MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING        MINISTRY OF DEFENSE

MILITARY INSTITUTE OF TRADITIONAL MEDICINE

LUONG THI KY THUY

STUDY ON THE THERAPEUTIC EFFECTIVENESS

OF TG EXTRACT ON CHRONIC SKIN ULCERS

Speciality: Traditional medicine

Code: 62720201

DOCTOR THESIS ABSTRACT

HANOI – 2016

THIS STUDY WAS COMPLETED AT THE MILITARY  INSTITUTE OF TRADITIONAL MEDICINE

Science instructors:

Associate Professor, Medicine Doctor LE DINH ROANH

Associate Professor, Medicine Doctor PHAM VIET DU

Reviewer 1: Associate Professor, Medicine Doctor LE LUONG DONG

Reviewer2: Associate Professor, Medicine Doctor LE VAN DOAN

Reviewer3: Medicine Doctor PHAM THI VAN ANH

The   thesis   is   protected   by   The   National   Council   at   The

Military Institute of Traditional Medicine

At (time)          date             month     2016

YOU CAN READ THIS THESIS IN:

­ National Library

­ Library of Central Medicine Information

­ Military Institute of Traditional Medicine Library

4

INTRODUCTION

1. Reason for choosing this subject

A chronic skin ulcer (CSU) is an injury in the form of a sore on the  skin or a mucous membrane. A CSU is defined as a wound lesion that   lasts more than four weeks without remarkable healing tendency or as a  frequently recurring wound. CSU seriously affects the quality of life of  patients and causes immense costs to the healthcare system. Although  the prevention and treatment of CSU has improved greatly, CSU still  remains a great challenge for modern medicine.

According to traditional medicine theories, CSU has various symptoms  such as local sores, chronic pain and itching, it is also prone to relapse.  Traditional medicine has been used for the prevention and treatment of CSU  for many years and it has now expanded and is used worldwide.

TG   extract   or   chicken   egg   yolk   oil   which   is   mentioned   in  “Miraculous Effects of Southern Medicine” (Tue Tinh, 14th century) and  “Compendium of Medical Material” (Shizhen Li, 1518­1593), is used to  treat   ulcers   because   of   its   functions:   qing­re   (clearing   heat),   anti­ inflammatory, pain relief, moisturizing and proliferation. 2. Objectives of thesis

1) Determine the chemical composition and safety of TG extract. 2) Evaluate the effects of TG extract on CSUs in vitro rabbits. 3) Evaluate the clinical therapeutic efficacy of TG extract on CSUs

stage II and III. 3. Scientific and practical significances

­ Determine the basic components of TG extract. ­ The results show that TG extract delivers effective treatment of  CSUs: increases fibroblast migration, proliferation and activity, boosts  the extracellular matrix (ECM) biosynthesis, increases angiogenesis and  epithelial   proliferation,   and  decreases   MMP9,   reduced  destruction   of  the ECM, therefore CSUs heal faster. ­   Give   a   hypothesis   of   action   mechanism   of   TG   extract   in   the treatment of CSUs.

5

­ Provide a simple remedy which is easy to produce and can be

used across­the­board in the treatment of CSUs. 4. The structure of the thesis

Our   thesis   consists   of   129   pages:   Introduction   (3   pages);  Background   (33   pages);   Method   (25   pages);   Results   (37   pages);  Discussion (29 pages); Conclusion (1 page); Request (1 page). There  are   158   references   (Vietnamese:   21,   English:   119,   Chinese:   18);   29  tables, 1 chart, 68 figures, 14 appendixes in the thesis.

Chapter 1: BACKGROUND

1.1. Skin histology

The most  common structural components within the dermis is the  extracellular matrix (ECM). Understanding the structure and function of  the ECM is the key to successful treatment of CSUs. 1.2. Pathophysiology of acute wound healing

Acute wound repair process can be divided into 4 continuous and  overlapping phases: coagulation, inflammation, proliferation and ECM  remodeling. 1.3. Pathophysiology of chronic skin ulcers

CSUs do not heal in normal phases and time scales. Despite intensive  treatment, the wound is unable to close. The pathological disorders: (1)  Proliferation   reduction;   (2)   Imbalance   between   enzymes   for   protein  hydrolysis and inhibitors; (3) The appearance of old and weak cells. 1.3.5. Treatment for chronic skin ulcers

Systemic therapy (according to etiology) Topical treatment: debridement, anti­inflammatory, anti­infection,  maintaining moisture balance, biological agents, skin grafts and other  forms   of   treatment.   However,   CSUs   which   are   still   a   challenge   for  modern medicine, still don’t have a specific drug to treat them. 1.4. Traditional medicinal opinion on chronic skin ulcers Traditional   medicine   considers   that   CSU   belongs   to   the   “ulcer” branch of the Ulcer and Sores diseases.

6

In traditional medicine, the pathogenesis of CSU is theoretically  caused by “Re (heat)”. The pathogenic process of CSU was described  first in “Lingshu: yongju” as follows: “harmful cold accumulates in the  meridian and the results in a stiffness in blood flow and obstruction,  which   inhibits   the   circulation   of   defensive   energy,   leading   to  inflammation. Subsequently, harmful cold changes into harmful heat,  which causes tissue damage and then pus formation.”

The pathologic mechanisms underlying the refractory skin ulcers  are that “long term disease results in a deficiency and stasis in both qi  and blood, leading to a disorder of ying (nutrition) and wei (immunity)  and skin dystrophy.” The “Xu (deficiency)” and “Yu (stasis)” are two  major pathologic factors of the development of CSUs.

Y. J. Wang and H. F. Que (2009) divided CSU into three syndrome  types of blood stagnation with dampness­heat, qi deficiency with blood   stasis and spleen deficiency with dampness encumbrance.

Treatment   of   a   CSU   follow   the   principle   of   “Qing­Hua­Bu”  method to treat for the syndrome differentiation: 1) Qing­re (clearing  heat),   zhi­shi   (remove   dampness),   hua­yu   (resolve   stasis),   sheng­ji  (stimulate the growth of new skin) to treat dampness­heat syndrome;  2)Tonify qi, hua­yu,  sheng­ji to treat  qi  deficiency with blood stasis  syndrome;  3) Jian­pi (strengthen spleen), zhi­shi, sheng­jitotreatspleen  deficiency with dampness encumbrance syndrome; and the last target is  “qu­fu­sheng­ji,   ji­ping­sheng­zhang”   (removing   necrotic   tissues   to  stimulate the growth of new skin). 1.5. Experimental chronic skin ulcer models

Rudolph   R.   (1979)   introduced an   animal   model   of   Adriamycin  ulceration.   More   than   50   days   (rats)   and   45­65   days   (rabbits)   of  prolonged testing is suitable for experimental research. 1.6. TG extract

TG   extract   or   chicken   egg   yolk   oil   mentioned   in   “Miraculous  effects   of   Vietnamese   medicine   –   Ten   therapies”   (Tue   Tinh,   14 th  century), can be used for treating ulcers, sores and burns. Chicken egg  yolk oil is made by a traditional heating method and has a sweet, sour,

7

warm,   non­toxic   characteristic.   This   remedy   is   useful   for   treating  venereal diseases, ulcers and burns.

Rastegar F. et al (2011) studied the effect of egg yolk oil in the healing  of 3rd degree burn wounds in rats which showed that burn wounds healed  faster and had abundant re­epithelialization without scarring.

Chapter 2: SUBJECTS AND METHODS

2.1. Drugs and Chemistries

TG extract which was made in the Pharmacy Department of The  Military Institute of Traditional Medicine is a topical concentration of 6  grams of medicine per milliliter (Figure 2.1).  2.2. Subjects

Determine the chemical composition of TG extract: 6 samples were

taken at random from a batch of new products. Determine the safety of TG extract. Skin irritation: 03 New Zealand White rabbits. Acute   toxicity   of   subcutaneous   and   oral   administrations:   Swiss  white mice (National Institute of Hygiene and Epidemiology), at least  10 mice per batch.

Dermal acute toxicity: 36 New Zealand White rabbits.

Figure 2.1. TG extract packaged form

Dermal subchronic toxicity: 30 New Zealand White rabbits. Experimental therapeutic effects: 30 New Zealand White rabbits. Evaluate clinical therapeutic effects: 64 chronic skin ulcers stage II  and   III   of   59   inpatients   and   outpatients   at   Departments   of   Military

8

Central Hospital 108 (A1, A2, A6,  A7, A10,  A15, B1A, B1B,  B1C)  from 10/2012 to 04/2015.

Included criteria: stage II and III chronic skin ulcers. Excluded criteria: stage IV skin ulcers, syphilis sores, tuberculosis,  leprosy; patients with systemic immunosuppression, systemic disease,  mental illness, blood disease, life­threatening, patients not cooperating  or dropped out of the treatment.

9

2.3. Method 2.3.1. The chemical composition analysis and the safety of TG extract 2.3.1.1. Chemical composition analysis

Determine fatty acids in Gas Chromatography Mass Spectrometry  (GC/MS). Quantitate some metals in Atomic Absorption Spectroscopy  (ASS). Determine pH in Seven Easy device. 2.3.1.2. Determine the safety of TG extract

*   Evaluate   acute   toxicity:   oral,   subcutaneous   (WHO   guidelines)  and   topical   administration   (the   guidance   of   the   Organization   for  Economic Co­operation and Development (OECD).

* Evaluate chronic toxicity: topical administration on rabbit for 90

days (the guidance of the OECD number 411, 1981). 2.3.2. The therapeutic efficacy of TG extract on experimental chronic   skin ulcers

Method: Controlled experimental study on animals. Use   the   model   of   Rudolph   R   et   al:   Experimental   skin   ulcers

produced by Adriamycin on rabbits.

Experimental treatment model of TG extract Each rabbit was treated with 2 parallel therapies: Controlled ulcers:  Group 1 (10 rabbits): Change the dressing, wash and cover sores with  gauze   soaked   in   NaCl   0.9%   solution.   Group   2   (20   rabbits):   Silver  Sulfadiazine   grease   (SS).   The   study   ulcers   (30   rabbits):   topical   TG  extract. Change the dressing once every 2 days and photograph the ulcers.

Location: Laboratory ­ National Institute of Burns.

10

Figure 2.5. Measure the size of CSUs using the Image Pro Plus software

Evaluate the therapeutic efficacy in general anatomy  Measuring size: perform on ulcer photographs (with standard ruler  (cm):   Askina,   B.   Braun)   on   the   1st  day,   14th  day   and   22nd  day   of  treatment   using   polygon   mode   of   the   Image   Pro   Plus   4.5   software  (America) (Figure 2.6). Evaluate   the   effectiveness   of   TG   extract   by   rate   of   ulcer   size reduction: Percentage change in wound area of a CSU (%) = (initial size – inspection time size)/initial size x 100 Evaluate   the   effectiveness   of   experimental   treatment   on   scoring system by Sanada DESIGN H et al (2004) (Table 2.2.).

Histopathology Biopsy   the   ulcers   3   times:   1st  day,   14th  day,   22nd  day   of   the treatment. Histopathological test: H&E (hematoxylin eosin) staining, scanned by light microscope.

Immunohistochemistry:  Randomly   selected   biopsy   samples   of   5  animals,   immunohistochemical   staining   (ABC   method)   to   represent  CD34, Vimentin and MMP9.

Ultrastructure:  Template   biopsies   were   scanned   on   electron  microscope   (JSM   5410LV,   JEOL,   Japan),   and   transmission   electron  microscope (JEM 1400, JEOL, Japan). 2.3.3. Evaluate clinical therapeutic effectiveness of TG extract  Method: clinical trial, longitudinal and cross­sectional study. Systemic therapy: follow to protocol.

11

Site treatment: prepare ulcers bed: clean the surface, excision. All  lesions had their dressing changed, cleansed and ointment was applied  once per day.

Medication:  Apply   TG   extract   on   ulcer   surface   once   per   day.  Dosage: 0.5 to 1 ml of TG extract per 1000  mm2  of skin. Cover and  hold a thin piece of gauze in place.

Method of evaluating the clinical therapeutic effectiveness Measuring ulcer size:  Measure the size of ulcers on photographs  taken at the moments: the start, the middle and the end of treatment  using polygon mode of Image Pro Plus 4.5 software (US).

Evaluate the ulcer size changing: Percent of ulcer size reduction (%) = (initial size – inspection time

size)/initial size x 100

Table 2.2. Ulcers scoring based on the DESIGN criteria

DESIGN criteria

Values

Score

Depth Exudate

Size (mm2)

Infection

Granulation tissue

Necrotic tissue Pocketing

I, II, III, IV stage ­ No; ­ Less to medium; ­ Much 0; <400; 400 to<1600; 1600 to < 3600; 3600 to  < 6400; 6400 to< 10000; ≥ 10000  No; obvious symptoms or localized infection Unknown (closed wounds) ≥50% area of injury  < 50% area of injury No; Yes No; Yes

0; 3; 6 0; 3; 6; 8; 9;  12; 15 0; 3 0 3 6 0; 3 0; 6

Evaluate the clinical effectiveness of treatment based on DESIGN

scoring system of Sanada H et al (2004) (Table 2.2).

Use the following formula to determine the change of detail scores: Changing in detail scores according to DESIGN: Changing   in   detail   score   of   ulcers  =   (inspection   time   score)   ­

(initial score)

Proportion of effective treatment for ulcers

12

Efficiency ratio (%)  = (Number of effective ulcers) / (number of

effective ulcers + number of inefficient ulcers) x100

Effective: reducing ≥50% of total score compared to the initial score. Ineffective: reducing<50% of the total score compared to the initial score. Percentage of complete healing (%) = (number of < 1 cm2ulcers at

the end of the treatment) * 100 / total number of ulcers.

2.4. Statistical Analysis.

Use Epi Info 2008 and SPSS 13.0 software and statistical analysis

methods in medical research and evaluate the results.

13

Chapter 3: RESULT

3.1. The chemical composition and the safety of TG extract 3.1.1. The chemical composition of TG extract: shown in Table 3.1.

Table 3.1. Fatty acid composition of TG extract

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Composition Palmitic acid (C16:0)  Palmitoleate (C16:1) Stearic acid (C18:0) Oleic acid (C18:1) Linolenic acid (18:2) Arachidonic acid (C20:4) Docosahexaenoic acid (C22:6) Cholesterol n 6 6 6 6 6 6 6 6 Content (mg/ml) (± SD) 21,01±0,63 1,72±0,16 15,27±1,55 38,13±3,20 6,79±0,64 1,14±0,09 1,77±0,30 21,01±0,63

linolenic   acid   (omega­3,

Essential components of TG extract are the long­chain fatty acids:  oleic   acid   (omega­9),   omega­6),  docosahexaenoic acid (DHA), arachidonic acid (a type of omega­6) and  cholesterol.   Magnesium   (Mg)   (3,28±0,63),   zinc   (Zn)   (3,95±1,93)   are  presented in TG extract. pH of TG extract was 5.2 ± 0.2, acidic. 3.1.2. The safety of TG extract

Determine the acute toxicity of TG extract Identify   the   acute   toxicity   of   subcutainous   administration:   With  volume, the highest concentration of TG extract 60g medicine per kg in  rats, there were no signs of acute toxicity. LD50 of subcutainous TG  extract was unidentified.

Determine acute toxicity of oral administration: maximum dose of  450 mg per kg in rats did not show signs of acute toxicity, after a week   of   tracking.  LD50  of   oral  TG  extract  was   unidentified based  on the  Litchfield – Wilcoxon method.

14

Identify the acute toxicity of topical administration: The lethal dose  50% of the animals (LD50) of TG extract with the highest dose (14,4g  per kg) was not able to be determined.

15

The sub­chronic toxicity of TG extract After   6   weeks   and   12   weeks   of   topical   TG   extract,   no   special  expression was figured out in the control group and two study groups.  The hematopoietic function, liver and kidney functions tests in both 2  study   groups   have   no  significant   difference   compared   to   the   control  group   and   before   treatment   (p   >   0.05).   Liver,   kidney   and   skin  histopathology did not show any pathological lesions. TG extract had  no experimental sub­chronic toxicity. 3.2.   Therapeutic   efficacy   of   TG   extract   on   experimental   chronic  skin ulcers 3.2.1. Experimental chronic skin ulcers in rabbits

2 skin ulcers were produced successfully on each of 30 rabbits with  similar sizes and characteristics. Average time to produce ulcer was 21.3  ± 2.6 days, average size was 11.1 ± 3.5 cm2. 3.3.2. The therapeutic effectiveness of TG extract

Treatment duration: Table 3.13. Compare treatment duration between groups (day(s))

Group NaCl 0,9%(1) SS (2) TG extract (3) n 10 20 30 ± SD 29.9±2.4 26.7±2.0 22.3±2.9 p p1­2<0,01 p2­3<0,001 p1­3<0,001

Healing time of the treatment group was significantly shorter than the 2  control groups (p <0.001), (t­test). Changes in ulcer size:

Table 3.14. Changes in ulcer size after 14 and 22 days of treatment

Group

Time After 14  days of  treatment After 22  days of  treatment TG extract (1) NaCl (2) SS (3) TG extract (1) NaCl (2) SS (3) n 30 10 20 30 10 20 ± SD 2.99±1.31 5.48±2.11 4.95±1.57 0.52±0.55 3.44±1.31 2.15±0.67 p p1­2<0.05 p1­3<0.05 p2­3>0.05 p1­2<0.01 p1­3<0.01 p2­3<0.05

16

The   ulcer   size   of   TG   extract   group   decreased   faster   than   the   2 control groups did (p <0.01). The proportion of complete healing is calculated by the ratio of ulcer which completely closed or size <1cm2 on the 22nd day.

Table 3.15. Compare effectiveness of completely closed ulcer  on the 22nd day Group Effectiveness Ineffectiveness Total

p p1­2<0.001; p1­3<0.001; p2­3<0.05 TG extract (1) NaCl 0,9%(2) SS (3) Total 29 (96.7%) 1 (10%) 11 (55%) 41 1 (3.3%) 9 (90%) 9 (45%) 19 30 10 20 60

TG extract group had healing rates significantly higher than control groups (p <0.001) (Fisher test).

Evaluate ulcers according to DESIGN system Table 3.16. Compare DESIGN total score between the groups

DESIGN p Group

NaCl 0,9% (n=10) pn0­n22<0.05 14th day 16.8±2.9

SS (n=20) pn0­n22<0.05 16.5±3.2

TG extract (n=30) pn0­n14,n22<0.01 total score 0 day 21.01 21.3±0.72 21.2±0.63 6.3±0.9 22nd day 11.1±3.51 12.5±3.12 0.9±1.63

p p1­2­3>0.05 p1­2,3<0.01 p1­2,3<0.01

After 14 and 22 days of treatment, total score of TG extract group  decreased significantly faster compared to two control groups (p <0.01)  (t­test). The therapeutic efficacy according to the rate >50% of reduction

on the DESIGN total score Table 3.17. Compare therapeutic efficacy between the groups according   to DESIGN p Group Effectiveness Total

p1­3<0.05 TG extract (1) 29 (96.7%) Ineffectivenes s 1 (3.3%) 30

17

p1­2<0.001 NaCl 0,9%(2) 4 (40%) 6 (60%) 10

p2­3>0.05 SS (3) 15 (75%) 5 (25%) 20

Total 45 15 60

The effective treatment proportion of TG extract group was significantly

higher compared to control groups (p <0.05, p <0.001) (Fisher test).

Histopathology The   similar   ulcers   were   made   in   rabbits:   frozen   necrotic   tissue,

inflammatory cell infiltration (Figure 3.6).

a

b Figure 3.6 and 3.10. Histopathology of skin ulcers which were treated   with TG extract. a ­ 3.6. Initial treatment, frozen necrotic tissue (**), inflammatory cells  ((cid:0) ). b – 3.10. TG extract group on the 14th day of treatment: Fibroblasts proliferation ((cid:0) ), angiogenesis ((cid:0) ­ ­), epithelial cells (**) .

The control groups still showed remarkable inflammatory process  after   14   days   of   treatment.   There   was   moderate   proliferation   of  fibroblast and blood vessel after 22 days.

In   the   TG   extract   group,   there   were   dominant   fibroblast  proliferation, angiogenesis, some samples showed epithelial cells on the  14th  day (Figure 3.10). Extracellular matrix structure similar to normal  skin, a thin epidermis covered after 22 days of treatment: Immunohistochemistry staining CD34 staining

18

Figure 3.14.CD34 staining of skin samples which was treated with TG   extract at 14th day. Positive blood vessels with dark brown CD34   (Rabbit 22). X400 (cited).

The positive level with CD34 of the groups was different over time. It  was slightly positive with CD34 of control groups on the 14th day, strongly  positive on the 22nd day. The TG extract group had a strong positive with  CD34 on the 14th day and decreased after 22 days of treatment. Vimentin antibody staining

Figure 3.15. Vimentin antibody staining, TG extract group, 14th day, X400

At   the   beginning,   all   skin   ulcer   samples   were   negative   with  Vimentin.   On   the   14th   day,   the   control   groups   samples   had   light  positive with Vimentin, increased on the 22nd day. The TG extract group  samples   had   strong   positive   with   Vimentin   on   the   14th  day   and   had  decreased on the 22nd day. MMP9 antibody staining

19

Figure 3.16. 0.9% NaCl control group on the 14th day, strong positive   with antibodies MMP9. X400.

At   the  beginning,   all  ulcers  were  strongly  positive  with  MMP9.  After 14 days, the control groups ulcer had strong positive with MMP9  and reduced on the 22nd day. The TG extract group had strong positive  with MMP9 on the 14th day and only scattered on the 22nd day. Ultrastructure

Ultra­structural   characteristics   of   chronic   skin   ulcers   before  treatment:   infiltration   of   inflammatory   cells,   decreasing   of   the  extracellular matrix density, disruption, swelling and disintegration of  collagen fiber bundles, degeneration of fibroblasts.

Figure 3.18. Extracellular matrix before treatment: disruption, swelling   and disintegration of collagen fiber bundles ((cid:0) ). TEMx10000. Ultra­structural characteristics of 2 control groups: After 14 days of  treatment,   the   inflammation   was   still   dominant.   SS   greased   group  appeared   migratory   fibroblasts,   increased   collagen   synthesis   activity.  After 22 days of treatment, there is increased migration and activity of  fibroblasts in both groups but stronger in SS group.

20

A

B Figure 3.30. Ultrastructure of 0.9% NaCl group ulcers (A): fibroblasts  (**), extracellular collagen ((cid:0) ) TEM x20000. SS group (B, 3.33) at 22nd  day. B­fibroblasts, micro collagen (**), granular endoplasmic reticulum  (*). TEM x25000

A

B Figure 3.25 and 3.26. Ultrastructure of TG extract group ulcer on the   14th  day.  A,   new   extracellular   collagen   ((cid:0) ).   X15000   TEM.   B,  fibroblasts, granular endoplasmic reticulum (**), microfilaments near  cell membrane ((cid:0) ). TEM X2500.

A

B Figure 3.34 and 3.36. Ultrastructure of ulcers which were treated with   TG extract, 22nd day. A, epithelial (**). SEM X2000. B ­ New collagens  (**). TEM x10000

21

On the 14th day, the TG extract group showed the proliferation and  migration   of   active   fibroblast,   strong   biosynthesis   and   secretion   of  collagen. New extracellular collagens, strong angiogenesis.

On the 22nd day of the TG extract group, epithelial cells covered the  surface of ulcers. Collagen structured and arranged similarly to normal  dermis. Most of fibroblast reduced activity. 3.3.   Evaluate   the   clinical   therapeutic   efficacy   of   TG   extract   for  chronic skin ulcers 3.3.1. Characteristics of patients and ulcers

There   were   59   patients   with   stroke,   nerve   damage,   cancer  metastases, depletion accounting for 59.32% (35). The injury patients  accounted for 27.12% (16) and 8.47% of patients due to complications  of treatment, 5.08% diabetes. 5 (8.5%) patients had 2 ulcers, 54 (91.5%)  patients had one ulcer.

Table 3.19. Site and rate of skin ulcers were treated with TG extract

Diagnosis Number Ratio

Leg ulcers 7 10.9%

Forearm and hand ulcers 4 6.3%

1 1,6%

29 45.3%

Arm ulcers Buttock   ulcers   (tailbone,   ischium,  trochanter) Thigh ulcers 3 4.7%

Knee ulcers 4 6.3%

Heel ulcers (heel, ankle) 13 20.3%

Instep ulcers 3 4.7%

64 100.0% Total

Tailbone, ischial, trochanteric ulcers accounted for 45.3%. The heel

ulcers accounted for 20.3% and leg ulcers were 10.9%.

Table 3.20. Ulcer classification before treatment (NPUAP / EPUAP)

Before treatment Number Ratio classification

22

9 14.1% Stage II

55 85.9% Stage III

64 100.0% Total

Stage III ulcers are the majority with 55/64 (85.9%).

3.3.2. Clinical effectiveness of TG extract on chronic skin ulcers

Duration of treatment: Average duration of treatment was 25.67 ±

14.34 day, the shortest: 7 days, the longest: 68 days.

Changing in ulcer size

Table 3.23. Compare ulcer size (mm2) before and after treatment and   the rate of complete healing (test t)

Area (mm2)

p

n

Complete  healing

Before  treatment1   ( ± SD)

End of  treatment2  ( ± SD)

p1­2<0.01

<400

264.1 ±70.8

23.2 ± 18.2

7 (100%)

7

p1­2<0.01

400­<1600

36

797.5  ± 298.2

99.7 ± 95.7

34 (94.4%)

p1­2<0.01

1600­<3600

15

2399.6 ± 544.2

683.0 ± 574.5

8 (53.3%)

p1­2<0.01

3600­<6400

4374.4 ± 255.1

1115.0 ± 1057.3

1 (33.3%)

3

p1­2<0.01

6400­<10000

7375.1 ± 597.2

2046.8 ± 2681.3

2

>10000

19029.5

318.6

1

Total

64

50 (78.1%)

Ulcer size from 400 to <1600 mm2 are the most common, followed  by   ulcers   size   1600   to   <3600   mm2  and   <400   mm2.   The   ulcer   size

23

reduced   significantly   after   treatment   (p<0.01).   The   average   rate   of  complete healing is 78.1%. Ulcer size <400 mm2  has the highest rate  with 100%. The rate of ulcer size from 400 to <1600 mm 2  is 94.4%.  Other larger ulcers have lower complete healing rates.

Effective treatment:  Effective   if   ulcer   size   reduced   ≥   50%,   ineffective   if   ulcer   size

reduced<50% compared to before treatment.

Table 3.24. Effectiveness of treatment according to the area of the ulcer

Ulcer size Number Ratio

6 9,4% Reduced<50%

58 90,6% Reduced ≥ 50% or closed

64 100,0% Total

There was 90.6% (58/64) ulcers with ulcer size reduction ≥ 50% or  completely   closed,   only   9.4%   (6/64)   ulcers   with   ulcer   size  reduced<50%.

Results of treatment according to DESIGN

Table 3.25. The results of clinical treatment according to DESIGN p

Th i gian

n

Criteria

Middle

64 64 64 64 64 64

Exudation Size Infection Granulation  Necrosis Pocketing

2.68±1.20 4.48±1.99 0.83±1.35 3.23±0.96 0.69±1.27 1.29±2.49

End of  treatment2 0.78±1.33 2.15±2.53 0.23±0.81 1.34±1.59 0.32±0.94 0.09±0.74

p1­2<0.01 p1­2<0.01 p1­2<0.01 p1­2<0.01 p1­2<0.01 p1­2<0.01

64

Total

13.20±6.79 4.92± 6.252

Before  treatment1 5.12±1.38 6.48±1.97 2.91±0.52 5.86±0.63 2.72±0.88 3.05±3.02 26.14±  5.881

p

p1­2<0.01

24

The results showed that: all the details and total scores before and

at the end of treatment were statistical significant differences (p <0.01).

25

Table 3.26. Therapeutic efficiency of TG extract according to DESIGN

DESIGN Number Ratio

DESIGN total reduced <50% 7 10.9%

DESIGN total reduced ≥50% 57 89.1%

64 100.0% Total

Treatment   for   chronic   ulcers   with  TG   extract   showed   that   there  were 57/64 ulcers (89.1%) decreased in total score ≥50% DESIGN, 7/64  ulcers  (10.9%)  decreased  in total  score  DESIGN <50%  compared  to  before treatment.

Figure 3.40.The ulcer of patient Luong Van G, prior to treatment with   TG extract. Figure 3.42. At the end of treatment with TG extract (52nd day). Comment: In general, the ulcers which were treated with TG extract not  only closed completely but also had characteristics such as a soft skin,  no scars, most of them had structures, morphology similar to normal  skin. In some cases, the surface is covered incompletely with a thin  layer of skin epithelium (Figure 3.42).

Chapter 4: DISCUSSION

4.1. The components and the safety of TG extract 4.1.1. The chemical components of TG extract

TG extract contains saturated and unsaturated fatty acids of omega­ 3,   omega­6,   omega­7   and   omega­9   groups   which   are   particularly  interesting in modern medicine due to their biological activities . Oleic

26

acid   (omega­9):   as   an   antioxidant   can   prevent   the   effects   of   free  radicals. Linolenic acid has antioxidant effects, especially used in the  treatment for eczema. Arachidonic acid (AA) (a type of omega­6) is the  most common eicosanoid precursor, is metabolized in the cell to form  prostaglandins, leukotrienes that are essential signaling molecules. They  control   for   multiple   systems   of   the   body,   such   as   inflammation   and  immunity  and   also  is   a  component   of   cell   membrane  phospholipids,  participate   in   the   repair   process   and   proliferation   of   cells.  Docosahexaenoic   acid   (DHA)   promotes   the   immune   response,   the  chemical   elements   of   cellular   response,   treating   for   autoimmune  diseases.

In addition, TG extract contains cholesterol which is not favorable  environment   for   the   growth   of   bacteria.   Magnesium   and   Zinc  participate in components of proteolytic enzymes depending on metals,  helps balance in ulcers. 4.1.2. Evaluate the safety of TG extract

Determine the acute toxicity of TG extract Under the guidance of the Organization for Economic Co­operation  and Development (OECD), TG extract can be applied directly to the  skin   lesions   so   it   should   be   tested   oral   acute,   subcutaneous   (usage  likely) and topical administration toxicity.

With all three acute toxicity tests, there were unidentified the lethal  dose 50% of the experimental animals (LD50) of TG extract. Thus, TG  extract has no acute oral, subcutaneous and topical toxicity. Determine the sub­chronic toxicity of TG extract Based on the guidance of the OECD (1981), we evaluated the sub­ chronic   toxicity  of   TG  extract   in  90  days   on  rabbit   skin.   The  study  results   showed   that   TG   extract   applied   on   skin   continuously   for   12  weeks  at  the highest  dose  (14,4g /  kg  / day)  did not  cause negative  impact   on   general   condition   such   as   movement,   liver,   kidney   and  hematopoietic   functions   compared   to   the   control   groups   and   before  treatment (p> 0.05). The histopathological images of the liver, kidney,

27

skin also showed no signs of macroscopic and microscopic disease or  injury compared to control samples.

Thus, TG extract did not cause subchronic toxicity on usage dose  used in clinical practice (4,8g / kg / day) and triple dose (14,4g / kg /  day) in 90­day trial based on the guidance of the OECD (1981). 4.2.   Experimental   therapeutic   efficacy   of   TG   extract   on   chronic  skin ulcers 4.2.1. Set up chronic skin ulcer model on rabbits

The ulcers on rabbits were created by the way of Rudolph R et al  (1979) and the macroscopy, histopathology, immunohistochemistry and  ultrastructure of injury were consistent with the pathological disorders  of CSUs. The total duration of the ulcers is 50 to 60 days. Thus, we  succeeded in creating CSUs on rabbits for research purposes. 4.2.2. Evaluate the effectiveness of treatment

The duration of treatment Time to completely close a chronic wound is considered at the end  of the treatment and are defined as complete re­epithelialization of skin  and not require drainage or dressing, is identified be 2 times of dressing  changes for about 2 weeks.

The Table 3.13 shows that the ulcers on experimental animals were  healed with an average time 29.9 ± 2.4 days. Two granted mechanisms  are   shrinkage   and   tissue   regeneration.   The   SS   group   average   time  shorter healing statistical significance compared to 0.9% NaCl group (p  <0.01). Recognized mechanism of SS is because silver's antibacterial  properties.   Average   time   instant   completely   wound   of   the   treatment  group   was   22.3   ±   2.9   days   shorter   with   statistical   significance   (p  <0.001)   compared   to   self­healing   time   of   about   1   week   and   faster  statistical significance compared to patients treated with SS. This result  allows us to think that the therapeutic efficacy of TG extract is due to  address the site pathological disorders ­ the main cause of CSUs.

The ulcer size Ulcer   size   and   its   changes   during   the   treatment   are   important  criteria. In our study, the healing time of ulcers which were treated with

28

TG extract is 22.3 ± 2.9 days. Therefore, based on the facts and the  "Guidance  for  Industry:  Chronic  cutaneous  ulcer  and  burn wounds   ­  Developing   products   for   treatment"   of   the   US   Food   and   Drug  Administration, we determine the final time of treatment is 22th day.

The results showed that ulcers which were treated with TG extract  miniaturized faster statistically (p <0.01 and p <0.05) compared to the  control groups. At 22th day, there were 29 lesions (96.7%), with an area of  < 1cm2  and only 1 case (3.3%) with an area > 1  cm2. Meanwhile, the  average size of the control ulcers still is 3.44 ± 1.31cm2(NaCl group) and  2.15 ± 0.67 cm2(SS group), only 11 cases had area < 1cm2 (55%). Kotz P.  et al evaluated the therapeutic effect of ice containing silver (2009), this  percentage was 27% in 21 days of the average duration of treatment. Our  results also showed lower efficiency in SS group than TG extract.

Evaluate the effectiveness of treatment according to DESIGN scale DESIGN scale which was launched by Sanada H et al in 2004 is  considered as a tool to evaluate therapeutic effect of products treating  CSU in clinical trials (Japanese Society of Pressure). The criteria shows  all the characteristics of CSU and is divided into detailed scale helping  quantify the changes in clinical practice (Table 2.2).

The results showed that TG extract reduced detailed scores faster on  compared to the control groups (p <0.01). On 22nd  day, 29/30 (96.7%)  lesions which were treated with TG extract reduced the total score ≥ 50%  compared to before treatment. This rate is 40% in NaCl 0.9% group and  75%   in   the   SS   group.   Thus,   TG   extract   reduced   ulcer   size,   increased  granulation tissue, decreased necrosis and reduced the DESIGN total score  faster  with statistical  significance  compared to the control groups (p <  0.01). 4.2.3. Activity mechanism of TG extract

In   chronic   skin   ulcers,   factors   such   as   foreign   bodies,   necrotic  tissue, bacteria (biofilm membrane), and the free radicals prevent the  healing   process.   The   authors   around   the   world   are   focusing   on:  increasing the level of growth factors; maintaining the balance between  proteolytic   enzymes   and   their   inhibitors;   stimulates   proliferation   and  increase   fibroblast   activity.   Trials   evaluating   the   effectiveness   of

29

traditional medical treatment of chronic skin ulcers are also based on  the   same   grounds.   The   results   of   histopathology,   ultrastructural   and  immunohistochemistry   made,   we   believe   that   TG   extract   had   the  following activity mechanisms: Stimulate   angiogenesis,   increased   migration,   proliferation   and fibroblast activity

to   normal skin.

The   histopathological,   immunohistochemical   and   ultrastructural  results showed a prolonged inflammatory process, slow proliferation of  CSU in the control groups. By contrast, the ulcers which were treated  with TG extract showed dense appearance of fibroblasts, blood vessels,  strong proliferation of epidermal cells covering ulcer surface. On 22nd  day, the ulcers which were treated with TG extract showed histological    Ultrastructure   and  structure   similar immunohistochemistry (CD34 and vimentin) showed the repair process  of extracellular matrix: collagen bundles were arranged in co­direction,  reduced fibroblast collagen biosynthesis, reduced the number of vessels,  reduced levels of both positive for antibodies.

About   pathogenesis,   this   process   depends   on   the   presence   of  fibroblast   proliferative   factors,   increased   trans   factors,   endothelial  proliferation and epidermal proliferative factor (EGF). Thus, TG extract  increased these factors and thereby accelerating the healing process. In  particular, a major role for the proliferation of granulation tissue is due  to arachidonic acid (AA) and docosahexaenoic acid (DHA) which were  presented in TG extract. Arachidonic acid plays a role for many systems  of   the   body,   mainly   in   inflammation   and   immunity,   participating  membrane   structure.   Docosahexaenoic   acid   stimulated   immune  response and controlled the secretion of cell chemical elements.

In   the   reconstruction   period,   local   proliferation   of   extracellular  matrix decreased, only a small number of activated fibroblasts involved  in the process of repairing the extracellular matrix, blood vessels were  reconstructed   similar   to   normal   skin.   The   results   showed   that   in  epithelial   were   completely   renewable,   no   scar   tissue   formation,  consistent with research by Rastegar F. et al (2011). Thus, TG extract  also   regulated   the   increased   collagen   synthesis   in   granulation   tissue,

30

thereby   improving   the   quality   of   wound   healing,   preventing   scar  formation.

The effect of reducing tissue damage At   the   beginning,   all   three   groups   were   strongly   positive   for  antibodies   MMP9,   showed   the   level   extracellular   matrix   destruction  going strong. The level of antibody positive for MMP9 plummeted in  the ulcers which were treated with TG extract on the 14 th  day showed  reduced process of protein destroying. With components mainly fatty  acids and high cholesterol showed TG was favorable environment for  the growth of bacteria. Besides, the magnesium and zinc ion affected  the activation of proteolytic enzymes. TG extract had fatty acids such as  oleic acid, linolenic acid which is the antioxidant that may prevent free  radicals, reduce toxicity, reduce the destruction of tissue, and prevent  one of pathological disorder causes in CSU. The activity mechanism of TG extract can be generalized in the following diagram:

Figure 4.1. Diagram about mechanism of action of TG extract 4.3. Clinical effectiveness of TG extract for chronic skin ulcers

31

Characteristics of patients and ulcers which were treated with TG

extract

According to foreign authors, pressure ulcers are most common in  patients who have spinal cord injuries and the elderly. About 95% of  pressure ulcers appeared at lower part of the body.

In our study, patients with severe systemic diseases, who must stay  in   bed,   accounted   for   59.32%,   the   highest   percentage   was  sacrococcygeal  ulcers,   seat  area,  and  line transfer   (45.3 %),  2.3%   is  lowland   such   as   heels,   ankles.   This   result   is   consistent   with   the  characteristic appearance of pressure CSU.

Evaluate the effectiveness of treatment through duration and the

size of ulcers

The pressure ulcers are extremely difficult healing. The obvious  study   evaluated  for   skin   ulcer   complete   healing   at   a  low   proportion  (10%). Approximately 13% of pressure ulcers complete healing after 2  weeks of intensive treatment. 59% of pressure ulcer stage III may be  healed  after   6  months   of   treatment.   Nguyen  Tien  Dung  et   al   (2014)  suggested that treatment duration0.1% berberine cream to for CSU was  29.2 ± 12.5 days.

The results of our study showed that the average treatment duration  of   TG   extract   for   CSU   stage   II   and   III   was   25.67   ±   14.34   days.  Although 85.9% of ulcers is CSU stage III but obviously time of TG  treatment  was  shorter  than other  methods  in  hospitals.  With average  treatment time of TG extract, there were 58/64 (90.6%) ulcers which  reduced   ≥   50%   in   size   or   complete   healing.   The   average   rate   of  complete healing is 78.1%. Ulcer size <400 mm2  has the highest rate  with 100%. The rate of ulcer size from 400 to <1600 mm 2  is 94.4%.  Other   larger   ulcers   have   lower   complete   healing   rates.   Thus,   size  reduction and closure ratio of TG extract were higher compared to the  other authors’ therapies.

Thus, TG extract had effectiveness of clinical treatment for CSU  stage II and III, the average treatment duration was 25.67 ± 14.34 days.  Treatment of CSUs with TG extract showed that size reduction ratio

32

was 90.6% and the rate of complete closure was 78.1% clinically. Ulcer  size <400 mm2  has the highest rate with 100%. The rate of ulcer size  from 400 to <1600 mm2 is 94.4%.

Evaluate the effectiveness of treatment according to DESIGN scale Single characteristics cannot be used for ulcer healing assessment.  With DESIGN, the sores are fully evaluated clinical characteristics and  indicated the real effectiveness of the drug on the individual symptoms.  The   results   of   our   study   showed   that   TG   extract   could   reduce   the  discharge, stimulate the proliferation of granulation tissue. Treatment  with   TG   extract   reduced   DESIGN   total   score  ≥50%   in  57/64   ulcers  (89.1%).   Corresponding   to   traditional   medicine,   TG   extract   can   be  stasis removing and muscle regenerating.

Clinically, the treatment of TG extract for CSUs helps  reducing  ulcer   size,   proliferation   of   granulation   tissue   and   reducing   necrosis.  Reduction rate ≥50% of the DESIGN total score achieved 89.1%.

CONCLUSION

The research results allow us to draw the following conclusions: 1.   TG   extract   contains   polyunsaturated   fatty   acids:   arachidonic acid, docosahexaenoic acid, oleic acid, linolenic acid and cholesterol. TG extract did not irritate skin. There was no acute toxicity by oral, subcutaneous and topical using.

Topical TG extract did not make chronic toxicity in the equivalent  dose used in clinical practice (4,8g / kg / day) and triple dose (14,4g / kg  / day) in 90 days under the guidance of the OECD (1981).

2.   TG   extract   had   effectiveness   of   treatment   for   CSUs   in  experimental animals: Average time to heal entirely is 22.3 ± 2.9 days;  Reducing   the   size   of   ulcers   faster   (p   <0.01;   p   <0.05),   the   rate   of  complete closure higher (p <0.01) compared to the control groups.

The detailed criteria (size of granulation tissue, necrosis, exudation) and  the DESIGN total score of ulcers which were treated with TG extract reduced  faster statistically significant compared to the control groups (p <0.01 ). Histopathological, ultrastructural   and   immunohistochemical  characteristics of experimental CSUs showed that TG extract stimulated

33

proliferation,   migration   and   activation   of   fibroblasts,   increased  extracellular   matrix   synthesis,   angiogenesis   and   re­epithelialization,  decreased activity of MMP9, reduced extracellular matrix destruction so  accelerated healing of CSUs.

3. Clinically, TG extract has effective treatment for chronic skin ulcers  stage II, III. The average treatment duration is 25.67±14.34 days. The rate  of  the reduced DESIGN total score (≥ 50%)  is 89.1%.  The ulcer  size  reduction ratio is 90.6%. The percentage of complete healing for all ulcer  sizes is 78.1%. The percentage of complete healing of ulcer size <400 mm2  and between 400mm2 to <1600mm2 is 100% and 94.4% respectively.

REQUEST

1. Continue to study the therapeutic effect of TG extract for chronic  skin ulcers which are caused by diabetes, venous disease, irradiation  and burn.

2. Use more modern research techniques to further elucidate the  mechanism of action of TG extract and the applicability in the treatment  for chronic wounds.

CATEGORY OF PUBLISHED STUDIES LINKED

TO THE THESIS

ươ ị ỳ ủ ạ ế ự ị 1. L ng Th  K  Th y, Ph m Vi ế   ễ t D , Nguy n Th  Tuy t

ủ ứ ộ ậ   Nga, (2014), Nghiên c u tính an toàn c a cao TG trên đ ng v t

ự ệ ạ ượ ọ ổ T p chí Y d ề c h c c  truy n Quân s , th c nghi m. ự  4(3); 48­

56.

ươ ị ỳ ủ ạ ế ự 2. L ng Th  K  Th y, Lê Đình Roanh, Ph m Vi t D , Đinh

ạ ụ ề Đánh giá tác d ng đi u tr ị Văn Hân, Ph m Lê Bách, (2014),

ự ủ ệ ạ ạ T p chí loét da m n tính c a cao TG trên mô hình th c nghi m.

ượ ọ ổ Y d ề c h c c  truy n Quân s , ự  4(2), 15­22.

ươ ị ỳ ủ ắ ạ 3. L ng Th  K  Th y, Ph m Xuân Th ng, Lê Đình Roanh

ứ ể ấ ặ (2015),  Nghiên c u đ c đi m hình thái siêu c u trúc quá trình

ự ề ế ệ ạ ậ ộ ượ li n v t loét da m n tính trên đ ng v t th c nghi m đ ề   c đi u

ị ằ ạ ọ ệ T p chí y h c Vi t Nam. tr  b ng cao TG, 437; 139­138.

ươ ị ỳ ủ ạ ị ế ự 4. L ng Th  K  Th y, Lê Th  Cúc, Ph m Vi t D , (2015),

ả ề ủ ệ ạ ị Đánh giá hi u qu  đi u tr  loét da m n tính c a cao TG trên lâm

ượ ọ ổ ề c h c c  truy n Quân s , ạ sàng, T p chí Y d ự 2(5), 34­42.

ươ ủ ạ ắ 5. L ng  Th ị ỳ  K  Th y, Ph m Xuân Th ng, Đinh Văn Hân

ả ề ố ớ ị ủ ứ ệ (2016), Nghiên c u hi u qu  đi u tr  c a cao TG đ i v i loét da

ỷ ế ộ ọ ự ệ ạ ị ố   ỏ K  y u H i ngh  khoa h c qu c m n tính th c nghi m trên th ,

ế ệ ệ ỏ ố ọ ế ề t li n v t th ng ươ . H c vi n Quân y, Vi n B ng qu c gia, Hà

ộ N i, 42.