Lai ADN – Phần 2
+ Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ:
Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong
các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là 32P và 35S. Kết quả
của phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được phát hiện trên X-phim hoặc nhấp
nháy lỏng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp đánh dấu phóng xạ là độ nhạy có thể
đạt tới dưới mức picrogam ADN đích. Hạn chế của phương pháp này là không đạt
được sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định
mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử
dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử
dụng cũng như việc quản lý chất thải.
Xuất phát từ thực tế trên mà càng ngày người ta càng quan tâm đến các
phương pháp đánh dấu phi phóng xạ. Mục tiêu là đạt được một hệ thống đánh dấu
có độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất phóng xạ. Bảng dưới đây liệt
kê các yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh dấu mẫu dò:
1, Dễ gắn với acid nucleic theo phương pháp đơn giản và có độ lặp lại cao.
2, Bền trong điều kiện lai và bảo quản.
3, Không bị ảnh hưởng và làm ảnh hưởng đến phản ứng lai.
4, Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong dịch thể (liquid phase)
hay có chất mang (solid phase).
5, Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản.
6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai.
7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện.
8, Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá.
Tuy nhiên, nếu theo các yêu cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ thống đánh dấu
phi phóng xạ nào thoả mãn.
Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao và đó là
lý do các phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là phương pháp
dựa trên các enzym như Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase. Tuy nhiên
phương pháp sử dụng các chất phóng xạ hiện tại vẫn đang được dùng cho một số
phòng thí nghiệm đặc biệt.
· Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ.
Có 3 phương pháp đánh dấu phi phóng xạ:
1, Dùng cơ chất hoá phát xạ và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơ
chất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ ánh sáng và sau đó là phương
pháp phát hiện bức xạ này.
* Với nguồn cơ chất hoá phát quang có loại như AMPPD (Bronstein,
Edward & Voyta, 1989) có thể được dùng trực tiếp như là cơ chất cho enzym
Alkaline phosphatase trong phép lai ADN đạt độ nhạy cao trong thời gian ngắn
(Bronstein et al., 1990).
* Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase trên cơ sở giải
phóng D-luciferin từ cơ chất, ví dụ D-luciferin-O-phosphate (Miska và Geiger.,
1987). Hai phương pháp này tương đối nhạy và đang được sử dụng rộng rãi.
2, Phương pháp phát hiện dựa vào thay đổi màu:
Phương pháp đo màu có thể thực hiện trên môi trường dịch thể hay chất
mang và khá nhạy so với phương pháp phát quang. Người ta đã tạo ra các cơ chất
sinh màu khi có mặt enzym (chẳng hạn như Alkaline phosphatase). Lợi thế của
phương pháp này là việc phát hiện đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ phát
hiện và ứng dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật.
Một phương pháp có thể làm tăng độ nhạy của phản ứng màu bằng cách
thêm một enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống. Một ví dụ cho điều này là
vai trò loại nhóm phosphat của phân tử NADP thành NAD do Alkaline
phosphatase trong hệ thống phát hiện mẫu dò nucleic. Trong hệ thống này thì
NAD có vai trò kích hoạt chu trình oxy hoá mà có sự tham gia của alcohol
dehydrogenease và diaphorase. Trong mỗi một chu trình thì NAD sẽ bị khử thành
NADPH + H+. Phản ứng oxy hoá này lại kèm theo phản ứng oxy hoá mà NADPH
+ H+ lại bị oxy hoá thành NAD, mọi phản ứng xảy ra gắn liền với việc khử ρ-
indonitro-tetrazolium màu tím thành formazan. Sản phẩm cuối cùng formazan
được định lượng bằng phép so màu (Self. 1985).
3, Cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian.
Sử dụng cơ chất phát xạ huỳnh quang là phương pháp khá nhạy và có thể
phát hiện được tới một phân tử chất phát xạ (fluorescein). Nói chung với các mẫu
sinh phẩm thường có mức độ nhiễu tín hiệu nền cao. Thực tế này có thể được cải
thiện với cơ chất fluorophore bền bị kích hoạt bởi sóng ánh sáng. Sự phát xạ sau
đó được ghi lại khi các bức xạ nền đã bị giảm. Đối với phương pháp dùng
Alkaline phosphatase thì việc phát hiện nhân tố gắn lanthanide theo thời gian đi
kèm với hoạt tính enzym này gọi là phương pháp phát quang lanthanide khuyếch
đại bởi enzym (EALL: Evangelista, Pollack & Templeton, 1991). Trong trường
hợp này, cơ chất không có khả hình thành phức hệ gắn với lathanide phát xạ. Dưới
tác dụng của Alkaline phosphatase thì cơ chất và lanthalide bị chuyển thành phức
hệ hoạt động. Phương pháp này khá nhạy nhưng hạn chế lớn nhất của nó là cần
thiết bị kích hoạt và đo bức xạ huỳnh quang.
+ Quá trình lai:
Nói chung quá trình lai (Hybridization ) được tiến hành theo một trong 3
cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai
trong dịch thể và lai với chất mang (solid support).
a. Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4.
Hình 1.4. Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in
situ hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori.
Kỹ thuật này được thực hiện để định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật
sau khi đã được cố định trong các tiêu bản hiển vi. Tuy nhiên, do hầu hết các vi
sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu
đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất
nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới kính