưng không thấy có sự hiện diện của amino acid. Hoạt tính kháng khuẩn

của thực vật do chúng có các thành phần như alkaloids, flavonoid, hợp chất phenolic,

tannin. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy

tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào

hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Trong khi đó, trên hợp chất

phenolic thấy sự tồn tại của các dẫn chất như catechol, epicatechin, cinnamic acid,

hypericin warfarin hay trong hợp chất của flavonoids có dẫn chất flavone và flavonols,

ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh

dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ

màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme

và bám dính protein, các chức năng trên giúp tiêu diệt vi sinh vật.

Cao chiết nướ c củ a các cây thử nghiê ̣m hầu hết đều có sự hiê ̣n diê ̣n củ a saponin, cardiac glycosides, flavonoid, hơ ̣p chất phenolic, tanin (trừ Podocarpus sp.), steroid (trừ Eupatorium sp). Ta cũng thấy rằ ng cao chiết nướ c từ các cây không hoă ̣c ı́t thể hiê ̣n hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn như Podocarpus sp., Eupatorium sp., Elephantopus sp., Lantana sp., Acorus sp., Calamus sp., Streptocaulon sp. đều không có sư ̣ hiê ̣n diê ̣n củ a

alkaloid. Tuy nhiên, cây Medinilla sp. cũng không cho kết quả có sư ̣ hiê ̣n diê ̣n củ a alkaloid mă ̣c dù hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a cây tốt nhất trong số các cây thuố c đươ ̣c khảo sát đánh giá. Có thể hoa ̣t tı́nh củ a cây Medinilla sp. là do các hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn khác hiê ̣n diê ̣n trong cây như flavonoid, hợp chất phenolic, tannin. Các cây thuố c khác cũng cho kết quả kháng khuẩn tố t là Xidi klung, Polygala sp. đều có sư ̣ hiê ̣n củ a alkaloid, chứ ng tỏ hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn củ a các cây thuố c này có thể do alkaloid, flavonoid, hợp chất phenolic, tannin gó p phần ta ̣o thành.

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả củ a các thử nghiê ̣m trên, ta nhâ ̣n thấy cao chiết nướ c từ cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. là những loại cây thuốc có hoạt tính sinh học khá cao, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn khi cho kết quả kháng đươ ̣c nhiều loa ̣i vi khuẩn gây bê ̣nh, đă ̣c biê ̣t là bê ̣nh tiêu chảy. Mă ̣c dù hiê ̣u suất tách chiết cao không cao (≥ 21%) nhưng không thể không đề cao chất có hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c tố t như alkaloid, flavonoid, hơ ̣p chất phenolic, tanin có trong cao chiết nướ c củ a các cây kể trên. Chı́nh những hợp chất này hı̀nh thành nên hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c củ a các cao chiết ấy. Với những nghiên cứu cơ bản về hoạt tính sinh học của các cây này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về khả năng trị bệnh của chúng đặc biệt là khả năng trị bệnh tiêu chảy – một trong

những bệnh phổ biến nhất hiện.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

- Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tách chiết cao từ

các cây thuố c dân gian thì cao chiết từ nướ c cất có hiệu suất thu hồi cao nhất (30%) là cây Euodia sp.

- Trong các thử nghiê ̣m về hoa ̣t tı́nh kháng khuẩn, cao chiết nướ c có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất là cây Medinilla sp. (cho kết quả ứ c chế hoă ̣c đối kháng 20/20 chủng). Ngoài ra, các cây Polygala sp. và Xidi klung cũng cho kết quả ứ c chế hoă ̣c đố i kháng tốt ở mô ̣t số chủ ng vi khuẩn gây bê ̣nh tiêu chảy. Cây Polygala sp. kháng đươ ̣c 8/20 chủ ng vi khuẩn, cây Xidi klung đố i kháng hoă ̣c ứ c chế đươ ̣c 8/20 chủ ng vi khuẩn.

- Kết quả thành phần hóa ho ̣c trong các cao chiết từ các cây thuố c cho sự hiê ̣n diê ̣n nhiều thành phần hó a ho ̣c như: carbonhydrate, alkaloids, saponin, cardiac glycosides, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid.

4.2 Đề nghị

- Tiến hành định danh loài cho cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp. - Xác đi ̣nh giá tri ̣ MIC củ a các cao chiết nướ c từ các cây Polygala sp., Xidi klung và

Medinilla sp.

- Khảo sát khả năng trị tiêu chảy của cây Polygala sp., Xidi klung và Medinilla sp

trên mô hình động vật.

- Đinh lượng các thành phần hóa học có trong cây Polygala sp., Xidi klung và

Medinilla sp.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Andrew Chevallier Fnimh (2006), Dược thảo toàn thư, NXBTHTPHCM.

Hà Minh Hiển (2014), Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm, Luận án tiến sĩ dược học, Đại học y dược TPHCM.

http://moodle.yds.edu.vn/yds2/upload2/SDH/NCSThongTinDuaLenMang/HaMi nhHien-LA.pdf

TS. Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK Bài 2: steroid và cholesterol, Đại học Y dược TPHCM.

BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc Điểm Shigella.sp gây tiêu chảy tại bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM, Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-dac-diem-vi-khuan-shigella-gay-benh-tieu- chay-cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/

Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate.

http://docsachysinh.com/dsys-ebook/Phan1/chuong14/index.html

Đỗ Tấn Lợi (1992), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXBKHKT TPHCM.

Nguyễn Hữu Liêm (2013), Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella, Khóa luận tốt nghiệp 2010 – 2013, Đại học công nghệ TPHCM.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-ve-vi-khuan-salmonella-11369/

Hoàng Ngân (2013), Bệnh tả và cách điều trị bệnh tả hiệu quả, Tạp chí sức khỏe và đời sống.

Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm thông tin KH&CN TPHCM.

Trần Kim Hùng Nguyên (2005), Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum), Khóa luận tốt nghiệp 2001-2005, Trường đại học Nông Lâm.

http://luanvan.net.vn/luan-van/khoa-luan-khao-sat-thanh-phan-hoa-hoc-va-kha- nang-khang-mot-so-chung-vi-sinh-vat-duong-ruot-cua-cay-xuan-hoa-38059/

Dương Văn Sĩ (2010), Tìm hiểu về vi khuẩn Streptococcus faecalis (Enterococcus faecalis), Chyên đề tốt nghiệp, Trường đại học Nông Lâm TPHCM.

http://www.zbook.vn/ebook/tim-hieu-ve-vi-khuan-streptococcus-faecalis- enterococcus-faecalis-mon-kiem-nghiem-chat-luong-thuc-pham-ban-trinh-chieu- 29121/

Đồ án tốt nghiệp

Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM

Lương Văn Tiến và ctv (2015), Kết quả nghiên cứu bước đầu về thành phấn hóa học của dầu hạt lai (Aleurites moluccana), Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.

http://vafs.gov.vn/vn/wp-content/uploads/sites/2/2015/04/11-Dau-Lai-Tien.pdf

Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược vàng, Trường đại học công nghệ TPHCM.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-thanh-phan-hop-chat-thu-cap-trong- cay-luoc-vang-callisia-fragrans-lindl-wood-52390/

Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội

Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường đại học Dược Hà Nội.

Hồ Chí Tuấn (2009), Bài giảng Amino acid, Trường Đại học Y Hà Nội

Đào Thị Thùy (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của chế biến cổ truyền đến thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của vị thuốc viễn chí (Radix Polygalae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2004-2009, Trường đại học Y Dược Hà Nội.

http://125.235.10.97/opacdigital/wpDetail_View.aspx?Id=3214

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

Abba D., Inabo, H. I., Yakubu, S. E. and Olonitola, O. S. (2009), Phytochemical analysis and antibacterial activity of some powered herbal preparations marketed in Kaduna metropolis, Full Lengh Research Article.

Harborne B. (1989) Plant Phenolics. Academic Press, UK p: 6

Harborne B. (1998) Phytochemical Methods: A guide to modern techniques of plant analysis. Chapman & Hall Pub. London, UK pp: 40-42; 49; 84.

James Hamuel Doughari (2010), Phytochemicals: Extraction Methods, Basic Structures and Mode of Action, Potential Chemotherapeutic Agents.

James Hamuel Doughari (2012), Phytochemical: extraction methods, basic structures and mode of action as potential chemotherapeutic agents. Department of Microbiology, School of Pure and Applied Sciences, Federal Univercity of Technology, Yola Nigeria.

Jean B. (1995), Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants - Technique & Documentation, Lavoisier.

JH Doughari (2006), Antimicrobial Activity of Tamarindus indica Linn. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, December 2006; 5 (2): 597-603.

Jigna Parekh, Nehal Karathia and Sumitra Chanda (2006), Screening of some for potential antibacterial activity, traditionally used medicinal plants International Journal of Engineering and Applied Sciences

Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N. M., Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. (2007), Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii, The Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770.

Mon M. M.,Maw S. S. and Oo Z. K. (2011), Screening of antioxidant, anti-tumor and traditional herbs, from some Myanmar antimicrobial herbal drugs/diets International Journal of Bioscience, Biochemitry and Bioinformatics.

Nicholson R., Vermerris W. (2008), Phenolic Compound Biochemistry, Springer USA, pp: 2; 40-151.

Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Makkah Saudi Arabia.

Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agriculturae Slovenica.

Salami Olufunmilayo Olamide, Afolabi Qasim Olaitan (2014), Antimicrobial activities of hot water extract and phytochemical screening of Acalypha wilkesiana (Red

Đồ án tốt nghiệp

acalypha) on some selected organisms causing infection, International Journal of Engineering and Applied Sciences.

Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014), Antibacterial activity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic microorganisms, African Journal of Biotechnology.

Satheesh K. B., Sachetha K. N., Vadisha S. B., Sharmila K.P., Mahesh P. B. (2012) Preliminary phytochemical screening of various extracts of punica granatum peel, whole fruit and seeds, Nite University Journal of Health Science.

Saxena Mamta and Saxena Jyoti (2012), Phytochemical screening of Acorus calamus and Lantana Camara, Interational Research Journal of Pharmacy.

Silva N. C. C., Fermandes J. A. (2010), Biological properties of medicinal plants: a review of their antimicrobial activity, The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases.

Thilza I.B. , Sanni S., Zakari Adamu Isah , F.S. Sanni, Muhammed Talle, Musa Bamaiyi Joseph (2010), In vitro Antimicrobial activity of water extract of Moringa oleifera leaf stalk on bacteria normally implicated in eye diseases, Academia Arena, 2010;2(6):80-82

Valgas C., Souza S. M., Smania E. F. A., Smania Jr A. (2006), Screening methods to determine antibacterial activity of natural products, Brazillian Journal ò Microbiology.

Venketeshwer Rao (2012), Phytochemicals – A global perspective of their role in nutrition and health.

Wendakoon C., Calderon P., Gagnon D. (2012), Evaluation of selected medicinal plants extracted in different ethanol concentrations for antibacterial activity against human pathogens, Journal of Medicinally Active Plants.

Wilfred Vermerris and Ralph Nicholson (2006), Phenolic compound biochemistry, Published, Springer, Netherlands.

Witkowska A. M., Hickey. D. K., Alonso-Gomez M.. and Wilkinson M. (2013), Evaluation of antimicrobial activities of commercial herb and Spice extracts against selected food-borne bacteria, Journal of Food Research.

Indian Journal of Research roneus, Yadav P. D., Bharadwaj N. S. P.,Yedukondalu M., Methushala C. H., Ravi K. (2013), Phytochemical evaluation of nyctanthes arbortristis, nerium oleander and catharathnus in Pharmacy and Biotechnology.

Yusuf A. Z., Zakir A., Shemau Z., Abdullahi M., and Halima S. A. (2014) Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: CÁ CH PHA MỘT SỐ DUNG DI ̣CH THUỐ C THỬ

A.1. Cá c thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh carbonhydrate

 Thuốc thử Molisch: Hòa tan 5g α- napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành

100 ml

 Thuố c thử Feling:

 Thuốc thử Fehling A: hòa tan 34,6 g CuSO4.5H2O vào 500ml nước cất.

 Thuốc thử Fehling B: Hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O

vào 500 ml nước cất.

 Thuốc thử Barfoed:

 Thêm 10 ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất

 Cân 66,5 g Copper (II) acetate monohydrate

 Đun và khuấy đến khi tan hoàn

A.2. Cá c thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh Alkaloids

 Thuố c thử Mayer: Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước, sau đó đổ vào trong

dung dịch này 5 g KI được pha trong 10ml nước. Sau đó định mức lên 100 ml.

 Thuốc thử Dragendroff gồm 2 dung dịch:

 Dung dịch A: hòa tan 0,5 g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid

acetic 20%.

 Dung dịch B: dung dịch KI 40% pha trong nước. Khi sử dụng, trộn 20 ml

dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70ml nước.

 Thuốc thử Hager: Hòa tan 1 g acid picric vào 100ml nước cất

 Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2g iodine và 6g KI vào 100ml nước.

A.3. Cá c thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh Cardiac glycosides

 Thuốc thử Na nitro prusside (trong phả n ứ ng Legal): 1g Na nitrofer-ricyanide

và bổ sung 10 ml nước cất.

A.4. Cá c thử nghiê ̣m đi ̣nh tı́nh Cardiac glycosides

 Thuốc thử Ninhydrin: 0,5 g ninhydrin và bổ sung 10 ml n – butanol. Gia nhiệt 70 – 800C, khuấy đều bằng cá từ cho tới khi tan hoàn toàn. Định mức bằng n – butanol lên 100 ml.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ MỨC ĐỘ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC LOẠI CAO CHIẾT KHÁC NHAU TRÊN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CHỈ THỊ

B.1. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli O157:H7

Bả ng one way ANOVA

Source

Sum of Squares Mean

F-Ratio P-Value

1970.74 0.0000

Between groups 718.5 Within groups 0.833333 Total (Corr.)

719.333

Square 102.643 0.0520833

Bả ng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean

Homogeneous Groups X X X X X X X X X

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

9.16667 X X

11.0

Elephantopus sp. Xidi klung Polygala sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Eupatorium sp. Streptocaulon sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

13.1667 X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

B.2. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli 0208

Bả ng one way ANOVA

Source

Df Mean

F-Ratio

P-Value

Sum of Squares 661.74

Square 7 94.5342

432.16

0.0000

3.5

16 0.21875

Between groups Within groups Total (Corr.) 665.24

Đồ án tốt nghiệp

Bả ng Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean

Homogeneous Groups

Elephantopus sp.

0.0 X

Streptocaulon sp. Polygala sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Eupatorium sp. Xidi klung Medinilla sp. Ciprofloxacin

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 9.16667 X 10.6667 X 12.3333 X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

B.3 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn E. coli (K)

Bả ng one way ANOVA

Source

F-Ratio

P-Value

Sum of Squares

Mean Square

669.458

95.6369

483.22

0.0000

3.16667

16 0.197917

Between groups Within groups Total (Corr.)

672.625

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean

Homogeneous Groups

Eupatorium sp. Streptocaulon sp. Elephantopus sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Polygala sp. Xidi klung

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 8.33333 X 9.33333 XX 60

Đồ án tốt nghiệp

Medinilla sp. Ciprofloxacin

3 3

10.1667 X 13.1667 X

B.4 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn ETEC

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way ANOVA Df Mean Square 341.058

Sum of Squares 2387.41

102.96

0.0000

53.0

3.3125

Between groups Within groups Total (Corr.)

2440.41

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD Count Mean

CAY

Homogeneous Groups

Eupatorium sp. Elephantopus sp. Streptocaulon sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Polygala sp. Medinilla sp. Xidi klung Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 5.83333 9.83333 10.8333 31.0

X X X X X X X X X X X X

Đồ án tốt nghiệp

B.5 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Listeria innocua

F-Ratio

P-Value

Source

Bả ng one way Anova Df Mean Square 86.8795

Sum of Squares 608.156

26.82

0.0000

51.8333

16 3.23958

Between groups Within groups Total (Corr.)

659.99

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean

Homogeneous Groups

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 5.83333 X

10.0

Eupatorium sp. Streptocaulon sp. Elephantopus sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Polygala sp. Xidi klung Medinilla sp. Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

XX 10.3333 XX X

12.0

B.6 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Listeria monocytogenes

F-Ratio

P-Value

Source

Bả ng one way Anova Df Mean Square 109.065

Sum of Squares 763.458

25.79

0.0000

67.6667

16 4.22917

Between groups Within groups Total (Corr.)

831.125

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

Đồ án tốt nghiệp

CAY

Count Mean Homogeneous

Eupatorium sp. Xidi klung Elephantopus sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Polygala sp. Streptocaulon sp. Ciprofloxacin Medinilla sp.

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.66667 11.3333 12.1667 12.8333

Groups X X X X X X X X X XX XX X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

B.7 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn Salmonella dublin

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way Anova Df Mean Square 86.5461

Sum of Squares 605.823

830.84

0.0000

1.66667

16 0.104167

Between groups Within groups Total (Corr.)

607.49

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Elephantopus sp. Xidi klung Polygala sp. Podocarpus sp. Eupatorium sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Streptocaulon sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.0 12.1667

Groups X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Đồ án tốt nghiệp

B.8 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Salmonella enteritidis

Bả ng one way Anova

Source

F-Ratio

P-Value

Sum of Squares

Mean Square

508.573

72.6533

14.97

0.0000

77.6667

16 4.85417

Between groups Within groups Total (Corr.)

586.24

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Elephantopus sp. Xidi klung Polygala sp. Podocarpus sp. Eupatorium sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Streptocaulon sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 7.16667 13.0

Groups X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Đồ án tốt nghiệp

B.9 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Salmonella typhii (K)

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way Anova Df Mean Square 91.3795

Sum of Squares 639.656

26.42

0.0000

55.3333

16 3.45833

Between groups Within groups Total (Corr.)

694.99

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

Streptocaulon sp. Elephantopus sp. Eupatorium sp. Polygala sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Podocarpus sp. Medinilla sp. Xidi klung Ciprofloxacin

0.0 X 3 0.0 X 3 0.0 X 3 3.0 X 3 0.0 X 3 0.0 X 3 0.0 X 3 0.0 X 3 3 9.83333 X 3 9.83333 X X 11.0 3 X 12.5 3

B.10 Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Salmonella typhimurium

F-Ratio

P-Value

Source

Bả ng one way Anova Df Mean Square 99.3095

Sum of Squares 695.167

733.36

0.0000

2.16667

16 0.135417

697.333

Between groups Within groups Total (Corr.)

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

Đồ án tốt nghiệp

CAY

Count Mean Homogeneous

Elephantopus sp. Streptocaulon sp. Polygala sp. Podocarpus sp. Eupatorium sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin Xidi klung

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.8333 11.0 11.5

Groups X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

B.11. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Shigella boydii

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way Anova Df Mean Square 83.1607

Sum of Squares 582.125

13.81

0.0000

96.3333

16 6.02083

Between groups Within groups Total (Corr.)

678.458

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups X X X X X X X X X X

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Polygala sp. Elephantopus sp. Ciprofloxacin Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Xidi klung Streptocaulon sp. Medinilla sp. Eupatorium sp.

7.83333 X 13.8333 X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Đồ án tốt nghiệp

B.12. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Shigella flexneri

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way Anova Df Mean Square 99.4985

Sum of Squares 696.49

29.12

0.0000

54.6667

16 3.41667

Between groups Within groups Total (Corr.)

751.156

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

Podocarpus sp. Eupatorium sp. Polygala sp. Streptocaulon sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Xidi klung Medinilla sp. Elephantopus sp. Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 X 0.0 X 0.0 X 3.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 9.33333 X 9.83333 X 12.1667 X 13.1667 X

B.13. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Shigella sonnei

F-Ratio

P-Value

Source

Bả ng one way Anova Df Mean Square 365.827

Sum of Squares 2560.79

65.28

0.0000

89.6667

16 5.60417

Between groups Within groups Total (Corr.)

2650.46

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

Streptocaulon sp.

0.0 X 67

Đồ án tốt nghiệp

sp. Eupatorium sp. Polygala sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Podocarpus sp. Xidi klung Medinilla sp. Elephantopus sp. Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 3.83333 XX 9.33333 XX 9.33333 XX 12.1667 X X

33.0

B.14. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Vibrio alginolyticus

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way Anova Df Mean Square 127.357

Sum of Squares 891.5

679.24

0.0000

3.0

0.1875

Between groups Within groups Total (Corr.)

894.5

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

Streptocaulon sp. sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Xidi klung Elephantopus sp. Podocarpus sp. Eupatorium sp. Polygala sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin.

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 9.16667 X 10.6667 X 16.1667 X

B.15. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Vibrio cholerae

Bả ng one way Anova

Đồ án tốt nghiệp

Source

F-Ratio

P-Value

Sum of Squares 629.167

Df Mean Square 89.881

539.29

0.0000

2.66667

16 0.166667

Between groups Within groups Total (Corr.)

631.833

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups X X X X X X X X X X X

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0

Elephantopus sp. Xidi klung Polygala sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Eupatorium sp. Streptocaulon sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

13.3333 X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Đồ án tốt nghiệp

B.16. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Vibrio harveyi

Source

F-Ratio

P-Value

Between groups Within groups Total (Corr.)

1087.16 152.833 1239.99

16.26

0.0000

Bả ng one way Anova Sum of Squares Df Mean Square 155.308 7 16 9.55208 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Elephantopus sp. Xidi klung Streptocaulon sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Polygala sp. Eupatorium sp. Medinilla sp. Podocarpus sp. Ciprofloxacin sp.

Groups X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 8.0 XX 10.0 XX 10.3333 XX 15.8333 XX X

18.0

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

B.17. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Vibrio parahaemolyticus

Source

F-Ratio

P-Value

Bả ng one way Anova Df Mean Square 81.2083

Sum of Squares 568.458

519.73

0.0000

2.5

16 0.15625

Between groups Within groups Total (Corr.)

570.958

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X

X X

Streptocaulon sp. Xidi klung Elephantopus sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Eupatorium sp. Polygala sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

8.16667 9.83333 11.6667

B.18. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Pseudomonas (K)

Source

F-Ratio

Sum of Squares Df

P-Value

Between groups Within groups Total (Corr.)

Bả ng one way Anova Mean Square 83.8571 0.25

587.0 4.0 591.0

335.43

0.0000

7 16 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

Streptocaulon sp. Xidi klung Elephantopus sp. Podocarpus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Eupatorium sp. Polygala sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 8.16667 X 9.66667 X 12.1667 X

Đồ án tốt nghiệp

B.19. Xử lý thống kê mức độ kháng khuẩn của các loại cao chiết trên nhóm vi khuẩn

Mẫu Staphylococcus aureus

Source

F-Ratio

P-Value

Between groups Within groups Total (Corr.)

Bả ng one way Anova Mean Square 84.5461 3.63542

Sum of Squares 591.823 58.1667 649.99

23.26

0.0000

7 16 23 Multiple Range Tests for VALUE by CAY Method: 95.0 percent Tukey HSD

CAY

Count Mean Homogeneous

Groups

Streptocaulon sp. Xidi klung Polygala sp. Elephantopus sp. Calamus sp. Euodia sp. Lantana sp. Acorus sp. Eupatorium sp. Podocarpus sp. Medinilla sp. Ciprofloxacin

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 0.0 X 6.16667 X 9.66667 XX 9.83333 XX 12.1667 X