Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính trên cơ sở graphen ứng dụng trong phân tích ure và axit uric

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:129

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án trình bày nghiên cứu vật liệu dùng biến tính điện cực để xác định UA bằng phương pháp điện hóa; Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định ure theo nguyên tắc đo điện thế và đo vôn-ampe; Khảo sát các điều kiện tối ưu nhất cho các điện cực đã chế tạo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính trên cơ sở graphen ứng dụng trong phân tích ure và axit uric

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Phương Thảo NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH TRÊN CƠ SỞ GRAPHEN ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH URE VÀ AXIT URIC LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Phương Thảo NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH TRÊN CƠ SỞ GRAPHEN ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH URE VÀ AXIT URIC Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã sỗ: 9 44 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Bùi Thị Phương Thảo
LỜI CẢM ƠN Công trình khoa học này được hoàn thành là nhờ vào sự nỗ lực của bản than tôi cùng quá trình đào tạo và chỉ bảo của các thầy cô hướng dẫn, sự hỗ trợ tạo điều kiện và dành thời gian của đồng nghiệp và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS. Đỗ Phúc Quân, GS. TS. Trần Đại Lâm đã trực tiếp chỉ bảo và định hướng chuyên môn khoa học đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi cho phép tôi hoàn thành tốt bản luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS Phạm Hùng Việt và ban giám đốc trung tâm nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển bền vững (CETASD), trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG Hà Nội, TS Nguyễn Văn Chúc, ThS. Nguyễn Hải Bình Viện Khoa học Vật Liệu – Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam đã dạy dỗ, giúp đỡ và bồi dưỡng cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Học viện Khoa học Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu trường Đại học Công nghiêp Việt trì, ban lãnh đạo khoa Kỹ thuật Phân tích tạo mọi điều kiện tuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi cũng xin cảm ơn các nhà khoa học đã có những ý kiến phản biện và ý kiến về chuyên môn giúp hoàn thành luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người luôn ở bên và động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Bùi Thị Phương Thảo
MỤC LỤC Mở đầu ..............................................................................Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................................... 4 1.1. Axit uric và ure .............................................................................................................. 4 1.1.1. Axit uric ...................................................................................................................... 4 1.1.1.1 Giới thiệu chung ....................................................................................................... 4 1.1.1.2. Vai trò của UA trong cơ thể ................................................................................... 5 1.1.1.3. Các phương pháp phân tích UA ............................................................................. 6 1.1.2. Ure............................................................................................................................. 13 1.1.2.1. Giới thiệu chung.................................................................................................... 13 1.1.2.2. Các phương pháp phân tích Ure........................................................................... 14 1.2. Cảm biến sinh học ....................................................................................................... 16 1.2.1. Cấu tạo cảm biến sinh học ....................................................................................... 16 1.2.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học ............................................................................ 21 1.2.3. Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học.................................................................. 22 1.3. Nghiên cứu trong nước về cảm biến điện hóa và sinh học……………...……23 1.4. Các phương pháp biến tính điện cực để xác định axit uric, ure ............................... 24 1.4.1. Ứng dụng graphen (Gr) ........................................................................................... 24 1.4.2. Ứng dụng Polyme dẫn ............................................................................................. 26 1.4.3. Ứng dụng hạt Nano kim loại ................................................................................... 28 1.4.4. Ứng dụng enzym ...................................................................................................... 29 1.5. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu .......................................................... 31 1.6. Kết luận ........................................................................................................................ 32 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 34 2.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 34 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ................................................................................................... 34 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................................... 35 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 35 2.1.3.1. Các phương pháp nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực ............................. 35 2.1.3.2. Phương pháp điện hóa tổng hợp polyme ............................................................. 38 2.1.3.3. Phương pháp xác định các thông số đặc trưng của điện cực ............................. 38 2.1.4. Ứng dụng phân tích mẫu và đánh giá kết quả ........................................................ 42 2.2. Thực nghiệm................................................................................................................ 42 2.2.1. Phân tích axit uric..................................................................................................... 42 2.2.1.1. Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs............................ 42 2.2.1.2. Chế tạo và khảo sát điện cực GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPs ................................ 43 2.2.2. Phân tích ure (Điện cực Pt/ Graphen/PANi/Ureaza) ............................................. 45 2.2.3. Phân tích mẫu nước tiểu .......................................................................................... 47 3.1. Điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs................................................................... 50
3.1.1. Khảo sát điều kiện chế tạo màng Gr trên điện cực GCE ....................................... 50 3.1.2. Khảo sát điều kiện chế tạo màng PDA-Cu(II) ....................................................... 51 3.1.2.1. Khảo sát phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II) .................................................. 51 3.1.2.2. Khảo sát thời gian điện phân ................................................................................ 53 3.1.3. Khảo sát điều kiện chế tạo GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs ..................................... 54 3.1.4. Khảo sát các đặc trưng của điện cực GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs..............55 3.1.4.1. Tính chất điện hóa........................................................................................55 3.1.4.2. Khảo sát pH của dung dịch đệm………………………………………..…59 3.1.4.3. Khảo sát khả năng đáp ứng của điện cực theo thời gian .................................... 60 3.1.4.4. Khảo sát độ chọn lọc của điện cực : Ảnh hưởng của DA, Glucozo, Citric....... 61 3.1.4.5. Các đặc trưng phân tích của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/ CuNPs ............... 62 3.1.5. Kết luận ..................................................................................................................... 67 3.2. Điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs ........................................................................ 68 3.2.1 Tổng hợp màng PDA – Cu(II) ................................................................................. 68 3.2.1.1. Khảo sát phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II) .................................................. 68 3.2.1.2. Khảo sát vai trò của Cu(II) trong PDA ............................................................... 70 3.2.1.3. Khảo sát số vòng điện phân.................................................................................. 72 3.2.1.4. Khảo sát dung dịch điện phân PDA – Cu(II) ...................................................... 74 3.2.2. Tổng hợp CuNPs ...................................................................................................... 77 3.2.3. Khảo sát các đặc trưng của điện cực GCE/rGO/PDA – Cu(II)/CuNPs ............. 78 3.2.4. Khảo sát độ chọn lọc của điện cực GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs ..................... 82 3.2.5. Kết luận ..................................................................................................................... 87 3.3. Điện cực Pt / Gr / PANi / ureaza ................................................................................ 88 3.3.1. Đặc tính của Gr tổng hợp......................................................................................... 88 3.3.2. Chế tạo vi điện cực Pt/Gr/ PANi/Ureaza ................................................................ 89 3.3.2.1. Tổng hợp điện hóa màng PANi trên vi điện cực tích hợp dropsens .................. 89 3.3.2.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu ............................................................................... 90 3.3.3. Kết quả phân tích hàm lượng UA sử dụng điện cực biến tính Pt/Gr/ PANi/Ureaza ....................................................................................................................... 92 3.3.4. Kết luận ..................................................................................................................... 93 3.5. Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực tế ................................................................... 93
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 với hàm lượng Gr khác nhau ..........................................................................................50 Bảng 3.3: Đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 khi điện phân PDA – Cu ở các khoảng thời gian khác nhau ..................................................53 Bảng 3.4: Đáp ứng của điện cực GC/Gr-PDA-Cu CuNPs với UA trong PBS pH 7 .....55 Bảng 3.5: Đặc điểm phân tích để xác định UA bằng các điện cực biến đổi khác nhau ......59 Bảng 3.6: Số liệu đường chuẩn xác định UA với điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs trong dung dịch đệm PBS 0,1M và pH 7, phương pháp xung vi phân ở các khoảng thời gian khác nhau.........................................................................................61 Bảng 3.7: Số liệu đường chuẩn xác định UA trong môi trường đệm PBS nồng độ 0,1M với pH 7 điện cực làm việc GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs...............................................63 Bảng 3.8: Độ lặp lại khi đo UA bằng điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs ...............63 Bảng 3.9: Các thông số thực nghiệm khảo sát đáp ứng của điện cực GCE/rGO/ePDA- Cu(II)/CuNPs và điện cực GCE/rGO/cPDA-Cu(II)/CuNPs với UA..............................69 Bảng 3.10: Các thông số thực nghiệm khảo sát vai trò của Cu(II) trong PDA lên bề mặt điện cực đối với khả năng đáp ứng UA ............................................................................71 Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào nồng độ UA ....................................72 Bảng 3.12: Các thông số thực nghiệm khảo sát sự thay đổi số vòng điện phân PDA-Cu đối với tín hiệu UA .............................................................................................................73 Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào nồng độ UA ......................................73 Bảng 3.14: Đáp ứng của điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs với ................................74 UA trong PBS pH 7............................................................................................................74 Bảng 3.15: Các thông số thực nghiệm khảo sát đáp ứng của điện cực với UA khi thay đổi số vòng điện phân CuNPs............................................................................................77 Bảng 3.16: Mối quan hệ giữa cường độ dòng và nồng độ UA........................................78 Bảng 3.17: Các thông số thực nghiệm khảo sát khoảng tuyến tính ................................81 Bảng 3.18: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào nồng độ UA ......................................82 Bảng 3.19: Các thông số khảo sát đáp ứng của điện cực với UA ...................................86 Bảng 3.20: Độ lặp lại khi đo UA bằng điện cực GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs ...............86 Bảng 3.21: Kết quả đo cường độ dòng của dung dich ure 2mM ....................................92 Bảng 3.22: Bảng giá trị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch ure và tín hiệu dòng đo được ......................................................................................................................93 Bảng 3.23: Phân tích mẫu nước tiểu với các điện cực cảm biến .....................................94
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo của UA .................................................................................. 4 Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hóa UA trong cơ thể người [28].................................................. 5 Hình 1.3: Tín hiệu điện hóa của AA, DA, UA trên điện cực GCEbiến tính bằng TmPO4 và GO [61] .......................................................................................................................... 10 Hình 1.4: Xét nghiệm urê máu để đánh giá khả năng lọc của thận................................. 13 Hình 1.5: Cấu tạo và các thành phần của cảm biến sinh học [105] ................................ 16 Hình 1.6: Một số phần tử sinh học được sử dụng làm đầu thu sinh học......................... 17 Hình 1.7: Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và .................... 18 gắn kết hoá học. .................................................................................................................. 18 Hình 1.8: Cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi quang ....................................... 19 Hình 1.9: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học trên tinh thể QCM ................... 20 Hình 1.10. Cảm biến sinh học sử dụng vi lò xo phát hiện DAN..................................... 21 Hình 1.11: Cấu trúc của Gr ................................................................................................ 24 Hình 1.12: Các liên kết của mỗi nguyên tử các bon trong mạng Gr ............................... 25 Hình 1.13: Những tính năng kỳ diệu đã tạo cho graphen khả năng ứng dụng đặc biệt . 25 Hình 1.14: Cơ chế nhận biết ure ở bề mặt cảm biến sinh học ......................................... 31 Hình 2.1: Sơ đồ quá trình khảo sát thưc nghiệm, qui trình tối ưu chế tạo điện cực biến tính/CuNPs .......................................................................................................................... 43 Hình 2.2: Sơ đồ quá trình chế tạo điện cực biến tính GC/rGO/PDA–Cu/CuNPs .......... 44 Hình 2.3: Sơ đồ quá trình chế tạo điện cực Pt/Gr/PANi/Ureaza ..................................... 47 Hình 3.1: (A)Tín hiệu DPV, (B,C)đường chuẩn của điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs với UA trong dung dịch PBS pH 7 với độ dày lớp Gr khác nhau (1): 0,5 mg/mL; (2): 0,3 mg/mL .....................................................................................................51 Hình 3.2: Đường chuẩn và tín hiệu DPV của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với UA trong PBS pH 7 theo hai phương pháp tổng hợp PDA – Cu(II) khác nhau (Phương pháp CA và CV) .................................................................................................................52 Hình 3.3: Ảnh SEM và phổ EDS của GCE/Gr/PDA-Cu(II) (A & B) và GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs (C & D) .......................................................................................................54 Hình 3.4: Tín hiệu CV khi quét dung dịch K3FeCN)6/K4Fe(CN)6 5mM và KCl 0,1M với các điện cực làm viêc: (1) GCE/Gr, (2)GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs; (3): GCE/Gr/PDA – Cu(II); ......................................................................................................56 Hình 3.5: (A) Đồ thị của dòng điện cực đại đáp ứng của điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs trong 5,0 mM Fe (CN)6 4-/3- so với căn bậc hai của tốc độ quét; (B) Các tín hiệu CV của điện cực GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNP trong 5,0 mM Fe (CN)6 4-/3- ở các tốc độ quét khác nhau từ 10 đến 120 mV /s ...............................................................57 Hình 3.6: (A) CV của GCE/Gr/PDA – Cu(II)/CuNPs trong 0,1 PBS (pH 7,0) trong 167 µM UA với tốc độ quét khác nhau từ 10 mV.s-1 đến 70 mV.s-1. (B) tín hiệu DPV của UA trong 0,1 PBS (pH 7,0) tại GCE biến tính. .........................................................57 Hình 3.7: (A) Đường cong DPV; (B) sự phụ thuộc của dòng điện anot so với nồng độ UA khác nhau trong PBS 0,1M (pH 7,0) ở các điện cực biến đổi khác nhau: a)
GCE/Gr/PDA–Cu(II)/CuNPs và (b) GCE/Gr/CuNPs và (c) GCE/Gr và (d) GCE/PDA–Cu(II)/CuNPs trong UA. ................................................................................58 Hình 3.8: (A) DPV đáp ứng với 292 µM UA với GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs trong các điều kiện pH khác nhau (pH = 2,5 ÷9); và (B) Sự phụ thuộc của Epa vào pH........60 Hình 3.9: Tín hiệu DPV của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs với citric trong dung dịch chứa UA 1,07.10-4 M + PBS pH 7 ...................................................................62 Hình 3.10: (A)Tín hiệu DPV và (B) đường chuẩn UA trên điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs, môi trường pH 7 dung dịch đệm PBS 0,1M ...........................................62 Hình 3.11: Độ ổn định tín hiệu sau nhiều lần đo ở nhiều nồng độ UA của điện cực GCE/Gr/PDA-Cu(II)/CuNPs .............................................................................................64 Hình 3.12: Cơ chế đề xuất khả năng chọn lọc UA của điện cực GCE/Gr/PDA- Cu(II)/CuNPs………………………………………………………………………65 Hình 3.13: Đáp ứng của điện cực GCE/rGO/ePDA-Cu/CuNPs và điện cực GCE/rGO/cPDA-Cu/CuNPs với UA trong PBS pH 7 ....................................................70 Hình 3.14: (A)Tín hiệu xung vi phân và (B) đường chuẩn của điện cực GCE/rRGO/PDA-Cu/CuNPs. ...........................................................................................71 Hình 3.15: Tín hiệu DPV và đường chuẩn của điện cực GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs khi điện phân 3 vòng khi tổng hợp PDA-Cu(II)...............................................................73 Hình 3.16: Tín hiệu DPV và đường chuẩn của điện cực GCE/rGO/PDA – Cu(II)/CuNPs với tỉ lệ dung dịch khác nhau ....................................................................76 Hình 3.17: (A) Tín hiệu xung vi phân và (B) đường chuẩn của điện cực GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs có số vòng điện phân CuNPs 10 vòng ..........................78 Hình 3.18: Tín hiệu CV của quá trình điện phân (A) PDA-Cu(II) và (B) CuNPs trong dung dịch CuCl2 30mM + DA 10mM ở khoảng thế từ -0,3V đến +0,5V, tốc độ quét 10mV/s ................................................................................................................................79 Hình 3.19: Tín hiệu CV của các điện cực biến tính khác nhau khi quét dung dịch K3FeCN)6/K4Fe(CN)6 1mM và KCl 0,1M ở thế từ -0,3 – 0,5V, tốc độ quét 100mV/s: (a) GCE/rGO; (b) GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs; (c) GCE/rGO/PDA-Cu .......................79 Hình 3.20: (A) Ảnh SEM và (B) phổ EDS của GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs ...........80 Hình 3.21: Tín hiệu CV của UA trên GCE/rGO/PDA-Cu/CuNPs với các tốc độ quét thế khác nhau từ 20 mV/s đến 125 mV/s. .........................................................................81 Hình 3.22: (A) Tín hiệu DPV và (B) đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ dòng vào nồng độ UA ........................................................................................................82 Hình 3.23: Tín hiệu xung vi phân của UA khi trong dung dịch có mặt DAở nồng độ 1,07×10-3M với nồng độ UA ở 1,07×10-4M trên điện cực làm việc GCE/rGO/PDA- Cu/CuNPs trong môi trường đệm PBS 0,1M, pH 7 .........................................................83 Hình 3.24: Tín hiệu xung vi phân của UA trong dung dịch có mặt của Paracetamolvới nồng độ 6,40×10-4M so với nồng độ UA 9,60×10-5M trên điện cực làm việc GCE/rGO/PDA–Cu/CuNPs trong môi trường đệm PBS 0,1M, pH 7, ở nồng độ UA 9,60×10-5M..........................................................................................................................84 Hình 3.25: Tín hiệu xung vi phân của UA1,07×10-4M khi trong dung dịch có mặt NO2- 1,06×10-2M..........................................................................................................................84
Hình 3.26: Tín hiệu DPV của UA 1,07×10-4M cùng với sự có mặt của đường glucozo 1,07×10-4M..........................................................................................................................85 Hình 3.27: Độ ổn định tín hiệu sau nhiều lần đo ở nhiều nồng độ UA của điện cực GCE/rGO/PDA-Cu(II)/CuNPs ..........................................................................................87 Hình 3.28: Ảnh SEM bề mặt của màng graphen trên đế đồng được tổng hợp bằng phương pháp CVD nhiệt ....................................................................................................88 Hình 3.29: (A) Phổ Raman và (B) hình ảnh HRTEM của màng Gr tổng hợp...............89 Hình 3.30: Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng PANi trên điện cực Pt (a) và trên điện cực Pt gắn màng Gr (b) ............................................................................90 Hình 3.31: Phổ CV (A, B) và đồ thị (C) khảo sát sự ảnh hưởng của pH tới cường độ dòng .....................................................................................................................................91 Hình 3.32: Phổ CV (A) và (B) đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của chất đối........................91 chứng axit ascorbic .............................................................................................................91 Hình 3.33: (A) phổ CV và (B) đường biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ urê vào cường độ dòng. ...................................................................................................................92
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt AA Ascobic Acid axit ascobic CA ChronoAmperometry Kỹ thuật đo dòng - thời gian CME Chemical Modified Electrode Điện cực biến tính hóa học CV Cyclic Voltammetry Von-Ampe vòng CVD Chemical Vapor Deposition Lắng đọng pha hơi hóa học CuNPs Copper Nano-Particles Hạt đồng nano DA Dopamine Dopamin DPV Different Pulse Voltammetry Von - Ampe xung vi phân EDS Energy Dispertive Spectroscopy Phổ tán xạ năng lượng GCE Glassy Carbon Electrode Điện cực glasy cacbon GO Graphene Oxide Graphen oxit Gr Graphene Graphen HPLC High Performance Liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao Chromatography LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantity Giới hạn định lượng MEMS Micro Electronic Mechanical Công nghệ Vi-cơ điện tử System NCP N-methyl-N- (4-aminophenyl) -3- N-methyl-N- (4-aminophenyl) -3- methoxyaniline methoxyanilin p – ABSA Poly Amino Benzen Sunfonic Acid PAR Paracetamol Paracetamol PBS Phosphate Buffered Saline Đệm photphat PDA PolyDopamine Polydopamin PMEs Polymer-Modified Electrodes Điện cực biến tính/polyme PPy Polypyrrole Polypyrol
QCM Quartz Crystal Microbalance Vi cân tinh thể thạch anh rGO Reduced - Graphene Oxide Graphen oxit khử SEM Scanning Electron Microscopy Hiển vi quét điện tử SWV Square Wave Voltammetry Von-Ampe sóng vuông TOOS N-ethyl-N- (2-hydroxy-3- N-ethyl-N- (2-hydroxy-3- sulfopropyl) -3-methylaniline sulfopropyl) -3-methylanilin UA Uric Acid axit uric Uox Uricase Uricaza Xdh Xanthine dehydrogenase Xanthin dehydrogenaza 4-AA 4-aminoantipyrine 4-aminoantipyrin
1 MỞ ĐẦU Axit uric (UA) và Ure là các thành phần thường có trong dịch sinh học trong cơ thể người bởi chúng là sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa sinh hóa của cơ thể. Các thông số về hàm lượng UA và Ure là một trong số những kênh thông tin quan trọng giúp theo dõi sự hoạt động của gan và thận. Bệnh tăng huyết áp, bệnh tim mạch và bệnh gút có liên quan khi nồng độ UA trong huyết thanh và nước tiểu quá cao (khoảng 420 μ M và 4,43 mM) [ 1]. Tuy nhiên khi UA trong huyết thanh và nước tiểu thấp hơn 120 μ M và 1,48 mM là dấu hiệu của bệnh thoái hóa thần kinh [2]. Việc đánh giá tỷ lệ UA/creatinin trong nước tiểu cho phép theo dõi nhanh bệnh gút, bệnh thận [3], và tính hữu ích trong điều trị một số bệnh như tăng UA máu, suy thận và bệnh thận do UA cấp tính [4]. Phương pháp sắc ký để xác định đồng thời UA và ure hiện đang được tiến hành bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [5] điện di mao quản vùng [6], sắc ký lỏng khối phổ [7] và sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle [8]. Mặc dù các phương pháp này cho độ chính xác và độ nhạy cao, nhưng chúng khá phức tạp và đòi hỏi phải có thiết bị. Do đó, sự phát triển của một phương pháp phân tích nhanh UA và ure thay thế các phương pháp trên là cần thiết. Trong những thập kỷ qua, kỹ thuật điện hóa là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất do tính đơn giản, chi phí thấp, dễ xử lý, thời gian đáp ứng nhanh, tính di động và tiêu thụ điện năng thấp [9]. Nhưng UA, DA và AA cùng tồn tại trong dịch cơ thể, cả ba chất chuyển hóa này đều hoạt động điện hóa và do đó chúng thích hợp cho các phương pháp điện hóa. Ở các điện cực thông thường, cả UA, DA, AA bị oxy hóa, các đỉnh vôn – ampe thường trùng nhau nên khó xác định chúng một cách chọn lọc [10]. Do đó, các điện cực biến tính được chế tạo kết hợp với các vật liệu nano tạo thành nanocompozit được phát triển trong những năm qua để loại bỏ ảnh hưởng của AA. Nhờ các kĩ thuật biến tính, người ta có thể tạo ra những cảm biến có độ chọn lọc, độ nhạy, độ ổn định hay bền vững cao. Gần đây, hướng chế tạo nanocompozit polyme dẫn và vật liệu nanocacbon được đặc biệt quan tâm và thu được các kết quả rất khả quan. Graphen là vật liệu mới nhất được phát hiện năm 2004 và nhanh chóng thu hút sự quan tâm mạnh mẽ của các nhà vật lý, hóa học và khoa
2 học vật liệu trong và ngoài nước. Ngay sau khi được phát minh, graphen đã nhanh chóng được nghiên cứu chế tạo nanocompozit với polyme dẫn và kỳ vọng có được đặc tính vượt trội nhờ kết hợp các ưu điểm của cả hai vật liệu thành phần. Cho đến nay, một số điện cực biến tính đã được phát triển để xác định UA, urê bao gồm, các điện cực paste cacbon [11], ống nano cacbon liên kết [12], Điện cực biến tính đất sét [13], Điện cực oxi hóa màng kim cương [14], màng sol – gel xêramic kết hợp xanh methylen trên GCE [15], điện cực biến tính axit ferrocenecarboxylic [16], biến tính β- cyclodextrin copolyme của axit sulfanilic và N-acetylanilin [17], xử lý điện hóa điện cực bút chì graphit [18], điện cực GCE biến tính màng polymerized luminol [19], cảm biến điện hóa graphen pha tạp nitơ [20], graphen/Pt kích thước nano[21], điện cực enzym dựa trên màng poly (vinyl alcohol) / polyion phức hợp chứa pyruvat oxyaza [22], điện cực biến tính enzym paste cacbon [23], điện cực biến tính cấu trúc nano NiO [24], điện cực NiO/Cellulose/CNT để phát hiện ure không enzym [25]. Ở nước ta, trong thời gian gần đây, nghiên cứu chế tạo cảm biến điện hóa và sinh học để xác định ure và UA đã được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm tìm kiếm các vật liệu biến tính để nâng cao chất lượng về độ nhạy, độ chọn lọc và độ ổn định của cảm biến xác định UA và ure. Không nằm ngoài xu hướng phát triển của hóa học phân tích hiện đại, đề tài “Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính trên cơ sở graphen ứng dụng trong phân tích ure và axít uric ” được thực hiện nhằm mục đích chính: i) Nghiên cứu chế tạo điện cực cảm biến xác định hàm lượng ure, UA với độ nhạy và độ chọn lọc đáp ứng yêu cầu với mẫu sinh học . ii) Đánh giá khả năng áp dụng thực tế của cảm biến chế tạo được trên cơ sở xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu sinh học. Để đạt được mục tiêu nêu trên, các nội dung nghiên cứu khoa học quan trọng của luận án được thực hiện gồm: - Nghiên cứu vật liệu dùng biến tính điện cực để xác định UA bằng phương pháp điện hóa. - Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học xác định ure theo nguyên tắc đo điện thế và đo vôn-ampe.
3 - Khảo sát các điều kiện tối ưu nhất cho các điện cực đã chế tạo. - Sử dụng điện cực mới chế tạo, sử dụng qui trình xây dựng được xác định hàm lượng ure, UA trong mẫu nước tiểu. Đồng thời đánh giá độ tin cậy của qui trình phân tích qua độ đúng và độ lặp lại. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích.
4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Axit uric và ure 1.1.1. Axit uric 1.1.1.1 Giới thiệu chung UA là một hợp chất hữu cơ dị vòng ngưng tụ chứa các dị tố nitơ, ôxi với công thức C5H4N4O3. Hình 1.1: Công thức cấu tạo của UA Tên gọi hóa học: 7,9-dihydro-1H-purin-2,6,8(3H)-trion Tên gọi khác: 2,6,8 Trioxypurin. UA là một axit yếu với hệ số phân li (pKa) =5,75-10,3. Trong huyết tương với pH= 7,4 thì 98% lượng UA tồn tại dưới dạng muối kiềm : monosodium Urat [26] UA được tạo thành trong cơ thể do quá trình dị hoá các base purin (adenin và guanidin), sau đó chúng được hòa tan trong máu, đưa đến thận và thải ra ngoài qua nước tiểu. UA trong cơ thể được tạo ra từ hai nguồn sau [27]: Ngoại sinh: từ thức ăn đưa vào cơ thể có chứa chất purin với hàm lượng từ 100 - 200 mg/ngày; Nội sinh: do các tế bào chết của cơ thể sinh ra, khoảng 600 mg/ngày. pH nước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan UA, bình thường lượng UA thải qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày. pH càng lớn càng thuận lợi cho việc thải UA và ngươc lại càng khó khăn cho việc đào thải UA. - pH 5,0: UA bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L
5 - pH 7,0: UA bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L 1.1.1.2. Vai trò của UA trong cơ thể UA được hấp thụ từ chế độ ăn qua ruột. Phần lớn chúng sau đó sẽ được đào thải qua thận. Ngoài ra, một lượng đáng kể UA cũng được tái hấp thu bởi cơ quan này (Hình 1.2). UA được tìm thấy trong các tế bào, mô và cơ quan với các hàm lượng khác nhau. Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hóa UA trong cơ thể người [28] Khi nồng độ UA tăng cao quá mức bão hòa trong huyết tương, trong một số điều kiện vật lý, sẽ xảy ra sự lắng đọng của natri urat ở các khớp trong cơ thể. Sự lắng đọng này gây tổn thương đến nhiều cơ quan như mạch máu, tim, mắt, màng não, cơ quan sinh dục. Trong đó điển hình là sự lắng đọng ở khớp gây nên các cơn gút cấp do quá trình viêm khớp tái phát nhiều lần. Không chỉ có vậy, tăng UA còn là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý khác. Các tác giả Frederick Mahomed, Alexandre Haig và Nathan Smith Davis là những người đầu tiên đưa ra giả thuyết tăng UA gây tăng huyết áp và bệnh thận. Đã có một số công trình nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa hàm lượng UA với các bệnh liên quan đến tim mạch bao gồm tăng huyết áp, hội chứng chuyển hóa, bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não,
6 tiền sản giật và cả bệnh thận [29-34]. Nghiên cứu chỉ ra rằng nếu UA kết tủa và lắng đọng ở tim mạch thì gây viêm mạch máu, viêm màng ngoài tim; ở vùng đầu gây ra viêm kết mạc, viêm mống mắt, viêm tuyến mang tai, viêm màng não. Nếu kết tủa ở vùng sinh dục, các tinh thể uric gây viêm tinh hoàn, viêm tuyến tiền liệt. Ở chiều ngược lại, nồng độ UA quá thấp có thể dẫn đến các bệnh đa xơ cứng, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer và viêm thần kinh thị giác. Nồng độ UA huyết thanh tăng có thể xuất phát từ một số yếu tố, bao gồm cả nguyên nhân cấp tính và mãn tính. Các nguyên nhân cấp tính của tăng UA máu như uống nhiều rượu, hội chứng ly giải khối u (một biến chứng của hóa trị ung thư) và chế độ ăn uống có nhiều purin hoặc protein. Ngoài ra, tăng UA máu mạn tính có thể xuất phát từ các điều kiện làm giảm mức lọc cầu thận, giảm bài tiết…[34]. 1.1.1.3. Các phương pháp phân tích UA Phương pháp phổ biến để xác định nồng độ UA bao gồm: phương pháp phân tích sử dụng quá trình oxy hóa enzym của UA để tạo ra hydro peroxit, allantoin và cacbon dioxit [35], các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên các cột pha đảo cùng; phương pháp phát hiện bằng phương pháp UV kết hợp khối phổ (MS) [36]. Các phương pháp này bao gồm nhiều bước như chuẩn bị huyết thanh và các yêu cầu của phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm hoặc kỹ thuật ghép enzym xác định gián tiếp nồng độ của chất trung gian H2O2 [37]. Các phương pháp trên đòi hỏi các quy trình vận hành phức tạp, các công cụ đắt tiền và thử nghiệm viên phải được đào tạo chuyên sâu. Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp. * Phương pháp xác định UA sử dụng enzym Uox Tác giả San V [38] dựa trên phản ứng ghép oxy hóa giữa thuốc thử NCP và thuốc thử TOOS, trong hệ thống liên quan đến ba enzym: Uox, peroxidaza và ascorbat oxyaza. UA  uricase  allantoin + H2O2 Nồng độ của phức được hình thành bởi sự liên kết oxy hóa của thuốc thử NCP và TOOS tỷ lệ thuận với nồng độ UA.
7 Sử dụng phương pháp này UA có thể được xác định ở nồng độ tối đa lên tới 1,428 mmol/L. Nghiên cứu cho thấy sử dụng thuốc thử NCP có độ nhạy hơn khi xác định UA so với 4-AA. Độ nhạy của phương pháp này khi xác định UA là 0,71 đơn vị độ hấp thụ trên mỗi mmol/L của UA; giới hạn phát hiện là LOD = 0,0035 mmol/L và giới hạn định lượng là LOQ = 0,015 mmol/L UA. Một số phương pháp cố định enzym UOx dựa trên cảm biến sinh học và phương pháp quang phổ để xác định UA đã được công bố [37-40]. Ngoài ra, đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp quang phổ đơn giản để phát hiện UA trong nước tiểu bình thường và mẫu nước tiểu của bệnh nhân gút dựa trên phản ứng của hydro peroxide (H2O2) với màu vàng của muối 4-Aminodiphenylamin Diazonium Sulfat (variamin blue)(RT) để thu được dung dịch màu vàng lục nhạt. Độ hấp thụ của các sản phẩm là đầu ra của phản ứng enzym và muối RT màu xanh lam được phát hiện bằng máy quang phổ UV với độ hấp thụ tối đa ở 269 nm. Thời gian đáp ứng của phương pháp là 20 phút. Hoạt tính pH tối ưu trên các phản ứng muối RT của enzym và variamin màu xanh da trời là pH 9. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương pháp này rất tốt ở mức 0,7%. Biểu đồ hiệu chuẩn nồng độ UA khác nhau được tìm thấy trong khoảng 0,5-13 mM với giới hạn phát hiện là 0,58 mM [41]. Galban và cộng sự đã đưa ra một phương pháp xác định UA trong huyết thanh bằng phản ứng với UOx. Quy trình này dựa trên những thay đổi trong huỳnh
8 quang diễn ra trong phản ứng enzym của UOx với UA khi dung dịch được kích thích ở bước sóng 287 nm và phát xạ được đo ở bước sóng 330 nm. Kết quả cho thấy dải nồng độ làm việc là 3.10−5 – 6.10−4 M và độ tái lập 4% ứng với n = 7 [42]. * Xác định axit uric bằng phương pháp HPLC Kovarik và đồng nghiệp đã sử dụng các phép đo HPLC trên 300 mẫu huyết thanh được so sánh với phương pháp enzym. Các mẫu huyết thanh được khử protein bằng axit perchloric và được phân tích bằng HPLC với cột pha đảo MAG 1; 4.6 x 150 mm, Biospher PSI 200 C18, 5µm, pha động bao gồm 5% metanol trong 25 mmol/L natri dihydrogenphosphat pH 4,75. Kết quả cho thấy sai khác giữa các xét nghiệm và phân tích dưới 5%. Độ thu hồi từ 90,0-103,4%, giới hạn định lượng đạt được 10,0 μmol/L (3,3 pmol/lần tiêm). Kết quả thu được bằng phương pháp sắc ký có sự phù hợp tương đối tốt so với phương pháp enzym, nhưng cho giá trị trung bình cao hơn [43]. Hai Fang Li và đồng nghiệp sử dụng phương pháp HPLC pha đảo (RP-HPLC) detector cực tím (UV) để xác định đồng thời các chất: Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu. Các mẫu được xử lý bằng cách pha loãng, ly tâm và lọc, thành phần trong các mẫu nước tiểu được phân tách bằng cột ODS-BP, sau đó rửa giải bằng dung dịch đệm metanol/50 mM NaH2PO4 ở pH 5,26 (5:95). Độ tuyến tính của các diện tích peak cực đại và nồng độ các dung dịch tiêu chuẩn thu được cho Creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin trong nước tiểu với các hệ số tương quan trong khoảng 0,9957 – 0,9993. Phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt (giá trị đối với UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 93,49; 97,90% và 95,38%). Giới hạn phát hiện (LOD, S / N≥3) đối với creatinin, UA, hypoxanthin và xanthin lần lượt là 0,010; 0,025; 0,050 và 0,025 mg / L [44]. * Xác định axit uric bằng phương pháp điện hóa Các kỹ thuật điện hóa đã được sử dụng để xác định nhiều chất, phổ biến nhất là các máy đo đường huyết được sử dụng bởi bệnh nhân tiểu đường. Ưu điểm của phương pháp phân tích điện hoá là thời gian tương đối nhanh khi so sánh với các phương pháp quang phổ [45]. Cảm biến điện hóa đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do lợi thế của thời gian phân tích ngắn,