LỜI CẢM ƠN
Kết thúc bốn năm học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học,
trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, đƣợc sự cho phép của nhà trƣờng em đã
có thể tiến hành làm khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết flavonoid lá
cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb)”.
Để có thể hoàn thành tốt bài luận này không thể không kể đến sự giúp sức
của quý Thầy Cô đang công tác và giảng dạy tại Viện Công nghệ Sinh học,
trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, gia đình cũng nhƣ bạn bè đã ở bên, đồng
hành và ủng hộ em trong suốt quãng thời gian dài.
Lời đầu tiên, cho phép em đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc và chân thành nhất
đến cô giáo trực tiếp hƣớng dẫn khóa luận - Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng
ngƣời Thầy khoa học đã định hƣớng và tận tình chỉ bảo, đã truyền đạt cho em
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong cách nghĩ, các tiếp cận và cách
giải quyết vấn đề, tác phong làm việc, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập
tốt nghiệp và hoàn thành khoá luận này.
Em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô giáo và chị Nguyễn
Thị Hồng Nhung của Bộ môn Công nghệ Vi sinh Hóa sinh đã hỗ trợ và tạo mọi
điều kiện về trang thiết bị, điều kiện thực nghiệm một cách tốt nhất để em có thể
hoàn thành khóa luận này.Đƣợc sự chỉ bảo tận tình của ThS. Nguyễn Thị Thu
Hằng và các Thầy Cô trong Viện cùng với sợ nỗ lực của bản thân đã cố gắng để
hoàn thiện luận văn này, song kiến thức,kinh nghiệm của em còn hạn chế ,vậy
nên bản báo cáo khoa học này không tránh đƣợc những sai sót, nhƣng mong các
thầy cô đóng góp ý kiến đánh giá, để bản báo cáo của em đƣợc hoàn thiện hơn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... v
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................ 2
1.1. Giới thiệu về cây Diếp cá ............................................................................... 2
1.1.1. Khái quát chung về cây Diếp cá .................................................................. 2
1.1.2. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật ................................................................. 2
1.1.3. Thành phần hóa học .................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về flavonoid ................................................................................. 8
1.2.1. Khái niệm .................................................................................................... 8
1.2.2. Cấu trúc chung và phân loại ....................................................................... 8
1.2.3. Tính chất lý hóa ......................................................................................... 14
1.2.4. Tính chất sinh học của flavonoid .............................................................. 14
1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các chất flavonoid ................ 17
1.3.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất trên thế giới ....................... 17
1.3.2. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất ở trong nƣớc. ..................... 17
PHẦN 2 NỘI DUNG MỤC TIÊU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 18
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 18
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 18
2.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 18
2.3.1. Vật liệu thực vật ........................................................................................ 18
2.3.2. Vật liệu vi sinh vật .................................................................................... 19
2.3.3.Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ................................................................. 19
2.4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu ........................................................ 19
2.4.1 Thiết bị ....................................................................................................... 19
ii
2.4.2 Dụng cụ ...................................................................................................... 19
2.4.3 Hóa chất ...................................................................................................... 20
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 20
2.5.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá ................. 20
2.5.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết .............................................................. 21
2.5.3. Xác định loại alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết .......................... 22
2.5.4. Xác định nồng độ dung môi ...................................................................... 22
2.5.5. Tách chiết hợp chất flavonoid theo phƣơng pháp trích ly ........................ 23
2.5.6. Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết................................... 24
2.5.7. Định tính flavonoid bằng phƣơng pháp chạy sắc ký ................................ 25
2.5.8. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoidchiết xuất từ lá .......... 26
PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 27
3.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá Diếp cá ............................ 27
3.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết ................................................................. 28
3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết ............................ 29
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích
ly theo phƣơng pháp ngâm chiết. ........................................................................ 30
3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol ................................. 30
3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol 32
3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol. ............. 34
3.5. Định tính các chất Flavonoid có trong nguyên liệu bằng các phản ứng hóa
học. ...................................................................................................................... 35
3.6. Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng .................................................. 36
3.7. Khả năng kháng khuẩn của cao flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá ............. 38
PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 40
4.1 Kết luận ......................................................................................................... 40
4.2 Kiến nghị ....................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cây Diếp cá ................................................... 3
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của lá Diếp cá .............................................. 27
Bảng 3.2 Kết quá xác định phƣơng pháp tách chiết ........................................... 28
Bảng 3.3 Kết quả đo OD của các loại Alcohol ................................................... 29
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất
trích ly flavonoid ................................................................................................. 31
Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi
ethanol đến hiệu suất trích ly .............................................................................. 32
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến
hiệu suất trích ly .................................................................................................. 34
Bảng 3.7. Kết quả định tính nhóm chất flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá ........ 36
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng của một số chủng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết
lá Diếp cá ............................................................................................................. 39
iv
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hoa và lá của cây Diếp cá ..................................................................... 2
Hình 1.3. Thành phần alkaloid trong Diếp cá ....................................................... 7
Hình 1.4. Cấu trúc của flavonoid .......................................................................... 8
Hình 1.5. Cấu trúc của Anthocyanidin .................................................................. 9
Hình 1.6. Cấu trúc của Flavan 3-ol ....................................................................... 9
Hình 1.7. Cấu trúc của Flavan 3,4-diol ............................................................... 10
Hình 1.8. Cấu trúc của Flavanon ......................................................................... 10
Hình 1.9. Cấu trúc của 3- Hydroxyflavanon ....................................................... 11
Hình 1.10. Cấu trúc của flavon ........................................................................... 11
Hình 1.11. Cấu trúc của flavonol ........................................................................ 12
Hình 1.12. Cấu trúc của chalcon ......................................................................... 12
Hình 1.13. Cấu trúc của Dihydrochalcon ............................................................ 12
Hình 1.14. Cấu trúc của Auron ........................................................................... 13
Hình 2.1 Hình ảnh lá và bột lá của cây Diếp Cá ................................................. 18
Hình 3.1. Lá Diếp cá và bột lá Diếp cá .............................................................. 28
Hình 3.2 Dịch chiết các loại Alcohol .................................................................. 29
Hình 3.3. Flavonoid thô thu đƣợc sau khi tách chiết .......................................... 30
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly
flavonoid .............................................................................................................. 31
Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến hiệu
suất trích ly flavonoid .......................................................................................... 33
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất trích
ly flavonoid.......................................................................................................... 35
Hình 3.7. Kết quả định tính flavonoid trích ly từ lá Diếp Cá ............................. 36
Hình 3.8. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của flavonoid quan sát dƣới ánh sáng
thƣờng (A) và ánh sáng tử ngoại (B) .................................................................. 37
Hình 3.9. Hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của flavonoid ....... 38
v
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới với nguồn dƣợc liệu phong
phú và đa dạng. Hệ thực vật Việt Nam có trên 10000 loài trong đó có khoảng
3200 loài cây thuốc. Thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu đƣợc
trong cuộc sống. Từ xa xƣa cho đến hiện nay,con ngƣời đã biết sử dụng các cây
cỏ vào điều trị bệnh. Mặc dù các loại thuốc tây y chiếm một phần lớn trong
phƣơng pháp điều trị nhƣng thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc vẫn đứng một vị trí hết
sức quan trọng. Trên thế giới, nguồn thực vật vô cùng phong phú và là
đối tƣợng nghiên cứu của rất nhiều tác giả trong mục đích tìm kiếm chất mới có
hoạt tính sinh học cũng nhƣ tìm ra các nguyên liệu chữa bệnh. Việc nghiên cứu
thuốc ở nƣớc ta những năm gần đây đã có nhiều bƣớc phát triển. Nghiên cứu
thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật giúp các nhà khoa
học tìm hiểu sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn dƣợc liệu sẵn có đồng thời
góp phần thúc đẩy ngành công nghiệp hóa dƣợc trong nƣớc phát triển, khoa học
hóa nền Y học Cổ truyền. Diếp cá là một loại thực vật đƣợc trồng rất phổ biến ở
Việt Nam và một số nƣớc châu Á. Trong đông y, Diếp cá đƣợc sử dụng trong các
bài thuốc để trị bệnh trĩ, mụn nhọt, lên sởi, đau mắt [12]. Diếp cá là đối tƣợng
nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau và đã đƣợc báo cáo là có khả năng kháng
khuẩn, kháng viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch do chứa nhiều thành phần có
hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là các hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhƣ rutin,
quercetine [6].
Các hợp chất có hoạt tính sinh học hiện nay đƣợc nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt
hƣớng tách chiết chúng từ các loại cây cỏ, thảo dƣợc và ứng dụng vào trong y
học. Từ thực tế đó khóa luận tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết
hợp chất flavonoid của lá cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb”. là một hƣớng
nghiên cứu cần thiết
1
PHẦN 1
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu về cây Diếp cá
1.1.1. Khái quát chung về cây Diếp cá
Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, lá Giấp, Ngƣ tinh thảo.
Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb.
Giới: Plantae
Bộ: Piperales
Họ: Saururacea
Chi: Houttuynia
Loài: Houttuynia Cordata
1.1.2. Nguồn gốc và đặc điểm thực vật
Diếp cá là một loại cây thảo, sống lâu năm, cao 20 – 40cm, thân ngầm,
mọc bò ngang trong đất, màu trắng, hơi có lông, bén rễ ở các mấu. Thân đứng,
nhẵn, màu lục hoặc tím đỏ. Lá Diếp cá mọc so le hình tim, đầu nhọn, mặt trên
màu lục sẫm, mặt dƣới màu tím, hơi có lông dọc theo gân lá của cả hai mặt, gân
chính 7; cuống lá dài, có bẹ, lá kèm có lông ở mép. Cụm hoa hình bông dài 2 –
2,5cm, mọc ở ngọn thân, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt; dài 4-6cm, rộng
3-4cm, có 5-7 gân gốc [3].
Hình 1.1. Hoa và lá của cây Diếp cá
2
Hoa Diếp cá nở vào tháng 5 – 8, cụm hoa hình bông dài 2,5cm bao bởi 4
lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Cây Diếp cá có toàn
bộ bề ngoài của cụm 4 hoa và lá bắc giống nhƣ một cái hoa đơn độ và quả nang
mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn.
Diếp cá phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn Độ, các
nƣớc Đông Dƣơng và Indonesia. Ở Việt Nam cây mọc rất phổ biến, thƣờng gặp
mọc hoang nơi ẩm ƣớt trên các bãi ven suối, bờ sông. Diếp cá là loại rau rất
quen thuộc trong các bữa ăn hàng ngày của các gia đình Việt Nam, thƣờng dùng
làm rau ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác [3].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của Diếp cá gồm có : flavonoid, tinh dầu, alkaloid và
một số thành phần khác [2, 6]
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cây Diếp cá
Hàm lƣợng STT Thành phần hóa học (trong 100g)
1 Nƣớc 91,5g
2 Protid 2,9g
3 Glucid 2,7g
4 Lipit 0,5g
5 cellulose 1,8g
6 Dẫn suất không protein 2,2g
7 Kháng toàn phần 1,1g
8 Vitamin C 68mg
9 Carotene 1,26mg
10 Kali 0,1mg
11 Calcium 0,3mg
3
Flavonoid
Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú. Các flavonoid
đang chú ý trong Diếp cá có thể kể đến nhƣ quercetin, quercetrin, isoquercetrin
ngoài ra còn một số flavonoid cũng không kém phần quan trọng
-quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid
- quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid
- kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosid
- phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid (phloridzin)
- quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin)
- quercetin-3-O- β-D-galactopyranosid (hyperin)
4
Hình 1.2. Thành phần flavonoid trong Diếp cá
Tinh dầu
Thành phần chủ yếu của tinh dầu Diếp cá là các nhóm aldehyd và các dẫn
xuất ceton nhƣ methyl n-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá khi vò có mùi
tanh), L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen,
camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol and caryophylen.
Ngoài ra, tinh dầu còn chứa acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid
hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic,
aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K [10]. Một số công bố gần đây
cho thấy thành phần và hàm lƣợng tinh dầu Diếp cá khác nhau tuỳ theo nguồn
gốc và quá trình phơi sấy khô:
5
- Tinh dầu Diếp cá khô mọc tại miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, trong
đó có 4 hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồm β-pinen (3,15%), 2-undecanon
(15,15%), propen 1-methoxy-2 methyl (12,12%), 1R-α-pinen (11,03%). Tinh
dầu Diếp cá tƣơi có 34 thành phần, và hàm lƣợng tinh dầu trong Diếp cá tƣơi
gấp 4,3 lần hàm lƣợng tinh dầu trong Diếp cá khô [7].
- Tinh dầu Diếp cá mọc tại miền Nam có 19 hợp chất trong đó thành phần
chủ yếu là 2(10) – pinen, (1S, 5S)-(-) (82,84%); ocimen (6,15%); keton methyl
nonyl (6,44%) [5].
- Diếp cá tƣơi mọc tại Trung Quốc có 38 thành phần, trong khi đó thành
phần tinh dầu trong Diếp cá khô chỉ có 22 hợp chất: β-mycen (3,47%), L-
nonanol (6,21%), α-terpineol (13,24%), methyl nonyl keton (35,2%), bornyl
acetat (5,52%), n-decanoic acid (10,58%), caryophyllen (3,41%), docosanoic
acid ethyl ester (5,34%) [13].
Alkaloid
Một số alkaloid có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy trong cây Diếp cá là:
aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion
A, cepharadion B, splendidin [15]. aristolactam A aristolactam B piperolactam
A norcepharadion B cepharadion A cepharadion B splendidin [15].
6
Hình 1.3. Thành phần alkaloid trong Diếp cá
7
1.2. Tổng quan về flavonoid
1.2.1. Khái niệm
Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên thƣờng gặp trong thực vật, tạo màu
cho rất nhiều loại rau, hoa và quả.
Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là
1,3diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen (vòng A và B) nối với nhau qua một
mạch 3 carbon (vòng pyron - vòng C). Phần lớn flavonoid có màu vàng nhạt,
một số có mà đỏ, xanh tía và các dạng không màu [8].
Hình 1.4. Cấu trúc của flavonoid
1.2.2. Cấu trúc chung và phân loại
Dựa trên mức độ oxy hóa của mạch 3 C và vị trí của gốc aryl (vòng B)
liên kết với vòng benzopyrano chia flavonoid thành các loại khác nhau nhƣ:
Flavonoids (2- phenylbenzopyrans): gồm có các nhóm phụ flavan, flavan
3ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone,
flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone.
Isoflavonoid (3-benzopyrans) gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-
ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thƣờng gặp nhất là isoflavon trong cây họ
đậu.
Neoflavonoid (4- benzopyrans) gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4-
arylcoumarin, dalbergion. .
Ngoài ra các nhà khoa học còn phân loại flavonoid thành flavonoid,
biflavonoid (những flavonoid dimer), triflavonoid (cấu tạo bởi 3 monomer
flavonoid) và flavonlignan (những flavonoid mà phân tử có cấu trúc lignan.
8
1.2.2.1. Flavonoids
Anthocyanidin: hay 2 phenylbenzopyrilium đây cũng là sắc tố phổ biến
trong thực vật.Trong cây các sắc tố này đều ở dạng glycoside
(anthocyanin=anthocyanosid) nằm trong dịch tế bào. Khi đun anthocyanin trong
dung dịch HCl 20% thì phần đƣờng trong phân tử (thƣờng nối vào OH ở C-3) bị
cắt và cho phần aglycon đƣợc gọi là anthocyanidin. Ở trong dung dịch acid (pH
1-4) tạo muối có màu đỏ, ở môi trƣờng kiềm (pH>6) là anion cũng tạo đƣợc
muối với các chất kiềm có màu xanh. Dung dịch anthocyanidin mất màu bởi
bisulfit kiềm và dễ bị oxi hóa nên ít đƣợc dùng làm phẩm màu [2, 8, 12].
Hình 1.5. Cấu trúc của Anthocyanidin
Flavan 3-ol: tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có những
dẫn chất flavan 3-ol khác nhau. Catechin, gallocatechin và những đồng phân của
chúng là những dẫn chất của flavan 3-ol nhiều trong thực vật nhƣ cây diếp cá.
Hình 1.6. Cấu trúc của Flavan 3-ol
Các nhà khoa học đã xác định đƣợc những dẫn xuất của flavan 3-ol ở
dạng dimer, trimer, tetramer, pentamer và đƣợc gọi là tannin, thƣờng có trong
loại trà Camellia sinensis CV.viridis [3–5, 15].
9
Flavan 3,4-diol: các dẫn chất flavan 3,4-diol đều không màu, có tính
quang hoạt, khi đun sôi với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ.
Vì dễ bị oxi hóa và trùng hợp nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn.
Phần lớn chúng thƣờng ở dạng dimmer. Các đơn phân đƣợc xác định bằng cách
chuyển thành các dẫn chất anthocyanidin tƣơng ứng [ 2, 8, 25 ].
Hình 1.7. Cấu trúc của Flavan 3,4-diol
Flavanon: flavanon là những chất không màu nhƣng khi làm phản ứng
cyaniding thì cho màu rõ hơn flavon, ngoài ra flavanon có điểm chảy thấp hơn
flavon tƣơng ứng, dựa vào đây có thể sơ bộ nhận biết. Nhóm này thƣờng có
nhiều trong cây cam thảo (liquiritin và isoliquiritin). Hesperidin, naringin là
những flavanon gặp nhiều trong một số vỏ cây Citrus. Naringin có vị đắng bằng
1/5 quinin, tuy nhiên aglycon thì không đắng ngoài ra nếu thay đƣờng
neohesperidose bằng đƣờng rutinose thì lại mất vị đắng. Nếu mở vòng C của
naringin để tạo thành chalcon rồi hydrogen hóa tạo thành dihydro chalcon thì
dẫn chất này có vị ngọt bằng saccharin [11, 15, 20].
Hình 1.8. Cấu trúc của Flavanon
10
3- Hydroxyflavanon (dihydroflavanol = flavanonol): có 2 carbon bất đối ở
C2 và C3. Phần lớn dihyroflavonol ở dạng aglycon, cũng có một số ở dạng
glycoside. Dihydroflavonol khó phân lập vì kém bền, dễ bị oxi hóa. Trong đó có
dẫn chất của taxifolin hay gặp nhất [3-5].
Hình 1.9. Cấu trúc của 3- Hydroxyflavanon
Flavon: có cấu trúc 2 vòng benzen A và B, với vòng B gắn vào vòng C
(pyran) tại vị trí C2, có nối đôi ở vị trí 2-3. Các dẫn chất flavon rất phổ biến
trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt. Chỉ tính đến các flavon có
nhóm thế OH và/ hoặc OCH3 đã có tới hơn 300 chất. Chất flavon đơn giản nhất
không có nhóm thế đã đƣợc phân lập từ cây anh thảo (Primula). Hai flavon hay
gặp nhất trong cây là apigenin và lutelin.
Hình 1.10. Cấu trúc của flavon
Flavonol (flavon 3-ol): khác với flavon thì flavonol có thêm nhóm OH ở
C3. Flavonol kết tinh màu vàng nhạt đến vàng. Những dẫn chất flavonol rất phổ
biến trong thực vật, đặc biệt là hành, hoa hòe, lúa mạch, rau nghễ, diếp cá. Cho
đến năm 1992 đã có tới 380 chất flavonol có nhóm thế hydroxyl và hoặc
methoxyl đã đƣợc biết tới. Các chất thƣờng gặp ở thực vật là: kaempferol,
quercetin, myricetin [13, 23, 24].
11
Hình 1.11. Cấu trúc của flavonol
Chalcon: có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C không có dị
vòng C nhƣ các flavonoid khác. Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam.
Chalcon có chủ yếu trong một số hoa thuộc họ Cúc–Asteraceae. Để nhận biết
chalcon có thể dùng hơi ammoniac hoặc khói kiềm của thuốc lá, màu sẽ chuyển
sang đỏ cam hoặc cam đỏ hay đỏ. Chalcon cũng có thể ở trong các bộ phận khác
nhƣ vỏ, lá, rễ, quả (ví dụ: isoliquiritigenin trong rễ cam thảo).
Hình 1.12. Cấu trúc của chalcon
Dihydrochalcon: các chất này ít gặp trong tự nhiên. Ví dụ nhƣ phloridin
có trong một loài Malus, chất này có độc tính ngăn sự hấp thu glucose ở ruột
non và ngăn sự tái hấp thu glucose ở tiểu quản thận. Một số dihydrochalcon có
vị rất ngọt ví dụ nhƣ neohesperidosid có vị ngọt gấp 2000 lần đƣờng mía.
Hình 1.13. Cấu trúc của Dihydrochalcon
12
Auron: là nhóm flavonoid có màu vàng sáng. Khung của auron cũng có
15 C nhƣ các flavonoids khác nhƣng dị vòng C có 5 cạnh. Số lƣợng cũng nhƣ sự
phân bố trong cây cũng bị hạn chế. Chất điển hình là auresidin gặp phổ biến
trong hoa của một số họ: Asteraceae, Scrophulariaceae, Plumbaginaceae,
Oxalidaceae và ở dạng 4- glucosid hay 6-glucosid.
Hình 1.14. Cấu trúc của Auron
1.2.2.2. Isoflavonoid
Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ
isoflavan, isoflava-3-ene, isoflavan 4-ol, isoflavanon; isoflavon, rotenoid,
pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon,
các chất này thƣờng gặp trong các cây họ đậu- Fabaceae.
+ Isoflavan: glabridin là một thành phần flavonoid gặp trong rễ cam thảo.
+ Isoflavan-3-ene: flabren có trong cam thảo.
+ Isoflavon: là nhóm lớn nhất của isoflavonoid. Hiện nay, hơn 364 chất đã
đƣợc xác định, chúng có nhiều tác dụng trong y học thƣờng gặp trong các họ
Rosaceae, Amaranthaceae, Iridacea, ví dụ daizein trong sắn dây, forrmonometin
trong cam thảo [2, 8, 12, 21].
Rotenoid: cho đến nay hơn 75 chất thuộc nhóm chất này đã đƣợc phân lập
và xác định đƣợc cấu trúc. Cấu trúc của nhóm rotenoid là C6-C4-C6 vì có thêm
1C do oxy hóa đóng vòng. Điển hình là rotenon có tác dụng diệt sâu bọ.
1.2.2.3. Neoflavonoid
Neoflavonoid các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4, gồm nhóm chất có
khung 4-arylchroman và 4-aryl coumarin, các chất này chỉ có giới hạn trong một
số loài thực vật [2, 8, 12].
13
1.2.3. Tính chất lý hóa
Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và
dạng liên kết với đƣờng (glycoside). Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid
hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đƣờng và aglycon. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là
Dglucose, Dgalactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [9].
Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen,
ether dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate,
dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung
dịch acid. Glycoside: tan trong ethanol, methanol. Các glycoside càng có nhiều
nhóm đƣờng và mạch đƣờng càng dài thì tan tốt trong nƣớc nóng. Các flavonoid
glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 còn tan đƣợc trong dung dịch NaOH,
Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid. Các flavonoid dạng aglycon thƣờng dễ kết
tinh, trong khi các glycoside thƣờng khó kết tinh hơn [9].
Các flavonoid thƣờng có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol có màu
vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon, flavanon,
flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu. Anthocyanidin
thƣờng hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin, delphinidin…tạo màu
xanh dƣơng, đỏ, tím cho hoa và trái [7,9].
Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nƣớc với các hydroxyd kiềm, nhạy
cảm với pH, nhiệt độ và ánh sáng. Có khả năng tạo phức với các ion kim loại
cho sản phẩm có màu đặc trƣng. Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng
benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại.
Thƣờng thu đƣợc 2 dải hấp thu cực đại, dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có
λmax = 240 - 280 nm [9].
1.2.4. Tính chất sinh học của flavonoid
1.2.4.1. Tác dụng chống oxi hóa
Gần đây, các hợp chất flavonoid đã đuợc coi là chất chống oxi hóa mạnh
mẽ trong ống nghiệm và đƣợc chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn
vitamin C, vitamin E và carotenoids [17].
14
Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế hoặc ngăn chặn
quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa
[5, 21]. Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lƣợng gốc tự do sản
sinh quá nhiều vƣợt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi
hóa của một loại đại phân tử sinh học, nhƣ các enzym , Protein. DNA và lipid
[5, 17]. Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các
bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thƣ và lão hóa [17,
21].
Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể đƣợc giải thích dựa vào các
đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng :
▪ Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp
với vòng thơm có khả năng nhƣờng hydro giúp chúng có thể tham gia vào các
phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do.
▪ Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ
liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và
các gốc tự do.
▪ Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại nhƣ
catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [17,
21].
1.2.4.2. Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm
Dịch chiết flavonoid từ lá cây Diếp cá cho thấy khả năng ức chế đối với
sự phát triển của S. aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans
với đƣờng kính vòng ức chế tƣơng ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [13]. Kết quả
tƣơng tự đối với dịch chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.
coli, P. aeruginosa, B. subtilis và S. aureus với giá trị MIC lần lƣợt là 100, 200,
200 và 50 µg/ml [29]. Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự
peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột
bạch [10].
15
1.2.4.3. Tác dụng đối với enzyme
Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của
enzym oxi hóa- khử. Flavonoid còn ức chế các tác động của hyaluronidase.
Enzym này làm tăng tính thấm của mao mạch. Khi enzym này thừa thì gây xuất
huyết dƣới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P. Các chế phẩm của flavonoid
chiết từ các loài Citrus nhƣ Cemaflavone, Circularine,…, flavonoid từ lá bạc hà
nhƣ Daflon, Diosmil, flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dƣợc khác nhau
đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính dòn và tính thấm
của mao mạch. Tác dụng này đƣợc hợp lực với acid ascorbic. Các dẫn chất
anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã đƣợc chứng minh có
tác dụng làm tăng thị lực vào ban đêm [16, 19, 24].
1.2.4.4. Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường
Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng
của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng
ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn
ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp... Các kết quả
nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid tự có vai trò nhƣ chất kích thích insulin
hay bắt chƣớc chức năng của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hƣởng đến
hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đƣờng…[23].
1.2.4.5. Tác dụng đối với ung thư
Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thƣ của các hợp chất
flavonoid. Gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in
vitro và in vivo của flavonoid lên các dòng tế bào ung thƣ khác nhau. Quercetin
có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thƣ tuyến tụy, chế độ ăn bổ
sung quercetin cũng có tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u
[14].
16
1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các chất flavonoid
1.3.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất trên thế giới
Trong những nghiên cứu, các nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh
rằng, flavonoid là một chất chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chống lại các tổn
thƣơng do sự oxy hóa và các gốc tự do một cách hữu hiệu. Nhờ vậy flavonoid
còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim
mạch nhƣ thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, xơ vữa động mạch. Ngƣợc lại, nếu
lƣợng flavonoid cung cấp hang ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên
rõ rệt. Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác nhƣ
vitamin C, vitamin E, selenium, kẽm [14, 17].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất ở trong nước.
Ở Việt nam trong thời gian gần đây đã có rất nhiều các nghiên cứu chiết
tách và xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của flavonoid có
trong một số loài thực vật nhƣ flavonoid trong hoa Actiso Cynara scolymus L.,
hoa Hòe, cây Đơn Kim, chè dây Cao Bằng, cây Cỏ lào, cây Diếp cá, lá Chùm
ngây,...[5, 6, 10].
Các công trình nghiên cứu về những tác dụng của hợp chất flavonoid có
trong Diếp cá còn rất hạn chế. Việc tinh chế các chất hữu ích có trong Diếp cá
vẫn là vấn đề hết sức phức tạp, đòi hỏi công nghệ hiện đại và tốn nhiều tiền bạc,
mà điều đó ở nƣớc ta chƣa thực sự đáp ứng đƣợc. [2, 5, 13, 24, 25]
Tuy nhiên, việc sản xuất các hợp chất flavonoid vẫn còn hạn chế : nhiều
sản phẩm chƣa đƣợc khai thác hay đang thực hiện ở mức độ thăm dò, qui trình
chiết tách còn đơn giản, không đồng bộ, vì vậy mới chỉ tạo ra sản phẩm ở dạng
cao chiết, chƣa tạo ra đƣợc sản phẩm có độ tinh khiết cao. Phần lớn các sản
phẩm các chất flavonoid nguyên liệu dùng trong dƣợc phẩm hay thực phẩm
chức năng đều đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Đặc biệt những nghiên cứu về
Diếp cá vẫn còn rất hạn chế [10, 12, 16, 17].
17
PHẦN 2
NỘI DUNG MỤC TIÊU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu khảo sát một só yếu tố công nghệ trong quá trình tách chiết
hợp chất flavonoid của lá cây Diếp cá ( Houttuynia cordata Thunb )
2.2. Nội dung nghiên cứu
Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá
Xác định loại dung môi thích hợp để tách chiết
Xác định nồng độ dung môi tách chiết
Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid trong bột lá Diếp Cá theo
phƣơng pháp và tối ƣu một số yếu tố trong quá trình tách chiết.
Xác định sự có mặt của flavonoid trong cao thô lá Diếp cá bằng các
phản ứng màu đặc trƣng và chạy sắc ký lớp mỏng.
Xác định hoạt tính kháng một số vi sinh vật kiểm định của flavonoid
tách chiết từ lá cây Diếp cá
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu thực vật
Lá cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb
Lá cây Diếp cá tƣới sau khi thu nhân đƣợc loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để ráo nƣớc rồi đem đi sấy đến khô ở 500C. Lá cây Diếp cá khi sấy khô đƣợc
nghiền mịn thành bột khô, đƣợc sử dụng để trích ly Flavonoid
Hình 2.1 Hình ảnh lá và bột lá của cây Diếp Cá
18
2.3.2. Vật liệu vi sinh vật
Các loại vi sinh vật kiểm định gồm :
Vi khuẩn Bacillus cereus
Vi khuẩn E.coli
Vi khuẩn Salmonella
Vi khuẩn Shigella
2.3.3.Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trƣờng LB nuôi cấy vi khuẩn E.coli, Salmonella Bacillus cereus Shigella (g/l)
Pepton 10g
Chiết suất nấm men (yeast extrart) 5g
NaCl 5g
Agar 16g
Hòa tan và dẫn nƣớc đến 1000ml và điều chỉnh pH= 7,0
2.4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
2.4.1 Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:
- Máy đo quang phổ
- Bếp đun
- Cân điện tử
- Tủ hút
- Tủ lạnh
- Tủ sấy
2.4.2 Dụng cụ
- Các dụng cụ tủy tinh nhƣ bình trụ, đũa thủy tinh, đĩa peptri, bình tam
giác
- Kẹp gỗ, pipetman, đầu côn các loại, ống cuvet, ống eppenandorf,
19
ống fancol, ống nghiệm, giấy lọc, phễu lọc
- Giấy sắc ký silica gel 60G.
2.4.3 Hóa chất
Ethanol (C2H5OH) FeCl3
Ethyl acetate (C3H8O2) Pepton
Cloroform (CH3Cl) Pepton Agar
Sodium hydroxide (NaOH) n-Hexan
Sodium chloride (NaCl) Natri acetate(C2H3NaO2)
Indigocarmine (C16H8N2Na2O8S2) H2O2
Toluene Glucose
Formic acid NaOH 10%
Hệ dung môi chạy dạng sắc ký lớp mỏng TLC (ethyaxetat:toluen:axit
fomic:nƣớc = 7: 3: 1, 5: 1)
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá
- Độ ẩm là lƣợng nƣớc tự do có trong mẫu, có thể đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp sấy khô .
- Nguyên lý: dùng nhiệt làm bay hết hơi nƣớc trong mẫu. Cân trọng
lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ đó tính đƣợc phần trăm nƣớc trong mẫu.
- Tiến hành: cân khối lƣợng lá Diếp cá đã đƣợc ngắt bỏ cành vào các
khay đĩa đã đƣợc sấy khô đến khối lƣợng không đổi và biết khối lƣợng chính xác. Cho khay đĩa chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 80oC trong 3 giờ. Sau đó lấy
khay ra thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích.
Cho lại mẫu vào tủ sấy và tiến hành lặp lại quá trình trên lần thứ hai và
những lần tiếp theo nữa cho đến khi khối lƣợng giữa ba lần cân liên tiếp là
không đổi, hoặc có sai số không cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu ban
đầu thì dừng quá trình sấy.
Độ ẩm của mẫu đƣợc tính theo công thức sau:
20
mo
x 100 H=
Trong đó:
H : là độ ẩm (%)
mo : khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g)
m1 : khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
2.5.2. Xác định phương pháp tách chiết
Phƣơng pháp siêu âm
Nội dung tiến hành
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá cho vào bình nón. Thêm 25 ml chloroform, để ở 600C trong 24h để loại hết nhựa, chất béo, caroten và
chlorophyl. Sau đó chiết trên máy siêu âm Power Sonic 410 ở điều kiện nhiệt độ
phòng, thời gian 30 phút. Lấy phần bột nguyên liệu ra, loại dịch chloroform, tiếp
tục sấy cho bay hết chloroform rồi chiết bằng ethanol với tỷ lệ nguyên liệu: dung
môi là 1:10 ở nồng độ ethanol 60% trong vòng 12h. Sau 12h thu dịch chiết
ethanol và cô cạn bằng đun cách thủy đƣợc cao Diếp cá.
Cao Diếp cá đƣợc chiết lại với 30ml nƣớc cất nóng. Dịch chiết sau khi đã
đƣợc lọc cho vào phễu chiết với 20ml eth yl axetat. Dồn dịch chiết ethyl
axetat lại và cô cạn bằng đun cách thủy. Xác định lƣợng flavonoid
Phƣơng pháp trích ly
Nội dung tiến hành
Cân chính xác 5g bột diếp cá cho vào bình nón. Bổ sung 50 ml ethanol
60%. Ngâm trong 12 h ở 60 độ C và tách lấy dịch chiết (bằng giấy lọc). Dịch
chiết đƣợc cô cạn ở nhiệt độ thấp cho đến khi đƣợc cao. Cao Diếp cá đƣợc chiết
lại với 30ml nƣớc cất nóng. Thu đƣợc dịch thủy phân và bổ sung 2ml
chloroform (3 lần) Loại bỏ phần màu xanh lắng xuống. Dịch chiết sau khi đã
đƣợc lọc cho vào phễu chiết với 10ml ethyl axetat. Dồn dịch chiết ethyl axetat
lại và cô cạn bằng đun cách thủy. Cân xác định trọng lƣợng flavonoid đã chiết
21
2.5.3. Xác định loại alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá cho vào bình nón. Thêm 25 ml chloroform, để ở 600C trong 24h để loại hết nhựa, chất béo, caroten và
chlorophyll loại dịch chiết tiếp tục sấy cho bay hết chloroform. Tiếp tục chiết
bằng ethanol, methanol, butanol, propanol với tỷ lệ dung môi 1:10 và đem ngâm trong 600C trong 12 h lọc lấy dịch chiết và đem đi đo OD490nm
2.5.4. Xác định nồng độ dung môi
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá cho vào bình nón. Thêm 25 ml chloroform, để ở 600C trong 24h để loại hết nhựa, chất béo, caroten và
chlorophyll tiếp tục sấy cho bay hết chloroform.Tiếp tục chiết bằng ethanol ở các nồng độ khác nhau và đem ngâm trong 600C trong 12 h lọc lấy dịch chiết và
đem đi đo OD600nm
22
2.5.5. Tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp trích ly
Sơ đồ tách chiết hợp chất flavonoid theo phƣơng pháp trích ly
Diếp Cá
Sấy khô
Xay bột
5g bột lá
Chiết bằng Alcohol
Dịch chiết lá diếp cá
Cô cạn ở nhiệt độ thấp
Cao diếp cá
Bổ sung 30 ml nƣớc nóng
Dịch hòa tan lá Diếp cá
Bổ sung 2ml Chloroform (3 lần)
Loại bỏ phần màu xanh lắng xuống
Dịch chiết
Bổ sung 10ml Ethyl Acetate
Loại bỏ phần lắng ở dƣới
Dịch chiết
Cô cạn ở nhiệt độ thấp
Flavonoid tổng số
23
2.5.5.1. Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng trích ly.
Tiến hành: Cân chính xác 5g bột diếp cá cho vào bình nón. dung môi là
1:10 ở các nồng độ ethanol 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%.Ngâm trong 12
tiếng tách lấy dịch chiết (bằng giấy lọc) và ngâm 3 lần trong 60 độ C. Dịch chiết
đƣợc cô cạn ở nhiệt độ thấp cho đến khi đƣợc cao. Cao ethanod đƣợc chiết lại
với 30ml nƣớc cất nóng. Thu đƣợc dịch thủy phân và bổ sung 2ml chloroform (3
lần) Loại bỏ phần màu xanh lắn xuống. Dịch chiết sau khi đã đƣợc lọc cho vào
phễu chiết với 10ml etyl axetat. Dồn dịch chiết ethyl axetat lại và cô cạn bằng
đun cách thủy. Cân xác định trọng lƣợng flavonoid đã chiết đƣợc ở các nồng độ
cồn khác nhau để xác định công thức với nồng độ ethanol thích hợp cho chiết
suất flavonoid đạt hiệu suất cao nhất.
2.5.5.2. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi đến khả năng trích
ly
Sử dụng nồng độ ethanol cho hiệu suất trích ly flavonoid cao nhất ở thí
nghiệm trên để thực hiện khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi.
Khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu bột lá Diếp cá : dung môi ethanol là 1/5; 1/10;
1/12; 1/20. Hàm lƣợng Flavonoid trích ly đƣợc tƣơng ứng với mỗi công thức thí
nghiệm đƣợc sử dụng xác định tỷ lệ nguyên liệu / dung môi tối ƣu nhất.
2.5.5.3. Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol đến khả năng
trích ly
Sử dụng nồng độ cồn và tỷ lệ nguyên liệu: dung môi cho hiệu suất trích ly
flavonoid cao nhất ở trên để khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol
đến khả năng trích ly flavonoid. Khảo sát ở 8h, 12h, 24h. Hàm lƣợng flavonoid
chiết suất đƣợc là cơ sở cho lựa chọn thời gian trích ly tốt nhất.
2.5.6. Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết
2.5.6.1 Định tính flavonoid bằng các phản ứng màu đặc trưng
+) Phản ứng với FeCl3 5%: hút 50µl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt
FeCl3 5%. Phản ứng dƣơng tính sẽ cho màu lục, xanh đen, xanh lam và nâu tùy
theo nhóm flavonoid số lƣợng và vị trí nhóm flavonoid
24
+) Phản ứng với NaOH 10%: hút 50µl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt
NaOH 10%. Phản ứng dƣơng tính sẽ cho màu đỏ, da cam
Phản ứng tạo ra muối phenolat có màu khác nhau tùy thuộc vào nồng độ
flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid. Nhóm flavon và flavonol cho màu vàng
sáng, anthocyanidin cho màu xanh dƣơng, auron có thể cho màu đỏ, da cam [6].
2.5.7. Định tính flavonoid bằng phương pháp chạy sắc ký
Nguyên tắc: Dựa trên sự tƣơng tác khác nhau giữa các thành phần trong
hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau
Dung môi chạy sắc ký:
ethyaxetat: toluen: axit fomic: nƣớc =7:3:1,5:1
Tiến hành:
Chuẩn bị: Hoạt hóa bản màng silicagel gel bằng cách sấy 2 giờ ở 80°, để
ở nhiệt độ phòng 30 phút
Chấm mẫu flavonoid lên bản mỏng
- Hòa tan mẫu flavonoid tách chiết theo quy trình bằng ethyacetat
- Dùng pipet hút một ít mẫu đã hòa tan chấm lên bản mỏng, khoảng cách
vết chấm cách bờ dƣới 1cm, hai bờ bên 0,5cm và khoảng cách giữa các vết
chấm cách nhau 0,6cm. Kích thƣớc các vết chấm cách vừa phải.
Triển khai bản mỏng:
- Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô.
- Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lƣợt theo các tỷ lệ xác định:
ethyaxetat: toluen: axitfomic: nƣớc= 7:3:1,5:1
- Đặt một tấm giấy lọc vào bình triền khai.
- Bão hòa dung môi trong bình triển khai từ 15-20 phút.
- Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình triển khai, đậy nắp
bình lại.
- Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cạnh mép trên của tấm bản
mỏng khoảng 0,5 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai.
- Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi.
- Phát hiện vết qua màu sắc tự nhiên.
25
2.5.8. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoidchiết xuất từ lá
Diếp cá
Mục đích : xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid từ lá
diếp cá đối với 4 loại vi khuẩn là Escherichica coli, Salmonella typhi, Bacillus
subtillis, sigella theo phƣơng pháp dung dịch khuếch tán, xác định vòng kháng
khuẩn.
Các bƣớc tiến hành: B1:Khử trùng bàn tay bằng cồn 70% trƣớc khi cho tay vào box cấy.
B2:Đổ môi trƣờng thích hợp đã chuẩn bị vào đĩa petri đã khử trùng để
khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo.
B3:Dùng pipet man vô trùng nhỏ dịch các chủng vi sinh vật đã đƣợc nuôi
lên sinh khối trong môi trƣờng lên trên đĩa môi trƣờng LB
B4 :Dùng que trang trải đều lên khắp mặt thạch.
B5 :Sau đó tiến hành đục lỗ bằng đầu lớn của pipet
-Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch flavonoid (pha loãng với cồn với tỷ
lệ 100mg/1ml) vào các lỗ thạch và để trong tủ lạnh 2 h sau đó ấy ra và để trong
tủ ấm ở nhiệt độ 50°C. Sau 24-48 giờ quan sát vòng kháng vi sinh vật tạo thành
và đo đƣờng kính kháng vi sinh vật
26
PHẦN 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá Diếp cá
Nƣớc có vai trò rất quan trọng đối với cơ thể sống, nƣớc còn là môi
trƣờng cho vi sinh vật trong thực phẩm phát triển. Nhƣ vậy muốn bảo quản để
sử dụng lâu dài cần quản lý tốt nồng độ nƣớc có trong nguyên liệu. Xác định
đƣợc lƣợng nƣớc có trong nguyên liệu từ đó để có phƣơng pháp bảo quản tốt
nguồn nguyên liệu, tiến hành đánh giá chất lƣợng nguyên liệu Diếp cá bằng
phƣơng pháp xác định độ ẩm của lá diếp cá và nguyên liệu bột lá Diếp cá cho
quá trình tách chiết. Độ ẩm của lá Diếp cá đƣợc xác định và tổng hợp ở bảng
3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của lá Diếp cá
Độ ẩm % Khối lƣợng mẫu sau khi sấy(g)
Khối lƣợng mẫu STT trƣớc khi sấy(g)
Khối lƣợng Khối lƣợng mẫu Khối lƣợng mẫu
mẫu sau khi sau khi cân lần 2 sau khi cân lần 3
cân lần 1 (g) (g) (g)
1 50,0012 6,7252 6,6835 6,5784 86,67 ± 2
2 50,1111 6,9174 6,9368 6,8126 86,25 ± 2
3 50,002 6,6715 6,6253 6,5145 86,79 ± 2
Độ ẩm trung bình 86,57 ± 2,4
27
Hình 3.1. Lá Diếp cá và bột lá Diếp cá
Nhận xét: Độ ẩm trung bình có trong lá Diếp cá là 86,57%.
3.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết
Kết quả xác định phƣơng pháp tách chiết flavonoid đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quá xác định phƣơng pháp tách chiết
Hàm lƣợng Hiệu suất trích ly Khối lƣợng bột Phƣơng pháp flavonoid thu theo diếp cá (g) đƣợc (g) TLKTD (%)
Siêu âm 5 0.1528 3,056 ± 0,81
Trích ly 5 0.1821 3,642 ± 0,62
Từ kết quả Bảng 3.2 cho thấy đƣợc hiệu suất trích ly của phƣơng pháp
trích ly cao hơn phƣơng pháp siêu âm nên ta áp dụng phƣơng pháp trích ly
28
3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết
Loại alcohol dùng tách chiết là yếu quan trọng trong quá trình tách chiết
để đạt hiệu quả cao nhất và đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả đo OD của các loại Alcohol
Dung môi Trị số OD490nm
Ethanol 2,906
Methanol 2,900
Butanol 1,364
Propanol 1,138
Hình 3.2 Dịch chiết các loại Alcohol
A. Dịch chiết methanol
B. Dịch chiết propanol
C. Dịch chiết butanol
D. Dịch chiết ethanol
Từ Bảng 3.3 cho thấy chỉ số đo OD490nm của dịch chiết ethanol là 2,906
còn propanol là 1,138 còn dịch chiết methanol cũng có chỉ số đo OD khá cao
gần băng ethanol nhƣng do methanol có tích chất hóa học độc hơn ethanol nên
khóa luận này chọn dung môi ethanol là dung môi tách chiết chính.
29
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng
trích ly theo phƣơng pháp ngâm chiết.
3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol
Dung môi chiết là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến
quá trình chiết xuất các hợp chất tự nhiên có trong thực vật. Cả hiệu quả chiết
xuất và hoạt tính của các chất chiết xuất phụ thuộc rất lớn vào dung môi và nồng
độ dung môi. Việc lựa chọn nồng độ dung môi ảnh hƣởng trực tiếp đến việc
hiệu suất tách chất ra khỏi nguyên liệu. Flavonoid là hợp chất có tính phân cực
mạnh do đó thông thƣờng sử dụng các chất có độ phân cực mạnh nhƣ methanol,
ethanol hay nƣớc làm dung môi trích ly. Flavonoid có khả năng hòa tan tốt trong
cả methanol và ethanol nhƣng do methanol là chất có độc tính cao nên đề tài tiến
hành lựa chọn ethanol ở các nồng độ khác nhau để trích ly. Kết quả nghiên cứu
đƣợc thể hiện trong Bảng 3.4. và Hình 3.3 và Hình 3.4.
Hình 3.3. Flavonoid thô thu đƣợc sau khi tách chiết
30
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất
trích ly flavonoid
Hàm lƣợng Hiệu suất trích Nồng độ Khối lƣợng flavonoid thu ly theo Trị số OD600nm ethanol (%) bột Diếp cá(g) đƣợc (g) TLKTĐ(%)
50% 5 0,05 0,1174 2,348 ± 0,052
60% 5 0,16 0,1602 3,204 ± 0,066
70% 5 0,25 0,1685 3,370 ± 0,075
80% 5 0,46 0,1708 3,404 ± 0,084
90% 5 0,83 0,1726 3,452 ± 0,091
100% 5 0,90 1,757 3,514 ± 0,11
Nồng độ ethanol
)
4
(
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
% Đ T K L T o e h t y l h c í r t t ấ u s u ệ i H
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Nồng độ ethanol
.
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly
flavonoid
31
Kết quả ở Bảng 3.4 và Hình 3.4. cho thấy khi trích ly ở các nồng độ
ethanol khác nhau cho hiệu suất trích ly flavonoid khác nhau dao động trong
khoảng 2,348% - 3,514%. Hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khi chiết ở nồng
độ ethanol từ 50% -100%, trong đó ethanol 100% cho hiệu suất trích ly cao nhất
là 3,514 %. Vì vậy nồng độ ethanol thích hợp để thực hiện quá trình trích ly
flavonoid trong lá diếp cá là 100%.
3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol
Quá trình trích ly đƣợc thực hiện dựa vào tính hòa tan tốt của hoạt chất
sinh học trong dung môi hữu cơ, đây là quá trình chuyển khối do có sự chênh
lệch nồng độ nguyên liệu và dòng chảy bên ngoài (dung môi). Vì vậy để nghiên
cứu hiệu suất trích ly flavonoid cần nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu
/ dung môi, em tiến hành khảo sát các tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi : 1/5, 1/10,
1/15, 1/20. Các kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.5
Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi
ethanol đến hiệu suất trích ly
Tỷ lệ nguyên Hiệu suất trích Khối lƣợng bột Hàm lƣợng flavonoid liệu: dung môi ly theo diếp cá (g) thu đƣợc (g) ethanol (g/ml) TLKTĐ(%)
2,590 ± 0,06 5 0,1295 1/5
3,514 ± 0,07 5 0,1757 1/10
3,602 ± 0,08 5 0,1801 1/15
3,702 ± 0,10 5 0,1851 1/20
32
)
4
(
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi
% Đ T K L T o e h t y l h c í r t t ấ u s u ệ i H
1:05
1:10
1:15
1:20
Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi
Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến
hiệu suất trích ly flavonoid
Qua Bảng 3.5. và Hình 3.5. cho thấy hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên
khi tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi tăng. Từ tỷ lệ 1/5 đến 1/10 hiệu suất trích ly
tăng nhanh từ 2,590% lên 3,702% nhƣng từ tỷ lệ 1/10 lên 1/15 và 1/15 lên 1/20
thì hiệu suất trích ly tăng nhƣng không đáng kể. Theo báo cáo tổng hơp kết quả
đề tài cấp bộ nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách các flavonoid từ phế thải
diếp cá, rau quả nhằm ứng dụng trong thực phẩm chức năng của Lý Ngọc Trâm
cũng đã chỉ ra tỷ lệ nguyên nguyên liệu / dung môi ethanol thích hợp nhất để
trích ly flavonoid từ phế thải Diếp cá bằng phƣơng pháp trích ly động ở nhiệt độ 60oC là 1/10 đạt hiệu suất trích ly cao nhất ở tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là
1/20, nhƣng để tiết kiệm dung môi hay để tăng hiệu quả kinh tế cho quá trình
trích ly thì chọn tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/10 sẽ phù hợp vì khi tỷ lệ
nguyên liệu / dung môi tăng lên 1/20 thì hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên
không nhiều so với chi phí sản xuất
33
3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol.
Theo lý thuyết khi thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu nhận sản
phẩm càng tăng nhƣng đến một ngƣỡng thời gian nhất định thì lƣợng sản phẩm
thu đƣợc tăng lên không đáng kể, đồng thời có thể ảnh hƣởng xấu đến chất
lƣợng sản phẩm. Do vậy cần xác định thời gian trích ly thích hợp cho nguyên
liệu. Tiến hành nghiên cứu thời gian chiết bằng ethanol trong 8 giờ, 12 giờ và 24
giờ.
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đƣợc thể
hiện trong Bảng 3.6. và Hình 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol
đến hiệu suất trích ly
Hiệu suất trích ly Khối lƣợng bột lá Hàm lƣợng Thời gian (h) theo Diếp cá (g) Flavonoid thu đƣợc (g) TLKTĐ (%)
2,686 ± 0,08 5 0,1343 8
3,514 ± 0,09 5 0,1757 12
3,886 ± 0,12 5 0,1943 24
34
)
(
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Thời gian chiết bằng ethanol
% Đ T K L T o e h t y l h c í r t t ấ u s u ệ i H
8 h
12 h
24 h
Thời gian chiết bằng ethanol
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất
trích ly flavonoid
Từ kết quả ở Bảng 3.4.3 và Hình 3.4.3 cho thấy hàm lƣợng flavonoid tăng
theo thời gian chiết. Thời gian chiết từ 8h đến 12h, hiệu suất trích ly flavonoid
tăng cao từ 2,686% lên 3,886%, tiếp tục tăng thời gian từ 12h đến 24h thì hiệu
suất trích ly flavonoid chỉ tăng 0,172%.
Chiết trong 24h cho hiệu suất trích ly cao hơn khi chiết trong 12h. Tuy
nhiên, chiết trong 24 h lại tốn nhiều thời gian hơn mà hiệu suất trích ly lại không
tăng nhiều hơn so với 12h nếu áp dụng trên quy mô công nghiệp thì không khả
quan, để tiết kiệm thời gian, chi phí cho quá trình chiết nên chọn thời gian là 24
h cho quá trình chiết bằng ethanol. Vì vậy lựa chọn thời gian chiết bằng ethanol
là 24 h.
3.5. Định tính các chất Flavonoid có trong nguyên liệu bằng các phản ứng
hóa học.
Tiến hành trích ly theo quy trình ngâm chiết thu đƣợc cao flavonoid toàn
phần, hòa tan cao flavonoid thu đƣợc chế phẩm hòa tan trong ethanol. Tiến hành
các phản ứng đặc trƣng phát hiện nhóm chất flavonoid.
35
Bảng 3.7. Kết quả định tính nhóm chất flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá
Thuốc thử NaOH FeCl3
Màu phản ứng Xanh đen Vàng nâu
A. Flavonoid tác dụng với Fecl3
B. Flavonoid tác dụng với NaOH
Hình 3.7. Kết quả định tính flavonoid trích ly từ lá Diếp Cá
Dựa vào màu sắc phản ứng của Flavonoid qua Bảng 3.7. và Hình 3.7. cho
thấy phản ứng flavonoid với FeCl3 và NaOH phản ứng tạo màu xanh đen và
phản ứng tạo màu vàng sáng đều là phản ứng dƣơng tính với nhóm Flavonol
3.6. Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng
Việc phân tích thành phần flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến
hành trên mẫu flavonoid trích ly đƣợc từ lá Diếp cá. Để phân tích thành phần
flavonoid trên bản mỏng, sử dụng phƣơng pháp sắc ký mỏng một chiều: đƣợc
tiến hành trên bản mỏng Silicagel, chạy sắc ký một chiều từ dƣới lên với hệ
dung môi (etyl axetat: toluene: formic acid : nƣớc = 7: 3: 1,5: 1). Sau khi chạy
sắc ký xong, bản mỏng đƣợc làm khô trong tủ ấm ở nhiệt độ 32⁰ C- 37⁰ C sau
đó quan sát dƣới ánh sáng thƣờng và ánh sáng tử ngoại
36
A B
Hình 3.8. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của flavonoid quan sát dƣới ánh
sáng thƣờng (A) và ánh sáng tử ngoại (B)
Quan sát Hình 3.8. nhận thấy quá trình trích ly flavonoid từ lá Diếp cá đã
thành công, dung môi để chạy sắc ký bản mỏng cho flavonoid tách chiết từ lá
Diếp cá là phù hợp. Khi quan sát dƣới ánh thƣờng trên ảnh sắc ký các vết tách ra
có màu nâu nhạt mờ và hơi khó quan sát, nhƣng khi quan sát ở ánh sáng tử
ngoại các vết tách ra phát quang rất dễ quan sát. Nhƣ đã biết thành phần
flavonoid trong lá Diếp cá gồm các flavanol nhƣ (-)-epicatechin gallate (ECG),
(-)- epigallocatechin (EGC), (-)- epigallocatechin gallate (EGCG), (-)-
epicatechin (EC), (+)- gallocatechin (GC), (+)- catechin (C) và các dẫn xuất;
flavonol nhƣ quercetin, kaempferol, và các dẫn xuất glycoside; flavone. Qua
hình ảnh chạy sắc ký, thấy có vết tách ra từ flavonoid tách chiết từ lá Diếp cá thu
đƣợc có querecetin với một hàm lƣợng nhỏ và bên cạnh đó flavonoid tách chiết
từ lá Diếp cá còn chứa các nhóm flavanol, flavone thể hiện ở các vết tách ra trên
ảnh chạy sắc ký.
37
3.7. Khả năng kháng khuẩn của cao flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá
Trong dân gian, lá Diếp cá thƣờng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh
viêm nhiễm nhƣ ghẻ lở,mụn nhọt,…đây là những bệnh liên quan tới các chủng
vi khuẩn có khả năng gây viêm nhiễm bên trong và bên ngoài cơ thể. Tiến hành
kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của cao Diếp cá chiết xuất từ lá diếp cá ở nồng
độ 100mg/ml 4 chủng vi sinh vật kiểm định: Bacilus creaus, Sigella.
Escherichia coli, Salmonella enterica.
A B
C D
Hình 3.9. Hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của flavonoid
A:Đƣờng kính vòng kháng nấm nem Bacilus creaus
B: Đƣờng kính vòng kháng vi khuẩn E.coli
C:Đƣờng kính vòng kháng vi khuẩn Sigella.
D:Đƣờng kính vòng kháng vi khuẩn Salmonella
38
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng của một số chủng vi sinh vật kiểm định của dịch
chiết lá Diếp cá
Đƣờng kính vòng Chủng vi sinh vật kiểm định kháng (cm)
Vi khuẩn Bacillus cereus 2,5 ± 0,037
Vi khuẩn E.coli 1,2 ± 0,012
Vi khuẩn Salmonella 1,1 ± 0,034
Vi khuẩn Shigella 2,2 ± 0,044
Kết quả Bảng 3.8 cho thấy dịch chiết lá Diếp cá có hoạt tính kháng vi sinh
vật kiểm định khá cao. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của lá Diếp cá hiệu
quả với vi khuẩn. Hoạt tính kháng thấp hơn với vi khuẩn E.coli và Salmonella.
Hoạt tính kháng cao đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Shigella.
39
PHẦN 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, đề tài đã rút ra một số kết luận sau:
- Xác định đƣợc độ ẩm trong lá Diếp cá là 86,57%.
- Xác định đƣợc loại dung môi dùng để tách chiết đạt hiệu quả cao là
ethanol
- Trong dịch chiết Ethanol của lá Diếp cá có chứa hợp chất Flavonoid.
- Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly
flavonoid theo phƣơng pháp ngâm chiết. Kết quả xác định đƣợc ở nồng độ ethanol 100o, tỷ lệ NL/DM =1/10, trong thời gian 24h là điều kiện tối ƣu để trích
ly Flavonoid từ lá Diếp cá theo phƣơng pháp ngâm chiết khi tách chiết hàm
lƣợng flavonoid thu đƣợc cao nhất là 3,886 ± 0,12 % trong 5g bột lá Diếp cá
khô.
Về hoạt tính kháng khuẩn, cao chiết từ lá Diếp cá có khả năng ức chế
nhóm trực khuẩn Gram dƣơng. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của lá
Diếp cá hiệu quả với vi khuẩn. Hoạt tính kháng thấp hơn với vi khuẩn E.coli và
Salmonella. Hoạt tính kháng cao đối với vi khuẩn Bacillus cereus và Shigella
4.2 Kiến nghị
Tiếp tục khảo sát thêm các yếu tố công nghệ ảnh hƣởng đến quá trình
trích ly Flavonoid theo phƣơng pháp ngâm chiết nhƣ số lần trích ly, khuấy trộn.
40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TIẾNG VIỆT
1. Phan Văn Cƣ , Nguyễn Thị Thu Hƣờng (2010), “Nguyên cứu tách chiết và
định lƣợng sterols từ lá của cây Diếp cá (houttynia cordata thunb) ở tỉnh
thừa thiên huế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ” Tạp Chí
Khoa Học, Đại học Huế, Số 63, 2010, 17-24.
2. Đỗ Trung Đàm (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc
từ thảo dược, Nhà xuất bản KH &KT, Hà nội.
3. Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ (2013) ,Stress oxi hóa và các chất chống oxi
hóa tự nhiên. tạp chí Khoa học và Phát triển 2013.
4. Lê Tất Khƣơng (1999), Giáo trình cây chè. NXB nông nghiệp.
5. Trần Văn Ơn (2006), Bài Giảng Thực vật học tập 2, Trƣờng Đại học Dƣợc
Hà Nội 2006.
6. Nguyễn Kim Phi Phụng ( 2007 ), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ.
NXB ĐH quốc gia Tp.HCM.
7. Đỗ ngọc Quý, Nguyễn Kim Phong (1997) ,Cây Diếp cá Việt Nam, NXB
Nông nghiệp, Hà Nội.
8. Đoàn Hùng Tiến, Đỗ Văn Ngọc (1998), Tuyển tập các công trình nghiên
cứu về diếp cá, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
9. Nguyễn Duy Thịnh (2004), Giáo trình Công Nghệ Diếp cá, Trƣờng Đại Học
Bách Khoa Hà Nội.
10. Ngô Văn Thu và Trần Hùng (2011), Dược liệu học. Nhà xuất bản Y học. Bộ
Y tế.
11. Nguyễn Anh Thủy, Dƣơng Anh Tuấn, Vũ Nguyên Thành (2011), Tinh chế
peroxide từ củ cải trắng Raphanus sativus Var hortensis và ứng dụng
trong xét nghiệm ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học, 113-118.
12. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Vũ Thị Ngọc Thanh, Trần Hùng, Đào Văn Phan
(2011). Nghiên cứu sàng lọc tác dụng trên cơ trơn và đông cầm máu của
flavonoid chiết xuất từ cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) Việt
Nam.
13. Đỗ Thị Hoa Viên, Nghiên cứu khảo sát hoạt chất flavonoid trong quả mơ
Prunus armeniaca (họ Rosaceae). Tạp chí Khoa học và công nghệ. 2007.
45(2): p. 49.
II. TIẾNG ANH
14. Boonyadist Vongsa et a (2013), “Maximizing total phenolics, total
flavonoidscontents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by
the
appropriate extraction method”, Mahidol University, Bangkok, pp. 566-571.
15. Caceres A et a (1992), “Pharmacologic properties of Moringa oleifera: 2:
Screening for antispasmodic, anti-inflammatory and diuretic activity”.
J.Ethnopharmacol 36: 233-237.
16. Gressman, The chemistry of flavonoid compounds, Academic press, Lon
don,1975.
17. Tan M.C., Tan C.P. and Ho C.W., Effects of extraction solvent system, time
and temperature on total phenolic content of henna (Lawsonia inermis)
stems,International Food Research Journal 20 6 (2013) 3117-3123.
18. Wang J., Sun B.G., Cao Y., Tian Y. and Li X. H., Optimization of
ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran,
Food Chemistry 106 (2008) 804-810.
19. Ei ert U, Wo ters B, Nadrtedt A. (1981), “The antibiotic princip e of seeds
of Moringa o eifera and Moringa stenopeta a”, P antaMed 42: 55-61.
20. J. E. Brown, H. Khodr, R. C. Hider, and C. Rice-Evans (1998), “Structural
dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their
antioxidant properties”, Biochemica Journa , vo . 330, no. 3, pp. 1173-
1178.
21. Makkar HPS, Becker K. (1996), Nutritional value and antinutritional
components of whole and ethanol extracted Moringa oleifera leaves.
22. Mehta LK., Balaraman R., Amin AH, Bafna PA, Gulati OD. (2003), Effect
of fruits of Moringa oleifera on the lipid profile of normal
andhypercholesterolaemic rabbits.
23. Suphachai Charoensin (2012), “Antioxidant and anticancer activities of
Moringa oleifera leaves”, Journa of Medicina P ant Research, pp. 318-325.
24. Wang Xiaomei, Cao Wengen (2007), “Advances in Research of
Pharmacological Effects of Flavonoid Compounds”, Department of
Pharmacy, Journal of Suzhou College.
25. Sandra et a (2003), “Ultrasound-assisted extraction of Ca, K and Mg from
invitro citrus culture”, Journal of the Brazilian Chemical Society
