Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ

NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY CỦA CAO CHIẾT

ETHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hƣớng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Trƣơng Thị Minh Hiền

MSSV: 1151110051 Lớp: 11DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ

sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm

Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công

bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam

đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viên

Trƣơng Thị Minh Hiền

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,

ngƣời đã giúp đỡ, định hƣớng và tận tình hƣớng dẫn em suốt quá trình thực hiện

khóa luận tốt nghiệp. Cảm ơn thầy vì đã truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức và

kinh nghiệm quý báu.

Em cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng

Đại học Công Nghệ TP.HCM, quý thầy cô hiện đang giảng dạy và làm việc tại

Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng đã truyền dạy rất nhiều

kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và các anh chị đã luôn

động viên và giúp đỡ em vƣợt qua khó khăn trong suốt thời gian học tập và nghiên

cứu.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viên

Trƣơng Thị Minh Hiền

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC ................................................................................................................... i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH ...................................................................................... vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................... ix

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1

2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2

4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................ 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp. ................................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc ........................................................................................................ 3

1.1.2. Phân loại khoa học ........................................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm và sự phân bố ................................................................................... 3

1.1.4. Thành phần hóa học thƣờng có trong thực vật ................................................. 4

1.1.4.1. Alkaloid ......................................................................................................... 4

1.1.4.2. Carbohydrate ................................................................................................. 6

1.1.4.3. Flavonoid ....................................................................................................... 7

1.1.4.4. Tannin ........................................................................................................... 9

1.1.4.5. Hợp chất phenolic ....................................................................................... 10

1.1.4.6. Glycoside ..................................................................................................... 11

1.1.4.7. Steroid ......................................................................................................... 14

1.1.5. Công dụng ...................................................................................................... 15

1.2. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật ......... 16

1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn .................................................................. 16

1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn ....................................................................................... 16

1.2.3. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam

i

Đồ án tốt nghiệp

................................................................................................................................... 19

1.2.3.1. Tình hình kháng khuẩn trên Thế Giới ......................................................... 19

1.2.3.2. Tình hình kháng khuẩn tại Việt Nam .......................................................... 20

1.3. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy ........................................................................... 20

1.3.1. Khái niệm ....................................................................................................... 20

1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh ................................................................................... 21

1.3.2.1. Do virus ....................................................................................................... 21

1.3.2.2. Do vi khuẩn ................................................................................................. 22

1.3.2.3. Do ký sinh trùng .......................................................................................... 22

1.3.2.4. Do các nguyên nhân khác ........................................................................... 23

1.3.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ............................................................................. 23

1.3.3.1. Tiêu chảy do thẩm thấu ............................................................................... 23

1.3.3.2. Tiêu chảy do xuất tiết .................................................................................. 24

1.3.3.3. Tiêu chảy do tăng nhu động ruột ................................................................ 24

1.3.3.4. Tiêu chảy do tổn thƣơng niêm mạc ruột ..................................................... 24

1.4. Đặc điểm một số vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy điển hình .......................... 24

1.4.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli .................................................................... 24

1.4.1.1. Đặc điểm ..................................................................................................... 25

1.4.1.2. Độc tính ....................................................................................................... 25

1.4.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. .................................................................... 26

1.4.2.1. Đặc điểm ..................................................................................................... 26

1.4.2.2. Độc tính ....................................................................................................... 27

1.4.3.Nhóm vi khuẩn Shigella spp. . ......................................................................... 27

1.4.3.1. Đặc điểm ..................................................................................................... 27

1.4.3.2. Độc tính ....................................................................................................... 28

1.4.4. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ............................................................................ 28

1.4.4.1. Đặc điểm ..................................................................................................... 28

1.4.4.2. Độc tính ....................................................................................................... 29

1.5. Một số mô hình đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của thực vật trên động vật

ii

Đồ án tốt nghiệp

................................................................................................................................... 30

1.5.1. Mô hình đánh giá khả năng trị tiêu chảy ........................................................ 30

1.5.1.1. Mô hình castor oil ....................................................................................... 30

1.5.1.2. Mô hình magnesium sulfate (MgSO4) ........................................................ 31

1.5.1.3. Mô hình serotonin ....................................................................................... 31

1.5.2. Mô hình khảo sát enteropooling ..................................................................... 32

1.5.2.1. Mô hình prostaglandin E2 ........................................................................... 32

1.5.2.2. Mô hình irinotecan ...................................................................................... 33

1.5.2.3. Mô hình sử dụng Heat-labile toxin ............................................................. 33

1.5.2.4. Mô hình castor oil ....................................................................................... 34

1.5.3. Mô hình khảo sát sự di chuyển ở ruột non ..................................................... 34

1.5.3.1. Mô hình castor oil ....................................................................................... 35

1.5.3.2. Mô hình prostaglandin E2 ........................................................................... 35

1.5.3.3. Mô hình irinotecan ...................................................................................... 35

CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 36

2.1. Địa điểm và thời gian ...................................................................................... 36

2.1.1. Địa điểm thu mẫu ........................................................................................... 36

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 36

2.1.3. Thời gian nghiên cứu ..................................................................................... 36

2.2. Vật liệu ............................................................................................................. 36

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................................... 36

2.2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 36

2.2.2.1. Vi sinh vật chỉ thị ........................................................................................ 36

2.2.2.2. Động vật thí nghiệm .................................................................................... 36

2.2.3. Môi trƣờng, hóa chất và thuốc ....................................................................... 37

2.2.4. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................... 37

2.2.4.1. Dụng cụ ....................................................................................................... 37

2.2.4.2. Thiết bị ........................................................................................................ 37

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 37

iii

Đồ án tốt nghiệp

2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật ........................................... 37

2.3.2. Phƣơng pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị ...................................................... 38

2.3.3. Phƣơng pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật .......................................... 38

2.3.4. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào ............................................................. 39

2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu .......................................................................... 39

2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ......................... 39

2.3.7. Phƣơng pháp gây tiêu chảy bằng castor oil trên mô hình chuột .................... 40

2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng di chuyển ở ruột ......................................... 40

2.3.9. Phƣơng pháp khảo sát enteropooling ............................................................. 41

2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................ 41

2.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 42

2.4.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu quy trình tách chiết cao ethanol 70% từ

Elephantopus sp. ...................................................................................................... 42

2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE .............................. 43

2.4.3. Đánh giá độc tính của EEE trên mô hình chuột ............................................. 45

2.4.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của EEE trên mô hình chuột . 45

2.4.4.1. Chuẩn bị chuột trƣớc khi thí nghiệm .......................................................... 45

2.4.4.2. Thí nghiệm 3.1: Thử nghiệm khả năng trị tiêu chảy của EEE trên mô hình

chuột ......................................................................................................................... 45

2.4.4.3. Thí nghiệm 3.2: Thử nghiệm enteropooling ............................................... 46

2.4.4.4. Thí nghiệm 3.3: Khảo sát sự di chuyển ở ruột non ..................................... 46

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 48

3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao ......................................................................... 48

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% đối với

nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy ................................................................................. 48

3.2.1. Kết quả mức độ kháng khuẩn trên nhóm Vibrio spp. của EEE ..................... 49

3.2.2. Kết quả kháng khuẩn trên các vi khuẩn khác ................................................. 50

3.3. Kết quả đánh giá độc tính của cao ethanol 70% trên mô hình chuột ........ 53

iv

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Kết quả đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của cao ethanol 70% trên mô hình

chuột ......................................................................................................................... 54

3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng trị tiêu chảy của EEE bằng dầu thầu dầu trên mô

hình chuột ................................................................................................................. 54

3.4.2. Kết quả về thử nghiệm enteropooling ............................................................ 57

3.4.3. Kết quả về khả năng di chuyển ở ruột non ..................................................... 60

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 65

4.1. Kết luận ............................................................................................................ 65

4.2. Đề nghị .............................................................................................................. 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 66

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ....................................................................................................... 1

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ VỀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY TRÊN MÔ HÌNH

CHUỘT ....................................................................................................................... 7

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP: Andenozin Triphotphat

cAMP: Cyclic Adenosine Monophosphate

Cip 500: Ciprofloxacin 500 µg/ml

Cip 8: Ciprofloxacin 8 µg/ml

DNA: Deoxyribo Nucleic Acid

EEE: Ethanolic extract of Elephantopus sp.

EHEC: Enterohaemorrhagic E.coli

ETEC: Enterotoxigenic E.coli

HUS: Haemolytic Uraemic Syndrom

PABA: p Aminobenzoic Acid

SD: Standard Deviation

STEC: Shiga Toxin-producing E.coli

vi

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Hình thái Elephantopus sp. (Mercadante, 2013) ........................................ 4

Hình 1.2. Một số loại alkaloid. (A) Samandarin, (B) Samanin .................................. 5

Hình 1.3. Cấu trúc chung của flavonoid (A) và các dạng flavonoid, (B)

Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid ...................................................... 8

Hình 1.4. Caffeic acid ............................................................................................... 11

Hình 1.5. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt,

2004).......................................................................................................................... 17

Hình 1.6. Cơ sở đánh giá các loại phân (Thompson, 2006) ..................................... 21

Hình 1.7. Hình thái của Rotavirus (De Junio Del, 2013) ......................................... 22

Hình 1.8. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005) ....... 25

Hình 1.9. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005) ............................... 26

Hình 1.10. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) ......................... 28

Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004) .............................. 29

Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu .................................................................... 39

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................. 42

Hình 2.3. Quy trình tách chiết cao EEE ................................................................... 43

Hình 2.4. Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE đối với vi khuẩn chỉ

thị ............................................................................................................................... 44

Hình 3.1. Dịch của Elephantopus sp. qua các lần ngâm ethanol 70% ..................... 48

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và Ciprofloxacin trên nhóm Vibrio spp.49

Hình 3.3. Đƣờng kính vòng ức chế của EEE đối với V.alginolyticus ...................... 50

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và kháng sinh Ciprofloxacin trên các

chủng vi khuẩn khác .................................................................................................. 50

Hình 3.5. Đƣờng kính vòng kháng của EEE đối với E.coli ..................................... 51

Hình 3.6. Đƣờng kính vòng kháng khuẩn của EEE đối với S.flexneri ..................... 51

Hình 3.7. Kết quả đánh giá độc tính của EEE trên chuột ......................................... 53

Hình 3.8. Tỷ lệ chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức ......................................... 54

vii

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.9. Thời gian bị tiêu chảy và khả năng ức chế tiêu chảy giữa các nghiệm thức

................................................................................................................................... 56

Hình 3.10. Khả năng ức chế sự mất nƣớc ở ruột giữa các nghiệm thức .................. 58

Hình 3.11. Tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than giữa các nghiệm thức ................. 60

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Những nhóm chính của hợp chất thực vật có hoạt tính kháng khuẩn

(Cowan, 1999) ........................................................................................................... 17

Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng trị tiêu chảy ............................................. 46

Bảng 2.2. Thí nghiệm khảo sát enteropooling .......................................................... 46

Bảng 2.3. Thí nghiệm khảo sát sự di chuyển ở ruột ................................................. 47

Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và kháng sinh Ciprofloxacin ......... 49

Bảng 3.2. Thời gian và lƣợng phân tiêu chảy ở các nghiệm thức ............................ 55

Bảng 3.3. Thể tích dịch ruột và tỷ lệ ức chế sự co bóp ở ruột .................................. 57

Bảng 3.4. Chiều dài di chuyển của than và tỷ lệ ức chế sự di chuyển trong ruột..... 59

ix

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe đang đƣợc quan tâm rộng rãi trên thế giới.

Đây là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, đặc

biệt là ở các nƣớc đang phát triển. Trong đó trẻ em chiếm đa số, trung bình hằng

năm có khoảng 1,6 triệu trẻ em tử vong vì tiêu chảy và 4 tỷ trẻ dƣới 5 tuổi bị tiêu

chảy cấp. Bệnh tiêu chảy vẫn là mối đe dọa toàn cầu đối với y tế công cộng, ƣớc

tính mỗi năm trên thế giới có khoảng 3 đến 5 triệu ngƣời mắc bệnh, trong đó có

100.000 đến 120.000 ngƣời chết theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2013). Tại Việt Nam,

tiêu chảy là một trong 10 nguyên nhân hàng đầu gây bệnh nghiêm trọng và dẫn đến

tử vong. Theo thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng Bình Thuận, chỉ trong hai

tháng 4 và 5/2015, toàn tỉnh Bình Thuận đã có 984 trƣờng hợp bị tiêu chảy.

Một sai lầm thƣờng gặp trong điều trị tiêu chảy hiện nay là việc sử dụng kháng

sinh khá tràn lan và bừa bãi. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách, không

những tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh mà tiêu diệt luôn cả các vi khuẩn có lợi trong

ruột, đồng thời làm xuất hiện những chủng vi khuẩn gây bệnh độc hại và kháng với

nhiều loại kháng sinh. Một số trƣờng hợp sử dụng kháng sinh lại gây phản tác dụng,

giống nhƣ khi nhiễm Escherichia coli sinh độc tố Shiga, việc dùng kháng sinh lúc

này sẽ làm tăng sự phóng thích độc tố, dẫn đến hội chứng tan huyết và làm tăng

urea huyết.

Mặt khác, do việc lạm dụng kháng sinh trong tình trạng hiện nay, khiến cho

việc điều trị tiêu chảy bằng kháng sinh không còn hiệu quả nhƣ trƣớc mà còn đem

lại nhiều tác dụng phụ. Vì thế, con ngƣời đang dần trở về với thiên nhiên bằng cách

sử dụng những bài thuốc cổ xƣa với nhiều loại thảo dƣợc đƣợc biết đến có tác dụng

trong việc điều trị tiêu chảy. Tuy nhiên, các cây thuốc đƣợc sử dụng chủ yếu dựa

vào kinh nghiệm dân gian và đƣợc truyền miệng từ đời này sang đời khác. Do đó,

liều lƣợng sử dụng, hoạt tính trị liệu và độc tính của 1 số cây thuốc vẫn chƣa đƣợc

xác định. Vì thế việc đánh giá hoạt tính sinh học của 1 số cây thuốc dựa trên kinh

nghiệm dân gian là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn

1

Đồ án tốt nghiệp

nhƣ vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp.”. Đề tài

đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm –

Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM và Phòng Thí nghiệm động vật

tại Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, cơ sở Linh Trung, quận Thủ

Đức.

2. Mục đích nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng khuẩn đối với các vi

khuẩn gây bệnh đƣờng ruột và hoạt tính trị tiêu chảy trên mô hình động vật từ cao

chiết ethanol của cây Elephantopus sp.

3. Nội dung nghiên cứu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% của cây Elephantopus

sp. trên các nhóm vi sinh vật chỉ thị Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella

spp., Vibrio spp..

Đánh giá độc tính cao chiết ethanol 70% của cây Elephantopus sp. trên mô

hình động vật.

Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của cao chiết ethanol 70% từ cây Elephantopus

sp. trên mô hình động vật bằng các thử nghiệm đánh giá dấu hiệu lâm sàng, thử

nghiệm enteropooling và khảo sát tốc độ di chuyển trong ruột.

4. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy cây Elephantopus

sp. chỉ tiến hành trên dung môi ethanol 70%.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cây Elephantopus sp. chỉ thực hiện với những

nhóm vi khuẩn gây bệnh ở đƣờng ruột.

Hiệu quả trị tiêu chảy cây Elephantopus sp. chỉ mới đƣợc đánh giá trên mô

hình chuột.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp.

1.1.1. Nguồn gốc

Elephantopus sp. là 1 chi thuộc họ Cúc (Asteraceae) có nguồn gốc ở Trung và

Nam Mỹ, từ Argentina đến Mexico bao gồm cả vùng biển Caribbean (Flann, 2009).

Một số loài khác có nguồn gốc ở Ấn Độ và Himalayas (Press và ctv, 2009). Hiện

nay, Elephantopus sp. đƣợc trồng phổ biến ở nhiều quốc gia và đƣợc biết đến với

nhiều tên gọi khác nhau nhƣ chỉ thiên, cúc chỉ thiên hoa trắng, cỏ lƣỡi mèo, cúc

chân voi mềm, địa đảm thảo, co tát nai (dân tộc Thái), nhả đản (dân tộc Tày) theo

Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2008).

Elephantopus sp. có khoảng 26 loài, trong đó một số loài đã đƣợc mô tả từ rất

sớm điển hình nhƣ Elephantopus scaber đƣợc mô tả lần đầu vào năm 1753 bởi

Lour. Elephantopus mollis đƣợc Kunth mô tả vào năm 1820 (Nguyễn Duy Chính,

2009).

1.1.2. Phân loại khoa học

Theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2008) thì Elephantopus sp. đƣợc

phân loại khoa học nhƣ sau:

 Giới : Plantae

 Ngành : Magnoliophyta

 Lớp : Magnoliopsida

 Bộ : Asterales

 Họ : Asteraceae

 Chi : Elephantopus

1.1.3. Đặc điểm và sự phân bố

Elephantopus sp. là loài cây thân thảo, thân cây đƣợc phủ đầy lông với chiều

cao trung bình 0,5 – 1 m. Lá mọc dài theo thân và không có cuống, các phiến thon

có chiều dài khoảng 10 – 15 cm, gốc ôm lấy thân, các mép khía lƣợn và có lông

mềm ngắn ở mặt dƣới, các lá trên bị tiêu giảm dần. Cụm hoa dài theo thân, nhánh

mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung. Các hoa cao 8 mm, mang 4 hay 5

3

Đồ án tốt nghiệp

hoa trắng và quả bế cao 3 mm, có rãnh. Mào lông có 5 tơ và cây ra hoa thƣờng vào

tháng 6 và 7 (Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, 2008).

Elephantopus sp. thƣờng mọc nhiều ở các vùng nhiệt đới nhƣ các nƣớc châu

Phi, Đông Nam Á và Thái Bình Dƣơng. Ngoài ra, Elephantopus sp. còn đƣợc tìm

thấy ở dọc các bờ biển Philippines và ở các nƣớc Mexico, Đài Loan, Borneo theo

Flann (2009). Ở nƣớc ta Elephantopus sp. thƣờng mọc ở rừng thƣa, rừng thông và

dọc đƣờng đi ở nhiều nơi, nhất là ở các tỉnh Tây Nguyên (Bùi Xuân Phƣợng, 2014).

Tại Việt Nam chúng ta có thể gặp một trong hai loài là Elephantopus scaber hay

Elephantopus tomentosus (Phùng Văn Phê, 2014).

1.1.4. Thành phần hóa học thường có trong thực vật

1.1.4.1. Alkaloid

a) Khái niệm

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa N, đa số có nhân dị vòng và là dẫn

xuất của các acid amin. Alkaloid thƣờng đƣợc tìm thấy ở các chất chuyển hóa phụ

trong thực vật. Sau này, ngƣời ta đã tìm thấy alkaloid còn có trong động vật nhƣ

samandarin và samanin lấy từ tuyến da con Salamandra maculosa và Salamandra

altra. Bufotenin, serotonin, bufotenidin và dehydrobufotenin là những chất độc lấy

4

Đồ án tốt nghiệp

từ các loài cóc Bufo. Batrachotoxin có trong tuyến da loài ếch độc Phyllobates

aurotaenia.

Tuy nhiên, cũng có những chất đƣợc xếp vào alkaloid nhƣng N không ở dị

vòng mà ở mạch nhánh nhƣ capsaicin trong ớt (Capsicum annuum L.). Một số

alkaloid không có phản ứng kiềm nhƣ colchicin lấy từ hạt tỏi độc (Colchicum

autumnale L.), ricinin lấy từ hạt thầu dầu (Ricinus communis L.) và alkaloid có

phản ứng acid yếu nhƣ arecaidin và guvacin trong hạt cau (Arca catechu L.) theo

Phạm Thanh Kỳ (1998).

b) Phân loại

Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm:

 Nhóm pyridin: Piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin,

cytisin, nicotin, spartein và pelletierin.

 Nhóm isoquinolin: Các alkaloid thuộc gốc thuốc phiện nhƣ morphin,

codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin và

berberin.

 Nhóm pyrrolidin: Hygrin, cuscohygrin và nicotin.

 Nhóm tropan: Atropin, cocain, ecgonin và scopolamin.

 Nhóm quinolin: Quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin,

strychnin, brucin, veratrin và cevadin.

 Nhóm purin: Các xanthin nhƣ caffein, theobromin và theophyllin.

 Nhóm indol:

 Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin và serotonin.

 Các ergolin: Các alkaloid từ ngũ cốc, cỏ nhƣ ergin, ergotamin,…

5

Đồ án tốt nghiệp

 Các β-cacbolin: Harmin, harmalin, yohimbin, reserpin và emetin (Vũ

Xuân Tạo, 2013).

c) Đặc điểm

Những alkaloid mà thành phần cấu tạo không có oxy thƣờng ở thể lỏng nhƣ

nicotin (C10H14N2) và coniin (C8H17N). Các alkaloid ở thể rắn thƣờng kết tinh đƣợc

và có điểm nóng chảy rõ ràng. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi đƣợc và bền

vững, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi. Đa số các alkaloid không có mùi, thƣờng

có vị đắng và một số ít có vị cay nhƣ capsaixin, piperin,… Thông thƣờng các

alkaloid kiềm không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại các

muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc và hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu

cơ ít phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng

dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.

Đa số các alkaloid có tính kiềm yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi

muối của nó bằng những chất có tính kiềm trung bình và mạnh. Khi định lƣợng

alkaloid bằng phƣơng pháp đo acid, ngƣời ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn

chỉ thị màu cho thích hợp. Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và

phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho

tủa rất ít tan trong nƣớc, tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là

alkaloid với 1 nhóm anion lớn thƣờng là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ

hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác

dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết

có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid

(Phạm Thanh Kỳ, 1998).

d) Vai trò

Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, 1 số loại có tác động lên hệ

thần kinh nhƣ morphin, codein, cocain,… Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và

giúp chống ung thƣ (Vũ Xuân Tạo, 2013).

1.1.4.2. Carbohydrate

a) Khái niệm

6

Đồ án tốt nghiệp

Carbohydrate là hợp chất hữu cơ đƣợc tạo nên từ các nguyên tố C, H, O và có

công thức cấu tạo là Cm(H2O)n, thƣờng thì m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).

b) Phân loại

Carbohydrate đƣợc chia thành 3 nhóm là monosaccharide, disaccharide và

polysaccharide (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).

c) Đặc điểm

Monosaccharide, disaccharide có đặc tính chung là dễ hoà tan trong nƣớc,

đồng hoá và sử dụng nhanh để tạo glycogen. Các carbohydrate đơn giản này đều có

vị ngọt, khi vào cơ thể xuất hiện tƣơng đối nhanh trong máu.

Polysaccharide tồn tại dƣới nhiều dạng, mỗi dạng đều có những đặc điểm và

tác dụng cũng nhƣ dƣợc tính riêng (Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh, 2011).

d) Vai trò

Cung cấp năng lƣợng, đóng vai trò là cấu trúc, tạo hình (cellulose,…), giúp

bảo vệ (mucopolysaccharide) và chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho

cơ thể) theo Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh (2011).

1.1.4.3. Flavonoid

a) Khái niệm

Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố

sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và

B đƣợc nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid có màu

vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong thực

7

Đồ án tốt nghiệp

vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng nhƣ carotenoid,

anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011).

b) Phân loại

Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 C nên

các flavonoid đƣợc chia thành 3 nhóm chính:

 Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid.

 Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid.

 Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011).

c) Đặc điểm

Flavonoid tạo đƣợc phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là

xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Do từng phân nhóm của flavonoid có cấu tạo

riêng nên chúng vừa có tính chất chung vừa có những khác biệt về tính chất vật lý

và hóa học. Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức

với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ƣa béo thì càng

có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011).

d) Vai trò

8

Đồ án tốt nghiệp

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa bởi các gốc tự do nhƣ OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào,

ung thƣ, tăng nhanh sự lão hóa,...) làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng.

Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu

cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl,… giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá

trình oxy có hại nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các

chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến

mạch, lão hóa, tổn thƣơng do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm

giảm thƣơng tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan.

Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự

phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng nhƣ

histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien,… (Quỳnh Ngọc, 2011).

1.1.4.4. Tannin

a) Khái niệm

Tannin là 1 hợp chất polyphenol có trong thực vật có khả năng tạo liên kết bền

vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và

alkaloid). Tannin có vị chát, tan trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa

số không tan trong các dung môi hữu cơ, tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì,

thuỷ ngân, kẽm, sắt) theo Ngô Văn Thu (2011).

b) Phân loại

Dựa vào khả năng phân ly mà tannin đƣợc chia thành 2 loại là tannin thủy

phân (tanin pyrogalic) và tannin ngƣng tụ (tanin pyrocatechic) theo Ngô Văn Thu

(2011).

 Tannin thủy phân đƣợc thuỷ phân bằng acid (hoặc enzyme tanaza) tạo

thành phần đƣờng (glucose) và phần không đƣờng (các acid) nối với nhau

theo dây nối este, tủa xanh đen với muối sắt (III) và dễ tan trong nƣớc nhƣ

Ðại hoàng, Ðinh hƣơng, lá cây Bạch đàn.

 Tannin không thủy phân đƣợc thì dễ tạo thành chất phlobaphen không tan,

thƣờng là chất trùng hợp từ catechin, leucoanthoxyanidin hay là những chất

9

Đồ án tốt nghiệp

đồng trùng hợp của 2 loại tủa xanh với muối sắt (III) nhƣ Vỏ quế,

Canhkina, Ðại hoàng.

c) Đặc điểm

Tanin pyrogalic khi đun ở 180 - 200oC sẽ thu đƣợc pyrogallol là chủ yếu và

thƣờng dễ tan trong nƣớc. Ngoài ra, tanin pyrogalic còn cho kết tủa bông với chì

acetate 10% và cho tủa xanh đen với muối sắt (III).

Tanin pyrocatechic khi đun sẽ thu pyrocatechin là chủ yếu và khó tan trong

nƣớc hơn tannin pyrogallic. Tanin pyrocatechic kết tủa bông với nƣớc brom và cho

kết tủa màu xanh đậm với muối sắt (III) theo Ngô Thị Thùy Dƣơng (2012).

d) Vai trò

Tannin giúp bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng nhƣ thuốc trừ

sâu, tác dụng kháng khuẩn, thƣờng dùng làm thuốc súc miệng và có công dụng

chữa viêm ruột, tiêu chảy (Ngô Thị Thùy Dƣơng, 2012).

1.1.4.5. Hợp chất phenolic

a) Khái niệm

Hợp chất phenolic là các hợp chất có 1 hoặc nhiều vòng thơm với 1 hoặc

nhiều nhóm hydroxyl, chúng đƣợc phân bố rộng rãi trong thực vật và các sản phẩm

trao đổi chất của thực vật. Hơn 8000 cấu trúc phenolic đã đƣợc tìm thấy từ các phân

tử đơn giản nhƣ các acid phenolic đến các hợp chất polymer nhƣ tannin. Sự tích lũy

các hợp chất phenolic phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh lý và vị trí địa lý của các

loài cây (Shetty và ctv, 2006).

b) Phân loại

Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể chia thành 10 nhóm

chính. Các hợp chất phenolic thực vật bao gồm stilben, lignan, phenolic acid,

flavonoid và tannin (Shetty và ctv, 2006).

c) Đặc điểm

Đa số các hợp chất phenolic đƣợc tổng hợp từ phenylalanine. Ở thực vật nhóm

phenolic chủ yếu đƣợc tìm thấy là caffeic acid, đây là 1 trong những hợp chất đơn

giản có độc tính sinh học và đƣợc cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic. Một số

10

Đồ án tốt nghiệp

phenolic nhƣ furanocoumarin thì không gây độc, nhƣng khi tiếp xúc với nhiệt độ

cao, dƣới ánh sáng có bƣớc sóng gần với tia tử ngoại (UV-A) thì nó trở nên rất độc

(Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012).

Hình 1.4. Caffeic acid

d) Vai trò

Tạo hƣơng vị và màu sắc cho các loại cây trồng, rau trái. Ngoài ra, chúng có

khả năng ức chế sự phát triển của nấm sợi, bảo vệ thực vật chống lại sự tấn công

của các vi sinh vật, côn trùng và động vật ăn cỏ. Đây còn là chất chống oxy hóa tự

nhiên, chống ung thƣ, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm. Một hợp chất phenolic

khác là chlorogenic acid đƣợc biết nhƣ là chất gây ra viêm da dị ứng ở ngƣời

(Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012).

1.1.4.6. Glycoside

a) Khái niệm

Glycoside là những sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng. Cấu tạo gồm 1 phần đƣờng

(glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đƣờng (aglycon) theo Vũ Kim Dung và

ctv (2011).

b) Phân loại

Dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết giữa chúng mà chia

thành 3 nhóm (Vũ Kim Dung và ctv, 2011).

11

Đồ án tốt nghiệp

c) Đặc điểm

Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol).

Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycoside phụ thuộc vào phần

aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị

hòa tan trong nƣớc, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trƣng (Trần Trƣờng Hận, 2010).

d) Vai trò

Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dƣỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có

vai trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, do thủy phân tạo ra một số chất kháng

khuẩn thƣờng tập trung ở vỏ và hạt (solanin ở khoai tây) theo Trần Trƣờng Hận

(2010).

 Saponin

a) Khái niệm

Saponin thuộc nhóm glycoside. Dƣới tác dụng của các enzyme thực vật, vi

khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (sapogenin) và phần

carbohydrate theo Ngô Văn Thu (2011).

b) Phân loại

Saponin đƣợc chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid

theo Nguyễn Tấn Thịnh (2013).

12

Đồ án tốt nghiệp

c) Đặc điểm

Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan đƣợc trong nƣớc, alcohol

và rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nƣớc sẽ làm giảm

sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).

d) Vai trò

Saponin có nhiều tác dụng dƣợc lý nhƣ chữa ho, long đờm, lợi tiểu (liều cao

gây nôn mửa, đi lỏng). Một số saponin có tác dụng chống viêm, 1 số có tác dụng

kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế virus. Ngoài ra, saponin có thể gây kích ứng

niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt (Ngô Văn Thu, 2011).

 Cardiac glycoside

a) Khái niệm

Cardiac glycoside là 1 nhóm của glycoside, bao gồm 2 phần là phần aglycone

(không đƣờng) và các glycone hay phần đƣờng (Karkare, 2007).

b) Đặc điểm

Cardiac glycoside là những chất kết tinh, không màu, có vị đắng. Chúng tan

trong các dung môi phân cực và dễ bị thủy phân trong môi trƣờng acid theo Karkare

(2007).

c) Vai trò

13

Đồ án tốt nghiệp

Ở nồng độ thấp, cardiac glycoside có tác dụng điều hòa nhịp tim, nhƣng khi ở

nồng độ cao cardiac glycoside lại gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy và giảm

sức co bóp của tim (Karkare, 2007).

 Anthraquinone glycoside

a) Khái niệm

Anthraquinone glycoside thƣờng tồn tại dƣới dạng glycoside. Ða số các

anthraquinone glycoside là các polyoxy anthraquinone và nhân thƣờng gắn các

nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH... Tuỳ theo vị trí các nhóm chức đính vào

nhân mà có các dẫn chất khác nhau (Ngô Văn Thu, 2011).

b) Phân loại

Dẫn xuất anthraquinone glycoside có thể chia thành ba nhóm là nhóm phẩm

nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquinon), nhóm nhuận tẩy (các dẫn chất

1,8 dihydroxy anthraquinon) và nhóm dimer theo Ngô Văn Thu (2011).

c) Đặc điểm

Những dẫn xuất anthraquinone glycoside đều có màu từ vàng, vàng cam đến

đỏ. Ở thể glycoside thì dễ tan trong nƣớc, còn thể tự do (aglycon) thì tan trong

ether, chloroform và một số dung môi hữu cơ khác (Ngô Văn Thu, 2011).

d) Vai trò

Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthraquinon glycoside có tác dụng

kích thích miễn dịch chống ung thƣ (Ngô Văn Thu, 2011).

1.1.4.7. Steroid

a) Khái niệm

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có bộ khung carbon stenan chứa bốn vòng

cycloalkane đƣợc nối với nhau theo những cách đặc trƣng riêng (Đặng Văn Hoài,

2009).

b) Phân loại

Steroid đƣợc chia thành 4 nhóm chính (Đặng Văn Hoài, 2009).

 Nhóm steroid động vật: Cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol,

desosterol, coprosterol, cerebrosterol và lathosterol.

14

Đồ án tốt nghiệp

 Nhóm steroid của động vật biển không xƣơng sống: Spongesterol,

clionasterol, 24-methylencholesterol và fucosterol.

 Nhóm sterol thực vật: Sistosterol (có các đồng phân α,β,y), stigmasterol,

α-spinasterol và brassicasterol.

 Nhóm sterol nấm men: Ergosterol, zymosterol, acosterol và fecosterol.

c) Đặc điểm

Các steroid kết tinh dƣới dạng vảy óng ánh nhƣ xà cừ, dạng kết tinh khác nhau

tùy theo môi trƣờng kết tinh. Steroid có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, dễ tan

trong chloroform, ether, rƣợu nóng và không tan trong nƣớc (Tôn Nữ Minh Nguyệt

và ctv, 2011).

d) Vai trò

Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống và thƣờng đƣợc sử

dụng làm các thuốc kích thích (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2011).

1.1.5. Công dụng

Toàn bộ cây Elephantopus mollis đƣợc sử dụng nhƣ 1 phƣơng thuốc trị tiêu

chảy, rễ cây có tác dụng chữa đau bụng, nhiễm trùng da, bệnh sởi và có tác dụng hạ

sốt (Mohan và ctv, 2010).

Theo Muthiumani và ctv (2010), E.mollis có tác dụng nhƣ thuốc trợ tim, làm

giải nhiệt, lợi tiểu và là thuốc giải độc khi bị rắn cắn. Rễ cây có tác dụng chống nôn,

trong khi lá cây đƣợc sử dụng trong điều trị viêm loét và eczema. Rễ và lá đều là

chất làm mềm, chống tiêu chảy, khó tiểu ở niệu đạo, trị sƣng hoặc đau ở dạ dày.

Chiết xuất ethanol của E.mollis đã đƣợc nghiên cứu thành công về khả năng

đẩy nhanh thời gian tái tạo xƣơng bị thƣơng ở chuột (Ngueguim và ctv, 2012).

Ngoài ra, E.mollis còn là bài thuốc để chữa đái buốt, đái ra máu, nƣớc tiểu lẫn

chất nhầy theo Tuệ Tĩnh (1960). Mặt khác nó còn công dụng chữa mụn nhọt, đinh

râu, chữa mũi chảy máu, môi lở sƣng đau, chữa viêm họng và viêm amidan (Đỗ

Huy Bích và Bùi Xuân Chƣơng, 1980).

Muthiumani và ctv (2010), đã khảo sát khả năng trị tiêu chảy và tác dụng trợ

tim của cao chiết Elephantopus scaber trên các hệ dung môi petroleum ether,

15

Đồ án tốt nghiệp

benzene, chloroform và ethyl acetate. Kết quả ethyl acetate cho hiệu quả trị tiêu

chảy tốt nhất, trong khi đó petroleum ether cho khả năng hoạt động tim tốt nhất khi

thí nghiệm trên ếch.

Khả năng trị suyễn của E.scaber đã đƣợc thử nghiệm khi sử dụng histamine và

acetylcholine gây co thắt phế quản. Sự kích ứng của các tế bào mast và histamine

gây co thắt khí quản trên chuột lang theo từng đợt khác nhau khi ở những liều lƣợng

khác nhau. Qua đó nhận thấy chiết xuất ethanol của E.scaber có tác dụng làm giảm

đáng kể sự co thắt phế quản gây ra bởi histamine, acetylcholine và chống lại sự kích

ứng của các tế bào mast (Laranja và ctv, 1991).

1.2. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật

1.2.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực

vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng

khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ

thƣờng rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).

1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn

Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn: Gồm có

penicillin, bacitracin, vancomycin. Các chất tác động lên quá trình tổng hợp vách

nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu.

Ức chế chức năng của màng tế bào: Gồm colistin, polymycin, gentamicin và

amphoterricin. Các chất sẽ làm mất chức năng của màng, làm cho các phân tử có

khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài.

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein:

 Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome

làm cho quá trình dịch mã không chính xác.

 Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.

 Nhóm macrolide và lincoxinamide gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm

ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.

16

Đồ án tốt nghiệp

Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic:

 Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao

mã tạo thành mRNA.

 Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho 2 mạch

đơn DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.

 Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA có tác dụng cạnh tranh PABA và

ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotide.

 Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân

purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv,

2010).

Hình 1.5. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004)

Bảng 1.1. Những nhóm chính của hợp chất thực vật có hoạt tính kháng khuẩn

(Cowan, 1999)

Nhóm Phân nhóm Ví dụ Cơ chế

Catechol Màng sinh chất

Phenols đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào

Phenolics Phenolic acid Cinnamic acid ?

17

Đồ án tốt nghiệp

Liên kết bám dính, Tạo phức

Quinones Hypericin hợp với thành tế bào, Khử hoạt

tính enzyme

Flavonoids Chrysin Liên kết bám dính

- Tạo phức hợp với thành tế bào

Flavones Khử hoạt tính enzyme Abyssinone

Ức chế phiên mã ngƣợc HIV

Flavonols Totarol ?

Bám dính protein

Bám dính Adhesin

Ức chế enzyme

Tannins Ellagitannin Màng sinh chất

Tạo phức với thành tế bào

Phá vỡ vách tế bào

Tạo phức với kim loại ion

Tƣơng tác với DNA nhân thực Coumarins Warfarin (hoạt tính khháng virus)

Terpenoids, - Capsaicin Phá vỡ vách tế bào

tinh dầu

Berberine Alkaloid - Xen vào thành tế bào hoặc DNA

Piperine

Lectins và Mannose-specific Khóa sự kết hợp của virus hoặc - polypeptides agglutinin hấp phụ

18

Đồ án tốt nghiệp

Falxatin Hình thành cầu Disulfide

8s-heptadeca-

Polyacetylens - 2(Z),9(Z)-diene- ?

4,6-diyne-1,8-diol

1.2.3. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt

Nam

1.2.3.1. Tình hình kháng khuẩn trên Thế Giới

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh công dụng diệt

khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito phân tích đƣợc hợp chất

alicin trong tỏi có công dụng nhƣ thuốc kháng sinh. Một nghiên cứu khác tại Brazil

năm 1982 đã chứng minh, nƣớc tinh chất từ tỏi có thể chữa đƣợc nhiều bệnh nhiễm

độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella spp. (Fulder, 2005).

Năm 1959, Horak đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ chiết xuất cây

Cannabit sativa có nguồn gốc từ Ấn Độ, ông đã tìm thấy cannabiriolic là 1 chất có

tác dụng ức chế với vi khuẩn lao ở ngƣời và 1 số vi khuẩn gram dƣơng nhƣ

Staphylococcus pyogenes aureus, Streptococcus alpha haemolyticus, Streptococcus

beta haemolyticus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae, B.subtilis, B.anthracis,

Corynebacterium diphtheriae và Corynebacterium cutis, đặc biệt có thể ức chế vi

khuẩn kháng lại penicilin (Kabelik và ctv, 1960).

Direkbusarakom và ctv (1997), đã thử nghiệm thành công khả năng kháng

khuẩn của các loài cây thảo dƣợc nhƣ: Tinospora cordifolia, T.cripspa, Psidium

guajava, Clinacanhus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina,

Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus và P.urinaria đối

với Vibrio spp.. Tuy nhiên, chỉ có 2 cây Momordica charatina và Psidium guajava

mới có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp..

Chaghaby và ctv (2014), đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây

Annona Squamosa L. đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn gram dƣơng

19

Đồ án tốt nghiệp

mạnh hơn gram âm. Kết quả của ông đƣợc nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của

Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn gram âm ít bị ảnh hƣởng nhiều bởi những

chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn gram dƣơng là do chúng có một

lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide. Đó là lớp màng

chọn lọc cho phép chúng có khả năng điều hòa lƣu thông các chất ra vào bên trong

cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng

vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các chủng

vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp chất hóa

học có trong mỗi loại dịch chiết.

1.2.3.2. Tình hình kháng khuẩn tại Việt Nam

Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và

khẳng định nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn

Hƣởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây

thuốc rất an toàn và có hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đó nhóm đã đƣa ra chế phẩm

cây Tô Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008).

Năm 2009, Võ Thị Mai Hƣơng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của

dịch chiết lá Muồng trâu trên 5 nhóm vi khuẩn Vibrio spp., Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và cho kết quả kháng khuẩn cao

hơn so với nghiên cứu tƣơng tự vào năm 2002 của Elysha và ctv.

Võ Thị Mai Hƣơng và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính

kháng khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan,

EtOAC, n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung môi

trên đều cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus

aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus pumilus.

1.3. Giới thiệu về bệnh tiêu chảy

1.3.1. Khái niệm

Theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2009), tiêu chảy là 1 dạng bệnh lý xảy ra khi

một cơ thể đi ngoài có phân lỏng bất thƣờng (phân lỏng, phân tóe nƣớc, phân có

nhầy máu,…) từ 3 lần trở lên trong vòng 24 giờ.

20

Đồ án tốt nghiệp

Phân đƣợc chia thành 7 dạng, trong đó dạng 1 – 2 thể hiện sự táo bón, dạng 3

– 4 là dạng bình thƣờng, dạng 5 – 7 đƣợc xem là dấu hiệu của bệnh tiêu chảy và tiêu

chảy cấp (Heaton, 1997).

Hình 1.6. Cơ sở đánh giá các loại phân (Thompson, 2006)

1.3.2.Nguyên nhân gây bệnh

1.3.2.1. Do virus

Rotavirus là nguyên nhân chính gây tiêu chảy nặng nề và đe dọa tính mạng

cho trẻ em, Rotavirus gây tiêu chảy ở khoảng 40% trẻ em dƣới 5 tuổi phải nhập

viện trên phạm vi toàn cầu theo Tổ chức Y tế Thế Giới (2009). Rotavirus tấn công

nhanh vào hệ tiêu hóa, phá hủy tế bào ở thành ruột non gây viêm dạ dày ruột, tiêu

chảy, nôn ói dẫn đến mất nƣớc nhanh chóng và có thể tử vong nếu không đƣợc bù

nƣớc kịp thời. Ngoài ra, các loại virus khác có thể gây tiêu chảy nhƣ: Adenovirus,

Enterovirus, Norovirus,... (Lê Anh, 2012).

21

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.7. Hình thái của Rotavirus (De Junio Del, 2013)

1.3.2.2. Do vi khuẩn

Đây là nguyên nhân thƣờng gặp nhất. Nguyên nhân này là do mất cân bằng

giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột. Các vi khuẩn có hại xâm

nhập vào đƣờng ruột, nếu mạnh hơn vi khuẩn có lợi chúng sẽ lấn át các vi khuẩn có

lợi và tiết ra độc tố gây tiêu chảy.

 Vibrio cholerae: Vi khuẩn tả gây tiêu chảy xuất tiết qua trung gian độc tố tả

làm xuất tiết ồ ạt nƣớc và điện giải ở ruột non gây tiêu chảy. Tiêu chảy có

thể nặng và dẫn tới mất nƣớc điện giải trong vài giờ (Trần Anh Văn, 2011).

 Shigella: Là tác nhân gây lỵ trong 60% trƣờng hợp lỵ. Khi bị nhiễm

Shigella cơ thể sẽ đau bụng quặn thắt, sốt nóng, tiêu chảy thƣờng có máu,

có thể bị động kinh và co giật theo Trần Anh Văn (2011).

 Staphylococcus aureus: Vi khuẩn gây bệnh bằng độc tố với các dấu hiệu

nhƣ đau bụng, tiêu chảy và nôn mửa dữ dội (Bùi Quỳnh Nga, 2012).

 Campylobacter jejuni: Thƣờng có ở thịt gia cầm sống chƣa đƣợc xử lý, vi

khuẩn gây tiêu chảy, hội chứng lỵ và sốt kéo dài 2 – 5 ngày. Theo các Báo

cáo về Ngƣời Tiêu dùng (2007) dựa vào kết quả phân tích các mẫu thịt gà

tƣơi đƣợc bán trên toàn quốc cho thấy, có đến 80% thịt gà đƣợc xét nghiệm

có chứa vi khuẩn Campylobacter spp. (Hồng Lĩnh, 2007).

1.3.2.3. Do ký sinh trùng

22

Đồ án tốt nghiệp

Entamoeba histolytica (Amip): Xâm nhập vào liên bào đại tràng hoặc hồi

tràng khi ở thể hoạt động, tạo các ổ apxe nhỏ, loét và biểu hiện hội chứng lỵ (Trần

Anh Văn, 2011).

Giardia lamblia: Là ký sinh trùng đơn bào, Giardia lamblia bám dính lên liên

bào ruột non làm teo các nhung mao ruột dẫn đến giảm hấp thu và gây tiêu chảy

(Trần Anh Văn, 2011).

Cryptosporidium: Xâm nhập vào ruột cƣ trú ở biểu mô, nhân lên và tạo ra các

nang đào thải qua phân ra ngoài. Cryptosporidium gây đau bụng, buồn nôn và gây

tiêu chảy kéo dài ở ngƣời đang bị suy giảm miễn dịch (Nguyễn Bạch Đằng, 2011).

1.3.2.4. Do các nguyên nhân khác

Thuốc: Nhiều loại thuốc có thể gây ra tiêu chảy. Phổ biến nhất là thuốc kháng

sinh. Thuốc kháng sinh tiêu diệt cả vi khuẩn tốt và xấu, có thể làm rối loạn sự cân

bằng tự nhiên của vi khuẩn trong đƣờng ruột dẫn đến tiêu chảy. Ngoài ra, còn có

những loại thuốc nhƣ thuốc chống cao huyết áp, thuốc nhuận tràng, thuốc Antacids

chứa magnesium cũng dễ gây tiêu chảy (Hà Hiền, 2014).

Fructose: Đây là một loại đƣờng tự nhiên đƣợc tìm thấy trong trái cây, mật

ong và làm chất tạo ngọt ở một số đồ uống. Fructose có thể gây tiêu chảy ở những

ngƣời gặp vấn đề trong việc tiêu hóa chúng (Hà Hiền, 2014).

Không dung nạp lactose: Lactose là một loại đƣờng đƣợc tìm thấy trong sữa

và các sản phẩm sữa khác. Nhiều ngƣời gặp khó khăn trong tiêu hóa lactose vì

không có enzyme để phân giải lactose trong sản phẩm. Vì thế, cơ thể không thể

dung nạp lactose và gây ra hiện tƣợng tiêu chảy (Nguyễn Thị Yến, 2011). Ngoài ra

còn các nguyên nhân nhƣ: Chất ngọt nhân tạo, các rối loạn tiêu hóa hay phẫu

thuật,…

1.3.3. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy

1.3.3.1. Tiêu chảy do thẩm thấu

Tiêu chảy thẩm thấu xảy ra khi trong ruột xuất hiện nhiều lƣợng chất tan có

hoạt tính thẩm thấu nhƣng lại hấp thu kém. Lƣợng chất tan này tạo áp lực thẩm thấu

đến màng nhầy trong ruột làm nƣớc bị hút vào lòng ruột, khiến cho Na và Cl cũng

23

Đồ án tốt nghiệp

bị kéo theo vào lòng ruột. Nƣớc mất nhiều hơn Na nên có khuynh hƣớng làm tăng

Na trong máu và độ thẩm thấu của dịch phân cao hơn độ thẩm thấu của các điện giải

trong phân (Đỗ Minh Quang, 2012).

1.3.3.2. Tiêu chảy do xuất tiết

Tiêu chảy xảy ra do sự bài tiết nƣớc và điện giải bất thƣờng vào lòng ruột. Sau

khi qua dạ dày, vi khuẩn cƣ trú ở phần dƣới hồi tràng và sản sinh ra độc tố ruột, đơn

vị B của độc tố gắn vào bộ phận tiếp nhận đặc hiệu của tế bào giải phóng ra đơn vị

A của độc tố. Đơn vị này đi vào tế bào ruột hoạt hoá adenylcyclase làm ATP trở

thành AMP vòng. Sự tăng AMP vòng trong tế bào làm ức chế hoặc ngăn cản sự hấp

thu Na ở ruột, nhƣng không ức chế đối với cơ chế hấp thu Na gắn với glucose và

các chất vận chuyển trung gian khác, làm tăng sự bài tiết ở các tế bào hẽm tuyến

vào trong lòng ruột do làm tăng tính thấm của màng tế bào phía lòng ruột theo Đỗ

Minh Quang (2012).

1.3.3.3. Tiêu chảy do tăng nhu động ruột

Để các chất dinh dƣỡng và nƣớc đƣợc hấp thu hiệu quả thì dịch ruột phải đƣợc

tiếp xúc với tất cả các biểu mô niêm mạc và giữ lại đủ lâu để có thể hấp thụ. Nhƣng

khi có sự rối loạn về nhu động ruột sẽ làm đẩy nhanh thời gian di chuyển ở ruột.

Nhu động ruột tăng lên khiến cho thời gian giữ thức ăn trong ruột bị giảm sút, làm

giảm thời gian tiếp xúc giữa tế bào niêm mạc và dịch ruột, dẫn đến tiêu chảy

(Bowen, 2006).

1.3.3.4. Tiêu chảy do tổn thương niêm mạc ruột

Khi các tác nhân gây tiêu chảy xâm nhập vào đƣờng tiêu hoá sẽ sản sinh ra các

độc tố ruột (enterotoxin) kích thích tiết các chất điện giải, tấn công trực tiếp và phá

huỷ các tế bào biểu mô niêm mạc ruột gây viêm tại ruột và toàn thân. Do tế bào

niêm mạc bị tổn thƣơng nên làm giảm sự hấp thu các chất và gia tăng sự bài tiết ion

do tăng số lƣợng tế bào hẻm tuyến từ đó dẫn đến tiêu chảy (Low-Beer và Read,

1971).

1.4. Đặc điểm một số vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy điển hình

1.4.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli

24

Đồ án tốt nghiệp

1.4.1.1. Đặc điểm

Escherichia coli là trực khuẩn gram âm có 2 đầu tròn với kích thƣớc trung

bình 0,5 x 2 - 3 µm, đa số vi khuẩn đều có lông, có khả năng di động và không sinh

bào tử. E.coli cƣ trú chủ yếu trong ruột ngƣời ở phần cuối của ruột non và ruột già

và ở trong ruột động vật máu nóng. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thƣờng ở đƣờng

tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây rất nhiều bệnh đƣờng ruột và ở các cơ quan khác.

E.coli dễ dàng phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng với nhiệt độ thích hợp là 37oC và pH tối ƣu là 7,2 – 7,4. E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ

chỉ khoảng 20 – 30 phút (Lê Thị Mai Khanh, 2004).

Hình 1.8. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc 2 µm (Bact, 2005)

Hầu hết các E.coli đều có khả năng lên men nhiều loại đƣờng và có sinh hơi,

trừ E.coli trơ (EIEC không lên men hoặc lên men chậm). E.coli có khả năng sinh

indole, không sinh H2S, không sử dụng đƣợc nguồn carbon của citrate trong môi

trƣờng Simmons. E.coli có decarboxylase, vì vậy chúng có khả năng khử carboxyl

của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Thử nghiệm β-galactosidase dƣơng

tính và thử nghiệm Voges proskauer sau 24 giờ âm tính, 48 giờ sau có thể dƣơng

tính theo Lê Thị Mai Khanh (2004).

1.4.1.2. Độc tính

Bệnh tiêu chảy do EHEC gây ra có thể diễn biến từ thể nhẹ, phân không có

máu hoặc ít máu đến thể nặng phân toàn máu nhƣng không chứa bạch cầu. Triệu

25

Đồ án tốt nghiệp

chứng lâm sàng của bệnh bao gồm đau quặn bụng và tiêu chảy cấp, phân có thể có

máu, kèm theo có thể có sốt hoặc nôn.

Một số chủng E.coli trong nhóm EHEC, trong đó có E.coli O157:H7 là căn

nguyên chủ yếu gây ra hội chứng tan máu suy thận cấp trên toàn thế giới. Khoảng

15% trẻ em và tỷ lệ thấp hơn ở ngƣời lớn bị nhiễm E.coli O157:H7, trong đó 50%

số bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong. E.coli O157:H7 có khả năng tiết ra độc

tố shiga làm tăng urea huyết, đây là nguyên nhân chính gây tử vong.

Nguy hiểm hơn khi nhiễm chủng STEC có thể gây ra hội chứng tan máu suy

thận cấp HUS với biểu hiện thiếu máu tan huyết, rối loạn thần kinh, sốt và nổi các

ban đỏ do thiếu tiểu cầu, đây là căn nguyên chính gây tử vong ở trẻ nhỏ và ngƣời

già (Trần Nhƣ Dƣơng, 2011).

1.4.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp.

1.4.2.1. Đặc điểm

Salmonella spp. là trực khuẩn gram âm, hình que, sống trong đƣờng ruột và có

kích thƣớc trung bình từ 2 - 3 x 0,5 - 1 µm. Đa số các loài Salmonella spp. di

chuyển bằng tiên mao trừ S.gallimarum, S.pullorum và không tạo bào tử.

Salmonella spp. là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42oC và pH từ 6 - 9, nhƣng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2.

Hình 1.9. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. (Taragui, 2005)

26

Đồ án tốt nghiệp

Salmonella spp. không lên men lactose nhƣng có khả năng lên men đƣờng

glucose và sinh hơi. Vi khuẩn thƣờng không lên men sucrose, salicin, inositol và sử

dụng đƣợc nguồn carbon của citrate trong môi trƣờng Simmons. Tuy nhiên, cũng có

những trƣờng hợp ngoại lệ nhƣ S.typhi lên men đƣờng glucose, không sinh hơi và

không sử dụng citrate trong môi trƣờng Simmons. Hầu hết, các chủng S.paratyphi

và S.cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các loài Salmonella spp. sinh độc tố là

bacteriocin chống lại E.coli, Shigella spp. và 1 số loài Salmonella spp. khác

(Nguyễn Hữu Liêm, 2013).

1.4.2.2. Độc tính

Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc

hay còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy, co

thắt dạ dày, đau đầu, sốt, nôn mửa và mất nƣớc (mất dịch cơ thể). Triệu chứng có

thể tiến triển từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thƣờng kéo dài

trong vòng từ 4 – 7 ngày và sau đó tự hồi phục. Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể

diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013).

Ngoài ra, S.typhi và S.paratyphi còn gây ra bệnh thƣơng hàn. Bệnh xảy ra có các dấu hiệu nhƣ đổ nhiều mồ hôi, sốt liên tục, sốt cao đến 40oC nhƣng nhịp tim

chậm. Cơ thể bị phát ban dạng sởi ở vùng quanh thắt lƣng, bị loét họng, loét ruột

gây chảy máu ruột. Độc tố vi khuẩn cũng gây nhiễm độc cơ tim, gây viêm cơ tim,

trụy tim mạch. Nếu độc tố nhiễm vào não thất gây triệu chứng mạch nhiệt phân ly

và gây viêm não. Các trƣờng hợp mắc thƣơng hàn nhẹ có triệu chứng giống nhƣ

viêm dạ dày, viêm ruột gây nên tiêu chảy theo Bùi Thị Thu Hƣơng (2014).

1.4.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp.

1.4.3.1. Đặc điểm

Shigella spp. là trực khuẩn lỵ, đây là vi khuẩn gram âm nhỏ, dài với kích

thƣớc 0,5 – 0,6 x 1 - 3 µm, thuộc họ vi khuẩn đƣờng ruột. Shigella spp. là vi khuẩn

kị khí tùy nghi, không có roi, không có khả năng di động và không sinh bào tử. Vi khuẩn này có thể tồn tại đƣợc ở nhiệt độ 7 - 46oC, trong đó nhiệt độ tối ƣu cho vi khuẩn tăng trƣởng là 37oC. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hóa khắc

27

Đồ án tốt nghiệp

nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl hay trong môi

trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng

phƣơng pháp khử trùng Pasteur.

Shigella spp. lên men glucose, không sinh hơi (trừ S.flexneri type 6) và có khả

năng lên men manitol (trừ S.dysenteriae). Hầu hết, các Shigella spp. không lên men

lactose, chỉ có S.sonnei lên men lactose nhƣng lên men chậm. Chúng có khả năng

sinh indole, không sinh H2S và cho kết quả âm tính với các thử nghiệm Urease,

Voges proskauer và Citrate (Nguyễn Thị Khánh Nhƣ, 2009).

Hình 1.10. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011)

1.4.3.2. Độc tính

Trực khuẩn Shigella spp. gây viêm nhiễm cấp tính ở đƣờng tiêu hoá với các

biểu hiện bệnh lý thay đổi từ thể tiêu chảy phân nƣớc nhẹ cho đến các thể nặng nề

với đau bụng quặn, mót rặn, phân nhầy máu, sốt, buồn nôn, ói, co thắt dạ dày và có

dấu hiệu nhiễm trùng nhiễm độc. Sau khi nhiễm vi khuẩn, triệu chứng bệnh khởi

phát trong vòng từ 1 - 7 ngày nhƣng cũng có khi lâu hơn.

Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết

mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết,...

theo Nguyễn Đức Hiền (2013).

1.4.4. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

1.4.4.1. Đặc điểm

28

Đồ án tốt nghiệp

Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, vi khuẩn có dạng que hơi uốn cong giống

hình dấu phẩy với kích thƣớc trung bình 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Phần lớn các loài

Vibrio spp. sống hoại sinh chỉ 1 số ít có khả năng lây bệnh cho ngƣời. Đây là vi

khuẩn gram âm có tiên mao nằm ở 1 đầu vi khuẩn nên có khả năng di động và

không sinh bào tử. Tất cả những loài Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, tồn tại ở nhiệt độ 16 - 42oC nhƣng nhiệt độ tối ƣu là 37oC. Vi khuẩn không thể phát

triển trong môi trƣờng mà không có muối và không sinh H2S. Một số chủng có khả

năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống trong bùn lắng ở

đầm hồ, vùng nƣớc lợ ven biển hay trong nội tạng của tôm, cua,… Đặc trƣng của

loài Vibrio spp. là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (pH 8,5 - 9,5) và bị

tiêu diệt nhanh ở môi trƣờng acid theo Phạm Thị Bích Ngọc (2011).

Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. (Microscopy, 2004)

Vibrio spp. có khả năng lên men đƣờng glucose trong cả điều kiện hiếu khí và

kị khí, có enzyme nitratase để khử nitrate thành nitrite. Vi khuẩn có kết quả dƣơng

tính với thử nghiệm Oxidase và Catalase (Phạm Thị Bích Ngọc, 2011).

1.4.4.2. Độc tính

Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện

lâm sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau

giống nhƣ dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài

29

Đồ án tốt nghiệp

phân lỏng có mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn

đến tử vong nếu không điều trị kịp thời.

Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong

ngày, đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013).

1.5. Một số mô hình đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của thực vật trên động vật

1.5.1. Mô hình đánh giá khả năng trị tiêu chảy

Mục đích: Đánh giá khả năng chống tiêu chảy của cao chiết so với thuốc đặc

trị tiêu chảy đƣợc thử nghiệm trên mô hình chuột, dƣới tác động của tác nhân gây

tiêu chảy (Ndukui và ctv, 2013).

Vật liệu nghiên cứu: Chuột bạch Thụy Sỹ cả giống đực và cái, có trọng lƣợng 20 - 30 g đạt 6 - 8 tuần tuổi. Chuột đƣợc nuôi ở điều kiện nhiệt độ 22 ± 2oC và chu

kỳ sáng tối 12 giờ. Chúng đƣợc cho ăn uống đầy đủ và quan sát trƣớc khi làm thí

nghiệm 1 tuần (Awounters và ctv, 1978). Bao gồm các loại mô hình sau:

1.5.1.1. Mô hình castor oil

a) Khái niệm: Castor oil còn đƣợc gọi là Oleum palmae christi đƣợc chiết xuất

bằng cách ép lạnh từ hạt thầu dầu (Ricinus communis) và có tác dụng chữa bệnh

trong nhiều thế kỷ (Gaginella và ctv, 1975). Castor oil là triglyceride chứa hàm

lƣợng cao acid béo không bão hòa ricinoleic acid [(9Z, 12R)-12-hydroxyoctadec-9-

enoic acid] theo Saalmüller L. (1848).

b) Cơ chế tác động: Sau khi uống castor oil, ricinoleic acid sẽ đƣợc phân giải nhờ

enzyme lipase, một lƣợng lớn ricinoleic acid đƣợc hấp thụ vào ruột (Meyer H.,

1890). Năm 2012, Tunaru S. và ctv đã chứng minh ricinoleic acid là chất đầu tiên

đƣợc cơ thể hấp thụ qua niêm mạc ruột giúp hoạt hóa thụ thể prostaglandin E

receptor 3 (EP3) ở trên tế bào cơ của ruột và dạ con, gây co thắt cơ trơn của ruột,

làm tăng nhu động ruột và giúp nhuận tràng.

c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói

24 giờ, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối

30

Đồ án tốt nghiệp

chứng. Sau 1 giờ cho tất cả chuột uống tiếp 1 ml castor oil và tiến hành quan sát

trong 4 giờ (Shoba và Thomas, 2001).

1.5.1.2. Mô hình magnesium sulfate (MgSO4)

a) Khái niệm: Magnesium sulfate (MgSO4) còn gọi là muối Epsom, đƣợc sử dụng

nhƣ chất làm khô, hút ẩm. Đây là 1 thành phần quan trọng đối với nhiều hệ thống

trong cơ thể, đặc biệt là cơ bắp và các dây thần kinh. Magnesium sulfate cũng làm

tăng lƣợng nƣớc tiết ra trong ruột nên cũng đƣợc sử dụng làm thuốc nhuận tràng

theo Multum (2011).

b) Cơ chế tác động: Magnesium sulfate tạo một lực gradient đẩy nƣớc ở phần đầu

của đoạn ruột làm gia tăng nhu động ruột, đồng thời kích thích của hormones ở túi

mật hoặc thay đổi mức huyết thanh hoặc những hormones khác, làm tăng tiết dịch

vào lòng ruột và gây tiêu chảy (Reichelderfer, 1984).

c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm toàn bộ chuột phải đƣợc nhịn

đói 24 giờ, cho từng nhóm chuột uống thuốc trị tiêu chảy, cao thuốc và dung dịch

đối chứng. Sau 30 phút, tất cả chuột uống tiếp magnesium sulfate 2 mg/kg và tiến

hành quan sát dạng phân trong 4 giờ (Doherty, 1981).

1.5.1.3. Mô hình serotonin

a) Khái niệm: Serotonin 5-hydroxy tryptamine (5-HT) là chất dẫn truyền thần kinh,

chất này đƣợc bài tiết dƣới tác động của các xung kích thích trong lòng ruột.

Serotonin đóng vai trò quan trọng trong điều hòa nhu động ruột. Serotonin đƣợc tiết

ra bởi các tế bào enterochromaffin (EC) và các hoạt động trên thụ thể nằm trên cơ

trơn, ruột và thần kinh. Có 7 loại thụ thể 5-HT, trong đó thụ thể 5-HT3 và 5-HT4

điều chỉnh sự vận động, cảm giác đau và sự bài tiết của ruột (Moskwa và ctv, 2007).

b) Cơ chế tác động: Serotonin sau khi đƣợc kích thích bằng 5-hydroxytryptamine

(5-HT) kích hoạt lên thụ thể 5-HT (1P) nằm dƣới lớp niêm mạc ruột bên trong

neurones hƣớng tâm chính thì serotonin mới có thể phối hợp co cơ trơn, tạo phản xạ

nhu động ruột, kích thích bài tiết nƣớc và điện giải vào lòng ruột và làm thay đổi

cảm nhận đau. Nếu serotonin đƣợc tăng tiết sẽ làm tăng nhu động ruột và gây tiêu

chảy. Ngƣợc lại, nếu serotonin giảm tiết sẽ làm giảm nhu động ruột và gây chứng

31

Đồ án tốt nghiệp

táo bón, đây là những triệu chứng của hội chứng ruột kích thích theo Gershon

(2004).

c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói qua

đêm. Từng nhóm chuột đƣợc uống thuốc trị tiêu chảy, cao thuốc và dung dịch đối

chứng. Sau 30 phút cho tất cả chuột uống serotonin 600 µg/kg. Tiến hành quan sát

dạng phân sau mỗi 30 phút và quan sát trong 6 giờ (Khan, 2004).

1.5.2. Mô hình khảo sát enteropooling

Mục đích: Bằng cách sử dụng các tác nhân gây tiêu chảy để làm giảm hoạt

động ở ruột, từ đó xác định hiệu quả tốt nhất khi lƣợng dịch trong ruột tiết ra ít nhất.

Vì vậy thử nghiệm “enteropooling” thƣờng sử dụng để đo lƣợng dịch tích tụ trong

ruột non của chuột (Bennett, 1983).

Vật liệu nghiên cứu: Chuột cống có khối lƣợng 150 - 200 g cả giống đực và

cái, đƣợc lấy từ Côte d’Ivoire. Chúng đƣợc cho ăn uống đầy đủ và đƣợc nhịn ăn 18

giờ trƣớc khi tiến hành thí nghiệm (Mitjans, 2008). Bao gồm các loại mô hình sau:

1.5.2.1. Mô hình prostaglandin E2

a) Khái niệm: Prostaglandin E2 là acid béo không bão hòa ở mô, đóng vai trò nhƣ

một chất trung gian của quá trình viêm và cảm nhận cơn đau. Prostaglandin E2

đƣợc giải phóng do kích thích cơ học, hóa học, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn

mạch, tăng tính thấm thành mạch gây viêm và đau (Đại học Y Dƣợc Hà Nội, 1998).

b) Cơ chế tác động: Giống với cơ chế gây dịch tả ở độc tố tả, khi độc tố đƣợc phát

tán từ các vi khuẩn trong ruột, nó liên kết với các tế bào ruột đƣợc gọi là ruột thông

qua sự tƣơng tác của các tiểu đơn vị pentameric B của độc tố với các thụ thể

ganglioside GM1 trên các tế bào ruột, kích hoạt endocytosis của các độc tố, tiếp

theo các độc tố bệnh tả phải trải qua sự phân cắt để trở thành một enzyme hoạt

động. Khi đã ở trong enterocyte, các enzyme A1 mảnh của các độc tố A tiểu đơn vị

đi vào bào tƣơng, nơi mà nó kích hoạt các protein G, Gsa thông qua một phản ứng

ADP-ribosylation để khóa các protein G, qua đó tiếp tục kích thích adenylate

cyclase để sản xuất cAMP (Cyclic adenosine monophosphate). cAMP ở nồng độ

cao sẽ làm kích hoạt CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

32

Đồ án tốt nghiệp

làm mất lƣợng lớn các ion và nƣớc ở ruột dẫn đến tiêu chảy theo Thiagarajah và

Verkman (2005). Trong khi prostagladin E2 có tác dụng làm tăng mức hoạt động

của cAMP (Beuble, 2000).

c) Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột đƣợc nhịn đói qua đêm, cho từng nhóm

chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối chứng. Sau khi uống

xong cho tất cả chuột uống tiếp tục tác nhân gây tiêu chảy 2 mg/kg prostaglandin

E2. Sau 30 phút, tiến hành mổ chuột lấy đoạn ruột non đem cân khối lƣợng. Vắt tất

cả dịch trong ruột ra ống và cân lại đoạn ruột sau khi đã lấy hết dịch bên trong

(Robert và ctv, 1976).

1.5.2.2. Mô hình irinotecan

a) Khái niệm: Irinotecan hydrochloride (CPT-11) là 1 dẫn xuất bán tổng hợp của

camptothecin có tác dụng ức chế enzyme topoisomerase (Andoh và ctv, 1987). Nó

có hiệu quả trong việc điều trị ung thƣ đại tràng và ung thƣ phổi. Nhƣng tác dụng

phụ là gây tiêu chảy chậm sau 24 giờ (Abigerges và ctv, 1994).

b) Cơ chế tác động: Irinotecan đƣợc chuyển hóa bởi gan và yếu tố ngoại

carboxylesterase thành chất hoạt hóa SN-38 (7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin),

tiếp tục đƣợc dung hợp bởi UDP-GT 1A1 (Uridine diphosphate glucuronosyl

transferase-1A1) ở gan thành SN38G (SN38-glucuronide), SN38G đƣợc bài tiết tới

khoang ruột thông qua dịch mật. Tại đây SG38G đƣợc hệ vi sinh đƣờng ruột β-

glucuronidase phân hủy thành SG-38 (Yoshio và ctv, 1997). Nồng độ SG-38 cao

gây thiệt hại manh tràng dẫn tới tiêu chảy (Kehrer và ctv, 2001).

c) Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói

qua đêm, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch đối

chứng. Sau đó 30 phút cho tất cả chuột uống irinotecan 30 mg/kg và sau 1 giờ tiến

hành mổ lấy đoạn ruột. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả các dịch trong ruột

ra ống tính lƣợng thể tích và cân lại đoạn ruột (Yoshio và ctv, 1997).

1.5.2.3. Mô hình sử dụng Heat-labile toxin

a) Khái niệm: Độc tố ruột kém bền nhiệt (LT) là oligopeptide, đƣợc sinh ra do

nhóm ETEC gồm 2 loại là LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn

33

Đồ án tốt nghiệp

dịch. Heat-labile toxin gây tích tụ muối và nƣớc trong lòng ruột nên thƣờng đƣợc sử

dụng làm mô hình tiêu chảy (Spangler, 1992).

b) Cơ chế tác động: Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc

tố LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động

dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein

kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Dẫn đến sự

phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thƣờng ở màng tế bào biểu mô làm kích thích những tế bào ruột tiết ra Cl-, đồng thời ức chế sự hấp thu

NaCl bởi những tế bào nhung mao gây tiêu chảy dữ dội. LT-II có cơ chế tƣơng tự

nhƣ LT-I, nhƣng LT-II không liên quan đến bệnh trên ngƣời và động vật (Nataro và

Kaper, 1998).

c) Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột đƣợc nhịn đói 16 giờ trƣớc khi làm thí

nghiệm, cho từng nhóm chuột uống cao ethanol với những nồng độ khác nhau và

dung dịch đối chứng. Sau đó tiêm 0,5 ml của 10 µg Heat-labile toxin cho tất cả

chuột và 6 giờ sau tiến hành mổ lấy đoạn ruột. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy

tất cả các dịch trong ruột và cân lại đoạn ruột (Jaw-Chyun Chen và ctv, 2007).

1.5.2.4. Mô hình castor oil

Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói 18 giờ trƣớc khi tiến

hành thí nghiệm. Cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung

dịch đối chứng. Sau 1 giờ cho uống 1 ml castor oil cho tất cả các nhóm. Tiến hành

mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến ruột tịt, sau khi đã uống castor oil 1 giờ. Cân khối

lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả các dịch trong ruột ra ống, cân lại khối lƣợng ruột

và tính lƣợng thể tích dịch (Saralaya và ctv, 2010).

1.5.3. Mô hình khảo sát sự di chuyển ở ruột non

Mục đích: Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy dựa vào tốc độ di chuyển lƣợng

dịch trong ruột, do sự kích thích nhu động hay phản nhu động làm tăng hoặc giảm

khả năng co bóp ở ruột non (Bennett, 1983).

34

Đồ án tốt nghiệp

Vật liệu nghiên cứu: Chuột cống cả giống đực và cái, có trọng lƣợng 200 -

250g. Nuôi ở chu kỳ sáng tối 12 giờ, đƣợc ăn uống đầy đủ và nhịn đói 18 giờ trƣớc

khi làm thí nghiệm (Saralaya và ctv, 2010). Bao gồm các loại mô hình sau:

1.5.3.1. Mô hình castor oil

Tiến hành thí nghiệm: Tất cả chuột phải đƣợc nhịn đói 18 giờ trƣớc khi tiến

hành thí nghiệm. Cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung

dịch đối chứng. Sau đó 1 giờ, cho tất cả chuột tiếp tục uống 1 ml castor oil. Chuột

đƣợc uống 1 ml than hoạt tính (10% than trong 5% gum acacia) 1 giờ sau khi uống

castor oil. Sau 1 giờ tiến hành mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến ruột tịt, đo chiều dài

từ môn vị đến vị trí có chứa than và tính đƣợc tỷ lệ phần trăm trên tổng chiều dài

ruột (Mascolo và ctv, 1994).

1.5.3.2. Mô hình prostaglandin E2

Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn

đói 24 giờ, cho từng nhóm chuột uống thuốc trị tiêu chảy, cao thuốc và dung dịch

đối chứng. Sau đó 10 phút cho tất cả chuột tiếp tục uống prostaglandin E2 2 mg/kg.

Chuột đƣợc uống dung dịch đánh dấu. Sau 45 phút chuột đƣợc làm ngạt bằng CO2

và tiến hành mổ chuột lấy hết đoạn ruột, đo chiều dài từ phía đầu đến vị trí đánh dấu

và đo chiều dài ruột (Ruwart và ctv, 1984).

1.5.3.3. Mô hình irinotecan

Tiến hành thí nghiệm: Trƣớc khi làm thí nghiệm tất cả chuột phải đƣợc nhịn

đói qua đêm, cho từng nhóm chuột uống cao thuốc, thuốc trị tiêu chảy và dung dịch

đối chứng. Sau đó 30 phút cho tất cả chuột uống irinotecan 60 mg/kg và chuột đƣợc

uống tiếp than hoạt tính. Sau 30 phút tiến hành mổ chuột lấy hết đoạn ruột, đo chiều

dài từ phía đầu đến vị trí đánh dấu và đo chiều dài ruột (Sarin và Bafna, 2012).

35

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian

2.1.1. Địa điểm thu mẫu

Vƣờn Quốc Gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực

phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM và Phòng Thí nghiệm

động vật, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, cơ sở Linh Trung, quận

Thủ Đức.

2.1.3. Thời gian nghiên cứu

Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 01/2015 đến 08/2015.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Toàn bộ cây Elephantopus sp. gồm các phần rễ, thân, lá và hoa.

2.2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.2.1. Vi sinh vật chỉ thị

Vi sinh vật chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 15 chủng vi khuẩn đƣờng

ruột đƣợc cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự

Nhiên TP.HCM và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, bao gồm:

 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E.coli, E.coli 0208, E.coli O157:H7 và

ETEC.

 Nhóm vi khuẩn Salmonella spp.: S.dublin, S.enteritidis, S.typhi và

S.typhimurium.

 Nhóm vi khuẩn Shigella spp.: S.boydii, S.flexneri và S.sonnei.

 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.: V.cholerae, V.harveyi, V.alginolyticus và

V.parahaemolyticus.

2.2.2.2. Động vật thí nghiệm

Chuột bạch, giống đực, khối lƣợng trung bình 25 – 30 gram/con, đƣợc lấy từ

Viện Pasteur TP.HCM.

36

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Môi trường, hóa chất và thuốc

- Môi trƣờng TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia – Ấn Độ).

- Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia – Ấn Độ).

- DMSO (Dimethyl sulfoxide) (Trung Quốc).

- Diethyl ether (Trung Quốc).

- Castor oil (France – Pháp).

- Than hoạt tính (3% w/v than trong 100 ml carboxymethyl cellulose 0,5%)

- Thuốc Loperamide (OLIC – Thái Lan).

- Thuốc Ciprofloxacin (Việt Nam).

2.2.4. Dụng cụ và thiết bị

2.2.4.1. Dụng cụ

- Đĩa petri - Các loại đầu típ

- Ống nghiệm - Micropipette 100 µl, 1000 µl

- Becher - Ống ly tâm eppendrof 2 ml

- Ống đong - Dây cấy vòng, que cấy trang

- Đèn cồn - Bông thấm nƣớc và bông không thấm

- Chai môi trƣờng nƣớc

- Đũa thủy tinh - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao chịu nhiệt,

- Dụng cụ đục lỗ giấy gói, kẹp gấp, muỗng, dao, thun,

- Thƣớc đo ghim…

- Bàn mổ

2.2.4.2. Thiết bị

- Cân phân tích (Orbital - Đức)

- Autoclave (Huxky - Đài Loan) - Tủ ấm 37oC (Memmert - Dức) - Bếp cách thủy siêu tốc (Scilogex - Mỹ)

- Máy ly tâm (Tuttligen - Đức) - Máy nƣớc cất (Branstead USA)

- Máy đo UV – VIS (Hach)

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật

37

Đồ án tốt nghiệp

Nguyên tắc: Sử dụng loại dung môi thích hợp để lôi kéo các hợp chất có khả

năng kháng khuẩn trong cây thuốc, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau.

Cách thực hiện: Mẫu cây sau khi rửa sạch, đƣợc đem đi phơi khô rồi nghiền

thành dạng bột. Bột cây đƣợc ngâm trong dung môi ethanol 70% trong 24 giờ, sau

đó đem lọc để thu dịch và bã đƣợc ngâm lặp lại từ 5 đến 7 lần cho dến khi dịch

chiết hoàn toàn trong suốt, để có thể trích ly hết các hợp chất trong cây. Dịch chiết đƣợc cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC cho đến khi trở thành dạng cao. Cao chiết thu đƣợc sẽ bảo quản ở nhiệt độ 4oC (Atta và ctv, 2005).

2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị

Nguyên tắc: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp giúp

vi sinh vật phát triển và đạt đƣợc số lƣợng cần thiết để phục vụ cho thí nghiệm.

Ngoài ra, việc tăng sinh còn giúp hoạt hóa vi khuẩn trở về với trạng thái bình

thƣờng sau khi bị suy yếu trong quá trình bảo quản.

Cách thực hiện: Vi khuẩn đƣợc bảo quản lạnh ở -80oC trong dung dịch chứa

20% (v/v) glycerol. Tiến hành tăng sinh bằng cách cấy vi khuẩn vào 10 ml môi trƣờng TSB, điều chỉnh cho pH 7 và lắc 220 vòng/phút ở 37oC. Sau 12 - 14 giờ, vi khuẩn đã bắt đầu phát triển nên để vi khuẩn ổn định ở nhiệt độ 25oC. Sau 18 giờ có

thể tiến hành đo OD ở 600 nm để xác định lƣợng vi khuẩn (Restaino và ctv, 2013).

2.3.3. Phương pháp cấy truyền và giữ giống vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phƣơng pháp bảo quản đơn giản nhất, các chủng vi sinh

vật đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng và ủ ở điều kiện phù hợp cho chủng vi

sinh vật phát triển. Sau đó, các chủng này đƣợc chuyển vào tủ mát có nhiệt độ từ 4oC để bảo quản. Quá trình này đƣợc lặp đi lặp lại sau một thời gian nhất định để

tránh hiện tƣợng thoái hóa giống, đảm bảo vi khuẩn không bị già và chết. Thời gian

chu kỳ cấy chuyển của từng chủng vi sinh vật là khác nhau, tuy nhiên thời gian tối

đa có thể đạt đƣợc của phƣơng pháp này là 3 tháng một lần. Đối với giống vi sinh

vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị cấy chuyền định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng TSA và bảo quản ở nhiệt độ 4oC.

38

Đồ án tốt nghiệp

Cách thực hiện: Giống vi khuẩn sau khi đã thuần khiết, đƣợc bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Sau 1 - 2 tháng phải cấy

truyền bằng cách dùng que cấy đầu tròn lấy ít giống cấy zích zắc sang ống thạch

nghiêng mới và đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật phát triển trong vòng 48 - 72 giờ rồi đem bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC (Nguyễn

Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007).

2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland).

Mật độ = OD600 x 1.02 x 109 (CFU/ml)

2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng rất

cần thiết trong hầu hết các thí nghiệm. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp

sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình phân tích nhờ đó giúp nâng cao đƣợc tính chính

xác của các thí nghiệm.

Cách thực hiện: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào các ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng để tạo nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục hút 1 ml dịch từ ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-1 vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng theo nguyên tắc trên cho đến khi

đạt đƣợc nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013).

Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu

2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

39

Đồ án tốt nghiệp

Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào

trong môi trƣờng thạch và tác động lên các vi khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả

năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch.

Từ đó, xác định đƣợc hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng đƣờng kính vòng

kháng khuẩn (mm).

Cách tiến hành: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ 106

CFU/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Sử dụng que đục lỗ để

đục lỗ, tạo giếng có đƣờng kính 6 mm trên đĩa TSA. Nhỏ 0,1 ml dịch cao chiết lên

các giếng và giữ trong tủ lạnh 1 giờ để các chiết xuất của cao có thể khuếch tán vào môi trƣờng thạch. Sau đó, các đĩa đƣợc ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 37oC trong 24

giờ và tiến hành đo đƣờng kính vòng ức chế (Aibinu, 2007).

2.3.7. Phương pháp gây tiêu chảy bằng castor oil trên mô hình chuột

Nguyên tắc: Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy sau khi uống dung dịch thí

nghiệm. Sau đó tính khối lƣợng phân tiêu chảy và đem so sánh với nhóm đối chứng.

Từ đó, xác định đƣợc tỷ lệ ức chế tiêu chảy.

Cách thực hiện: Chuột bạch có khối lƣợng từ 25 - 30 gram đƣợc sử dụng làm

thí nghiệm, sau khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng đƣợc chia thành các nghiệm thức để

uống cao chiết ethanol, thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg) và uống dung dịch

DMSO 1% đƣợc xem là nhóm đối chứng. Sau 1 giờ, tất cả chuột đƣợc uống 0,3 ml

castor oil. Tất cả chuột đƣợc nhốt ở những lồng riêng có lót miếng nhựa và quan sát

dạng phân trong 4 giờ.

Tỷ lệ ức chế tiêu chảy (%) = (To – T1/ To) x 100

To: lƣợng phân tiêu chảy ở nghiệm thức đối chứng (gram).

T1: lƣợng phân tiêu chảy ở nghiệm thức thí nghiệm (gram) theo Dosso và

ctv (2012).

2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng di chuyển ở ruột

Nguyên tắc: Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy sau khi uống dung dịch thí

nghiệm. Sau đó, xác định khả năng co bóp ở ruột non dựa vào tốc độ di chuyển của

lƣợng dịch trong ruột và tính đƣợc phần trăm ức chế sự di chuyển ở ruột.

40

Đồ án tốt nghiệp

Cách thực hiện: Chuột có khối lƣợng từ 25 - 30 gram đƣợc sử dụng làm thí

nghiệm, sau khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng đƣợc chia thành các nghiệm thức để

uống cao chiết ethanol, thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg) và uống dung dịch

DMSO 1% đƣợc xem là nhóm đối chứng. Sau 1 giờ, tất cả chuột đƣợc uống 0,3 ml

castor oil và 30 phút sau đƣợc uống tiếp 0,2 ml than hoạt tính. Sau 30 phút, tất cả

chuột đƣợc gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ lấy đoạn ruột từ môn vị đến

manh tràng, đem đo chiều dài và xác định tỷ lệ ức chế sự di chuyển ở ruột.

Tỷ lệ ức chế sự di chuyển ở ruột (%) = (To – T1/ To) x 100

To: tổng chiều dài đoạn ruột của các nghiệm thức (cm).

T1: chiều dài của than ở các nghiệm thức (cm) theo Dosso và ctv (2012).

2.3.9. Phương pháp khảo sát enteropooling

Nguyên tắc: Sử dụng tác nhân gây tiêu chảy để làm tăng hoạt động ở ruột của

các nhóm thí nghiệm. Từ đó, hiệu quả trị tiêu chảy đƣợc đánh giá tốt nhất khi sự tiết

dịch trong ruột là ít nhất.

Cách thực hiện: Chuột có khối lƣợng từ 25 - 30 gram đƣợc sử dụng làm thí

nghiệm, sau khi đã nhịn đói 24 giờ. Chúng đƣợc chia thành các nghiệm thức để

uống cao chiết ethanol, thuốc trị tiêu chảy Loperamide (3 mg/kg) và uống dung dịch

DMSO 1% đƣợc xem là nhóm đối chứng. Sau 1 giờ, tất cả chuột đƣợc uống 0,3 ml

castor oil. Sau 30 phút, tất cả chuột đƣợc gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ

lấy đoạn ruột từ môn vị đến ruột tịt. Cân khối lƣợng ruột, sau đó vắt lấy tất cả lƣợng

dịch trong ruột ra ống, cân lại khối lƣợng ruột và tính lƣợng thể tích dịch

Tỷ lệ ức chế sự co bóp ở ruột (%) = (To – T1/ To) x 100

To: lƣợng dịch ruột ở nghiệm thức đối chứng (gram).

T1: lƣợng dịch ruột ở nghiệm thức thí nghiệm (gram) theo Saralaya và ctv

(2010).

2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm

Statgraphics Centurion XV.1 với trắc nghiệm Tukey. Kết quả đƣợc thể hiện ở giá trị

41

Đồ án tốt nghiệp

trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Dữ liệu đƣợc phân tích theo oneway ANOVA (P

< 0,05) là có ý nghĩa thống kê.

2.4. Bố trí thí nghiệm

Để tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu

chảy của cao chiết ethanol từ cây Elephantopus sp., tiến trình thí nghiệm đƣợc trình

bày nhƣ ở hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.4.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu quy trình tách chiết cao ethanol 70% từ

Elephantopus sp.

Để tiến hành các thí nghiệm, phải thu đƣợc cao EEE và quy trình tách chiết

cao ethanol 70% từ Elephantopus sp. đƣợc thể hiện ở hình 2.3.

42

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3. Quy trình tách chiết cao EEE

Cây Elephantopus sp. đƣợc rửa sạch và đem đi phơi khô. Cây sau khi khô

đƣợc đem xay thành dạng bột, cân 200 g bột cây bổ sung thêm 2000 ml ethanol

70% và ngâm ở nhiệt độ thƣờng trong 24 giờ.

Mẫu sau khi ngâm đƣợc lọc thô, sau đó đƣợc lọc chân không để thu dịch. Bã

đƣợc ngâm lại và lọc nhiều lần cho đến khi dịch lọc thu đƣợc trở nên trong suốt.

Lấy tất cả dịch lọc thu đƣợc đem đi cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC cho đến khi

bay hết dung môi, thu đƣợc cao ethanol 70% của cây Elephantopus sp. (EEE). Cao EEE đƣợc bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC để phục vụ cho những thí nghiệm tiếp theo.

2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE

Cao EEE đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và quy trình tiến

hành kháng khuẩn đƣợc trình bày ở hình 2.4.

43

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.4. Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE đối

với vi khuẩn chỉ thị

Tiến hành tăng sinh vi khuẩn chỉ thị trong môi trƣờng TSB hay môi trƣờng

TSB có bổ sung 1,5% NaCl, ở 37oC trong 24 giờ.

Vi khuẩn sau khi tăng sinh đƣợc đem đi đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, sau đó pha loãng thành nồng độ 106 CFU/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã pha loãng cho

vào đĩa petri có chứa môi trƣờng TSA hay môi trƣờng TSA có bổ sung 1,5% NaCl

đối với các chủng Vibrio spp., cấy trang cho đến khi đĩa khô hoàn toàn.

Tiến hành chuẩn bị dịch cao EEE ở nồng độ 100 mg/ml bằng DMSO 1%. Đĩa

thạch sau khi khô đƣợc đem đi đục lỗ với đƣờng kính là 6 mm. Hút 100 µl dịch cao EEE cho vào lỗ và để yên trong 2 giờ, sau đó các đĩa đƣợc đem đi ủ ở 37oC trong 24

giờ và đọc kết quả. Đối chứng âm sử dụng DMSO 1%. Đối chứng dƣơng sử dụng

Ciprofloxacin ở dãy nồng độ theo cấp số 2 từ nồng độ 1000 µg/ml đến 8 µg/ml. Mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần.

44

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3. Đánh giá độc tính của EEE trên mô hình chuột

Độc tính cấp đƣợc xác định theo phƣơng pháp liều cố định trong OECD số

425, 12 con chuột đƣợc chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 6 con. Nhóm 1 cho uống

EEE ở nồng độ 5000 mg/kg. Nhóm 2 cho uống dung dịch DMSO 1% để làm đối

chứng. Quan sát hành vi, dạng phân, màu lông, khối lƣợng chuột, lƣợng thức ăn,

nƣớc uống và số chuột chết ở từng nhóm trong thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ

để xác định độ an toàn của cao chiết.

Các chỉ tiêu đánh giá độc tính bao gồm:

 Màu lông: Xem sự thay đổi màu sắc của lông, quan sát kỹ ở vùng cổ.

 Trạng thái lông: Xem dấu hiệu có sự rụng lông không.

 Sự linh hoạt: Xem chuột còn tỉnh, nhạy hay lừ đừ, nằm yên một chỗ.

 Tình trạng tiêu chảy: Quan sát trong trấu có phân lỏng không, quan sát hậu

môn có dính phân không.

 Lƣợng thức ăn: Kiểm soát lƣợng thức ăn hằng ngày.

 Lƣợng nƣớc uống: Kiểm soát lƣợng nƣớc sử dụng mỗi ngày.

 Trọng lƣợng: Kiểm tra xem chuột có xuống cân không.

 Tỷ lệ sống: Xem có con chuột nào bị chết không.

2.4.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của EEE trên mô hình

chuột

2.4.4.1. Chuẩn bị chuột trước khi thí nghiệm

Chuột bạch, giống đực có khối lƣợng trung bình 25 - 30 gram/con, đƣợc nuôi

bằng thức ăn tổng hợp, nƣớc sạch, nuôi trong điều kiện bình thƣờng với nhiệt độ môi trƣờng 22 ± 2oC và đƣợc quan sát trƣớc khi làm thí nghiệm 1 tuần. Trƣớc khi

thí nghiệm chuột phải phải đƣợc nhịn đói 24 giờ và chỉ cho uống nƣớc.

2.4.4.2. Thí nghiệm 3.1: Thử nghiệm khả năng trị tiêu chảy của EEE trên mô hình

chuột

Trƣớc khi thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc nhịn đói 24 giờ, 48 con chuột đƣợc

chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 6 con đƣợc uống các nghiệm thức theo trình tự sau:

45

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng trị tiêu chảy

N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8

DMSO 1% Nghiệm Loperamide EEE (đối chứng) thức

Nồng độ 3 ml/kg 3 1000 500 250 125 63 32 (mg/kg)

Sau 1 giờ, cho tất cả các nhóm uống 0,3 ml castor oil.

2.4.4.3. Thí nghiệm 3.2: Thử nghiệm enteropooling

Xác định thời điểm tiêu chảy và tính lƣợng phân tiêu chảy trong 4 giờ

Trƣớc khi thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc nhịn đói 24 giờ, 48 con chuột đƣợc

chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 6 con đƣợc uống các nghiệm thức theo trình tự sau:

Bảng 2.2. Thí nghiệm khảo sát enteropooling

N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8

DMSO 1% Nghiệm Loperamide EEE (đối chứng) thức

Nồng độ 3 ml/kg 3 1000 500 250 125 63 32 (mg/kg)

Sau 1 giờ, cho tất cả các nhóm uống 0,3 ml castor oil.

Gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ chuột sau 1 giờ, lấy đoạn ruột từ cuối

2.4.4.4. Thí nghiệm 3.3: Khảo sát sự di chuyển ở ruột non

dạ dày đến ruột tịt. Thu dịch trong ruột, xác định thể tích và so sánh với đối chứng.

Trƣớc khi thí nghiệm, tất cả chuột đƣợc nhịn đói 24 giờ, 48 con chuột đƣợc

chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 6 con đƣợc uống các nghiệm thức theo trình tự sau:

46

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.3. Thí nghiệm khảo sát sự di chuyển ở ruột

N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8

DMSO 1% Nghiệm Loperamide EEE

(đối chứng) thức

Nồng độ 3 ml/kg 3 1000 500 250 125 63 32

(mg/kg)

Sau 60 phút, cho tất cả các nhóm uống 0,3 ml castor oil.

Sau 30 phút tiếp theo, cho tất cả các nhóm uống 0,2 ml than hoạt tính.

Gây mê bằng diethyl ether và tiến hành mổ chuột sau 30 phút, lấy đoạn ruột từ cuối

dạ dày đến ruột tịt. Đo chiều dài ruột và chiều dài than để so sánh với đối chứng.

47

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao

Bột cây Elephantopus sp. sau khi ngâm trong dung môi ethanol 70%, lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70oC, kết thúc quá trình nàythu đƣợc cao chiết ethanol 70%

với hiệu suất là 17,889%.

Lần 2 Lần 1

Lần 3 Lần 4

Lần 5

Hình 3.1. Dịch của Elephantopus sp. qua các lần ngâm ethanol 70%

3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% đối với

nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy

48

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% đối với 15

chủng vi khuẩn chỉ thị và đƣợc trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và kháng sinh Ciprofloxacin

EEE Ciprofloxacin Ciprofloxacin Vi sinh vật 100 mg/ml 8 µg/ml 500 µg/ml

E.coli O157:H7 12,2 ± 0,3 0,0 13,2 ± 0,3

E.coli 13,5 ± 0,5 0,0 13,2 ± 0,3

S.flexneri 17,3 ± 0,6 0,0 13,2 ± 0,3

V.alginolyticus 13,2 ± 0,3 16,2 ± 0,3 34,2 ± 0,3

V.cholerae 11,7 ± 0,6 13,3 ± 0,6 22,3 ± 0,3

V.harveyi 15,7 ± 0,6 18,0 ± 0,5 33,0 ± 0,5

Dựa vào bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy rằng, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể

11,3 ± 0,3 28,2 ± 0,3 V.parahaemolyticus 17,3 ± 0,3

hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 7/15 chủng vi khuẩn chỉ thị khảo sát, bao gồm 4

chủng Vibrio spp., E.coli, E.coli O157:H7 và S.flexneri.

3.2.1. Kết quả mức độ kháng khuẩn trên nhóm Vibrio spp. của EEE

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và Ciprofloxacin trên nhóm Vibrio spp.

Đối với nhóm Vibrio spp., EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn đối với 4/4 chủng khảo sát (Hình 3.2). Điều này chứng tỏ rằng, nhóm Vibrio

49

Đồ án tốt nghiệp

spp. khá nhạy cảm đối với EEE ở nồng độ 100 mg/ml. Khi so sánh hoạt tính kháng

khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 8 µg/ml, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện

hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng V.alginolyticus, V.cholerae và V.harveyi

thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), nhƣng V.parahaemolyticus cao

hơn Ciprofloxacin ở nồng độ 8 µg/ml một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Đối

với 2 chủng V.alginolyticus và V.cholerae, EEE ở nồng độ 100 mg/ml chỉ có khả

năng ức chế vi khuẩn khảo sát.

Hình 3.3. Đƣờng kính vòng ức chế của EEE đối với V.alginolyticus

3.2.2. Kết quả kháng khuẩn trên các vi khuẩn khác

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của EEE và kháng sinh Ciprofloxacin trên

các chủng vi khuẩn khác

50

Đồ án tốt nghiệp

Đối với nhóm E.coli, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn đối với 2/4 chủng khảo sát đó là E.coli O157:H7 và E.coli. So với hoạt tính

kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml, EEE ở nồng độ 100 mg/ml

thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với E.coli O157:H7 thấp hơn một cách có ý

nghĩa thống kê (P < 0,05). Khi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn E.coli,

chúng tôi nhận thấy rằng, ở nồng độ 100 mg/ml hoạt tính kháng khuẩn của EEE

tƣơng đồng và không có sự sai biệt về ý nghĩa thống kê so với Ciprofloxacin ở nồng

độ 500 µg/ml (P > 0,05).

Hình 3.5. Đƣờng kính vòng kháng của EEE đối với E.coli

O157:H7 Đối với nhóm Shigella spp., EEE ở nồng độ 100 mg/ml chỉ cho hoạt tính

kháng khuẩn đối với 1/3 chủng khảo sát đó là Shigella flexneri. Khi so sánh hoạt

tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ 500µg/ml, EEE thể hiện hoạt tính

kháng S.flexneri với đƣờng kính vòng kháng khuẩn là 17,3 mm, cao hơn một cách

có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Hình 3.6. Đƣờng kính vòng kháng của EEE đối với S.flexneri

51

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào kết quả ở bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng phổ kháng khuẩn của

EEE ở nồng độ 100 mg/ml khá hẹp, chỉ đối kháng đƣợc với 7/15 chủng vi khuẩn

khảo sát, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn của chúng khá cao với đƣờng kính vòng

kháng khuẩn dao động từ 11,7 – 17,3 mm. Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn mạnh

nhất đối với 2 chủng vi khuẩn là V.parahaemolyticus và S.flexneri đƣợc thể hiện ở

đƣờng kính vòng kháng khuẩn là 17,3 mm.

Theo nghiên cứu của Aibinu và ctv (2007), khi tiến hành đánh giá khả năng

kháng khuẩn đối với S.flexneri và E.coli trên một số loại cao chiết từ cây

Bryophyllum pinnatum và Kalanchoe crenata kết quả cho thấy rằng, cao methanol

của Kalanchoe crenata ở nồng độ 512 mg/ml cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn

lần lƣợt là 17 mm và 12 mm. Trong khi đó, đƣờng kính vòng kháng khuẩn của EEE

ở nồng độ 100 mg/ml đối với S.flexneri là 17,3 mm và E.coli là 13,5 mm khi so

sánh ở cùng đƣờng kính lỗ. Nhƣ vậy, EEE ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn đối với S.flexneri và E.coli tốt hơn so với cao methanol của Kalanchoe

crenata ở nồng độ 512 mg/ml.

Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn đối với V.parahaemolyticus và V.harveyi

của EEE ở nồng độ 100 mg/ml với cao ethanol của Salichornia brachiata ở nồng độ

500 mg/ml chúng tôi thấy rằng, EEE ở nồng độ 100 mg/ml cho đƣờng kính vòng

kháng khuẩn là 17,3 mm và 15,7 mm so với 14 mm và 12 mm của cao chiết ethanol

từ cây Salichornia brachiata. Đối với V.alginolyticus, EEE tuy có đƣờng kính vòng

kháng khuẩn không lớn bằng đƣờng kính của cao ethanol từ cây Salichornia

brachiata (13,2 mm so với 14 mm), nhƣng EEE khảo sát ở nồng độ 100 mg/ml còn

cao ethanol của S. brachiata lại sử dụng ở nồng độ 500 mg/ml nên hoạt tính của

EEE đƣợc xem nhƣ mạnh hơn (Babuselvam và ctv, 2012).

Từ các kết quả so sánh trên có thể nhận thấy, EEE ở nồng độ 100 mg/ml tuy

có phổ kháng hẹp chỉ kháng đƣợc 7/15 chủng vi khuẩn khảo sát, nhƣng mặt khác

EEE ở nồng độ 100 mg/ml lại cho hoạt tính kháng khuẩn khá cao. Do đó, chúng tôi

sẽ tiếp tục sử dụng EEE để tiến hành các thử nghiệm để đánh giá hiệu quả trị tiêu

chảy trên mô hình chuột.

52

Đồ án tốt nghiệp

3.3. Kết quả đánh giá độc tính của cao ethanol 70% trên mô hình chuột

Sau khi đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EEE ở nồng độ 100 mg/ml cho

kết quả kháng khuẩn, EEE sẽ đƣợc sử dụng tiếp để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy

trên chuột. Nhƣng trƣớc khi thực hiện các thử nghiệm trên chuột, phải tiến hành

kiểm tra độc tính của EEE, để xác định độ an toàn của EEE. Kết quả đánh giá độc

tính của EEE đƣợc thể hiện ở hình 3.7.

Hình 3.7. Kết quả đánh giá độc tính của EEE trên chuột

Dựa vào hình 3.7 chúng tôi nhận thấy rằng, tỷ lệ sống của chuột sau khi uống

EEE ở nồng độ 5000 mg/kg sau 120 giờ khảo sát không có sự khác biệt về ý nghĩa

thống kê so với nghiệm thức đối chứng (P > 0,05). Về hình dáng bên ngoài, màu sắc

lông không bị thay đổi và không có dấu hiệu của sự rụng lông khi so sánh với đối

chứng. Về hoạt động của chúng, trong thời gian 12 giờ sau khi uống thuốc một số

con tỏ ra hung hăng hơn, tuy nhiên hiện tƣợng này không còn và hoạt động bình

thƣờng sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ theo dõi. Về hoạt động ăn uống, bài tiết, chuột

vẫn ăn uống, bài tiết và tăng cân bình thƣờng. Không thấy xuất hiện phân lỏng và

cũng không có bất kỳ dấu hiệu ngộ độc nào xảy ra trên chuột.

Thông qua các chỉ số đánh giá chúng tôi nhận thấy rằng EEE ở nồng độ 5000

mg/kg an toàn trên chuột theo đƣờng uống. Nhƣ vậy, EEE có thể tiến hành các thử

nghiệm tiếp theo trên chuột.

53

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Kết quả đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của cao ethanol 70% trên mô hình

chuột

Để đánh giá đƣợc hiệu quả trị tiêu chảy của EEE, chúng tôi dựa vào các dấu

hiệu lâm sàng về thời gian và lƣợng phân tiêu chảy hay dựa vào khả năng co bóp

của nhu động ruột, thông qua các thử nghiệm enteropooling và thời gian di chuyển

trong ruột.

3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng trị tiêu chảy của EEE bằng dầu thầu dầu trên

mô hình chuột

Kết quả về tỷ lệ chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức đƣợc thể hiện ở hình

3.8.

Hình 3.8. Tỷ lệ chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức

Dựa vào hình 3.8 chúng tôi nhận thấy rằng, ở nghiệm thức đối chứng toàn bộ

chuột đều bị tiêu chảy sau 4 giờ khảo sát, điều này chứng tỏ dầu thầu dầu là một tác

nhân có khả năng gây tiêu chảy. Ở các nghiệm thức xử lý bằng thuốc đặc trị là

Loperamide (3 mg/kg) và EEE ở các nồng độ khác nhau thì có hiệu quả làm giảm tỷ

lệ chuột bị tiêu chảy. Nghiệm thức cho uống EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và

Loperamide nồng độ 3 mg/kg cho tỷ lệ chuột bị tiêu chảy thấp nhất là 33,33%. EEE

ở nồng độ 500 mg/kg và 250 mg/kg có tỷ lệ chuột bị tiêu chảy là 66,67%. EEE ở

nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg cho kết quả phần trăm tiêu chảy khá cao

là 83,33%. Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng, EEE có nồng độ càng giảm thì

54

Đồ án tốt nghiệp

cho tỷ lệ chuột bị tiêu chảy càng tăng, nhƣng dù cho EEE có ở nồng độ thấp nhƣ 32

mg/kg thì vẫn có tỷ lệ chuột bị tiêu chảy thấp hơn so với đối chứng. Điều đó chứng

tỏ rằng, các nồng độ của EEE đều có khả năng kìm hãm sự tiêu chảy, nhƣng chỉ có

nồng độ 1000 mg/kg mới cho khả năng kìm hãm sự tiêu chảy tƣơng đƣơng nhƣ

Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg.

Sau khi xác định tỷ lệ chuột bị tiêu chảy, từ đó xác định thời gian và lƣợng

phân tiêu chảy giữa các nghiệm thức. Kết quả đánh giá đƣợc trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Thời gian và lƣợng phân tiêu chảy ở các nghiệm thức

Thời gian gây Lƣợng phân Nhóm Nghiệm thức tiêu chảy (phút) tiêu chảy (g)

1 DMSO 1% 3 ml/kg (đối chứng) 92,67 ± 12,79

2 Loperamide 3 mg/kg 176,00 ± 9,90

3 EEE 1000 mg/kg 170,5 ± 9,19

4 EEE 500 mg/kg 155,75 ± 9,07

5 EEE 250 mg/kg 149,25 ± 9,98

6 EEE 125 mg/kg 122,60 ± 9,71

7 EEE 63 mg/kg 116,00 ± 9,57

Dựa vào bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy, có sự khác biệt về lƣợng phân tiêu

8 EEE 32 mg/kg 92,80 ± 10,47 0,75 ± 0,22c 0,15 ± 0,07a 0,25 ± 0,21ab 0,28 ± 0,17ab 0,40 ± 0,14abc 0,46 ± 0,11abc 0,58 ± 0,27bc 0,66 ± 0,18c

chảy giữa các nghiệm thức và sự khác biệt trên có ý nghĩa về thống kê (P < 0,05).

Khi so sánh lƣợng phân tiêu chảy của Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg, EEE ở các

nồng độ 1000 mg/kg, 500 mg/kg, 250 mg/kg và 125 mg/kg đều cho lƣợng phân tiêu

chảy không có sự sai khác về ý nghĩa (P > 0,05). Riêng các EEE ở nồng độ từ 32

mg/kg đến 250 mg/kg và đối chứng đều cho lƣợng phân tiêu chảy là nhƣ nhau (P >

0,05). Từ kết quả trên chúng tôi thấy rằng, tuy EEE ở các nồng độ khác nhau, từ

1000 mg/kg đến 125 mg/kg đều cho lƣợng phân tiêu chảy giống nhƣ Loperamide ở

nồng độ 3 mg/kg.

55

Đồ án tốt nghiệp

Sau 4 giờ theo dõi, tiến hành xác định đƣợc thời gian, lƣợng phân tiêu chảy và

từ đó xác định tỷ lệ ức chế tiêu chảy ở các nghiệm thức. Kết quả đƣợc thể hiện ở

hình 3.9.

Hình 3.9. Thời gian bị tiêu chảy và khả năng ức chế tiêu chảy giữa

các nghiệm thức

Kết quả khảo sát thời gian tiêu chảy và tỷ lệ ức chế khả năng tiêu chảy của các

nghiệm thức đƣợc trình bày ở hình 3.9. Dựa vào kết quả này chúng tôi nhận thấy

rằng, thời gian bị tiêu chảy ở chuột tỷ lệ thuận với tỷ lệ ức chế tiêu chảy. Khi đánh

giá thời gian chuột bị tiêu chảy giữa các nghiệm thức chúng tôi nhận thấy rằng,

nồng độ EEE càng cao thì thời gian chuột bị tiêu chảy càng lâu. Thời gian chuột bị

tiêu chảy ở các nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng độ từ 63 mg/kg đến 1000

mg/kg lâu hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng (P <

0,05). Riêng nghiệm thức bổ sung EEE với nồng độ 32 mg/kg không có sự khác

biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Điều này chứng tỏ nồng độ 32 mg/kg của

EEE không kìm hãm đƣợc thời gian tiêu chảy. So với nghiệm thức bổ sung

Loperamide với nồng độ 3 mg/kg trọng lƣợng chuột, thời gian bị tiêu chảy của

chuột ở nghiệm thức 1000 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg không có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê (P > 0,05), điều này chứng tỏ hiệu quả kéo dài thời gian tiêu

chảy của cao EEE ở nồng độ 1000 mg/kg, 500 mg/kg và 250 mg/kg tƣơng đƣơng

56

Đồ án tốt nghiệp

với thuốc Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. Song song đó, tỷ lệ ức chế khả năng tiêu

chảy đƣợc đánh giá thông qua lƣợng phân lỏng của các nghiệm thức có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Ở nghiệm thức cho uống EEE ở nồng độ 1000

mg/kg và 500 mg/kg thì tỷ lệ ức chế tiêu chảy ở chuột không có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê so với Loperamide (3 mg/kg), điều này có nghĩa rằng EEE ở nồng

độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả ức chế sự hình thành tiêu chảy tƣơng

đƣơng với thuốc đặc trị là Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg trọng lƣợng chuột. Trong

khi đó các nghiệm thức còn lại, mặc dù tỷ lệ ức chế tiêu chảy thấp hơn một cách có

ý nghĩa so với Loperamide nhƣng lƣợng phân tiêu chảy ở các nghiệm thức này vẫn

cao hơn một cách có ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,05). Kết quả cho thấy rằng,

các nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng độ khác nhau đều có khả năng kìm hãm

sự hình thành tiêu chảy ở chuột nhƣng chỉ có nồng độ 500 mg/kg và 1000 mg/kg

của EEE mới có hiệu quả kìm hãm tiêu chảy tƣơng đƣơng với thuốc Loperamide (3

mg/kg).

3.4.2. Kết quả về thử nghiệm enteropooling

Sau khi đánh giá các dấu hiệu lâm sàng, tiến hành thử nghiệm enteropooling

để đánh giá khả năng kìm hãm sự mất nƣớc ở ruột của EEE. Kết quả đánh giá tỷ lệ

ức chế sự mất nƣớc ở ruột trên chuột đƣợc trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Thể tích dịch ruột và tỷ lệ ức chế sự co bóp ở ruột

Thể tích Ức chế sự Nhóm Nghiệm thức dịch ruột (ml) mất nƣớc (%)

1 DMSO 1% 3 ml/kg 0,329 ± 0,110c -

2 Loperamide 3 mg/kg 0,087 ± 0,048a 74,660 ± 9,942

3 EEE 1000 mg/kg 0,088 ± 0,047a 74,919 ± 8,077

4 EEE 500 mg/kg 0,108 ± 0,030a 66,529 ± 3,425

5 EEE 250 mg/kg 0,154 ± 0,051ab 52,422 ± 9,390

6 EEE 125 mg/kg 0,200 ± 0,072abc 39,094 ± 9,323

7 EEE 63 mg/kg 0,278 ± 0,107bc 16,995 ± 5,040

57

Đồ án tốt nghiệp

8 EEE 32 mg/kg 0,300 ± 0,106c 9,313 ± 4,952

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở nghiệm thức đối

chứng, cho dịch ruột ở dạng lỏng và lƣợng dịch thu đƣợc nhiều nhất, điều này

chứng tỏ dầu thầu dầu là một tác nhân gây tiêu chảy thông qua làm tăng lƣợng dịch

tiết ra trong ruột. Khi chuột ở các nghiệm thức cho uống Loperamide nồng độ 3

mg/kg và EEE nồng độ 1000 mg/kg sẽ cho dịch trong ruột ở dạng rắn. EEE ở nồng

độ 500 mg/kg cho dịch ở trạng thái rắn và bán rắn. Đối với nghiệm thức cho uống

EEE ở các nồng độ từ 250 mg/kg đến 32 mg/kg và nghiệm thức đối chứng đều cho

dịch trong ruột ở dạng lỏng. Dựa vào bảng 3.3 để đánh giá sự sai khác về lƣợng

dịch ruột giữa các nghiệm thức, chúng tôi nhận thấy sự khác nhau giữa các nghiệm

thức là có ý nghĩa về thống kê (P < 0,05). EEE ở các nồng độ từ 1000 mg/kg đến

125 mg/kg cho khả năng kìm hãm sự mất nƣớc ở ruột không có khác biệt về ý nghĩa

khi so sánh với Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg (P > 0,05). Khi so sánh với khả

năng kìm hãm sự mất nƣớc của đối chứng, EEE ở các nồng độ 125 mg/kg, 63

mg/kg và 32 mg/kg cho khả năng kìm hãm sự mất nƣớc không có sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê (P > 0,05). Nhƣ vậy, khả năng kìm hãm sự mất nƣớc giữa EEE ở

nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg và đối chứng là nhƣ nhau.

Hình 3.10. Khả năng ức chế sự mất nƣớc ở ruột giữa các nghiệm thức

58

Đồ án tốt nghiệp

Tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc ở ruột đƣợc đánh giá thông qua lƣợng dịch

trong ruột của các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) và

kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.10. Dựa vào kết quả này, chúng tôi nhận thấy nồng

độ EEE càng cao thì cho tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc ở ruột cũng tăng theo. So

với Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg, EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg cho

tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc ở ruột không khác biệt về ý nghĩa thống kê (P >

0,05), điều này có nghĩa rằng EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả

ức chế sự mất nƣớc ở ruột tƣơng đƣơng với thuốc đặc trị là Loperamide ở nồng độ 3

mg/kg trọng lƣợng chuột. Trong khi đó, các nghiệm thức bổ sung EEE ở các nồng

độ 250 mg/kg, 125 mg/kg, 63 mg/kg và 32 mg/kg, tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc ở

ruột thấp hơn một cách có ý nghĩa so với Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg (P <

0,05). EEE ở nồng độ 250 mg/kg và 125 mg/kg cho tỷ lệ ức chế khả năng mất nƣớc

ở ruột là nhƣ nhau về ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Bên cạnh đó, tỷ lệ ức chế sự mất

nƣớc của EEE nồng độ 63 mg/kg và 32 mg/kg là nhƣ nhau về ý nghĩa thống kê (P >

0,05). Mặc dù khả năng kìm hãm sự mất nƣớc ở ruột của các nghiệm thức bổ sung

EEE ở nồng độ 250 mg/kg đến 32 mg/kg thấp hơn so với nghiệm thức bổ sung

Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg nhƣng lại cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so

với đối chứng (P < 0,05).

3.4.3. Kết quả về khả năng di chuyển ở ruột non

Để đánh giá thời gian di chuyển của than ở ruột của EEE ở các nồng độ khác

nhau, dựa vào tốc độ di chuyển của than và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Chiều dài di chuyển của than và tỷ lệ ức chế sự di chuyển trong ruột

Tổng Chiều dài Ức chế sự

Nhóm Nghiệm thức chiều dài di chuyển di chuyển

ruột (cm) của than (cm) ở ruột (%)

1 DMSO 1% 3 ml/kg (đối chứng) 44,00 ± 11,05 39,25 ± 10,33 10,52 ± 6,97c

Loperamide 3 mg/kg 39,58 ± 9,99 13,42 ± 3,71 65,52 ± 8,17a 2

EEE 1000 mg/kg 45,25 ± 9,21 16,17 ± 4,78 64,08 ± 8,18a 3

59

Đồ án tốt nghiệp

EEE 500 mg/kg 43,25 ± 4,63 19,50 ± 6,50 55,14 ± 12,53a 4

EEE 250 mg/kg 32,17 ± 4,31 20,42 ± 5,04 37,06 ± 9,83b 5

EEE 125 mg/kg 44,58 ± 3,96 33,00 ± 6,04 25,77 ± 12,99bc 6

EEE 63 mg/kg 43,08 ± 7,16 34,00 ± 6,76 21,22 ± 7,46bc 7

Dựa vào bảng 3.3 chúng tôi nhận thấy rằng, ở nghiệm thức đối chứng chỉ cho

EEE 32 mg/kg 45,00 ± 4,15 37,58 ± 3,97 16,21 ± 7,95c 8

uống DMSO 1% mà chiều dài di chuyển của than trong ruột lớn hơn nhiều so với

nghiệm thức xử lý bằng thuốc đặc trị là Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg và EEE ở

các nồng độ khác nhau. Điều đó chứng tỏ dầu thầu dầu là một tác nhân có khả năng

làm tăng nhanh tốc độ di chuyển trong ruột và có thể sử dụng tác nhân này để khảo

sát thời gian di chuyển của than ở ruột non.

Hình 3.11. Tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than giữa các nghiệm thức

Để khảo sát khả năng ức chế sự di chuyển ở ruột của các nghiệm thức, chúng

tôi dựa vào tốc độ di chuyển của than và kết quả đánh giá đƣợc trình bày ở hình

3.11. Tỷ lệ kìm hãm sự di chuyển của than ở ruột đƣợc đánh giá thông qua chiều dài

di chuyển của than giữa các nghiệm thức, kết quả này cho thấy rằng tỷ lệ kìm hãm

sự di chuyển của than ở ruột non giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê (P < 0,05). So với nghiệm thức bổ sung Loperamide với nồng độ 3 mg/kg

60

Đồ án tốt nghiệp

trọng lƣợng chuột, tỷ lệ ức chế sự di chuyển trong ruột của chuột ở nghiệm thức

1000 mg/kg và 500 mg/kg không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (P > 0,05),

điều này chứng tỏ cao EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả kìm

hãm sự di chuyển của than hoạt tính tƣơng đƣơng với thuốc Loperamide ở nồng độ

3 mg/kg. Trong khi đó, các nghiệm thức EEE ở các nồng độ còn lại, tỷ lệ ức chế sự

di chuyển của ruột thấp hơn một cách có ý nghĩa so với Loperamide ở nồng độ 3

mg/kg (P < 0,05). Tỷ lệ ức chế sự di chuyển ở ruột của nghiệm thức bổ sung EEE ở

các nồng độ từ 250 mg/kg đến 1000 mg/kg cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so

với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05). Riêng nghiệm thức bổ sung EEE với các

nồng độ 125 mg/kg, 63 mg/kg, 32 mg/kg và nghiệm thức đối chứng cho tốc độ di

chuyển của than trong ruột là nhƣ nhau. Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng,

chỉ có EEE ở nồng độ 500 mg/kg và 1000 mg/kg có hiệu quả kìm hãm tốc độ di

chuyển trong ruột tƣơng đƣơng với thuốc đặc trị tiêu chảy Loperamide ở nồng độ 3

mg/kg.

Tiêu chảy xảy ra bởi nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể do sự ảnh hƣởng

của các tác nhân hóa học, các vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột, virus,… Các tác

nhân tấn công vào niêm mạc ruột gây rối loạn nhu động ruột, từ đó đẩy nhanh thời

gian di chuyển ở ruột, làm tăng nhanh khả năng mất nƣớc và dẫn đến tiêu chảy. Bên

cạnh đó, để đánh giá đƣợc hiệu quả trị tiêu chảy, chúng tôi phải dựa trên những dấu

hiệu lâm sàng hay các thử nghiệm về đánh giá sự ức chế khả năng mất nƣớc và thời

gian di chuyển của than trong ruột. Qua đó chúng tôi nhận thấy cơ chế hoạt động

của các tác nhân gây tiêu chảy và cơ chế đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy có những

điểm tƣơng đồng. Chính vì lý do đó, mà các vi sinh vật nói chung hay dầu thầu dầu

nói riêng đƣợc sử dụng làm tác nhân gây tiêu chảy để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy

trên chuột.

Khi sử dụng dầu thầu dầu làm tác nhân gây tiêu chảy, ricinoleic acid trong dầu

thầu dầu sẽ đƣợc phân giải nhờ enzyme lipase. Một lƣợng lớn ricinoleic acid đƣợc

hấp thụ vào ruột giúp hoạt hóa thụ thể prostaglandin ở trên tế bào cơ của ruột, gây

co thắt cơ trơn của ruột, dẫn đến làm tăng nhu động ruột và gây tiêu chảy. Sau khi

61

Đồ án tốt nghiệp

đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của EEE bằng việc dựa trên các dấu hiệu lâm sàng,

thử nghiệm enteropooling và đánh giá thời gian di chuyển của than. Kết quả thí

nghiệm cho thấy rằng EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả trị tiêu

chảy giống nhƣ Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg. Dựa trên cơ sở đó, chúng tôi nghĩ

rằng cơ chế hoạt động của EEE sẽ tƣơng tự nhƣ cơ chế hoạt động của thuốc đặc trị

tiêu chảy Loperamide. EEE sẽ gắn với thụ thể opiat tại thành ống tiêu hóa nên ức

chế sự phóng thích acetylcholine và prostaglandin, giúp làm giảm nhu động đẩy tới

và kéo dài thời gian di chuyển ở ruột. Mặt khác, EEE làm tăng trƣơng lực cơ thắt

hậu môn giúp giảm bớt sự tiêu chảy.

Theo nghiên cứu của Emudainohwo và ctv (2015), khi tiến hành đánh giá hiệu

quả trị tiêu chảy của cao chiết nƣớc từ phần lá của Ageratum Conyzoides. Đây là

một cây thuộc họ Cúc, cùng họ với Elephantopus sp.. Kết quả cho thấy rằng, cao

nƣớc của A.Conyzoides ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg cho tỷ lệ ức chế tiêu

chảy lần lƣợt là 58,69% và 56,52%. Trong khi đó, khả năng trị tiêu chảy của EEE ở

nồng độ 1000 mg/kg là 76,62% và ở nồng độ 500 mg/kg và 67,5%. Khi đánh giá về

khả năng ức chế sự co bóp ở ruột, EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg cho

kết quả là 74,919% và 66,529% cao hơn so với cao nƣớc của A.Conyzoides là

37,29% khi ở nồng độ 1000 mg/kg và 29,94% ở nồng độ 500 mg/kg. Mặt khác, khi

xét về thời gian di chuyển ở ruột, cao nƣớc của A.Conyzoides cho khả năng ức chế

sự di chuyển ở ruột là 20,53% ở nồng độ 1000 và 5,39% ở nồng độ 500 mg/kg. Kết

quả này khá thấp so với EEE là 64,08% và 55,14% khi xét cùng 1 nồng độ cao. Nhƣ

vậy, EEE cho hiệu quả trị tiêu chảy tốt hơn so với A.Conyzoides khi ở nồng độ 1000

mg/kg và 500 mg/kg.

Một nghiên cứu khác của Meite và ctv về hiệu quả trị tiêu chảy từ cao ethyl

acetate của cây Morinda morindoides đƣợc thực hiện trên chuột vào năm 2009. Cao

chiết ethyl acetate cho khả năng ức chế tiêu chảy ở nồng độ 1000 mg/kg là 67,00%,

kết quả này gần giống với tỷ lệ ức chế tiêu chảy EEE ở nồng độ 500 mg/kg là

67,50%. Khi so sánh về khả năng ức chế sự co bóp giữa 2 loại cao chiết chúng tôi

nhận thấy rằng, cao ethyl acetate của M.morindoides ở nồng độ 1000 mg/kg có khả

62

Đồ án tốt nghiệp

năng ức chế co bóp ở ruột là 61,04% gần bằng với kết quả của EEE là 66,529% khi

ở nồng độ 500 mg/kg. Đánh giá khả năng ức chế sự di chuyển ở ruột, EEE ở nồng

độ 500 mg/kg cho phần trăm ức chế là 55,14% cao hơn so với cao ethyl acetate của

M.morindoides là 51,83% khi ở nồng độ 1000 mg/kg. Từ kết quả trên chúng tôi

nhận thấy, cao ethyl acetate của M.morindoides ở nồng độ 1000 mg/kg cho hiệu quả

trị tiêu chảy tƣơng tự nhƣ EEE khi ở nồng độ 500 mg/kg.

Khi so sánh hiệu quả trị tiêu chảy trên cùng dung môi ethanol thông qua kết

quả nghiên cứu của Vimochana và ctv (2014), đánh giá khả năng trị tiêu chảy trên

chuột từ cao chiết ethanol từ phần vỏ của thân cây Glycosmis pentaphylla. Khi xét

về khả năng ức chế sự co bóp ở ruột, chúng tôi nhận thấy EEE ở nồng độ 250

mg/kg cho phần trăm ức chế là 52,422% cao hơn so với cao ethanol của

G.pentaphylla là 50,1% khi ở nồng độ 200 mg/kg. Mặt khác khi đánh giá khả năng

trị tiêu chảy, EEE ở nồng độ 250 mg/kg cho tỷ lệ ức chế là 41,63% gần bằng kết

quả cao ethanol của G.pentaphylla ở nồng độ 200 mg/kg là 45,55%. Nhƣ vậy, khi

xét trên cùng loại dung môi thì EEE ở nồng độ 250 mg/kg cho khả năng trị tiêu

chảy tƣơng tự nhƣ cao chiết ethanol của G.pentaphylla ở nồng độ 200 mg/kg.

Từ những kết quả kháng khuẩn và kết quả về hiệu quả trị tiêu chảy trên chuột

của EEE. Khi đánh giá về khả năng kháng khuẩn, EEE ở nồng độ 100 mg/ml tuy có

phổ kháng hẹp chỉ kháng đƣợc 7/15 chủng vi khuẩn chỉ thị nhƣng EEE lại cho kết

quả kháng khá cao. EEE có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng

ruột nhƣ nhóm vi khuẩn Shigella spp., E.coli và một số chủng Vibrio spp. trong đó

có cả V.cholerae. Để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy phải dựa trên những kết quả từ

3 thử nghiệm về đánh giá các dấu hiệu lâm sàng, đánh giá thời gian di chuyển ở ruột

và thử nghiệm enteropooling đƣợc thực hiện trên chuột. Chúng tôi nhận thấy rằng

EEE ở nồng độ 1000 mg/kg và 500 mg/kg có hiệu quả trị tiêu chảy tƣơng đƣơng với

thuốc trị tiêu chảy đặc hiệu Loperamide ở nồng độ 3 mg/kg.

Đây là cơ sở để chúng tôi khẳng định rằng, trong tƣơng lai con ngƣời sẽ bào

chế ra một loại thuốc có nguồn gốc thực vật giống nhƣ cây Elephantopus sp. để

thay thế cho loại thuốc đặc trị tiêu chảy hiện nay là Loperamide trong việc điều trị

63

Đồ án tốt nghiệp

tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu này đƣợc xem là tiền đề, giúp mở ra các hƣớng

nghiên cứu mới trong tƣơng lai về khả năng trị tiêu chảy của cây Elephantopus sp.

Qua đó, không chỉ giúp cho lĩnh vực y học phát triển lên một tầm cao mới và còn

giải quyết thực trạng kháng kháng sinh nhƣ hiện nay.

64

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% của Elephantopus sp. là 17,889%.

EEE ở nồng độ 100 mg/ml cho hoạt tính kháng khuẩn đối với 7/15 chủng vi

khuẩn chỉ thị và có đƣờng kính vòng kháng khuẩn từ 11,7 – 17,3 mm.

Khi tiến hành đánh giá độc tính chúng tôi nhận thấy, EEE ở nồng độ 5000

mg/kg vẫn an toàn trên chuột theo đƣờng uống.

Để đánh giá hiệu quả trị tiêu chảy của EEE, phải dựa vào các dấu hiệu lâm

sàng, các thử nghiệm về enteropooling và thử nghiệm về đánh giá khả năng di

chuyển ở ruột. Kết quả cho thấy, EEE ở nồng độ 1000 và 500 mg/kg đƣợc đánh giá

là có hiệu quả trị tiêu chảy tƣơng tự nhƣ thuốc trị tiêu chảy Loperamide ở nồng độ 3

mg/kg.

4.2. Đề nghị

Tiến hành xác định thành phần hóa học cao chiết ethanol 70% của

Elephantopus sp.

Khảo sát khả năng kháng khuẩn từ cao chiết của Elephantopus sp. trên những

dung môi khác nhƣ ethanol 50%, ethanol 90%, nƣớc, ethyl acetate…

Tiến hành nghiên cứu khả năng trị tiêu chảy của cao ethanol 70% của

Elephantopus sp. trên những mô hình động vật khác.

65

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài Liệu Tiếng Anh

Abigerges D., Armand J.P., Chabot G.G., Dacosta L., Fadel E., Cote C., Herait P.

and Gandia D. (1994). Iriotecan (CPT-11) high-doseescalation usingintensive

high-dose loperamide to control diarrhea, J. Natl Cancer Inst, 86, 446-449.

Aibinu I.E., Akinsulire O.R., Adenipekun T. and Odugbemi T.A.T. (2007). In vitro

antimicrobial activity of crude extracts from plants bryophyllum pinnatum and

kalanchoe crenata, Afr. J. Traditional Complementary and Alternative

Medicines, 4 (3), 338-344.

Andoh T., Ishii K., Suzuki Y., Ikegami Y., Kusunoki Y., Takemoto Y. and Okada

K. (1987). Characterization of a mammalian mutant with a camptothecin-

resistant DNA topoisomerase, I. Proc Natl Acad Sci USA, 84, 5565-5569.

Atta A.H. and Mounier S.M. (2005). Evaluation of some medicinal plant extracts

for antidiarrhoeal activity, Phytother. Res, 19, 481-485.

Awounters F., Niemegeers C.J.E., Lenaerts F.M. and Janseen P.A.J. (1978). Delay

of castor oil diarhoea in rats, a new way to evaluate inhibitors of

prostaglandin biosynthesis, Journal of Pharmacy Pharmacology, 30, 41-45.

Babuselvam M., Farook K.A.M., Abideen S., Mohamed M.P. and Uthiraselvam M.

(2012). Screening of antibacterial activity of mangrove plant extracts against

fish and shrimp pathogens, International Journal of Applied Microbiology

Science, 1 (3), 20-25.

Bennett A. (1983). Mechanisms of Gastrointestinal Motility and Secretion, NATO

ASI Series, Italy.

Beubler E. and Schuligoi R. (2000). Mechanisms of cholera toxin-induced diarrhea,

Ann N Y Acad Sci., 915 (3), 39-46.

Bowen R., Pathophysiology of Diarrhea, 6/2006,

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/smallgut/diarrhea.ht

ml

66

Đồ án tốt nghiệp

Burt S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential

applications in foods – a review, Int J. Food Microbiol, 94 (3), 233-253.

Cowan M.M. (1999). Plant products as antimicrobial agents, Clin Microbiol Rev.,

12 (4), 564-582.

Chaghaby G.A.E., Ahmad A.F. and Ramis E.S. (2014). Evaluation of the

antioxidant and antibacterial properties of various solvents extracts of

Annona squamosa L. leaves, 7 (2), 227-233.

Direkbusarakom S., Herunsalee A., Yoshimizu M., Ezura Y. and Kimura T. (1997).

Efficacy of guava (Psidium guajava) extract against some fish and shrimp

pathogenic agents, Diseases in Asian Aquaculture III.

Doherty S.S. (1981). Inhibition of arachidonic acid release, mechanism by which

glucocorticoids inhibit endotoxininduced diarrhoea, British J. Pharmacol., 73,

549-554.

Dosso K., N'guessan B.B., Bidie A.P., Gnangoran B.N., Méité S., N'guessan D.,

Yapo A.P. and Ehilé E.E. (2012). Antidiarrhoeal activity of an ethanol extract

of the stem bark of piliostigma reticulatum (Caesalpiniaceae) in rats, Afr. J.

Tradit Complement Altern Med, 9 (2), 242-249.

Emudainohwo JO.T., Erhirhie EO. and Moke EGJ. (2015). Anti-Diarrheal Activity

of the Aqueous Leaf Extract of Ageratum Conyzoides in Wistar Rats, Appl.

Sci. Environ. Manage., 19 (2), 169-175.

Flann C. (2009). Global Compositae Checklist,

http://dixon.iplantcollaborative.org/CompositaeWeb/Default.aspx?Page=Nam

eSearch&searchText=elephantopus

Fulder S. (2005). Garlic-the natural antibiotic, User's Guide to Garlic, 42-50.

Gaginella TS. and Phillips SF. (1975). Ricinoleic acid: Current view of an ancient

oil, Am J. Dig Dis, 20, 1171-1177.

Gershon MD. (2004). Serotonin receptors and transporters - roles in normal and

abnormal gastrointestinal motility, Aliment Pharmacol Ther., 7, 3-14.

67

Đồ án tốt nghiệp

Heaton K.W. (1997). Meyers Scale, Scandinavian Journal of Gastroenterology, Đại

học Bristol.

Jaw-Chyun Chen, Yuan-Shiun Chang, Shih-Lu Wu, De-Cheng Chao, Chih-Shiang

Chang, Chia-Cheng Li, Tin-Yun Ho and Chien-Yun Hsiang (2007). Inhibition

of Escherichia coli heat-labile enterotoxin-induced diarrhea by Chaenomeles

speciosa. Journal of Ethnopharmacology, 113, 233-239.

Kabelik J., Krejci Z. and Santavy F. (1960). Treatment with cannabis in ancient,

folk and official medicine up to the beginning of the twentieth century,

Cannabis as a medicament, 5-23.

Karkare (2007). Cardiac glycosides from Strophanthus boivinii,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2528960/

Kehrer D.F., Sparreboom A., Verweij J., Bruijn P., Nierop C.A., Schraaf J.,

Ruijgrok E.J. and Jonge M.J. (2001). Modulation of irinotecan-induced

diarrhea by cotreatment with neomycin in cancer patients, Clin Cancer Res., 7

(5), 36-41.

Khan M.A., Khan N.A., Qasmi I.A., Ahma G. and Zafar S. (2004). Protective effect

of Arque-Ajeeb on acute experimental diarrhoea in rats, BMC

Complementary and Alternative Medicine, doi:10.1186/1472-6882-4-8.

Laranja S.M., Bergamaschi C.M. and Schor N. (1991). Evaluation of acute

administration of natural productswith potential diuretic effects in humans,

Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 86, 237-240.

Low-Beer T.S. and Read A.E. (1971). Diarrhoea: mechanisms and treatment, 12,

1021-1036, http://gut.bmj.com/content/12/12/1021.full.pdf+html

Mascolo N., Izzo A.A., Avotore G., Barboto F. and Capasso F. (1994). Nitric oxide

and castor oil included diarrhea, Journal of Pharmacology and Experimental

therapeutics, 268, 291-292.

Meite S., Guessan J.D.N., Bahi C., Yapi H.F., Djaman A.J. and Guina F.G. (2009).

Antidiarrheal Activity of the Ethyl Acetate Extract of Morinda morindoides in

Rats, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8 (3), 201-207.

68

Đồ án tốt nghiệp

Meyer H. (1890). Ueber den wirksamen Bestandtheil des Ricinusöls. [On the active

component of castor oil], Arch Exp Path Pharmak, 28, 145-152.

Mitjans M., Garcia L., Marrero E. and Vinardell M.P. (2008). Study of ligmed-A, an

antidiarrheal drug based on liguin, on rat small intestine enzyme activity and

morphometry, J. Vet. Pharmacol Ther., 24, 349-351.

Mohan V.R., Chenthurpandy P. and Kalidass C. (2010). Pharmacognostic and

phytochemical investigation of Elephantopus scaber L. (Asteraceae), Journal

of Pharmaceutical Science and Technology, 2 (3), 191-197.

Moskwa A. and BoznaÃ…ska P. (2007). Role of serotonin in the pathophysiology

of the irritable bowel syndrome, Wiad Lek, 60 (7-8), 371-376.

Multum. Information has been compiled for use by healthcare practitioners and

consumers in the United States, 2011, http://www.emedicinehealth.com/drug-

magnesium_sulfate/page3_em.htm

Muthumani P., Chiristina A.J.M., Venkataraman S., Meera R., Devi P., Kameswari

B. and Eswarapriya B. (2010). Anti-diarrhoeal and cardiotonic activity of

extracts of Elephantopus scaber linn in experimental animals, Research

Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 1 (3), 1-4.

Nataro J.P. and Kaper J.B. (1998). Diarrheagenic Escherichia coli, Clin. Microbiol.

Rev, 11, 142-201.

Ndukui J.G., Godfrey K., Larry F.S. and John K. (2013). Antidiarrheal activity and

Phytochemical profile of the ethanolic leaf extract of Leonotis nepetifolia

(Lion’s ear) in Wistar albino rats, J. Intercult Ethnopharmacol., 2 (2), 121-

126.

Ngueguim F.T., Khan M.P., Donfack J.H., Siddiqui J.A., Tewari D., Nagar G.K.,

Tiwari S.C., Theophile D., Maurya R. and Chattopadhyay N. (2012).

Evaluation of Cameroonian plants towards experimental bone regeneration,

Journal of Ethno pharmacology, 141 (1), 331-337.

69

Đồ án tốt nghiệp

Press J.R., Shrestha K.K. and Sutton D.A.. "Elephantopus L.", Annotated Checklist

of the Flowering Plants of Nepal, 2009,

http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=110&taxon_id=200023877

Reichelderfer M., Pero B., Lorenzsonn V. and Olsen WA. (1984). Magnesium

sulfate-induced water secretion in hamster small intestine, Proc Soc Exp Biol

Med., 176 (1), 8-13.

Restaino O.F., Bhaskar U., Paul P., Lin L., Rosa M.D., Jonathan S. D. and Robert J.

L. (2013). High cell density cultivation of a recombinant E.coli strain

expressing a key enzyme in bioengineered heparin production, Appl.

Microbiol Biotechnol, 97 (9), 3893-3900.

Robert A., Nezamis J.E., Lancaster C., Hanchar A.J. and Klepper M.S. (1976).

Enteropooling assay; a test for diarrhea produced by prostaglandins,

Prostaglandins, 11, 809-828.

Ruwart M.J. and Rush B.D. (1984). The role of accelerated colonic transit in

prostaglandin-induced diarrhoea and its inhibition by prostacyclin, Br. J.

Pharmacol, 83 (1), 157-159.

Saalmüller L. (1848). Ueber die fetten Säuren des Ricinusöls. [On the fatty acids of

castor oil], Justus Liebigs Ann Chem, 64, 108-126.

Saralaya M.G., Patel P., Patel M., Roy S.P. and Patel A.N. (2010). Antidiarrheal

activity of methanolic extract of Moringa oleifera Lam roots in experimental

animal models, International Journal of Pharmaceutical Research, 2 (2), 35-39.

Sarin R.V. and Bafna P.A. (2012). Herbal Antidiarrhoeals: A Review, International

Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 3 (2), 637-

649.

Shetty K., Paliyath G., Pometto A. and Levin R.E. (2006). Clonal Screening and

Sprout Based Bioprocessing of Phenolic Phytochemicals for Functional

Foods, Functional Foods and Biotechnology, 1, 1-16.

70

Đồ án tốt nghiệp

Shoba F.G. and Thomas M. (2001). Study of antidiarrhoeal activity of four

medicinal plants in castor oil induced diarrhoea, J. Ethnopharmacol, 76, 73-

76.

Silva and Fernandes (2010). Biological properties of medicinal plants: a review of

their antimicrobial activity, The Journal of Venomous Animals and Toxins

including Tropical Diseases, 16 (3), 402-413.

Spangler B.D. (1992). Structure and Function of Cholera Toxin and the Related

Escherichia coli Heat Labile Enterotoxin, Biological and Medical Research

Division, 56 (4), 622-647.

Tổ chức Y tế Thế giới (2009). Why children are still dying and what can be done,

WHO Library Cataloging-in-Publication Data, 2, 8-14.

Tunaru S., Till F., Althoff R.M., Nüsing, Diener M. and Offermanns S. (2012).

Castor oil induces laxation and uterus contraction via ricinoleic acid

activating prostaglandin EP3 receptors, Proc Natl Acad Sci USA, 109 (23),

9179-9184.

Thiagarajah J.R. and Verkman A.S. (2005). New Drug Targets for Cholera Toxin,

Trends Pharmacol Sci., 5, 172.

Vimochana B., Sumalatha G. and Rani Ch.U. (2014). Evaluation of antidiarrhoeal

activity of ethanolic extract of stem bark of Glycosmis pentaphylla in rats,

World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 3 (9), 692-698.

Yoshio K., Hayakawa T., Togashi Y. and Kamataki T. (1997). Relevance of

Irinotecan Hydrochloride-Induced Diarrhea to the Level of Prostaglandin E2

and Water Absorption of Large Intestine in Rats, Jpn. J. Pharmacol, 75, 399-

405.

Yoshio K., Terumasa H., Masaki A., Yasuhiro K. and Tetsuya K. (1997).

Preventive Effects of Hange-shashin-to on Irinotecan Hydrochloride Caused

Diarrhea and Its Relevance to the Colonic Prostaglandin E2 and Water

Absorption in the Rat, Jpa J. Pharmacol, 75, 407-413.

71

Đồ án tốt nghiệp

Tài Liệu Tiếng Việt

Bùi Quỳnh Nga, Ngộ độc thức ăn do vi khuẩn, 2012,

http://suckhoedoisong.vn/benh-thuong-gap/ngo-doc-thuc-an-do-vi-khuan-

20120616100120362.htm

Bùi Thị Thu Hƣơng.Cảnh giác với bệnh thương hàn, Báo Sức khỏe và Đời sống,

2014,

http://suckhoedoisong.vn/ban-can-biet-ve-y-hoc/canh-giac-voi-benh-thuong-

han-20140515210436859.htm

Bùi Xuân Phƣợng. 1903-Cúc chỉ thiên mềm, 2014,

http://buixuanphuong09blogspot.blogspot.com/2014/03/1903-cuc-chi-thien-

mem.html

Đặng Văn Hoài (2009). Steroid và cholesterol, Đại học Y Dƣợc TP.HCM.

Đỗ Huy Bích và Bùi Xuân Phƣơng (1980). Sổ tay cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất

bản Y học.

Đỗ Minh Quang (2012). Sinh lý bệnh đại cương chức năng tiêu hóa, Trƣờng Đại

học Y Dƣợc TP.HCM.

Hà Hiền, 5 nguyên nhân không ngờ gây bệnh tiêu chảy không ngờ, 2014,

http://dantri.com.vn/suc-khoe/5-nguyen-nhan-khong-ngo-gay-benh-tieu-chay-

879181.htm

Hoàng Ngân. Bệnh tả và cách điều trị bệnh tả hiệu quả, Báo Sức khỏe và Đời sống,

2013,

http://tapchisuckhoe.edu.vn/benh-ta-va-cach-dieu-tri-benh-ta-hieu-qua/

Hồng Lĩnh, Vi khuẩn campylobacter, nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh qua thực

phẩm tại Mỹ, thâm nhập vào tế bào như thế nào?, Sở Khoa học và Công nghệ

Đồng Nai, 2007,

http://khoahoc.tv/doisong/yhoc/suc-khoe/11936_vi-khuan-campylobacter-

nguyen-nhan-hang-dau-gay-ra-benh-qua-thuc-pham-tai-my-tham-nhap-vao-te-

bao-nhu-the-nao.aspx

72

Đồ án tốt nghiệp

Lê Anh, Tiêu chảy cấp do rotavirus, Báo Sức khỏe và Đời sống, 2012,

http://suckhoedoisong.vn/phong-benh/tieu-chay-cap-do-rotavirus-

20120617102428800.htm

Lê Thị Mai Khanh (2004). Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia coli phân

lập được từ phân và thịt của bò, heo bằng kỹ thuật multiplex – PCR, Luận văn

thạc sĩ, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM.

Ngô Thị Thùy Dƣơng (2012). Nghiên cứu tách chiết tannin từ thịt quả điều lộn hột

và ứng dụng làm chất ức chế ăn mòn kim loại, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại

học Sƣ Phạm Đà Nẵng.

Ngô Văn Thu (2011). Anthraquinone glycosides, Bài giảng dƣợc liệu tập I, Trƣờng

Đại học Y Dƣợc Hà Nội, 215-230.

Ngô Văn Thu (2011). Bài giảng dược liệu – tập I. Nhà xuất bản Trung tâm thông

tin thƣ viện - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.

Nguyễn Bạch Đằng, Cảnh giác với tiêu chảy cấp tính do Crytosporidium, Báo Sức

khỏe và Đời sống, 2011,

http://suckhoedoisong.vn/bac-si-tra-loi/canh-giac-voi-tieu-chay-cap-tinh-do-

crytosporidium-20111102101832590.htm

Nguyễn Duy Chính (2009). Nghiên cứu đa dạng sinh học thực vật rừng thông ba lá

(Pinus kesiya) mọc tự nhiên ở Lâm Đồng và vùng lân cận, Báo cáo đề tài

Khoa học cấp bộ, Trƣờng Đại học Đà Lạt.

Nguyễn Đức Hiền. Bệnh truyền nhiễm do trực khuẩn lỵ Shigella, Viện YHLS bệnh

Nhiệt đới QG, 2013,

http://benh.vn/truyen-Nhiem/Benh-truyen-nhiem-do-truc-khuan-ly-

shigella/35/3530/10-6-2013.htm

Nguyễn Hữu Liêm (2013). Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella, Khóa luận tốt nghiệp,

Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM.

Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp (2007). Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất

bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội.

73

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh. Cấu tạo, tính chất và vai trò của carbohydrate,

2011,

http://tailieu.vn/doc/cau-tao-tinh-chat-va-vai-tro-cua-carbohydrate-

887289.html

Nguyễn Tấn Thịnh (2013). Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây lược

vàng Callisia fragrans (lindl). Wood, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học

Công Nghệ TP.HCM.

Nguyễn Thị Khánh Nhƣ (2009). Xác định gen kháng Ceftriaxone ở vi khuẩn

Shigella sonnei phân lập từ các mẫu bệnh phẩm, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại

học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012). Phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật,

Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại học Hà Nội.

Nguyễn thị Yến, Khi trẻ tiêu chảy do bất dung nạp lactose, 2011,

http://baosuckhoe.org/suc-khoe-tre-em/khi-tre-tieu-chay-do-bat-dung-nap-

lastose.html

Phạm Minh Nhựt (2013). Thực hành vi sinh đại cương, Trƣờng Đại học Công Nghệ

TP.HCM.

Phạm Thanh Kỳ (1998). Bài giảng dược liệu – tập II. Nhà xuất bản Trung tâm

thông tin thƣ viện - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội.

Phạm Thị Bích Ngọc (2011). Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản

đông lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM.

Phạm Thị Cẩm Hà. Bệnh do nhiễm khuẩn Salmonella - Một số vấn đề cần quan

tâm, Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, 2013,

http://www.nihe.org.vn/new-vn/hoi-dap-ve-dich-benh-dich-benh-

khac/764/Benh-do-nhiem-khuan-Salmonella--Mot-so-van-de-can-quan-

tam.vhtm

Phùng Trung Hùng, Phan Nguyễn Hữu Trọng và Nguyễn Phƣớc Long. Đại cương

Carbohydrate, 2013,

http://docsachysinh.com/dsys-ebook/Phan1/chuong14/index.html

74

Đồ án tốt nghiệp

Phùng Văn Phê (2014). Bước đầu nghiên cứu các kiểu thảm thực vật tại khu bảo

tồn thiên nhiên Ngọc Sơn, Ngổ Luông, tỉnh Hòa Bình. Tạp chí Khoa học,

Trƣờng ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30 (4), 30-39.

Quỳnh Ngọc (2011). Flavonoids-bảo vệ sức khỏe an toàn, Tạp chí thông tin Khoa

học và Công nghệ số 1&2, Trung tâm thông tin KH&CN TP.HCM.

Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv (2010). Chất kháng khuẩn thực vật, Tiểu luận môn

CNCB rau trái, Trƣờng Đại học Bách khoa, TP.HCM.

Tôn Nữ Minh Nguyệt, Nguyễn Văn Bảy, Nguyễn Bảo Dƣ và Đỗ Minh Hiển (2011).

Sterol-nguồn gốc, cấu tạo và tính năng sinh học, Báo cáo Tiểu luận, Trƣờng

Đại học Bách Khoa TP.HCM.

Tuệ Tĩnh (1960). Nam dược thần hiệu, Nhà xuất bản Y học.

Trần Anh Văn, Tiêu chảy cấp, 2011,

http://tailieu.vn/doc/tieu-chay-cap-521216.html

Trần Nam Hà (2008). Nghiên cứu tác dụng của bokashi trầu lên vi khuẩn gây bệnh

đường ruột ở tôm sú nuôi, Tiểu luận tốt nghiệp, TP.HCM.

Trần Nhƣ Dƣơng. Sự thật về tác hại của vi khuẩn E.coli., Báo Sức khỏe và Đời

sống, 2011,

http://suckhoedoisong.vn/ban-can-biet-ve-y-hoc/su-that-ve-tac-hai-cua-vi-

khuan-ecoli-20110624104521436.htm

Trần Trƣờng Hận. Hợp chất thiên nhiên, 2010,

http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/4329903

Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam. Thảm thực vật tự nhiên ở vườn quốc gia

Hoàng Liên, 7/6/2008,

http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=21

Trƣờng Đại học Y Dƣợc Hà Nội (1998). Bộ môn Dược lý, Dược lý học, Nhà xuất

bản Y học, Hà Nội.

Võ thị Mai Hƣơng (2009). Thành phần hóa sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết lá Muồng trâu (Cassia alata L.), Tạp chí Khoa học số 52, Đại học Huế.

75

Đồ án tốt nghiệp

Võ Thị Mai Hƣơng và Trần Thanh Phong (2013). Nghiên cứu một số đặc trưng hoá

sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết quả nhàu ((Morinda citrifolia

L.), Báo cáo Khoa học tại Hội nghị Khoa học Quốc gia và Quốc tế, 1073-

1078.

Vũ xuân Tạo (2013). Nghiên cứu alkaloid và quy trình tách chiết một số chất có

bản chất là alkaloid, Công nghệ tách chiết các hợp chất thứ sinh.

76

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN

A.1.Kết quả hiệu suất thu hồi cao ethanol 70% của Elephantopus sp.

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

5,003 5,000 5,006 Khối lƣợng bột (g)

0,895 0,880 0,910 Khối lƣợng cao (g)

17,889 17,600 18,178 Hiệu suất thu hồi (%)

17,889 ± 0,289 Hiệu suất thu hồi trung bình (%)

A.2. Kết quả kháng khuẩn của cao ethanol 70% (d = 6 mm)

Vi sinh vật EEE 100 mg/ml Trung bình SD

E.coli O157:H7 12,0 12,5 12,2 0,289 12,0

E.coli 13,0 13,5 13,5 0,500 14,0

S.flexneri 17,0 17,0 17,3 0,577 18,0

V.alginolyticus 13,0 13,5 13,2 0,289 13,0

V.cholerae 12,0 12,0 11,7 0,577 11,0

V.harveyi 16,0 15,0 15,7 0,577 16,0

V.parahaemolyticus 17,5 17,5 17,0 17,3 0,289

A.3. Kết quả kháng khuẩn của kháng sinh Ciprofloxacin (d = 6 mm) ở các

nồng độ khác nhau

1

Đồ án tốt nghiệp

2

Đồ án tốt nghiệp

A.4. Kết quả so sánh sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn của cao chiết

ethanol 70% và Ciprofloxacin trên từng chủng vi khuẩn

A.4.1. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 8 µg/ml của

V.alginolyticus

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 13,5 13,5 162,00 0,0002 1

Within groups 0,333333 0,0833333 4

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Total (Corr.) 13,8333 5

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

V.alginolyticus EEE 3 13,1667 X

V.alginolyticus Cip8 3 16,1667 X

A.4.2. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 8 µg/ml của V.cholerea

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 4,16667 4,16667 12,50 0,0241 1

Within groups 1,33333 0,333333 4

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Total (Corr.) 5,5 5

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

V.cholerae EEE 11,6667 X 3

V.cholerae Cip8 13,3333 X 3

3

Đồ án tốt nghiệp

A.4.3. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 8 µg/ml của V.harveyi

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 8,16667 8,16667 28,00 0,0061 1

Within groups 1,16667 0,291667 4

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Total (Corr.) 9,33333 5

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

V.harveyi EEE 3 15,6667 X

V.harveyi Cip8 3 18,0 X

A.4.4. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 8 µg/ml của

V.parahaemolyticus

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 54,0 54,0 648,00 0,0000 1

Within groups 0,333333 0,0833333 4

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Total (Corr.) 54,3333 5

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

V.parahaemolyticus Cip8 3 11,3333 X

V.parahaemolyticus EEE 3 17,3333 X

4

Đồ án tốt nghiệp

A.4.5. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 500 µg/ml của E.coli

O157:H7

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 1,5 1,5 18,00 0,0132 1

Within groups 0,333333 0,0833333 4

Total (Corr.) 1,83333 5

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

E.coli O157:H7 EEE 12,1667 X 3

E.coli O157:H7 Cip500 13,1667 X 3

A.4.6. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 500 µg/ml của E.coli

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 0,166667 0,166667 1,00 0,3739 1

Within groups 0,666667 0,166667 4

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Total (Corr.) 0,833333 5

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

E.coli Cip500 13,1667 X 3

E.coli EEE 13,5 X 3

5

Đồ án tốt nghiệp

A.4.7. So sánh giữa cao ethanol 70% và Ciprofloxacin 500 µg/ml của S.flexneri

ANOVA Table for Col_2 by Col_1

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 26,0417 26,0417 125,00 0,0004 1

Within groups 0,833333 0,208333 4

Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1

Total (Corr.) 26,875 5

Method: 95,0 percent Tukey HSD

Col_1 Count Mean Homogeneous Groups

S.flexneri Cip500 3 13,1667 X

S.flexneri EEE 3 17,3333 X

6

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ VỀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY

TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT

B.1. Kết quả về hiệu quả trị tiêu chảy

B.1.1. Thời gian bị tiêu chảy (phút) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

B.1.2. Lượng phân tiêu chảy (g) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

B.1.3. Phần trăm ức chế tiêu chảy (%) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

7

Đồ án tốt nghiệp

B.1.4. So sánh thời gian bị tiêu chảy giữa các nhóm

B.1.5. So sánh lượng phân tiêu chảy giữa các nhóm

B.1.6. So sánh khả năng ức chế tiêu chảy giữa các nhóm

8

Đồ án tốt nghiệp

B.2. Kết quả thử nghiệm enteropooling

B.2.1. Khối lượng dịch ruột (g) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

B.2.2. Thể tích dịch ruột (ml) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

9

Đồ án tốt nghiệp

B.2.3. Phần trăm ức chế sự co bóp ruột (%) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

B.2.4. So sánh thể tích dịch ruột giữa các nhóm

B.2.5. So sánh khả năng ức chế sự mất nước giữa các nhóm

10

Đồ án tốt nghiệp

B.3. Kết quả về sự di chuyển ở ruột non

B.3.1. Chiều dài ruột (cm) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

B.3.2. Chiều dài của than (cm) ở các nhóm thông qua các lần lặp lại

11

Đồ án tốt nghiệp

B.3.3. Phần trăm ức chế sự di chuyển ở ruột (%) giữa các nhóm thông qua các

lần lặp lại

B.3.4. So sánh khả năng ức chế sự di chuyển ở ruột giữa các nhóm

12