Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen Nelumbo nucifera

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ SEN NELUMBO NUCIFERA

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHÊ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Ngọc Hồng

Th.S: Nguyễn Thị Thu Hương

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Kim Ngân

MSSV: 1151110218 Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự đồng hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng và Thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Hương.

Các số liệu, những kết luận được trình bày trong đồ án này hoàn toàn trung

thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào.

Em xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Sinh viên

Trần Thị Kim Ngân

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Ngọc Hồng và

Th.S Nguyễn Thị Thu Hương, là giáo viên đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo mọi điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đồ án này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô đã giảng dạy tại khoa Công nghệ sinh học

– Thực phẩm – Môi trường đã truyền đạt những kiến thức quý cho tôi trong suốt khoảng

thời gian học tập tại Trường Đại học Công nghệ TP.HCM.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của tập thể cán bộ, các anh,

chị và các bạn trong Phòng thí nghiệm – Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM.

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Sinh viên

Trần Thị Kim Ngân

Mục lục

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................3

DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................4

DANH MỤC HÌNH ẢNH...............................................................................................5

MỞ ĐẦU .........................................................................................................................7

1. Lý do chọn đề tài ...................................................................................................7

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...........................................................8

3. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................9

4. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................................9

5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................9

6. Các kết quả đạt được của đề tài...........................................................................10

7. Kết cấu của ĐATN ..............................................................................................10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................11

1.1. Tổng quan về cây Sen ......................................................................................11

1.1.1. Vị trí, phân loại .........................................................................................11

1.1.2. Đặc điểm thực vật học, sinh thái ...............................................................11

1.1.3. Thành phần hóa học ..................................................................................12

1.1.4. Tính vị, tác dụng .......................................................................................14

1.1.5. Công dụng, chỉ định, phối hợp..................................................................14

1.2. Tổng quan về hợp chất Phenolics ....................................................................16

1.2.1. Phân loại....................................................................................................16

1.2.2. Tính chất hóa học ......................................................................................17

1.2.3. Vai trò của các hợp chất trong phenol trong thực vật ...............................17

1.2.4. Flavonoid...................................................................................................18

1.3. Tổng quan về hợp chất alkaloid.......................................................................20

1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa ...........................................................24

1.4.1. Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa...24

1.4.2. Tính chống oxy hóa của các hợp chất trong lá sen ...................................25

1.5. Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS .................................................26

1.5.1. Phổ khối lượng ..........................................................................................26

1.5.2. Cấu tạo một khối phổ kế ...........................................................................27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..........................................................35

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................35

2.2. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm ..........................................................................35

2.3. Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................36

2.3.1. Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu ............................................37

2.3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu.......................................................................39

2.3.3. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết........................................................41

2.3.4. Phương pháp xác định lượng cao thu được...............................................43

2.3.5. Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong lá sen....................44

2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số.............................45

2.3.7. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số ..............................................45

2.3.8. Phương pháp định lượng alkaloid tổng số ................................................46

2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử.........................................................48

2.3.10. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH............................49

2.3.11. Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS .............................................50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................53

3.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen....................................................................53

3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu..............................................................................55

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng cao thu được ......................56

3.4. Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết lá sen ..........................58

3.5. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết .............................................61

3.6. Định lượng Flavonoid tổng số .........................................................................64

3.7. Định lượng alkaloid tổng số.............................................................................67

3.8. Xác định năng lực khử .....................................................................................68

3.9. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH......................................................69

3.10. Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết lá sen bằng HPLC-ESI/MS...........74

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................78

4.1. Kết luận ............................................................................................................78

4.2. Kiến nghị..........................................................................................................79

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................80

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AG: Acid Gallic

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EtOAC: Ethyl Acetate

Et-F: Ethyl acetate Fraction

IC50: half maximal inhibitory concentration

LC-MS: Liquid Chromatography–Mass Spectrometry

TPHH: Thành Phần Hóa Học

TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số)

TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số)

db: gam dược liệu khô

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Độ ẩm dược liệu................................................................................................ 55

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khô thu được.............................. 56

Bảng 3.3: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá sen ................................... 59

Bảng 3.4: Kết quả đường chuẩn Acid Gallic..................................................................... 60

Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số ............................................................ 61

Bảng 3.6: Kết quả đường chuẩn Rutin .............................................................................. 63

Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số.............................................................. 64

Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng alkaloid toàn phần ............................................................ 65

Bảng 3.9: Năng lực khử của dịch chiết ethanol tối ưu. .................................................... 66

Bảng 3.10: Giá trị %I và kết quả IC50của vitamin C ......................................................... 68

Bảng 3.11: Giá trị %I và IC50 của mẫu lá sen trưởng thành chiết bằng ethanol 96% ....... 70

Bảng 3.12: Giá trị %I và IC50 của lá sen non chiết bằng ethanol 70%............................. 71

Bảng 3.13: Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết cồn từ lá sen .................................... 73

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây sen .............................................................................................................. 11

Hình 1.2: Cấu trúc Nuciferine ........................................................................................... 13

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất có trong lá sen.................................................. 13

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số chất có trong tâm sen. ...................................... 14

Hình 1.5: Một số hợp chất phenol ..................................................................................... 17

Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế. .............................................................................. 27

Hình 2.1: Lá sen non ......................................................................................................... 34

Hình 2.2: Lá sen trưởng thành........................................................................................... 34

Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm................................................................................ 35

Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu ......................................................................... 37

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen ........................................... 40

Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid toàn phần .................................................................... 46

Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình năng lực khử ............................................................................ 48

Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen ...................................................................................... 53

Hình 3.2: Bột lá sen ........................................................................................................... 53

Hình 3.3: Vi phẫu bột lá sen .............................................................................................. 54

Hình 3.4: Sự biến đổi màu sắc dịch chiết ở các nồng độ cồn khác nhau .......................... 56

Hình 3.5: Sự biến đổi màu sắc khi hơ dịch chiết qua NH4OH .......................................... 57

Hình 3.6: Sự tạo tủa với thuốc thử Mayer ........................................................................ 57

Hình 3.7: Cột bọt trước và sau khi để yên 15 phút............................................................ 58

Hình 3.8: Kết tủa đỏ gạch hình thành................................................................................ 58

Hình 3.9: Sự đổi màu của dịch chiết ................................................................................ 59

Hình 3.10: Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic...................................................... 60

Hình 3.11: Đường chuẩn Acid Gallic................................................................................ 61

Hình 3.12: Dung dịch Rutin chuẩn.................................................................................... 63

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.13: Đường chuẩn Rutin ......................................................................................... 64

Hình 3.14: Mẫu lá sen phản ứng AlCl3 ............................................................................. 64

Hình 3.15: Đồ thị năng lực khử của dịch chiết.................................................................. 67

Hình 3.16: Sự đổi màu dung dịch do hiện tưởng khử Fe3+ ............................................... 68

Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C ....................................... 69

Hình 3.18: Phản ứng màu của dung dịch DPPH + Vitamin C .......................................... 69

Hình 3.19: Phản ứng của dịch mẫu + DPPH ..................................................................... 70

Hình 3.20: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen trưởng thành cồn 96%...................... 70

Hình 3.21: Biểu đồ % I (% ức chế) của mẫu lá sen non trong ethanol 70%..................... 71

Hình 3.22: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của 2 đối tượng lá sen và vitamin C ................... 71

Hình 3.23: Sắc ký đồ HPLC-ESI/MS của dịch chiết cồn 96% từ lá sen........................... 73

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Từ ngày xưa người ta đã biết dùng đến các loại thảo dược để chữa trị nhiều loại

bệnh khác nhau, trong đó có bệnh béo phì và tim mạch, Bên cạnh đó, khả năng

chống béo phì trên người của nhóm hợp chất catechin đã được nghiên cứu và

chứng minh.

Sen là loại cây quen thuộc với người dân Việt Nam, là loại cây mà hầu như tất

cả các bộ phận đều được sử dụng để phục vụ cho việc trang trí, thực phẩm, dược

phẩm chữa bệnh…Dù vậy, việc nghiên cứu các hoạt chất sinh học có trong sen vẫn

còn rất hạn chế ở nước ta.

Việc nghiên cứu sản xuất ra các chất chiết từ thiên nhiên để bổ sung vào đồ

uống, thực phẩm nói riêng và trong các ngành công nghiệp khác nói chung luôn

được quan tâm mà chủ yếu là các hợp chất phenolic như flavonoid và các hợp chất

alkaloid.

Những hợp chất nay tồn tại nhiều trong các loại hoa lá, củ quả…của nhiều loại

thảo dược, Những thành phần này được sử dụng như một loại thực phẩm chức

năng nhằm mục đích ngừa bệnh do có tính chống oxy hóa mạnh. Chúng được sử

dụng với nhiều mục đích khác nhau trong các ngành công nghiệp như thực phẩm,

dược phẩm, mỹ phẩm…

Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm, là

một điều kiện tốt để sen tồn tại và phát triển. Việc nghiên cứu, phân tích các thành

phần hóa học có trong sen sẽ là một bước đi cụ thể nhằm tìm ra các hợp chất thứ

cấp có dược tính tốt trong cây sen, trong đó có alkaloid và flavonoid, tạo tiền đề cơ

bản cho việc ứng dụng các hợp chất này vào trong các chế phẩm phòng và chữa

bệnh cho người.

Sen là một loài thực vật gần gũi với đời sống của người dân Việt Nam. Tất cả

các bộ phận của sen đều được sử dụng để phục vụ cho con người: lá dùng gói xôi,

hoa sen dùng để trang trí, hạt sen thì dùng nấu chè, tâm sen lại có dược tính an thần

cho những ai mắc căn bệnh mất ngủ. Trong dân gian, lá sen được dùng nấu nước

uống thay trà, nhưng hiện nay, chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu về lá sen

cũng như những thành phần dược tính có giá trị của nó. Do vậy, đề tài “Nghiên

cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy của lá sen Nelumbo

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

nucifera” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho việc tạo sản phẩm trà túi lọc từ

lá sen hoặc tạo viên nang chức năng mang lại nhiều giá trị thực tiễn.

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Những nghiên cứu trong nước

- Tiến sĩ Hoàng Thị Tuyết Nhung đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và

tinh chế Conessin, Kaempferon, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối

chiếu trong kiểm nghiệm thuốc”.Trong đó Nuciferin là chất được chiết xuất và

tinh sạch từ cây Sen (Nelumbo nucifera).

- Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của dịch chiết cây

sen thu hái ở Đà Nẵng.

- Xây dựng qui trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và

quercetin-3-0-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò

PDA.

- Độc tính mãn và tác dụng chống béo phì từ lá trà xanh và lá sen

- Phương pháp khối lượng định lượng alkaloid toàn phần của lá sen và sự thay

đổi hàm lượng alkaloid theo tuổi và thời vụ thu lá.

- Nghiên cứu thành phần hóa học của tâm sen và gương sen,

- Tinh chế và xác định một vài tính chất đặc trưng của lectin từ nhị hoa sen

(Nelumbo nucifera) và hoa cây thiên lý (Telosma condata)

- Chiết xuất alkaloid từ lá sen làm thuốc senin chữa bệnh loạn nhịp tim.

- Tác dụng chống loạn nhịp tim của lá sen.

Những nghiên cứu nước ngoài

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về cây Sen như:

- Phân tích thành phần Alkaloid trong lá sen bằng phương pháp sử dụng tia UV

và đo phổ khối lượng.

- Xác định hàm lượng các hợp chất phenolic trong hoa sen (Nelumbo nucifera)

bằng phương pháp điện di mao dẫn.

- Xác định Nuciferin và các đồng phân của nó bằng phương pháp sắc ký lỏng

cao năng ngược pha.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3. Mục đích nghiên cứu

- Xác định các thành phần hóa học của cây sen thu hái tại khu vực quận 7, Thành

phố Hồ Chí Minh.

- Xác định được hàm lượng các chất có dược tính trong lá sen, đồng thời xác

định được khả năng chống oxy hóa của lá sen sẽ là tiền đề cho việc tạo những

chế phẩm có hàm lượng phenolic, alkaloid cao, có thể được bổ sung vào các

thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thiên nhiên, tăng cường sức khỏe, phòng

chống bệnh tật.

- Xác định một số thành phần flavonoid, alkaloid, mở ra hướng ứng dụng trong

việc khai thác các chế phẩm chức năng giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên

cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo.

- Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp

xác định, khảo sát, phân tích.

- Nhiệm vụ 3: Thu nhận dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong

ethanol

- Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hóa học có trong lá sen

- Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số và

alkaloid tổng số từ dịch chiết lá sen

- Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua giá trị IC50 hay nồng

độ ức chế 50% gốc tự do của dịch chiết lá sen, đánh giá năng lực khử và thử

nghiệm in vitro trên mô hình DPPH.

- Nhiệm vụ 7: Khảo sát các thành phần hóa học trong lá sen bằng phương pháp

HPLC-ESI/MS

5. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về lá sen, sơ bộ thành

phần hóa học của lá sen, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ

cấp, mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa, phương pháp HPLC/MS

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết

các nhiệm vụ nghiên cứu.

- Phương pháp xử lý số liệu bằng toán học và phân tích phương sai ANOVA

bằng phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.I: Các số liệu thu được sẽ

được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài.

6. Các kết quả đạt được của đề tài.

- Thu nhận được dịch chiết lá sen bằng phương pháp ngâm dầm trong ethanol

96% có hàm lượng phenolic và alkaloid cao (đối với lá sen trưởng thành) và

trong ethanol 70% (đối với lá sen non).

- Định tính sơ bộ các thành phần hóa học trong dịch chiết cồn lá sen.

- Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số, alkaloid toàn phần

của dịch chiết.

- Xác định được các thành phần flavonoid, alkaloid trong dịch chiết lá sen

- Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hóa trên mô hình DPPH với

Vitamin C và so sánh năng lực khử của dịch chiết với Acid Gallic.

7. Kết cấu của đề tài. - Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài

- Chương 2: Vật liệu, hóa chất và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Chương 4: Kiến nghị

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây Sen

1.1.1. Vị trí, phân loại

Giới (regnum): Plantae

Proteales Bộ (ordo)

Họ (familia) Nelumbonaceae

Chi (genus) Nelumbo

Loài (species): N. nucifera

Danh pháp: Nelumbo nucifera

Hình 1.1: Cây sen

1.1.2. Đặc điểm thực vật học, sinh thái

Về mặt thực vật học, Nelumbo nucifera (Gaertn,) đôi khi còn được gọi theo các

danh pháp cũ như Nelumbium speciosum (Willd.) hay Nymphaea nelumbo. Đây là một

loại cây thủy sinh sống lâu năm. Trong thời kỳ cổ đại nó đã từng là loại cây mọc phổ

biến dọc theo bờ sông Nin ở Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng

gần gũi có tên gọi dài dòng là hoa sen xanh linh thiêng sông Nin (Nymphaea caerulea)

Dạng thân thảo mọc dưới nước, sống dai nhờ thân rễ (ngó sen). Ngó sen màu trắng,

tiết diện gần tròn, có khía dọc màu nâu, ngọn có mang chồi hình chóp nhọn. Thân rễ

phình to thành củ, màu vàng nâu, hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong

có nhiều khuyết rộng.

Lá hình lọng có 2 thùy sâu đối xứng nhau, dài 30-55 cm, rộng 20-30 cm, mép lá

hơi uốn lượn, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng; mặt dưới xanh nhạt, nhám. Gân tỏa tròn,

nổi rõ ở mặt dưới. Cuống lá màu xanh, hình trụ, dài 1-1,5m, rám, có nhiều gai.

Hoa đơn độc, to, màu hồng hay trắng. Cuống hoa màu xanh, dài 1,3-1,5 m, già

chuyển sang màu nâu, có nhiều gai nhọn. Cuống lá và cuống hoa có nhiều khoang

rỗng bên trong. Đế hoa rất lồi dạng hình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

già màu xanh, dài 5-7 cm, đường kính 6-8 cm, chứa nhiều quả sen. Bao hoa gồm 12-

16 phiến xếp xoắn ốc không phân biệt rõ lá đài và cánh hoa, bên ngoài 3-5 phiến màu

xanh hơi hồng, dài 3-6 cm; bên trong các phiến thuôn dài hình thuyền, dài 9-16 cm,

rộng 4-9 cm, màu trắng hồng, đậm hơn ở bìa và ngọn cánh hoa, nhiều gân dọc nổi rõ ở

mặt dưới; móng rất ngắn, màu trắng, hình chữ nhật hơi loe.

Bộ nhị: nhiều, rời, đều, đính xoắn ốc, chỉ nhị màu trắng, hình sợi, dài 7-9 mm,

nhẵn; chung đới màu trắng, hình sợi, dài 1,2-1,3 cm, đầu chung đới kéo dài thành hình

chùy (gạo sen), màu trắng, dài 4-5 mm; bao phấn 2 ô, màu vàng, thuôn dài, nứt dọc,

hướng ngoại, đính đáy, hạt phấn hình bầu dục hay hình trứng, màu vàng, dài 57-75

µm, có rãnh. Bộ nhụy nhiều lá noãn rời đính thành nhiều vòng vùi sâu trong đế hoa,

bầu màu vàng nhạt, hình bầu dục dài 6-11 mm, rộng 3-4 mm, 1 ô có 1 noãn đính nóc.

Vòi nhụy rất ngắn, đầu nhụy hình tròn, lõm ở giữa. Quả bế màu xanh, nhẵn, hình bầu

dục, dài 1,7-2,5 cm, đường kính 0,6-1,2 cm, Hạt màu trắng, dài 1,3-1,5 m, đường kính

5-6 mm, 2 lá mầm dày mập màu trắng bên trong có tâm sen màu xanh.

Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm không rõ;

thân mầm màu xanh, dài 3-4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng; 2 lá đầu tiên, 1 to, 1

nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài 1,8-2 cm, phiến lá

mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm.

Nelumbo lutea là loài sen thứ hai có màu trắng thấy phổ biến ở Bắc Mỹ.

Thế giới có 1 chi 2 loài, phân bố ở nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, châu Úc, Bắc

Mỹ. Ở Việt Nam có 1 loài.

1.1.3. Thành phần hóa học

Lá có nhiều alkaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc: nuciferin, anonain,

roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin, N-methyl-coclaurin, 4-

methyl-N-methylcoclaurin, nepherin, liriodenin, dehydroroemerin, armepavin,

dehydronuciferin, dehydroanonain, N- methylsococlaurin, Nuciferin là thành phần

chính, Ngoài alkaloid ra, lá sen còn có các flavonoid: quercetin, isoquercitrin,

leucocyanidin, leucodelphinidin.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

R= R1= R2=

CH3 CH3 H

Nuciferin N-Nornuciferin O-Nornuciferin Anonain Roemerin -CH2- -CH2- CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3

Hình 1.2: Cấu trúc Nuciferin

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất có trong lá sen

Tâm sen có các alkaloid sau đã được biết: liensinin, isoliensinin, methyl-corypalin,

neferin, lotusin, 1(p-hydroxybenzyl) 6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetra-hydroisoquinolin,

Gương sen có quercetin, 4,9% chất đạm, 0,6% chất béo, 9% carbohydrat và một

lượng nhỏ vitamin C 0,017%,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của một số chất có trong tâm sen

Hạt Sen chứa nhiều tinh bột (60%), đường raffinose, 1% chất đạm, 2% chất béo và

có một số chất khác như canxi 0,089%, phosphor 0,285%, sắt 0,0064%, với các chất

lotusine, demethyl coclaurine, liensinine, isoliensinine.

Tua nhị Sen có tannin.

Ngó Sen chứa 70% tinh bột, 8% asparagin, arginin, trigonellin, tyrosinglucose,

vitamin C, A, B, PP, tinh bột và một ít tannin.

1.1.4. Tính vị, tác dụng

Hạt Sen: Vị ngọt, tính bình; có tác dụng bổ tỳ dưỡng tâm, sáp trường, cổ tinh.

Tâm Sen: Vị rất đắng, có tác dụng an thần nhẹ.

Gương Sen: Có tác dụng tiêu ứ, cầm máu.

Tua nhị Sen: Vị chát, tính ấm; có tác dụng sáp tinh, ích thận, thanh tâm, chỉ huyết.

Lá Sen: Vị đắng, tính mát; có tác dụng hạ huyết áp, an thần, thanh thử,lợi thấp, tán

ứ, chỉ huyết.

Ngó Sen: Có tác dụng cầm máu, tráng dương, an thần.

1.1.5. Công dụng, chỉ định, phối hợp

Hạt Sen: Chữa các bệnh đường ruột như tỳ hư, tiết tả, lỵ; di mộng tinh, đới hạ, hồi

hộp mất ngủ, cơ thể suy nhược, kém ăn ít ngủ. Ngày dùng 12-20g có thể đến 100g,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

dạng thuốc sắc hay hoàn tán. Là thực phẩm cao cấp để dùng cho người già yếu, trẻ con

hoặc dùng chế biến các món ăn quý, chất lượng cao như làm mứt, nấu chè; là phụ liệu

cho các món ăn dân tộc như bánh phồng tôm.

Tâm Sen: Chữa sốt và khát nước, di mộng tinh, tim đập nhanh, huyết áp cao, hồi

hộp hoảng hốt mất ngủ, Dùng 1,5-3g.

Gương Sen: Chữa chảy máu tử cung, băng huyết, đau bụng dưới do máu ứ, tiêu ra

máu, nôn ra máu. Dùng 10-15g, Trong các bài thuốc chữa băng huyết, rong huyết,

thường có kèm gương sen bên cạnh các vị thuốc khác.

Tua nhị Sen: Chữa băng huyết, thổ huyết, di mộng tinh, trĩ bạch đới, đái dầm, tiểu

nhiều, Dùng 3-10g.

Lá Sen: trị say nóng, viêm ruột, nôn ra máu dạ dày, chảy máu cam và các chứng

chảy máu khác. Dùng 5-12g sấy trên than hoặc ngày dùng độ 1 lá, sắc nước uống. Còn

dùng chữa chứng béo phì; dùng 15g lá sen rửa sạch đun với nước sôi trong 50 phút

hoặc hãm với nước sôi trong 10 phút, mỗi sáng uống 1 ấm.

Ngó Sen: Dùng chữa bệnh sốt có khát nước và dùng cầm máu (tiêu ra máu, tiểu ra

máu, nôn ra máu, chảy máu cam, xuất huyết sau sinh) và trị bạch đới, tiêu chảy. Dùng

ngó sen 5-12g phơi khô sắc uống hàng ngày hoặc có thể giã lá sen tươi lấy nước uống.

Các bài thuốc dân gian từ lá sen

Giảm béo phì: Dùng lá sen sấy khô đun lấy nước uống thay trà lá vối hàng ngày

hoặc cho một giúm nhỏ vào tách (ly) rồi hãm với nước sôi, sau khoảng 2 - 5 phút thì

uống. Uống thường xuyên và liên tục sẽ giảm lượng mỡ dư thừa trong cơ thể đáng kể,

giúp bạn có thân hình khỏe và đẹp.

Chữa háo khát: Lá sen non (loại lá còn cuộn lại chưa mở càng tốt) rửa sạch, thái

nhỏ, ép lấy nước uống làm nhiều lần trong ngày. Hoặc thái nhỏ, trộn với các loại rau

ghém, ăn sống hằng ngày. Người bị tiêu chảy vừa chữa khỏi, cơ thể đang bị thiếu nước

dùng rất tốt.

Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao thơm 20-30g tán nhỏ, uống với

nước hoặc đồng tiện (nước tiểu trẻ em) hoặc sắc với 200ml nước còn 50ml, uống làm

một lần trong ngày.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40g, rau má 30g, hạt mã

đề 20g, sắc uống ngày một thang. Nếu xuất huyết nhiều, có thể tăng liều của lá và ngó

sen lên 50-60g.

Chữa chảy máu não và các biến chứng kèm theo ở bệnh nhân tăng huyết áp: Lá sen

15,5g, cam thảo 15,5g, đỗ trọng 12,5g, sinh địa, mạch môn, tang ký sinh, bạch thược

mỗi vị 10g, sắc uống ngày một thang.

Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40g để sống, rau má 12g

sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm hai lần trong ngày.

Chữa ho ra máu, nôn ra máu: Lá sen, ngó sen, sinh địa mỗi vị 30g; trắc bá, ngải

cứu mỗi vị 20g. Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc uống trong ngày.

Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô, sắc hoặc hãm

uống. Có thể dùng viên nén gồm cao mềm lá sen 0,03g, bột mịn lá sen 0,09g, tá dược

vừa đủ cho một viên, Ngày uống 3-6 viên trước khi đi ngủ 3 giờ. Hoặc sirô lá sen gồm

cao mềm lá sen 4g, cồn 45% 20ml, sirô đơn vừa đủ cho 1,000ml, Người lớn uống

15ml, trẻ em tùy tuổi 5ml.

1.2. Tổng quan về hợp chất Phenolics

Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật, Các nhà

khoa học đã phát hiện ra hơn 8,000 hợp chất phenol tự nhiên. Đặc biệt trong

cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp

một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH). Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 và

được đặc trưng bởi tính acid yếu.

1.2.1. Phân loại - Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3

nhóm là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol, Phân loại

này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm

phenyl, C1 là nhóm methyl, C2 là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon,

C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1

(acid (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3

hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4

(naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6 (stilbene, anthraquinone),

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

C6-C3-C6 (flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-

C3)2(lignan, neolignan), (C6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n

(catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ).

- Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol,

có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trung hợp của các đơn phân,

Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng

Hình 1.5: Một số hợp chất phenol

1.2.2. Tính chất hóa học Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những đặc

điểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vòng benzene nên chúng có một số

tính chất chung :

 Phản ứng của nhóm hydroxyl.

 Phản ứng phá vòng benzen

 Phản ứng tạo phức với kim loại

 Phản ứng este hóa

1.2.3. Vai trò của các hợp chất trong phenol trong thực vật Thực vật tổng hợp rất nhiều các chất thứ sinh so với động vật vì chúng không

thể lẫn trốn đươc kẻ thù mà phải dựa vào hệ thống phòng thủ hóa học này, Nhìn chung

vai trò bảo vệ của các hợp chất phenol dựa trên đặc tính kháng khuẩn, kháng dinh

dưỡng của chúng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các phenol còn có vai trò then chốt trong hình thành các sắc tố của hoa như đỏ,

xanh, tím…Đặc tính chống oxyl hóa (antioxidant) hay tạo phức với kim loại; tạo ra

các tín hiệu thông tin giữ phần ở trên cũng như dưới mặt đất, giữa các cây khác với

sinh vật khác; phenol còn là các tác nhân che chắn tia tử ngoại (UV) từ mặt trời. Khả

năng che chắn tia UV giúp cho thực vật có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn

toàn

Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ là bảo vệ

chống lại các yếu tố sinh học, vô sinh mà còn có tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ

phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường

Các flavonoid như flavonol và anthoxyane có vai trò quan trọng trong việc điều

chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp. Một số

hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng

thụ phấn cho hoa.

1.2.4. Flavonoid Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn

4,500 hợp chất, phần lớn dễ tan trong nước màu vàng nên được gọi là “flavonoid”

(flavus – tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng, một sắc tố xanh đỏ tím hoặc không màu

cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hóa học.

Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbon

chung là C6-C3-C6. Flavonoid gồm hai vòng benzen A, B và vòng pyran C, trong đó

A kết hợp với C tạo thành khung chroman.

1.1.1.1. Tính chất của Flavonoids

Tính chất vật lý

- Tính chất vật lý là cơ sở để lựa chọn những phương pháp phân lập, phân tích

và xác định các hợp chất flavonid. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt,

flavol vàng nhạt đến vàng, chalcone và auro vàng đậm đến đỏ cam. Các chất

thuộc nhóm isoflavonne, flavanol, isoflavanone, flavanone, leucoantoxyanidin,

catechin không màu. Các dẫn chất anthocyanidin có màu thay đổi tùy theo pH

môi trường.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Tính tan trong dung môi: khả năng hào tan cuar flavonoid không giống nhau,

tùy thuộc vào số nhóm OH và các nhóm thế khác của chúng. Flavonoid

glycoside không tan trong ether, tan được trong nước nóng, tốt nhất là cồn

nóng. Các dẫn xuất 7-hydroxyl thường dễ tan trong kiềm loãng.

- Một đặc điểm quan trọng của flavonoid là có khả năng hấp thụ tia tử ngoại.

Nguyên nhân này có thể do hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi hai vòng

benzen A, B và vòng pyran C. Flavonoid có hai dãy hấp thụ cực đại, giải 1 ở

bước sóng > 290nm, giải 2 ở bước sóng 220 – 280 nm

Tính chất hóa học

- Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học, vì vậy khả năng phản ứng hóa hoc của

chúng rất lớn phụ thuộc vào nhiều yếu tố : vị trí các nhóm OH, hệ thống nối

đôi liên tiếp và các nhóm thế. Dưới đây là các phản ứng hóa học cơ bản của

flavonoid

 Phản ứng của nhóm OH: gồm phản ứng oxyl hóa, phản ứng tạo thành

liên kết hydrogen, phản ứng este hóa,

 Phản ứng của vòng thơm : phản ứng diazo hóa

 Phản ứng của nhóm carboxyl: phản ứng shinoda, phản ứng tạo phức với

kim loại, Đây là phản ứng khử, có sự tham gia của kim loại như Fe, Zn, Mg và

HCl, Sản phẩm có màu da cam, hồng hoặc đỏ. Phản ứng này đặc trưng cho các

flvonoid có nhóm C=O ở vị trí C4 và nối đôi giữa C2 và C3. Điển hình là

flavonol, flavanone, flavanonol.

Tính chất sinh học

Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú, Các cơ

chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng

vai trò quyết định là tác dụng chống oxyl hóa. Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu

gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chống

bệnh tật.

- Flavonoid có khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi

gốc tự do hoạt động, Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc

vào đặc điểm cấu tọa hóa học của từng chất flavonoid cụ thể. Do bản chất cấu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể động

vật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa khử, bị oxyl hóa từng bước và tồn

tại ở dạng hydroxyl, semiquinone, Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự

do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO*. Chúng có thể nhận điện tử và

hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone, Các chất này có

khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý

và bệnh lý để triệt tiêu chúng.

- Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các

polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với protein. Tương tác này có

thể làm hoạt hóa hay ức chế hoạt động của enzyme. Tác dụng của flavonoid lên

các enzyme là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng

các chất flavonoid để chữa bệnh.

- Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năng

chống ung thư. Các flavonoid có tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hóa, kìm

hãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn

chế sự phá vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào.

- Nhiều flavonoid có hoạt tính của vitamin P có tác dụng làm tăng sức bền và

tính đàn hồi của thành mao mạch. Củng cố và làm giảm tính thấm thành mạch,

bảo vệ thành mạch trong các bệnh làm tăng tính thấm thành mạch như đái

đường, trĩ, giãn tĩnh mạch.

1.3. Tổng quan về hợp chất alkaloid Năm 1806 một dược sĩ là Friedrich Wilhelm Sertüner phân lập được một chất từ

nhựa thuốc phiện có tính kiềm và gây ngủ mạnh đã đặt tên là “Cinchonino”, sau đó

chiết được chất kết tinh từ vỏ cây Canhkina và đặt tên là “Cinchonino”, sau đó P,J,

Pelletier và J,B,Caventou lại chiết được hai chất có tính kềm từ một loài Strychnos đặt

tên là strychnin và brucin. Đến năm 1819 một dược sĩ là Wilhelm Meissner đề nghị

xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và ông đề nghị gọi

tên là alkaloid do đó người ta ghi nhận Meissener là người đầu tiên đưa ra khái niệm

về alkaloid và có định nghĩa: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có

phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ngoài tính kiềm, alkaloid còn có những đặc tính khác như có hoạt tính sinh học

mạnh, có tác dụng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid… Sau này

Pôlônôpski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có

nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động

vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc

thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid.

Tuy nhiên cũng có một số chất được xếp vào nhóm alkaloid nhưng nitơ không có dị

vòng mà ở mạch nhánh như: Ephedrin trong ma hoàng (Ephedra sinica Staf,),

capsaisin trong ớt (Capsicum annuum L,), hordenin trong mầm mạch nha (Hordenum

sativum Jess,), colchicin trong hạt cây tỏi độc (Colchicum autumnale L,); một số

alkaloid không có phản ứng với kiềm như colchicin lấy từ hạt tỏi độc, ricinin lấy từ hạt

thầu dầu (Ricinus communis L,), theobromin trong hạt cây cacao (Theobroma cacao

L,) và có alkaloid có phản ứng acid yếu như arecaidin và guvacin trong hạt cau (Areca

catechu L.)

Tính chất vật lý

Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong

công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví

dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin

(C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2)…

Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như:

Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2). Tuy nhiên cũng có vài chất

trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecolin (C8H13NO2), pilocarpidin

(C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecvirin (C19H16N2),

conexin (C24H40N2),

Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có

một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy,

Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân hủy ở

nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu,

- Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như

capsaixin, piperin…

- Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng

như berberin, palmatin, chelidonin,

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung

môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen,, trái lại các muối

alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân

cực,

Có một số trường hợp ngoại lệ, alkaloid base lại tan được trong nước như coniin,

nicotin, spactein, colchicin, cafein (tan 1/80 trong nước lạnh và 1/2 trong nước sôi).

Một số alkaloid có chức phenol như morphine, cephelin tan trong dung dịch kiềm.

Muối alkaloid như berberin nitrat lại rất ít tan trong nước.

Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid người ta sử dụng

dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.

- Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid có khả năng quay cực (vì trong cấu trúc có

cacbon không đối xứng), thường tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền như cinchonin,

quinidin, aconitin, pilocacpin…một số không có tác dụng với ánh sáng phân cực (vì

không có cacbon không đối xứng) như piperin, papaverin, naxein… một số alkaloid là

hỗn hợp đồng phân tả tuyền và hữu tuyền (raxemic) như atropin, atropamin,… năng

suất quay cực là hằng số giúp ta kiểm tra độ tinh khiết của alkaloid, Khi có hai dạng D

và L thì alkaloid dạng L có tác dụng sinh lý mạnh hơn dạng D.

Tính chất hóa học

- Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base

mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu

như cafein, piperin… vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng

kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu

như arecaidin, guvacin.

Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những

kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH… khi định lượng

alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ

thị màu cho thích hợp.

- Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng.

- Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức.

- Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của

alkaloid, Những phản ứng chung này được chia làm 2 loại:

 Phản ứng tạo tủa:

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid

Nhóm thuốc thử thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, Tủa này sinh ra hầu hết là do

sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp

của thuốc thử.

Có nhiều thuốc thử tạo tủa với alkaloid:

+ Thuốc thử Mayer (K2HgI4 – kalitetraiodomercurat): Cho tủa trắng hay màu vàng

nhạt.

+ Thuốc thử Bouchardat (iodo – iodid): Cho tủa nâu.

+ Thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng cam

đến đỏ.

+ Muối Reinecke [NH4[Cr(SCN)4(NH3)2],H2O – amoni tetra sulfocyanua diamin

cromat III]

+ Thuốc thử Scheibler [acid phosphovonframic – H3P (W3O10)4].

+ Thuốc thử Godeffroy [acid silicovonframic – H3Si [(W3O10)4].

+ Thuốc thử Sonnenschein [acid photphomolybdic – H3P (Mo3O10)4].

Phản ứng tạo tủa này rất nhạy, độ nhạy của mỗi loại thuốc thử đối với từng alkaloid

có khác nhau, Ví dụ: Thuốc thử Mayer còn xuất hiện tủa với morphin khi pha loãng

1/2,700 nhưng với quinin ở độ pha loãng 1/125,000, Cafein còn tạo tủa với thuốc thử

Dragendorff ở độ pha loãng 1/600, nhưng với thuốc thử Bouchardat ở độ pha loãng

1/10,000.

Trong phân tích alkaloid, một số thuốc thử tạo tủa trên còn được dùng với ý nghĩa

khác: Thuốc thử Dragendorff còn được dùng phun hiện màu trong sắc ký giấy và sắc

ký lớp mỏng. Muối Reinecke dùng trong định lượng alkaloid bằng phương pháp so

màu. Acid photphomolybdic và acid photphovonframmic được dùng trong định lượng

alkaloid bằng phương pháp cân và phương pháp so màu.

Nhóm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể:

+ Dung dịch vàng clorid

+ Dung dịch platin clorid

+ Dung dịch nước bão hòa acid picric

+ Acid picrolonic

+ Acid styphnic

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Người ta thường đo điểm chảy của các hợp chất này để góp phần xác định các

alkaloid.

 Phản ứng tạo màu:

Có một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho màu đặc biệt khác nhau do đó người

ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có

alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid gì trong đó.

Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa trong acid

H2SO4 đậm đặc. Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: Acid sulfuric đậm đặc

(d=1,84), acid nitric đậm đặc (d=1,4), thuốc thử Fröhde (acid sulfomolybdic), thuốc

thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic), thuốc thử

Erdmann (acid sulfonitric), thuốc thử Wasicky (p, dimetylaminobenzaldehyt hòa trong

H2SO4), thuốc thử Merke (acid sulfoselenic).

Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu

không thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết.Do đó

để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương

pháp sắc ký lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh.

1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa

1.4.1. Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa Gốc tự do là các nguyên tử không trọn vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là số

lẻ nên không bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn

để bền vững, Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một nguyên tử

không trọn vẹn khác và tiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên

tử không trọn vẹn và tiếp tục chu kỳ bất tận như thế. Phản ứng hóa học của nó rất

mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nó, cho ra những phân tử

khác bị hư hại hay bị oxy hóa, Một khi phân tử bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mất

đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó lại là tác nhân oxi hóa các phân

tử chung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử xung quanh. Và quá trình

này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình thường dẫn tới các loại bệnh

như: xơ vữa động mạch, ung thư…

Theo các tài liệu nghiên cứu đã công bố, các bệnh như: ung thư, tim mạch, lão

hóa…có liên quan rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong các tế bào sống.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các quá trình oxy hóa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiết

để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình sinh tổng hợp của cơ thể. Gốc tự do là

những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất

hay được đưa vào từ bên ngoài do virút, vi khuẩn…Các gốc tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như hydroxyl (OH), ion sắt (Fe2+O),Cu(OH)2 những gốc tự do có hoạt tính trung bình và yếu như peroxyl (ROO), hydrogen peroxde H2O2, singlet

oxy (O1), nitric oxide (NO), ankoxyl…

Thông thường các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng

được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất

như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzym superoxide dismutase, Ngoài ra cơ thể

còn có các tế bào như neutrophill, monocyte, B-cell…có khả năng chống lại các yếu tố

oxy hóa ngoại lai xâm nhập.

Tuy nhiên, trong các tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo

ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các

chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá,

môi trường ô nhiễm…Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ

để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hòa của tế bào,

làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ

bên ngoài oxy hoá các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến các quá

trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóa

enzym trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh…

1.4.2. Tính chống oxy hóa của các hợp chất trong lá sen

Trong cơ thể con người có sẵn một vài enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa

nhiều loại gốc tự do làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hóa nhiều

trong các tế bào hồng cầu và gan, Tuy nhiên với số lượng gốc tự do quá nhiều nên cơ

thể phải nhờ đến các chất chống oxy hóa từ bên ngoài như vitamin E, vitamin C…Tuy

nhiên người ta đặc biệt chú tâm tới khả năng chống oxy hóa của các hợp chất

polyphenol có trong các loại thực phẩm như: lá dâu tằm, trà xanh, lá chè…

Công thức hóa học của các geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranyl

flavonoids (1, 3, 6, 7) có mặt các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hóa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

mạnh, Quá trình kháng oxy hóa của chúng được thể hiện bằng cách tác động trực tiếp

lên các gốc tự do được sinh ra trong cơ thể, chúng sẽ tương tác với các gốc tự do đưa

chúng về trạng thái các chất bền qua đó làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua

các dạng phản ứng sau:

AH ROOH + A* (1) RO2

+ AH ROH + A RO* (2)

A* ROOA* (3) RO2

* , RO* vì Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2 chúng không có khả năng lấy các ion H+ từ các acid béo không no hay của các hợp

RO*+ A* ROA (4)

chất trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình

oxy hóa. Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3)(4) là những sản phẩm khá bền và kết

quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn.

1.5. Tổng quan về phương pháp khối phổ LC-MS

1.5.1. Phổ khối lượng Một trong những phổ có ứng dụng nhiều nhất hiện nay trong phân tích và xác

định các chất tự nhiên là phổ khối lượng (mass spectrometry, MS, thường được gọi là

phổ khối), Phổ khối cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ

phân tử.

Phổ khối không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỉ lệ giữa

khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z), Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion

thường là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lượng của ion, Với

các đại phân tử, điện tích của ion có thể lớn hơn 1, Khi đó, để xác định khối lượng

phân tử (M) cấn phải biết số điện tích của ion.

Dưới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion

phân tử (hay còn gọi là ion mẹ) M+, Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh

nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lượng của các electron rất nhỏ,

có thể bỏ qua, nên khối lượng của M+ chính là khối lượng của phân tử.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion

mẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra

những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng phân tử và các mảnh của phân tử, cùng

với các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất

chưa biết, So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp

định danh chất đó dễ dàng và chính xác.

Khối phổ kế có thể hoạt động độc lập như một thiết bị đo phổ các chất tinh

khiết hay ghép nối với các thiết bị sắc ký như sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện di

mao quản… như một detector và đồng thời cung cấp các thông tin cấu trúc.

1.5.2. Cấu tạo một khối phổ kế Cấu tạo của một khối phổ kế gồm có các bộ phận chính sau: (a) Đầu vào, (b)

buồng ion hóa, (c) bộ phận phân tích khối, (d) detector và (e) máy tính ghi nhậ xử lý,

lưu trữ kết quả và điều khiển hệ thống, Các bộ phận từ (b) - (d) được đặt trong một

buồng chân không sâu, Tùy theo từng kỹ thuật phối khổ mà cấu tạo và nguyên lý hoạt

động của từng bộ phận có thể khác nhau.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đầu vào

Hình 1.6: Sơ đồ của một khối phổ kế

Đầu vào là nơi mẫu được đưa vào máy phổ khối, Mẫu có thể được đưa vào trực

tiếp hay được ghép nối với đầu ra của một hệ thống sắc ký. Mẫu có thể được đưa vào

dưới dạng rắn, lỏng hay khí nhưng được ion hóa trong buồng ion hóa. Cổ điển nhất là

mẫu được hóa hơi, Với các kỹ thuật ion hóa mới, mẫu có thể được ion hóa trực tiếp từ

dạng lỏng hay dạng rắn. Ngày nay, việc ghép nối đã trở nên dễ dàng và khối phổ đang

dần trở thành một detector phổ thông cho các hệ thống sắc ký.

Buồng ion hóa

Buồng ion hóa là nơi mẫu thử được biến thành các ion để đi vào hệ thống phân

tích, Hiện nay, có nhiều kỹ thuật để biến các phân tử trung hòa thành ion. Tùy từng kỹ

thuật, mức độ bị ion hóa của các phân tử có thể khác nhau, từ ion hóa mạnh cho các

chất dễ bay hơi và bền tới ion hóa nhẹ nhàng cho các phân tử lớn, khó bay hơi.

Cách cổ điển nhất để ion hóa các chất là kỹ thuật bắn phá electron hay sau này còn

được gọi là ion hóa bằng electron (electron impact hay electron ionization, EI). Người

ta dùng một chùm electron để “bắn phá” phân tử mẫu ở trạng thái hơi, Điều kiện chuẩn

để thực hiện EI là 70eV, Phổ EI thu được ở điều kiện này có thể dùng để so sánh với

phổ chuẩn để xác định các chất.

EI là phương pháp ion hóa mạnh, nhiều chất trong điều kiện này bị phân mảnh đến

mức không còn nhậ thấy ion M+ nữa. Để có thể phát hiện được M+, nhiều kỹ thuật ion

hóa nhẹ nhàng hơn đã được áp dụng, Ion hóa hóa học (Chemical Ionization, CI) là một

trong những kỹ thuật sớm nhất được sử dụng. Nguyên tắc của phương pháp là trong

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

buồng ion hóa, người ta đưa vào một chất khí khác (được gọi là khí thử). Chất này sẽ

bị ion hóa và các ion này sẽ tác động lên mẫu để ion hóa mẫu tạo ra M+ hay các ion

cộng tương ứng. Các khí thử thường dùng trong CI là methan, isobutan hay ammonia.

+ + 2 e-

Quá trình ion hóa mẫu thử M với khí thử là ammonia xảy ra như sau:

NH3 + e- → NH4

NH4+ + M → NH3 + [M+H]+ Phân tử proton hóa

NH4+ + M → [M+NH4]+ Ion cộng amoni

Với CI, phổ MS thu được có số lượng các ion ít hơn và cường độ các ion cao hơn nên

dễ xác định được phân tử lượng của mẫu.

EI và CI chỉ thích hợp với kỹ thuật đưa mẫu rắn (phân tích trực tiếp các mẫu

tinh khiết) và khí (như GC-MS). Với dạng mẫu lỏng như trong HPLC–MS, CE-

MS…các kỹ thuật ion hóa nhẹ nhàng ở áp suất thường như ion hóa phun điện

(electrospray ionization, ESI), ion hóa hóa học ở áp suất thường (atmospheric pressure

chemical ionization, APCI), ion hóa phun nhiệt (Thermospray Ionization, TS hay TSP)

thường được sử dụng. Các chất dễ bị phân hủy nhiệt, khó hay không bay hơi cũng có

thể áp dụng tốt bởi các kỹ thuật ion hóa này.

Với ESI, dung dịch mẫu được phun thành những hạt nhỏ vào một buồng chân

không dưới một điện trường mạnh. Các giọt dung dịch bị tích điện và bay hoiw dung

môi sẽ vỡ giọt thành các hạt nhỏ hơn và cuối cùng thành các ion. Các ion (dương hay

âm) cần được phân tích sẽ được đẩy vào bộ phận phân tích khối, Các phân tử bị ‘vỡ’

nhẹ nhàng hơn tạo ra ít phân mảnh và có cường độ lớn hơn. Với các polymer (với M

tới vài chục ngàn đơn vị khối), điện tích của các ion (z) sẽ >1 (có thể tới 20 hay hơn)

do vậy vẫn có thể được phân tích trong thiết bị phổ với m/z 1000-2000.

APCI tạo ra các ion dương được proton hóa hay ion âm do loại bỏ khỏi phân tử,

Dung dịch mẫu được hóa hơi bởi nhiệt độ dưới dạng phun mù và đi vào trong vùng

plasma của các ion dung môi tạo bởi hồ quang ở áp suất khí quyển. Sự cho nhận

proton xảy ra giữa mẫu và dung môi tạo nên các ion của mẫu thử.

Trong TSP, dung dịch mẫu được bơm dưới áp suất tương đối cao qua 1 mao

quản được nung nóng bởi bằng nhiệt điện. Khi ra khỏi ống mao quản, dung môi được

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

hóa hơi hỗ trợ cho việc phun dung dịch thành các hạt mù rồi thành các ion đẩy vào bộ

phận phân tích khối, TSP có thể áp dụng cho những hệ thống có tốc độ dòng cao

(HPLC). Tuy nhiên, ngày nay kỹ thuật này phần lớn được thay thế bằng ESI.

Ngoài những phương pháp ion hóa trên được sử dụng nhiều trong phân tích các

hợp chất phân tử nhỏ còn có nhiều kỹ thuật ion hóa khác sử dụng cho các đại phân tử.

Ví dụ, kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử (Fast Atom Bombardment, FAB), các

kỹ thuật giải hấp trường (Field Desorption, FD), giải hấp laser (Laser Desorption, LD)

và một trong những kỹ thuật đang được sử dụng nhiều là kỹ thuật giải hấp laser hỗ trợ

bởi chất nền (matrix – assisted laser desorption ionization, MALDI). Với MALDI,

mẫu được trộn với dung dịch chất nền và được làm khô dung môi trên phiến kim loại

rồi đưa vào buồng ion hóa của máy phổ khối chứ không kêt nối trực tiếp được với hệ

thống sắc ký.

Bộ phận phân tích khối

Nhiệm vụ của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp các ion sinh ra bởi bộ

phận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo m/z để đưa các ion này tới detector để ghi

nhận phổ, Có nhiều cơ chế để tách riêng các ion như sử dụng từ trường, điện trường và

vận tốc của các ion…Các bộ phận phân tích khối đang được sử dụng trong phổ khối

gồm có các loại sau: cung từ (magnetic sector), tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap),

thời gian bay (time of flight) và cộng hưởng bằng gia tốc ion – biến đổi Fourier

(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR).

Kinh điển nhất trong các bộ phân tích khối là thiết bị sử dụng từ trường, Dưới một

từ trường mạnh, quỹ đạo các ion sẽ thay đổi và khác nhau phụ thuộc vào điện tích và

khối lượng ion. Thay đổi từ trường sẽ thay đổi quỹ đạo các ion, lần lượt đưa chúng đi

vào detector, Đây cũng là 1 trong 2 loại phân tích ion mạnh và có độ chính xác cao

nhất được dùng trong các máy khối phổ phân giải cao (HR-MS).

Bộ phân tích tứ cực gồm 4 thanh kim loại có tiết diện tròn hay hyperbol đặt song

song với nhau dài khoảng 100 - 200 mm. Một điện thế một chiều không đổi được điều

biến bởi điện thế tần số radio được áp lên tứ cực tạo nên một điện trường trong tứ cực.

Dưới tác động của điện trường, chỉ có những ion nhất định bay dọc theo tứ cực đi tới

detector. Các ion khác quỹ đạo bị lệch và va vào các thanh tứ cực hoặc bay ra ngoài.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Thay đổi dòng điện tần số radio trên tứ cực sẽ lần lượt cho phép các ion khác nhau bay

vào detector và được ghi nhận thành phổ.

Bẫy ion có cấu tạo gồm một điện cực vòng với mặt trong có dạng hyperbol và hai

điện cực chỏm nằm ở hai đầu trống của điện cực vòng cũng có dạng hyperbol. Bằng

cách thay đổi điện thế các điện cực, người ta có thể điều khiển được quỹ đạo của các

ion trong bẫy. Tuy nhiên, khác với tứ cực, các ion khi đi vào bẫy ion sẽ bị giữ tại đó

bởi điện trường nếu điện thế của điện cực vòng và 2 điện cực chỏm không khác nhau.

Thay đổi điện thế và tần số của điện cực vòng sẽ lần lượt quét các ion ra khỏi bẫy đi

tới detector để ghi nhận thành phổ. Thay đổi thế của hai điện cực chỏm sẽ giữ lại một

hay một vài ion nhất định trong bẫy (trong chế độ chọn lọc ion) hay gia tốc các ion

(trong chế độ MS nhiều lần).

Tứ cực và bẫy ion cho phép phân tích các chất có m/z tới 5000. Độ chính xác khối

của tứ cực và bẫy ion không cao (0,1 đơn vị khối) nhưng nhỏ gọn, đơn giản, dễ sử

dụng và rẻ tiền hơn nên được áp dụng nhiều trong các hệ LC-MS.

Một cách khác để tách các ion ra khỏi hỗn hợp là dựa vào vận tốc của các ion. Ở

cùng một mức năng lượng, vận tốc của ion phụ thuộc vào khối lượng của ion. Phân tử

càng nhẹ vận tốc càng lớn. Đo lường thời gian để ion từ điểm xuất phát bay tới

detector sẽ tính ra được khối lượng của ion. Do vậy, kỹ thuật này được gọi là xác định

thời gian bay của ion (TOF), TOF có độ phân giải tương đối cao (tới 20,000), với số

khối chính xác hơn (tới 0,0001). Khoảng phân tích khối của TOF là không giới hạn, rất

hữu dụng cho việc phân tích các đại phân tử.

Một kỹ thuật mới để phân tích khối là cộng hưởng bằng gia tốc ion - biến đổi

Fourier (FT-ICR). Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường

mạnh ở bên và một điện trường theo hướng trục. Giống như trong cộng hưởng từ hạt

nhân, tất cả các ion trong buồn được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng

(10KHz - 1MHz), Các ion sẽ hấp thu năng lượng phù hợp để cộng hưởng. Các ion

cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng nhất tạo ra một tần

số nhất định phụ thuộc vào m/z.Tất cả các tần số của các ion tạo ra sẽ được ghi nhận

dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian và sau đó được biến đổi

Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống, FT-ICR có độ phân giải và độ chính

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

xác khối rất cao (tới 1 ppm), khoảng phân tích khối rộng (hiện nay là m/z tới 10,000).

Độ nhạy của FT-ICR cũng rất cao, giới hạn phát hiện có thể đạt tới mức attomole. Khi

phối hợp với ESI, FT-ICR có thể phân tích các protein tới 15,000 đơn vị khối.

Ngoài các kỹ thuật phân tích khối đã nêu trên, còn có các loại khác đã hoặc đang

được phát triển như bẫy quỹ đạo (orbital trap) hay dựa trên tính linh động của ion (ion

mobility) và các kỹ thuật lai hay kết hợp giữa các loại trên.

Detector

Là nơi tiếp nhận các ion và biến thành các tín hiện điện để được ghi nhận thành các

tín hiệu phổ khối, Có nhiều loại detector khác nhau nhưng thường là loại ống nhân

điện, ống nhân quang… các tín hiện điện thu được từ detector sẽ được số hoá và lưu

trữ dưới dang các tập tin kỹ thuật số.

Trong phân tích khổ phối, việc xác định chính xác một ion (M+ hay các phân

mảnh) rất quan trọng cho việc xác định chất được phân tích. Một hợp chất xác định,

trong những điều kiện xác định sẽ cho các ion xác định trên phổ khối. Tuy nhiên, một

ion có số khối xác định trên phổ khối lại có thể xuất phát từ nhiều chất khác nhau.

Trong phân tích một hỗn hợp bằng sắc ký - khối phổ, nếu điều kiện sắc ký không đảm

bảo, các chất tách ra không hoàn toàn dẫn tới phổ khối thu được sẽ có các ion của các

phân tử khác làm ảnh hưởng tới việc nhận định kết quả. Trong các trường hợp này,

việc xác định MS thông thường (một lần) khong cho được kết quả chính xác. Để khắc

phục, người ta sử dụng các kỹ thuật khối phổ n lần với n thường là 2 hay đôi khi hơn.

Kỹ thuật này được gọi là MS/MS hay MSn.

Nguyên tắc của các kỹ thuật này là lực chọn một ion xác định (thường là M+ nhưng cũng có thể là các ion con) trong các ion của lần ion hoá thứ nhất và loại bỏ tất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các ion này sau đó được cho tiếp xúc

với 1 lượng nhỏ các khí (thường là argon). Với vận tốc cao, các ion này sẽ va đập vào

các phân tử khí và phân thành các mảnh nhỏ hơn. Các ion sinh ra trong lần phân mảnh

thứ 2 này sẽ được phân tích và ghi nhận phổ MS, Vì phổ khối ghi nhận được chỉ từ 1

loại ion duy nhất nên không còn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu nữa. Việc

nhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khih hàm lượng chất

phân tích thấp và năm trong hỗn hợp phức tạp.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Các thiết bị để thực hiện MS/MS có 2 loại chính là: loại phổ khối nối tiếp và bẫy

ion.

Loại cổ điển nhất của phổ khối nối tiếp gồm 3 tứ cực ghép nối tiếp với nhau. Tứ cực

thứ nhất làm nhiệm vụ chọn lọc ion. Các ion được chọn sẽ bay vào tứ cực thứ 2 và va

đập với khí argon để phân mảnh ion lần 2. Tất cả các ion tạo ra sẽ bay vào tứ cực thứ 3

và được quét lần lượt bởi điện trường để đi tới detector và ghi nhận thành phổ. Do cấu

tạo bởi 3 tứ cực nên loại này thường được gọi là triplequad (triple quadrupoles).

Với bẫy ion, cả 3 giai đoạn trên đều xảy tra trong bẫy theo trình tự thời gian. Vì

các ion được giữ lại trong bẫy nên việc phân mảnh có thể được thực hiện thêm nhiều

lần nữa, Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật này ở các lần sau giảm đi nhanh chóng do số

ion giảm, Trên thực tế, người ta thường chỉ sử dụng MS2.

Ngoài hai thiết kế cơ bản trên, còn có các loại lai khác như: Q-Trap (kết hợp

giữa tứ cực và bẫy ion), Q-Tof (kết hợp giữa tứ cực và TOF), IT-Tof (kết hợp giữa bẫy

ion và TOF)… Các loại thiết bị này kết nối với GC, HPLC…hiện có mặt trên thị

trường.

Một phương tiện rất hữu hiệu trong phân tích các chất, đặc biệt là trong phân

tích các chất có nguồn gốc tự nhiên. Phổ khối cho nhiều thông tin về các trúc để xác

định cấu trúc một chất mới hay định danh một chất đã biết. Phổ khối có độ nhạy cao,

khoảng tuyến tính động học rộng rất thích hợp cho phân tích định lượng, đặc biệt là

trong phân tích vết.Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, phổ khối có thể sử dụng như một

detector phổ thông, phát hiện hầu hết các chất nhưng với chế độ chọn lọc ion nó lại là

detector chọn lọc cho những chất xác định rất có ích trong việc định lượng các chất

trong một hỗn hợp phức tạp. Các thiết bị phổ khối ngày càng nhạy và tin cậy hơn; giới

hạn phân tích khối ngày càng mở rộng; việc sử dụng ngày càng dễ dang và giá thành

ngày càng hạ, Điều này làm cho thiết bị khổ phối dần trở thành các phương tiện phân

tích thường quy trong phân tích dược liệu.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu - Lá sen được thu hái tại khu vực quận 7, thành phố Hồ Chí Minh.

- Lá sen thu hái gồm 2 dạng: một loại lá còn non, lá còn cuộn lại, chiều dài

khoảng từ 10-15cm và một loại lá đã trưởng thành (lá xòe rộng đường kính từ

20-30cm).

Hình 2.1: Lá sen non Hình 2.2: Lá sen trưởng thành

2.2. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm

Dụng cụ thí nghiệm

- Máy sấy; Máy cô quay chân không; Máy lọc chân không.

- Máy lắc; Hệ thống chạy khối phổ MS; Máy quang phổ UV-Vis 2000

- Bể điều nhiệt; Bếp đun cách thủy.

Hóa chất

- Thuốc thử Folin-Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hòa 20%;

Acid Gallic.

- Rutin, dung dịch AlCl3 2%, đệm photphast (pH=6,6)

- Vitamin C ; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Methanol

- Dung dịch FeCl3 0,1%; dung dịch K3Fe(CN)6 1% ; CCl3COOH 10%

- Chloroform, NH4OH 25%, H3PO4 3%, NH4OH 10%.

- Ethanol 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, PE, Cloroform, Ethyl acetate.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3. Phương pháp thí nghiệm

Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

Lá sen trưởng thành và lá non

Vi phẫu lá còn tươi

Sấy khô

Xay nhỏ Định tính sơ bộ TPHH Thử độ tinh khiết & soi bột

Ngâm dầm trong cồn với các nồng độ khác nhau

Thu cao Xác định hàm lượng cao thu được

Polyphenol tổng số

Flavonoid tổng Định lượng một số hợp chất thức cấp

Alkaloid tổng số

Thử hoạt tính kháng oxy hóa

Xác định TPHH bằng phương pháp LC-MS

Hình 2.3: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.1. Phương pháp vi học kiểm nghiệm dược liệu

2.3.1.1. Phương pháp vi phẫu

Chọn mẫu

Dùng mẫu lá tươi để thực hiện vi phẫu. Mẫu lá sen không quá già cũng cũng không

quá non (DĐVN quyển III).

Cắt vi phẫu

Cắt mẫu bằng tay với dao lam. Dao lam mới, khi cắt đặt dao lam thẳng góc với

mẫu vật.Cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không sát đáy phiến lá sen. Bỏ bớt phần

thịt lá 2 bên, còn lại bề rộng 0,6 - 0,8cm. Độ dày lát cắt khoảng <1mm. Chọn các

lát cắt thật mỏng để nhuộm.

Nhuộm vi phẫu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

(t=15-20 phút)

Ngâm vi phẫu trong Javel

Rửa bằng nước cất

(3-4 lần)

Ngâm vi phẫu trong acid acetic 10% trong 2 phút

Rửa bằng nước cất

(3-4 lần)

Ngâm vi phẫu trong thuốc nhuộm 2 màu (t=15 phút)

Rửa mẫu bằng nước cất và ngâm ngay vào nước

Hình 2.4: Sơ đồ tiến trình nhuộm vi phẫu

2.3.1.2. Phương pháp soi bột

Chuẩn bị bột để soi

Lấy lá sen cắt nhỏ và sấy ở nhiệt độ khoảng 60oC, tán nhỏ, nghiền nát hoặc dùng máy xay. Rây qua rây số 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được tán hoặc xay và rây

tiếp (có thể sấy lại cho dễ xay tán, nếu cần) cho đến khi tất cả dược liệu trở thành bột

mịn

Bột lá sau khi xay mịn thường có màu xanh lục hoặc xanh nâu. Các cấu tử thường

thấy là: biểu bì mang khí khổng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch

gỗ v.v…

Làm tiêu bản bột

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Cho 1 giọt nước cất vào giữa lame kính, lấy một ít bột cho vào giữa chất lỏng

- Đậy lamette lại, Dùng ngón trỏ di nhẹ trên lá kính để các phần tử phân tán đều.

- Loại bỏ phần bột và nước cất thừa bằng giấy thấm rồi quan sát bằng kính hiển

- Nêu không nhìn thấy rõ vân tễ có thể bổ sung thêm 1 giọt dung dịch KOH 5%

để quan sát rõ hơn

2.3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu

2.3.2.1. Xác định độ ẩm

Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối

lượng do làm khô . Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường.

theo DĐVN III Phụ lục 5.16 (Trang PL-98).

Cách thực hiện

Sấy cốc cân ở nhiệt độ 125-1300C trong 1h. Cho cốc vào bình hút ẩm 30 phút.

Dùng cân phân tích có độ chính xác 0,001g cân khối lượng của cốc.

Cân chính xác 1g bột dược liệu cho vào cốc cân (đã biết trước khối lượng). Đặt vào

tủ sấy ở nhiệt độ 125-1300C trong 1 giờ và cân khối lượng.

Làm tương tự như vậy cho đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5

mg.

Tính toán kết quả

Độ ẩm được tính bằng phần trăm theo công thức:

% Trong đó: W: độ ẩm của dược liệu (%)

mbd: Khối lượng ban đầu (g)

msay: Khối lượng sấy (g)

2.3.2.2. Xác định tro toàn phần

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Xác định tro toàn phần theo DĐVN Phụ lục 7.5 và 7.6 (Trang PL-128 -129)

Cách thực hiện

Trong chén nung bằng sứ, đường kinh 35mm, sơ bộ đã đem nung đỏ, để nguội

và cân bì.

Cân chính xác 5g lá sen đã được cắt nhỏ cho vào chén nung.

Lúc đầu đốt nhẹ rồi tăng dần nhiệt độ để dược liệu cháy hết. Cần theo dõi và

điều chỉnh nhiệt độ để tránh than không bị thoát ra khỏi miệng chén.

Đốt xong cho chén vào lò nung ở nhiệt độ 5000C cho đến khi thu được khối lượng không đổi. Để tránh các dược liệu hóa gỗ tạo ra than khó đốt cháy, có thể ngừng

nung rồi làm ẩm bằng nước cất hoặc acid nitric đậm đặc rồi đem nung lại.

Sau khi tro không còn màu đen, để nguội trong bình hút ẩm và đem cân.

Tính toán kết quả

Tro theo công toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt thức sau

Trong đó: X: tỉ lệ tro toàn phần. tính ra phàn tram

a: Khối lượng chén có tro

b: Khối lượng chén không

c:Khối lượng dược liệu dung

W: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.3. Quá trình chiết và thu nhận cao chiết

Bột dược liệu khô

- Ngấm kiệt với cồn 60%, 70%, 80%, 90%, 96%

- Cô quay loại dung môi

Cao chiết cồn-nước

- Nước

- Dung môi CHCl3

Dịch chiết CHCl3

Dịch chiết cồn-nước sau lắc CHCl3

Dung môi EtOAC

Cô quay loại

dung môi

Dịch chiết cồn-nước sau lắc EtOAC

2.3.3.1. Sơ đồ quy trình

Et-F

Phân tích bằng sắc ký LC-MS

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình chiết và phân tích cao chiết lá sen

Xác định TPHH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.3.2. Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu : lá sen tươi được lựa chọn, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 600C và

xay cho đến khi tạo thành bột có kích thước từ d=1,5-2 mm.

Chiết

Mục đích: Chiết các hợp chất có trong lá sen nhờ dung môi ethanol với nhiều

nồng độ khác nhau, nhằm khảo sát nồng độ dung môi nào phù hợp vớitừng đối tượng

lá sen, Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24h, trên máy lắc 150 vòng /phút.

Cách thực hiện : Ngâm bột lá sen vào 200ml dung dịch ethanol tại các nồng độ

khác nhau, Để trên máy lắc 24h với tốc độ lắc 150 vòng/phút.

Lọc

Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch

chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình tinh chế. Thể tích dung dịch sau lọc

V=175ml

Cô quay

Nhằm thu hồi dung môi ethanol để tái sử dụng, Dịch sau cô quay được chuyển

sang dung môi khác để loại bỏ tạp chất khác không mong muốn cũng như thực hiện

quá trình tiếp theo.

Cô quay bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ 70 – 800C, sau đó tiến hành quá trình

xử lý chloroform.

Xử lý chloroform

Mục đích: Sau khi xử lý lá sen bằng dung môi chiết, thì trong dịch chiết, ngoài

polyphenol và các alkaloid cần thiết, còn có mặt cafein, pigment và polysacarit, Để

tách cafein và các tạp chất dịch trích sau khi loại dung môi chiết được xử lý với

chloroform để giải phóng polyphenol, alkaloid tự do.

Lắng

Mục đích : Do chloroform không hòa tan trong dịch trích chứa polyphenol,

Alkaloid mà chỉ hòa tan cafein và các tạp chất nên sau khi xử lý cần quá trình lắng để

cho tách lớp.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Cách thực hiện: Chloroform có khối lượng riêng cao nên sau khi tách lớp nằm

phía dưới, tiến hành loại chloroform bằng bình chiết hoặc cẩn thận hút lớp dung dịch

phía trên ra khỏi chloroform.

Cô quay loại dung môi

Nhằm loại bỏ triệt để chloroform ra khỏi dịch chiết và thu hồi chloroform, bằng

cách cô quay 70 – 800C, trong 30 phút. Dịch sau khi cô đặc được chuyển sang công

đoạn thu nhận sau,

Xử lý ethyl acetate

Mục đích: Dịch chiết sau khi xử lý bằng chloroform tuy đã loại bỏ một phần tạp

chất nhưng vẫn còn lại polysacarit và một số thành phần không hòa tan trong

chloroform. Do đó dịch chiết tiếp tục được xử lý bằng dung môi ethyl acetate nhằm

làm tăng độ tinh sạch của chế phẩm.

Dùng dung môi là ethyl acetate để lôi kéo các chất cần có trong dung dịch. Sau

khi để yên, hỗn hợp phân tách thành 2 lớp, lớp bên trên là dịch ethyl acetate, bên dưới

là nước. Tách lấy lớp trên là dung dịch ethyl acetate. Dung chiết Et-F được sử dụng để

phân tích sắc ký LC-MS, xác định các thanh phần hóa học của dịch chiết lá sen.

2.3.4. Phương pháp xác định lượng cao thu được

Với mỗi loại dược liệu, sau quá trình chiết xuất ta thu được cao chiết. Cân khối

lượng các cao thu được trên cân phân tích 4 số lẻ.

Tính toán % cao thu được cho phép ta biết được hiệu quả kinh tế của dược liệu.

Với mỗi loại dược liệu, % cao được tính theo công thức sau:

Trong đó: mcao : khối lượng cao thu được (g)

mdl : khối lượng dược liệu đem chiết (g)

wdl : độ ẩm của dược liệu đem chiết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.5. Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong lá sen.

Định tính Alkaloid

Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn vào chén sứ, bốc hơi tới cắn, Hòa tan cắn trong

2-4ml dung dịch HCl 5%. Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử Mayer.

So sánh với ống đối chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa:

có alkaloid

Định tính Flavonoid

Nếu hơ một tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết trên miệng lọ ammoniac thì có màu

vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid. Flavon và

flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương, Chalcon và auron có

thể cho màu đỏ da cam.

Định tính Tannin

Pha loãng 0,5ml dịch chiết với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCl3

5% lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen, xanh rêu hay nâu (tùy theo số lượng

nhóm OH): có polyphenol trong đó bao gồm cả tannin.

Định tính Saponin

Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn, Hòa tan

cắn trong 5m cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước cất và

lắc mạnh theo chiều dọc, Nếu có bọt bền: có saponin

Định tính các chất khử

Lấy 5ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn, Hòa cắn với 3ml

nước cất trên bếp cách thủy, để nguội, lọc qua giấy lọc.

Thêm 0,5ml dung dịch Fehling A và 0,5ml dung dịch Fehling B.

Đun cách thủy 5 phút.

Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử (chủ yếu là

đường khử).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử Folin-

Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở bước sóng λ=765 nm,

Hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid Gallic.

Đường chuẩn acid Gallic:

- Chuẩn bị các dung dịch acid Gallic có các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,2;

0,3; 0,4; 0,5 mg/ml,

- Cho 60 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 4,74ml nước cất, sau đó

cho 300 thuốc thử Folin-Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giấy

dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản

đến 8 phút cho vào 900 ứng được giữ ở 400C trong vòng 30 phút. So màu ở bước sóng λ=765 nm

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất

nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường

chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính toán

dựa theo đường chuẩn Acid Gallic trên.

2.3.7. Phương pháp định lượng flavonoid tổng số Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi

phản ứng với AlCl3 tại bước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng

(theo phương pháp của Woisky and Salatino)

Dựng đường chuẩn Rutin - Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 960 theo dãy nồng độ sau: 0;

0,0125; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1 (mg/ml)

- Hút 2ml từ mỗi nồng độ vào 6 ống nghiệm sạch

- Thêm 2ml dung dịch AlCl3 2%

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1h, So màu ở bước sóng λ=420 nm,

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất

nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường

chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính toán

dựa theo đường chuẩn Rutin.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.8. Phương pháp định lượng alkaloid tổng số

Alkaloid tổng số được định lượng bằng phương pháp cân (Tạp chí dược liệu số

2+3/2011).

Nguyên tắc: Trước tiên dung dung môi hữu cơ chiết alkaloid toàn phần trong

môi trường kiềm, Acid hóa dịch chiết kiềm, loại nhựa và các tạp chất khác, Sau đó

kiềm hóa dịch acid và chiết alkaloid ở dạng bazo, làm khô cắn, cân và tính kết quả

Cách tiến hành

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyên liệu

2,50-3,00g bột lá sen

Tẩm uớt dược liệu bằng 2ml ethanol 960 và

3ml ammoniac 25%

Chiết với chloroform trong máy Soxhlet 4h

Thu hồi chloroform đến cắn khô.

Hòa cắn với 15ml acid phosphoric 3% nóng

Rửa cắn và giấy lọc bằng 5ml acid rồi 5ml

nước cất

Kiềm hóa dịch acid đến pH 10-11 bằng ammoniac 10%

Lắc dung dịch đã kiềm hóa với chloroform

Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan, chuyển vào bình có khối lượng đã biết

Thu hồi chloroform

Sấy cắn alkaloid ở 1000C đến khối lượng không đổi

Hình 2.6: Sơ đồ xác định alkaloid toàn phần

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Tính toán kết quả

Hàm lượng % alkaloid toàn phần được tính theo công thức:

X =

Trong đó:

a: cắn alkaloid (g)

b: Lượng dược liệu (g)

c: Độ ẩm dược liệu (%)

2.3.9. Phương pháp xác định năng lực khử Năng lực khử của dịch chiết lá được xác định theo phương pháp của Wang và

cộng sự 2008.

Nguyên tắc: Dựa trên giá trị OD tại bước sóng λ=700 nm của dung dịch khi có

sự biến đổi màu sắc từ vàng sang màu xanh lục do sự khử Fe3+ thành Fe2+

Cách thực hiện: theo sơ đồ 2.7.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hút 2,5ml dịch chiết với các nồng độ khác

nhau từ 0,001-0,005 mg/ml

Thêm 2,5ml đệm photphate (pH=6,6).

Bổ sung 2,5ml dung dịch K3Fe(CN)6 1%.

Ủ ở 500C khoảng 20 phút

Thêm vào 2,5ml CCl3COOH 10%.

Ly tâm hỗn hợp 3000 vòng/10 phút.

Hút 2,5ml lớp trên và cho vào 3,5ml nước

cất.

Thêm 0,5 ml FeCl3 0,1%

Đo OD ở bước sóng λ=700 nm

Hình 2.7: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm đánh giá năng lực khử

2.3.10.Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro

và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn

định hơn, Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do

DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch

sẽ giảm đi.

Z + AH = ZH + A, (1)

Trong đó: Z: là gốc tự do DPPH, AH là chất chống ôxi hóa

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Đánh giá Khả năng kháng oxy hóa thông qua IC50 là một giá trị nồng độ

của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do

Dựng đường chuẩn Vitamin C - Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,25;

0,5 (mg/ml).

- Dùng micropipet hút 50 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn

2ml dung dịch DPPH.

- Ủ trong tối 15’ ở nhiệt độ phòng. So màu ở bước sóng λ=517 nm.

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất

nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường

chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị

IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức

chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định

- Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh thông số giá trị IC50

Tính toán kết quả

Phần trăm ức chế (%I) =

% Trong đó:

ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đẩu pha trong methanol

(ADPPH=0,705)

ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu)

Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn: y=ax+b theo công thức

2.3.11.Phương pháp phân tích phổ khối lượng MS

Nguyên tắc: khi dung dịch chạy qua hệ thống phân tích TOF-Time of Fly sẽ cho ra

các peak phân mảnh của các chất có trong dung dịch trên detector. Giải phổ khối

lượng các chất này bằng phần mềm ChemDraw và đối chiếu với ngân hàng dữ

liệu.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Cách tiến hành:

- Dịch chiết nguyên liệu được lọc nhiều lần qua màng vi lọc trước khi bơm

vào bộ phận tiêm mẫu, tiến hành cùng phương pháp với dịch chiết cồn.

- Tiến hành thí nghiệm bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ

bắn phá ion dương trên hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ HPLC Agilent

1200 Series coupled to MS detector, micrOTOF-QII Bruker. Thiết lập các

thông số cho hệ thống: điện thế tần số radio RF buồng va chạm 250,0 Vpp;

tốc độ phun khí gas N2 làm sạch 9,0 l/phút với nhiệt độ dòng khí 20oC; áp

lực bơm phun 1,2 bar; điện thế ion hóa 4500V, điện tích nền -500V, khối

phổ được quét ở chế độ quét liên tục với điểm bắt đầu 50 m/z đến điểm kết

thúc 3000 m/z. Không kích hoạt hệ thống tham số thông minh.

- Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Chemstation cung cấp bởi Agilent

Corporation, MA, USA. So sánh với dữ liệu trong phần mềm Bruker

compass data analysis 4.0 với mức sai số ý nghĩa để kết luận.

0,005

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát vi phẫu và soi bột lá sen Vi phẫu lá sen

Gân giữa Biểu bì trên tế bào hình chữ nhật khá đều, kéo dài thành núm lồi đầu

tù dài 7,5-15 µm có lỗ khí.

Biểu bì dưới giống biểu bì trên nhưng tế bào dài hơn, vách hóa mô cứng, lớp

cutin dày. Dưới biểu bì trên là mô mềm giậu.

Dưới mô mềm giậu và trên biểu bì dưới là mô dày góc gồm nhiều lớp tế bào đa

giác gần tròn.

Mô mềm khuyết tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn, kích thước lớn xếp tạo

nhiều khuyết to, ven khuyết có nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai.

Nhiều bó libe gỗ kích thước không đều, 2 bó to giữa 2 khuyết lớn, một số bó

nhỏ hơn nằm rải rác trong mô mềm. Mỗi bó dẫn gồm gỗ ở trên, libe ở dưới; mạch gỗ

to, hình bầu dục hoặc đa giác gần tròn; tế bào mô mềm libe hình đa giác, kích thước

nhỏ, sắp xếp lộn xộn; nhiều mạch rây hình đa giác.

Bao quanh bó libe gỗ là 1-2 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô

cứng thành vòng.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.1: Vi phẫu cấu trúc lá sen

A: Cấu trúc gân lá. B: Mô mềm khuyết với bó mạnh libe-gỗ; C: Biểu bì dưới

D: Biểu bê trên, E: Mô mềm giậu và các tinh thể calci oxalate; F: Mô dày

Soi bột

Hình 3.2: Bột lá sen

Bột lá sen: Bột màu xanh đến nâu, mịn, vị chát. Mảnh biểu bì trên tế bào hình

đa giác, có núm lồi. Mảnh biểu bì dưới tế bào vách uốn lượn. Sợi vách dày, khoang

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

rộng. Tinh thể calci oxalat cầu gai kích thước lớn, đường kính 25-30 µm. Mảnh mạch

vạch

Hình 3.3: Vi phẫu bột lá sen

A: Mảnh mạch vạch. B: Lông che chở đa bào. C: Mô cứng

D: Núm lồi. E: Tinh thể canxi oxalate. F: Mảnh biểu bì dưới

3.2. Thử độ tinh khiết dược liệu Độ ẩm

Nguyên liệu được sấy khô đến khối lượng không đổi. Độ ẩm được xác định

bằng công thức nêu trong mục 2.2 và biểu thị trong bảng 3.1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.1: Độ ẩm dược liệu

Lá sen non Đối tượng Lá sen trưởng thành

9,39 ± 0,18 11,66 ± 0.09 Độ ẩm (%)

Độ ẩm là lượng nước chứa trong 100g dược liệu. Dược liệu tươi thường chứa

một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60 - 80% nước, thân và cành chứa khoảng 40 -

50% nước. Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối

với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn. Để bảo quản tốt, dược liệu

cần có độ ẩm bằng hoặc dưới độ ẩm an toàn.

Theo DĐVN III độ ẩm cho phép của lá cây dược liệu khoảng từ 8%-12%. Độ

ẩm của lá sen thí nghiệm nằm trong giới hạn an toàn quy định. Cụ thể là 9,39% đối với

lá sen trưởng thành và 11,66% đối với lá sen non. Tuy nhiên việc độ ẩm cao ở lá sen

non sẽ gây ảnh hưởng đến việc bảo quản lá non nhiều hơn so với việc bảo quản lá sen

trưởng thành.

Tro toàn phần

Hàm lượng tro toàn phần được xác định theo phương pháp 2.2. Kết quả hàm lượng tro

toàn phần của lá sen là 5,45%.

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng cao thu được

Điều kiện thí nghiệm:

- Thời gian ngâm dung môi: 24h

- Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi=1:10

- Nhiệt độ sấy: sấy cùng một chế độ nhiệt

- Chiết kiệt

- Nồng độ ethanol: 60%, 70%, 80%, 90%, 96%

Kết quả thu được thể hiện qua phụ lục và được mô tả trong bảng 3.2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khô thu được

Nồng độ Lượng cao lá sen trưởng thành

Lượng cao lá sen non (%) (%)

Cồn 60%

Cồn 70%

Cồn 80%

Cồn 90%

(%) 7,12b ± 0,19 7,62a ± 0,08 6,67c ± 0,06 5,93d ± 0,06 5,20e ± 0,07 7,28b ± 0,07 7,80a ± 0,01 7,13c ± 0,1 5,27d ± 0,06 4,29e ± 0,02 Cồn 96%

Nhận xét: Khi thay đổi nồng độ ethanol từ 60% cho đến 70%, lượng chất khô tăng

dần. Do dung môi ethanol cho phép chiết nhiều hợp chất có độ phân cực khác nhau và

kể cả những chất không phân cực, do vậy nồng độ ethanol càng tăng thì khả năng

thẩm thấu và khuyếch tán hoạt chất càng cao. Chính vì vậy lượng cao thu được tăng

dần khi nồng độ ethanol tăng. Tuy nhiên, ở nồng độ ethanol từ 80% lên 90% và 96% ,

lượng cao thu được giảm dần, đồng thời màu dịch chiết chuyển từ màu xanh vàng sang

màu xanh lục.

Ở nồng độ ethanol 96% thì hiệu suất chiết giảm đáng kể. Nguyên nhân là do khi

nồng độ ethanol quá cao, ethanol sẽ háo nước làm các thành tế bào bị mất nước cục bộ

dẫn tới hiện tượng các tế bào bị khô và co lại ngăn cản quá trình chiết, đồng thời nhiều

phức hợp khác cũng được chiết ra khỏi tế bào như chlorophyll… làm cho dịch trích

chuyển sang màu xanh lục.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.4: Sự biến đổi màu sắc dịch chiết ở các nồng độ cồn khác nhau

Việc sử dụng dung môi chiết với các nồng độ khác nhau đã có ảnh hưởng đến

hiệu suất thu cao chiết. Đối với mẫu lá trưởng thành ta thấy, hiệu suất thu cao có phần

lớn hơn so với mẫu lá non, vì lá trưởng thành tổng hợp nhiều hợp chất hơn so với lá

non. Ethanol 70% cho hiệu suất thu cao hơn hẳn các nồng độ khác vì nó có thể lôi kéo

các chất từ phân cực trung bình đến rất phân cực.

Hiệu suất thu cao cao nhất đạt 7,62% đối với lá sen trường thành, đạt 7,80% đối

với lá sen non, kết quả này cao hơn so với hiệu suất thu cao chiết từ lá sen trong

nghiên cứu của Ju-Hui Choe và cộng sự, được đăng trên tạp chí Food Sci.Biotechnol

(2010) là 6,95%.

3.4. Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết lá sen

Định tính Flavonoid

Hình 3.5: Sự biến đổi màu sắc khi hơ dịch chiết qua NH4OH

- Khi hơ vết thấm của dịch chiết lá sen trên miệng lọ NH4OH 25%, vết thấm

chuyển từ màu xanh sang màu vàng nhạt => có sự hiện diện của Flavon và

Flavonol.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Định tính Alkaloid

Hình 3.6: Sự tạo tủa với thuốc thử Mayer

- Khi cho dịch chiết pha loãng với HCl 5% rồi phản ứng với thuốc thử

Mayer, Quan sát ta thấy dung dịch bị đục và xuất hiện kết tủa vô định hình

màu trắng, Đối chứng với ống thuốc thử không có dịch chiết, không có tủa

xuất hiện => có mặt alkaloid trong dịch chiết.

Định tính saponin

- Saponin có tính tạo bọt và bền trong khoảng thời gian nhất định, Việc dung

dịch tạo cột bọt bền chứng tỏ trong dung dịch có sự hiện diện của saponin,

- Sau khi lắc mạnh và để yên ống nghiệm trong vòng 15 phút, Tuy chiều cao

cột bọt giảm dần nhưng vẫn còn bọt sau 15 phút => lá sen có saponin

nhưng hàm lượng rất ít nên sự duy trì bọt không được lâu.

Hình 3.7: Cột bọt trước và sau khi để yên 15 phút

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Định tính các hợp chất khử

Hình 3.8: Kết tủa đỏ gạch hình thành

Sau khi đun ống nghiệm trong khoảng thời gian 8 phút, dung dịch trong ống

nghiệm đã chuyển từ màu xanh rêu sang màu vàng nâu có xuất hiện kết tủa Cu2O (màu

đỏ gạch) dưới đáy ống nghiệm.

Sự có mặt của các hợp chất khử mà chủ yếu là đường khử, trong môi trường

kiềm NaOH đã khử Cu (II) về Cu (I) oxid, có màu đỏ gạch đặc trưng => có mặt các

hợp chất khử trong dịch chiết.

Định tính tannin

Hình 3.9: Sự đổi màu của dịch chiết

Sau khi bổ sung vào ống nghiệm 2-3 giọt FeCl3, dung dịch đục dần và chuyển

từ màu xanh lục qua màu nâu, Có thể giải thích hiện tượng bằng sự tạo thành hợp chất

Fe(OH)3 (màu nâu đỏ) trong ống nghiệm, làm cho dung dịch bị đục và xuất hiện màu

đặc trưng => có mặt các phenolics trong dung dịch.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá sen được trình bày trong

bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá sen

Kết quả Lá non Nhóm hợp chất Thuốc thử và cách thực hiện Lá trưởng thành

Flavonoid Polyphenol Alkaloid ++ +++ +++ +++ ++ ++

+ + ++ +++ + + + ++ NH4OH đậm đặc FeCl3 Các thuốc thử chung của alkaloid Tạo bọt bền Na2CO3 Bốc hơi tới cắn Thuốc thử Fehling Saponin Acid hữu cơ Tinh dầu Các thành phần khử

Ghi chú: (-): Không có; (±): Nghi ngờ, (+): Có ít, (++): Có, (+++): Có nhiều

Kết quả cho thấy lá sen có nhiều các nhóm hoạt chất flavonoid, alkaloid ,

tannin; có ít acid hữu cơ; có carotenoid, tinh dầu… Đây là những chất có tiềm năng

chống oxy hóa mạnh.

3.5. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết

Xây dựng đường chuẩn Acid Gallic

- Acid Gallic là chất chuẩn được sử dụng để tính toán hàm lượng polyphenol

tồng số.

- Sau khi ủ ở nhiệt độ 400C, dung dịch có màu xanh lam và được đo độ hấp

thu ánh sáng tại bước sóng λ=765 nm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình: 3.10: Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic

Bảng: 3.4 Kết quả đường chuẩn Acid Gallic

1 2 3 4 5

Nồng độ AG (µg/l)

0,126 0,215 0,297 0,393 0,483 OD765nm

Hình 3.11: Đường chuẩn Acid Gallic

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Từ đường chuẩn trên, ta tính được hàm lượng polyphenol tổng số tại các nồng

độ cồn khác nhau, Hàm lượng polyphenol tổng số được tính cho tổng thể tích dịch

chiết thu được sau quá trình chiết.

Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số

độ độ Polyphenol tổng lá sen già (mg GE/g dược liệu) Polyphenol tổng lá sen non (mg GE/g dược liệu) Nồng mẫu TN (mg/ml) Nồng cồn TN (0)

0,5

273,08d ± 22,29 300,73c ± 11,12 304,42b ± 12,12 264,45e ± 23,56 335,47a ± 4,06 252,94c ± 3,99 322,04a ± 3,77 293,63b ± 11,14 132,86d ± 5,89 98,5e ± 2,94

60 70 80 90 96 Nhận xét

- Lá sen trưởng thành có hàm lượng polyphenol tổng số tăng dần theo nồng

độ cồn từ 60%, 70%, 80%; tại nồng độ cồn 90%, có sự giảm nhẹ tuy nhiên

ở nồng độ 96%C thì lượng polyphenol tổng số đạt cao nhất. Nhìn chung, cồn 960 cho hiệu suất chiết polyphenol tốt nhất, và hàm lượng polyphenol

tổng số tăng dần theo nồng độ dung môi.

- Lá sen non có hàm lượng phenolics tăng dần từ 60% đến 70% và cao nhất

ở nồng độ cồn 70%, giảm dần từ nồng độ cồn trở về sau. Có thể giải thích

vì lá sen non các polyphenol khá phân cực nên tại nồng độ cồn 60% và

70%, hàm lượng polyphenol tổng tăng dần. Tuy nhiên giảm dần về sau vì

độ phân cực của dung môi ngày càng giảm nên các polyphenol không được

hòa tan tiếp tục.

- Khi lá sen càng trưởng thành thì sẽ có sự polymer hóa hoặc biến đổi các

nhóm gắn trên vòng benzene, nhóm OH- bị thay đổi bởi các gốc –CH3 hay

nhóm acyl làm giảm dần tính phân cực của các polyphenol. Điều đó giải

thích tại sao tại lá sen già thì cồn 96% cho kết quả chiết polyphenol tốt nhất

còn ở lá sen non thì ethanol 70% có phần tốt hơn

- Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ

lớn trong thực vật nói chung. Đây là chất chống oxi hóa mạnh, Vì vậy, chỉ

tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của thực

vật.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số của lá sen đạt cao nhất khi thực

hiện chiết ở lá sen trưởng thành, đạt 335,47mg GE/g chất khô (db), Kết

quả này so với hàm lượng polyphenol lá sen được công bố trên Tạp chí

DD&TP/Journal of Food and Nutrition Sciences - Tập 8 - số 1 - Tháng 3

năm 2012/ Vol 8, No 1 - March 2012, trong cùng điều kiện thí nghiệm có

phần lớn hơn. Theo như nghiên cứu của tạp chí này thì hàm lượng

polyphenol tổng số lá sen chỉ đạt 288,4mg GE/g.

- Theo Marja et al. (1999), những loài thực vật có hàm lượng polyphenol

tổng số lớn hơn 20mg GE/db thì có hoạt tính chống oxy hóa mạnh.Như vậy

hàm lượng polyphenol tổng số của lá sen trưởng thành hay lá sen non đều

cao hơn giá trị 20mg GE/db trên nên lá sen cơ bản có hoạt tính chống oxy

hóa mạnh.

- Việc sử dụng dung môi thích hợp cũng ảnh hưởng đến hàm lượng

polyphenol tổng số thu được, Theo như kết quả thể hiện trên bảng 3.5, thì

hàm lượng polyphenol tổng số thu được cao nhất khi chiết lá sen trưởng

thành bằng ethanol 96%. Nên dịch chiết lá sen trong cồn 96% được sử

dụng cho việc thừ nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH, vì

hàm lượng polyphenol có mối liên quan chặt chẽ với hoạt tính chống oxy

hóa.

3.6. Định lượng Flavonoid tổng số

Xây dựng đường chuẩn Rutin

- Dung dịch Rutin chuẩn ban đầu được pha loãng thành các nông độ thích

hợp, cho phản ứng với AlCl3, phản ứng cho hỗn hợp màu vàng từ nhạt đến

đậm, so màu ở bước sóng λ= 420nm.

- Độ đậm nhạt của dịch màu tùy thuộc nồng độ Rutin.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.12: Dung dịch Rutin chuẩn

Bảng 3.6: Bảng kết quả đường chuẩn Rutin

0,0625 0,125 0,25 0,375 0,5

0,053 0,151 0,283 0,401 0,526 Nồng độ Rutin (mg/ml) OD420nm

Hình 3.13: Đường chuẩn Rutin

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Mẫu thí nghiệm được pha loãng thành nồng độ 0,25mg/ml và cho phản ứng với

dung dịch AlCl3, Từ phương trình đường chuẩn Rutin, ta tiến hành tính toán hàm

lượng Flavonoid tổng số (mg RE/g dược liệu khô),

Hình 3.14: Mẫu lá sen phản ứng AlCl3

Bảng: 3.7: Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số

Nồng độ cồn TN (%) Nồng độ mẫu TN (mg/ml)

0,25

60 70 80 90 96 Flavonoid tổng lá sen trưởng thành (mg RE/g dược liệu) 140,53c ± 0,41 145,10b ± 1,2 159,39a ± 2,25 128,81d ± 1,81 102,83e ± 4,02 Flavonoid tổng lá sen non (mg RE/g dược liệu) 149,77d ± 3,27 205,23a ± 3,72 189,13b ± 1,74 150,05c ± 1,62 111,52e ± 0,25

- Các flavonoid là nhóm hợp chất có khả năng kháng oxy hoá nổi bật nhất trong

số các hợp chất phenolic thực vật.

- Đối với 2 loại lá sen, cồn 70% cho hiệu quả chiết flavonoid tốt nhất. Lượng flavonoid tổng tăng dần từ nồng độ cồn 60% đến 70%, Có thể giải thích điều này dựa trên tính phân cực của thành phần flavonoid trong lá sen. Các flavonoid có độ phân cực mạnh nên khi ngâm trong dung môi có độ phân cực tăng dần thì khả năng hòa tan của các flavonoid vào trong dung môi sẽ tăng dần và đạt cực đại khi trích bằng cồn 70% (205,23 mg RE/g db). Càng về sau độ phân cực của dung môi càng kém nên flavonoid tổng giảm dần.

- So sánh với kết quả nghiên cứu Ju-Hui Choe , Aera Jang được đăng trên tạp chí

Food Sci.Biotechnol (2010) đạt 69,5 mg KE/g db, thì lượng flavonoid tổng số

có phần tương đương, do Rutin là chất chuẩn hoạt tính kém hơn Kaempferol

nên kết quả có sự sai khác với nhau.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Polyphenol và Flavonoid cùng tồn tại trong cùng một đối tượng nghiên cứu. và

tỉ số TFC/TPC quyết định hoạt tính kháng oxy hóa của đối tượng nghiên cứu.

Tỉ số này càng cao thì khả năng kháng oxy hóa càng mạnh

- Tùy theo mục đích chiết, sử dụng mà ta có thể lựa chọn đối tượng thí nghiệm

sao cho phù hợp. Cụ thể, nếu muốn chiết polyphenol có độ phân cực kém, ta

chọn lá sen to và chiết bằng ethanol 96%, Tuy nhiên, để thu nhận các flavonoid

có độ phân cực cao thì ta sử dụng lá sen non làm đối tượng nghiên cứu và chiết

tốt nhất trong ethanol 70%.

3.7. Định lượng alkaloid tổng số

Hàm lượng alkaloid toàn phần được xác định bằng phương pháp cân và tính

toán dựa trên công thức đã nêu trong mục 2.5. Kết quả được trình bày dưới bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng alkaloid toàn phần

Lá sen non Đối tượng Lá sen trưởng thành

4,96 ± 0,006 3,08 ± 0,03 Alkaloid toàn phần (%)

Kết quả trên cho ta thấy, lá sen trưởng thành có hàm lượng % alkaloid toàn

phần là 4,96% cao hơn so với hàm lượng % alkaloid toàn phần trong lá sen non là

3,08%.

So sánh với kết quả nghiên cứu được đăng trên Tạp chí dược liệu ISSN 0868 –

3859 tập 6, theo tạp chí này hàm lượng % alkaloid toàn phần của lá sen trưởng thành

thu hái ở huyện Đông Anh, Hà Nội là 2,15% và hàm lượng % alkaloid toàn phần trong

lá sen non đạt 2%., ta thấy có sự khác biệt rõ rệt. Điều này cho thấy, hàm lượng %

alkaloid toàn phần phụ thuộc vào địa điểm thu mẫu, thời vụ thu hái, tuổi lá, phương

pháp tách chiết và cách bảo quản nguyên liệu trong quá trình thí nghiệm.

Alkaloid là một trong những thành phần có tác dụng dược lý rất tốt ở lá sen.

Alkaloid tác động lên hệ thần kinh, có thể giúp kéo dài giấc ngủ, làm giảm nhịp tim và

hạ huyết áp, chống lão hóa. Một nghiên cứu trên mô hình in vivo cho thấy, Nuciferine

trong dịch chiết lá sen có khả năng ngăn ngừa việc thoái hoá và gây tổn thương gan

trong chế độ ăn nhiều lipid (Guo F & et.al, 2013). Việc tinh chế thành phần alkaloid

trong sen, tạo ra các loại thuốc làm giảm huyết áp (thuốc senin) …đã chứng tỏ được

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

dược tính sinh học của lá sen rất hữu ích cho việc hỗ trợ điều trị các căn bệnh thời đại:

tim mạch, béo phì, cao huyết áp…

3.8. Xác định năng lực khử

Năng lực khử là một trong những phép phân tích nhằm đánh giá khả năng

kháng oxy hóa in vitro.Kết quả xác định năng lực khử của dịch chiết lá sen được thể

hiện trong bảng 3.9

Bảng 3.9: Năng lực khử của dịch chiết ethanol tối ưu.

Độ hấp thu Nồng độ

(mg/ml) Acid Gallic Lá sen non Lá sen trưởng thành

0,001 0,183 ± 0,003 0,132 ± 0,00 0,047 ± 0,002

0,002 0,199 ± 0,003 0,14 ± 0,001 0,063 ± 0,003

0,003 0,213 ± 0,012 0,142 ± 0,001 0,068 ± 0,002

0,004 0,242 ± 0,004 0,158 ± 0,002 0,075 ± 0,003

0,005 0,294 ± 0,008 0,163 ± 0,002 0,089 ± 0,002

Hình 3.15: Đồ thị năng lực khử của dịch chiết

Trong khảo sát năng lực khử dịch chiết, sự có mặt của các chất chống oxy hóa đã khử Fe3+ về Fe2+, làm dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu xanh lục, và được đo độ hấp thụ tại λ=700 nm, Độ hấp thụ càng tăng cho thấy năng lực khử càng mạnh.

Hình 3.20: cho thấy đường cong cường độ hấp thụ ánh sáng của chất chuẩn và dịch

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

chiết, tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch. Độ hấp thu ánh sáng của dung dịch tăng dần

từ 1ppm-5ppm. Tại nồng độ 1ppm, giá trị hấp thu của AG, lá sen trưởng thành, lá sen

non lần lượt là 0,183 ± 0,003, 0,132 và 0,047 ± 0,002. Theo như kết quả nghiên cứu

của Ju-Hui Choe và cộng sự (2010) được đăng trên tạp chí Food Sci.Biotechnol, độ

hấp thu tại nồng độ 1ppm của dịch chiết lá sen trong ethanol (L/E) là 0,0199, còn giá

trị BHT chuẩn đạt được là 0,0261.

So sánh với kết quả thí nghiệm của Ju-Hui Choe, nhận thấy dịch chiết lá sen

trong thí nghiệm của đề tài có độ hấp thu cao hơn. Cụ thể, lá sen trưởng thành có độ

hấp thu gấp 6,6 lần và lá sen non gấp 2,36 lần. Năng lực khử càng cao, khả năng kháng

oxy hóa càng mạnh.

Hình 3.16: Sự đổi màu dung dịch do hiện tưởng khử Fe3+

3.9. Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH

- Dựng đường chuẩn Vitamin C với dung dịch DPPH có các nồng độ: 0,025;

0,05; 0,1; 0,25; 0,5, Từ đó ta xác định được % ức chế gốc tự do (%I) theo

công thức đã nêu, Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.10: Giá trị %I và kết quả IC50của vitamin C

độ IC50 Nồng vitamin C % ức chế (%I)

/ 4,553

6,1 2,4 1,2 0,61 56,83 ± 0.78 41,23 ± 0.46 34,89 ±0.57 28,84 ±0.86

Hình 3.17: Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C

Hình 3.18: Phản ứng màu của dung dịch DPPH + Vitamin C

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Mẫu thí nghiệm được pha loãng với các nồng độ : 0,025; 0,05; 0,1; 0,25;

0,5 (mg/ml) và cho phản ứng vs dung dịch DPPH.

Hình 3.19 Phản ứng của dịch mẫu + DPPH

Kết quả OD của mẫu lá sen trưởng thành được trích bằng cồn 96% và phần

trăm ức chế gốc tự do được biểu thị trong bảng 3.12

Bảng 3.11: Giá trị %I và IC50 của mẫu lá sen trưởng thành chiết bằng ethanol 96%

/ml) IC50 ( /ml) NĐ mẫu ( % ức chế (%I)

6,1 73,74 ± 1,92

2,4 45,72 ± 3,42 2,907 1,2 40,26 ± 0.9

0,61 30,4 ± 0.5

y = 4.7932x + 31.299 R² = 0.9856

%I 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.20: Biểu đồ %I của mẫu lá sen trường thành cồn 96%

Kết quả OD của mẫu lá sen non được trích bằng cồn 70% và phần trăm ức chế gốc tự do được biểu thị trong bảng 3.12

Bảng 3.12: Giá trị %I và IC50 của lá sen non chiết bằng ethanol 70%

/ml) IC50 ( /ml) NĐ mẫu ( % ức chế (%I)

6,1 27,42 ± 0.54 13,59

2,4 14,75 ± 0.43

1,2 12,1 ± 0.46

0,61 10,97 ± 0.85

y = 2.3657x + 9.6495 R² = 0.9911

Nồng độ mẫu

(

)

% I

Hình 3.21: Biểu đồ % I theo của mẫu lá sen non ethanol 70%

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.27: Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của 2 đối tượng lá sen và vitamin C

Nhận xét:

Hoạt tính loại gốc tự do DPPH được sử dụng rộng rãi để sàng lọc hoạt tính

chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và vi khuẩn.Hiệu quả loại gốc tự

do của dich chiết cồn 96% của lá sen trưởng thành và dịch chiết cồn 70% lá sen non

trong thử nghiệm loại gốc DPPH được trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.12.Kết quả cho

thấy hoạt tính loại gốc tự do ở nồng độ 0,5mg/ml của lá sen trưởng thành rất mạnh có

khả năng loại gốc tự do trên 88%. Do đó các dịch chiết lá này được xác định IC50 với

vitamin C là chuẩn đối chứng.

Để xác định chỉ số IC50, mỗi cao chiết được pha thành 6 nồng độ: 0,5 mg/ml; 0,25

mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml và 0,025 mg/ml tương ứng với các nồng độ cuối của

/ml; 6,1 /ml; 2,4 /ml; 1,2 /ml; 0,61 mẫu trong hỗn hợp phản ứng là 12,2

/ml, Sau đó hoạt tính ức chế DPPH ở mỗi nồng độ được xác định. Kết quả xác định

IC50 của các dịch chiết so với vitamin C được trình bày ở hình 3.10. Theo đó, giá trị

IC50 của dịch chiết cồn 96% lá sen trưởng thành là 2,907 µg/ml, dịch chiết cồn 70%

/ml có sự khác biệt đáng kể về hoạt tính chống oxy của lá sen non IC50 = 13,59

/ml). hóa của Vitamin C (IC50= 4,932

Từ kết quả trên cho thấy, dịch chiết lá sen có khả năng bắt giữ các gốc tự do tốt

đặc biệt là dịch chiết lá sen cồn 96% có khả năng kháng các gốc tự do DPPH cao hơn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

cả vitamin C trong cùng điều kiện thí nghiệm, thể hiện rõ nhất qua chỉ số IC50 của 2

loại dịch chiết.

3.10. Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết lá sen bằng HPLC-ESI/MS

Những thành phần alkaloid và flavonoid phong phú của dịch chiết cồn từ lá sen

trưởng thành đã được xác định bằng HPLC-ESI/MS, Thiết bị phân tích TOF-Time of

Fly cho phép độ đúng Mass ± 0,005 Da. Sắc ký đồ HPLC-MS của dịch chiết cồn lá sen

được trình bày trong Bảng 3.13 và Hình 3.28.

Bảng 3.13: Kết quả phân tích TPHH của dịch chiết cồn từ lá sen

MS lý Công Rt thức MS thực tế Mũi thuyết Đơn vị Định danh (phút) (m/z) phân tử (m/z) (Dalton)

325,0319 325,0357 Quercetine Da 1 4,1 C15H10O7

272,1281 272,1298 Demethylcorlaurin Da 3 5,7 C16H17NO3

291,0863 291,0869 Catechin Da 4 6,5 C15H14O6

314,1751 314,1738 Armepavine Da 7 9,2 C19H23NO3

282,1489 282,1489 O-Nornuciferine Da 10 18,5 C18H19NO2

296,1645 296,1656 Nuciferine Da 15 23,3 C19H21NO2

280,1332 280,1338 Roemerine Da 16 23,8 C18H17NO2

266,1175 266,1187 Anonaine Da 18 24,9 C17H15NO2

325,0319 325,0357 Pronuciferine Da 19 25,6 C19H21NO3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.28: Sắc ký đồ HPLC-ESI/MS của dịch chiết cồn 96% từ lá sen

Những hợp chất đã phát hiện nằm trong khoảng thời gian Rt từ 4,1 phút và 6,5

phút gồm quercetine, demethylcorlaurin và catechin. [28] [31]. Ngoài ra, những hợp

chất vừa được xác định này cũng đã được tìm thấy trong gương sen và hạt sen trong

các nghiên cứu trước đó [26].

Mũi thứ 7 ở thời điểm Rt 9,2 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được

m/z 314,1738 so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Armepavine.

[28].

Mũi thứ 10 ở thời điểm Rt 18,5 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được

m/z 282,1491, so sánh với ngân hàng dữ liệu khối phổ MS kết luận được thành phần

này chính là O-Nuceferine[29].

Mũi thứ 15 cho thấy chúng chiếm thành phần chính của mẫu dịch chiết, với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được m/z 296,1656, so sánh với dữ liệu kết luận được

thành phần này là Nuciferine [19] [29].

Mũi thứ 16 ở thời điểm Rt 23,8 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được

m/z 280,1338, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Roemerine

[22].

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Mũi thứ 18 ở thời điểm Rt 24,9 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được

m/z 266,1187, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là Anonaine

[22] [14].

Mũi thứ 19 ở thời điểm Rt 25,6 phút với chế độ ion dương [M-H]+ xác định được

m/z 312,1575, so sánh với dữ liệu kết luận được thành phần này chính là

Pronuciferine. [27]

Tuy đã xác định có những mũi ở những thời điểm khác nhưng không có dữ liệu

khối phổ MS tương tự để xác định, Do đó những chất ở thời điểm Rt khác các mũi ở

trên đều không được định danh.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Qua thời gian thực hiện đề tài, kết quả nghiên cứu thu được như sau:

- Vi phẫu cấu trúc của lá và bột dược liệu Sen (Nelubo nucifera) có đặc điểm:

 Lá: biểu bì trên tế bào hình chữ nhật, có núm lồi. Biểu bì dưới có vách hóa

cutin dày, vách tế bào hình uốn lượn. Mô mềm khuyết tế bào có nhiều tinh

thể calci oxalate. Bó libe xếp lộn xộn, kích thước nhỏ nằm rải rác trong mô

mềm

 Bột lá sen: Bột màu xanh, mịn, vị chát. Mảnh biểu bì trên tế bào hình đa

giác, có núm lồi . Mảnh biểu bì dưới tế bào vách uốn lượn. Sợi vách dày,

khoang rộng. Tinh thể calci oxalat cầu gai kích thước lớn, đường kính 25-30

µm. Mảnh mạch vạch

- Xác định được nồng độ dung môi thích hợp cho việc tách chiết các hợp chất có

dược tính từ lá sen (polyphenol, flavonoid, alkaloid) là ethanol 96% đối với lá

sen trưởng thành và ethanol 70% đối với lá sen non.

- Xác định được hàm lượng cao thu được cao nhất của lá sen trưởng thành là

7,62%, của lá sen non là 7,8%, khi trích ly bằng ethanol 70%

- Xác định được hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết ethanol 96% của

lá sen trưởng thành là 335,47 mg GE/db và hàm lượng polyphenol tổng số trong

dịch chiết ethanol 70% là 322,04 mg GE/db đối với lá sen non.

- Đã xác định được hàm lượng Flavonoid tổng số trong dịch chiết lá sen trưởng

thành và lá sen non.

- Đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết lá sen trên 2 mô hình

cho thấy khả năng chống oxy hóa của lá sen trưởng thành có hoạt tính khá

mạnh:

 Trên mô hình DPPH thì dịch chiết cồn lá sen trường thành có hoạt tính

cao hơn chất chuẩn vitamin C( giá trị IC50 trên lá sen trưởng thành là

2,907, lá sen non là 13,59, IC50 của vitamin C là 4,553).

 Trên mô hình đo năng lực khử, năng lực khử của lá sen trưởng thành

thấp hơn khoảng 1,38 lần so với chất chuẩn acid gallic.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Xác định các thành phần hóa học của dịch chiết lá trưởng thành, bằng phương

pháp sắc ký LC-MS/ESI. Qua sắc ký đồ cho thấy, Nuciferine là thành phần

chiếm số lượng nhiều nhất trong mẫu (mũi 15). Nuciferin có tác dụng làm giảm

nhịp tim [10]. Việc xác định hàm lượng cao Nuciferine trong lá sen, mở ra một

hướng ứng dụng mới trong việc điều chế các sản phẩm giúp phòng và điều trị

các chứng bệnh do nhịp tim tăng nhanh: ngất xỉu, ngưng tim, đột quỵ, suy tim.

Bên cạnh đó Nuciferine còn có tác dụng giảm lipid và hạn chế sự tổn thương

gan do cholesterol gây ra, nên có thể dùng lá sen để hỗ trợ điều trị béo phì, mỡ

máu…

4.2. Kiến nghị

Do giới hạn về mặt thời gian, điều kiện trang thiết bị cũng như điều kiện kinh tế nên

thí nghiệm vẫn chưa hoàn chỉnh. Đề hoàn thiện đề tài, người thực hiện đề tài có một số

kiến nghị như sau:

- Cần tìm ra phương pháp làm tăng hiệu suất trích ly: hỗ trợ vi sóng, kết hợp trích

ly gián đoạn và trích ly liên tục.

- Nghiên cứu thêm về khả năng kháng khuẩn và các tác dụng khác của các chất

có trong polyphenol, flavonoid lá sen

- Thiết lập được quy trình tạo 1 sản phẩm từ lá sen hoặc cao polyphenol hoặc 1

sản phẩm có bổ sung cao polyphenol

Ý nghĩa khoa học:

- Xác định thành phần hóa học , định lượng polypohenol tổng, hàm lượng

alkaloid, flavonoid tổng số, đánh giá khả năng kháng oxy hóa trên cùng một

loại nguyên liệu mà chưa có một nghiên cứu nào trước đây

- So sánh hoạt tính kháng oxy hóa và đo năng lực khử của lá sen non và lá sen

trưởng thành

Ý nghĩa thực tiễn

Ứng dụng trong viêc tạo sản phẩm trà túi lọc lá sen, viên nang chức năng để điều trị

các bệnh: tim mạch, béo phì, lão hóa…

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

NGUỒN TÀI LIỆU TRONG NƯỚC

1. Bộ Y Tế Việt Nam, Sổ tay tra cứu đông dược, NXB Y học

2. Bộ môn dược liệu (2011), “Bài giảng dược liệu”, tập I. Trường đại học Dược

Hà Nội.

3. Bộ môn dược liệu (1998), “Bài giảng dược liệu”, tập II. Trường đại học Dược

Hà Nội

4. Đỗ Tất Lợi (2001)- “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Khoa học

Kỹ thuật.

5. Lê Trung Hiếu và cộng sự (2014), “Bước đầu nghiên cứu đánh giá khả năng kháng oxy hóa của một số đối tượng làm nguồn dược liệu”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ, Trường ĐH Khoa học Huế, tập 1, số 1.

6. Lưu Hoàng Ngọc (2006). Nghiên cứu công nghệ chiết tách một số chế phẩm thiên nhiên có giá trị kinh tế cao bằng CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn, Viện hóa học Việt Nam.

7. Nguyễn Hữu Lạc Thủy và cộng sự (2011), “Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá Trinh nữ hoàng cung Crinum Latifolium L. (Amaryllidacae) bằng phương pháp quang phổ UV-Vis, Y học TP.Hồ Chí Minh.

8. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000-2001, “Các phương pháp định danh;trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ” Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, TP.HCM

9. Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh Kỳ, Phó Đức Thuần // Dược học. - Năm

2000, tháng , số 6, chuyên đề , tập 290, tr. 12-14.

10. Phạm Ngọc Thiện, Lê Ngọc Liễn – Chiết xuất, xác định hàm lượng polyphenol và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các mẫu bột chiết lá dâu tằm – Tạp chí nghiên cứu y học 38 (5), 2005.

11. Viện dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, tập I,

Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật..

12. Võ Văn Chi (1999) – Từ điển cây thuốc Việt Nam – Nhà xuất bản Y học.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGUỒN TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

13. Andersen O. M., Markham K. R. (2006), Flavonoids: Chemistry,

biochemistry and Applications, Taylor & Francis Group, pp. 433-471.

14. Chi-Ming Liu and et.al (2014), Antioxidant and Anticancer Aporphine Alkaloid from the Leaves of Nelumbo nucifera Garetn.cv.Rosa-plena, Molecules ISSN 1420-3049.

15. Da-Bin Lee, Do-Hyung Kim and Jae-Young Je (2015), Antioxidant and Cytoprotective Effect of Lotus (Nelumbo nucifera) Leaves Phenolic Fraction, Nutri.Food Sci. pp 22-28.

16. Dongmei Yang ME and et.al (2007), Antioxidant activities of various extracts of lotus (Nelumbo nuficera Gaertn) rhizome.Asia pac J Clin Nutr 2007, pp 158-163

17. Folin, O; and Denis – A colorimetric method for determination of phenols (and phenol derivatives) in urine – Journal of biological chemistry, 1915

18. Fuchuan Guo and et al (2013), Nuciferine Prevents Hepatic Steatosis and Injury Induced by a High-Fat Diet in Hamsters, PLoS One 2013 May 15;8(5):e63770

19. Ju-Hui Choe and etc., (2010), Antioxidant Activities of Lotus Leaves (Nelumbo nucifera) and Barley Leaves (Hoedeum vulgare) Extracts, Food Sci.Biotechanol .19(3): 831-836.

20. Harborne J.B. (1994), The flavonoids advances in research since 1986,

Chapman & Hall Ltd, London.

21. Hagerman, A.E – Method for determining tannin in plant extracts – Journal of

chemical ecology, 1987.

22. Hong-Yu-Lin and et.al (2009), Antioxidative Effect and Active Components from Leaves of Lotus (Nelumbo nucifera), J. Agric. Food Chem, pp.6623– 6629.

23. Li-Jun Zheng and et.al (2012), Antioxidant activity of lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) receptacles of eleven cultivars grown in China, Journal of Medicinal Plants Research Vol.6, pp 1902-1911.

24. Marja and et.al (1999). Antioxidant activity of plant extracts containing

phenolic compounds. J. Agric. Food Chem., 47: 3954-3961.

25. Ming-Zhi Zhu, Wei-Wu and et.al (2015) Analysis of Flavonoids in Lotus (Nelumbo nucifera) Leaves and Their Antioxidant Activity Using

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Macroporous Resin Chromatography Coupled with LC-MS/MS and Antioxidant Biochemical Assays, Molecules ISSN 1420-3049.

26. Pengelly A. (2004), The constituents of medicinal plants, Sunflower Herbals,

2nd Edition, pp.109.

27. Sha Chen and et al. (2012), Simultaneous qualitative assessment and quantitative analysis of flavonoids in various tissues of lotus (Nelumbo nucifera) using high performance liquid chromatography coupled with triple quad mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 724 , pp.127-135.

28. Wang Y and et.al (2005), Simultaneous determination of quercetin, kaempferol and isorhamnetin accumulated human breast cancer cells, by high-performance liquid chromatography, J Pharm Biomed Anal. Pp.328-33.

29. Wang YX and et.al

(2008), HPLC determination of 2-hydroxy-1- methoxyaporphine, pronuciferine, nuciferine and roemerine in Nelumbo nucifera and its alkaloid fraction, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,1713-6.

30. Xia Xu and et.al (2011), LC/MS Guided Isolation of Alkaloids from Lotus Leaves by pH-Zone-Refining Counter-Current Chromatography, Molecules 2011, 16, 2551-2560

roemerine in

31. Xubiao Luo, Shouzhuo Yao and et.al (2005), Simultaneous analysis of N- nornuciferine, O-nornuciferine, nuciferine, and leaves of Nelumbo nuciferaGaertn by high-performance liquid chromatography– photodiode array detection–electrospray mass spectrometry, Analytica Chimica Acta Volume 538, Issues 1–2 , Pages 129–133

32. Zu Y1, Li C, Fu Y, Zhao C (2006), Simultaneous determination of catechin, rutin, quercetin kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leaves by RP-HPLC with DAD, J Pharm Biomed Anal. 2006 Jun 7;41(3):714-9

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU INTERNET

33. http://www.lrc-

hueuni.edu.vn/dongy/show_target.plx?url=/thuocdongy/S/Sen.htm&key=&ch ar=S

34. http://moodle.yds.edu.vn/tcyh/index.php?Content=ChiTietBai&idBai=8515

35. http://www.duoclieu.org/2012/01/sen-nelumbo-nucifera.html

36. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/73160#section=NLM-Curated-

PubMed-Citations

37. http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/151

38. http://vienduoclieu.org.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/bang-tra-cuu-muc-luc-cac-

cong-trinh-nckh-ve-cay-sen-nelumbo-nucifera-gaertn-nelumbonaceae-co-tai- trung-tam-thong-tin-thu-vien-vien-duoc-lieu-513-50.html

39. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18841775

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Acquisition Date

6/10/2015 1:27:18 AM

D:\Data\dmm 2015\dich la sen 5-6_1-f,5_01_16661.d dmm.m dich la sen 5-6

Operator Instrument / Ser#

Mai micrOTOF-Q

10187

Analysis Info Analysis Name Method Sample Name Comment

Ion Polarity Set Capillary Set End Plate Offset Set Collision Cell RF

Positive 4500 V -500 V 200.0 Vpp

Acquisition Parameter Source Type Focus Scan Begin Scan End

ESI Not active 100 m/z 1000 m/z

Set Nebulizer Set Dry Heater Set Dry Gas Set Divert Valve

2.0 Bar 200 °C 9.0 l/min Source

Intens. 6x10

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

1314

1 2

0.0

Time [min]

dich la sen 5-6_1-f,5_01_16661.d: TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

1 of 10

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 1, 4.1 min

Intens.

+MS, 3.8-4.6min #(228-277), 100%=5802, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

8 7 5 0 . 3 0 2

6000

4000

2 4 1 1 . 3 8 3

2000

8 9 2 0 . 9 1 2

6 6 7 0 . 0 9 2

3 6 5 0 . 5 3 4

4 4 2 0 . 5 6 2

1 5 6 0 . 3 6 1

0 1 8 0 . 9 9 3

2 6 6 0 . 3 3 2

7 1 4 0 . 1 9 1

9 4 4 0 . 9 4 2

4 1 6 0 . 9 8 4

1 9 6 0 . 3 1 5

7 5 3 0 . 5 2 3

8 9 4 0 . 5 1 4

5 6 4 0 . 9 0 3

1 9 5 0 . 9 3 3

0 150

200

250

400

300

350

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 2, 4.9 min

+MS, 4.7-5.1min #(278-305), 100%=10278, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10 1.25

9 4 4 1 . 8 9 2

1.00

0.75

0.50

0.25

3 9 0 1 . 5 5 2

0 3 8 0 . 7 8 4

6 2 2 1 . 8 8 2

0.00

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 3, 5.7 min

Intens. 4x10

2 +MS, 5.1-6.2min #(306-373), 100%=23888, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd 9 3 1 . 4 1 3

8 9 2 1 . 2 7 0 2 7 0 1 . 5 5 2

0 150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

2 of 10

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 4, 6.5 min

Intens.

+MS, 6.3-6.7min #(374-398), 100%=1655, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

2000

9 6 8 0 . 1 9 2

1500

5 9 5 1 . 0 0 3

1000

0 8 6 0 . 3 1 3

0 1 6 0 . 5 6 1

500

1 7 4 0 . 3 9 3

6 4 0 1 . 7 6 2

1 2 9 0 . 5 5 4

9 9 7 0 . 9 4 2

9 4 0 0 . 5 4 3

0 0 3 0 . 5 7 3

1 5 5 0 . 1 1 4

8 5 1 0 . 3 6 3

250

0 150

200

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 5, 6.9 min

+MS, 6.7-7.0min #(399-419), 100%=17423, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10 2.0

3 0 6 1 . 0 0 3

1.5

1.0

0.5

0.0

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 6, 7.1 min

+MS, 7.0-8.2min #(420-492), 100%=10311, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10 1.25

7 4 4 1 . 6 8 2

1.00

0.75

0.50

5 8 5 1 . 2 1 3

3 9 1 1 . 9 6 2

0.25

6 3 5 1 . 8 2 3

3 6 7 0 . 8 8 1

0.00

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

3 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 7, 9.2 min

Intens. 4x10 2.0

8 +MS, 8.9-10.1min #(532-603), 100%=16763, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd 3 7 1 . 4 1 3

1.5

1.0

0.5

1 3 4 1 . 8 9 2

0.0

150

200

250

350

400

450

500

m/z

300

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 8, 10.5 min

+MS, 10.1-11.5min #(604-687), 100%=30859, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

7 9 5 1 . 0 0 3

6 3 3 1 . 3 8 2

0 150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 9, 16.7 min

+MS, 15.5-17.6min #(926-1052), 100%=50567, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10 6

1 9 4 1 . 2 8 2

3 8 0 1 . 1 5 2

2 3 8 0 . 9 1 2

0 150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

4 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 10, 18.5 min

+MS, 17.6-19.1min #(1053-1139), 100%=38857, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

9 8 4 1 . 2 8 2

2 8 0 1 . 1 5 2

6 3 3 1 . 8 6 2

1 3 8 0 . 9 1 2

200

250

300

350

400

450

500

m/z

0 150

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 11, 19.3 min

Intens.

+MS, 19.1-19.5min #(1140-1168), 100%=1292, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

1500

7 8 4 0 . 3 0 3

1000

5 7 5 1 . 2 1 3

0 8 9 0 . 5 6 4

500

0 7 5 0 . 6 3 3

8 8 4 0 . 7 2 3

0 9 6 0 . 4 0 5

2 2 1 0 . 8 5 3

9 9 1 1 . 1 8 2

200

250

300

350

400

450

500

m/z

0 150

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 12, 19.9 min

+MS, 19.6-20.7min #(1169-1239), 100%=13868, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

1 8 0 1 . 1 5 2

1.5

6 3 3 1 . 8 6 2

1.0

0.5

0 7 8 0 . 9 1 2

0.0

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

5 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 13, 22.1 min

+MS, 21.5-22.2min #(1287-1326), 100%=7211, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

0.8

1 9 4 0 . 3 0 3

0.6

3 8 7 0 . 9 7 4

2 0 6 0 . 1 0 5

0.4

8 0 8 0 . 7 8 4

0.2

4 0 3 0 . 7 7 2

6 8 9 0 . 5 6 4

8 3 3 0 . 0 1 4

7 3 9 9 . 0 4 5

8 7 2 0 . 9 1 5

5 1 2 0 . 8 6 2

0.0

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 14, 22.4 min

+MS, 22.2-22.9min #(1327-1367), 100%=10379, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10 1.25

1 9 4 0 . 3 0 3

1.00

1 1 8 0 . 7 8 4

0.75

0.50

1 9 9 0 . 5 6 4

0.25

3 9 3 0 . 0 7 2

4 3 3 0 . 1 6 2

2 2 1 0 . 7 2 5

8 0 5 0 . 9 4 5

8 7 4 5 . 3 0 4

4 0 5 0 . 3 0 5

0 0 2 0 . 9 1 5

0.00

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 15, 23.3 min

Intens. 5x10 5

6 +MS, 23.0-23.7min #(1374-1416), 100%=405013, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd 5 6 1 . 6 9 2

3 4 2 1 . 5 6 2

0 150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

6 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 16, 23.8 min

+MS, 23.7-24.0min #(1417-1433), 100%=24304, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10 3

8 3 3 1 . 0 8 2

7 2 9 0 . 9 4 2

200

250

300

350

400

450

500

m/z

0 150

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 17, 24.2 min

+MS, 24.0-24.7min #(1434-1475), 100%=88991, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 5x10

1.0

9 3 2 1 . 5 6 2

0.8

0.6

0 9 4 1 . 2 8 2

0.4

0.2

2 9 9 0 . 0 5 2

0.0

250

150

200

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 18, 24.9 min

+MS, 24.7-25.5min #(1476-1522), 100%=26904, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

8 2 9 0 . 9 4 2

7 8 1 1 . 6 6 2

6 5 9 0 . 1 0 5

1 5 6 0 . 7 1 3

9 2 8 0 . 9 1 2

500

200

250

300

350

400

450

m/z

0 150

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

7 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 19, 25.6 min

Intens. 4000

0+MS, 25.5-26.1min #(1523-1560), 100%=3083, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd 8 5 1 . 2 1 3

3000

2000

1000

7 2 2 1 . 5 6 2

3 1 2 1 . 2 5 2

250

0 150

200

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 20, 30.4 min

Intens.

+MS, 30.1-31.0min #(1802-1853), 100%=5322, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

6000

9 6 7 1 . 3 1 4

4000

3 9 4 1 . 9 6 3

2000

0 4 7 1 . 9 9 3

7 0 0 1 . 7 8 1

5 9 8 1 . 7 2 4

4 9 1 1 . 9 0 2

9 7 1 1 . 8 4 3

6 3 4 1 . 1 6 4

0 150

200

250

300

450

500

m/z

350

400

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 21, 32.7 min

+MS, 32.5-33.2min #(1944-1984), 100%=7585, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

4 1 2 2 . 5 5 4

0.8

0.6

0.4

0.2

1 4 9 0 . 9 7 2

3 5 8 1 . 1 6 3

3 6 3 2 . 3 3 4

2 5 9 1 . 7 1 5

0.0

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

8 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Cmpd 22, 33.5 min

+MS, 33.2-33.7min #(1984-2018), 100%=52548, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

5 0 8 1 . 7 9 3

4 0 3 1 . 5 1 2

1 4 8 1 . 1 6 3

3 7 9 1 . 5 7 3

8 9 4 1 . 9 5 4

0 150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Cmpd 23, 34.1 min

+MS, 33.8-34.9min #(2019-2084), 100%=9072, -Spectral Bkgrnd, -Peak Bkgrnd

Intens. 4x10

1.0

5 7 8 9 . 8 4 3

0.8

0.6

0.4

2 7 9 9 . 4 7 1

0 1 0 0 . 1 5 2

0.2

6 3 0 0 . 9 2 3

5 1 8 9 . 2 7 2

8 2 6 9 . 8 2 4

0.0

150

200

250

300

350

400

450

500

m/z

Component Molecular Molecule Absolute Relative Mass Abundance Abundance

Area

Int. Type

# RT [min] 4.1 1 4.9 2 5.7 3 6.5 4 6.9 5 7.1 6 9.2 7 10.5 8 16.7 9 18.5 10 19.3 11 19.9 12 22.1 13 22.4 14 23.3 15 23.8 16 24.2 17 24.9 18 25.6 19 30.4 20

Intens. 51287 1141986 Chromatogram 49785 909015 Chromatogram 87685 2981017 Chromatogram 36343 526126 Chromatogram 66910 951937 Chromatogram 60653 1538991 Chromatogram 41449 663734 Chromatogram 76143 1469075 Chromatogram 127629 5547056 Chromatogram 149657 5344799 Chromatogram 29246 456081 Chromatogram 52845 1016538 Chromatogram 117826 2108084 Chromatogram 2322155 Chromatogram 130409 19458954 Chromatogram 1069495 152956 2129288 Chromatogram 332450 5699191 Chromatogram 122580 2120226 Chromatogram 24439 37439

200502 Manual 632005 Chromatogram

S/N Chromatogram 26.1 25.0 45.7 17.0 33.7 30.2 20.1 39.2 67.1 79.1 12.4 25.4 59.1 65.5 585.0 78.0 177.2 61.1 1.4 12.7

TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd

Max. m/z 203.0578 298.1449 314.1392 291.0869 300.1603 286.1447 314.1738 300.1597 282.1491 282.1489 303.0487 251.1081 303.0491 303.0491 296.1656 280.1338 265.1239 249.0928 312.1580 413.1769

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

9 of 10

Compound Mass Spectrum Deconvolution Report

Area

Int. Type

S/N Chromatogram

291299 Manual

# RT [min] 32.7 21 33.5 22 34.1 23

2258325 Chromatogram 2303952 Chromatogram

Intens. 35983 151799 104203

2.1 71.7 42.6

TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd TIC +All MS, -Spectral Bkgrnd

Max. m/z 455.2214 397.1805 348.9875

Bruker Compass DataAnalysis 4.0

printed:

6/10/2015 11:08:20 AM

Page

10 of 10

PHỤ LỤC

1. LÁ SEN TRƯỞNG THÀNH

Kết quả xác định độ ẩm dược liệu (w)

Độ ẩm (%) Khối lượng M0 (g) Khối lượng M1 (g)

M1 35,5727 36,4906

M2 36,0953 37,0068 9,39 ± 0,18

M3 34,8381 35,7501

Kết quả xác định % cao thu được của lá sen trưởng thành

Trung bình Cồn 60% % cao thu được (%)

7,12 A1 A2 7,1% 7,02%

A3 7,38%

Trung bình

Cồn 70% % cao thu được (%)

7,62

B1 B2 B3 7,70% 7,55% 7,60%

Trung bình Cồn 80%

6,67

C1 C2 C3 % cao thu được (%) 6,65% 6,61% 6,73%

Trung bình Cồn 90%

5,93

D1 D2 D3 % cao thu được (%) 5,88% 5,93% 5,99%

Trung bình Cồn 96%

5,2

Hàm lượng polyphenol tổng số, nồng độ 0,5mg/ml

E1 E2 E3 % cao thu được (%) 5,15% 5,18% 5,28%

Trung bình Cồn 60% Giá trị OD

273,07  22,3

0,166 0,171 0,151 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 280,22 290,93 248,08

A1 A2 A3

Trung bình Cồn 70% Giá trị OD

300,73  11,11

0,171 0,163 0,172 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 305,98 287,96 308,24

B1 B2 B3

Trung bình Cồn 80% Giá trị OD

304,42  12,12

0,181 0,192 0,191 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 290,47 312,39 310,39

C1 C2 C3

Trung bình Cồn 90% Giá trị OD

264,44  23,6

0,18 0,199 0,208 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 238,62 269,93 284,77

D1 D2 D3

Cồn 96% Giá trị OD Trung bình

335,46  4,05 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 340,06 332,4 333,93 0,257 0,252 0,253

E1 E2 E3 Hàm lượng Flavonoid tổng số, nồng độ mẫu 0,25mg/ml

Trung bình Cồn 60% Giá trị OD

140,53 ± 0,41

A1 A2 A3 0,528 0,525 0,526 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 140,98 140,17 140,44

Trung bình Cồn 70% Giá trị OD

145,1 ± 1,2

B1 B2 B3 0,512 0,504 5,508 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 146,26 143,95 145,10

Trung bình Cồn 80% Giá trị OD

159,39 ± 2,25

C1 C2 C3 0,626 0,643 0,639 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 156,86 161,16 160,15

Trung bình Cồn 90% Giá trị OD

128,81 ± 1,81

D1 D2 D3 0,57 0,586 0,58 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 126,87 130,46 129,11

Trung bình Cồn 96% Giá trị OD Flavonoid tổng (mg RE/g db)

102,83 ± 4,02

E1 E2 E3 0,505 0,545 0,532 98,43 106,32 103,75

Hàm lượng alkaloid toàn phần.

Trung bình

M0 (g) M1 (g) % Alkaloid toàn phần (%)

4,96 113,3833 113,5180 F1

4,95 112,4586 112,5931 F2 4,96 4,96 120,4805 120,6156 F3

Kết quả giá trị đánh giá năng lực khử

Độ hấp thu Nồng độ (mg/ml) Acid Gallic Mẫu TN

0,180 0,202 0,218 0,246 0,301 0,132 0,139 0,142 0,159 0,161 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

Độ hấp thu Nồng độ (mg/ml) Acid Gallic Mẫu TN

0,185 0,197 0,199 0,241 0,294 0,132 0,141 0,143 0,155 0,164 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

Độ hấp thu Nồng độ (mg/ml) Acid Gallic Mẫu TN

0,184 0,198 0,222 0,239 0,285 0,132 0,140 0,142 0,159 0,165 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

Kết quả đo OD517nm phản ứng với DPPH

I1 I2 I3

75,89 49,65 41,28 29,93 72,20 44,11 39,57 30,92 73,12 43,40 30,92 30,35

Nồng độ ( 6,1 2,4 1,2 0,61 Phương trình

y=7,4892x + 28,227 R2=0,9853 2,907 IC50

2. LÁ SEN NON

Kết quả xác định độ ẩm dược liệu (w)

Độ ẩm (%) Khối lượng M0 (g) Khối lượng M1 (g)

11,66

N1 N2 N3 36,2781 36,8023 37,2009 37,2821 37,8053 38,2037

Kết quả xác định % cao thu được của lá sen non

Trung bình Cồn 60%

7,28

% cao thu được (%) 7,24 7,24 7,36 A1 A2 A3

Trung bình Cồn 70%

7,8

% cao thu được (%) 7,79 7,81 7,81 B1 B2 B3

Trung bình Cồn 80%

7,14

C1 C2 C3 % cao thu được (%) 7,12 7,20 7,10

Trung bình Cồn 90%

5,27

D1 D2 D3 % cao thu được (%) 5,21 5,27 5,32

Trung bình Cồn 96%

4,29

Hàm lượng polyphenol tổng số, nồng độ 0,5mg/ml

E1 E2 E3 % cao thu được (%) 4,26 4,30 4,30

252,94 ± 3,99

Trung bình Cồn 60% Giá trị OD

0,192 0,195 0,197 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 248,71 253,47 256,64

A1 A2 A3

Trung bình Cồn 70% Giá trị OD

322,04 ± 3,77

0,215 0,214 0,211 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 325,06 323,25 317,82

B1 B2 B3

Trung bình Cồn 80% Giá trị OD

293,63 ± 11,14

0,246 0,254 0,238 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 293,63 304,77 282,49

C1 C2 C3

Trung bình Cồn 90% Giá trị OD

132,85 ± 5,89

0,157 0,168 0,165 Polyphenol tổng (mg GE/g db) 126,29 137,69 134,58

D1 D2 D3

Trung bình Cồn 96% Giá trị OD

98,50 ± 2,94

Polyphenol tổng (mg GE/g db) 100,84 95,21 99,44 0,178 0,17 0,176

E1 E2 E3 Hàm lượng Flavonoid tổng số, nồng độ mẫu 0,25mg/ml

Trung bình Cồn 60% Giá trị OD

149,77 ± 3,27

0,562 0,541 0,542 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 153,54 147,74 148,02 A1 A2 A3

Trung bình Cồn 70% Giá trị OD

205,23 ± 3,72

0,688 0,698 0,713 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 201,78 204,74 209,17 B1 B2 B3

Trung bình Cồn 80% Giá trị OD

189,13 ± 1,74

0,708 0,71 0,698 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 189,85 190,39 187,15 C1 C2 C3

Trung bình Cồn 90% Giá trị OD

150,05 ± 1,62

D1 D2 D3 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 148,32 150,32 151,52 0,748 0,758 0,764

Trung bình Cồn 96% Giá trị OD

111,52 ± 0,25

Hàm lượng alkaloid toàn phần.

E1 E2 E3 Flavonoid tổng (mg RE/g db) 111,47 111,30 111,79 0,691 0,69 0,693

Trung bình % Alkaloid

3.09 ± 0,03

3,09 3,05 3,1 M1 M2 M3 M0 (g) 121,5323 121,5365 130,6728 M1 (g) 121,6143 121,6175 130,7558

Kết quả giá trị đánh giá năng lực khử

Độ hấp thu

Nồng độ (mg/ml) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 Mẫu TN 0,048 0,06 0,068 0,074 0,088 Acid Gallic 0,180 0,202 0,218 0,246 0,301

Độ hấp thu

Nồng độ (mg/ml) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 Mẫu TN 0,048 0,064 0,069 0,073 0,091 Acid Gallic 0,185 0,197 0,199 0,241 0,294

Độ hấp thu

Nồng độ (mg/ml) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 Acid Gallic 0,184 0,198 0,222 0,239 0,285 Mẫu TN 0,045 0,065 0,069 0,078 0,088

I2 I1 I3

Kết quả đo OD517nm phản ứng với DPPH Nồng độ ( 6,1 2,4 1,2 0,61 26,81 15,18 11,91 11,77 27,80 14,75 11,77 10,07

Phương trình

27,66 14,33 12,62 11,06 y= 3,06x + 8,4227 R2=0,9799 13,58 IC50

3. Xử lý số liệu bằng phần mềm Statgraphic

Xác định độ ẩm nguyên liệu

Summary Statistics for D0 AM Count 3 3 6

Average Median 9.39333 11.66 10.5267

YTTN M N Total

9.36 11.66 10.58

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.1823 0.09 1.24815

1.94074% 0.77187% 11.857%

9.23 11.57 9.23

9.59 11.75 11.75

ANOVA Table for D0 AM by YTTN Sum of Squares 7.70667 0.0826667 7.78933

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Df 1 4 5

Mean Square 7.70667 0.0206667

F-Ratio 372.90

P-Value 0.0000

Multiple Range Tests for D0 AM by YTTN Method: 95.0 percent LSD

YTTN

Count

Mean

Homogeneous Groups

9.39333

11.66

Contrast

Sig.

Difference

+/- Limits

M - N

-2.26667

0.325897

* denotes a statistically significant difference

Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến lượng chất khô thu được.

Summary Statistics for HAM LUONG CAO NONG DO CON A60 A70 A80 A90 A96 B60 B70 B80 B90 B96 Total

Average Median 7.16667 7.61667 6.66333 5.93333 5.20333 7.28 7.80333 7.13 5.26667 4.28667 6.435

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30

7.1 7.6 6.65 5.93 5.18 7.24 7.81 7.12 5.27 4.3 6.875

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.189033 0.0763763 0.061101 0.0550757 0.0680686 0.069282 0.011547 0.105357 0.0550757 0.023094 1.15298

2.63766% 1.00275% 0.916974% 0.928242% 1.30817% 0.951676% 0.147975% 1.47765% 1.04574% 0.538741% 17.9174%

7.02 7.55 6.61 5.88 5.15 7.24 7.79 7.03 5.21 4.26 4.26

7.38 7.7 6.73 5.99 5.28 7.36 7.81 7.24 5.32 4.3 7.81

P-Value 0.0000

F-Ratio 588.07

4.2674 0.00725667

Sum of Squares Df Mean Square 9 38.4066 20 0.145133 29 38.5517

Homogeneous Groups X X X X X X XX X X X

4.28667 5.20333 5.26667 5.93333 6.66333 7.13 7.16667 7.28 7.61667 7.80333

ANOVA Table for HAM LUONG CAO by NONG DO CON Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for HAM LUONG CAO by NONG DO CON Method: 95.0 percent LSD Count Mean NONG DO CON 3 B96 3 A96 3 B90 3 A90 3 A80 3 B80 3 A60 3 B60 3 A70 B70 3 * denotes a statistically significant difference.

Hàm lượng Polyphenol tổng số

Average Median 280.22 273.08 305.99 300.73 310.4 304.423 269.94 264.447 333.93 335.467 253.47 252.94 323.25 322.043 293.63 293.63 134.58 132.853 99.44 98.5033 286.365 257.812

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 22.2946 11.1162 12.1162 23.5554 4.05934 3.99148 3.76782 11.14 5.89288 2.93916 77.3076

8.16414% 3.69641% 3.98005% 8.90743% 1.21006% 1.57803% 1.16997% 3.79389% 4.43563% 2.98381% 29.9861%

248.09 287.96 290.48 238.63 332.4 248.71 317.82 282.49 126.29 95.21 95.21

290.93 308.24 312.39 284.77 340.07 256.64 325.06 304.77 137.69 100.86 340.07

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30

Summary Statistics for POLYPHENOL TS YTTN M60 M70 M80 M90 M96 N60 N70 N80 N90 N96 Total

ANOVA Table for POLYPHENOL TS by YTTN Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square 9 170245. 20 3072.7 29 173317.

18916.1 153.635

F-Ratio 123.12

P-Value 0.0000

Homogeneous Groups X

Multiple Range Tests for POLYPHENOL TS by YTTN Method: 95.0 percent LSD YTTN N96

Mean 98.5033

Count 3

X X X

3 3 3

N90 N60 M90

132.853 252.94 264.447

XX XX

3 3

M60 N80

273.08 293.63

X XX XX

3 3 3

M70 M80 N70

300.73 304.423 322.043

335.467

M96 * denotes a statistically significant difference

Định lượng Flavonoid tổng số

Average Median 127.56 127.643 131.45 131.45 145.02 144.337 116.49 116.22 93.18 92.3533 130.73 132.277 180.33 180.76 160.56 159.953 127.5 127.277 97.96 98.0033 129.46 131.027

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.372066 1.05 2.03304 1.63184 3.61167 2.88924 3.27623 1.46729 1.36873 0.218251 25.6289

0.291489% 0.798783% 1.40854% 1.4041% 3.9107% 2.18424% 1.81248% 0.917322% 1.0754% 0.222697% 19.56%

128.05 132.5 145.94 117.7 95.48 135.61 184.23 161.02 128.52 98.24 184.23

127.32 130.4 142.05 114.47 88.4 130.49 177.72 158.28 125.81 97.81 88.4

Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30

Summary Statistics for FLAVONOID TS YTTN M60 M70 M80 M90 M96 N60 N70 N80 N90 N96 Total

ANOVA Table for FLAVONOID TS by YTTN Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square 9 18959.9 20 88.4733 29 19048.4

2106.66 4.42366

F-Ratio 476.22

P-Value 0.0000

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

92.3533 98.0033 116.22 127.277 127.643 131.45 132.277 144.337 159.953 180.76

Multiple Range Tests for FLAVONOID TS by YTTN Method: 95.0 percent LSD YTTN M96 N96 M90 N90 M60 M70 N60 M80 N80 N70

Count 3 3 6

Average Median 4.95667 3.08 4.01833

4.96 3.09 4.025

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.0057735 0.0264575 1.02804

0.11648% 0.85901% 25.5836%

4.96 3.1 4.96

4.95 3.05 3.05

Định lượng alkaloid toàn phần

Summary Statistics for ALKALOID TP YTTN A B Total ANOVA Table for ALKALOID TP by YTTN Source Between groups

Sum of Squares 5.28282

Df Mean Square 5.28282 1

F-Ratio 14407.68

P-Value 0.0000

Within groups

0.00146667

0.000366667

Total (Corr.)

5.28428

Homogeneous Groups X X

Count Mean 3 3

3.08 4.95667

1.87667

Multiple Range Tests for ALKALOID TP by YTTN Method: 95.0 percent LSD YTTN B A Sig. Difference +/- Limits Contrast A - B 0.0434091 * * denotes a statistically significant difference.

Khảo sát năng lực khử của dịch chiết lá sen

Count 3 3 3

Average 0.183 0.198667 0.213

Median 0.184 0.198 0.218

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.00264575 0.00305505 0.0122882

1.44577% 1.53778% 5.76911%

0.18 0.196 0.199

0.185 0.202 0.222

NONG DO 0,001 0,002 0,003

3 3 15

0.242333 0.294 0.2262

0.242 0.296 0.218

0.00351188 0.00818535 0.0409358

1.4492% 2.78413% 18.0972%

0.239 0.285 0.18

0.246 0.301 0.301

0,004 0,005 Total

 Chất chuẩn Acid Gallic Summary Statistics for DO HAP THU

F-Ratio 116.39

P-Value 0.0000

Sum of Squares Df Mean Square 4 0.0229671 10 0.000493333 14 0.0234604

0.00574177 0.0000493333

ANOVA Table for DO HAP THU by NONG DO Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Homogeneous Groups X X X X X

Count Mean 0.183 3 0.198667 3 0.213 3 0.242333 3 0.294 3

Multiple Range Tests for DO HAP THU by NONG DO Method: 95.0 percent LSD NONG DO 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 * denotes a statistically significant difference.

 Lá sen trưởng thành

Summary Statistics for DO HAP THU 2

Count 3 3 3 3 3 15

Average 0.132 0.14 0.142333 0.157667 0.163333 0.147067

Median 0.132 0.14 0.142 0.159 0.164 0.142

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.0 0.001 0.00057735 0.0023094 0.00208167 0.0121035

0.0% 0.714286% 0.405633% 1.46474% 1.27449% 8.22996%

0.132 0.139 0.142 0.155 0.161 0.132

0.132 0.141 0.143 0.159 0.165 0.165

B.NONG DO 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 Total

Homogeneous Groups X

Multiple Range Tests for DO HAP THU 2 by B.NONG DO Method: 95.0 percent LSD B.NONG DO 0,001

Count 3

Mean 0.132

X X

0,002 0,003

3 3

0.14 0.142333

X X

3 3

0.157667 0.163333

0,004 0,005 * denotes a statistically significant difference

Sum of Squares Df Mean Square 0.000507233 4 0.00202893 0.0000022 10 0.000022 14 0.00205093

F-Ratio 230.56

P-Value 0.0000

ANOVA Table for DO HAP THU 2 by B.NONG DO CON Source Between groups Within groups Total (Corr.)

0.048 0.064 0.069 0.074 0.088 0.069

Average Median 0.047 0.063 0.068 0.075 0.089 0.0684

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.00173205 0.00264575 0.00173205 0.00264575 0.00173205 0.0144212

3.68521% 4.19961% 2.54713% 3.52767% 1.94612% 21.0836%

0.045 0.06 0.066 0.073 0.088 0.045

0.048 0.065 0.069 0.078 0.091 0.091

Sum of Squares Df Mean Square 4 0.0028656 10 0.000046 14 0.0029116

0.0007164 0.0000046

F-Ratio 155.74

P-Value 0.0000

 Lá sen non

Summary Statistics for DO HAP THU 3 Count C.NONG DO 3 0,001 3 0,002 3 0,003 3 0,004 3 0,005 Total 15 ANOVA Table for DO HAP THU 3 by C.NONG DO Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Table of Means for DO HAP THU 3 by C.NONG DO with 95.0 percent LSD intervals C.NONG DO 0,001

Stnd. error (pooled s) 0.00123828

Lower limit 0.045049

Upper limit 0.048951

Count 3

Mean 0.047

0,002

0.063

0.00123828

0.061049

0.064951

0,003

0.068

0.00123828

0.066049

0.069951

0,004 0,005

3 3

0.075 0.089

0.00123828 0.00123828

0.073049 0.087049

0.076951 0.090951

Total

0.0684

0.047 0.063 0.068 0.075 0.089

Multiple Range Tests for DO HAP THU 3 by C.NONG DO Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups C.NONG DO X 3 0,001 X 3 0,002 X 3 0,003 X 3 0,004 X 0,005 3 * denotes a statistically significant difference.

Đánh giá khả năng kháng oxy hóa trên mô hình DPPH

 Vitamin C

Summary Statistics for % UC CHE VITA C Average Median NONG DO 3 28.8433 0.61 34.8933 1.2 41.23 2.4 56.8333 6.1 40.45 Total

Count 3 3 3 3 12

28.94 34.89 41.42 56.88 38.085

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.859089 0.565007 0.455741 0.781046 10.9028

2.97847% 1.61924% 1.10536% 1.37428% 26.9539%

27.94 34.33 40.71 56.03 27.94

29.65 35.46 41.56 57.59 57.59

ANOVA Table for % UC CHE by NONG DO MAU Source Between groups Within groups Total (Corr.)

Sum of Squares Df Mean Square 3 1303.84 8 3.75 11 1307.59

434.613 0.46875

F-Ratio 927.17

P-Value 0.0000

Multiple Range Tests for % UC CHE by NONG DO MAU

Homogeneous Groups X X X X

Method: 95.0 percent LSD NONG DO 3 0.61 1.2 2.4 6.1

Count Mean 3 3 3 3

28.8433 34.8933 41.23 56.8333

* denotes a statistically significant difference

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.49689 0.903346 3.42194 1.92074 16.9011

1.63451% 2.24397% 7.48457% 2.60486% 35.5601%

29.93 39.57 43.4 72.2 29.93

30.92 41.28 49.65 75.89 75.89

0.2469 0.816033 11.7097 3.68923 285.649

Average Variance 30.4 40.2567 45.72 73.7367 47.5283

Homogeneous Groups X X X X

 Lá sen trưởng thành

Summary Statistics for % UC CHE Count NONG DO 3 0.61 3 1.2 3 2.4 3 6.1 Total 12 Multiple Range Tests for % UC CHE by NONG DO Method: 95.0 percent LSD NONG DO 0.61 1.2 2.4 6.1

Count Mean 3 3 3 3

30.4 40.2567 45.72 73.7367

* denotes a statistically significant difference

 Lá sen non

Summary Statistics for % UC CHE 2 NONG DO 2 0.61 1.2 2.4 6.1 Total

Average Median 10.9667 12.1 14.7533 27.4233 16.3108

Count 3 3 3 3 12

11.06 11.91 14.75 27.66 13.475

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum 0.853834 0.455741 0.42501 0.535755 6.8717

7.78572% 3.76646% 2.88077% 1.95365% 42.1297%

11.77 12.62 15.18 27.8 27.8

10.07 11.77 14.33 26.81 10.07

ANOVA Table for % UC CHE 2 by NONG DO 2 Df Source 3 Between groups

Sum of Squares 516.614

Mean Square 172.205

F-Ratio 490.47

P-Value 0.0000

Within groups

2.8088

0.3511

Total (Corr.)

519.423

Homogeneous Groups X

Multiple Range Tests for % UC CHE 2 by NONG DO 2 Method: 95.0 percent LSD NONG DO 2 0.61

Count Mean 3

10.9667

X X

1.2 2.4

3 3

12.1 14.7533

27.4233

6.1 * denotes a statistically significant difference