Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu in vivo của dịch chiết quả lựu (Punica granatum Linn.fruits)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

HỒ THỊ HẰNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG TĂNG

GLUCOSE MÁU VÀ LIPID MÁU

IN VIVO CỦA DỊCH CHIẾT QUẢ LỰU

(PUNICA GRANATUM LINN.FRUITS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: HỒ THỊ HẰNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG TĂNG

GLUCOSE MÁU VÀ LIPID MÁU

IN VIVO CỦA DỊCH CHIẾT QUẢ LỰU

(PUNICA GRANATUM LINN.FRUITS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2014.Y

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Bùi Thanh Tùng

2. Ths Đặng Kim Thu

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Bùi Thanh Tùng, Ths. Đặng Kim Thu giảng viên bộ môn Dược lý, Dược lâm sàng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giao đề tài và luôn hướng dẫn tôi từ những ngày đầu tôi bước đi trên con đường nghiên cứu khoa học cho đến khi tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Các thầy, cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức, mà còn truyền cho tôi niềm đam mê, lòng nhiệt huyết với nghề và luôn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, bộ môn Hóa dược đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa cùng toàn thể các thầy, cô giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại nhà trường.

Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CA.18.10A do PGS.TS Bùi Thanh Tùng chủ trì để thực hiện nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, chăm sóc, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 30 tháng 4 năm 2019

Sinh viên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hồ Thị Hằng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1 - TỔNG QUAN .............................................................................. 3

1.1. Đái tháo đường ......................................................................................... 3 1.1.1. Định nghĩa ........................................................................................... 3 1.1.2. Dịch tễ ................................................................................................. 3 1.1.3. Phân loại .............................................................................................. 3 1.1.4. Cơ chế bệnh sinh ................................................................................. 4 1.1.5. Các mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm ................................................... 5

1.2. Tổng quan cây lựu .................................................................................... 8 1.2.1. Tên gọi ................................................................................................ 8 1.2.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................... 9 1.2.3. Phân bố, sinh thái .............................................................................. 10 1.2.4. Thành phần hóa học .......................................................................... 10 1.2.5. Hoạt tính sinh học ............................................................................. 12 1.2.5.1. Tác dụng chống oxy hóa .............................................................. 12 1.2.5.2. Tác dụng vi sinh ........................................................................... 13 1.2.5.3. Tác dụng chống viêm ................................................................... 13 1.2.5.4. Tác dụng chống ung thư ............................................................... 14 1.2.5.5. Tác dụng đối với tim mạch .......................................................... 14 1.2.5.6. Tác dụng đối với bệnh tiểu đường ............................................... 15 1.2.5.7. Tác dụng đối với bệnh béo phì ..................................................... 16 1.2.5.8. Độc tính của lựu ........................................................................... 16

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 17

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 17 2.1.1. Mẫu thực vật ..................................................................................... 17 2.2.2. Động vật thí nghiệm .......................................................................... 17

2.2. Dụng cụ và hóa chất ............................................................................... 17 2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................. 17 2.2.2. Hóa chất ............................................................................................ 17

2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 18

2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

máu ................................................................................................................ 18 2.3.1.1. Tạo mô hình chuột béo phì .......................................................... 18 2.3.1.2. Gây ĐTĐ typ 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozocin (STZ) ............................................................................................................... 19 2.3.1.3. Phân lô chuột thí nghiệm ............................................................. 19 2.3.1.4. Tiến hành thí nghiệm ................................................................... 20 2.3.1.5. Theo dõi thí nghiệm ..................................................................... 20

2.3.1.6. Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm . 20 2.3.2. Phương pháp xác định một số chỉ số hóa sinh máu .......................... 20 2.3.2.1. Định lượng Glucose máu theo giai đoạn thực nghiệm ................ 20 2.3.2.2. Định lượng Cholesterol trong huyết thanh .................................. 21

Chương 3 - KẾT QUẢ .................................................................................. 23

3.1. Kết quả gây mô hình béo phì thực nghiệm ............................................ 23

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên trọng lượng chuột ............................................................................................................. 25

3.3. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm. ............................................ 27

Chương 4 - BÀN LUẬN ................................................................................ 30

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 33

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Đái tháo đường ĐTĐ

ADA

Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ (American Diabetes Association )

Streptozocin STZ

Chiết xuất vỏ (Peel extract) PE

Chiết xuất hạt (Seed extract) SE

HDL Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein)

LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein)

IDF

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (International Diabetes Federation )

DANH MỤC CÁC BẢNG

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Bảng 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm ......................................................................................................... 23 Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột sau 10 ngày tiêm STZ 24 Bảng 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu ............................................................ 26 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu lên nồng độ glucose máu ........ 27 Bảng 3.5. Ảnh hướng của dịch chiết quả lựu đối với các chỉ số lipid máu .... 29

DANH MỤC CÁC HÌNH

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của streptozocin .................................................... 6 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của alloxan ............................................................ 7 Hình 1.3. Quả lựu (Punica granatum Linn.Fruits) ........................................... 9 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của punicalagin .................................................... 10 Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của delphinidin 3,5 - diglucoside và cyanidin 3,5 - diglucoside ...................................................................................... 11 Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của axit punicic .................................................... 11 Hình 2.1. Sơ đồ và phương pháp nghiên cứu .................................................. 18 Hình 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm ......................................................................................................... 24 Hình 3.2. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm ......................................................................................................... 25 Hình 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu ............................................................ 27 Hình 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu lên nồng độ glucose máu ......... 28

MỞ ĐẦU

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), béo phì là một trong những vấn đề sức khỏe cộng đồng thường gặp nhưng hầu như không được chú trọng và đang ngày càng gia tăng theo mức độ đáng báo động. Từ năm 1980, tỷ lệ béo phì trên toàn thế giới đã gia tăng gấp hai lần, tăng từ 4,7% lên 8,5% ở người lớn và dự đoán đến năm 2030 sẽ có 470 triệu người mắc bệnh này [55]. Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Viện dinh dưỡng Quốc gia năm 2007 báo cáo rằng tỷ lệ thừa cân/béo phì (tính theo chỉ số khối cơ thể) lên tới 16,3% với đối tượng tuổi từ 25 đến 64 tuổi và vẫn tiếp tục tăng. Đây là một dấu hiệu cảnh báo về sự gia tăng bệnh mạn tính không lây nhiễm tại cộng đồng, gây nên những biến chứng sức khỏe nghiêm trọng như bệnh tim mạch, mỡ máu, đột quỵ và các bệnh rối loạn chuyển hóa trong đó đặc biệt là bệnh ĐTĐ.

Đái tháo đường là hội chứng lâm sàng đặc trưng bởi tình trạng tăng nồng độ glucose máu do thiếu hụt insulin ở tế bào. Trên toàn thế giới, ĐTĐ đang ngày càng gia tăng về tỷ lệ và mức độ ảnh hưởng đến các vấn đề sức khỏe khác. Mặc dù có tiến bộ đáng kể trong điều trị bệnh ĐTĐ bằng các thuốc đường uống, việc tìm kiếm các loại thuốc mới hơn vẫn tiếp tục vì những hạn chế do các tác dụng bất lợi và chi phí điều trị [60].

Sử dụng cây thuốc trong điều trị bệnh tiểu đường rất phổ biến ở các nước đang phát triển, khi chi phí của các loại thuốc thông thường là gánh nặng về kinh tế đối với người dân [24]. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tiềm năng điều trị bệnh ĐTĐ của các cây thuốc và đã cho những kết quả khả quan như: Thân cây Ý dĩ, thân cây Mướp đắng, quả cây Chuối hột [3, 4, 7].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Lựu được biết đến không chỉ là loại cây ăn quả được trồng nhiều ở nước ta mà còn là loại dược liệu được sử dụng nhiều trong Y học cổ truyền. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu từ các thành phần của cây lựu. Tuy nhiên tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa tìm thấy nghiên cứu nào đánh giá tác dụng sinh học của lựu. Để góp phần cung cấp những cơ sở cho việc sử dụng và phát triển các sản phẩm từ lựu, đề tài “Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu in vivo của

dịch chiết quả lựu (Punica granatum Linn.fruits)” được thực hiện nhằm mục tiêu sau:

 Xây dựng được mô hình chuột bị ĐTĐ typ 2 trên nền chuột béo phì.

 Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

ethanol quả lựu trên mô hình chuột ĐTĐ typ 2.

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1. Đái tháo đường

1.1.1. Định nghĩa

Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ năm 2017 (American Diabetes Association - ADA): “Đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra bởi sự giảm tiết insulin và/hoặc giảm hoạt tính của insulin. Sự tăng đường huyết mạn tính dẫn đến những tác hại lâu dài, rối loạn hoặc suy yếu chức năng các cơ quan đặc biệt là mắt, thận, hệ thần kinh, tim và mạch máu” [8].

1.1.2. Dịch tễ

Đái tháo đường trở thành bệnh lý đáng báo động nhất trên toàn thế giới từ những năm đầu của thế kỷ 21. Theo cuộc điều tra của Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới (International Diabetes Federation - IDF): năm 2017 dân số thế giới là 7,5 tỷ người trong đó có 425 triệu người (trong độ tuổi 20 - 79) bị bệnh ĐTĐ, dự tính đến năm 2045 con số này sẽ là 629 triệu; đặc biệt trong hai người trưởng thành (trong độ tuổi 20 - 79) bị ĐTĐ thì có một người không được chẩn đoán. Hầu hết những người mắc bệnh ĐTĐ sinh sống ở các nước đang phát triển, những nước có thu nhập thấp và trung bình. Đông Nam Á có số người trưởng thành bị ĐTĐ cao thứ hai trong các vùng theo IDF, chiếm tỷ lệ 8,5% tổng số người bị ĐTĐ trên thế giới, trong đó khoảng 45,8% các trường hợp bị ĐTĐ không được chẩn đoán và gần 48,8% người trưởng thành mắc bệnh ĐTĐ sống ở thành thị [25].

Tại Việt Nam, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống đái tháo đường quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện năm 2012 trên 11000 người tuổi 30 - 69 sống tại 6 vùng miền gồm: miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ trên toàn quốc ở người trưởng thành là 5,42%, tăng gấp gần hai lần so với tỷ lệ ĐTĐ năm 2012 là 2,7%. Ngoài ra, tỷ lệ ĐTĐ chưa được chẩn đoán trong cộng đồng lên tới 63,6% [2]. Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đói toàn quốc 1,9% (năm 2003).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.1.3. Phân loại

Theo ADA bệnh ĐTĐ có thể được phân thành [8]:

Bệnh ĐTĐ typ 1: do sự tự phá hủy tế bào β đảo tụy, thường dẫn đến sự

thiếu hụt insulin tuyệt đối.

Bệnh ĐTĐ typ 2: do tế bào mất dần sự bài tiết insulin.

Bệnh ĐTĐ thai kỳ: được chẩn đoán trong khoảng từ tháng thứ ba đến

tháng thứ chín của thai kỳ và được phát hiện lần đầu trong lúc mang thai.

Bệnh ĐTĐ do các nguyên nhân khác: giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen; bệnh nội tiết; tăng đường huyết do thuốc và hóa chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi ghép tạng.

1.1.4. Cơ chế bệnh sinh 1.1.4.1. Bệnh sinh ĐTĐ typ 1

Đái tháo đường typ 1 hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin, được coi là một bệnh tự miễn do hệ thống miễn dịch của cơ thể tấn công các tế bào β sản xuất insulin trong tuyến tụy và phá hủy chúng. Tuyến tụy sau đó sản xuất ít hoặc không sản xuất insulin dẫn đến nồng độ glucose trong máu ở mức không bình thường và người bệnh được chẩn đoán là mắc bệnh ĐTĐ.

Bệnh ĐTĐ typ 1 xuất hiện ở những cá thể có gen mẫn cảm với bệnh và thêm các yếu tố môi trường thuận lợi sẽ kích hoạt quá trình bệnh sinh. Tiếp đó, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ xảy ra, các tế bào đơn nhân, đại thực bào và tế bào lympho T gây độc thâm nhiễm vào các tiểu đảo tụy. Quá trình này diễn ra rất thầm lặng và được gọi là viêm tiểu đảo tụy. Giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1 được xác định khi phát hiện được kháng thể kháng tế bào β đảo tụy trong huyết thanh người bệnh [6, 8].

1.1.4.2. Bệnh sinh ĐTĐ typ 2

ĐTĐ typ 2 là dạng ĐTĐ thường gặp nhất, chiếm khoảng 80 - 90% trong số bệnh nhân bị ĐTĐ. Thông thường, với bệnh ĐTĐ typ 2, trong cơ thể vẫn còn sản xuất insulin, nhưng insulin được sản xuất ra không đủ hoặc các tế bào không thể sử dụng nó và được gọi là kháng insulin [8].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Có hai yếu tố cơ bản đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 là đề kháng với insulin và suy giảm chức năng tiết insulin kết hợp với nhau [8].

Glucose đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng chính cho các tế bào. Tuy nhiên để có thể nhận được glucose các tế bào phải cần đến insulin hoạt động như một “chiếc chìa khóa” giúp glucose có thể vào được tế bào. Kháng insulin có thể xảy ra ở gan và các mô ngoại vi theo các hình thức: giảm sử dụng glucose ở các cơ quan, giảm thu nhận glucose ở mô ngoại vi và khả năng ức chế sản xuất glucose ở gan bị thuyên giảm.

Thừa cân và béo phì là những yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin, mà béo phì thường là do cơ thể hấp thu quá nhiều chất béo nhưng lại ít vận động. Axit béo tự do có nhiều ở những người bệnh béo phì sẽ cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân dẫn đến sự rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên và gây nên tình trạng đề kháng insulin [7].

Suy giảm chức năng tiết insulin Khi cơ thể có hiện tượng kháng insulin, nồng độ glucose trong máu sẽ tăng cao. Tế bào β đảo tụy lại đáp ứng bằng cách sản xuất nhiều hơn insulin. Quá trình này diễn ra kéo dài sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm.

Ngoài ra khi cả axit béo tự do và insulin đều tăng, quá trình chuyển hóa sẽ tăng lên tại ty thể, làm gia tăng các gốc tự do dẫn đến gia tăng tình trạng viêm. Thêm vào đó, insulin trong máu cao còn gây hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai tình trạng này đều dẫn đến kết quả là tế bào chết theo chu trình. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin. Khi nồng độ insulin ở tế bào cửa gan thấp, gan đáp ứng bằng việc giải phóng glucose vào máu trong khi nồng độ glucose đã cao sẵn sau bữa ăn. Ngoài ra ở tế bào cơ vân, nồng độ insulin thấp làm glucose ít vào tế bào, góp phần dẫn đến glucose trong máu cao. Trong giai đoạn này, nồng độ insulin thấp do tụy ít sản xuất và bài tiết insulin kèm theo tình trạng kháng insulin làm khả năng kiểm soát nồng độ glucose ngày càng xấu đi và có thể gây nên nhiều biến chứng nghiêm trọng [7].

1.1.5. Các mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Thử nghiệm ĐTĐ trên mô hình động vật là điều cần thiết để nâng cao nhận thức và hiểu biết về các khía cạnh khác nhau của cơ chế bệnh sinh từ đó tìm ra các liệu pháp và các phương pháp trị liệu mới. Hầu hết các mô hình hiện nay đều sử dụng động vật gặm nhấm vì nhiều ưu điểm như kích thước nhỏ, khoảng cách thế hệ ngắn, tính sẵn có và chi phí thấp. Bệnh ĐTĐ thực nghiệm thường được gây ra ở động vật thí nghiệm bằng các phương pháp phổ biến như: tác nhân hóa học, phẫu thuật, di truyền [31].

1.1.5.1. Tác nhân hóa học

Các tác nhân hóa học gây ra ĐTĐ có thể phân thành ba loại: phá hủy tế bào β đảo tụy, gây ức chế tạm thời việc sản xuất và/hoặc tiết insulin, làm giảm chuyển hóa insulin trong mô đích.

Streptozocin (STZ 61%) và Alloxan (31%) cho đến nay là những thuốc được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh ĐTĐ và giúp ích cho nghiên cứu nhiều khía cạnh của bệnh. Các loại thuốc này có thể được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng hoặc tiêm dưới da. Liều cần thiết để gây ra bệnh ĐTĐ phụ thuộc vào loại động vật, đường dùng thuốc và tình trạng dinh dưỡng. Tùy theo liều dùng của các thuốc này, các hội chứng tương tự như ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2 hoặc không dung nạp glucose có thể được gây ra. Tác dụng gây độc tế bào của các loại thuốc này đều qua trung gian là các phản ứng oxy hóa nhưng chúng khác nhau về cơ chế hoạt động [31].

 Streptozocin

Streptozocin là một hơp chất glucosamine nitrosourea đã được thử nghiệm lâm sàng từ năm 1967. Trước đây được chỉ định dưới tên streptozotocin. STZ gây ra ĐTĐ ở hầu hết các loài và được sử dụng phổ biến nhất để gây ra ĐTĐ ở chuột [27, 62].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của streptozocin

STZ xâm nhập vào tế bào tụy thông qua chất vật chuyển glucose - GLUT2 và gây ra sự alkyl hóa axit deoxyribonucleic (DNA). Ngoài ra STZ còn gây kích hoạt sự ribosyl hóa poly adenosin diphosphat và giải phóng nitric oxid. Kết quả là tế bào tụy bị phá hủy do hoại tử [31].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Sử dụng STZ trong mô hình bằng nhiều phương pháp:

- STZ cho chuột mới sinh: Mô hình tiêm STZ cho chuột mới sinh (với sự thay đổi liều và ngày tiêm STZ) biểu hiện các giai đoạn khác nhau của ĐTĐ typ 2 như giảm dung nạp glucose, glucose máu giảm nhẹ, trung bình, nặng. Các tế bào β ở chuột mới sinh tiêm STZ có sự tương đồng về đặc điểm bài tiết insulin ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 [9, 63].

- Kết hợp Nicotinamid - Streptozocin (NAD - STZ): Nicotinamid là một chất chống oxy hóa có tác dụng bảo vệ bằng cách làm sạch các gốc tự do và do đó bảo vệ được một phần tế bào β khỏi tác động gây độc tế bào của STZ [42].

Một vấn đề khi sử dụng STZ là tác dụng độc hại của nó không giới hạn ở tuyến tụy vì nó có thể gây tổn thương thận, gây viêm và rối loạn chức năng nội mô.

 Alloxan

Alloxan còn được gọi là mesozalylurea, mesoxalylcarbamide, 2, 4, 5, 6 - tetraoxohexa hydropyrimidin hoặc pyimidineteton. Nó là dẫn xuất của axit uric, không bền ở pH trung tính, khá ổn định ở pH=3. Alloxan tạo ra các phản ứng oxy hóa trong phản ứng oxy hóa khử tuần hoàn với sản phẩm khử của nó là axit dialuric. Axit này tự oxy hóa tạo thành các gốc superoxide, hydro peroxide, gốc hydroxyl. Các gốc hydroxyl này gây nên sự phân hủy tế bào β [34].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của alloxan

Alloxan tác động qua ba giai đoạn [46]:

- Giai đoạn 1: gây tăng đường huyết sau thời gian ngắn (khoảng 1 - 4

giờ) do insulin giảm đột ngột và kéo dài; gây phân hủy glycogen ở gan.

- Giai đoạn 2: tăng đường huyết kéo dài đến 48 giờ, thường dẫn đến co

giật, tử vong.

- Giai đoạn 3: gây ĐTĐ mạn tính do thiếu insulin, số lượng tế bào β còn

lại rất ít.

1.1.5.2. Phẫu thuật gây ĐTĐ

Phương pháp này bao gồm cắt bỏ hoàn toàn hoặc một phần tụy để gây ĐTĐ typ 1 hoặc typ 2. Trong lịch sử, mô hình mắc bệnh tiểu đường ở chó được Oskar Minkowski phát hiện thông qua phẫu thuật cắt bỏ tụy được coi là mô hình động vật đầu tiên về bệnh tiểu đường [41]. Một số nhà nghiên cứu đã sử dụng mô hình này để thử nghiệm các sản phẩm tự nhiên trên chuột, chó, linh trưởng [36, 45].

1.1.5.3. ĐTĐ do di truyền

Các động vật mắc bệnh ĐTĐ typ 2 có thể được lấy từ chọn giống (các động vật có một hoặc một số gen đột biến được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác) hoặc từ lai tạo (lai tạo từ chuột ob không bị ĐTĐ bằng nhân giống lặp đi lặp lại qua nhiều thế hệ (chuột BB, chuột tiểu đường béo phì Tsumara Suzuki). Những động vật này bị ĐTĐ là do di truyền hoặc do khiếm khuyết đơn hoặc đa gen (chuột KK, chuột db/db hoặc chuột béo Zucker). Bệnh ĐTĐ typ 2 ở người phần lớn là kết quả của sự tương tác giữa môi trường và sự khiếm khuyết đa gen. Do đó động vật khiếm khuyến đa gen sẽ gần giống với người hơn động vật khiếm khuyết đơn gen [30].

1.2. Tổng quan cây lựu

1.2.1. Tên gọi

Tên khoa học: Punica granatum Linn.

Tên gọi khác: Bạch lựu, tháp lựu, lựu chùa Tháp.

Tên nước ngoài: Pomegranate (Anh), grenadier (Pháp).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Họ: Lựu (Punicaceae).

Chi Punica gồm 2 loài: P.protopunica và P.granatum, P.protopunica chỉ có ở bán đảo Socotra (Yemen) và được liệt kê vào loài thực vật có nguy bị tuyệt chủng ở Danh sách đỏ của Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [5, 39].

Hình 1.3: Quả lựu (Punica granatum Linn.Fruits) [64]

1.2.2. Đặc điểm thực vật

Cây lựu là một cây thuộc mộc, cao chừng 3 - 4 m [5]. Thân màu xám, có vỏ mỏng, cành mảnh, đôi khi có gai. Lá mọc đối, nhưng thường tụ họp thành cụm nhiều lá, cuống ngắn, hình mác thuôn, dài 5 - 6 cm, rộng 1 - 2 cm, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, lá kèm rất nhỏ, hình chỉ [1].

Quả to bằng nắm tay, đầu quả còn 4 - 5 lá đài tồn tại. Vỏ dài, ngoài da sắc lục, khi chín có màu vàng đỏ lốm đốm. Trong quả có 8 ngăn xếp thành 2 tầng, tầng trên có 5 ngăn tầng dưới có 3. Các loại ngăn phân cách bởi các màng mỏng. Hạt rất nhiều, hình 5 cạnh, sắc hồng trắng [5].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, màu đỏ hoặc màu vàng, loại màu trắng là bạch lựu, dài 6 phiến dày, màu đỏ nhạt, hàn liền thành ống ngắn ở phần dưới, tràng 6 cánh mỏng, nhăn nheo, nhị rất nhiều, bầu có 2 tầng, tầng trên 6 - 7 ô, tầng dưới 3 - 4 ô, noãn nhiều [1].

1.2.3. Phân bố, sinh thái

Lựu là loại cây được trồng ở vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Lựu có nguồn gốc từ các khu vực bao gồm Iran và Afganistan, được canh tác và tự nhiên hóa trên toàn bộ khu vực Địa Trung Hải từ thời cổ đại. Ngày nay nó được trồng rộng rãi ở khắp Ấn Độ, Đông Nam Á, Malaysia, Đông Ấn và vùng nhiệt đới Châu Phi [20].

Ở Việt Nam, cây được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam và một số tỉnh ở

đồng bằng trung du Bắc Bộ [1].

Lựu là cây ưa sáng, nếu bị che bóng có thể ra nhiều hoa nhưng không đậu quả. Cây rụng lá về mùa đông, tái sinh chủ yếu bằng hạt. Lựu trồng hiện nay gồm nhiều giống. Người ta căn cứ vào màu hoa và quả để phân biệt giữa các giống khác nhau [1].

1.2.4. Thành phần hóa học

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học đối với các bộ phận của quả lựu nhằm hướng tới xác định thành phần nào chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học mà quả lựu có được.

Vỏ lựu chiếm 50% trọng lượng quả, là nguồn giàu các thành phần có hoạt tính sinh học như phenolics, ellagitannins và anthocyanins [35]. Ellagitannins là nhóm hợp chất phenolic chiếm ưu thế cả trong vỏ và thịt quả lựu với hàm lượng cao nhất là punicalagin (HHDP - gallagyl - hexoside) [17].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của punicalagin

Thịt quả chứa nước (85%), đường (10%) chủ yếu là fructose và glucose, pectin (1,5%) và axit tự nhiên như axit ascorbic, axit citric, axit malic [11]. Các nhóm chất đã được xác định trong thành phần hóa học của thịt quả lựu là anthocyanins, gallotannins, ellagitannins, estes gallagyl, axit hydroxybenzoic, hydroxycinnamic [17].

Vỏ quả và thịt quả có hàm lượng anthocyanin là ngang nhau với các hợp chất đã được xác định là: delphinidin 3,5 - diglucoside, cyanidin 3,5 - diglucoside, pelargonidin 3,5 - diglucoside, delphinidin 3 - glucoside, cyanidin 3 - glucoside, cyanidin 3 - rutinoside, pelargonidin 3 - glucoside và cyanidin - pentoside [17].

Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của delphinidin 3,5 - diglucoside và cyanidin 3,5 - diglucoside

Dầu hạt lựu chiếm khoảng 12 - 20% tổng trọng lượng hạt, đặc trưng bởi các axit béo không bão hòa đa nối đôi như linoleic, linolenic và các axit béo khác như axit palmitic, axit stearic, axit oleic trong đó hàm lượng cao (7%) là axit punicic, được biết đến như một đồng phân của axit linoleic [16, 40]. Hạt lựu cũng chứa protein, vitamin, khoáng chất, isoflavones (chủ yếu là genistein), phytoestrogen coumestrol, estrone [14].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1.6. Cấu trúc phân tử của axit punicic

1.2.5. Hoạt tính sinh học

Mặc dù mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý của các thành phần trong quả lựu đến nay vẫn chưa được xác định rõ. Tuy nhiên, trong hơn thế kỷ qua rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để hướng tới sự hiểu biết toàn diện về tác dụng dược lý của lựu. Quả lựu ngoài tác dụng là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng quan trọng, nó còn có thể được sử dụng với nhiều mục đích y học khác nhau. Trong y học cổ truyền, vỏ quả lựu thường được dùng để trị sán (peletierin kết hợp với tanin). Ngoài ra, nó còn được dùng chữa đau răng, đi ngoài, chữa lỵ nhờ tác dụng săn da và sát khuẩn mạnh [1]. Chất chiết xuất từ vỏ, nước, hạt lựu đều được ghi nhận có ý nghĩa về y học, đáng chú ý là hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, tính kháng khuẩn, sử dụng trong bệnh tiểu đường, bệnh tim và ung thư.

1.2.5.1. Tác dụng chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa của quả lựu đã được tiến hành trong nhiều nghiên cứu, bao gồm cả in vitro và in vivo. Kannat và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro của chiết xuất vỏ (PE) và hạt (SE) quả lựu theo mô hình loại bỏ gốc tự do của 2,2 - diphenyl -1 - picrylhydrazyl (DPPH), có đối chứng với chất chống oxy hóa là Butylated Hydroxy Toluene (BHT). Kết quả báo cáo rằng giá trị IC50 (nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do) của PE đối với DPPH là 4,9 µg/mL trong khi đó BHT với DPPH là 21,2 µg/mL, đã cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh của PE. Ngoài ra, nghiên cứu còn báo cáo việc bổ sung PE vào các sản phẩm thịt gà đã tăng thời gian bảo quản lên 2 - 3 tuần trong điều kiện lạnh, có hiệu quả trong việc kiểm soát sự oxy hóa của các sản phẩm này [28].

Nước quả lựu có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất khi so sánh khả năng chống oxy hóa của nước quả lựu, punicalagin, axit ellagic và tổng tanin trong quả lựu [50].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hoạt tính chống oxy hóa có thể liên quan đến sự đa dạng của các phenolic có mặt trong quả lựu, bao gồm các đồng phân của punicalagin, dẫn xuất tanin và anthocyanin (delphinidin, cyanidin và pelargonidin 3 - glucosides và 3,5 - diglucosides). Những hợp chất này được biết đến với tính chất loại bỏ các gốc tự do và ức chế quá trình oxy hóa lipid trong ống nghiệm [19]. Tuy nhiên,

Tzulker và cộng sự cho rằng punicalagin có nguồn gốc từ vỏ mới là chất đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa của lựu, còn anthocyanin chỉ đóng vai trò nhỏ trong hoạt tính này [56].

1.2.5.2. Tác dụng vi sinh

Tác dụng kháng khuẩn của quả lựu đã được nghiên cứu rộng rãi bởi các nhà khoa học khác nhau trên toàn thế giới. Năm 2005, nghiên cứu dịch chiết methanol từ quả lựu, Braga LC. đã phát hiện ra khả năng làm tăng cường đáng kể hoạt động và kéo dài thời gian tác dụng của các loại kháng sinh chống lại 30 chủng Staphylococcus aureus kháng Methicilin và Staphylococcus aureus nhạy cảm với Methicilin [12].

Nghiên cứu của Neurath và cộng sự được tiến hành để sàng lọc các loại nước ép trái cây có hoạt tính ức chế virus HIV IIIB gắn lõi gp120 vào các tế bào biểu hiện thụ thể CD4 và đồng thụ thể CXCR4 trên màng tế bào. Kết quả là nước quả lựu có hoạt động ức chế cao nhất. Neurath đã tách được chất ức chế sự gắn gp120 - CD4 ra khỏi nước ép lựu khi sử dụng tinh bột ngô như một chất hấp phụ, tạo sản phẩm gần như không màu [38].

Trong một nghiên cứu khác trong lĩnh vực nha khoa, gel được làm từ vỏ quả lựu cho tác dụng ức chế các chủng vi khuẩn Streptococci (mutans, sanguis, mitis) và Candidan albicans tốt hơn miconazol dạng gel [57]. Chiết xuất hydroalcoholic với quả lựu cũng cho hoạt tính kháng khuẩn đối với các vi sinh vật mảng bám trong nghiên cứu trên các bệnh nhân khỏe mạnh đang sử dụng thiết bị niềng răng [37].

1.2.5.3. Tác dụng chống viêm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Sử dụng các chất chiết xuất từ quả lựu có thể ức chế sự sản xuất NO của đại thực bào. Ngoài ra, nó còn giảm đáng kể sự phù nề ở chuột gây ra bởi carragenin trong một thời gian (tối đa 5h). Hơn nữa, sử dụng tách phân đoạn in vitro và sắc ký cột để tách punicalagin, punicalin, strictinin A và granatan B đã cho kết quả là các hợp chất này có thể ức chế sản xuất NO cũng như sự biểu hiện của iNOs trong đại thực bào. Granatin B cho thấy tác dụng ức chế iNOs và COX - 2 tốt nhất, biểu hiện qua mức PGE2 và mức phù nề ở chuột [33].

Rasheed và cộng sự cho rằng chiết xuất giàu polyphenol của nước quả lựu có tác dụng ức chế IL - 6, IL - 8 thông qua NF - kB (phức hợp Protein hoạt động như một yếu tố phiên mã gen) thông qua nghiên cứu ảnh hưởng của nó lên MAPK (Protein kinase được hoạt hóa bởi Mitogen) và Nf - kB tồn tại trong PMACI (có tác dụng kích thích biểu hiện của gen đáp ứng với quá trình viêm và sản xuất IL - 6, IL - 8 trong tế bào KU812 ở người). Nghiên cứu đã chứng minh khả năng làm giảm biểu hiện của gen đáp ứng với quá trình viêm và sản xuất IL - 6, IL - 8. Tác dụng ức chế của dịch chiết lên NF - kB (bị ức chế bởi protein IkB) là do nó ức chế sự giáng hóa IkB trong tế bào bạch cầu [44].

1.2.5.4. Tác dụng chống ung thư

Các phân đoạn giàu polyphenol từ các bộ phận của quả lựu có tác dụng hiệp đồng chống lại sự gia tăng và xâm lấn, cũng như ức chế sự biểu hiện phospholipase A2 ở các tế bào ung thư tuyến tiền liệt [32].

Chiết xuất methanol của vỏ lựu được chứng minh là có tính chất điều biến thụ thể estrogen chọn lọc trong các dòng tế bào ung thư vú ở người và các mô hình in vivo thiếu estrogen. Các chất điều biến thụ thể estrogen chọn lọc, hợp chất có tác động như estrogen lên thụ thể của estrogen có thể đồng vận hoặc đối vận trên mô đích của estrogen và thường được sử dụng để điều trị ung thư vú phụ thuộc estrogen [53]. Nghiên cứu sử dụng hai dòng tế bào ung thư vú gồm tế bào MDA - MB - 231 (ER-), MCF - 7 (ER+) và dòng tế bào không bị ung thư MCF10A, cho thấy phần nước quả lựu chứa các thành phần luteolin, axit ellagic và axit punicic giúp tăng độ bám dính của các tế bào ung thư, giảm sự di căn của tế bào ung thư và giảm sự tăng trưởng của các tế bào ung thư vú mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường [47].

Hỗn hợp axit ellagic, luteolin và axit punicic có thể ức chế sự phát triển

khối u nguyên phát [61].

1.2.5.5. Tác dụng đối với tim mạch

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nước lựu làm giảm đáng kể cholesterol tổng, LDL cholesterol, tỷ lệ LDL/HDL, và tỷ lệ cholesterol tổng/HDL. Những phát hiện này cho thấy rằng sử dụng nước ép quả lựu có thể thay đổi các yếu tố nguy cơ bệnh tim mạch ở bệnh nhân có tăng lipid máu [15].

Sử dụng nước ép quả lựu hàng ngày có thể cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim do stress gây ra ở những bệnh nhân bị bệnh mạch vành [54]. Nước ép quả lựu có thể giúp bệnh nhân hẹp động mạch cảnh, nó có tác dụng làm giảm độ dày của lớp áo trong - áo giữa thành động mạch và huyết áp tâm thu của họ [10].

1.2.5.6. Tác dụng đối với bệnh tiểu đường

Các nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng của lựu đối với bệnh tiểu đường trên sự thay đổi đường huyết khi chuột bị tiểu đường do tiêm STZ được điều trị bằng chiết xuất methanol của hạt. Tất cả các chuột đươc điều trị bằng chlorpropamid và dịch chiết methanol hạt lựu đều cho kết quả nồng độ glucose máu giảm. Lô điều trị bằng chlorpropamid biểu hiện nồng độ glucose giảm 10% sau 2h và giảm cao nhất là 42,55% sau 12h so với lô chuột chứng. Lô điều trị dịch chiết methanol hạt lựu ở liều 600 mg/kg cho kết quả tốt nhất so với liều 150 mg/kg và 300 mg/kg; giảm thấp nhất là 15% sau 2h và cao nhất là 52% sau 12h, trong khi đó liều 150 mg/kg là giảm 6% sau 2h và 40% sau 12h; liều 300 mg/kg cho kết quả giảm 7% sau 2h và 47% sau 12h so với lô chứng.

Các bệnh nhân bị tiểu đường sử dụng nước quả lựu không ảnh hưởng nhiều đến các thông số cholesterol tổng, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid. Nghiên cứu khẳng định là mặc dù có sự hiện diện của đường trong nước quả lựu nhưng không ảnh hưởng xấu đến các thông số tiểu đường: glucose, HbA1c, insulin, C - peptide đều khả quan [48].

Nghiên cứu của Das AK và cộng sự cho thấy rằng chuột bị gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ sau khi cho uống chiết xuất methanol hạt lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg và 600 mg/kg đều đạt được mức giảm gần 10% so với nhóm đối chứng sử dụng chlorpropamid [13].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Chiết xuất nước vỏ quả lựu liều 0,43 g/kg thể trọng chuột làm giảm nồng độ glucose máu là 57,14% so với nhóm chuột bị tiểu đường sau 4 tuần cho chuột sử dụng liên tục, ngoài ra nồng độ insulin trong máu chuột cũng tăng lên đến 60% so với nhóm chứng tiểu đường sau khi sử dụng chiết xuất nước vỏ quả lựu [29].

1.2.5.7. Tác dụng đối với bệnh béo phì

Chuột đực C57BI/J6 được cho ăn 1g dầu hạt lựu/100 g chế độ ăn giàu

chất béo trong 12 tuần làm giảm trọng lượng chuột so với nhóm chứng [59].

Hontecillas nghiên cứu thấy dầu hạt lựu có tác dụng cải thiện độ nhạy cảm với insulin trên chuột đực C57BI/J6 được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo trong 12 tuần [23].

Chuột được cho ăn 1g axit caltapic trên 100 g thức ăn giàu chất béo trong 78 ngày có sự cải thiện nồng độ glucose và nồng độ insulin so với nhóm chứng. Axit punicic cũng làm tăng HDL cholesterol và giảm nồng độ triacylglycerol trong huyết tương [22].

1.2.5.8. Độc tính của lựu

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Từ lâu nay, quả lựu được tiêu thụ rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới và được đánh giá là an toàn khi sử dụng. Chiết xuất quả lựu không gây độc ở nồng độ và mức độ thường được sử dụng trong y học cổ truyền ở Cuba để điều trị các bệnh về đường hô hấp mà gây độc ở liều cao hơn rất nhiều. Liều 0,4 mg/kg và 1,2 mg/kg không gây bất kỳ ảnh hưởng nào đến lượng thức ăn, cân nặng, hoạt động, thông số sinh hóa và mô bệnh học của chuột, liều gây chết trung bình khi tiêm phúc mạc trên chuột là 731 mg/kg [58]. Sử dụng thuốc sắc được làm từ vỏ cây và một lượng thấp vỏ quả, có thể gây viêm dạ dày cấp tính và thậm chí tử vong do sự hiện diện của cả tanin và alkaloid [52]. Nước quả lựu được báo cáo là ức chế enzyme chuyển hóa cytochrom P450 3A (CYP3A) [21]. Sử dụng nước lựu trong quá trình điều trị bệnh cơ với rosuvastatin cho thấy nước lựu có thể làm gia tăng nguy cơ tiêu cơ vân [51]. Một số người được báo cáo là dị ứng với lựu, những triệu chứng nghiêm trọng như sốc phản vệ, phù nề thanh quản đã xảy ra. Bệnh nhân dị ứng với lựu thường nhạy cảm với các chất gây dị ứng khác [18].

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Mẫu thực vật

Dược liệu sử dụng là toàn bộ quả lựu chín (bao gồm: vỏ quả, thịt quả và hạt quả). Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật bởi Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội.

Quả lựu được rửa sạch và ngâm trong ethanol 50% (3 lần, mỗi lần 1,5L) ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc của cả ba lần, loại bỏ dung môi bằng cách sử dụng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thu được cao tổng.

2.2.2. Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, khỏe mạnh và trưởng thành. Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22±20C với chu kỳ sáng 12 giờ và tối 12 giờ, cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (được cấp từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) trong 3 - 4 ngày để thích nghi với điều kiện môi trường trước khi tiến hành thí nghiệm.

2.2. Dụng cụ và hóa chất

2.2.1. Dụng cụ

• Dụng cụ: phễu chiết, ống đong, bình tam giác, giấy lọc, phễu lọc, tủ

hút, pipet, cốc có mỏ 50 mL, 250 mL, 500 mL…

• Thiết bị: máy cô quay chân không, tủ hút, tủ sấy, máy li tâm, máy siêu

âm, bếp điện từ…

• Máy đo glucose huyết One Touch Ultra và que thử tương ứng. • Máy ly tâm Shimadzu - Nhật Bản. • Máy khuấy từ Shimadzu - Nhật Bản.

• Máy cô quay Shimadzu - Nhật Bản.

2.2.2. Hóa chất

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

• Dung môi: ethanol • Streptozocin (250 mg, Aladdin, Trung Quốc) • Gliclazide (DiamicronRMR 60 mg)

citric monohydrate và 0,2995g natri citrate dihydrat).

• Nước muối sinh lý NaCl 0,9% • Dung dịch đệm citrate pH=4,3 (pha 250 ml đệm citrate gồm: 0,2966 g axit

Chuột được nuôi béo phì

Mẫu quả lựu khô

Chiết bằng ethanol 50%, cô quay chân không

Gây ĐTĐ typ 2 bằng cách tiêm STZ liều 120 mg/kg

Chuột có nồng độ glucose huyết cao

Cao ethanol

Thử khả năng chống tăng đường huyết và lipid máu trên chuột ĐTĐ typ 2

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ và phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu

Để đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trên chuột nhắt trắng bị ĐTĐ typ 2, nghiên cứu được thiết kế qua hai giai đoạn:

- Xây dựng mô hình chuột ĐTĐ typ 2.

- Đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết

quả lựu trên chuột ĐTĐ typ 2.

2.3.1.1. Tạo mô hình chuột béo phì

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, được mua từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, khỏe mạnh và trưởng thành. Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (được cấp từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) trong 3 - 4

ngày để thích nghi với điều kiện môi trường, sau đó tiến hành phân ngẫu nhiên thành 2 nhóm:

 

Nhóm 1 (n= 20 con): chế độ ăn bình thường Nhóm 2 (n= 60 con): chế độ ăn giàu chất béo (40% hydratcacbon, 32% Lipid, 20% Protein, 2% Cholesterol, 4% chất khoáng, 2% vitamin và axit amin)

Chuột nhóm 1 được nuôi bằng chế độ ăn bình thường và chuột nhóm 2 được nuôi bằng chế độ ăn giàu chất béo trong vòng 28 ngày liên tục. Sau 28 ngày nuôi, tiến hành cân trọng lượng để chọn lọc những con chuột đạt trọng lượng trên 40 g được coi là đạt tiêu chuẩn để tiến hành gây mô hình đái tháo đường.

2.3.1.2. Gây ĐTĐ typ 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozocin (STZ)

Sau khi chuột được nuôi béo phì thực nghiệm thành công, tiến hành gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói qua đêm, gây ĐTĐ nhóm nuôi béo bằng cách tiêm phúc mạc chuột với liều duy nhất 120 mg/kg thể trọng, STZ được hòa tan trong đệm citrate 0,01M, pH=4,3. Nhóm nuôi thường được tiêm đệm citrate. Sau đó, cho chuột ăn thức ăn bình thường, 10 ngày sau tiêm STZ hoặc dung dịch đệm, định lượng glucose máu ở đuôi chuột, chọn các chuột ở lô tiêm STZ bị ĐTĐ (các chuột có nồng độ glucose huyết lúc đói trên 10 mmol/L được coi là ĐTĐ) được tham gia nghiên cứu.

2.3.1.3. Phân lô chuột thí nghiệm

Sau khi gây được mô hình ĐTĐ kiểu typ 2, chuột được chọn tiếp tục được tiến hành chia nhóm để đánh giá khả năng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trong đó: nhóm nuôi chế độ ăn bình thường ở giai đoạn trên được sử dụng làm nhóm 1 (nhóm chứng sinh lý) và các chuột bị ĐTĐ typ 2 được chia thành 4 nhóm từ nhóm 2 đến nhóm 5:

Nhóm 1: Nhóm chứng sinh lý, chuột bình thường, được cho uống nước

muối sinh lý.

Nhóm 2: Nhóm chứng bệnh tiểu đường: chuột ĐTĐ typ 2 do tiêm STZ

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

không điều trị.

Nhóm 3: Nhóm chứng dương: chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống 5 mg/kg

gliclazid (nhóm thuốc đối chứng dương).

Nhóm 4: Chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống 150 mg/kg thể trọng cao

ethanol từ dịch chiết quả lựu.

Nhóm 5: Chuột ĐTĐ typ 2 được cho uống 300 mg/kg thể trọng cao

ethanol từ dịch chiết quả lựu.

2.3.1.4. Tiến hành thí nghiệm

Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều được nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm Khoa Y - Dược Đại học Quốc gia Hà Nội. Các lô chuột được điều trị trong 21 ngày. Đường huyết được xác định vào 7 - 8 giờ sáng vào các ngày thứ 0, thứ 5, thứ 10, thứ 15 và thứ 21. Sau khi đo khoảng 60 phút chuột được cho ăn và uống nước bình thường. Sau 21 ngày, lấy máu chuột, tiến hành ly tâm và gửi đến Bệnh viện Đại học Y Hà Nội để phân tích các chỉ số hóa sinh: cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol, HDL cholesterol. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến và kết quả thí nghiệm.

2.3.1.5. Theo dõi thí nghiệm

Để thí nghiệm đạt kết quả như mục tiêu đã đề ra, tình trạng chuột, vận động, bài tiết... được theo dõi hàng ngày. Chuột được cân hằng ngày để xác định liều điều trị của chuột.

2.3.1.6. Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm

Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Chuột được gây mê bằng diethyl ether, dùng kim tiêm 1 mL để tiến hành lấy máu tim chuột. Sau 21 ngày điều trị, mẫu máu được thu thập vào các ống có chứa heparin. Huyết thanh được tách ra bằng cách ly tâm ở 3000 vòng/phút ở 25°C trong 15 phút và được gửi đến bệnh viện Đại học Y Hà Nội để phân tích các chỉ số hóa sinh: cholesterol tổng, LDL cholesterol, HDL cholesterol, triglycerid.

2.3.2. Phương pháp xác định một số chỉ số hóa sinh máu

2.3.2.1. Định lượng Glucose máu theo giai đoạn thực nghiệm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột. Định lượng glucose máu bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (One touch ultra, Johnson & Johnson, USA)

Glucose oxidase

Nguyên tắc: Glucose trong máu phản ứng đặc hiệu với glucose oxidase (GOD) có trong kit thử tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hóa O - dianisidin tạo phức chất màu vàng nàu (phản ứng 2).

Glucose + O axit gluconic + H2O2 (1)

O - dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O (2)

2.3.2.2. Định lượng Cholesterol trong huyết thanh

Nguyên tắc: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4 - aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase.

Cholesterol + axit béo Cholesterol este + H2O

Cholesterol + O2 Cholesterol–3– one + H2O2

Quinonimin 2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol

+ H2O

Tính kết quả: So mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn

2.3.2.3. Định lượng triglycerid trong huyết thanh

Thuỷ phân triglycerid bằng enzym lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyryl và 4 - chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Triglycerid Glycerol + axit béo

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Glycerol + ATP Glycerol–3–phosphate + ADP

Glycerol – 3 – phosphate + O2 Dihydroxyacetone phosphate + H2O2

H2O2 + Aminoantipyrine + 4 - chlorophenol peroxidase

Quinonimin + 4HCl + 4H2O

Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại.

Chương 3 - KẾT QUẢ

3.1. Kết quả gây mô hình béo phì thực nghiệm

Để đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu của cao chiết quả lựu trên chuột nhắt ĐTĐ typ 2, trước hết chúng tôi đã gây mô hình ĐTĐ typ 2 trên chuột nhắt trắng. Chuột được gây béo phì hoặc tăng cân rõ rệt sau 28 ngày nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và sau đó kết hợp tiêm STZ liều 120 mg/kg cân nặng để gây mô hình chuột ĐTĐ typ 2. Kết quả gây mô hình chuột ĐTĐ typ 2 như sau:

 Sự thay đổi về thể trọng chuột trung bình của các nhóm chuột thí

nghiệm sau 28 ngày nuôi được thể hiện trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm

Khối lượng (g)

Thời gian (ngày)

Nhóm nuôi thường (n=20) Nhóm nuôi béo (n=60)

Ngày 0 15,3±1,14 15,1±1,32

Ngày 28 33,35±1,35 44,13±1,45

Thay đổi (%) ↑ 117,97% ↑ 192,25%

Thay đổi so với đối chứng (%) ↑ 32,32%

D0: Thể trọng chuột trước khi tiến hành thí nghiệm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

D28: Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi với hai chế độ ăn khác nhau

44,13

33,35

) g (

g n ợ ư

l g n ọ r T

15,3

15,1

Lô nuôi béo

Lô nuôi thường

D 0 D 28

Hình 3.1. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm

Nhận xét: Nhóm chuột ăn thức ăn bình thường sau 28 ngày nuôi thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày bắt đầu thí nghiệm là 18,05 g (tăng 117,97 %), nhóm chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo thì khối lượng cơ thể tăng so với ngày đầu thí nghiệm là 29,03 g (tăng 192,25%). Chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo có khối lượng cơ thể lớn hơn chuột nuôi thường là 10,78 g tương đương tăng 32,32%. Như vậy có thể kết luận chuột nuôi bằng thức ăn giàu chất béo đã tăng cân rõ rệt về khối lượng so với chuột nuôi chế độ ăn thức ăn thường.



Sự thay đổi nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thí nghiệm sau 10 ngày tiêm STZ liều 120 mg/kg thể trọng được thể hiện trong Bảng 3.2

Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột sau 10 ngày tiêm STZ

Glucose máu (mmol/L) Thời gian Nhóm nuôi thường Nhóm nuôi béo

Trước khi tiêm 6,9 ± 0,56 6,72 ± 1,73

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Sau khi tiêm 4 ngày 6,78 ± 1,03 10,34 ± 1,43

Thay đổi (%) ↓ 1,74% ↑ 53,87%

Sau khi tiêm 10 ngày 7,32 ± 1,22 16,22 ± 1,56

Thay đổi (%) ↑ 6,09% ↑ 141,37%

)

L

16,22

/ l o m m

7,32

6,9

6,72

( u á m e s o c u

l g ộ đ g n ồ N

Nhóm nuôi béo

Nhóm nuôi thường

D 0 D 10

Hình 3.2. Thể trọng chuột sau 28 ngày nuôi theo mô hình gây béo thực nghiệm

Nhận xét: Nồng độ glucose máu ở các thời điểm nghiên cứu nhóm nuôi thường không có sự khác biệt đáng kể so với trước nghiên cứu (p>0,05). Sau khi tiêm STZ 4 ngày, nồng độ glucose máu ở nhóm chuột nuôi béo tăng 53,87% so với ban đầu và sau 10 ngày tiêm, nồng độ glucose máu đã tăng cao rõ rệt lên đến 141,37% so với ban đầu.

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên trọng lượng chuột

Để tiến hành nghiên cứu tác dụng của dịch chiết quả lựu lên trọng lượng trên mô hình chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm, chuột ĐTĐ typ 2 được điều trị trong 21 ngày bằng cách cho chuột uống cao pha trong nước cất của dịch chiết quả lựu vào buổi sáng.

Trọng lượng chuột vào các ngày 0, 5, 10, 15, 21 được thể hiện trong

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu

33,35±1,35

34,2±1

35,35±0,55 36,15±0,35 37,4±0,4

Ngày 0 (g) 5 (g) 10 (g) 15 (g) 21 (g) Thay đổi (%)

42,55±1,45 45,15±1,65 46,05±2,05

48,1±1,3

49,4±1,3#

↑ 12,14

↑ 16,1

45,6±1,2

45,05±1,55

43,6±0,8

43,05±0,95 43,1±1,8*

Chứng sinh lý Chứng tiểu đường

44,6±1,7

45,3±1,5

43,6±1,5

43,8±0,6

43,2±0,3*

↓ 5,48 Gliclazid

45,1±1,2

44,35±0,55

43,1±0,3

43±1,4

43,2±1,2*

↓ 3,14 150 mg/kg

↓ 4,21 300 mg/kg

*Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 1.

49,4

45,6

45,1

44,6

43,2

43,1

42,55

37,4

) g (

33,35

g n ợ ư

l g n ọ r T

Nhóm 1

Nhóm 2

Nhóm 3

Nhóm 4

Nhóm 5

D 0 D 21

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 3.3. Thể trọng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng hai nồng độ khác nhau của dịch chiết quả lựu

D 0: cân nặng chuột trước ngày điều trị

D 21: cân nặng chuột sau 21 ngày điều trị

Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.3 và Hình 3.3 nhận thấy rằng sau 21 ngày điều trị, nhóm chứng sinh lý và nhóm chứng tiểu đường không điều trị chỉ cho uống nước không cho uống dịch chiết thì khối lượng chuột tăng dần đặc biệt là nhóm chứng tiểu đường tăng 16,1% còn nhóm chứng sinh lý tăng 12,14%. Trong khi đó các nhóm chuột được điều trị bằng gliclazid và lượng cao chiết khác nhau của dịch chiết quả lựu thì khối lượng cơ thể chuột giảm. Mức độ giảm mạnh nhất là ở nhóm chuột cho uống gliclazid giảm 5,48%; tiếp đến là nhóm cho uống dịch chiết cao ethanol liều 300 mg/kg (4,21%) và cuối cùng nhóm điều trị bằng dịch chiết cao ethanol liều 150 mg/kg (3,14%). Mức độ giảm thể trọng ở các nhóm chuột cho uống cao chiết là không tuyến tính. Từ kết quả trên có thể kết luận rằng dịch chiết quả lựu có tác dụng kìm hãm cân nặng của chuột.

3.3. Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết quả lựu lên một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm.

3.3.2. Nồng độ Glucose máu chuột ĐTĐ typ 2

Trong 21 ngày cho uống dịch chiết, chuột được lấy máu đuôi vào các

ngày 0, 5, 10, 15, 21 để xác định nồng độ glucose máu.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu lên nồng độ glucose máu

Ngày

0 (mmol/L)

5 (mmol/L)

10 (mmol/L)

15 (mmol/L)

21 (mmol/L)

Thay đổi (%)

6,75±1,25

7,25±2,14

6,6±2,19

6,7±1,58

6,85±1,377

↑ 1,48

16,6±3,28

16,8±3,14

17,1±2,69

16,9±3,24

17,2±2,34#

↑ 3,61

Chứng sinh lý Chứng tiểu đường

15,8±2,51

16,28±2,69

15,72±3,81

13,65±3,69* ↓ 15,22

Gliclazid 16,1±2,67

15,8±3,64 15,41±2,87

13,6±3,19

14,51±2,14

13,53±3,16* ↓ 14,37

150 mg/kg

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

15,6±2,57 15,36±2,34

13,26±2,39

12,88±3,27

11,4±3,12*

↓ 26,9

300 mg/kg

*Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 1

)

L

16,6

15,8

17,2

16,1

15,6

13,65

13,53

/ l o m m

11,40

6,85

6,75

( u á m e s o c u

l g ộ đ g n ồ N

Nhóm 1

Nhóm 2

Nhóm 3

Nhóm 4

Nhóm 5

D 0 D 21

Hình 3.4. Chỉ số glucose máu của các nhóm chuột trước và sau điều trị 21 ngày

Nhận xét: Từ số liệu Bảng 3.4 và Hình 3.4 cho thấy, nhóm chứng sinh lý có nồng độ glucose máu tăng nhẹ và khá ổn định ở mức bình thường, nhóm chuột tiểu đường cũng tăng nhẹ và mức nồng độ glucose máu cao. Tất cả các nhóm chuột điều trị bằng gliclazid và hai liều khác nhau của cao chiết ethanol quả lựu đều giảm nồng độ glucose máu, nhóm điều trị bằng gliclazid giảm nhiều nhất (17,79%), tiếp đến là nhóm được điều trị bằng cao chiết ethanol liều 300 mg/kg (9,35%) và cuối cùng là liều 150 mg/kg (5,04%).

3.3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết quả lựu đối với tình trạng tăng lipid máu

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Tiến hành đánh giá sự thay đổi một số chỉ tiêu hóa sinh trong máu chuột sau khi điều trị, so sánh sự biến đổi của các chỉ số cholesterol tổng, triglycerid, HDL cholesterol, LDL cholesterol với nhóm chuột ăn thức ăn bình thường (nhóm chứng sinh lý) và nhóm chuột ăn thức ăn có hàm lượng chất béo cao (nhóm chứng tiểu đường).

Bảng 3.5. Ảnh hướng của dịch chiết quả lựu đối với các chỉ số lipid máu

Cholesterol tổng (mmol/L) 43,78±7,54

Triglycerid (mmol/L) 56,23±4,36

HDLc (mmol/L) 34,45±2,31

LDLc (mmol/L) 12,36±2,14

Chứng sinh lý

78,69±5,3#

98,34±5,17#

23,12±3,18#

37,21±2,35#

Chứng tiểu đường

36,48±5,73* 56,88±6,36* 46,39±4,35*

38,45±8,35* 62,14±8,39* 48,76±7,21*

36,31±4,21* 26,12±2,47* 32,47±5,36*

15,35±2,39* 26,14±2,37* 19,36±2,41*

Gliclazid 150 mg/kg 300 mg/kg

*Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 2; # Khác biệt có ý nghĩa so với nhóm 1

Nhận xét: Sau 21 ngày điều trị, hàm lượng cholesterol tổng, triglycerid và LDL cholesterol máu chuột ở các nhóm điều trị bằng gliclazid và cao chiết quả lựu đều giảm so với nhóm không điều trị. Nhóm chuột điều trị bằng gliclazid giảm cholesterol tổng 53,64% so với nhóm chứng tiểu đường, nhóm điều trị bằng cao chiết quả lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg giảm lần lượt 27,72% và 41,05%, sự thay đổi có ý nghĩa thống kê. Cao chiết quả lựu liều 150 mg/kg làm giảm chỉ số triglycerid 36,81% và giảm LDL cholesterol 29,75% so với nhóm chứng tiểu đường. Cao chiết liều 300 mg/kg giúp giảm chỉ số triglycerid 50,42% và giảm LDL cholesterol 47,97% so với nhóm chứng tiểu đường. Như vậy cao chiết lựu liều 300 mg/kg giúp giảm cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol tốt hơn so với liều 150 mg/kg.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

HDL cholesterol là một lipoprotein có vai trò quan trọng trong việc vận chuyển cholesterol ra khỏi máu và ngăn không cho chúng xâm nhập vào thành động mạch giúp làm giảm các nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Do đó, việc nâng hàm lượng HDL cholesterol trong máu có ý nghĩa rất quan trọng với cơ thể con người. Trong nghiên cứu này, cao chiết quả lựu 150 mg/kg có tác dụng làm tăng 11,49% và liều 300 mg/kg làm tăng 28,8% HDL cholesterol so với nhóm chứng tiểu đường.

Chương 4 - BÀN LUẬN

Bệnh ĐTĐ typ 2 đặc trưng bởi sự đề kháng insulin và suy giảm chức năng tiết insulin của các tế bào β đảo tụy. Dựa trên cơ sở này, nhiều mô hình ĐTĐ thực nghiệm đã được xây dựng theo xu hướng tạo sự đề kháng với insulin và/hoặc làm suy giảm chức năng các tế bào β đảo tụy. Nhu cầu xây dựng các mô hình này càng lớn hơn khi việc phát hiện, nghiên cứu và đánh giá tác dụng các thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc từ thiên nhiên đang trở thành một xu hướng ngày càng được chú trọng và phát triển. Có thể gây ĐTĐ typ 2 bằng nhiều phương pháp. Mỗi mô hình đều có những ưu, nhược điểm riêng trong việc gây ra ĐTĐ typ 2 và ứng dụng nó trong thực nghiệm. Nhằm đánh giá tác dụng chống tăng glucose máu và lipid máu trên chuột bị ĐTĐ typ 2, mô hình kết hợp giữa chế độ ăn giàu chất béo và sử dụng hóa chất STZ liều 120 mg/kg thể trọng chuột đã được lựa chọn. Béo phì đóng vai trò quan trọng gây nên tình trạng kháng insulin. Dựa trên cơ sở đó trong mô hình nghiên cứu này, chuột được nuôi với chế độ ăn giàu chất béo nhằm gây nên tình trạng béo phì để làm tăng khả năng kháng insulin. Sự tổn thương tế bào β đảo tụy làm giảm tiết insulin là cơ chế không thể thiếu trong bệnh sinh ĐTĐ typ 2 vì vậy cần kết hợp với tiêm STZ sau khi nuôi béo để gây tổn thương đảo tụy trên nền đề kháng insulin, gây ĐTĐ typ 2. STZ là kháng sinh tổng hợp gây tổn thương tế bào β được sử dụng nhiều trong các mô hình gây ĐTĐ. Có nhiều nghiên cứu sử dụng STZ với các mức liều khác nhau và qua đó các nghiên cứu đã thể hiện rằng mức liều khác nhau chỉ làm tổn thương tế bào β nhiều hay ít. Từ nhiều nghiên cứu của tác giả trong và ngoài nước, liều 120 mg/kg được lựa chọn trong nghiên cứu này và kết hợp với chế độ ăn giàu chất béo để gây ĐTĐ typ 2 trên chuột nhắt trắng. Mô hình được đảm bảo dựa trên cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 với chi phí thấp, dễ thực hiện và hữu ích trong các mô hình đánh giá tiền lâm sàng với các thuốc có tiềm năng điều trị ĐTĐ.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Trong mô hình nghiên cứu này, ngoài việc so sánh với nhóm chứng sinh lý và nhóm chứng tiểu đường được cho uống nước cất, còn sử dụng gliclazid làm thuốc đối chứng dương. Gliclazid thuộc thế hệ thứ hai nhóm sulfonylure được sử dụng để điều trị ĐTĐ, kích thích tế bào β sản xuất insulin do đó làm giảm nồng độ glucose trong máu, được sử dụng cho các bệnh nhân bị ĐTĐ không phụ thuộc insulin.

Kết quả thực nghiệm cho thấy: trên chuột nhắt trắng bị gây ĐTĐ typ 2, sau 21 ngày uống cao chiết lựu liều 150 mg/kg và 300 mg/kg đã gây giảm nồng độ glucose máu lần lượt là 14,37% và 26,9 % so với nhóm chứng bệnh, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05, mức liều 300 mg/kg giảm cao hơn mức hạ glucose máu của gliclazid so với nhóm chứng là 20,64%. Cho tới thời điểm này, mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu của S. Radhika và cộng sự sử dụng bột khô liều 100 mg/kg từ quả lựu cho thấy làm giảm nồng độ glucose, triglycerid, cholesterol tổng, cholesterol LDL và tăng nồng độ HDL cholesterol [43].Tuy nhiên, những bộ phận riêng lẻ của quả lựu là hạt, vỏ, và nước quả lựu đã được nghiên cứu rất nhiều. Nghiên cứu của Das AK và cộng sự cho thấy rằng chuột bị gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ sau khi cho uống chiết xuất methanol hạt lựu liều 150 mg/kg, 300 mg/kg và 600 mg/kg đều đạt được mức giảm gần 10% so với nhóm đối chứng được cho uống thuốc kiểm soát đường huyết là chlorpropamid. Một nghiên cứu khác trên bộ phận dùng là vỏ đã được Das AK và cộng sự nghiên cứu đánh giá khả năng làm giảm glucose máu trên chuột ĐTĐ typ 2. Sau 4 tuần sử dụng chiết xuất nước vỏ quả lựu liều 430 mg/kg, nồng độ glucose máu được đánh giá là giảm 57,14% so với nhóm chuột bị tiểu đường [13]. Vỏ quả lựu còn được đánh giá tác dụng hạ glucose huyết liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể trọng trên chuột cống trắng chủng Wistar. Kết quả nghiên cứu báo cáo liều 200 mg/kg chiết xuất vỏ làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết từ ngày thứ 7. Mức giảm đường huyết trung bình lần lượt của chiết xuất vỏ 100 mg/kg, 200 mg/kg và thuốc đối chứng dương glibenclamide lần lượt là 20,03%, 42,75% và 51,33% [49].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Với nhóm chuột được điều trị, dịch chiết lựu có khả năng làm giảm nồng độ glucose huyết có thể là do có chứa hàm lượng cao các hợp chất phenolic. Vishal Jain và cộng sự đã phân lập thành công và đánh giá hoạt động chống ĐTĐ của các thành phần hóa học từ vỏ quả lựu bao gồm cả in vitro và in vivo. Họ đã phân lập được axit valoneic dilactone trong dịch chiết với dung môi methanol và đánh giá khả năng ức chế aldose reductase, α - amylase và PTP1B (Protein tyrosine phosphatase 1B) trong ống nghiệm. Kết quả đã cho thấy hoạt động chống đái tháo đường mạnh trong các thử nghiệm ức chế α - amylase, aldose reductase và PTP1B với các giá trị IC50 lần lượt đạt 0,284; 0,788; 12,41 µg/mL [26]. Hơn nữa trong mô hình tiểu đường in vivo, cả chiết xuất vỏ lựu và

axit valoneic dilactone đều cho thấy sự bảo vệ đối với mô tụy bị gây độc bởi alloxan.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Các chỉ số lipid máu đã được xác định là đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của ĐTĐ. Mức độ lipid máu thường tăng cao ở bệnh nhân ĐTĐ và được đánh giá như một yếu tố nguy cơ của bệnh tim mạch. Do đó trong nghiên cứu này, các chỉ số lipid máu sau khi chuột được điều trị cũng là thông số được xác định. Sau 21 ngày uống cao chiết liều 150 mg/kg và 300 mg/kg, các chỉ số cholesterol tổng, LDL cholesterol, triglycerid trong huyết thanh chuột đều giảm so với nhóm chứng tiểu đường (p<0,05) và chỉ số HDL cholesterol tăng so với nhóm chứng tiểu đường (p<0,05). Cho đến nay trên thế giới chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu tác dụng của toàn bộ quả lựu lên các chỉ số lipid máu. Nghiên cứu của Salwe KJ báo cáo rằng chiết xuất vỏ quả lựu liều 200 mg/kg giúp làm giảm đáng kể cholesterol tổng, triglycerid và còn gia tăng đáng kể HDL cholesterol [49]. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Esmaillzadeh A và cộng sự thực hiện trên đối tượng là bệnh nhân ĐTĐ typ 2 cho thấy sử dụng nước ép quả lựu 40 g/ngày trong 8 tuần làm giảm đáng kể cholesterol tổng, LDL cholesterol, tỷ lệ LDL/HDL và tỷ lệ cholesterol tổng/HDL nhưng không có sự thay đổi đáng kể nồng độ triacylglycerol và HDL cholesterol trong huyết thanh [15].

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận

Xuất phát từ 2 mục tiêu nghiên cứu ban đầu, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu và kết quả thực nghiệm đưa đến các kết luận sau:

- Đã tạo được mô hình chuột ĐTĐ typ 2 trên nền chuột béo phì thực nghiệm: sau 8 tuần nuôi trọng lượng cơ thể của chuột béo phì tăng lên so với chuột bình thường. Những con chuột đủ tiêu chuẩn có trọng lượng trên 40 mg được tiêm STZ liều 120 mg/kg. Sau 10 ngày tiêm STZ, mô hình gây ĐTĐ typ 2 đã thành công với nồng độ glucose máu lúc đói đạt trên 10 mmol/L.

- Sau 21 ngày chuột ĐTĐ typ 2 được điều trị bằng cao chiết quả lựu với 2 mức liều 150 mg/kg và 300 mg/kg, thể trọng chuột và các chỉ số hóa sinh: glucose, cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol trong máu đều biểu hiện giảm trong khi đó cao chiết lựu giúp làm tăng HDL cholesterol.

- Cao chiết ethanol quả lựu với mức liều 300 mg/kg có khả năng làm giảm glucose máu tốt ở chuột ĐTĐ typ 2 sau 21 ngày điều trị với mức giảm là 26,9% trong khi đó điều trị bằng thuốc gliclazide khả năng giảm là 15,22%.

- Cao chiết ethanol quả lựu với mức liều 300 mg/kg có khả năng làm giảm cholesterol tổng, triglycerid, LDL cholesterol lần lượt là 41,05%; 50,42%; 47,97% so với nhóm chứng tiểu đường.

Đề xuất

Từ những kết quả nghiên cứu như trên, nhóm nghiên cứu đưa ra đề xuất

- Cần tiếp tục nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn về thành phần hóa học của các hợp chất tự nhiên có trong quả lựu, đặc biệt là xác định thành phần và cấu trúc hóa học của các hợp chất từ phân đoạn cao tổng ethanol quả lựu có hiệu quả chống tăng glucose máu và lipid máu ở chuột ĐTĐ typ 2.

- Tiếp tục nghiên cứu liều lượng điều trị tối ưu của các phân đoạn dịch chiết khác xuất phát từ cao tổng ethanol trên mô hình chuột béo phì và đái tháo đường.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

như sau:

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 191-196.

[2] Bệnh viện Nội tiết Trung ương (2013), Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động của Dự án phòng chống đái tháo đường quốc gia năm 2012 và triển khai kế hoạch năm 2013.

[3] Nguyễn Thị Đông (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết phân đoạn cloroform thân cây ý dĩ trên động vật thực nghiệm", luận văn tốt nghiệp thạc sĩ.

[4] Phùng Thanh Hương và Nguyễn Xuân Thắng (2010), "Tác dụng hạn chế tăng glucose huyết của thân cây Mướp đắng trên một số mô hình gây tăng glucose huyết thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 1, 22-25.

[5] Đỗ Tất Lợi (2007), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản

Y học.

[6] Đỗ Trung Quân (2007), Đái tháo đường và điều trị, Nhà xuất bản y học, Hà

Nội.

[7] Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung và Nguyễn Thanh Thủy (2006), "Sơ bộ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cây Chuối hột (Musa balbisiana Colla.) trên chuột thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 5, 8-10.

[8] American Diabetes Association (2017), "Standards of Medical Care in

Diabetes", 40(1), 11-75.

[9] Arulmozhi DK, Veeranjaneyulu A and Bodhankar SL (2004), "Neonatal streptozotocin-induced rat model of Type 2 diabetes mellitus: A glance", Indian Journal of Pharmacology, 36(4), 217.

[10] Aviram M and Dornfeld L (2001), "Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure", Atherosclerosis, 158(1), 195-198.

[11] Aviram M, Dornfeld L, Rosenblat M, Volkova N, Kaplan M, Coleman R, Hayek T, Presser D and Fuhrman B (2000), "Pomegranate juice consumption reduces oxidative stress, atherogenic modifications to LDL, and platelet aggregation: studies in humans and in atherosclerotic apolipoprotein E–deficient mice", The American journal of clinical nutrition, 71(5), 1062-1076.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[12] Braga LC, Leite AA, Xavier KGS, Takahashi JA, Bemquerer MP, Chartone-Souza E and Nascimento AM (2005), "Synergic interaction between pomegranate extract and antibiotics against Staphylococcus aureus", Canadian journal of microbiology, 51(7), 541-547.

[13] Das AK, Mandal SC, Banerjee SK, Sinha S, Saha BP and Pal M (2001), "Studies on the hypoglycaemic activity of Punica granatum seed in streptozotocin induced diabetic rats", Phytother Res, 15(7), 628-9. [14] El-Nemr S. E., Ismail I. A. Ragab M. (1990), "Chemical composition of

juice and seeds of pomegranate fruit", Food / Nahrung, 34(7), 601-606.

[15] Esmaillzadeh A, Tahbaz F, Gaieni I, Alavi-Majd H and Azadbakht L (2006), "Cholesterol-lowering effect of concentrated pomegranate juice consumption in type II diabetic patients with hyperlipidemia", Int J Vitam Nutr Res, 76(3), 147-51.

[16] Fadavi A, Barzegar M and Azizi MH (2006), "Determination of fatty axits and total lipid content in oilseed of 25 pomegranates varieties grown in Iran", Journal of Food Composition and Analysis, 19(6-7), 676-680. [17] Fischer UA, Carle R and Kammerer DR (2011), "Identification and quantification of phenolic compounds from pomegranate (Punica granatum L.) peel, mesocarp, aril and differently produced juices by HPLC-DAD–ESI/MSn", Food chemistry, 127(2), 807-821.

[18] Gaig P, Bartolome B, Lleonart R, García‐Ortega P, Palacios R and Richart C (1999), "Allergy to pomegranate (Punica granatum)", Allergy, 54(3), 287-288.

[19] Gil MI, Tomás-Barberán FA, Hess-Pierce B, Holcroft DM and Kader AA (2000), "Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing", Journal of Agricultural and Food chemistry, 48(10), 4581-4589.

[20] Gómez-Caravaca AM, Verardo V, Toselli M, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A MF Caboni (2013), "Determination of the major phenolic compounds in pomegranate juices by HPLC–DAD–ESI-MS", Journal of agricultural and food chemistry, 61(22), 5328-5337.

cytochrome p450 3A (CYP3A) and

[21] Hidaka M, Okumura M, Fujita K, Ogikubo T, Yamasaki K, Iwakiri T, Setoguchi N and Arimori K (2005), "Effects of pomegranate juice on human carbamazepine pharmacokinetics in rats", Drug metabolism and disposition,

[22] Hontecillas R, Diguardo M, Duran E, Orpi M and Bassaganya-Riera J (2008), "Catalpic axit decreases abdominal fat deposition, improves glucose homeostasis and upregulates PPAR alpha expression in adipose tissue", Clinical nutrition, 27(5), 764-772.

[23] Hontecillas R, O'Shea M, Einerhand A, Diguardo M and Bassaganya- Riera J (2009), "Activation of PPAR γ and α by Punicic Axit Ameliorates mGlucose Tolerance and Suppresses Obesity-Related Inflammation", Journal of the American College of Nutrition, 28(2), 184-195.

[24] Hui H, Tang G and Go VLW (2009), "Hypoglycemic herbs and their

action mechanisms", Chin Med, 4(1), 11-14.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[25] International Diabetes Foudation, Diabetes Atlas Eighth Edition, 2017.

[26] Jain V, Viswanatha GL, Manohar D and Shivaprasad HN (2012), "Isolation of Antidiabetic Principle from Fruit Rinds of Punica granatum", Evid Based Complement Alternat Med, 2012.

[27] Junod ALAEOLPRCAERAE, Lambert AE, Orci L, Pictet R, Gonet AE and Renold AE (1967), "Studies of the diabetogenic action of streptozotocin", Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 126(1), 201-205.

[28] Kanatt SR, Chander R and Sharma A (2010), "Antioxidant and antimicrobial activity of pomegranate peel extract improves the shelf life of chicken products", International journal of food science & technology, 45(2), 216-222.

[29] Khalil and Enas AM (2004), "Antidiabetic effect of an aqueous extract of Pomegranate (Punica granatum L.) peels in normal and alloxan diabetic rats", The Egyptian Journal of Hospital Medicine, 16(1), 92-99.

[30] Ktorza A, Bernard C, Parent V, Pénicaud L, Froguel P, Lathrop M and Gauguier D (1997), "Are animal models of diabetes relevant to the study of the genetics of non-insulin-dependent diabetes in humans?", Diabetes & metabolism, 23, 38-46.

[31] Kumar S, Singh R, Vasudeva N and Sharma S (2012), "Acute and chronic animal models for the evaluation of anti-diabetic agents", Cardiovascular Diabetology, 11(1), 9.

[32] Lansky EP, Jian W, Mo H, Bravo L, Froom P, Yu W, Harris NM, Neeman I and Campbell MJ (2005), "Possible synergistic prostate cancer suppression by anatomically discrete pomegranate fractions", Invest New Drugs, 23(1), 11-20.

[33] Lee CJ, Chen LG, Liang WL and Wang CC (2010), "Anti-inflammatory effects of Punica granatum Linne in vitro and in vivo", Food chemistry, 118(2), 315-322.

[34] Lenze S (2008), "The mechanisms of alloxan-and streptozotocin-induced

diabetes", Diabetologia, 51(2), 216-226.

[35] Li Y, Guo C, Yang J, Wei J, Xu J and Cheng S (2006), "Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract", Food chemistry, 96(2), 254-260.

[36] McIntosh CHS and Pederson RA (1999), "Noninsulin-dependent animal models of diabetes mellitus", Experimental models of diabetes, 337-398. [37] Menezes SMS, Cordeiro LN and Viana GSB (2006), "Punica granatum (pomegranate) extract is active against dental plaque", Journal of herbal pharmacotherapy, 6(2), 79-92.

[38] Neurath AR, Strick N, Li YYand Debnath AK (2004), "Punica granatum (Pomegranate) juice provides an HIV-1 entry inhibitor and candidate topical microbicide", BMC Infectious diseases, 4(1), 41.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[39] Orwa et al (2009), "Agroforestry Database 4.0",

[40] Özgül-Yücel S (2005), "Determination of conjugated linolenic axit content of selected oil seeds grown in Turkey", Journal of the American Oil Chemists' Society, 82(12), 893-897.

[41] Oztürk Y, Altan VM and Yildizoğlu-Ari N (1996), "Effects of experimental diabetes and insulin on smooth muscle functions", Pharmacological reviews, 48(1), 69-112.

[42] Pellegrino M, Christopher B, Michelle M and Gerard R (1998), "Development of a new model of type II diabetes in adult rats administered with streptozotocin and nicotinamide", Diabetes, 47, 224- 229.

[43] Radhika S, Smila KH and Muthezhilan R (2011), "Antidiabetic and Hypolipidemic Activity of Punica granatum Linn on Alloxan Induced Rats ", 6(4), 178-182.

[44] Rasheed Z, Akhtar N, Anbazhagan AN, Ramamurthy S, Shukla M TM and Haqqi (2009), "Polyphenol-rich pomegranate fruit extract (POMx) suppresses PMACI-induced expression of pro-inflammatory cytokines by inhibiting the activation of MAP Kinases and NF-κB in human KU812 cells", Journal of inflammation, 6(1), 1.

[45] Rees DA and Alcolado JC (2005), "Animal models of diabetes mellitus",

Diabetic medicine, 22(4), 359-370.

[46] Rerup CC (1970), "Drugs producing diabetes through damage of the insulin secreting cells", Pharmacological reviews, 22(4), 485-518. [47] Rocha A, Wang L, Peniche M and Martins-Green M (2012), "Pomegranate juice and specific components inhibit cell and molecular processes critical for metastasis of breast cancer", Breast Cancer Res Treat, 136(3), 647-58. [48] Rosenblat M, Hayek T and Aviram M (2006), "Anti-oxidative effects of pomegranate juice (PJ) consumption by diabetic patients on serum and on macrophages", Atherosclerosis, 187(2), 363-371.

[49] Salwe KJ, Sachdev DO, Bahurupi Y and Kumarappan M (2015), "Evaluation of antidiabetic, hypolipedimic and antioxidant activity of hydroalcoholic extract of leaves and fruit peel of Punica granatum in male Wistar albino rats", Journal of natural science, biology, and medicine, 6(1), 56.

[50] Seeram NP, Adam LS, Henning SM, Niu Y, Zhang Y, Nair MG and Heber D (2005), "In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic axit and a total pomegranate tanin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice", The Journal of nutritional biochemistry, 16(6), 360-367.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[51] Soroki AV, Duncan B, Panetta R and Thompson PD (2006), "Rhabdomyolysis associated with pomegranate juice consumption", The American journal of cardiology, 98(5), 705-706.

[52] Squillaci G Maggio G and Di (1946), "Acute morbidity and mortality from decoctions of the bark of Punica granatum", Bollettino Societa Italiana Biologia Sperimentale, 1946, 1095-1096.

[53] Sreeja S, Kumar TR Santhosh, Lakshmi BS and Sreeja S (2012), "Pomegranate extract demonstrate a selective estrogen receptor modulator profile in human tumor cell lines and in vivo models of estrogen deprivation", The Journal of Nutritional Biochemistry, 23(7), 725-732. [54] Sumner MD, Elliott-Eller M, Weidner G, Daubenmier JJ, Chew MH, Marlin R, Raisin CJ and Ornish D (2005), "Effects of pomegranate juice consumption on myocardial perfusion in patients with coronary heart disease", The American journal of cardiology, 96(6), 810-814.

[55] Tabák AG, Herder C, Rathann W and Brunner EJ (2012), "Prediabetes: a high-risk state for diabetes development", The Lancet, 379(9833), 2279- 2290.

[56] Tzulker R, Glazer I, Bar-Ila I, Holland M D, Aviram M and Amir R (2007), "Antioxidant activity, polyphenol content, and related compounds in different fruit juices and homogenates prepared from 29 different pomegranate accessions", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(23), 9559-9570.

[57] Vasconcelos LCDS, Sampaio FC, Sampaio MCC, Pereira MDSV, Higino JS and Peixoto MHP (2006), "Minimum inhibitory concentration of adherence of Punica granatum Linn (pomegranate) gel against S. mutans, S. mitis and C. albicans", Brazilian Dental Journal, 17(3), 223-227. [58] Vida A, Fallarero A, Peña BR, Medina ME, Gra B, Rivera F and Gutierrez Y (2003), "Studies on the toxicity of Punica granatum L.(Punicaceae) whole fruit extracts", Journal of ethnopharmacology, 89(2-3), 295-300.

[59] Vroegrijk IO, Diepen JA van, Berg S van den, Westbroek I, Keizer H, Gambelli L, Raque l Hontecillas, Bassaganya-Riera J, Zondag GC, Romijn JA, Havekes LM and Voshol PJ (2011), "Pomegranate seed oil, a rich source of punicic axit, prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice", Food and Chemical Toxicology, 49(6), 1426-1430.

[60] Wadkar KA, Magdum CS, Patil SS and Naikwade NS (2008), "Antidiabetic potential and Indian medicinal plants", J Herbal Med and Toxicol, 2(1), 45-50.

[61] Wang L, Li W, Lin M, Garcia M, Mulholland D, Lilly M and MartinsGreen M (2014), " Luteolin, ellagic axit and punicic axit are natural products that inhibit prostate cancer metastasis. Carcinogenesis", Carcinogenesis 35(10), 2321–2330.

[62] Weiss RB (1982), "Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy,

and toxicity", Cancer treatment reports, 66(3), 427-438.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[63] Young DA, Ho RS, Bell PA, Cohen DK, McIntosh RH, Nadelson J and Foley JE (1990), "Inhibition of hepatic glucose production by SDZ 51641", Diabetes, 39(11), 1408-1413.

[64] https://3fatpigs.co.uk/punica-granatum-dente-di-cavallo-pomegranate-in-

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

2l-pot-tasty-fruit/ Ngày truy cập 05/05/2019