Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ABA Abcisis acid

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

ATP Adenozin triphosphata

ATP-ase Enzym phân giải ATP

cDNA Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym

phiên mã ngược (Complementary DNA)

AS A. tumefaciens BAP bar bp CCM DEPC Acetosyringone Agrobacterium tumefaciens 6-benzyladenine gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase Base pair Cocultivation medium - Diethyl pyrocarbonate

đtg đồng tác giả

deoxynucleoside triphosphate Ethylene diamine tetraacetic acid Escherichia coli Gibberellic acid Germination medium – môi trường nảy mầm hạt β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

dNTP EDTA E. coli GA3 GM GUS HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) Indoleacetic acid IAA Indole-3-butyric acid IBA Isopropylthio-beta-D-galactoside IPTG kilo base kb Luria Bertani LB Least significant difference = độ lệch chuẩn LSD LEA Late embryogenesis abundant 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid MES Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) MS α-Naphthaleneacetic acid NAA nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density P5CS pyroline-5-carboxylate synthetase P5CDH Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase P5CR Pyrroline 5 carboxylate reductase PDH Pyrroline dehydrogenase

Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase Rooting medium – môi trường ra rễ Sodium dodecylsulfat Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi Thermus aquaticus DNA Transfer –DNA = đoạn ADN được chuyển Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u rd29A Responsive Dehydration PCR RM SDS SIM SEM Taq T-DNA Ti- plasmid TBE Tris - Boric acid - EDTA

TAE Tris - Acetate - EDTA

TE Tris - EDTA

v/p X-gluc X-gal vòng/phút 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

YEP Yeast extract peptone

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU................................................................................................................ 0 1. Đặt vấn đề........................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 4 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG ............................................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại................................................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học ......................................................................................... 4 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương ....................................... 5

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam............................. 6 1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ............................................................................................. 10

1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn ...................................... 11 1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ............................................................................... 11 1.2.1.2. Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn .................. 13 1.2.2. Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều kiện

hạn ........................................................................................................................ 14 1.2.2.1. Cường độ thoát hơi nước của khí khổng ................................................... 14 1.2.2.2. Cường độ thoát hơi nước của biểu bì ........................................................ 15

1.2.2.3. Mật độ lông tơ của lá................................................................................ 16 1.2.2.4. Hiệu quả sử dụng nước............................................................................. 17 1.2.3. Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn ... 18 1.2.4. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn ................................................................... 19 1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLIN ........................................................................................... 21 1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp prolin..................................................................... 21 1.3.2. Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật ............................................... 23

1.3.3. Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây...................... 25 1.3.4. Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống chịu của cây trồng .............................................................................................................................. 27 1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN

DƯỚI ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN 29

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter 29

1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học 30 1.4.3. Promoter rd29A 32 1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG................................................................................................................ 32

1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm .................................................................................................................. 32 1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng đậu tương chịu hạn ..... 33

1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương .............................................................................................................................. 35 1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .................................................. 35 1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây

đậu tương chịu hạn................................................................................................ 37 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 38 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ............................................................. 38

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 39 2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh ..................................................................... 39 2.2.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ........................................................... 39 2.2.1.2. Định lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt .... 39

2.2.1.3. Xác định hàm lượng prolin ....................................................................... 40 2.2.1.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ..................................................... 40 2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro................................................. 40 2.2.2.1. Arabidopsis ............................................................................................. 40 2.2.2.2. Thuốc lá .................................................................................................. 40 2.2.2.3. Đậu tương ............................................................................................... 41 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 44

2.2.3.1. Thiết kế mồi ............................................................................................. 44 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA...................................... 44 2.2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA................................................................... 45

2.2.3.4. Phản ứng PCR ......................................................................................... 45 2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention)........................................... 46 2.2.3.6. Phương pháp tách dòng ............................................................................ 46 2.2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ........................... 49 2.2.2.8. Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ..……………49 2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây biến nạp.................................................. 52

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 53 3.1. KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA ........................................................................... 53 3.1.1. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương........................................... 53

3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu ... 55 3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC ..... 58 3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS ......................................................................... 58 3.2.2. Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS ..................... 58 3.2.3. Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây đậu tương..... 69 3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A ................................................................................................. 72 3.3.1. Phân lập promoter rd29A............................................................................. 72 3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A ............................................................... 73 3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A ........................................ 75 3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS.......................... 75 3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM .......................................... 78 3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM.......................... 78 3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM ....................... 81 3.4.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen ................... 82 3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN.................................. 84

3.5.1. Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 .................................. 84 3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt .................................................................. 84 3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín ........... 87 3.5.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA3 tới khả năng kéo dài chồi ................... 89 3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ ................................................... 91 3.5.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro.......................................... 93 3.5.2. Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84...................... 94 3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương .................................. 96 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 102

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7

Bảng 1.2 Sản lượng đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7

Bảng 1.3 Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 8

Bảng 1.4 Sản lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố 9

Bảng 1.5 Cây chuyển gen mang gen P5CS 29

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 45

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 46

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng OE -PCR 46

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 47

Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid 48

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 49

50 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt rd29A và vector pBI 101 bằng

BamHI và HindII

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101 50

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM bằng BamHI và SacI 50

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101 51

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52

Bảng 3.1 Các giống đậu tương địa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La 53

Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống đậu 57

tương nghiên cứu

Bảng 3.3 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 58

64 Bảng 3.4 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống

đậu tương

Bảng 3.5 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin của gen P5CS ở 3 giống 65

đậu tương

Bảng 3.6 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 69

Bảng 3.7 Hàm lượng prolin tích lũy trong các dòng thuốc lá nghiên cứu 82

(µmol/g)

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến khả năng 85

nảy mầm đậu tương DT84

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng 86

nảy mầm đậu tương DT84

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi 88

90 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 92

Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu qua các giai đoạn 97

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao 22

Hình 1.2 Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở 23

thực vật

Hình 1.3 Vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây 25

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh cây đậu tương 42

Hình 2.2 Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm 43

Hình 2.3 Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A 49

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương đối của một số giống 56

đậu tương địa phương và giống DT84

Hình 3.2 Sản phẩm tách RNA 59

Hình 3.3 Kết quả nhân hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 59

và SL5

60 Hình 3.4 Kết quả PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu

tương DT84 và SL5

Hình 3.5 Kết quả tách dòng gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và 62

SL5

Hình 3.6 Trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 64

Hình 3.7 Trình tự axit amin của Protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống 67

đậu tương

68 Hình 3.8 Mức độ tương đồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của

các giống đậu tương.

Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức độ tương đồng 68

của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống đậu

Hình 3.10 Điện di sản phẩm PCR 70

Hình 3.11 Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với 70

cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS

71 Hình 3.12 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới

hạn BamHI

Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện đột biến tại 71

vị trí nucleotid 374 của gen P5CS

Hình 3.14 Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana 72

Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBT/rd29A 73

Hình 3.16 Phân tích trình tự promoter rd29A 74

Hình 3.17 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75

Hình 3.18 Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBI101/rd29A 75

Hình 3.19 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc lá 76

Hình 3.20 Biểu hiện gen GUS trên cây chuyển gen 77

Hình 2.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen

mang promoter rd29A dưới điều kiện hạn nhân tạo 78

Hình 3.22 Các sản phẩm cắt đồng thời bằng enzym BamHI và SacI 79

80 Hình 3.23 Điện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT

rd29A::/P5CSM

Hình 3.24 Kết quả colny PCR chọn dòng trong A. tumefaciens 81

Hình 3.25 Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A 82

for/rd29Arev

Hình 3.26 Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo 83

Hình 3.27 Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau 84

phục hồi (B)

87 Hình 3.28 Hạt nảy mầm bằng các phương pháp khử trùng khác nhau

Hình 3.29 Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau 89

90 Hình 3.30 Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA3 khác nhau

Hình 3.31 Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro 93

Hình 3.32 Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả 94

Biểu hiện của gen GUS Hình 3.33 95

Hình 3.34 Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá 96

mầm

97 Hình 3.35 Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen

98 Hình 3.36 Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen bằng PCR

Hình 3.37 Cây đậu tương T0 chuyển gen 98

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cây đậu tương (Glycine max L. Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng

không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Hạt đậu tương có

thể được dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con người và là nguồn nguyên liệu

quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến. Đậu tương là loại cây trồng ngắn

ngày, có giá trị kinh tế cao khi sử dụng làm thương phẩm, và được sử dụng cho mục

đích cải tạo đất. Bên cạnh đó, đậu tương rất dễ canh tác, có khả năng thích nghi với

nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác nhau và được trồng ở nhiều vùng quốc gia và vùng

lãnh thổ với sản lượng năm 2009 là trên 222 triệu tấn [107].

Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây

trồng ở nhiều địa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 là 239,1 nghìn tấn.

Theo thống kê năm 2009 cho thấy, cây đậu tương được canh tác có hệ thống trên diện

tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải đều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ

yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [107]. Trong khu

vực ASEAN, năng suất đậu tương năm 2009 của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước

trồng đậu tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Việt Nam. Tuy

nhiên so với các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa

Kỳ thì sản lượng đậu tương của nước ta còn khá thấp [107]. Vì thế, để đáp ứng đủ nhu

cầu trong nước nên chúng ta phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từ các quốc

gia bên ngoài đặc biệt là Hoa Kỳ.

Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở

Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới như

Argentina. Thống kê cho thấy, sản lượng đậu tương của Argentina vào vụ mùa năm

2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời điểm năm 2008 là 46,2 triệu tấn. Ở Việt

Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương

của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn

và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [106]. Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả

năng chịu hạn kém. Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống đậu tương có khả năng sống

trong điều kiện bất lợi về nước đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm của các

nhà chọn giống. Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn đã

được chọn tạo thành công và đang được triển khai canh tác ở một số địa phương. Có

thể kể đến các giống DT96, DT2008 do các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông

nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo. Dòng đậu tương ML48,

ML61 do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo có khả năng chịu hạn cao [15]. Tuy nhiên

các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có

quần thể đủ lớn và không ổn định. Những nhược điểm của phương pháp truyền thống

có thể được khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học. Kỹ

thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được

các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng và đạt được những kết quả rất có triển vọng

trên cây đậu tương. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện

nghiên cứu lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã thành công trong việc tạo ra các giống

đậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh [9]. Tuy nhiên, cho đến nay công trình

nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây đậu tương vẫn chưa được quan tâm đúng

mức. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ là: “Phân

lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm

chuyển vào cây đậu tương Việt Nam”

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của giống địa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt

và giống đậu tương DT84. Tạo được đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi

prolin.

2.2. Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu

tương.

2.3. Tạo cây đậu tương mang cấu trúc gen liên quan đến đặc tính chịu hạn.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Phân tích đặc điểm sinh lý, hóa sinh của một số giống đậu tương trồng tại khu vực

miền Bắc.

3.2. Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa enzyme pyroline-5 carboxylate synthetase

(P5CS).

3.3. Tạo đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) bởi prolin

bằng phương pháp tạo đột biến điểm.

3.4. Phân lập promoter cảm ứng dưới điều kiện khô hạn rd29A từ cây Arabidopsis

thaliana. Phân tích hoạt động của promoter dựa vào hoạt động của gen GUS ở các

dòng cây thuốc lá chuyển gen.

3.5. Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS đột biến được điều khiển bởi promoter rd29A và

chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá.

3.6. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh và khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá

trong điều kiện gây hạn nhân tạo.

3.7. Biến nạp cấu trúc mang gen P5CS vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens. Phân tích sự có mặt của gen biến nạp.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L. MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ

VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Cây đậu tương là một trong những loài cây trồng được biết đến từ rất sớm.

Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn

gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở

Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên. Cây đậu tương được

truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, du nhập vào nhiều nước Châu

Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó.

Cây đậu tương được trồng ở Châu Âu vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ thế kỷ XVIII .

Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm

Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill. Tuy nhiên

theo Hymowit và Newell (1984) thì ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja. Chi

Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài

đậu tương trồng Glycine max L. Merrill (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [6], (Trần Văn

Điền, 2007) [8].

1.1.2. Đặc điểm sinh học

Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn

non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây

cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân

có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo

giống.

Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3

thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của lá thay

đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp,

những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn.

Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc

thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự

thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.

Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3

hạt. Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục…, những giống có hạt màu vàng có giá trị

thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g. Hình dạng

và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống.

Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết

quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài

1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt

nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có

vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp

cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha.

Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất

sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung

bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120

ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 -

150 ngày (Ngô Thế Dân và đtg, 1999) [6], (Trần Văn Điền, 2007) [8].

1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương

Đậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó được

dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp,

làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt. Đậu tương được xem là ông

hoàng trong các cây họ đậu vì giá trị rất toàn diện của nó (Trần Văn Điền, 2007) [8].

Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá, thịt và

cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ

thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần

tạo cholesteron. Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng,

lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm

khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là các vitamin

nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và

các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa.

Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu về cung

cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -180C và từ dầu người ta

có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều ngành công

nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt

lỏng,…

Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có thể dùng

làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất trồng, một ha

đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá

với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu cơ. Việc luân

canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu.

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới: Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương nên đây được

xem là một trong những loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng

sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và

sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung

nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và

Nông nghiệp Liên hiệp quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng

3,6 triệu ha trong vòng 4 năm trở lại đây (năm 2006 là 95,2 triệu ha và năm 2009 là

98,8 triệu ha) [107].

Trong đó, Hoa Kỳ là quốc gia có diện tích gieo trồng cây đậu tương lớn nhất là

30,91 triệu ha tiếp đến là quốc gia Brazil (21,76 triệu ha) và Argentina (16,77 triệu ha)

vào năm 2009 (Bảng 1.1) trong khi đó Việt Nam chỉ có 0,15 triệu ha.

Mặc dù diện tích gieo trồng cây đậu tương tăng lên đáng kể trong các năm trở

lại đây tuy nhiên sản lượng đậu tương của cả thế giới lại có những biến động khác

nhau giữa các năm. Năm 2006 sản xuất đậu tương của cả thế giới đạt 221,9 triệu tấn,

năm 2007 giảm xuống còn 219,5 triệu tấn, tăng lên vào năm 2008 là 230,5 triệu tấn

nhưng năm 2009 chỉ còn 222,2 triệu tấn.

Bảng 1.1. Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Diện tích gieo trồng (triệu ha)* Quốc gia

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO) [107].

Argentina Brazil Trung Quốc Ấn Độ Indonesia Thái Lan Hoa Kỳ Việt Nam Năm 2006 15,13 22,05 9,30 8,33 0,58 0,14 30,19 0,19 Năm 2007 15,98 20,57 8,75 8,88 0,46 0,13 25,96 0,19 Năm 2008 16,39 21,06 9,13 9,52 0,59 0,12 30,22 0,19 Năm 2009 16,77 21,76 8,80 9,60 0,72 0,11 30,91 0,15

Năm 2009, Hoa Kỳ là quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới với 91,42 triệu tấn,

tiếp theo là Brazil với 56,96 triệu tấn và Argentina là 30,99 triệu tấn [107] (Bảng 1.2).

Bảng 1.2. Sản lượng đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Sản lượng (triệu tấn)* Quốc gia Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009

Argentina 40,54 47,48 46,24 30,99

Brazil 52,46 57,86 59,24 56,96

Trung Quốc 15,50 12,73 15.55 14,50

Ấn Độ 8,86 10,97 9,91 10,22

Indonesia 0,75 0,59 0,78 0,97

Thái Lan 0,21 0,20 0,19 0,19

Hoa Kỳ 87,00 72,86 80,75 91,42

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

Việt Nam 0,26 0,28 0,27 0,21

[107].

Trong bốn năm trở lại đây năng suất cao nhất đạt được vào năm 2007 là 24,3 tạ/ha

và thấp nhất là năm 2009 là 22,4 tạ/ha. Trong số các quốc gia trồng cây đậu tương hàng

đầu thế giới chỉ duy nhất Hoa Kỳ vẫn duy trì được năng suất cây đậu tương thậm chí có

phần tăng vào năm 2009 so với các năm 2006, 2007 và 2008 (Bảng 1.3). Argentina là

nước có năng suất đậu tương giảm mạnh nhất vào năm 2009 chỉ còn 18,48 tạ/ha so với

các năm trước trung bình đạt khoảng 27 tạ/ha (Bảng 1.3).

Bảng 1.3. Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

Quốc gia Năng suất (tạ/ha)* Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

Argentina Brazil Trung Quốc Ấn Độ Indonesia Thái Lan Hoa Kỳ Việt Nam 26,79 23,80 16,66 10,63 12,88 15,60 28,82 13,91 29,71 28,13 14,54 12,35 12,91 15,93 28,07 14,70 28,22 28,13 17,03 10,40 13,12 15,99 26,72 14,03 18,48 26,18 16,48 10,64 13,48 16,33 29,58 14,61

[107].

Có thể kể đến nhiều nguyên nhân làm cho năng suất và sản lượng đậu tương không ổn định trong một vài năm trở lại đây ở trên thế giới và tại các quốc gia trồng đậu tương là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác nhưng đáng chú ý nhất phải kể đến là do tình hình biến đổi khí hậu và hạn là một yếu tố có ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất

đậu tương trên thế giới. Hạn hán hay vấn đề không chủ động được nguồn nước làm giảm tới 40% phần năng suất của cây đậu tương. Theo thống kê của cơ quan nông nghiệp Hoa Kỳ thì sản lượng đậu tương của Argentina hơn 10 triệu tấn vào năm 2009, trong đó năng suất khoảng 10 tạ/ha. Nguyên nhân gây ra tình trạng này chính là do

tình trạng hạn hán tại một số nước Châu Mỹ Latinh trong đó có Argentina (Bảng 1.3). Do sự suy giảm năng suất và sản lượng tại hai quốc gia hàng đầu về sản xuất đậu tương là Brazil và Argentina nên đã ảnh hưởng đến sản lượng đậu tương của cả thế giới (Bảng 1.3).

Ở Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ lâu đời, trước cây đậu xanh và đậu đen. Tuy nhiên, với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống có năng suất thấp,

8 sản xuất nhỏ lẻ, giá thành đậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là lý do khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương. Diện tích trồng đậu tương tăng qua các năm nhưng vẫn chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ (1,5 - 1,6% tổng diện tích cây nông nghiệp).

Bảng 1.4. Sản lượng sản xuất đậu tương tại các tỉnh và thành phố

Sản lượng các địa phương (nghìn tấn)* Các địa phương 2006 2007 2008 2009

Hà Nội 2,1 2,1 43,9 11,8

Hà Tây 47,7 51,7

Vĩnh Phúc 10,2 6,4 10,5 4,2

Bắc Ninh 2,9 3,2 4,0 4,1

Quảng Ninh 1,1 1,1 1,1 1,3

Hải Dương 2,9 2,5 2,3 2,7

Hưng Yên 8,4 7,9 6,9 5,8

Thái Bình 12,4 13,8 14,0 16,8

Hà Nam 11,1 12,0 13,0 2,1

Nam Định 5,3 5,6 5,4 4,0

Hà Giang 14,1 14,1 20,4 23,7

Cao Bằng 4,4 5,2 5,1 4,1

Bắc Kạn 2,9 2,8 3,6 4,0

Tuyên Quang 3,2 4,1 4,5 3,9

Lào Cai 4,7 5,4 4,9 5,3

Thái Nguyên 3,6 3,1 2,8 2,5

Lạng Sơn 2,0 3,0 2,7 2,2

Bắc Giang 4,5 3,4 3,1 3,0

Điện Biên 10,7 11,2 13,0 11,7

Lai Châu 1,7 1,8 2,1 2,4

Sơn La 11,1 11,5 10,0 9,8

Hoà Bình 3,4 4,3 3,6 1,9

Thanh Hóa 6,6 7,6 6,3 7,4

Đắk Lắk 10,4 11,3 11,2 10,4

Đắk Nông 26,7 30,3 30,5 33,2

Đồng Nai 3,2 3,2 2,1 1,5

Đồng Tháp 14,0 16,6 13,7 10,7

3,1 2,0 1,6 2,8

An Giang * Theo số liệu của Tổng Cục Thống kê [107].

Mặc dù chưa có những số liệu thống kê cụ thể thiệt hại do hạn hán gây ra đối

với sản xuất đậu tương ở Việt Nam. Tuy nhiên, khi nhìn vào số liệu thống kê sản 9

lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố của Việt Nam có thể thấy rằng tại nhiều khu

vực sản lượng sản xuất đậu tương giảm đáng kể so với những năm trước đây, thêm vào

đó kết hợp với những thông tin về tình hình thời tiết bất thường trong vòng 3 năm trở

lại đây có thể thấy rằng bên cạnh những yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học khác

thì hạn hán cũng đã ảnh hưởng không nhỏ tới sản lượng đậu tương ở một số tỉnh thành

nói riêng và do đó ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất đậu tương của cả nước nói

chung.

Kết hợp với những số liệu thống kê cụ thể về sản lượng đậu tương ở các quốc

gia trên thế giới và đánh giá tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam trong vòng 4

năm trở lại đây có thể khẳng định rằng, vấn đề nâng cao khả năng kháng hạn trở nên

cấp thiết đối với cây đậu tương. Thêm vào đó những nghiên cứu này hoàn toàn mới

đối với tình hình nghiên cứu cây đậu tương tại Việt Nam và phù hợp với xu thế chung

trên thế giới.

1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU

TƯƠNG

Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng để có thể

thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia

thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape),

cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).

Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình

trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống đậu tương

ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này

để thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt

đầu nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này

có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước

xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có

các cơ chế để duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc

tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận

khác nhau của cây. Ở các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có

thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có

thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất

thấp. Sức căng của các mô và tế bào của cây được duy trì thông qua việc tổng hợp

mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi (Nguyen và đtg, 2007) [68].

1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn

1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy

nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu

tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ

để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu (Taylor và đtg, 1978) [93]. Bên

cạnh đó hệ thống rễ sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ

ẩm cao và tìm kiếm các chất dinh dưỡng. Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng

đến độ sâu của rễ đậu tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate). Do rễ trụ

được hình thành đầu tiên ở đậu tương, chính vì thế việc xác định các giống đậu tương

có đặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ. Sự

khác nhau về tính trạng kéo dài bộ rễ ở các giống đậu tương đã được nghiên cứu khá

chi tiết ở trong điều kiện nhà lưới (Kaspar và đtg, 1984) [54]. đã đánh giá 105 giống

đậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ khác nhau giữa các giống vào khoảng

1,3cm/ngày. Những nghiên cứu tiếp theo trên các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho

thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu trên 120cm so với các giống còn lại.

Một vài nghiên cứu cũng đã được thực hiện đối với hệ thống rễ nhánh của cây đậu

tương cho thấy trong điều kiện hạn số lượng rễ nhánh trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng

đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ không thay đổi. Hạn chế về nước ở cây

đậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ đó làm tăng tỉ lễ rễ : thân. Ở cây đậu

tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới

nước (Huck và đtg, 1983) [47]. Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương

quan rất chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu

trúc và số lượng rễ nhánh ở các giống chịu hạn. Những tính trạng này thường được

dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có

tính chịu hạn. Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia thành

hai giai đoạn là sinh trưởng sinh dưỡng (V) và sinh trưởng sinh sản (R). Giai đoạn V 11

được chia thành VE đến VN, trong giai đoạn VN đỉnh sinh trưởng xuất hiện và các

giai đoạn VN được đánh số phụ thuộc số lượng lá bánh tẻ xuất hiện. Giai đoạn R được

chia thành các giai đoạn từ R1 đến R8. Trong hai giai đoạn đầu R1 và R2 hình thành

hoa, giai đoạn R3 và R4 là sự hình thành quả đậu tương, các giai đoạn chín và làm

chắc hạt là từ R5 tới R8. Ở cây đậu tương, khi hạn hán xảy ra ở các giai đoạn sớm hay

muộn của giai đoạn sinh trưởng sinh sản làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, đặc biệt là

hệ thống rễ ở các lớp đất sâu. Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi

hạn hán xảy ra ở giai đoạn R4 và R5 (Hoogenboom và đtg, 1987) [43]. Trong một

nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi bị xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa

sẽ cho năng suất hạn cao những cây đậu tương bị xử lý hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa,

điều này được giải thích là do chúng đã phát triển bộ rễ đầy đủ để thích ứng với điều

kiện hạn trước khi nở hoa (Hirasawa và đtg, 1994) [39]. Các kết quả này cho thấy nếu

khi cây đậu tương phát triển bộ rễ lớn ở những giai đoạn sớm của quá trình sinh trưởng

sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các điều kiện hạn.

Các kết quả từ các nghiên cứu được trình bày trên đây cho thấy những tính

trạng bộ rễ có thể sử dụng để cải thiện tính chịu hạn ở cây đậu tương bằng các phương

pháp nhân giống thông thường. Tuy nhiên, các phương pháp đo đạc các tính trạng liên

quan đến bộ rễ thường rất khó thực hiện. Thay vào đó các phương pháp phân tử sẽ là

công cụ hỗ trợ cho các phương pháp truyền thống để nghiên cứu các tính trạng về rễ.

Quá trình chọn lọc các gen liên quan đến các tính trạng về rễ bao gồm các nghiên cứu

sàng lọc gen từ các cơ sở dữ liệu, thiết kế mồi để nhân bản gen, xác định sự đa dạng,

phát triển phương pháp phân tích hệ gen, xác định quần thể nghiên cứu. Phương pháp

này đã thành công trong việc xác định nhiều gen quý quy định các tính trạng rễ ở lúa

trong điều kiện hạn (Valliyodan và đtg, 2006) [98]. Thêm vào đó, việc hiểu biết các cơ

chế sinh lý và quá trình điều hòa di truyền của sự thích nghi của bộ rễ dưới điều kiện

hạn sẽ giúp ích cho việc xác định các gen đặc hiệu, các quá trình chuyển hóa để sử

dụng cho việc nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp sử

dụng chỉ thị gen hoặc kỹ thuật chuyển gen.

1.2.1.2. Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn

Khả năng cố định nitơ ở các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình

trạng nước ở trong đất. Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng

cố định CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định nitơ cũng bị ảnh hưởng

nghiêm trọng. Kết quả này làm giảm sinh tổng hợp protein (Purcell và King, 1996)

[75]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn đã được xác

định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2 giảm, nguồn carbon tới các nốt

sần giảm, hoạt tính của enzym sucrose synthase giảm, hàm lượng ure và axit amin tự

do tăng (King và Purcell, 2005) [56]. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và

nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của enzym

nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình

quang hợp giảm khoảng 5%. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp

đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng

khuyếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá

của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt

sần.

Sự thay đổi về di truyền cũng được xác định ở các cá thể nhạy cảm với khả

năng cố định nitơ trong điều kiện hạn. Khi so sánh các giống đậu tương có hoặc không

có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới điều kiện hạn ở giai đoạn sinh

trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất

hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong

những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn

trong điều kiện khô hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng đậu tương dựa

vào chỉ tiêu này, 8 dòng đậu tương có khả năng cố định nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt

hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng đậu tương này, Sinclair và đtg (2007) [86] tìm ra

rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên

cứu. Giống đậu tương Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố định nitơ cao, đã

được dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao

ở các điều kiện hạn. Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt được dùng để

cải thiện khả năng cố định nitơ và năng suất trong các điều kiện ngập úng (Sinclair và 13

đtg, 2007) [86]. Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích được liệu khả

năng cố định nitơ trong điều kiện hạn có được điều hòa ở mức độ cơ thể của cây đậu

tương hay không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta đã biết

rằng, tín hiệu điều hòa quá trình cố định nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen

feedback mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá. King và Purcell (2005)

[56] đề xuất giả thiết là sự kết hợp ure và axit aspartic ở nốt sần và quá trình vận

chuyển một số các axit amin từ lá có thể tham gia vào cơ chế ức chế phản hồi ở cây

đậu tương. Gần đây một nghiên cứu trên hệ thống rễ phân tách ở điều kiện hạn cho

thấy hoạt tính cố định nitơ được điều khiển ở mức độ khu trú (local) hơn là ở mức độ

tín hiệu nitơ hệ thống (Marino và đtg, 2007) [64]. Nhiều nghiên cứu cũng đang được

thực hiện theo hướng này để hiểu hơn bản chất phân tử các nhân tố hạn chế và điều

hòa quá trình cố định nitơ trong điều kiện hạn ở cây đậu tương.

1.2.2. Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều

kiện hạn

1.2.2.1. Cường độ thoát hơi nước của khí khổng

Cường độ thoái hơi nước của khí khổng là một trong những tính trạng sinh lý

của lá có liên quan chặt chẽ đến khả năng sử dụng nước của cơ thể thực vật khi cây

gặp điều kiện khô hạn. Khi cây gặp bất lợi về nước, cơ thể thực vật sẽ thực hiện quá

trình chuyển đổi từ pha trung hòa nước, mà trong đó việc sử dụng nước ở trong cơ thể

không tùy thuộc vào lượng nước ở bên ngoài, sang pha thứ cấp khi mà việc sử dụng

nước sẽ liên quan trực tiếp đến lượng nước ở bên ngoài (Sinclair và đtg, 1986) [85].

Quá trình chuyển hóa này liên quan đến việc giảm cường độ thoát hơi nước qua khí

khổng ở lá và có thể xảy ra ở nhiều loài cây khác nhau trong các điều kiện khác nhau.

Cường độ thoát hơi nước là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự trao đổi khí và

hơi nước ở lá. Ảnh hưởng của hạn hán đến sự sinh trưởng của lá, cường độ thoát hơi

nước và lượng nước ở trong cây được nghiên cứu khá chi tiết ở đậu tương. Chúng ta

biết rằng, hạn hán làm giảm tốc độ mở rộng của lá, cường độ thoát hơi nước của khí

khổng và sức căng của lá. Trong đó, nó làm tăng hàm lượng axit abscisic (ABA) ở lá

và xylem. Nghiên cứu này cho thấy việc giảm cường độ thoát hơi nước của khí khổng

xảy ra đồng thời với việc tăng hàm lượng ABA ở trong xylem và xảy ra trước khi có 14

những thay đổi về sức căng của lá. Điều này chỉ ra rằng các tín hiệu hóa học ABA bắt

nguồn từ rễ điều khiển hoạt động của khí khổng khi tính trạng thiếu nước tương đối ở

trong đất xảy ra (Liu và đtg, 2003) [61]. Sự khác nhau về mặt di truyền về khả năng

duy trì khí khổng mở dưới điều kiện bất lợi về nước đã được nghiên cứu ở đậu tương.

Khi so sánh các loài cây họ đậu khác với cây đậu tương cho thấy, cây đậu xanh, đậu

đen và đậu đũa có khả năng điều khiển sự đóng mở khí khổng tốt hơn khi cây bị mất

nước. Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh rất rõ ràng rằng cường độ thoát hơi

nước của khí khổng giảm tỉ lệ thuận với sự mất nước ở cây đậu tương (Liu và đtg,

2005) [62]. Khả năng điều khiển cường độ thoát hơi nước của khí khổng dưới điều

kiện hạn là một đặc tính sinh lý tốt để phát hiện các giống đậu tương chịu hạn do các

phương pháp đo đạc chính xác đã được phát triển. Tuy nhiên, khả năng di truyền tính

trạng này cũng là một yếu tố rất quan trọng cần được quan tâm.

1.2.2.2. Cường độ thoát hơi nước của biểu bì

Đặc tính sinh lý thứ hai của lá cũng có thể được sử dụng để đánh giá và xác

định khả năng chịu hạn và khả năng sinh trưởng của cây trồng trong điều kiện hạn đó

là cường độ thoát hơi nước của biểu bì của lá (Epidermal conductance). Cường độ

thoát hơi nước tổng số của lá được tính bằng tổng của cường độ thoát hơi nước của khí

khổng và của mặt biểu bì. Khi khí khổng mở, quá trình thoát hơi nước của biểu bì

thường không được tính đến khi tính toán cường độ thoát hơi nước tổng số của lá. Tuy

nhiên, khi lá bị thiếu nước hay bị bóng tối, trong các điều kiện này thì khí khổng

thường đóng, thì hệ thống thoát hơi nước ở bề mặt biểu bì có thể vượt qua cả cường độ

thoát hơi nước của khí khổng. Trong những điều kiện thiếu nước nghiêm trọng khi khí

khổng đóng hoàn toàn, cường độ thoát hơi nước của biểu bì được dùng để xác định

lượng nước mất mát của mô lá. Nhiều loại thực vật sống trong môi trường khô có

cường độ thoát hơi nước của biểu bì rất thấp (Riederer và đtg, 2001) [77], và những

loài cây trồng có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp thường duy trì khả năng

sống tốt và dài hơn trong những điều kiện khô hạn (Jovanovi và đtg, 1996) [52].

Nghiên cứu trên 74 giống đậu tương thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau cho thấy

sự khác nhau đáng kể về cường độ thoát hơi nước của biểu bì ở các giống này và có

quan hệ chặt chẽ với môi trường mà các giống nghiên cứu sinh sống. Điều đang quan 15

tâm đó là sự khác nhau này không liên quan đến sự khác nhau về mật độ khí khổng ở

lá. Những giống có cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp có thể cải thiện khả năng

phát triển và sinh trưởng của lá ở những điều kiện bất lợi về nước, vì thế diện tích lá

được duy trì đảm bảo sự sinh trưởng của cây sau khi bị hạn. Nghiên cứu gần đây cho

thấy mối tương quan nghịch (r = -0,74) giữa cường độ thoát hơi nước của biểu bì và

hiệu quả sử dụng nước trong điều kiện hạn, kết quả này dẫn đến một giả thiết cho rằng

cường độ thoát hơi nước của biểu bì thấp sẽ là một chỉ tiêu đáng tin cậy về tính chịu

hạn (Hufstetler và đtg, 2007) [48]. Giống đậu tương dại có cường độ thoát hơi nước

của biểu bì thấp hơn hẳn so với các giống đậu tương canh tác. Trong số các giống đậu

tương được gieo trồng ngày nay, các giống ở khu vực nhiệt đới có cường độ thoát hơi

nước của biểu bì thấp nhất và thế năng thẩm thấu nhỏ hơn so với các giống ở khu vực

khí hậu ôn hòa, điều này có thể là do quá trình chọn lọc tự nhiên dưới các điều kiện

môi trường (James và đtg, 2008a) [49]. Nghiên cứu trên các quần thể lai cho thấy

cường độ thoát hơi nước của biểu bì khác nhau một cách có ý nghĩa dao động từ 60 -

93% (James và đtg, 2008b) [50]. Như vậy tính trạng này có tính di truyền khá cao. Tuy

nhiên, để khẳng định tính hữu dụng của các tính trạng này trong việc tạo ra các giống

đậu tương có tính kháng hạn cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ

giữa cường độ thoát hơi nước của biểu bì, khả năng duy trì sức căng của lá và sức sống

của cây.

1.2.2.3. Mật độ lông tơ của lá

Hệ thống lông tơ của lá là một đặc điểm chung của các loài thực vật chịu hạn,

cũng như một số loài cây trồng trong đó có đậu tương. Trong điều kiện hạn thì đây là

một trong những tính trạng thích nghi quan trọng của cây đậu tương. Các dòng có mật

độ lông tơ cao có sức sinh trưởng sinh dưỡng tốt hơn, mật độ rễ nhiều hơn và rễ đâm

sâu hơn. Mật độ lông tơ của lá tăng lên làm tăng tính kháng ở các lớp bề mặt của lá lên

tới 50%. Nhiệt độ của lá giảm, sự mất nước bị giới hạn và quá trình quang hợp tăng

lên do sự thâm nhập của phóng xạ thấp hơn cũng có liên quan đến mật độ lông tơ của

lá (Specht và đtg, 1985) [87]. Hơn nữa, nếu hệ lông tơ càng dày đặc thì có thể làm

giảm hiện tượng nhiễm bệnh gây ra bởi virus khảm đậu tương. Tuy nhiên, mật độ lông

tơ được điều khiển bởi hai allen là Pd1 và Pd2, tăng lên sẽ tạo ra những hiệu ứng có lợi 16

và không có lợi về mặt nông học. Đặc biệt, các allen này đã được chứng minh là làm

giảm năng suất hạt, làm trễ quá trình chín và tăng chiều cao của cây đi kèm với làm

tăng diện tích trồng (Specht và đtg, 1985) [87]. Chính vì vậy, mối liên quan bất lợi

giữa mật độ lông tơ của lá và năng suất hạt cần được xem xét trước khi đưa tính trạng

này vào các dòng/giống đậu tương quý.

1.2.2.4. Hiệu quả sử dụng nước

Hiệu quả sử dụng nước của cây được định nghĩa chung là lượng sinh khối tích

lũy trên một đơn vị nước sử dụng. Sự đa dạng về di truyền liên quan đến hiệu quả sử

dụng được đã được nghiên cứu nhiều năm trên nhiều đối tượng cây trồng bao gồm cây

đậu tương. Hiệu quả sử dụng nước cao giúp cải thiện năng suất của cây trồng trong

điều kiện hạn. Mối tương quan thuận giữa hiệu quả sử dụng nước và năng suất sinh

khối tổng số trong điều kiện hạn cho thấy việc cải thiện hiệu quả sử dụng nước của

một cây trồng có thể dẫn tới năng suất cao nếu chỉ số thu hoạch được duy trì. Giống

đậu tương “Young” có hiệu quả sử dụng nước tương đối cao (4,4g dw/l) trong điều

kiện nhà lưới. Trong một nghiên cứu khác cho thấy giống đậu tương “Jackson” tích

lũy sinh khối tốt hơn và lượng nitơ tổng số cao hơn các giống khác trong cùng điều

kiện hạn nhân tạo. Mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và năng suất trung bình là

một bằng chứng cho thấy hiệu quả sử dụng nước của cây đậu tương có thể được cải

thiện một cách đơn giản bằng cách chọn lọc cá thể mang kiểu gen có năng suất trung

bình cao hơn. Trong một nghiên cứu trên 24 giống đậu tương khác nhau, hiệu quả sử

dụng nước dao động từ 2,7g trọng lượng khô/kg nước cho tới 3,4g trọng lượng khô/kg

nước (Hufstetler và đtg, 2007) [48]. Một giả thiết được đặt ra là khả năng mở khí

khổng có thể được điều hòa theo các mức độ đóng của khí khổng tùy theo sự mất nước

ở đất có thể làm tăng hiệu quả sử dụng nước (Liu và đtg, 2005) [62]. Mặc dù có nhiều

kết quả khả quan đạt được theo hướng này nhưng vẫn còn nhiều điều không chắc chắn

liên quan đến việc thực hiện các kỹ thuật tưới tiêu ở các loài cây trồng khác nhau ở các

điều kiện môi trường khác nhau. Do đó, những hiểu biết sâu sắc bản chất sinh lý quá

trình điều hòa hoạt động khí khổng và để cải thiện hiệu quả sử dụng nước khi cây bị

hạn là cần thiết.

Một tính trạng liên quan đến hiệu quả sử dụng nước khác đó là hiệu quả thoát

hơi, mà được định nghĩa là quá trình đồng hóa và tích lũy chất khô trên một đơn vị

thoát hơi nước. Quá trình thoát hơi nước được kiểm soát bởi yếu tố di truyền và loại bỏ

lượng nước mất mát do sự bay hơi của đất, và do vậy cần phải được xem như là một

tính trạng tiềm năng.

1.2.3. Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn

Một trong những đáp ứng về phương diện hóa sinh thường thấy ở thực vật khi

cây gặp tình trạng khan hiếm về nước, đó là khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu

trong tế bào. Áp suất thẩm thấu được định nghĩa là sự tích lũy chủ động các chất trao

đổi trong mô, thế bào của thực vật để duy trì sức căng của tế bào và mô khi lượng

nước bên ngoài tế bào thụt giảm. Áp suất thẩm thấu có thể duy trì cường độ thoát hơi

nước của khí khổng và quá trình quang hợp trong các trường hợp thế năng nước thấp,

làm chậm quá trình úa của lá, giảm quá trình héo hoa, kích thích rễ phát triển và tăng

cường khả năng hút nước từ đất (Turner và đtg, 2001) [96]. Ở cây đậu tương áp suất

thẩm thấu của tế bào dao động từ 0,3 tới 1,0 Mpa, độ dao động ít hơn so với đậu cove

và đậu pigeon (Turner và đtg, 2001) [96]. Trong số 6 loài đậu tương nghiên cứu thì áp

suất thẩm thấu của lá đo được giao động từ 0,3 cho tới 0,5 Mpa trong điều kiện gây

hạn thực nghiệm. Trong một nghiên cứu gần đây các nhà khoa học đã thử đo đạc thế

năng thẩm thấu ở lá của các giống đậu tương trồng và đậu tương dại. Kết quả cho thấy

thế năng thẩm thấu của lá trong điều kiện hàm lượng nước tương đối chỉ là 70% ở các

giống đậu tương trồng dao động từ -2,3 cho tới -3,5 Mpa và ở các loài đậu tương dại là

-4,3 Mpa. Các nhà khoa học cũng đã xác định được mối tương quan rất có ý nghĩa (r =

0,98) giữa hàm lượng nước tương đối của lá và thế năng thẩm thấu tương đối trong số

các giống đậu tương nghiên cứu, kết quả này chỉ ra rằng, đối với các giống có thế năng

thẩm thấu cao hơn thì hàm lượng nước tương đối của lá giảm chậm hơn do đó khả

năng duy trì sức căng của mô dài và mạnh hơn trong điều kiện hạn (James và đtg,

2008b) [50]. Hầu hết các nghiên cứu được công bố về áp suất thẩm thấu ở các loài cây

trồng chỉ được thực hiện đơn thuần bởi các đo đạc ở lá và chỉ rất ít các nghiên cứu đưa

ra được mối quan hệ giữa áp suất thẩm thấu và năng suất cây trồng. Trên đối tượng

cây lúa mì, đã chứng minh được tiềm năng và giá trị của áp suất thẩm thấu đối với 18

năng suất cây trồng, ở cây đậu răng ngựa thì mối quan hệ giữa áp suất thẩm thấu ở lá

và năng suất trong điều kiện giới hạn về nước lại không ổn định (Turner và đtg, 2001)

[96]. Nghiên cứu các dòng đậu răng ngựa thu thập từ các khu vực khác nhau trên thế

giới đã chứng minh được rằng sự khác nhau về khả năng duy trì áp suất thẩm thấu ở

loài cây này có khả năng di truyền, nhưng khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu lại

không ổn định và khác nhau đối với mỗi vụ gieo trồng. Thêm vào đó các nhà khoa học

cũng nhận thấy rằng sự khác nhau về khả năng duy trì áp suất thẩm thấu không ảnh

hưởng nhiều đến năng suất trong điều kiện hạn cục bộ hay khi gieo trồng trong điều

kiện tưới tiêu đầy đủ. Những kết quả này có thể bắt nguồn từ nguyên nhân là do tập

tính sinh trưởng, mức độ hạn và các đặc tính của các giống nghiên cứu. Ngoại trừ duy

nhất mà các nhà khoa học tin rằng khả năng duy trì áp suất thẩm thấu giữ vai trò quan

trọng, đó là khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của bộ rễ do ảnh hưởng đến sức căng

của rễ sẽ giúp cho việc đâm sâu vào các lớp đất và vì vậy khả năng thu nhận nước sẽ

được cải thiện hơn cho cây trong các điều kiện hạn. Tính trạng này sẽ là một tính trạng

đáng được quan tâm trong việc nâng cao khả năng chống chịu hạn của cây trong điều

kiện bất lợi về nước. Vấn đề chính gặp phải đối với việc chọn lọc các giống có khả

năng duy trì áp suất thẩm thấu đó là sự giới hạn về số lượng nguồn gen. Mặc dù vậy,

(Turner và đtg, 2001) [96] đã nhận định rằng sự phát triển các công cụ chỉ thị phân tử

ở lúa và lúa mì có thể ứng dụng với mục đích chọn lọc các giống có khả năng duy trì

áp suất thẩm thấu mạnh ở cây đậu tương.

1.2.4. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các

kỹ thuật di truyền làm tăng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi đã được ứng dụng

rộng rãi trong cải thiện di truyền của một số giống cây trồng khác nhau. Việc sử dụng

các gen liên quan đến chống chịu đã được thiết kế chuyển vào hệ thống thực vật, cải

thiện mức độ chống chịu các điều kiện bất lợi của một số giống cây trồng. Gần đây các

nghiên cứu đã phát hiện rằng sự tác động của tác nhân bất lợi có liên quan đến sự biểu

hiện của một số gen chia làm 3 nhóm chính: (1) nhóm gen mã hóa protein chức năng

liên quan trong trao đổi các chất gây áp suất thẩm thấu, các protein bảo vệ, … (2)

nhóm nhân tố điều hòa sự phiên mã (transcription factors) và (3) nhóm nhân tố tín hiệu

(signaling factors). Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa phosphoryl

hóa các protein. Có vài protein kinase đã được miêu tả như nhân tố truyền tín hiệu

(signal transduction factor) liên quan đến phản ứng thẩm thấu ở thực vật. Trong đó,

SnRK2 (SNF1- related protein kinase 2) là protein kinase liên quan đến các phản ứng

thích nghi với điều kiện bất lợi của môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA

(Umezawa và đtg, 2004 [97]; Hiroaki Fujii đtg, 2009) [40]. Một số nghiên cứu cũng đã

chứng minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến phản ứng điều kiện mất

nước và siêu biểu hiện gen này có khả năng làm tăng khả năng chống chịu điều kiện

Protein chịu nóng (Hsps) chịu nóng, muối và nhiệt độ cao, tích tụ nước, đóng vai

trò quan trọng việc bảo vệ tế bào (Vierling và đtg, 1992 [99],Thomashow 1998 [94]).

Hsps có 5 dòng: Hsp100, Hsp90, Hps 70, Hps 60 và sHps. sHsps không chỉ được nhấn

mạnh trong phản ứng với độ nóng, mà còn với nước, muối, quá trình oxihóa và nhiệt độ

thấp (Sabehat và đtg, 1998 [78], Hamilton và đtg, 2001 [36]). sHsps và Hsps đóng vai trò

quan trọng trong việc tăng khả năng chống chịu trong điều kiện bất lợi của môi trường.

khô hạn của cây trồng (Umezawa và đtg, 2004 [97]).

Khi cây trồng gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như: nóng, lạnh, phèn, mặn,

hạn,...làm cho tế bào bị mất nước. LEA (Late embryogenesis abundant protein) là

loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối của quá trình hình

thành phôi, nó là một trong những nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện

mất nước của tế bào, nhóm gen mã hoá loại protein LEA còn đóng vai trò trong sự

chịu khô hạn của hạt. Khi hiện tượng mất nước xảy ra, gen LEA phiên mã một lượng

lớn mARN và protein LEA được tổng hợp. Ngoài ra LEA không những điều chỉnh quá

trình mất nước sinh lí khi hạt chín, mà còn hạn chế sự mất nước bắt buộc do các điều

R và đtg, 2005) [74]. Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi axit absisis

kiện ngoại cảnh bất lợi gây ra (Trần Thị Phương Liên [13], Close T.J, 1997 [25], Porcel

(ABA) và độ mất nước của tế bào, áp suất thẩm thấu trong tế bào. Nhiều gen LEA đã

được nghiên cứu, phân lập, xác định chức năng. LEA được chia thành các nhóm sau:

nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn gọi là dehydrin) (Close T.J.1997 [25]), nhóm 3-D7;

nhóm 4-D113; nhóm5-D29; nhóm 6- D95 (Trần Thị Phương Liên và đtg, 1999 [13],

Close T.J, 1997 [25]). Khi điều kiện mất nước xảy ra, protein LEA được tổng hợp với

số lượng lớn, trong đó dehydrin có thể chiếm tới 1% tổng số protein hoà tan của hạt

(Close T.J, 1997) [25].

P5CS (pyroline-5-carboxylase) là một trong những enzym chức năng, liên quan

quá trình tổng hợp prolin, một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điểu chỉnh

áp suất thẩm thấu khi cơ thể thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn

(Kohl và đtg, 1988 [59]; Kavi Kishor và đtg, 1995 [55]; Peng và đtg, 1996 [73]; Hua

và đtg, 1997 [46]; Zhang và đtg, 1997 [104]; Delauney và Verma, 1993 [30]). Gen

P5CS đã được sử dụng cho biến nạp làm tăng khả năng chống chịu khô hạn và mất

nước ở một số loại cây trồng (Zhang và đtg, 1995 [103]; Hong và đtg, 2000 [42]).

Tính chịu hạn là tính trạng đa gen, đòi hỏi những nghiên cứu tổng thể về mặt sinh

lý, hóa sinh kết hợp với sinh học phân tử, lập bản đồ gen dựa vào các chỉ thị phân tử

đồng thời với việc phân lập các gen liên quan đến tính chịu hạn trên từng đối tượng

cây, trong đó, việc nghiên cứu sâu hơn về protein liên quan đến tính chống chịu vẫn

luôn cần thiết (Trần thị Phương Liên, 2010) [13].

1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYM P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG

HỢP PROLIN

1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp prolin

Sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao có thể được thực hiện qua hai con đường

hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine. Prolin được tổng hợp từ glutamate được coi là một

trong những chu trình sinh tổng hợp quan trọng nhất của cơ thể thực vật ở những điều

kiện sinh lý nhất định, khi cây bị giới hạn về nguồn nitơ hay gặp phải những bất lợi về

áp suất thẩm thấu (Csonka và đtg, 1988) [26]. Trong khi đó con đường sinh tổng hợp

prolin thông qua ornithine thường xảy ra khi cây ở trong các điều kiện thừa nitơ

(Delanuney và Verma, 1993) [30]. Sinh tổng hợp prolin ở thực vật được minh họa tại

hình 1.1.

Hình 1.1. Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao

(Delanuney và Verma, 1993) [30]

P5CS là enzym giữ hai chức năng, thứ nhất enzym hoạt hóa glutamate trở thành

dạng hoạt động và thứ hai xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5-

carboxylate. Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi enzym

pyroline-5-carboxylate reductase để tạo prolin (Hu và đtg, 1992) [44].

Trong quá trình sinh tổng hợp gốc amin của ornithine có thể được chuyển thành

glutamic semialdehyde bởi sự xúc tác của ornithine aminotransferase hoặc thành keto-

aminovalerate bởi sự xúc tác của ornithine aminotransferase. Theo con đường thứ

nhất, glutamic semialdehyde sẽ được đóng vòng để tạo pyroline-5-carboxylate do hoạt

tính của pyroline-5-carboxylate reductase. Ở con đường thứ hai keto-aminovalerate

được đóng vòng tạo pyroline-2-carboxylate do hoạt tính của pyroline-2-carboxylate

reductase (Hình 1.1). Những phân tích về sự biểu hiện của ornithine aminotransferase

ở cây đậu cho thấy gen mã hóa cho enzym này biểu hiện rất yếu trong điều kiện bình

thường và điều kiện bất lợi, nhưng trong điều kiện thừa nitơ thì gen này biểu hiện rất

mạnh (Armengaud và đtg, 2004) [20]. Chính vì lý do này mà quá trình tổng hợp prolin

từ ornithine được cho là xảy ra trong các điều kiện thừa nitơ. Mặc dù vậy, trong một

vài trường hợp đặc biệt như ở cây cỏ ngọt và lá non của cây Arabidopsis thì hàm

lượng mRNA của gen ornithine aminotransferase tăng lên rất mạnh ở các điều kiện bất

lợi về áp suất thẩm thấu. Vì vậy, sự tích lũy prolin theo chu trình này cũng được coi là

có vai trò đối với tính chống chịu của cây khi gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm

thấu.

1.3.2. Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật

Mặc dù quá trình trao đổi prolin ở thực vật đã được nghiên cứu trên 40 năm,

nhưng kiến thức về cơ chế điều hòa quá trình này còn rất hạn chế. Hình 1.2 mô tả cơ

chế và các tác nhân có vai trò trong quá trình điều hòa trao đổi prolin ở thực vật. Quá

trình sinh tổng hợp prolin được hoạt hóa và quá trình dị hóa prolin bị hạn chế khi cây

bị xử lý bởi hạn, trong khi đó cung cấp nước trở lại cho cây thì các quá trình này sẽ

hoạt động theo hướng ngược lại.

Hình 1.2. Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật

(Szabados và đtg, 2009) [89]

Ở thực vật, quá trình sinh tổng hợp prolin được kiểm soát bởi hoạt tính của hai

gen mã hóa cho enzym P5CS. Hai gen này có độ tương đồng rất cao về trình tự mã hóa

nhưng biểu hiện lại rất khác nhau trong những điều kiện khác nhau. Ở cây

Arabidopsis, gen P5CS2 là một gen “giữ nhà” (housekeeping), hoạt động của gen này

chủ yếu ở các mô phân sinh như đầu rễ và đỉnh chồi, ở hoa và các tế bào nuôi cấy

(Székely và đtg, 2008) [90]. Cả hai gen P5CS đều hoạt động ở các mô phân sinh của

hoa, chủ yếu để cung cấp prolin cho quá trình phát triển của hoa (Mattioli và đtg,

2009) [65]. Gen P5CS1 của cây Arabidopsis hoạt động rất mạnh và được cảm ứng bởi

các yếu tố bất lợi về thẩm thấu, mặn và nó cũng được hoạt hóa bởi axit abscisic. Ngoài

ra, hoạt động của gen này và sự tích lũy prolin cũng bị kích thích bởi ánh sáng và bị ức

chế bởi các hợp chất brassinosteroid. Trong điều kiện bình thường, enzym phospholip

D (PLD) giữ chức năng như một chất điều hòa quá trình tích lũy prolin, trong khi đó

calcium và phospholipase C (PLC) kích thích quá trình phiên mã gen P5CS và sự tích

lũy prolin khi cây bị bất lợi về mặn. Ở loài cây chịu mặn Thellungiella halophila, PLD

lại là một chất điều hòa có tác dụng kích thích và PLC được cho là chất điều hòa có tác

dụng bất hoạt sự tích lũy prolin trong tế bào. Calcium có chức năng như một chất

truyền tín hiệu tương tác với nhân tố phiên mã MYB2 để hoạt hóa sự phiên mã của

gen P5CS1.

Tương tự như cơ chế điều hòa quá trình trao đổi prolin thông qua điều hòa sự

phiên mã các gen P5CS, hoạt tính của enzym P5CS cũng được kiểm soát bởi quá trình

trao đổi. Một trong những ví dụ điển hình đó là sự ức chế ngược hoạt tính P5CS bởi

prolin (Zhang và đtg, 1995) [103]. Khi enzym P5CS không bị ức chế bởi prolin thì sự

tích lũy axit amin này sẽ tăng rất mạnh trong tế bào. Quá trình chuyển hóa P5C thành

prolin không phải là bước giới hạn trong chu trình sinh tổng hợp prolin, chính vì vậy

sự điều hòa hoạt tính enzym P5CR cho thấy sự phức tạp trong cơ chế điều hòa sự

phiên mã của gen này. Khi phân tích promoter của gen P5CR ở cây Arabidopsis đã xác

định được một đoạn trình tự có chiều dài 69 nucleotid qui định hoạt động đặc hiệu mô

của gen (Hua và đtg, 1999) [45]. Tuy nhiên, các nhân tố tác động dạng trans liên kết

với đoạn trình tự cho đến nay vẫn chưa được xác định.

Trong khi quá trình sinh tổng hợp prolin bị kích hoạt bởi ánh sáng và các yếu tố

bất lợi về áp suất thẩm thấu thì quá trình dị hóa prolin lại được hoạt hóa trong điều

kiện không có ánh sáng và trong quá trình cây gặp các tác động bất lợi từ môi trường.

Quá trình này được kiểm soát bởi hai enzym là PDH và P5CDH (Hình 1.2). Quá trình

phiên mã của gen PDH được hoạt hóa bởi prolin và khi cây được cung cấp đủ nước

sau khi bị hạn, nhưng sự phiên mã của gen lại bị ức chế khi cây gặp điều kiện hạn do

đó đảm bảo prolin không bị phân giải khi cơ thể gặp các điều kiện bất lợi từ môi

trường. Sự phiên mã của gen PDH1 bị ức chế vào ban ngày và được hoạt hóa vào buổi

tối do đó hoạt động của gen ngược với hoạt động của gen P5CS1. Phân tích promoter

của gen PDH1 đã xác định được nhân tố cảm ứng với trạng thái thẩm thấu và prolin,

và nhân tố giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình hoạt hóa của gen (Satoh và đtg,

2002) [83]. Yếu tố phiên mã liên kết với nhân tố trên là họ protein giàu leucine

(Leucine Zipper Protein). Phân tích hoạt động của gen P5CDH cho thấy gen biểu hiện

rất yếu ở các mô của cây Arabidopsis và biểu hiện của gen tăng lên khi bổ sung prolin.

Trên promoter của gen phân lập từ Arabidopsis và lúa, các nhà khoa học cũng xác định

được các nhân tố tương tự trên promoter của gen PDH1. Hoạt động của gen FIS1 mã

hóa cho enzym P5CDH ở cây lanh bị hoạt hóa khi cây bị nhiễm virus và bị tổn thương.

Kết quả phân tích cơ chế điều hòa hậu phiên mã (post-transcription) cho thấy các đoạn

đối mã tồn tại trong tự nhiên của gen P5CDH tạo ra các cấu trúc ức chế RNA nhỏ

(small interfering RNA) hoạt hóa cho quá trình cắt các phân tử RNA của gen P5CDH,

do vậy làm giảm mức độ phiên mã của gen khi cây gặp các điều kiện bất lợi từ môi

trường. Kết quả này cho thấy cơ chế ức chế hoạt động của gen ở mức độ hậu phiên mã

là rất quan trọng trong việc điều khiển hoạt động của gen P5CDH ở thực vật (Borsani

và đtg, 2005) [24].

1.3.3. Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây

Prolin được xem là một chất thẩm thấu có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào

và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu. Tuy nhiên,

sự tích lũy prolin có thể ảnh hưởng đến tính chống chịu của cơ thể thực vật theo nhiều

con đường khác nhau. Hình 1.3 khái quát các vai trò của prolin đối với tính chống chịu

ở thực vật.

Hình 1.3. Sơ đồ mô tả vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây

(Szabados và đtg, 2009) [89]

Prolin có vai trò như là một chất định hình phân tử (molecular chaperone) trong

việc bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzym khác nhau.

Các ví dụ điển hình có thể kể đến đó là khả năng ổn định hoạt tính của M4 lactate

dehydrogenase khi có các tác động bất lợi về nhiệt độ xảy ra; bảo vệ nitrate reductase

khi tế bào gặp các tác động bất lợi về áp suất thẩm thấu và kim loại nặng; ổn định hoạt

động của các ribonuclease và protease trong điều kiện nồng độ arsen ngoài môi trường

tăng cao. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vai trò của prolin như một chất chống oxy

hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng (reactive oxygen residues) và bất

hoạt các gốc oxy tự do (singlet oxygen quencher) (Matysik và đtg, 2002) [66]. Khi xử

lý các tế bào nấm men bằng prolin cho thấy hàm lượng các gốc oxy phản ứng giảm, do

đó làm chậm quá trình gây chết tế bào theo chương trình (programmed cell death). Đối

với các tế bào người, prolin có thể ngăn ngừa tác động của các chất có khả năng gây ung

thư, trong khi đó đối với các tế bào tảo nuôi cấy ở các điều kiện có nồng độ kim loại cao

thì prolin có thể làm giảm quá trình phân giải các hợp chất béo. Dẫn chứng trên cây lúa

cho thấy, prolin làm giảm độc tính của thủy ngân thông qua quá trình phân cắt các gốc

oxy phản ứng như hydro peroxide. Hiệu ứng phá hủy của các gốc oxy tự do đối với hệ

thống quang hóa II có thể bị ức chế bởi prolin khi nghiên cứu trên hệ màng thylakoid. Tác

động của tia phóng xạ đến các tế bào tảo và cây thuốc lá chuyển gen tăng cường tích lũy

prolin cũng bị giảm thiểu khá mạnh (Szavados và đtg, 2009) [89].

Sự tích lũy prolin đã được chứng minh là có tính đặc hiệu loài, tuy nhiên liệu sự

khác nhau này có liên quan đến tính thích ứng của mỗi loài hay không vẫn còn là câu

hỏi mở đối với các nhà khoa học. Ở hai loài cây chịu mặn có họ hàng với Arabidopsis

là Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium, tích lũy prolin mạnh hơn hẳn so

với Arabidopsis ở trong điều kiện mặn. Sự tích lũy prolin của cây Thellungiella là kết

quả của sự tăng cường hoạt động của gen P5CS và giảm hoạt động của gen PDH (Taji

và đtg, 2004) [92]. Hàm lượng prolin cao có thể cải thiện tính chịu mặn ở loài cây ưa

mặn Pancratium maritimum thông qua khả năng ổn định hoạt động của nhiều enzym

khử độc và của bộ máy luân chuyển protein và kích thích sự tích lũy các protein có

chức năng bảo vệ. Hàm lượng prolin ở các loài cây ưa mặn khác như Camphorosma

annua và Limonium spp. không cao nhưng thay vào đó ở các loài này lại tích lũy mạnh 26

nhiều chất thẩm thấu khác như các loại carbohydrate hay các chất tổng hợp từ betain

(Murakeozy và đtg, 2003) [67]. Những nghiên cứu trên đây cho thấy, sự tích lũy prolin

thường đi kèm với những đặc tính chống chịu ở các loài cây; vì thế có thể cho rằng,

quá trình này là để giúp tăng cường tính chống chịu, tuy nhiên đây lại không phải là

một yếu tố quá cần thiết cho sự thích ứng của các loài thực vật khác nhau đối với các

điều kiện khắc nghiệt từ môi trường (Szabados và đtg, 2009) [89].

1.3.4. Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống

chịu của cây trồng

Thuốc lá là cây trồng đầu tiên được chuyển gen P5CS phân lập từ cây nho được

điều khiển bởi promoter 35S. Phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen này cho thấy:

hoạt động của enzym P5CS rất mạnh và hàm lượng prolin tích lũy tăng lên từ 10-18

lần so với cây đối chứng không chuyển gen. Tăng cường tích lũy prolin ở các dòng

thuốc lá này còn kích thích sự phát triển của sinh khối rễ khi cây bị xử lý mặn trong

các điều kiện thí nghiệm tại nhà lưới. Do hàm lượng prolin tăng lên rất mạnh ở các

dòng chuyển gen nên kết quả này cho thấy hoạt tính của enzym P5CS giữ vai trò quyết

định tới quá trình sinh tổng hợp prolin ở cây. Đặc biệt hơn, khi bổ sung thêm nitơ vào

môi trường nuôi cấy các dòng thuốc lá này thì hàm lượng prolin tăng lên đáng kể so

với dòng thuốc lá chuyển gen không được bổ sung nitơ. Những nghiên cứu ở enzym

P5CS tinh sạch từ cây đậu xanh cũng cho thấy, enzym này bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng

ức chế ngược bởi prolin và hoạt tính của enzym này giảm tới 50% khi bổ sung 50mM

prolin ngoại bào. Bên cạnh đó, nitơ đóng vai trò như là cơ chất và cũng là sản phẩm

cuối cùng của quá trình trao đổi prolin và cũng giữ chức năng điều hòa hoạt động của

prolin. Nghiên cứu trên cây Arabidopsis, các nhà khoa học đã chứng minh được mối

quan hệ chặt chẽ giữa hoạt động của enzym P5CS và sự tích lũy prolin trong điều kiện

cây bị xử lý mặn; và hiệu ứng ức chế ngược của prolin tới hoạt tính của P5CS cũng bị

ảnh hưởng trong các điều kiện bất lợi này. Khi chuyển gen P5CS đã bị gây đột biến

loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược bởi prolin vào cây thuốc lá, các nhà khoa học đã nhận

ra rằng các dòng thuốc lá chuyển gen này tăng cường tích lũy prolin nhiều hơn gấp 2

lần so với các dòng thuốc lá được chuyển gen P5CS kiểu dại. Thêm vào đó, khi xử lý

các dòng chuyển gen này với 200mM NaCl thì kích thích sự tích lũy prolin (Hong và

đtg, 2000) [42]. Những kết quả này là những dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức

chế ngược của enzym P5CS bởi prolin giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh

tổng hợp prolin trong cả điều kiện bình thường và khi cây gặp phải các điều kiện bất

lợi về áp suất thẩm thấu. Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh prolin thì cây có tính

chống chịu tốt hơn so với các loài thực vật khác trong các điều kiện hạn, mặn… Ví dụ

cây lúa chuyển gen P5CS phân lập từ cây đậu có tính kháng mặn tốt hơn hẳn các dòng

lúa đối chứng không chuyển gen. Tương tự như vậy, khi các nhà khoa học tiến hành

chuyển trực tiếp gen P5CS vào hạt phấn của của cây lúa mì và tiến hành kiểm tra tính

kháng trong điều kiện mặn thì cũng cho thấy các kết quả tương tự như ở cây lúa. Ở cây

cà rốt khi được chuyển gen P5CS các dòng cà rốt có tính kháng muối cao hơn tới 6 lần

so với dòng đối chứng. Những kết quả này không chỉ được chứng minh ở thực vật bậc

cao mà còn cả ở loài vi tảo Chlamydomonas reinhardtii khi được chuyển gen P5CS.

Các dòng vi tảo chuyển gen tích lũy prolin cao hơn 80% so với các dòng không

chuyển gen. Những dòng chuyển gen này sinh trưởng nhanh hơn trong môi trường có

chứa 100 micromole cadmium và khả năng tích lũy cadmium cao hơn tới 4 lần so với

dòng đối chứng. Gần đây, gen P5CS được phân lập thành công từ cây lúa và khi được

chuyển trở lại lúa nhằm tăng cường hoạt động của gen này các nhà khoa học đã nhận

thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh được cải thiện rõ rệt. Promoter của gen P5CS

cũng được nghiên cứu khá chi tiết ở cây Arabidopsis chuyển gen trong điều kiện hạn

(Kishor và đtg, 2005) [57]. Bảng 1.5 trích dẫn những loài thực vật đã được chuyển gen

P5CS và các đặc điểm quan tâm được cải thiện.

Bản chất tính kháng muối cũng được các nhà khoa học nghiên cứu trên đối

tượng cây thuốc lá Nicotinana plumbaginifolia đột biến bằng phương pháp sử dụng

đồng vị phóng xạ của carbon. Các nhà khoa học sgử dụng glutamate mang ion carbon

13 làm cơ chất cho sự tổng hợp prolin. Trong điều kiện mặn, các dòng đột biến tích

lũy prolin mạnh hơn các dòng kiểu dại. Nghiên cứu chỉ ra, rằng hoạt tính của các

enzym trong chu trình sinh tổng hợp prolin từ ornithine và quá trình dị hóa prolin

không bị ảnh hưởng và enzym P5CS cũng không bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng ức chế

ngược bởi prolin do đột biến ở các dòng thuốc lá này.

Tên loài

Kiểu hình của cây chuyển gen

Bảng 1.5. Cây chuyển gen P5CS

Thuốc lá Tăng cường sinh khối, lá và hạt phát triển bình thường

Thuốc lá

trong điều kiện muối Loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược của enzym P5CS và tổng hợp prolin nhiều gấp 2 lần Tăng cường sinh khối trong điều kiện hạn và mặn

Lúa Arabidopsis

Lúa Cây chuyển gen đối mã cho thấy cây dễ bị hạn và hình thái cây không bình thường trong điều kiện nuôi cấy bình thường Tăng cường tính chống chịu oxy hóa trong điều kiện bất

Lúa

lợi về áp suất thẩm thấu Rễ sinh trưởng tốt hơn và sinh khối phát triển trong điều kiện nồng độ NaCl là 200 mM

Lúa

Lúa mì Cây non chuyển gen biểu hiện tính kháng hạn và mặn tốt hơn Cây chuyển gen tổng hợp nhiều prolin và chịu mặn tốt

hơn

Chlamydomonas Dòng chuyển gen tích lũy nhiều prolin hơn tới 80% và

Nấm men chống chịu kim loại nặng tốt hơn Sinh trưởng giảm trong điều kiện không xử lý

Carot Lúa Cây chanh Chống chịu mặn tốt hơn Chịu lạnh và muối tốt hơn Chống chịu hạn tốt hơn

(Kishor và đtg, 2005) [57]

1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN

TRONG ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN

1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter

Promoter là vùng DNA trong gen của sinh vật có chức năng khởi đầu quá

trình phiên mã của gen. Tận dụng chức năng tự nhiên của promoter, các nhà khoa

học có thể điều khiển hoạt động của các gen một cách có chủ đích ở các cá thể. Ở

các loài sinh vật nhân thực, cấu trúc của một promoter bao gồm các thành phần

chính như sau: Phần lõi (Core) promoter

• Vị trí khởi đầu phiên mã (TSS)

− Vị trí khoảng -35

• Vị trí bám của RNA polymerase

− RNA-polymerase I: phiên mã gen mã hóa cho RNA ribosome

− RNA-polymerase II: phiên mã gen mã hóa cho mRNA và một số RNA nhân

− RNA-polymerase III: phiên mã gen mã hóa cho RNA vận chuyển và những

nhỏ (small nuclear RNA)

• Ví trí bám của các nhân tố phiên mã

• Phần cận biên (Proximal) promoter

− Vị trí khoảng -250

− Điểm bám của một số nhân tố phiên mã đặc biệt

• Phần ngoại biên (Distal) promoter

− Ví trí xa hơn ở phía thượng nguồn (upstream) (ngoại trừ enhancer hoặc

RNA nhỏ khác

− Điểm bám của một số nhân tố phiên mã đặc biệt

các vùng điều hòa không phụ thuộc vị trí và chiều)

Promoter là nhân tố quan trọng phối hợp với enhancer, silencer, nhân tố liên kết

trong việc quyết định mức độ biểu hiện của một gen nhất định [108].

1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học

Promoter của sinh vật nhân thực thường rất đa hình và khó xác định. Chúng có

thể nằm cách điểm khởi đầu phiên mã vài kilobase. Người ta thường tìm thấy hộp

TATA trong nhiều promoter của sinh vật nhân thực. Các liên kết giữa protein với hộp

TATA có tác dụng hỗ trợ việc hình thành phức hệ phiên mã của RNA polymerase.

Hộp TATA thường nằm khá gần vị trí khởi đầu phiên mã (trong khoảng 50 base) (Hồ

Huỳnh Thùy Dương, 2005) [7].

Trình tự điều hòa promoter của sinh vật nhân thực thường liên kết với các protein

gọi là nhân tố phiên mã.

Những nghiên cứu về promoter đã giúp các nhà khoa học tìm ra các hướng mới

nhằm điều khiển sự hoạt động của gen. Việc đi sâu vào nghiên cứu cấu trúc, chức năng

và các yếu tố liên quan của promoter đã cho thấy khả năng thay đổi sự biểu hiện gen

trong sinh vật cũng như các gen quan tâm bằng việc sử dụng cấu trúc (Promoter +

Gen). Do đó promoter được coi như là một nhân tố rất quan trọng trong việc kiểm soát

quá trình biểu hiện của gen (Goicoechea và đtg, 2005) [34], (Sambrook và đtg, 1989)

[81] (Xu và đtg, 2004) [101].

Phân loại các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học phụ thuộc vào từng

loại gen cụ thể. Các loại promoter này bao gồm:

Nhóm các promoter biểu hiện toàn phần: Những promoter này điều khiển hoạt

động của gen quan tâm ở tất cả các mô và tế bào. Sự biểu hiện của các gen quan tâm

này hoàn toàn không phụ thuộc vào các yếu tố tác động từ bên ngoài như môi

trường… Chính vì những ưu điểm này nên các loại promoter thuộc nhóm này thường

được dùng với phổ rất rộng ở các loài và các giới thực vật khác nhau.

Nhóm các promoter biểu hiện đặc hiệu mô hoặc ở các giai đoạn phát triển: Khác

với nhóm trên, các loại promoter thuộc nhóm này sẽ điều khiển sự biểu hiện các gen

quan tâm ở các mô nhất định trong cơ thể thực vật hoặc ở các giai đoạn phát triển nhất

định của cây. Ở thực vật, hoạt động của promoter ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các

gen ở các loại mô quan tâm bao gồm hệ thống bó mạch, các mô liên quan đến quá

trình quang hợp, ở các cơ quan dự trữ như củ hay hạt và ở các cơ quan sinh sản như

hoa đối với những trường hợp khác loài (thông thường được áp dụng cho các loài có

quan hệ họ hàng xa)… Tuy nhiên sự biểu hiện đặc hiệu chỉ thường đạt được đối với

cùng loài, chi hoặc họ. Điều này có thể là do tương tác của các yếu tố phiên mã đến sự

điều hòa hoạt động của các promoter (Hai và đtg, 2003 [35], (Hawkins và đtg, 1997) [37].

các promoter được phân lập từ các đối tượng nghiên cứu có quan hệ họ hàng gần như

Nhóm các promoter cảm ứng: Điểm khác biệt của các promoter thuộc nhóm này là

hoạt động của chúng không phụ thuộc vào các nhân tố nội sinh nhưng lại phụ thuộc

vào các yếu tố từ môi trường bên ngoài hay các yếu tố kích thích nhân tạo. Trong

nhóm này, hoạt động của nhiều promoter được kích hoạt bởi các nhân tố sinh học như

ánh sáng, nồng độ oxy, nhiệt độ và các yếu tố gây tổn thương. Bên cạnh đó, các loại

promoter được kích hoạt bởi các hợp chất hóa học cũng được quan tâm đặc biệt,

thường không có ở các cơ thể nghiên cứu. Trong số này, các promoter phản ứng với

các nhân tố phi sinh học, kim loại đồng, cồn, các nhóm chất steroid hay các loại thuốc

trừ sâu đã được đưa vào sử dụng để điều khiển hoạt động của các gen quan tâm trong

các điều kiện chủ động.

các vùng cơ bản của các promoter có nguồn gốc khác nhau (Baucher và đtg, 1999) [22].

Nhóm các promoter tổng hợp: Các loại promoter này được tạo ra bằng cách ghép nối

Ngoài các nhóm promoter kể trên, có thể kể đến các hệ thống biểu hiện khác dựa

trên các loại protein hoạt hóa dạng trans (trans-activating). Các hệ thống này điều hoà

sự biểu hiện của các gen quan tâm mà không phụ thuộc vào vị trí của gen đích. Trong

thực tế, nhiều loại promoter cảm ứng hóa học liên kết với các protein hoạt hóa dạng

trans và các promoter biểu hiện toàn phần (Baucher và đtg, 1999) [22].

1.4.3. Promoter rd29A

Gen rd29A là một gen bị cảm ứng biểu hiện dưới các điều kiện bất lợi như khô

hạn, mặn và lạnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Một số nghiên cứu đã phát

hiện được trình tự promoter rd29A chứa 2 vùng có hoạt tính cis là vùng cảm ứng ABA

(ABRE) và vùng cảm ứng mất nước (DRE)/C repeat (CRT). Cả 2 vùng đều liên quan

Shinozaki và Shinozaki, 1993 [102]). Nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã phân lập và

kiểm tra hoạt động của promoter rd29A trên nhiều loài cây như A. thaliana, thuốc lá và

lúa mì (Sun và Chen, 2002 [88]). Cấu trúc promoter rd29A điều khiển gen chỉ thị GUS

được chuyển vào cây khoai tây, mía. Hoạt tính của GUS đều được phát hiện trong cây

chuyển gen dưới điều kiện bất lợi của môi trường nuôi cấy (Zhang et al., 2005) [105].

đến sự biểu hiện các gen biểu hiện dưới điều kiện bất lợi của môi trường (Yamaguchi-

1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến

thực nghiệm

Dựa vào nguồn tác động mà người ta phân ra đột biến tự nhiên hay đột biến gây

tạo (Kodym và đtg, 2003) [58], dựa vào tính chất biến đổi cấu trúc của cơ sở vật chất

di truyền mà người ta chia đột biến thành đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể. Đột

biến tự nhiên phát sinh với tần số thấp, để khắc phục nhược điểm này người ta đã sử

dụng các tác nhân gây đột biến (tác nhân tố vật lí, hóa học) nhằm làm tăng tần số lên

10 đến 100 nghìn lần để tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc (Kodym và đtg, 2003)

[58]. Nghiên cứu cải tiến giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ra

đời từ những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng chỉ 30 năm gần đây mới phát triển mạnh

và có hiệu quả trong lĩnh vực tăng năng suất và phẩm chất giống cây trồng, góp phần

không nhỏ vào đời sống con người. Đối với cây đậu tương tại Việt Nam, Trần Đình

Long và đtg (1995) [14] tạo ra giống M103, giống được tạo ra từ giống đậu tương V70

năm 1978 sử dụng phương pháp xử lý đột biến bằng ethylenimin nồng độ 0,01%. Sau

đó, giống này đã được chọn thuần lại, khảo nghiệm và công nhận là giống quốc gia.

Giống M103 có khả năng chịu nóng tốt, chịu sâu bệnh ở mức trung bình, có thể gieo

trồng được cả 3 vụ trong năm nhưng thích hợp nhất là vụ hè. Sau 7 năm khảo nghiệm

liên tục (1998-2004) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, các tác giả Viện Di truyền

nông nghiệp đã sản xuất thành công giống đậu tương chịu hạn mới - DT96 có khả

năng chịu hạn tốt và cho năng suất cao. Hiện nay giống đậu tương này đang được

trồng khá phổ biến ở nhiều vùng canh tác và được Bộ NN&PTNT công nhận chính

thức là giống quốc gia vào tháng 7-2004. Chu Hoàng Mậu (2001) [15] sử dụng tia

gamma, hóa chất NMU, EI với các liều lượng và nồng độ khác nhau đã tạo được các

đột biến về hình thái, sinh lý cũng như đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể, từ 60 dòng đột

biến đậu tương đánh giá và chọn lọc qua 5 thế hệ đã thu được 4 dòng đậu tương với

những đặc tính nông sinh học ưu việt như: chín sớm (dòng ML59, ML61), có khả năng

chịu hạn (dòng ML48, ML61). Những dòng đậu tương này được gieo trồng tại nhiều

địa phương có điều kiện sinh thái khác nhau.

1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng đậu tương chịu hạn

Cơ sở khoa học đầu tiên của chọn dòng tế bào thực vật là tính toàn năng của tế

bào. Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát

triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều này đã được các nhà khoa học chứng minh qua

nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế

bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế

bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về

kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay

đổi đó ở mức độ cơ thể. Thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào

ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành

một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi di truyền do ảnh hưởng của các

yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hoà sinh trưởng. Tế bào nuôi cấy in vitro có tỷ lệ biến dị di truyền lớn (10-5- 10-8) vì thế có thể chọn được các cá thể đột

biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn giống thông thường

khác áp dụng trên cây nguyên vẹn. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào còn cho phép làm

giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn được những tính trạng mong muốn (Nguyễn

Đức Thành, 2000) [18].

Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma bao gồm tạo mô sẹo,

Nuôi cấy tế bào huyền phù và Nuôi cấy tế bào trần. Mô sẹo (Callus) là khối mô thực

vật gồm những tế bào chưa phân hoá, có khả năng phân chia liên tục và có tính biến

động di truyền cao. Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo được tạo ra bằng cách nuôi cấy

các cơ quan của thực vật (lá, hoa, quả, thân...) trong môi trường và điều kiện nuôi cấy

thích hợp. Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển

định kỳ, song việc cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh

cây và làm tăng tính biến động di truyền của mô. Những cây tái sinh từ mô sẹo với

những biến đổi di truyền phong phú có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra nguồn

nguyên liệu ban đầu cho quá trình chọn giống. Nhiều tác giả đã thu được những giống

cây trồng mới bằng con đường nuôi cấy mô sẹo. Hạn chế lớn nhất trong chọn dòng

bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt để do kích thước khối mô lớn và không

đồng nhất. Để đạt được hiệu quả cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước

nhỏ và đều nhau, kích thước thường dùng các khối mô sẹo có đường kính 1-3mm để

xử lý và chọn dòng chống chịu (Lê Trần Bình và đtg, 1998 [2]; Đinh Thị Phòng, 2001

[16]; Dix và đtg, 1986 [31]).

Người ta đã sử dụng các phương thức chọn dòng tế bào như chọn trực tiếp,

chọn gián tiếp và chọn tổng thể. Hướng nghiên cứu chọn dòng tế bào chống chịu ở

thực vật đã thu được nhiều thành tựu, đó là sự thành công tạo ra các dòng cây chịu

hạn, chịu lạnh, chịu nóng. Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học đã tạo được

2 giống lúa DR1 và DR2 vừa có khả năng chịu lạnh, chịu hạn bằng kỹ thuật chọn dòng

tế bào và nuôi cấy in vitro (Đinh Thị Phòng, 2001) [16].

1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương

1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật

Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu và

thành công trên nhiều đối tượng giống cây trồng như: chuyển gen thông qua

Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng hóa chất, xung điện, súng bắn

gen, chuyển gen bằng vi tiêm, chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng ủ dung dịch

hạt khô với dung dịch DNA… Hai phương pháp chuyển gen thành công nhất là

chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens.

Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen là phương pháp đưa các gen ngoại lai vào tế

bào chủ, là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là vàng (hoặc Vonfam) kích thước hiển vi (0.5-

5um) có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài

tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen được

áp dụng với những đối tượng mà việc chuyển gen bằng A. tumefaciens khó thực hiện được

(do không mẫn cảm với A. tumefaciens) hay khả năng tái sinh kém (khi chuyển gen vào tế

bào trần). Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen được sử dụng rộng rãi sau phương

pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các ưu điểm là có thể áp dụng

với hầu hết các loại mô và tế bào, chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh, dễ sử dụng với

quy trình đơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể được xử lý trong thời gian ngắn, các

vecto được thiết kế đơn giản, không đòi hỏi các trình tự DNA cho đoạn T-DNA như

chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens, cần một lượng nhỏ plasmid DNA, biểu hiện

gen tạm thời có thể được quan sát sau vài ngày. Tuy nhiên cũng có nhược điểm như nhiều

bản sao vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn cho việc phân tích chọn lọc về sau này,

hiệu quả chuyển gen thấp nhưng chi phí lại cao (Hiei và đtg, 1994) [38].

Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens được ứng dụng

rộng rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng nhờ những đặc tính ưu việt của hệ

thống chuyển gen này: giúp tạo cây trồng có tính bền vững cao; có thể chuyển một đoạn

DNA có kích thước tương đối lớn vào thực vật mà không cần thiết bị cũng như hệ thống

nuôi cấy phức tạp; số bản copy của gen chuyển trong cây chuyển gen ít, tạo thuận lợi cho

việc phân tích cũng như nghiên cứu sự biểu hiện của gen mới trong cây chuyển gen.

Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens thường được dùng cho

các loại cây hai lá mầm vì Agrobacterium tumefaciens mẫn cảm với các loại cây này. Tuy

nhiên, ngày nay người ta đã tìm ra các chủng A. tumefaciens mẫn cảm với cây một lá mầm

trong đó có ngô, lúa và các cây chuyển gen hữu thụ đã nhận được. Chuyển gen bằng

Agrobacterium tumefaciens đã được nghiên cứu thành công bởi nhiều tác giả, các yếu tố

ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển gen đã được tối ưu hoá như chủng Agrobacterium

tumefaciens, kiểu gen của từng loài, giống, thành phần môi trường nuôi cấy, nhiệt độ...).

Một nghiên cứu ở đậu tương đã kết hợp hai phương pháp dùng súng bắn gen và

Agrobacterium tumefaciens, trước khi lây nhiễm A. tumefaciens mô được làm bị thương

bằng cách “bắn” đạn không mang gen. Phương pháp này có thể cho hiệu quả lây nhiễm

cao, bởi sau khi bị “bắn” mô tạo phản ứng đối với vết thương, tạo điều kiện cho lây nhiễm

bằng Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có khả năng chuyển một đoạn

DNA từ Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào tế bào thực vật. Ti plasmid - một phân

tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử bằng 3-5% so với trọng lượng phân tử

của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Ti plasmid có kích thước khoảng 200 kb, trong tế bào chúng

tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập gồm 4 vùng tương đồng: A, B, C và D. Vùng A

luôn được truyền sang tế bào thực vật nên có tên là T-DNA. Tại đây có hai hệ gen: hệ gen

gây khối u onc (oncogenic) gồm các gen khi hoạt động sẽ sản sinh một lượng lớn các chất

kích thích sinh trưởng như auxin, cytokinin tạo thành khối u ở thực vật; hệ gen mã hoá

một số enzym điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn suất của các axit amin hay đường,

gọi là opin. Vùng B có liên quan đến sự tái bản. Vùng C liên quan đến sự tiếp hợp. Vùng

D chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của

tế bào thực vật.

Các vector dùng trong chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens là: vector

liên hợp và vector nhị thể, hai loại vector này đang được sử dụng rất có hiệu quả.

Đoạn T- DNA muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hoá bởi hoạt động

của các gen vir. Hiện tượng này xảy ra khi Agrobacterium tumefaciens bắt đầu tiếp xúc

với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy hay

protoplast, đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gen virA. Potein virA

nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium tumefaciens, đóng vai trò như một chất thụ

cảm đối với acetosyringon có trong môi trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự

hoạt hoá gen virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gen chỉ huy nằm sát trình tự khởi động

thuộc các gen vir khác nhau. Bằng cách như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hoá

làm tăng quá trình hoạt hoá của chính nó, đồng thời làm giảm hoạt động của các operon

B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-

plasmid tại hai trật tự biên, ở vị trí giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư của mạch đơn nằm phía

dưới. Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó

là một mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’ – 3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên

phải. Điều này giải thích tại sao đầu biên phải cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA vào

thực vật. Trong quá trình di chuyển, sợi đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trước khi

vào được đến nhân tế bào thực vật. Vì vậy, để giữ được tình trạng nguyên vẹn thì T- DNA

sợi đơn được gắn với virE. Sản phẩm của gen virB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có

nhiệm vụ chuyển trực tiếp DNA sợi đơn sang tế bào thực vật. Sau khi T-AND chui được

qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với DNA nhân thực vật ở những vị

trí ngẫu nhiên. Tại đó các gen trên T- DNA dưới sự điều khiển của gen thực vật bắt đầu

sản sinh ra auxin, cytokinin, opine dẫn đến sự hình thành khối u trên cơ thể thực vật (

Nguyễn Đức Thành, 2000) [18].

1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây

đậu tương chịu hạn

Những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật trong việc nâng cao

khả năng chịu hạn đã đạt được kết quả ở nhiều loài cây trồng khác nhau như lúa,

Arabidopsis thalian, bạch dương… Tuy nhiên những nghiên cứu tương tự ở đậu tương

còn khá là mới mẻ không chỉ trong điều kiện Việt Nam mà còn cả ở trên thế giới. Các

nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật chủ yếu tập trung vào một số tính

trạng như chống chịu bệnh và năng suất (Trần Thị Cúc Hòa, 2007) [9]. Ngoài ra cũng phải

kể đến việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen thực vật ở đậu tương nhằm mục đích tạo ra thư

viện các dòng đậu tương mang T-DNA phục vụ cho các nghiên cứu chức năng gen. Có

thể nhận định rằng tính khả thi và tiềm năng ứng dụng phương pháp chuyển gen thực vật

như là biện pháp nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương tại Việt Nam là rất cao.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

Nguyên liệu thực vật

Sử dụng 17 giống đậu tương làm vật liệu nghiên cứu, trong đó: 16 giống đậu

tương địa phương thu thập tại các huyện của tỉnh Sơn La và DT84 do Trung tâm

Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.

Arabidopsis thaliana do trường Đại học Tự do Vương quốc Bỉ cung cấp; giống

thuốc lá Nicotiana tabacum K326 do Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công

nghệ sinh học cung cấp.

Chủng vi khuẩn và các nguyên liệu DNA

Vector pBI 101, Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 101 mang vector

pPTN289 chứa gen gus intron và gen chọn lọc bar kháng ppt do Đại học Tổng

hợp Nebraska, Hoa Kỳ cung cấp. Vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ tế bào

thực vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α và A.tumefaciens CV58C1, EHA101 do

phòng Công nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp.

Hóa chất

Kit tinh sạch DNA (AccuPrep® Gel Purification Kit), các tách chiết và tinh sạch

plasmid (Plasmid Extraction Kit) của hãng Bioneer (Hàn Quốc). Các loại enzym hạn

chế của Fermentas (Hàn Quốc).

Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Glucose, Trypton, KCl,

Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, Nước khử

ion. Các loại kháng sinh kanamycin, rifapicine, cefotaxime, streptomycine,

spectinomycine và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose,...) của các hãng

Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech…

Môi trường sử dụng trong thí nghiệm tái sinh và chuyển gen vào cây đậu tương

là môi trường GM, SIM, SEM, RM. Môi trường nuôi khuẩn và tạo dịch huyền phù

khuẩn là LB, YEB, CCM. Thành phần các loại môi trường trên được trình bày trong

phụ lục 1 và 2.

Các chất điều tiết sinh trưởng: BAP, IBA, GA3,…và các kháng sinh:

kanamycin, cefotaxim, carbecillin

Thiết bị

Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300

(Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp

ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA,

Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung

điện Gen Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào

Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh

học.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh

2.2.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn

Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống đậu tương được tiến hành ở giai

đoạn cây non theo phương pháp của Lê Trần Bình và đtg, 1997 [1].

2.2.1.2. Định lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt

Định lượng protein

Định lượng protein tan được thực hiện theo phương pháp Lowry và đtg, 1951

[63]

Định lượng lipit

Nguyên tắc: Dựa vào tính chất hoà tan của dung môi hữu cơ để chiết lipit. Dung

môi hữu cơ được sử dụng là ete dầu hoả (petroleum ether). Hàm lượng lipit được tính

bằng hiệu số giữa khối lượng mẫu trước khi chiết và khối lượng mẫu sau khi chiết,

được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu [4]

Hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt

Xác định hàm lượng và thành phần axit amin trên máy phân tích axit amin tự

động HP-Amino Quant Seisee II của Phòng hoá sinh protein, Viện Công nghệ Sinh

học. Sử dụng OPA (ortho-phthalađehye) tạo dẫn xuất đối với axit amin bậc I và

FMOC (9-flueryl methy choloroforrmate) đối với axit amin bậc II. Mẫu được xử lý

theo phương pháp thuỷ phân trong pha lỏng trong hướng dẫn sử dụng máy phân tích

axit amin tự động theo Phan Văn Chi và đtg (1998) [5]. Thành phần axit amin được

tính theo g axit amin/100 g protein.

2.2.1.3. Xác định hàm lượng prolin

Hàm lượng prolin được xác định bằng phương pháp Bates và đtg (1973) [21]

2.2.1.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu

2σ , σ,

Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính bằng phần

S ( Nguyễn Hải Tuất và đtg, 1996) [17]

mềm Excel với các giá trị

2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro

Các môi trường đều được chuẩn pH = 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến

hành ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ chiếu sáng 30-40 µEm-2s-1, thời gian chiếu sáng

16 giờ sáng/ngày.

2.2.2.1. Arabidopsis

Hạt Arabidopsis được khử trùng bằng cách lắc nhẹ trong cồn 70% với thời gian

1 phút, Javel 30% cùng 0,05% Tween 20 trong thời gian 10 phút, sau đó rửa sạch bằng

nước cất vô trùng 5 lần. Sau khi khử trùng xong, hạt được thấm khô bằng giấy thấm vô

trùng và đặt trên môi trường nảy mầm. Sau khi hạt nảy mầm 2 tuần, thu mẫu để tách

DNA.

2.2.2.2. Thuốc lá

Khử trùng hạt (Topping 1988) [95]. Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20 giây và lắc

nhẹ. Sau đó loại bỏ cồn bằng pippet khử trùng. Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel

10-30% + Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20 phút. Lắc nhẹ nhàng. Loại bỏ dung dịch tẩy

bằng pippet và rửa hạt khoảng 5 lần bằng H2O cất khử trùng. Để lại một ít nước trong

ống 0.3-0.4ml.

Nảy chồi: Hạt thuốc lá sau khi khử trùng được đặt nhẹ nhàng lên đĩa petri có chứa môi trường nảy chồi (MS), để 4oC 2-3 ngày để xuân hóa. Sau đó chuyển ra buồng sinh

trưởng 22-25oC với ánh sáng 50-200µmol/m2/s. Có thể để ánh sáng cố định hoặc ngày

dài. Sau 2-4 ngày hạt sẽ này chồi và chuyển sang bình tam giác 50ml có chứa môi

trường nảy chồi.

Tái sinh đa chồi và chuyển gen: Sau 2-3 tuần cây con phát triển 3-4 lá thật thì có thể tiến hành nuôi cấy. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1cm2 và đặt lên môi

trường tái sinh GM (MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + BAP 1mg/l). Các mảnh lá này

cũng là đối tượng cho chuyển gen. Sau hai ngày trên môi trường GM, mảnh lá sẽ được

ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm.

Sau 10 phút, các mảnh lá sẽ được đồng nuôi cấy với vi khuẩn trên môi trường GM

(BAP 1mg/l) 2 ngày. Sau đó, các mảnh lá tiếp tục được chuyển lên môi trường GM

(BAP 1mg/l) để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục được cắt

chuyển sang môi trường GM mới.

Ra rễ: Sau 4-5 tuần các chồi phát triển cao khoảng 2-3cm thì được cắt và chuyển sang

môi trường ra rễ RM (MS + sucrose 30g/l + Aga 8g/l) có chứa kháng sinh chọn lọc và

IBA 0,1mg/l .

Ra bầu và nhà lưới: Sau 3 - 4 tuần cây con ra rễ và phát triển hoàn chỉnh với 3-4 lá

thật sẵn sàng cho ra bầu trấu : cát (1:1). Cây phát triển với 4-5 lá thật thì chuyển ra

trồng trong bầu 40% đất, 30% trấu hun hoặc mùn mục và 30% phân chuồng mục được

trộn đều và xử lý sạch bệnh dưới điều kiện nhà kính.

2.2.2.3. Đậu tương

Phương pháp tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín được tiến hành

dựa trên phương pháp của Olhoft và đtg, 2001 có cải tiến [69], [71]. Các bước thực

hiện theo sơ đồ hình 2.1.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các thí nghiệm

của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2,

cường độ chiếu sáng 2000 lux.

Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro

Hạt chín được loại bỏ tạp chất, các hạt kém chất lượng và tiến hành khử trùng

bằng khí clo. Khí clo được tạo ra bằng cách bổ sung vào 100ml javen 3ml HCl đậm

đặc. Việc khử trùng được thực hiện trong một bình kín và đặt trong tủ hút. Sau khi khử

trùng, cho hạt nảy mầm trên môi trường GM, sau 4-5 ngày cắt lấy phần lá mầm, tách

đôi hai lá mầm, loại đỉnh sinh trưởng, phần lá mầm còn lại sử dụng làm nguyên liệu

Hạt đậu tương

Khử trùng bề mặt

Nảy mầm

Gây tổn thương, gây nhiễm

Cảm ứng chồi

Kéo dài chồi

cảm ứng tạo đa chồi.

Ra rễ Ra cây Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh cây đậu tương

Cảm ứng tạo đa chồi: Các mảnh lá mầm được đặt lên môi trường cảm ứng tạo đa chồi.

Theo dõi tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/cụm sau thời gian cảm ứng là 4

tuần để đánh giá khả năng tạo đa chồi của giống đậu tương cũng như mức độ phù hợp

của môi trường

Kéo dài chồi: Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM

được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi

sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng như

chất lượng chồi.

Tái sinh cây hoàn chỉnh: Khi các chồi đạt chiều cao từ 4 - 5cm, chọn những chồi khỏe

42 chuyển sang môi trường ra rễ RM

Ra cây: Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2 tuần nuôi cấy) sẽ thực

hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một cách nhẹ nhàng, rửa sạch

phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được đặt trên giá thể ra cây. Cây sống sót

trên giá thể được đưa ra trồng trên chậu đất có bổ sung phân bón và trồng trong điều

kiện nhà lưới.

Quy trình chuyển gen vào nách lá mầm hạt chín: Phương pháp chuyển gen thông qua

nách lá mầm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Olhoft và cộng sự (2001) có cải tiến

Hạt đậu tương

Chủng vi khuẩn A. tumefaciens

Khử trùng bề mặt

Nuôi lỏng khuẩn

Nảy mầm

Tạo huyền phù khuẩn

Gây tổn thương nách lá mầm, nhiễm khuẩn

Đồng nuôi cấy

Diệt khuẩn, cảm ứng tạo chồi

Kéo dài chồi

Ra rễ

[71]. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen được mô tả tổng quát trong hình 2.2 dưới đây.

Ra cây Hình 2.2. Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm

Hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm

(tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được

gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm. Lá mầm đã bị

tổn thương được nhiễm khuẩn Agrobacterium chứa gen quan tâm.

Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1 trong thời gian

30 phút. Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 5 ngày.

Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được lắc trong môi trường cảm ứng

tạo chồi (SIM) có bổ sung 500mg/l cefotaxim với thời gian là 10 phút, sau đó thấm

khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt bỏ chồi chính trên các mảnh lá mầm và cấy mẫu

lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500mg/l cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu

được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500mg/l cefotaxim và kháng sinh

thích hợp.

Sau 2 tuần, các cụm chồi sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển

sang môi trường phát triển chồi (SEM) có bổ sung 500mg/l cefotaxim và kháng sinh

thích hợp. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3-5cm sẽ được chuyển sang môi

trường ra rễ (RM) có bổ sung 250mg/l cefotaxim để tạo cây hoàn chỉnh.

2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử

2.2.3.1. Thiết kế mồi

Các cặp mồi được thiết kế với mục đích nhân bản gen P5CS, promoter rd29A

và gây đột biến thay thế tại vị trí axitamin thứ 125 được thực hiện dựa trên việc sử

dụng chương trình DNAStar. Các bước chính bao gồm: i) thu thập trình tự nucleotid

gen, promoter từ ngân hàng gen NCBI; ii) thiết kế cặp mồi với các với các thuộc tính

mặc định của chương trình DNAStar; iii) Kiểm tra chất lượng cặp mồi bằng phản ứng

PCR.

2.2.3.2. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA

Quy trình tách chiết DNA tổng số (đối với Arabidopsic và thuốc lá: Cân 200mg mẫu

và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.

Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo

ngược nhẹ.

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng

1 2 3 Tris - HCl 1 M, pH = 8,0 NaCl 5 M EDTA 0,5 M 0,1 M 1,4 M 0,02 M

CTAB 4%

4 5 0.4% β - mercaptoethanol

Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ một lần).

Thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở

nhiệt độ phòng.

Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, Trong 5 phút. Dùng pipette hút

lấy 500µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

Thêm 500µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, trong 10 phút.

Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1

lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.

Thêm 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút. Bảo quản DNA tổng số ở -200C.

Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit Trizol Regents (của hãng

Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà

sản xuất.

2.2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA

RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp cDNA, cDNA được tổng hợp theo quy trình RevertAidTMH Minus First Strand cDNA

Synthesis Kit (Fermentas).

2.2.3.4. Phản ứng PCR

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Gen P5CS được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR

với cặp mồi đặc hiệu theo chu trình nhiệt như sau: 94ºC/5 phút;: 94ºC/30 giây, Tm /45

giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 35 chu kì. Tiến hành phản ứng PCR với các nhiệt độ khác nhau (từ 50 - 620C) để tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu.

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 2 3 2,5 µl 2,5 µl 2,0 µl

4 5 6 7 Đệm PCR 10X MgCl2 (25mM) dNTPs (10 mM) Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) Nước khử ion Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0,5 µl 1 µl 15,5 µl 0,5 µl

8 Mồi ngược (10 pmol/µl) 0,5 µl

Tổng thể tích 25µl

2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention)

Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng OE -PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 2,5 µl

2 3 4 5 6 7 Đệm PCR 10X MgCl2 (25mM) dNTPs (10 mM) Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) Nước khử ion 2,5 µl 2,0 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 15,5 µl

Tổng thể tích 23µl

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1

phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 4 chu kì. Sau 4 chu kỳ lấy sản phẩm ra đặt ngay vào đá và

bổ sung 1µl BamHI và 1µl SacI thực hiện tiếp phản ứng theo chu trình nhiệt sau:

94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì.

2.2.3.6. Phương pháp tách dòng

Tinh sạch và gắn đoạn gen/promoter vào vector tách dòng pBT: (1) Gen được làm

sạch (thôi gel) theo quy trình QIAquick Gel Extraction Kit (Bioneer); (2) điện di sản

phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm. (3) Bổ sung đệm hòa tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : V QG = 1 : 3 (1µl tương ứng với 1mg mẫu). (4) Ủ ở 500C 15 46

phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn. (5)

Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 v/p

trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. (6) Bổ sung thêm 500µl QG, ly tâm 13000 v/p

trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. (7) Thêm 750µl đệm rửa PE vào cột, để ở

nhiệt độ phòng trong 5 phút. (8) Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua

cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE. (9) Hòa tan DNA trong 30 - 50µl H20 khử ion đã được làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p

trong 1 phút. (10) Điện di kiểm tra sản phẩm. (11) Gắn đoạn gen/promoter vào vector

tách dòng pBT.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng

STT Thành phần Thể tích

1 2 3 DNA (10 - 20 ng/µl) Ligation buffer 10X Vector pBT 13 µl 2 µl 2 µl

4 5 PEG 4000 T4 ligase 2 µl 1 µl

Tổng 20 µl

Hỗn hợp trên được ủ ở 22oC trong 2 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào khả

biến E.coli chủng DH5α.

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Tạo tế bào khả biến: Tế bào E.coli DH5α được cấy ra môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, qua đêm. Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB, lắc 200 v/p, ở 370C trong 2-3 giờ.

Đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch sang cấy ống ly tâm, để 15 phút trong đá (hoặc ở 40C). Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ

hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB

ban đầu, sau đó bổ sung 15 - 20% glycerol. Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống Eppendorf 2,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh - 840C.

Biến nạp: Bổ sung 5µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.

Hỗn hợp được đặt trong đá 15 phút. Với nhiệt độ lạnh để mẫu trên đá và sau 30 phút

đặt ngay hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ở 420C chính xác 1 phút 30 giây. Sau khi sốc nhiệt,

hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút. Bổ sung 150 - 300µl môi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ. Sử dụng que cấy

trải đã khử trùng trải 150 - 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng

sinh phù hợp (pBT: 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM; pENTR: 50mg/l kanamicine; pBENDER 50mg/l carbenicillin). Ủ đĩa petri ở 370C qua đêm

trong vòng 16 giờ.

Tách chiết plasmid tái tổ hợp được thực hiện theo Sambrook và đtg (2001) [80] và tinh

sạch bằng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen).

Bảng 2.5. Thành phần hoá chất tách plasmid

Ký hiệu Thành phần

50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 Sol I

0.2M NaOH, SDS 1% Sol II

Sol III 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20

Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 4oC [26].

Các bước tiến hành: Lấy 1 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 370C trong 3ml môi trường LB

(có chứa kháng sinh thích hợp). Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Eppendorf

2ml, ly tâm 8000 v/p trong 2 - 3 phút. Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200µl sol

I, đảo đều cho tới khi phần cặn tế bào tan hoàn toàn. Bổ sung 150µl sol II, đảo nhẹ

bằng cách đảo ngược ống Eppendorf. Bổ sung 200µl sol III, đảo nhẹ bằng cách đảo

ngược ống Eppendorf, sau đó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi sau đó bổ

sung hỗn hợp chloroform : isoamyl (24 : 1), đảo nhẹ. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

Thu phần dịch nổi sau đó bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1. Ly tâm 13000 v/p

trong 10 phút sau đó thu tủa. Bổ sung 500µl cồn 70%, lắc nhẹ sau đó ly tâm 13000v/p

trong 10 phút. Lặp lại bước rửa cồn 70%. Thu tủa sau đó làm khô trong thời gian 15 - 20

phút. Bổ sung 40µl H2O khử RNAase. Tiến hành điện di kiểm tra sản phấm tách

plasmid trên gel agarose 0,9%.

Phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế thực hiện theo Sambrook và đtg (2001) [81].

2.2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

STT

Thành phần

Nồng độ

1 2 3 4 5 6 7 8

Đệm PCR 10X MgCl2 (25mM) dNTPs (10 mM) Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) DNA khuôn (10 - 20 ng/µl) Nước khử ion Mồi xuôi (10 pmol/µl) (mồi đặc hiệu) Mồi ngược (10 pmol/µl) (mồi đặc hiệu)

2,5 µl 2,5 µl 2,0 µl 0,5 µl 1 µl 15,5 µl 0,5 µl 0,5 µl

Tổng thể tích phản ứng

25µl

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony - PCR

72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm/45 giây,

THIẾT KẾ MỒI

DNA

THIẾT KẾ MỒI

cDNA

2.2.2.8. Thiết kế cấu trúc rd29A:: GUS và rd29A :: P5CSM

Ligation

PCR

Promotor

P5CS

pBI101

PCR

rd29A

GUS

NOS

Ligation

P5CSM

rd29A::GUS

NOS

rd29A

P5CSM

rd29A::P5CSM

Minh họa bằng sơ đồ sau:

Hình 2.3 Tạo vector chuyển gen mang promotor rd29A

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt rd29A và vector pBI101 bằng BamHI và HindII

STT Thành phần Thể tích

1 2 3 2 µl 3 µl 0,2 µl

4 0,2 µl 14,6 µl

Đệm 10x rd29A (pBI 101) Enzym BamHI Enzym Hind III H2O khử ion Tổng thể tích 20 µl

Sản phẩm PCR rd29A đã đọc trình tự với cặp mồi rd29A HindIII và rd29A

BamHI.

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101

STT Thành phần Thể tích

1 rd29A 6µl

pBI 101 8µl

2 T4 buffer 2µl

3 T4 ligase 1µl

4 1µl H20 khử ion

Tổng thế tích 20 µl

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220C trong 2h. Đặt phản ứng trên đá và

thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.

Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chịu hạn rd29A :: P5CSM

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt rd29A :: P5CSM bằng BamHI và SacI

STT Thành phần Thể tích

1 1 µl

2 3 4 20 µl 0,5 µl 1 µl

5 17,5 µl

Buffer BamHI rd29A(P5CSM) Enzym BamHI Enzym SacI H2O khử ion Tổng thể tích 20 µl

Ủ 370C trong 2h, điện di kiểm tra, cắt lấy băng quan tâm và thôi gel.

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101

Thành phần

STT 1 2 3 4 Thể tích 6µl 6µl 2µl 1µl 4µl

rd29A :: pBI 101 P5CSM T4 buffer T4 ligase H20 khử ion Tổng thế tích 20 µl

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220C trong 2h. Đặt phản ứng trên đá và

thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.

+ Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α (tương tự các

bước trên)

+ Chọn dòng bằng phương pháp: PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) sử

dụng mồi đặc hiệu và tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer).

Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens

Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens: Làm mới giống trên môi trường LB đặc. Nuôi lắc

một khuẩn lạc trong 2ml môi trường LB lỏng ở 28oC trong 6 giờ. Lấy 100µl dung dịch vi khuẩn nuôi cấy tiếp ở 28oC qua đêm trong 100ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh

chọn lọc đến khi OD600nm = 1. Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5.000 vòng/phút

trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn hai lần trong 10ml 1mM HEPES (N-2-

hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0. Cặn tế bào hoà tan trong

500-700µl 10% glycerol. Chia 45µl dịch tế bào vào mỗi ống eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và giữ chủng ở -85oC. Khi đã có được tế bào khả biến A. tumefaciens, ta tiến

hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào bằng phương pháp xung điện.

Biến nạp bằng xung điện: Tế bào khả biến đặt trong đá 5 phút. Bổ sung 1µl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và mix nhẹ. Rửa Cuvette bằng cồn 100oC, rửa lại bằng

nước khử ion, khử trùng rồi thấm khô.

Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vector tái tổ hợp vào Cuvette.

Xung điện: 2,5kv, 25µF và điện trở 400. Đặt ngay vào đá. Sau 5 phút bổ sung 1ml

YEB (hoặc LB lỏng) và mix nhẹ.

Chuyển sang ống eppendorft 2ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc.

Chuyển 300µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycine 40mg/l, spectinomycine 100mg/l và rifamycin 50mg/l. Ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ. Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng 2h. Điện di kiểm tra.

Bảng 2.11. Thành phần của phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 :: P5CSM

STT Thành phần Thể tích

Buffer Tango 1X 1 1µl

Enzym BamHI 2 0,2µl

Enzym SaclI 3 0,2µl

Plasmid 4 5µl

Nước khử ion 5 3,6 µl

Tổng thể tích 10µl

2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây biến nạp

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp hóa sinh

Với gen GUS, được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm của Jefferson và đtg

(1987) [51]. Các mảnh lá được nhuộm với dung dịch 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucoronide (X-gluc) 8-10 giờ trong tối ở nhiệt độ 370C, sau đó rửa bằng cồn 70% và

quan sát dưới kính hiển vi. Những vùng có gen GUS nhuộm màu xanh lam.

Cây thuốc lá chuyển gen sau khi sống trong nhà kính được xử lý hạn nhân tạo

bằng PEG (Jun và đtg, 2001) [53]. Sau các khoảng thời gian 5 giờ và 24 giờ lá được

cắt ra để kiểm tra biểu hiện GUS (Jefferson và đtg, 1987) [51]. Mẫu lá được ngâm

trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục

bằng Ethanol và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau

khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ

phận của cây chuyển gen. Hàm lượng enzym GUS tiếp tục được xác định bằng

phương pháp của Jefferson và đtg (1987) [51]

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA

PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA

3.1.1. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương

Chúng tôi đã tiến hành điều tra tình hình sản xuất đậu tương ở 11 huyện thị

khác nhau của tỉnh Sơn La và đã phát hiện 16 giống đậu tương địa phương ở 7 huyện.

Trong số 16 giống đậu tương địa phương trên có 5 giống thu thập tại huyện Phù Yên

và 5 giống từ huyện Sông Mã, 2 giống sưu tập tại huyện Quỳnh Nhai, các huyện Yên

Châu, Mai Sơn, Mộc Châu, Mường La mỗi huyện có 1 giống. Các giống đậu tương địa

phương được giám định tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ Viện Khoa học

Nông nghiệp Việt Nam theo hướng dẫn của quy phạm khảo nghiệm DUS (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Các giống đậu tương địa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La

TT Tên giống Ký hiệu Địa điểm

1 Mường La Xã Ngọc Chiến - H. Mường La - Sơn La SL1

2 Mộc Châu Xã Phiêng Luông - H. Mộc Châu - Sơn La SL2

3 Sông Mã Xã Mường Hung - H. Sông Mã - Sơn La SL3

4 Quỳnh Nhai 2 Xã Cà Nàng - H. Quỳnh Nhai - Sơn la SL4

5 Mắt Cua Phù Yên Xã Gia Phù - H. Phù Yên - Sơn La SL5

6 Yên Châu Xã Chiềng Sàng - H. Yên Châu - Sơn La SL6

7 Dài Phù Yên Xã Mường Cơi - H. Phù Yên - Sơn La PY1

8 Vàng Phù Yên Xã Sập Xa - H. Phù Yên - Sơn La PY2

9 Bóng Phù Yên Xã Mường Do - H. Phù Yên - Sơn La PY3

10 Xanh Phù Yên Xã Mường Lang - H. Phù Yên - Sơn La PY4

11 Mèo SM2 Xã Chiềng Khương - H. Sông Mã - Sơn La

12 Lào SM3 Xã Chiềng Khương - H. Sông Mã - Sơn La

13 Vàng nhỏ SM4 Xã Chiềng Cang - H. Sông Mã - Sơn la

14 Vàng to SM5 Xã Chiềng Khương- H. Sông Mã - Sơn La

15 Mai Sơn MS Xã Mường Chanh - H. Mai Sơn - Sơn La

16 Quỳnh Nhai 1 QN1 Xã Mường Chiên - H. Quỳnh Nhai-Sơn La

Kết quả giám định cho thấy các giống đậu tương địa phương sưu tập được có sự

đa dạng và phong phú về hình thái, kích thước và khối lượng hạt. Hạt có dạng hình

tròn, tròn dẹt, hình dài với mức độ phồng, dẹp khác nhau, màu sắc hạt có 4 màu điển

hình, đó là: vàng, vàng nhạt, xanh, vàng xanh, nhưng màu vàng là phổ biến hơn cả.

Hình dạng vỏ hạt thường trơn, một số giống có vỏ rạn. Khối lượng hạt của các giống

đậu tương dao động từ 93,80(g) ± 0,38 (giống QN2) đến 185,83(g) ± 0,19 (giống

PY4). Chiều rộng hạt của các giống cũng rất khác nhau, cao nhất là SM2 (0,84 cm ±

0,02), thấp nhất là QN1 (0,54 cm ± 0,01).

Protein tổng số trong hạt đậu tương chủ yếu là protein dự trữ, tuy nhiên trong tế

bào vẫn có những đoạn polypeptit, những enzyme như proteaza, amylaza.... các enzym

này tham gia vào chuyển hoá các chất (protein dự trữ, tinh bột), cùng với peptit là

những yếu tố tham gia vào quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu của hạt trong giai

đoạn nảy mầm, chính vì vậy phân tích hàm lượng protein trong hạt là một chỉ tiêu cho

phép xác định mức độ chống chịu của giống trên phương diện hóa sinh.

Kết quả phân tích hàm lượng protein trong hạt của 17 giống đậu tương cho thấy

hàm lượng protein trong hạt của các giống dao động trong khoảng 29,72%-52,75%

protein/khối lượng khô. Kết quả nhận này là phù hợp với tài liệu đã công bố (Lambert

và đtg, 1992) [60]. Hàm lượng protein cao nhất ở giống PY1 (52,57%), thấp nhất ở

giống QN1 (29,23%).

Kết quả phân tích hàm lượng lipit trong hạt của các giống đậu tương địa

phương cho thấy hàm lượng lipit trong hạt của 17 giống đậu tương (16 giống đậu

tương địa phương và giống DT84 khá chênh lệch nhau, dao động từ 9,9% - 18,65%.

Giống DT84 có hàm lượng lipit trong hạt cao nhất là 18,65%, sau đến SL3 (17,34%),

thấp nhất là giống PY3 (9,9%). Thành phần axit amin là chỉ tiêu quan trọng đánh giá

chất lượng protein của hạt. Chúng tôi đã chọn ra 5 giống đậu tương địa phương phân

bố ở các huyện khác nhau với các vùng khí hậu khác nhau để đem phân tích hàm

lượng axit amin với đối chứng là giống DT84. Bằng máy phân tích axit amin tự động

HP- Amino Quant Seriese II, căn cứ vào sắc ký đồ, đã xác định hàm lượng từng loại

axit amin (hàm lượng axit amin được tính theo gam axit amin/100g vật chất khô).

Kết quả phân tích thành phần và hàm lượng axit amin trong protein của hạt ở 6

giống đậu tương SL1, SL2, SL3, SL5, SL6 và DT84 đều thu được 17 loại axit amin,

trong đó đều có 7 loại axit amin không thay thế là lysine, valin, isolơxin, lơxin,

phenylalanin, treonin, metionin. Hàm lượng axit amin tổng số của 6 giống chênh lệch

nhau không đáng kể nhưng hàm lượng mỗi loại axit amin ở từng giống đậu tương lại

có sự khác nhau. Cũng như các chỉ tiêu hoá sinh khác, hàm lượng axit amin trong hạt

đậu có thể thay đổi theo địa hình, thổ nhưỡng, thời vụ và thời tiết, nhưng sự biến động

là không lớn (Trần Thị Phương Liên, 1999) [12].

3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu

Sử dụng phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống đậu

tương, trên cơ sở phân tích một số chỉ tiêu như: tỷ lệ cây không héo, tỷ lệ cây phục

hồi, tỷ lệ vật chất khô ở các giai đoạn trước hạn, sau hạn 5, 7, 9 ngày. Vào thời điểm

sau hạn 5 ngày tất cả các giống đều có cây héo, nhưng tỷ lệ cây chết của các giống là

khác nhau. Các giống đậu tương địa phương đều có tỷ lệ số cây chết và héo thấp hơn

so với giống đối chứng và khả năng phục hồi sau hạn là cao hơn. Cụ thể là, ở thời

điểm sau hạn 5 ngày một số giống có cây chết, tỷ lệ % số cây héo dao động từ 6-

19,149%, tỷ lệ cây chết dao động từ 0-6,38%. Sau khi xử lý 7 ngày hạn tỷ lệ cây chết

và héo của các giống đậu tương đều thấp hơn giống đối chứng. Tỷ lệ cây héo dao động

từ 18-36,73%, tỷ lệ cây chết dao động từ 8-25,53%. Sau 9 ngày xử lý hạn tỷ lệ cây héo

dao động từ 28-36,17%, tỷ lệ cây chết dao động từ 26,53-69,38%. Sau khi xử lý bởi

hạn 11 ngày tất cả các giống đậu tương nghiên cứu đều có tỷ lệ chết 100%. Phân tích

ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương thông qua kết quả

xác định được tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra ở tất cả các giống đậu tương nghiên cứu, kết

quả cho thấy, tỷ lệ thiệt hại của các giống đậu tương tăng theo thời gian gây hạn và có

sự khác nhau giữa các giống. Giống có tỷ lệ thiệt hại cao nhất là DT84 (5 ngày thiệt

hại là 24,49%; 7 ngày là 61,22%; 9 ngày là 99%).

Sau 9 ngày hạn (khoảng 12 ngày) tưới nước và tính số cây phục hồi. Sau 5 ngày

hạn tỷ lệ phục hồi dao động từ 30-65,63%. Sau 7 ngày hạn tỷ lệ phục hồi dao động từ

0-36,36%. Tỷ lệ phục hồi của các giống đậu tương địa phương cao hơn giống đối

chứng.

Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương dựa trên cơ sở xác định

chỉ số chịu hạn tương đối (Bảng 3.2). Chỉ số chịu hạn của các giống đậu tương dao

động từ 6788,75 đến 12701,30. Giống SL5 có chỉ số chịu hạn cao nhất (12701,30) và

cũng có diện tích rada lớn nhất (hình3.1), thấp nhất là giống DT84 có chỉ số chịu hạn

(6788,75) có diện tích rada nhỏ nhất (Hình 3.1), phản ánh khả năng chịu hạn kém nhất

% CKH sau 5 ngày hạn

100

% VCK của cây sau 9 ngày hạn

% HP sau 5 ngày hạn

% VCK của cây sau 7 ngày hạn

% CKH sau 7 ngày hạn

% HP sau 7ngày hạn

% VCK của cây sau 5 ngày hạn

% VCK của cây trước hạn

% CKH sau 9 ngày hạn

SL5

SL3

SL6

SL4

SL2

SL1

DT84

so với những giống địa phương.

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương đối của một số giống đậu

tương địa phương và giống DT84.

( CKH: cây không héo; HP: hồi phục; VCK: vật chất khô)

Prolin là loại axit amin tham gia tích cực trong việc điều hoà áp suất thẩm thấu

của tế bào, prolin là một axit amin ưa nước có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào,

ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tương tác với protein màng và lipit màng, ngăn

chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein khác.

Từ kết quả sưu tập, phân tích các đặc điểm hình thái hoá sinh và sinh lý của hạt

của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Sơn La, chúng tôi tiến hành chọn ra

các giống đậu tương như: SL1, SL2, SL3, SL4, SL5, SL6 là những giống được phân

bố đa dạng ở các tiểu vùng khí hậu khác nhau, có hàm lượng protein và lipit cao, thấp

khác nhau và giống đối chứng DT84 để đánh giá khả năng chịu hạn.

Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương khác nhau góp phần định hướng

cho việc chọn các giống đậu tương chịu hạn có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu, đánh giá so sánh hàm lượng prolin ở thời điểm trước khi gây hạn và sau khi cây

bị hạn (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống đậu tương

Giống Chỉ số chịu hạn tương đối

SL1 SL2 SL3 SL4 SL5 SL6 DT84 11108,24 9509,91 9582,35 9565,23 12701,30 12486,58 6788,75 Tỷ lệ tăng hàm lượng prolin sau 5 ngày hạn (%) 109,29 202,94 158,16 152,87 200,75 144,83 101,06 Tỷ lệ tăng hàm lượng prolin sau 7 ngày hạn (%) 133,88 227,94 209,18 159,24 233,08 268,97 129,26 Tỷ lệ tăng hàm lượng prolin sau 9 ngày hạn (%) 156,83 272,79 229,59 184,71 377,44 351,72 146,81

Sau khi cây bị hạn 5, 7, 9 ngày hàm lượng prolin của tất cả các giống đậu tương

địa phương đều tăng lên so với trước khi gây hạn và tăng lên đáng kể so với giống đối

chứng. Đối với giống SL5, hàm lượng prolin trước hạn là 1,33 µM/g, tuy nhiên sau khi

gây hạn 5 ngày đã tăng đến 200,75%, sau hạn 7 ngày hàm lượng prolin tăng lên

233,08%, tăng cao nhất sau khi gây hạn được 9 ngày (tăng 377,44%). Tiếp theo là

giống SL6, hàm lượng prolin tăng lên 351,72% (sau hạn 9 ngày). Giống DT84 có tỷ lệ

tăng hàm lượng prolin ở cả ba thời điểm đều thấp nhất (101,06; 129,26 và 146,81%).

Kết quả ở bảng 3.2 còn chỉ ra rằng, sự tăng nhanh về hàm lượng prolin của các giống

đậu tương sau khi bị hạn chứng tỏ cây đậu tương đã có phản ứng một cách tích cực

trước sự thay đổi của các điều kiện môi trường và sự tích luỹ prolin của các giống đậu

tương khác nhau trong từng thời điểm gây hạn. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các

nghiên cứu của các tác giả trên các loài cây trồng khác nhau như lúa (Nguyễn Hữu

Cường và đtg, 2003) [3], (Do và đtg, 2003) [32], (Choudhary và đtg, 2005) [29], cây

họ đậu (Curtis và đtg, 2004) [27], (Chen và đtg, 2009) [28].

Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy giống SL5 có tỷ lệ tăng hàm lượng prolin

cao nhất và cũng là giống có chỉ số chịu hạn tương đối cao nhất, là giống chịu hạn tốt

nhất; giống DT84 chịu hạn kém nhất. Chúng tôi chọn hai giống đó làm nguyên liệu

cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC

3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS

Dựa trên trình tự gen P5CS của đậu tương (Glycine max) đã công bố tại Ngân

hàng gen quốc tế (AY492005), gen P5CS có kích thước khoảng 2150 bp. Vì gen quá

dài nên để tách được dòng gen này chính xác, chúng tôi đã thiết kế 2 cặp mồi đặc hiệu

P5CSfor/SacI-P5CS và BamHI-P5CS/P5CSrev. Sản phẩm PCR với các cặp mồi này

có kích thước tương ứng khoảng 1300 và 1100 bp (Bảng 3.3).

Bảng 3.3. Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS

STT Tên mồi Trình tự Kích thước (bp)

P5CSfor gactgttccagacggcttcag 1300bp 1

BamHl -P5CS ctcacagagacctttctatatga 2

1100bp SacI-P5CS atggagaacacagatccttgt 3

P5CSrev gaagatccaattggtcgagtgt 4

P5CS

SacI-P5CS P5CSfor

P5CSrev BamHI-P5CS

3.2.2. Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS

Từ lá của 2 giống đậu tương SL5 và DT84, RNA tổng số đã được tách chiết và tổng hợp cDNA. Bốn đoạn gen P5CS ở hai giống đậu tương nghiên cứu DT84 và SL5 được nhân lên bằng PCR và được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả hình 3.3 cho thấy, các đoạn thu được có kích thước tương ứng với kích thước tính toán

1 2 3 4

M 1 2 3 4

theo lý thuyết.

M 1 2 3 4

Hình 3.2. Sản phẩm tách RNA 1, 2: SL5; 3,4 DT84

1500bp

1000bp

Hình 3.3. Kết quả nhân hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5

1, 3: giống DT84; 2, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn 1 kb.

Để thu được gen P5CS hoàn chỉnh, hai sản phẩm PCR được trộn lẫn và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi P5CSfor/P5CSrev theo phương pháp OE-PCR. Theo nhiều tác giả trên thế giới, cần thiết phải tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối. Chúng tôi tiến hành tinh sạch theo phương pháp thôi gel

M 1 2 3 4

bằng kit của hãng QIAGEN. Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 2100 bp (Hình 3.4), phù hợp với kích thước tính toán theo lý thuyết.

2000bp

Hình 3.4. Kết quả PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5

1, 3: giống DT84; 2, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn 1 kb.

Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α

Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện phản ứng ghép nối gen

P5CS và vector tách dòng pBT, đây là vector có nhiều ưu điểm như: kích thước nhỏ,

có nhiều điểm cắt giới hạn của các enzym hạn chế. Đồng thời, vector này còn chứa hai

gen kháng kháng sinh ampicillin và carbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản

hơn. Đặc biệt vector này rất thuận lợi cho thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai

do chúng được thiết kế dưới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn

thêm nucleotid T. Đầu 5' của đoạn gen P5CS có mang nucleotid loại A. Vì vậy khi

thực hiện phản ứng kết nối, gen P5CS sẽ dễ dàng được gắn vào vector theo nguyên tắc

bổ sung. Phản ứng nối được xúc tác bởi T4 DNA ligase. Bước tiếp theo chúng tôi tiến

hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α bằng

phương pháp sốc nhiệt. Sau đó, sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB

đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin, X-gal và IPTG. Sự có mặt của X-gal

sẽ giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng.

Trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG, phát triển hai

loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng (Hình 3.5). Tất cả các

khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng

sinh carbenicillin, nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp. Vì

những vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản

xuất ra β-galactosidase. Enzym này phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo

nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh.

Nếu đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa gen lacZ thì gen này sẽ bị phá hỏng, enzym β-

galactosidase không được tạo ra, vì thế mặc dù có X-gal trong môi trường nhưng cơ

chất này không bị thủy phân, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng.

Kết quả tách dòng gen P5CS

Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen

P5CS quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật colony-PCR. Vì số lượng

khuẩn lạc sau khi biến nạp là rất nhiều nên chúng tôi chọn ngẫu nhiên 28 khuẩn lạc

trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu P5CSfor/P5CSrev

(Hình 3.5). Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel

agarose 1%. Nếu khuẩn có plasmid mang gen P5CS thì sản phẩm PCR sẽ xuất hiện

một băng có kích thước mong muốn khoảng 2100 bp. Đồng thời nuôi những khuẩn lạc

này vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác

định trình tự.

Sau khi nuôi khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh

carbenicillin, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của nhà sản xuất.

Để khẳng định chắc chắn rằng plasmid mới tách chiết có mang đoạn gen P5CS quan

tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt plasmid. Sản phẩm cắt plasmid được kiểm tra

bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện qua hình 3.5.

Hình 3.5. Kết quả tách dòng gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 Chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường chứa X-gal/IPTG (ảnh trái). Điện di sản phẩm

colony -PCR (ảnh trên phải) và cắt vector tái tổ hợp bằng BamHI (ảnh phải dưới): 1, 2:

giống DT84; 3, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn 1 kb.

Từ kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy, trong 2 dòng khuẩn lạc trắng kiểm tra

có 1 dòng cho kết quả dương tính với PCR và kết quả cắt vector tái tổ hợp bằng

Enzym hạn chế BamHI cho các băng kích thước đúng. Ở giống SL5 cả 2 khuẩn lạc

trắng kiểm tra đều cho kết quả đúng.

Kết quả xác định trình tự gen P5CS

Kết quả đọc trình tự gen cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ 2 mẫu nghiên cứu

có kích thước 2148 nucleotid, mã hoá 715 axit amin. Các trình tự gen này mã hoá cho

protein P5CS của đậu tương. Như vậy chúng tôi đã tách dòng thành công gen mã hoá

P5CS của 2 giống đậu tương DT84 và SL5.

So sánh trình tự nucleotid của 3 giống đậu tương này cho thấy có sự tương đồng

cao (99,2 - 99,5%), sự sai khác ở 20 vị trí (Bảng 3.4 và hình 3.6).

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. atggagaacacagatccttgtagacattttctcaaggatgttaagcgcatcataatcaaggttgggactgctgtggtcactcgccaagatggaaggttag DT84 ...........................C........................................................................ SL5 .................................................................................................... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ctgttggaaaattaggggcactctgtgagcagattaaggagctgaattctcttggttatgagattattttggtgtcatcaggtgctgttggccttggtcg DT84 ........G........................................................................................... SL5 .................................................................................................... 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ccaaaggcttagatacagaaaattaattaacagcagctttgctgaccttcagaagccgcaagttgaacttgatggcaaggcttgtgctgctgttggacaa DT84 ..........................................C......................................................... SL5 .................................................................................................... 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. aacagccttatggctctttatgatgttttgtttagtcagctggatgtgacatctgctcagcttcttgtgacggacaatgattttagagacaaagatttca DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gaatgcagctcagcgaaactatgaaatcattgttagcattaaaagttattcccatattcaacgagaacgatgcagttagtactaggaaagctccatatga DT84 .................................................................................................C.. SL5 ...............................................................................C.................... 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ggattcttctggcatattttgggataatgacagtttatcagctttattggcattggaattaaaagctgatcttcttattttgttgagtgatgtagagggt DT84 .........................G.......................................................................... SL5 ..........................................................................................C......... 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ctctatagtggccctccaagtgatccacgttcaaaacttattcatacatacattaaggaaaagcatcaaagtgaaattacttttggagacaagtctagag DT84 .................................................................................................... SL5 .............................C...................................................................... 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. tgggaagaggtggaatgactgctaaagtaaaggcttctattcatgcagctgaagctggcattcctgttatcattactagtggttatgcagctgaaaatat DT84 .................................................................................................... SL5 ........................................................................................G........... 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. cattaaagttctccaaggacaacggattggaaccctcttccataaagatgcacataaatgggccccggtaaaagaggttgatgctcgtgagatggcagtt DT84 .................................................................................................... SL5 .......................................................................G...................G........ 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gcagctagggactgttccagacggcttcaggccttatcttcagaagagaggaaacaaattttgctaaaaatagctgatgccctggaagcacatcaaaatg DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. agatcaggattgaaaatgaagctgatgttgctgatgcaaaagaagcaggatatgaaaaatccttggttgctagactggttttaaagaatgagaagcttgc DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. aagtcttgctaacaacattcgaattattgcaaacatggaagatccaattggtcgagtgttaaaacgaactgagcttgcagaggggctgattttggagaaa DT84 ...C..............................................................G................................. SL5 ...C................................................................................................ 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. acatcatcttctttaggagttcttttaattgtttttgagtctcgccctgatgcactagtacagatagcttctttggcaatccgaagtgggaatgggcttc DT84 ..............................................g.....T............................................... SL5 ..........................T......................................................................... 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. tcttgaaaggaggcaaggaggctaagcgatcaaatgcaattttgcacaaagtaattactgaagccataccagatattgttggctcaaaacttattggact DT84 .........................................................................A.......................... SL5 .........................................................................A.......................... 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. tgtgacatcaagagcagaaattcctgagctacttaagttggatgatgtaattgatctagtgattccaagaggcagcaacaaacttgtctctcagatcaag DT84 ........................................................................................A........... SL5 ........................................................................................A........... 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. agttccactaaaattcctgtcctgggtcatgcagatggaatttgtcatgtctatgttgataaatctgctgatctggagatggcaaggcggattgtactag DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. atgcaaaaatagactatccagcaggctgcaatgccatggaaactcttcttgttcacaaggacttggtagagaaaggttggctcaatagtattattattga DT84 .........................................G.......................................................... SL5 ....................................................................................................

1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. cctacggacagaaggtgttacattgtatggaggacccaaggcaagtcctttgttaaatattccaatggctcgtatgttacatcatgagtacaattcgttg DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gcatgcacagttgaaattgtggatgatgtttatgcagctattgatcatataaatctttatggaagtgcacatactgattccgttgttgcagaagatcatg DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. aagtagccaatgtgtttctacgccaagtagacagtgctgctgttttccacaatgctagtacaagattcagtgatggggcacgatttggactaggtgcaga DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ggttggaataagtacaagcaggattcatgctcggggtccagtaggagttgatggattgttaacaaccagatggattctcaaaggaagtggacaaatagtg DT84 .................................................................................................... SL5 .................................................................................................... 2110 2120 2130 2140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|... Glycine max. gatggtgacaaagcagttaactacactcacagagacctttctatatga DT84 ........................T.......................

Hình 3.6. Trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương

DT84 C G C T C G T T A A A C G A G T A A G T

Vị trí 28 109 243 480 498 526 591 636 789 872 892 1104 1167 1227 1247 1253 1374 1489 1641 2125

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

SL5 T A T C T A C C G G G C A T C C A A A A

Bảng 3.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương Glycine max* T A T T T A T T A A A T A A C C T T A A

(Trình tự gen P5CS của đậu tương Glycine max có mã số AY 492005)

Trong đó DT84 và Glycine max có độ tương đồng là 99,4 %, khác nhau ở 13 vị

trí. Giữa Glycine max và SL5 mức độ tương đồng là 99,5%, khác nhau ở 10 vị trí. Đặc

biệt với 2 giống nghiên cứu DT84 và SL5 có độ tương đồng là 99,2%, sự sai khác về

trình tự nucleotid ở 17 vị trí (28, 109, 243, 480, 498, 526, 591, 637, 789, 872, 892,

1167, 1227, 1247, 1253, 1641, 2125).

So sánh trình tự axit amin của ba giống đậu tương có sự khác biệt ở 12 vị trí

khác nhau (Bảng 3.5 và hình 3.7).

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Vị trí 10 37 176 291 298 409 416 418 420 497 548 709

Glycine max F K N K M L P A D S T T

SL5 F K N R V F P A E T T T

DT84 L E D K M L R V E T A S

30 40 50 60 70 80 90 100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Bảng 3.5. Vị trí sai khác trong trình tự axit amin của protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống đậu tương

Glycine max. atggagaacacagatccttgtagacattttctcaaggatgttaagcgcatcataatcaaggttgggactgctgtggtcactcgccaagatggaaggttag M E N T D P C R H F L K D V K R I I I K V G T A V V T R Q D G R L DT84 ...........................C........................................................................ M E N T D P C R H L L K D V K R I I I K V G T A V V T R Q D G R L SL5 .................................................................................................... M E N T D P C R H F L K D V K R I I I K V G T A V V T R Q D G R L

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ctgttggaaaattaggggcactctgtgagcagattaaggagctgaattctcttggttatgagattattttggtgtcatcaggtgctgttggccttggtcg A V G K L G A L C E Q I K E L N S L G Y E I I L V S S G A V G L G R DT84 ........G........................................................................................... A V G E L G A L C E Q I K E L N S L G Y E I I L V S S G A V G L G R

SL5 .................................................................................................... A V G K L G A L C E Q I K E L N S L G Y E I I L V S S G A V G L G R

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

Glycine max. ccaaaggcttagatacagaaaattaattaacagcagctttgctgaccttcagaagccgcaagttgaacttgatggcaaggcttgtgctgctgttggacaa Q R L R Y R K L I N S S F A D L Q K P Q V E L D G K A C A A V G Q DT84 ..........................................C......................................................... Q R L R Y R K L I N S S F A D L Q K P Q V E L D G K A C A A V G Q SL5 .................................................................................................... Q R L R Y R K L I N S S F A D L Q K P Q V E L D G K A C A A V G Q

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. aacagccttatggctctttatgatgttttgtttagtcagctggatgtgacatctgctcagcttcttgtgacggacaatgattttagagacaaagatttca N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D F R D K D F DT84 .................................................................................................... N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D F R D K D F

SL5 .................................................................................................... N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D F R D K D F

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gaatgcagctcagcgaaactatgaaatcattgttagcattaaaagttattcccatattcaacgagaacgatgcagttagtactaggaaagctccatatga

R M Q L S E T M K S L L A L K V I P I F N E N D A V S T R K A P Y E DT84 .................................................................................................C.. R M Q L S E T M K S L L A L K V I P I F N E N D A V S T R K A P Y E SL5 ...............................................................................C.................... R M Q L S E T M K S L L A L K V I P I F N E N D A V S T R K A P Y E 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ggattcttctggcatattttgggataatgacagtttatcagctttattggcattggaattaaaagctgatcttcttattttgttgagtgatgtagagggt D S S G I F W D N D S L S A L L A L E L K A D L L I L L S D V E G DT84 .........................G.......................................................................... D S S G I F W D D D S L S A L L A L E L K A D L L I L L S D V E G SL5 ..........................................................................................C......... D S S G I F W D N D S L S A L L A L E L K A D L L I L L S D V E G 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ctctatagtggccctccaagtgatccacgttcaaaacttattcatacatacattaaggaaaagcatcaaagtgaaattacttttggagacaagtctagag L Y S G P P S D P R S K L I H T Y I K E K H Q S E I T F G D K S R DT84 .................................................................................................... L Y S G P P S D P R S K L I H T Y I K E K H Q S E I T F G D K S R SL5 .............................C...................................................................... L Y S G P P S D P R S K L I H T Y I K E K H Q S E I T F G D K S R

710 720 730 740 750 760 770 780 790 800

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. tgggaagaggtggaatgactgctaaagtaaaggcttctattcatgcagctgaagctggcattcctgttatcattactagtggttatgcagctgaaaatat V G R G G M T A K V K A S I H A A E A G I P V I I T S G Y A A E N I DT84 .................................................................................................... V G R G G M T A K V K A S I H A A E A G I P V I I T S G Y A A E N I SL5 ........................................................................................G........... V G R G G M T A K V K A S I H A A E A G I P V I I T S G Y A A E N I

810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. cattaaagttctccaaggacaacggattggaaccctcttccataaagatgcacataaatgggccccggtaaaagaggttgatgctcgtgagatggcagtt I K V L Q G Q R I G T L F H K D A H K W A P V K E V D A R E M A V DT84 .................................................................................................... I K V L Q G Q R I G T L F H K D A H K W A P V K E V D A R E M A V SL5 .......................................................................G...................G........ I K V L Q G Q R I G T L F H K D A H K W A P V R E V D A R E V A V

910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gcagctagggactgttccagacggcttcaggccttatcttcagaagagaggaaacaaattttgctaaaaatagctgatgccctggaagcacatcaaaatg A A R D C S R R L Q A L S S E E R K Q I L L K I A D A L E A H Q N DT84 .................................................................................................... A A R D C S R R L Q A L S S E E R K Q I L L K I A D A L E A H Q N SL5 .................................................................................................... A A R D C S R R L Q A L S S E E R K Q I L L K I A D A L E A H Q N

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. agatcaggattgaaaatgaagctgatgttgctgatgcaaaagaagcaggatatgaaaaatccttggttgctagactggttttaaagaatgagaagcttgc E I R I E N E A D V A D A K E A G Y E K S L V A R L V L K N E K L A DT84 .................................................................................................... E I R I E N E A D V A D A K E A G Y E K S L V A R L V L K N E K L A SL5 .................................................................................................... E I R I E N E A D V A D A K E A G Y E K S L V A R L V L K N E K L A

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. aagtcttgctaacaacattcgaattattgcaaacatggaagatccaattggtcgagtgttaaaacgaactgagcttgcagaggggctgattttggagaaa S L A N N I R I I A N M E D P I G R V L K R T E L A E G L I L E K DT84 ...C..............................................................G................................. S L A N N I R I I A N M E D P I G R V L K R T E L A E G L I L E K SL5 ...C................................................................................................ S L A N N I R I I A N M E D P I G R V L K R T E L A E G L I L E K 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. acatcatcttctttaggagttcttttaattgtttttgagtctcgccctgatgcactagtacagatagcttctttggcaatccgaagtgggaatgggcttc T S S S L G V L L I V F E S R P D A L V Q I A S L A I R S G N G L DT84 ..............................................g.....T............................................... T S S S L G V L L I V F E S R R D V L V Q I A S L A I R S G N G L SL5 ..........................T......................................................................... T S S S L G V L F I V F E S R P D A L V Q I A S L A I R S G N G L 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. tcttgaaaggaggcaaggaggctaagcgatcaaatgcaattttgcacaaagtaattactgaagccataccagatattgttggctcaaaacttattggact L L K G G K E A K R S N A I L H K V I T E A I P D I V G S K L I G L

DT84 .........................................................................A.......................... L L K G G K E A K R S N A I L H K V I T E A I P E I V G S K L I G L SL5 .........................................................................A.......................... L L K G G K E A K R S N A I L H K V I T E A I P E I V G S K L I G L 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. tgtgacatcaagagcagaaattcctgagctacttaagttggatgatgtaattgatctagtgattccaagaggcagcaacaaacttgtctctcagatcaag V T S R A E I P E L L K L D D V I D L V I P R G S N K L V S Q I K DT84 ........................................................................................A........... V T S R A E I P E L L K L D D V I D L V I P R G S N K L V T Q I K SL5 ........................................................................................A........... V T S R A E I P E L L K L D D V I D L V I P R G S N K L V T Q I K 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. agttccactaaaattcctgtcctgggtcatgcagatggaatttgtcatgtctatgttgataaatctgctgatctggagatggcaaggcggattgtactag S S T K I P V L G H A D G I C H V Y V D K S A D L E M A R R I V L DT84 .................................................................................................... S S T K I P V L G H A D G I C H V Y V D K S A D L E M A R R I V L SL5 .................................................................................................... S S T K I P V L G H A D G I C H V Y V D K S A D L E M A R R I V L 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. atgcaaaaatagactatccagcaggctgcaatgccatggaaactcttcttgttcacaaggacttggtagagaaaggttggctcaatagtattattattga D A K I D Y P A G C N A M E T L L V H K D L V E K G W L N S I I I D DT84 .........................................G.......................................................... D A K I D Y P A G C N A M E A L L V H K D L V E K G W L N S I I I D SL5 .................................................................................................... D A K I D Y P A G C N A M E T L L V H K D L V E K G W L N S I I I D 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. cctacggacagaaggtgttacattgtatggaggacccaaggcaagtcctttgttaaatattccaatggctcgtatgttacatcatgagtacaattcgttg L R T E G V T L Y G G P K A S P L L N I P M A R M L H H E Y N S L DT84 .................................................................................................... L R T E G V T L Y G G P K A S P L L N I P M A R M L H H E Y N S L SL5 .................................................................................................... 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gcatgcacagttgaaattgtggatgatgtttatgcagctattgatcatataaatctttatggaagtgcacatactgattccgttgttgcagaagatcatg A C T V E I V D D V Y A A I D H I N L Y G S A H T D S V V A E D H DT84 .................................................................................................... A C T V E I V D D V Y A A I D H I N L Y G S A H T D S V V A E D H SL5 .................................................................................................... A C T V E I V D D V Y A A I D H I N L Y G S A H T D S V V A E D H 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. aagtagccaatgtgtttctacgccaagtagacagtgctgctgttttccacaatgctagtacaagattcagtgatggggcacgatttggactaggtgcaga E V A N V F L R Q V D S A A V F H N A S T R F S D G A R F G L G A E DT84 .................................................................................................... E V A N V F L R Q V D S A A V F H N A S T R F S D G A R F G L G A E SL5 .................................................................................................... E V A N V F L R Q V D S A A V F H N A S T R F S D G A R F G L G A E 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. ggttggaataagtacaagcaggattcatgctcggggtccagtaggagttgatggattgttaacaaccagatggattctcaaaggaagtggacaaatagtg V G I S T S R I H A R G P V G V D G L L T T R W I L K G S G Q I V DT84 .................................................................................................... V G I S T S R I H A R G P V G V D G L L T T R W I L K G S G Q I V SL5 .................................................................................................... V G I S T S R I H A R G P V G V D G L L T T R W I L K G S G Q I V 2110 2120 2130 2140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|... Glycine max. gatggtgacaaagcagttaactacactcacagagacctttctatatga D G D K A V N Y T H R D L S I * DT84 ........................T....................... D G D K A V N Y S H R D L S I * SL5 ................................................ D G D K A V N Y T H R D L S I *

Hình 3.7. Trình tự axit amin của protein do gen P5CS mã hóa ở ba giống đậu tương

So sánh trình tự axit amin của ba giống đậu tương có sự khác biệt ở 12 vị trí

khác nhau (Bảng 3.5). Giữa hai giống SL5 và DT84 có 10 vị trí sai khác (10, 37, 176,

291, 298, 409, 416, 418, 548, 709). Giữa DT84 và Glycine max có 10 vị trí sai khác.

Glycine max và SL5 có 5 vị trí sai khác. Độ tương đồng protein P5CS của 2 giống đậu

tương nghiên cứu là 98,6%.

Hình 3.8. Mức độ tương đồng của các axit amin do gen P5CS mã hóa của các giống đậu tương

Hình 3.9. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức độ tương đồng các axit amin của protein do gen P5CS mã hóa ở các giống đậu tương

Ở 2 vị trí 125 và 128 của P5CS ở cả ba giống đều là axit amin Asp và Phe. Đây là hai vị trí gây ra sự ức chế hoạt động của enzym P5CS do tăng hàm lượng của prolin trong tế bào (Zhang và đtg, 1995) [103], (Hong và đtg, 2000) [42]. Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng sự tích lũy của prolin trong tế bào khi cây gặp điều kiện

bất lợi được điều hòa thông qua cơ chế ức chế phản hồi (feedback inhibition) làm thay đổi cấu trúc protein P5CS (Boggess và đtg, 1976) [23]. Khi thay đổi Asp ở vị trí 125 và 128 thì hoạt tính enzym P5CS bền hơn so với enzym ban đầu khi thực hiện các

phản ứng ở nồng độ cao của prolin (Zhang và đtg, 1995) [103]. Như vậy, khi so sánh trình tự nucleotid và trình tự axit amin suy diễn, chúng tôi nhận thấy có nhiều vị trí khác biệt nhau giữa các giống đậu tương nghiên cứu. Sự khác nhau đó có vai trò liên quan đến khả năng chống chịu hạn của các giống hay không, điều đó cần có những

nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ. Vì vậy chúng tôi chọn giống SL5 gây đột biến tại vị trí 125 để tạo nguyên liệu chuyển gen chịu hạn.

3.2.3. Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược gen P5CS phân lập từ cây đậu tương

Đột biến điểm định hướng là kỹ thuật sinh học phân tử trong đó điểm đột biến được tạo ra đã được định rõ vị trí trên phân tử DNA, vị trí đột biến phụ thuộc vào kiểu gen bình thường đã biết trước trình tự. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi tạo đột

biến điểm thay thế vị trí một cặp nucleotid để tạo ra những đột biến có lợi phục vụ cho các quá trình nghiên cứu. Căn cứ vào trình tự gen P5CS của giống SL5 đã được công bố tại Ngân hàng gen (FM999729.1), gen P5CS có kích thước 2148bp. Để tạo được đột biến tại điểm 125, chúng tôi đã thiết kế các cặp mồi P5CS M125for2/SacI-P5CS, BamHI- P5CS/P5CS M125rev1 và P5Csfor- P5Csrev (bảng 3.6).

Bảng 3.6. Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS

Ký hiệu Tên mồi Trình tự Kích thước (bp)

1 M125for2 gcttcttgtgacggccaatga 400bp

Sacl –P5CS ctcacagagacctttctatatga

2 BamHI-P5CS atggagaacacagatccttgt 1770bp

M125rev1 tcattggccgtcacaagaagc

3 P5CSfor gactgttccagacggcttcag 700bp

P5CSrev

69 gaagatccaattggtcgagtgt Đột biến làm cho nucleotid A ở vị trí 374 của mã bộ ba GAC được thay thế bằng nucleotid C của mã bộ ba GCC, tương ứng trên trình tự protein, axit amin ở vị trí 125 Asp được thay bằng Ala.

Sản phẩm PCR với hai cặp mồi này có kích thước tương ứng 400 bp và 1770bp. Kết quả được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% và được biểu hiện ở hình 3.10.

2000bp

1800bp

500bp

400bp

Hình 3.10. Điện di sản phẩm PCR

Kết quả biểu thị ở hình 3.10 cho thấy, các đoạn thu được có kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết. Ở giếng 1 thu được sản phẩm có kích thước khoảng 400bp, giếng 2 thu được sản phẩm kích thước khoảng 1800bp, Khi hai đoạn gen có chung nhau từ 11 đến 22 nucleotid thì có thể nối được hai đoạn này bằng phương pháp OE-PCR (Overlay Extension PCR). Vì hai đoạn gen chung nhau ít nucleotid nên chúng tôi sử dụng phương pháp nối; nối đoạn kích thước 400bp (đoạn 1) với đoạn kích thước 1770bp (đoạn 2). Sản phẩm OE-PCR thu được có kích thước khoảng 2100bp (hình 3.11). Kích thước này tương ứng với kích thước của gen P5CS gốc.

1. Với cặp mồi P5CS M125for2/SacI-P5CS; 2. Với cặp mồi P5CS for / P5CS rev ; M : Thang DNA chuẩn 1 kb.

2100bp

M A B

Hình 3.11. Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS. A, B : 1+2, M: thang DNA chuẩn 1 kb

Sản phẩm của phản ứng OE-PCR (Đoạn gen P5CS đã bị gây đột biến tại

nucleotid tại vị trí 374) gen P5CS hoàn chỉnh được gắn vào vector tách dòng pBT,

lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trường LB có bổ sung carbenicillin và X-gal/IPTG là

khuẩn lạc phát triển có màu xanh/trắng. Dòng tế bào màu trắng mang gen P5CS được

chọn bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu P5CSfor/P5CSrev, chọn các kết quả dương

tính để nuôi cấy và tách plasmid kiểm tra. Để xác định chính xác đoạn gen chèn, plasmid

được cắt bằng enzym hạn chế BamHI, kết quả được thể hiện ở hình 3.12.

M A B M A B

hình thành vector tái tổ hợp và được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Kết quả chọn

2770bp(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) 2100bp(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)

Hình 3.12. Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn BamHI A, B: 1+2, M : thang DNA chuẩn 1 kb

Kết quả điện di kiểm tra cho thấy một băng có kích thước tương ứng gen P5CS ( ≈ 2100bp), băng còn lại là pBT ( ≈ 2,7bp) đã bị cắt (hình 3.12). Do vậy vector tái tổ hợp đã bị cắt hoàn toàn và qua đó có thể kết luận chắc chắn rằng đoạn gen P5CS đã được chèn vào vetor pBT. Nhưng để biết chính xác có tạo được đột biến điểm trong gen hay không cần phải được đọc trình tự gen, kết quả được thể hiện ở hình 3.13. 310 320 330 340 350 360 370 380 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSL5 AACAGCCTTATGGCTCTTTATGATGTTTTGTTTAGTCAGCTGGATGTGACATCTGCTCAGCTTCTTGTGACGGCCAATGA N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T A N D SL5 .........................................................................A...... N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D

Hình 3.13. Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện đột biến tại vị trí nucleotid 374 của gen P5CS

Trình tự gen này mã hoá protein P5CS của đậu tương, qua kết quả đọc trình tự,

chúng tôi nhận thấy nucleotid A ở vị trí 374 của mã bộ ba GAC được thay thế bằng

nucleotid C của mã bộ ba GCC tương ứng trên trình tự protein axit amin ở vị trí 125,

Asp được thay bằng Ala. Kết quả thu được giống với kết quả nghiên cứu của các tác

giả trên thế giới (Zhang và đtg, 1995) [103].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tạo đột biến điểm có

định hướng nhằm mục đích loại bỏ tác dụng ức chế ngược bởi prolin đối với egnzym

P5CS tách dòng từ đậu tương (nucleotid C ở vị trí 374 của mã bộ ba GCC được thay

thế bằng nucleotid A của mã bộ ba GAC tương ứng trên trình tự protein axit amin ở vị

trí 125 Asp được thay bằng Ala). Đây là thành công đối với gen P5CS phân lập từ cây

đậu tương Việt Nam. Gen đột biến tạo được sẽ là nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp

theo nhằm tạo ra các giống đậu tương có khả năng sống trong các điều kiện khô hạn.

3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG

KHÔ HẠN rd29A

Hạt của Arabidopsis thaliana khử trùng bằng cồn 70% và javen 30% được gieo

trên môi trường MS (MS (I-IV), sucrose 30g/l + agar 9g/l.PH5.8) và được nuôi cấy trong

điều kiện invitro. Sau 12 ngày tuổi thu mẫu lá làm nguyên liệu tách DNA (Hình 3.14)

3.3.1. Phân lập promoter rd29A

1 2

1. SP DNA 2. Khử RNA

Hình 3.14. Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana

1 2

(A, B) và tách DNA (C)

Trên cơ sở trình tự gen rd29A đã công bố trên ngân hàng gen thế giới, cặp mồi

rd29A -HindIII/rd29A -BamHI đã được thiết kế. Cặp mồi này sẽ tách được promoter

có kích thước 1290 bp, nằm trước codon mở đầu của gen chức năng rd29A.

Bằng kỹ thuật PCR, promoter rd29A đã được phân lập từ A. thaliana sử dụng

cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm được kiểm tra trên gel agarose cho thấy có một băng duy

2,5kb

1kb

nhất với kích thước khoảng 1300 bp, tương đương kích thước tính toán theo lý thuyết.

Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBT/rd29A M) Thang DNA chuẩn 1kb; 1) sản phẩm PCR; 2) sản phẩm cắt bằng BamHI/HindIII

Sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pBT và được biến nạp vào E.

coli DH5α. Kết quả chọn dòng bằng colony-PCR và cắt plasmid bằng enzym hạn chế

BamHI/HindIII cho thấy sản phẩm có kích thước tương đương kích thước đã tính toán

theo lý thuyết (hình 3.15). Như vậy sản phẩm PCR đã được ghép nối thành công vào

vector tách dòng pBT.

3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A

Để biết chính xác sản phẩm PCR, chúng tôi đã tiến hành đọc trình tự nucleotid.

Kết quả thu được so sánh với các trình tự gen trên Ngân hàng gen chính cho thấy sản

phẩm là promoter rd29A của A.thaliana.

Khi phân tích trình tự thu được cho thấy promoter phân lập có chiều dài 1290

bp, chứa các box trình tự cần thiết cho promoter điều hòa biểu hiện gen như TATA;

CCAAT box- vùng giàu GC (GGGCCAATAG), Cap signal và các vùng liên quan quá

trình phiên mã (-10 và -35). Ngoài ra còn chứa các vùng liên quan đến cảm ứng điều

kiện khô hạn DRE, ABRE (hình 3.16). Kết quả này hoàn thống nhất với những công

bố trước của Wu và đtg (2008) [100] và Shinozaki và đtg (2007) [84].

atcatgttagcgtcagatatttaattattcgaagatgattgtgatagatttaaaattatcctagtcaaaaagaaagagtaggttgag cagaaacagtgacatctgttgtttgtaccatacaaattagtttagattattggttaacatgttaaatggctatgcatgtgacatttag accttatcggaattaatttgtagaattattaattaagatgttgattagttcaaacaaaaattttatattaaaaaatgtaaacgaatattt tgtatgttcagtgaaagtaaaacaaattaaattaacaagaaacttatagaagaaaatttttactatttaagagaaagaaaaaaatc tatcatttaatctgagtcctaaaaactgttatacttaacagttaacgcatgatttgatggaggagccatagatgcaattcaatcaa actgaaatttctgcaagaatctcaaacacggagatctcaaagtttgaaagaaaatttatttcttcgactcaaaacaaacttacga aatttaggtagaacttatatacattatattgtaatttt ttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagagga ggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtaaaagtttacaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaat attctctagtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaatt aattttccttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattc gaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaac -10 agccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccga CCAAT box và vùng giàu GC ctactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcaTACCGACATcag DRE-1 ttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatacTACCGACATg -35 DRE-2 agttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaa aacagacgcttcatACGTGTCcctttatctct ABRE ctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgca Cap signal TATA box aactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattgga

Hình 3.16. Phân tích trình tự promoter rd29A Sau khi đã tách dòng và xác định trình tự promoter rd29A, sử dụng phần mềm

chuyên dụng để phân tích trình tự đoạn promoter đã tách dòng được. Nhằm mục đích

tìm ra các nhân tố cis đặc hiệu cho một promoter cảm ứng bởi yếu tố hạn. Kết quả cho

thấy rằng, trên đoạn trình tự promoter rd29A phân lập trong nghiên cứu này có chứa

các nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMYBOX. Các nhân tố cis này đã được

khẳng định là đặc hiệu cho các promoter điều khiển biểu hiện của gen dưới các điều

kiện bất lợi như hạn, mất nước và mặn…

Chúng tôi đã phân lập thành công promoter rd29A, đoạn gen dài 1290bp chứa

các nhân tố cis đặc hiệu, sử dụng đoạn gen để thiết kế vector phân tích quá trình biểu

hiện của promoter dưới điều kiện khô hạn.

3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A

Sơ đồ nghiên cứu

THIẾT KẾ MỒI

ADN

PCR

Ligation

pBI101

PROMOTER

RD29A

Biến nạp

GUS

NOS

RD29A + GUS

Kiểm tra gen chuyển

Hình 3.17. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A

12 kb

1,5kb

Để kiểm tra khả năng điều khiển của promoter thu được, promoter rd29A được thiết kế vào vector pBI101 điều khiển sự biểu hiện gen chỉ thị GUS. Kết quả kiểm tra bằng PCR và cắt bằng enzym hạn chế BamHI/SacI cho thấy vector tái tổ hợp thu được chứa đoạn promoter rd29A (hình 3.18) có kích thước như mong muốn.

Hình 3.18. Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBI101/rd29A M) Thang DNA chuẩn 1kb ; 1-2) sản phẩm PCR; 3-4) sản phẩm cắt bằng BamHI/SacI

Vector tái tổ hợp thu được biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium C58, đây sẽ là nguyên liệu cho chuyển gen vào thực vật, để đánh giá khả năng điều khiển của promoter bằng mức độ biểu hiện GUS dưới điều kiện xử lý hạn.

Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô đến

cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học

thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình. vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây

thuốc lá đã được tiến hành từ khá sớm. Phạm Thị Vân và đtg ( 2009) [19] đã tạo thành công

cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc kháng đồng thời hai loại vius gây bệnh khảm.

Vì những lí do trên chúng tôi tiến hành chọn cây thuốc lá làm cây mô hình để chuyển các cấu

trúc chuyển gen

1. Mảnh lá thuốc lá trên môi trường cảm ứng GM sau 2 ngày

2. Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn

3. Mảnh lá trên môi trường cộng sinh sau 2 ngày

4. Mảnh lá trên môi trường GM + 50 mg/l Kanamycine + 400 mg/l Cefotaxime sau 1 tháng

5. Cụm chồi trên môi trường GM + 50 mg/l Kanamycine + 400 mg/l Cefotaxime sau 1 tháng

6. Cây con trên môi trường RM + 50 mg/l Kanamycine + 400 mg/l Cefotaxime sau 1 tháng

7. Ra cây trong bầu trấu: cát

8. Trong bầu đất

9. Ra nhà lưới

3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS

Hình 3.19. Hình ảnh chuyển cấu trúc promotor rd29A vào thuốc lá

Sau biến nạp, các mảnh lá được đồng nuôi cấy hai ngày trên môi trường GM và

chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 30. Sau 3 tuần, các cụm chồi được tách và cấy

chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 50. Những chồi phát triển tốt sẽ được tách ra và

cấy chuyển sang môi trường chọn lọc Kan 50 một lần nữa. Sau đó chồi được cấy

chuyển sang môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Từ những dòng chọn lọc trên môi

trường RM (Kan 50), chọn ngẫu nhiên 22 dòng thuốc lá chuyển gen để ra cây vào giá

thể trấu: cát (tỉ lệ 1: 1). Sau 14 ngày chuyển các dòng sống trên giá thể trấu : cát vào

chậu đất đặt trong nhà lưới. Tỷ lệ sống của các dòng khi trồng ra chậu vại đất là 88,1

% (tương đương với Đ/C) chứng tỏ cây thích nghi tốt với điều kiện ngoại cảnh. Như

vậy quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá, chọn lọc sau biến nạp, tái sinh cây hoàn

chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây ra bầu đất đã hoàn thành.

Đánh giá hoạt động của promotor rd29A trong cây thuốc lá chuyển gen

Cấu trúc gen chuyển gồm promoter rd29A điều khiển hoạt động gen GUS được

chuyển vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả thu được 51 dòng

cây thuốc lá tái sinh trên môi trường chứa kanamycin. Kiểm tra 22 dòng cây bằng

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rd29A -HindIII/rd29A -BamHI cho thấy có 21

dòng mang gen chuyển rd29A. Để đánh giá hoạt động điều khiển sự biểu hiện gen

GUS của promoter rd29A, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 3 dòng cây dương tính với PCR

và tiến hành xử lý hạn nhân tạo bằng 10% PEG (polyethylene glycol).

Kết quả cho thấy, dưới điều kiện thiếu nước, biểu hiện gen GUS ở lá các dòng

thuốc lá chuyển gen khá mạnh và rõ ràng so với lá các dòng cây chuyển gen không xử

lý và lá cây đối chứng (hình 3.20).

A: Lá cây đối chứng không chuyển gen có xử lý hạn; B: Lá cây chuyển gen không xử

lý hạn; C: Lá cây chuyển gen sau xử lý hạn 24 giờ. 77

Hình 3.20. Biểu hiện gen GUS trên lá cây chuyển gen

Bên cạnh việc đánh giá hoạt động của promoter rd29A bằng phương pháp phát hiện khả năng biểu hiện tạm thời của gen GUS ở trên lá của các dòng cây chuyển gen khi bị xử lý hạn nhân tạo, hoạt tính của enzym GUS còn được xác định thông qua phản ứng

chuyển hóa cơ chất 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG). Enzym GUS xúc tác

cho phản ứng chuyển hóa MUG thành 4-methylumbelliferone (MU), hoạt tính của gen enzym GUS càng mạnh thì MU được tạo ra càng nhiều. MU được phát hiện bằng phép đo

800

700

600

độ hấp thụ ở bước sóng 378 nm (Fior và đtg, 2009) [33].

.

i

500

/ l

400

300

) g m n m o m p ( U M g n ợ ư L

200

100

DCT

DCS

Mẫu

Hình 2.21. Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang promoter rd29A trong điều kiện hạn nhân tạo

ĐC: mẫu cây đối chứng không chuyển gen; 3, 4, 5: các dòng cây chuyển gen, T:

trước xử lý hạn, S: sau xử lý hạn.

Dựa trên lượng MU sinh ra trong một đơn vị thời gian và trong một mg protein

tổng số, hoạt tính của enzym GUS được đánh giá ở cây đối chứng và các dòng cây

chuyển gen trong điều kiện trước và sau gây hạn nhân tạo (hình 2.21). Ngược với lượng

MU đo được quá nhỏ ở dòng cây đối chứng không chuyển gen, ở các dòng cây chuyển gen

hoạt tính enzym GUS khá mạnh, lượng MU đo được sau xử lý hạn cao hơn so với trước xử

lý hạn từ 6 - 13 lần. (Zhang và đtg, 2005) [105] nghiên cứu cũng nhận thấy kết quả khi xử

lý hạn lượng MU trong các dòng chuyển gen cao hơn đối chứng. Điều này không chỉ chứng

minh hoạt động của promoter rd29A ở các dòng thuốc lá chuyển gen được tạo ra trong

nghiên cứu này mà còn một lần nữa chứng minh tính cảm ứng của promoter rd29A dưới

các điều kiện khô hạn, có khả năng điều khiển hoạt động gen mạnh trong điều kiện khô hạn.

Promoter này có thể sử dụng cho các gen liên quan đến tính chống chịu khô hạn, biến nạp

vào cây trồng nhằm nâng cao sức chống chịu của một số cây trồng.

3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM 3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM

Trình tự rd29A được thiết kế vào vector pBI101 mang gen chỉ thị GUS, vector

pBI101 mang một vị trí cắt của BamHI và SacI ở hai đầu gen GUS.

12,2kb

1,8kb

2kb 1,5kb

2,5kb 2kb

2,7kb 2,1 kb

Kết quả cắt P5CSM và rd29A :: GUS bằng BamHI và SacI

A B

Hình 3.22. Các sản phẩm cắt đồng thời bằng enzym BamHI và SacI M: Thang DNA chuẩn 1kb; A: sản phẩm cắt của P5CSM; B: Sản phẩm cắt của

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phản ứng cắt giữa plasmid mang gen

rd29A ::GUS

P5CS đột biến và cấu trúc rd29A::GUS bằng hai enzym cắt đồng thời BamHI và SacI.

Plasmid tái tổ hợp cũng có vị trí cắt duy nhất của hai enzym giới hạn BamHI và SacI

nên chúng tôi tiến hành cắt đồng thời vector pBI101/rd29A và plasmid tái tổ hợp bằng

enzym BamHI và SacI. Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt của pBI101 sẽ có hai băng

tương ứng với kích thước khoảng 11,7 kb (kích thước của pBI 101 và rd29A) và 1,8 kb

(kích thước của gen GUS) (Hình 3.22 A). Sản phẩm cắt của plasmit tái tổ hợp sẽ có hai

băng khoảng 2,7 kb (tương ứng với kích thước của vector pBT gốc) và 2,1 kb (kích

thước của gen P5CSM). Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.21 B. Như vậy kết quả cắt

enzym hoàn toàn phù hợp với dự đoán theo lý thuyết, chứng tỏ kết quả cắt enzym tốt.

Trên sản phẩm cắt của pBI101/rd29A thôi gel và tinh sạch đoạn gel có kích thước 11,7

kb (vector pBI101/rd29A đã loại bỏ gen GUS). Trên sản phẩm cắt của vector tái tổ hợp

Hai sản phẩm này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng ghép nối bằng

T4 ligaza và biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α, cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh kana nồng độ 25 mg/l và ủ ở 37oC qua đêm. Chọn ngẫu nhiên 3 dòng khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường có kháng sinh chọn lọc,

tách plasmit, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen rd29A nhằm tìm ra

chính xác dòng khuẩn lạc mang vector pBI101 tái tổ hợp mong muốn. Kết quả điện di sản

phẩm PCR được thể hiện trên hình 3.23A. Kết quả trên hình 3.23A cho thấy xuất hiện

băng có kích thước 1,3 kb, tương ứng với kích thước của gen rd29A chứng tỏ 3 dòng

mang cấu trúc vector pBI101/rd29A::P5CSM tái tổ hợp. Kết quả cắt plasmid bằng enzym

hạn chế BamHI/SacI cho thấy sản phẩm có kích thước 3,4kb (rd29A::P5CSM) tương

đương kích thước đã tính toán theo lý thuyết (hình 3.22B).

thôi gel và tinh sạch đoạn gen có kích thước 2,1 kb (gen P5CSM).

Kết quả của phản ứng cắt bằng enzym giới hạn và colony-PCR đã khẳng định

chắc chắn cả 3 dòng khuẩn lạc đều có chứa vector chuyển gen, nghĩa là chúng tôi đã

thiết kế thành công cấu trúc gen chuyển mang gen chịu hạn rd29A::P5CSM được ghép

nối thành công vào vector tách dòng pBT.

M 1 2 3 - +

1,3kb

1 2 3 M

12kb

3,4kb

1,5kb 1,3kb 1kb

B: sản phẩm cắt đồng thời bằng enzym BamHI và SacI M: Thang DNA 1kb; Giếng 1-3: Các dòng khuẩn lạc

A: sản phẩm clony- PCR với cặp mồi rd29A for /rd29A rev M: Thang DNA 1kb; Giếng 1-3: Các dòng khuẩn lạc (-) Đối chứng âm, ( + ) đối chứng dương Hình 3.23. Điện di sản phẩm clony- PCRvà cắt hạn chế vector pBI101::rd29A::P5CSM

Kết quả biến nạp vector chuyển gen rd29::P5CSM vào A. tumefaciens

Để kiểm tra hoạt động của gen chịu hạn trên vector tái tổ hợp trong cây trồng cũng như tạo ra nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình chuyển gen tạo cây thuốc lá chịu hạn thì vector tái tổ hợp rd29A::P5CSM cần được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens pGV2260 bằng xung điện. Đây là phương pháp biến nạp có hiệu quả cao đồng thời rút ngắn được thời gian thí nghiệm. Sản phẩm sau khi biến nạp được cấy trải trên các đĩa chọn lọc có chứa các kháng sinh carbenicillin 50 mg/l và rifampicin 50 mg/l.

Kết quả của quá trình biến nạp, chúng tôi thu được một số dòng khuẩn lạc màu trắng. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn vector rd29A::P5CSM đã được biến nạp thành công, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 9 dòng khuẩn lạc nuôi, tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rd29A for/rd29A rev .

Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% thể hiện trên hình 3.24 cho thấy: có 4 trong 9 dòng khuẩn lạc được lựa chọn cho kết quả dương tính với phản ứng PCR với 1 băng duy nhất có kích thước khoảng 1300 bp. Điều này chứng tỏ đã biến nạp thành công cấu trúc rd29A::P5CSM vào tế bào A. tumefaciens.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - +

1500bp

Như vậy chúng tôi đã tạo được chủng A. tumefaciens pGV2260 mang plasmid tái

tổ hợp rd29A::P5CSM. Đây chính là nguồn nguyên liệu phục vụ cho mục đích chuyển

gen tạo cây trồng chống chịu hạn.

Hình 3.24. Kết quả clony- PCR chọn dòng trong A. tumefaciens pGV2260 bằng cặp mồi rd29A for/rd29A rev M: Thang DNA 1kb; Giếng 1-9: Các dòng khuẩn lạc; (-) đối chứng âm; (+) đối chứng dương

3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM

Cấu trúc chuyển gen pBI101 mang promoter rd29A điều khiển hoạt động của gen

P5CS được chuyển vào mảnh lá cây thuốc lá giống K326. Các dòng cây chuyển gen được

tái sinh và trên môi trường chứa kháng sinh kanamycin nồng độ 50mg/l. Chỉ những cây

mang cấu trúc chuyển gen có thể sống trên môi trường chọn lọc. 33 dòng cây này được

trồng trong nhà lưới. Khi cây sinh trưởng bình thường, lá của 33 dòng cây này được thu

và sử dụng cho để sàng lọc bằng kỹ thuật PCR.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - +

1,5kb 1kb

M: Marker DNA 1kb; 1-9: Các dòng chuyển gen; (-) Đối chứng âm; (+) Đối chứng

dương

Hình 3.25. Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A for/rd29Arev

Hình 3.24 cho thấy, trong số 33 dòng kiểm tra thu được 30 dòng cho phản ứng dương tính, các giếng xuất hiện một vạch DNA có kích thước khoảng 1,4kb. Đây là kích thước tương ứng của promoter rd29A. Điều này chứng tỏ các dòng cây này có mang cấu trúc rd29A::P5CSM mong muốn.

3.4.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen

Prolin đóng vai trò quan trọng trong chống chịu hạn ở thực vật. Khi gặp điều

kiện khô hạn, prolin sẽ được tổng hợp tăng trong tế bào. Để biết được chi tiết hơn, các

mẫu lá của các dòng thuốc lá chuyển gen và đối chứng đã được thu trước gây hạn và

sau khi gây hạn 3, 5, 7 và 9 ngày. Các mẫu được tách chiết và kiểm tra hàm lượng

Sau khi gây hạn nhân tạo, hàm lượng prolin tăng rất mạnh so với trước gây hạn ở

tất cả các dòng cây nghiên cứu, đặc biệt các dòng cây chuyển gen. Sau 9 ngày gây hạn,

prolin ở cây đối chứng không chuyển gen tăng 206.8%, trong khi đó với cây chuyển gen

tăng từ 259,54 - 451,77% (cao nhất ở dòng H33 và thấp nhất dòng H11) (bảng 3.7).

prolin. Kết quả trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.24.

Dòng

Tỷ lệ tăng so TH (%) 206.84

Bảng 3.7. Hàm lượng prolin tích lũy trong các dòng thuốc lá nghiên cứu (µmol/g)

451.77 297.21 286.10

0.12 0.24 0.24 0.29 0.27 0.23 0.27

0.17 0.79 0.50 0.65 0.45 0.42 0.44

WT H33 H40 H15 H11 H21 H26

0.18 0.81 0.51 0.73 0.56 0.63 0.68

0.23 1.04 0.69 0.79 0.68 0.72 0.81

0.25 1.11 0.72 0.83 0.70 0.72 0.93

259.54 315.55 343.84

1.2

/

l

0.8

WT H33

H40

) g e o m µ ( e n

i l

0.6

H15 H11

0.4

H21

l

H26

m à H

0.2

o r p g n ợ ư

Thời gian (ngày)

Hình 3.26. Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo TH: trước hạn; S3, S5, S7, S9: thời gian gây hạn trong 3, 5, 7, 9 ngày

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với biểu hiện về hình thái cây về khả năng chống chịu khô hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen sau 9 ngày, 20 ngày gây hạn nhân tạo. Kết quả cho thấy, sau 9 ngày ở điều kiện không được tưới nước, các dòng

cây thuốc lá chuyển gen vẫn sinh trưởng bình thường trong khi cây thuốc lá không chuyển gen bắt đầu hiện tượng héo lá. Xử lý hạn sau 20 ngày, hình thái và phát triển cây rõ nét nhất (hình 3.27A). Khả năng chịu hạn ở các dòng thuốc lá chuyển gen có thể được giải thích là do hoạt động của gen P5CS đột biến không bị ức chế bởi hàm lượng prolin trong tế bào. Các dòng thuốc lá chuyển gen có các mức độ chống chịu khác nhau, điều này có thể do khả năng biểu hiện của gen biến nạp và phụ thuộc vào vị trí chèn trong hệ gen vật chủ hoặc số lượng copy của gen biến nạp. Kết quả này cũng

phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hong và đtg (2000) [42] khi nghiên cứu các dòng cây thuốc lá chuyển gen tăng cường biểu hiện gen mã hóa cho các dạng enzym P5CS đột biến thay thế Asp ở hai vị trí 126 và 129 thể hiện tính chống chịu mặn tốt hơn so với các dòng cây thuốc lá chuyển gen P5CS dạng chưa đột biến trên môi trường chứa

200mM NaCl.

Hình 3.27. Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau phục hồi (B) WT: cây đối chứng không chuyển gen, H11, H15, H26, H33: các dòng cây chuyển gen

Sau 20 ngày khô hạn, các dòng cây thí nghiệm được tưới nước phục hồi. Các

dòng cây chuyển gen có khả năng phục hồi tốt và nhanh hơn các dòng cây không

chuyển gen (hình 3.27B). Kết quả này rất có ý nghĩa trong sử dụng cấu trúc

rd29A::P5CSM để biến nạp vào các loài cây trồng khác, nâng cao khả năng chống

chịu điều kiện khô hạn và mất nước.

3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN

3.5.1. Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84

3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt

Có rất nhiều nguyên liệu được sử dụng cho mục đích tái sinh cây đậu tương

phục vụ chuyển gen như: lá mầm non, đỉnh sinh trưởng phôi hạt chín,…. Trong nghiên

cứu này, chúng tôi sử dụng nách lá mầm hạt chín làm nguyên liệu tái sinh cây thông

qua đa chồi. Nách lá mầm hạt chín được xử lý sau khi hạt đậu tương được khử trùng

bằng hai cách: Khử trùng bằng Javen và bằng khí clo và đặt lên môi trường nảy mầm

sau 4 - 5 ngày.

Thời gian khử trùng có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nảy mầm cũng như tỉ

lệ mẫu nhiễm trên môi trường nuôi cấy in vitro. Do vậy để thu được nguyên liệu tốt

nhất phục vụ cho công việc tái sinh cây đậu tương. Với phương pháp khử trùng bằng

Javen, chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa thời gian khử trùng và nồng độ Javen cho hạt

đậu tương chín với các khoảng thời gian là: 10; 20; 30 và 40 phút ở các nồng độ Javen

10;20;30 và 40%. Kết quả được đánh giá bằng các chỉ tiêu là tỉ lệ mẫu nảy mầm, tỉ lệ

mẫu nhiễm trên môi trường nảy mầm của hạt. Kết quả nghiên cứu thu được trình bày

trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng Javen đến khả năng nảy mầm của giống đậu tương DT84

Tỉ lệ mẫu nảy mầm (%)

Thời gian khử trùng (phút) Nồng độ Javen (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)

10 20 30 40 10 20 30 40 10 20 30 40 10 20 30 40 + 100 60 69 89 100 60 80 70 95 55 85,6 83,7 89 65 66 62 - - 12 21 19 - 24 17 10 0,5 18 3,9 15 10 15 8,4 33 96,5 21 31 29 98 18 17 6 94 45 5% 4 95 55 4 2

Ghi chú: (+) Hạt nảy mầm có màu xanh, thân mầm dài và mập; (-) Hạt nảy

mầm có màu vàng, thân mầm ngắn, không có khả năng kéo dài.

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng và nồng độ khử trùng khác

nhau có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cũng như số lượng lá mầm thu được dùng

cho tái sinh. Việc tăng thời gian và nồng độ khử trùng làm giảm số lượng mẫu bị

nhiễm (mốc và khuẩn) trên môi trường nảy mầm. Tuy nhiên, trong thời gian 40 phút

và nộng độ Javen 40% mặc dù tỷ lệ mẫu nhiễm là thấp (2%) nhưng khả năng kéo dài 85

chồi lại thấp. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian tối ưu của phương pháp khử trùng bằng

Javen trong thời gian 30 phút ở nồng độ 30%.

Phương pháp khử trùng bằng khí clo ở 4 thời gian khác nhau cho thấy 4 giờ có

tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất (12,56%), tỉ lệ này giảm dần khi tăng thời gian khử trùng lên

8 giờ (8,1%), 16 giờ (2,4%). Và khi thời gian khử trùng tăng lên đến 24 giờ, tất cả các

hạt mang khử trùng đã được làm sạch hoàn toàn (bảng 3.9).

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí Clo đến khả năng nảy mầm

của giống đậu tương DT84

Tỉ lệ mẫu nảy mầm (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Thời gian khử trùng (giờ) + -

4 8 16 100 94,1 98,68 0,00 5,9 1,32 12,56 8,1 2,4

24 50,69 45,9 0,00

Ghi chú: (+) Hạt nảy mầm có màu xanh, thân mầm dài và mập; (-) Hạt nảy

mầm có màu vàng, thân mầm ngắn, không có khả năng kéo dài.

Như vậy, nếu chỉ căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm trên môi trường GM thì thời gian

khử trùng thích hợp là 24 giờ. Tuy nhiên, chất lượng lá mầm thu được có tác động đến

khả năng tạo đa chồi của mẫu cấy trong thí nghiệm tiếp theo, những lá mầm có màu

xanh đậm, mập được xem là lựa chọn tối ưu. Vì vậy, trong thí nghiệm này, yếu tố thứ

2 được quan tâm là tỉ lệ hạt nảy mầm được, cũng như chất lượng mẫu sau nảy mầm.

Từ kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy rằng: tỉ lệ hạt nảy mầm đạt 100% ở các thời

gian thí nghiệm là 4; 8 và 16 giờ. Với thời gian thí nghiệm là 24 giờ đã xuất hiện một

số hạt không có khả năng nảy mầm (3,41%) và trong số các hạt nảy mầm thì tỉ lệ mẫu

có chất lượng tốt, sử dụng được cho tái sinh tạo đa chồi là rất thấp, chỉ đạt 50,69%,

trong khi ở các công thức khác là 100% (4 giờ) và 94,1% (8 giờ) và 98,68% (16 giờ).

Như vậy việc tăng thời gian khử trùng đã có ảnh hưởng ức chế khả năng nảy mầm của

hạt cũng như chất lượng mẫu thu được sau nảy mầm.

Vậy căn cứ vào tỉ lệ mẫu nhiễm và chất lượng mẫu sau nảy mầm cho thấy, thời

gian khử trùng thích hợp cho hạt đậu tương DT84 là 16 giờ, ngắn hơn so với nghiên

cứu của một số tác giả khác là 24 giờ (Olhoft và đtg, 2001) [69], Olhoft và đtg, 2007)

[70], Olhoft và đtg, 2001) [71], (Pazl và đtg, 2004) [75] và trùng với thời gian nghiên

cứu trên ĐT12.

Hình 3.28. Hạt nảy mầm ở các phương pháp khử trùng khác nhau

A: Khử trùng bằng Javen 30% trong 30 phút B: Khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ

So sánh hai phương pháp khử trùng trên, chúng tôi nhận thấy phương pháp khử

trùng bằng khí clo đã tỏ ra ưu thế hơn, vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp khử

trùng này trong thời gian 16 giờ để thu nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín

Đa số các công trình tái sinh đậu tương sử dụng hai phương pháp chủ yếu là

tái sinh qua đa chồi và tái sinh qua phôi soma. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng

tái sinh cây hoàn chỉnh từ phương pháp tái sinh qua phôi soma đã được nghiên cứu

trên nhiều giống đậu tương khác nhau. Tuy nhiên, quy trình này gặp một số hạn chế

đó là: nguồn nguyên liệu khó thu thập, thời gian tái sinh kéo dài (tối thiểu 8 tháng),

quy trình tương đối phức tạp (Hong và đtg, 2007) [41], (Sairam và đtg, 2003) [79],

(Samoylov và đtg, 1998) [82], (Tae-Seok và đtg, 2004) [91]. Phương pháp tái sinh tạo

đa chồi có nhiều ưu điểm: chủ động được nguồn nguyên liệu, ít lệ thuộc vào thời vụ,

rút ngắn thời gian tạo cây (3 tháng), đồng thời việc khử trùng nguyên liệu cũng được

tiến hành khá đơn giản. Có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen công bố gần đây

đã thành công bằng việc sử dụng phương pháp này (Olhoft và đtg, 2001) [69], (Olhoft

và đtg, 2007) [70], Olhoft và đtg, 2001) [71], (Pazl và đtg, 2004) [72], (Ren-Gao và

đtg, 2006) [76].

Trong phương pháp tái sinh cây thông qua đa chồi, hàm lượng hoocmon sinh

trưởng trong môi trường là yếu tố rất quan trọng. Mỗi giống cây đều có một ngưỡng

nồng độ thích hợp để có được hiệu quả tạo đa chồi cao nhất. Với giống DT84, hạt chín

sau khi khử trùng được tách thành 2 mẫu giống nhau, mỗi mẫu có 1 lá mầm liên kết

với nách lá mầm và một nửa trụ mầm. Các mẫu này sau khi gây tổn thương và cắt bỏ

đỉnh sinh trưởng, chúng được tạo đa chồi trên 8 loại môi trường (SIM0-SIM7) chứa

nồng độ BAP từ 0mg/l đến 2,5 mg/l . Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.10.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi

Số chồi Công thức BAP (mg/l) Tỉ lệ mẫu tạo đa chồi (%) trung bình/cụm

SIM0 0,0 0,00 0,0

SIM1 1 68,1 4,8

SIM2 1,25 72,57 5,1

SIM3 1,5 74,15 5,4

SIM4 1,75 78,8 5,7

SIM5 2 81,3 6

SIM6 2,25 60,2 5,5

SIM7 2,5 55,68 5,0

Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, sự có mặt của BAP trong môi trường nuôi cấy đã

có vai trò kích thích hình thành các cụm chồi trên mẫu cấy, song tỷ lệ mẫu tạo đa chồi

không tỷ lệ thuận với nồng độ BAP có trong môi trường. Khi môi trường không có

BAP, 100% mẫu cấy không tạo được chồi phụ, rễ xuất hiện ở các lá mầm. Trong khi,

với việc bổ sung 2mg/l BAP vào môi trường SIM5, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi và số chồi

trung bình/cụm thu được là cao nhất (81,3% và 6 chồi/cụm), tỷ lệ này là thấp nhất

(68,1% và 4,8 chồi/cụm) trên môi trường SIM1 với nồng độ BAP là 1mg/l. Khi nồng

độ BAP được tăng lên 2,5mg/l ở môi trường SIM7 thì tỷ lệ mẫu tạo đa chồi lại giảm

xuống (55,68%), trên môi trường xuất hiện những mảnh lá mầm mà phần nách lá mầm

bị hóa đen, chồi phụ không được hình thành. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý

thuyết là các chất kích thích sinh trưởng chỉ có tác dụng ở nồng độ nhất định và sẽ ức

chế các hoạt động thậm chí là gây chết nếu ở nồng độ quá cao.

SIM0 SIM5 SIM7

Hình 3.29. Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau

So sánh với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác trên thế giới nhận thấy

nồng độ phù hợp chúng tôi thu được trong nghiên cứu này là 2mg/l BAP cho môi

trường tạo đa chồi, trong khi nồng độ mà các tác giả khác sử dụng là 1,67mg/l (Olhoft

và đtg, 2007) [70], (Trần Thị Cúc Hòa, 2007) [9]. Điều này cho thấy, mỗi giống đậu

tương phù hợp với một nồng độ BAP nhất định. Như vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ

BAP là 2mg/l để bổ sung vào môi trường tạo đa chồi và sử dụng kết quả này cho các

thí nghiệm tiếp theo.

3.5.1.3. Ảnh hưởng của hoocmon sinh trưởng GA3, tới khả năng kéo dài chồi

Các cụm chồi hình thành trên môi trường SIM sẽ được chuyển sang môi trường

kéo dài chồi. Trong các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì gibberellin được

biết đến với vai trò chủ yếu trong việc kích thích sự sinh trưởng dãn dài của thân thông

qua việc kích thích sự sinh trưởng dãn dài của tế bào, kích thích sự phân bào của mô

phân sinh đỉnh và mô phân sinh lóng. GA3 là một trong hai đại diện của nhóm

gibberellin có hoạt tính sinh học và được sử dụng rất phổ biến trong nuôi cấy mô tế

bào thực vật (Nguyễn Như Khanh, 2008) [10], (Nguyễn Như Khanh và đtg, 2008)

[11]. Trong nghiên cứu này, để rút ngắn thời gian tạo cây hoàn chỉnh từ các cụm chồi,

chúng tôi tiến hành bổ sung vào môi trường chất kích thích sinh trưởng GA3. Các cụm

chồi tạo trên môi trường SIM4 được chuyển sang 4 môi trường (SEM0-SEM3) có bổ

sung GA3 với các nồng độ tương ứng là 0,5mg/l, 1mg/l và 1,5mg/l. Hiệu quả kéo dài

chồi được đánh giá thông qua tỷ lệ mẫu kéo dài chồi, số chồi kéo dài/cụm và chất

lượng chồi sau kéo dài. Số liệu được tổng hợp trong bảng 3.11.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi

Tỷ lệ mẫu kéo Số chồi kéo Chất lượng Công thức GA3 (mg/l) dài chồi (%) dài/cụm chồi

SEM0 0,0 31,21 2,1 +++

SEM1 0,5 83,15 4,0 +++

SEM2 1,0 86,68 4,5 ++

SEM3 1,5 88,45 4,7 +

Ghi chú: (+++): thân chồi khỏe, phiến lá dày và có màu xanh; (++): thân chồi mảnh, lá

mỏng và có màu lục nhạt; (+): thân chồi nhỏ và yếu có màu vàng, lá mỏng và có màu

lục nhạt hơi vàng.

Kết quả của bảng 3.11 cho thấy, trong môi trường không có GA3 vẫn xuất hiện

các cụm chồi kéo dài, tỷ lệ này là 30,7% nhưng tốc độ kéo dài chồi chậm, số chồi kéo

dài/cụm thu được là thấp nhất (2,5). Khi môi trường có mặt của GA3, tỷ lệ mẫu kéo dài

chồi cũng như số chồi kéo dài/cụm tăng lên. Tỷ lệ mẫu kéo dài chồi dao động từ

83,33% đến 88,33%, trong đó cao nhất ở môi trường SEM3 có bổ sung 1,5mg/l GA3

và thấp nhất ở môi trường SEM1 với 0,5mg/l GA3, song mức độ thay đổi về tỷ lệ này

giữa các công thức thí nghiệm là không nhiều. Đối với chỉ tiêu về số chồi kéo dài/cụm

cũng có sự tăng lên nhưng không lớn giữa việc bổ sung 0,5mg/l với việc bổ sung

1,5mg/l GA3, cụ thể thu được 4 chồi kéo dài/cụm trong môi trường SEM1 và 4,5 chồi

kéo dài/cụm trong môi trường SEM2 và SEM3. Như vậy, so sánh với công thức đối

chứng, có thể nhận thấy GA3 có vai trò quan trọng trong việc kích thích khả năng kéo

dài chồi.

Các chồi sau khi kéo dài được cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, chất lượng của

chúng sẽ ảnh hưởng đến khả năng sống sót của cây khi đưa ra giá thể. Chất lượng của

chồi được đánh giá dựa vào việc quan sát hình thái của chồi và màu sắc của thân và lá.

Nhận thấy rằng chất lượng chồi giảm theo sự tăng nồng độ GA3 được bổ sung vào môi

trường. Khi nồng độ GA3 là 0,5mg/l thì chất lượng chồi thu được là tốt nhất (+++)

tương đương với sự phát triển bình thường của chồi trên môi trường không bổ sung

GA3, chồi kéo dài có thân to, phiến lá dày và có màu xanh. Còn khi tăng nồng độ GA3

lên 1,5mg/l thì tốc độ kéo dài của chồi nhanh nhưng kèm theo nó là sự giảm chất

lượng của các chồi được kéo dài (+), chồi lớn vóng lên, thân nhỏ và yếu, phiến lá

mỏng và có màu lục nhạt hơi vàng .

0mg/l 0,5mg/l 1mg/l 1,5mg/l

Hình 3.30. Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA3 khác nhau

Như vậy, căn cứ vào kết quả thu được, với những nồng độ GA3 nghiên cứu,

chúng tôi lựa chọn nồng độ GA3 bổ sung vào môi trường là 0,5mg/l

Như vậy với những kết quả thu được ở trên nhận thấy sự phối hợp giữa GA3

(0,5mg/l) là thích hợp cho quá trình kéo dài chồi. Kết quả này cũng phù hợp với một

số kết quả nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố (Olhoft và đtg, 2001) [69],

Olhoft và đtg, 2007) [70]

3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ

IBA được sử dụng để kích thích sự ra rễ của cây in vitro trong nhiều nghiên cứu

về cây đậu tương. Trong thí nhiệm này, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng tạo

rễ của cây đậu tương với các nồng độ IBA khác nhau. Các chồi sau khi đạt chiều cao

từ 4-5 cm trên môi trường kéo dài được cắt và chuyển sang môi trường ra rễ với nồng

độ IBA được bổ sung lần lượt là: 0,1mg/l; 0,5mg/l; 1 mg/l IBA và gây sốc bằng cách

nhúng chồi vào IBA có nồng độ 1mg/ml. Có bốn chỉ tiêu được theo dõi trong thí

nghiệm này là: tỉ lệ mẫu tạo rễ, ngày bắt đầu ra rễ, số rễ trung bình, và chất lượng rễ.

Các kết quả được trình bày trong bảng 3.12.

Bảng 3.12 . Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ

Công IBA Tỉ lệ mẫu tạo rễ Ngày bắt đầu Số rễ Chất lượng rễ thức (mg/l) (%) ra rễ trung bình

RM0 0 100 5 3,5 +

Ghi chú: (+++): rễ trắng, to và có nhiều rễ thứ cấp; (++): rễ có màu vàng, ít rễ thứ cấp; (+): rễ mảnh, có màu nâu, rất ít rễ thứ cấp.

RM1 RM2 RM3 0,1 0,5 1 100 100 100 4 3 3 5,5 6,0 7,0 +++ ++ ++

Căn cứ vào kết quả ở bảng 3.12 nhận thấy, khác với một số cây nuôi cấy in vitro như

thông, cam, quýt,…khả năng tạo rễ của chồi cây đậu tương tốt hơn, tỉ lệ chồi tạo rễ thu được

trong tất cả các môi trường đều đạt 100% ngay cả trong công thức đối chứng. Thời gian bắt

đầu xuất hiện rễ của cây đậu tương sớm hơn: 3 ngày trong công thức RM2 (0,5mg/l IBA) và

RM3 (1mg/l IBA), dài nhất là 5 ngày trong công thức RM0.

Số rễ trung bình thu được trong các công thức dao động từ 3,5 đến 7 rễ trên một

chồi. Số lượng rễ thu được cao nhất là khi tăng nồng độ IBA lên 1mg/l trong công thức

RM4, quan sát thấy rễ ra thành chùm xung quanh phần gốc thân. Còn ở công thức

RM0, số lượng rễ thu được là thấp nhất với 3,5 rễ/chồi.

Bên cạnh số lượng rễ thì chất lượng rễ được coi là yếu tố quyết định đến khả

năng sống của cây khi đưa ra trồng trong môi trường tự nhiên. Với kết quả thu được

trong bảng 1.5 cho thấy, chất lượng rễ tốt nhất quan sát được ở công thức có bổ sung

0,1mg/l IBA, rễ có màu trắng, to, dài, nhiều rễ thứ cấp và xuất hiện đều xung quanh

gốc cấy. Rễ sinh trưởng kém nhất ở hai công thức RM0 và RM4, hình thái rễ quan sát

được trong 2 môi trường này khá giống nhau: rễ mảnh, có màu nâu sậm, rất ít rễ thứ

cấp (Hình 3.31).

RM1

ĐC

RM2

RM3

Hình 3.31. Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro

Như vậy, trong những nồng độ IBA đã nghiên cứu thì nồng độ 0,1mg/l là thích hợp

nhất cho việc ra rễ của cây đậu tương in vitro giống DT84.

3.5.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro

Để cây nuôi cấy in vtro sinh trưởng được một cách bình thường trong điều kiện

tự nhiên, chúng cần có thời gian thích ứng và phục hồi thông qua giai đoạn phát triển

trên giá thể trong điều kiện nhà lưới hay vườn ươm. Đây là khâu cuối cùng và cũng là

bước để đánh giá mức độ hiệu quả của một quy trình tái sinh. Vì vậy việc lựa chọn

một giá thể ra cây phù hợp có ý nghĩa đặc biệt quan trọng, giá thể thích hợp sẽ giúp rễ

cây nhanh chóng phục hồi và phát triển, làm tăng tỉ lệ sống khi ra cây.

Thông thường, với ưu điểm là xốp nhẹ, giữ ẩm tốt, trấu hun được sử dụng khá

phổ biến để làm giá thể ra cây. Đồng thời việc kết hợp trấu hun với một số thành phần

khác như cát, đất phù sa,… với tỉ lệ nhất định tạo ra giá thể thích hợp cho nhiều loại

cây in vitro khác nhau.

Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng thử nghiệm 3 loại giá thể khác nhau là:

trấu hun, 1 trấu hun :1 cát vàng và hỗn hợp trồng cây có bán sẵn. Hai yếu tố được đánh

giá trong thí nghiệm này là tỉ lệ sống của cây con và chất lượng cây con.

Tỷ lệ cây sống là tiêu chí quan trọng để đánh giá mức độ phù hợp của giá thể.

Khi bộ rễ cây in vitro có khả năng thích ứng với môi trường bên ngoài để sống sót và

bắt đầu hình thành rễ mới thì cây sẽ được phục hồi và xuất hiện lá mới. Điều này được

thể hiện ở chất lượng cây con trên giá thể ra cây. Căn cứ vào chất lượng cây con kết

quả nhận thấy với tỷ lệ giá thể là 1 trấu hun: 1 cát vàng là phù hợp. Cây con trên giá

thể này có thời gian xuất hiện lá mới sớm, thân kéo dài nhanh. Điều này có thể giải

thích giá thể xốp và thoáng khí bởi việc bổ sung cát vàng vào trấu hun trong khi vẫn

giữ được độ ẩm cần thiết. Đây chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn giá thể (1 trấu hun

: 1 cát vàng) làm nguyên liệu để đưa cây đậu tương in vitro ra môi trường tự nhiên.

Sau hai tuần chúng tôi chuyển ra đất.

Hình 3.32. Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả

3.5.2. Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84

Gen mã hóa enzym β- glucuronidase (GUS) được phân lập từ chủng E.coli

RA201. Enzym β- glucuronidase có khả năng phân hủy cơ chất glucuronidase thành

sản phẩm có khả năng tạo màu xanh lam dễ nhận biết. Chính những đặc điểm này mà

các nhà khoa học đã thiết kế gen GUS vào các vector chuyển gen để làm chỉ thị dễ

nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển (Jefferson và đtg, 1987) [51]. Hiện

nay có rất nhiều vector chuyển gen vào thực vật thông dụng được thiết kế có mang gen

gus như pBI 121, pCAM 301,… hiệu suất của quá trình chuyển gen không chỉ phụ

thuộc vào hệ thống tái sinh mà còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có đặc

điểm di truyền của giống. Nhiều nghiên cứu chuyển gen thành công vào cây đậu tương

thông qua nách lá mầm đã được công bố, tuy nhiên để xác định DT84 có phải là giống

thích hợp cho việc chuyển gen theo phương pháp này hay không, chúng tôi đã khảo sát

khả năng chuyển gen thông qua việc sử dụng gen chỉ thị GUS intron.

Theo quy trình chuyển gen tham khảo từ một số nghiên cứu đã công bố, chúng

tôi tiến hành nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút và sau thời gian đồng nuôi cấy là 5

ngày các mẫu được kiểm tra biểu hiện gen GUS tạm thời bằng phương pháp nhuộm

màu với cơ chất X-Gluc (Hình 3.33). Tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen GUS chúng tôi thu

được là 67,5%. Sau 2 tuần trên môi trường tạo đa chồi không chứa chất chọn lọc, các

cụm chồi được chuyển sang môi trường chứa ppt với nồng độ 3mg/l (Olhoft và đtg,

2001) [69]. Trên môi trường này, đa số các cụm chồi bị hóa vàng, khô và chết dần. Tỷ

lệ mẫu sống sót sau 2 tuần trên môi trường chứa chất chọn lọc thống kê được là

15,21%. Những cụm chồi sống sót sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM

và tiếp tục được chọn lọc.

Như vậy, dựa trên tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus tạm thời, cũng như tỷ lệ mẫu

sống trên môi trường chọn lọc, bước đầu nhận thấy rằng DT84 là giống đậu tương

thích hợp với phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín.

A B

Hình 3.33. Biểu hiện của gen GUS

A: Biểu hiện của gen GUS sau 5 ngày đồng nuôi cấy; B: Mẫu biến nạp sống trên môi trường

chọn lọc

Từ các kết quả trên, chúng tôi trình bày quy trình hoàn chỉnh cho việc tái sinh

phục vụ chuyển gen đối với cây đậu tương thông qua phương pháp nách lá mầm như

- Khử trùng hạt bằng khí clo, 16 giờ

- Nảy mầm hạt trên GM (4–5 ngày)

- Nuôi đặc tạo khuẩn lạc - Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù - Ly tâm thu cặn khuẩn, hòa cặn trong CCM (OD600 0,6-1)

1. Chuẩn bị vật liệu chuyển gen 2. Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens mang cấu trúc gen chuyển

- Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn - Lây nhiễm 30 – 40 phút - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối (5 ngày)

3. Chuyển gen

- Rửa mẫu trong SIM lỏng + 500 mg/l cefotaxime - Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1 (2 tuần) - Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2 (2 tuần)

4. Rửa khuẩn và chọn lọc trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi

- Cắt bỏ lá mầm - Chuyển mẫu sang SEM (2 tuần/lần)

5. Chọn lọc trên môi trường kéo dài chồi

- Ra rễ trên RM (14-20 ngày) - Ra cây trên giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng

6. Ra rễ và ra cây hoàn chỉnh

Hình 3.34. Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm

3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương

Từ các kết quả nghiên cứu chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào cây thuốc lá

chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc này vào nách lá mầm giống đậu tương DT84 bằng

vi khuẩn A. tumefaciens theo quy trình đã được tối ưu.

Bảng 3.13. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai đoạn

Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ

410 480 425 1262 189 200 175 564 30 33 38 101 16 23 14 53 Số cây sống trên giá thể 9 11 8 28 Số cây dương tính với PCR 2 - 1 3

1 2 3 Tổng

Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như nguồn vật liệu ban

đầu, môi trường nuôi cấy, thời gian nhiễm khuẩn, vector chuyển gen,... Trong nghiên

cứu này, cây mầm 4 - 5 ngày tuổi được sử dụng làm vật liệu chuyển gen ở giai đoạn

này, việc tách đôi hai lá mầm được thực hiện dễ dàng, đồng thời chồi ngọn và chồi bên

có thể được phát hiện và loại bỏ nhằm tránh hiện tượng ưu thế ngọn ảnh hưởng đến sự

phát triển của các mô phân sinh phụ nằm ở vùng nách lá mầm. Việc sử dụng dao gây

tổn thương nách lá mầm giúp cho mẫu vật sản sinh ra các hợp chất phenolic có tác

dụng dẫn dụ vi khuẩn, làm tăng cường khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn. Ngoài ra, tổ

hợp các hợp chất có chứa thiol (L-cysteine, dithiothreitol và sodium thiosulfate) được

bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy CCM giúp làm tăng khả năng gắn T-DNA vào

bộ gen thực vật và do đó tăng hiệu quả chuyển gen (Olhoft và đtg, 2001) [69].

Thí nghiệm được tiến hành trên 3 lô thí nghiệm với tổng số 1262 mẫu được sử

dụng cho chuyển gen, có 564 số mẫu tạo chồi, 101 số mẫu kéo dài chồi, trong quá

trình chọn lọc kháng sinh có 28 cây sống sót ra rễ và trồng ở nhà lưới.

BN

GM

SEM

SIM

Hình 3.35. Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen

Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển, sau khi ra cây khoảng 1 tháng, mẫu lá

của các dòng cây T0 được tiến hành thu để tách chiết DNA tổng số. Kết quả điện di

sản phẩm DNA tổng số cho thấy các băng vạch thu được đều rõ, chứng tỏ DNA có

chất lượng tốt, có thể dùng làm mẫu cho phản ứng PCR nhân gen.

Sử dụng 1µl sản phẩm DNA đã được tách chiết, chúng tôi tiến hành phản ứng

PCR với các cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A. Kết quả điện di sản phẩm PCR

cho thấy đã thu nhận được 3 cây dương tính với phản ứng PCR chiếm tỷ lệ 0,23% tổng

mẫu biến nạp. Trong số 3 dòng cây thu được có một dòng không ra hoa. Các dòng cây

được tiếp tục trồng để thu hạt và đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển ở các thế hệ

sau.

1,3kb

1,5kb 1kb

M 1 2 3 4 5 WT - +

Hình 3.36. Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen bằng PCR M: Thang DNA chuẩn 1kb; (-): Đối chứng âm; WT: Cây không chuyển

gen; 1 -5: Các dòng T0 được phân tích; (+): Đối chứng dương (plasmid)

Dòng 11 Dòng 17 Dòng 23

Hình 3.37. Cây đậu tương T0 chuyển gen 98

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. 16 giống đậu tương địa phương sưu tập được có sự đa dạng và phong phú về hình

thái, kích thước và khối lượng hạt. Phân tích về chỉ tiêu hóa sinh cho thấy các giống

đậu tương địa phương có chất lượng và khả năng chịu hạn cao hơn so với giống đối

chứng. Đã xác định được mối liên quan giữa tỷ lệ tăng hàm lượng prolin và khả năng

chịu hạn của các giống đậu tương trong phạm vi nghiên cứu.

1.2. Trình tự gen P5CS của hai giống đậu tương DT84 và SL5 đã được phân lập gồm

có 2148 nucleotid, mã hóa 715 axit amin.

1.3. Đã tạo đột biến ở bộ ba có vị trí thứ 125 của gen P5CS của giống SL5, thay thế

Asp bằng Ala trong trình tự protein.

1.4. Promoter rd29A đã được phân lập thành công từ cây A.thaliana. Promotor rd29A

có chiều dài 1298bp mang các trình tự đặc trưng gồm các nhân tố cis thuộc nhóm

MYB, DRE, AMY box nhân tố đặc trưng của promoter và nhân tố cảm ứng điều kiện

khô hạn.

1.5. Khả năng hoạt động của promtor rd29A đã được đánh giá trong cây thuốc lá

chuyển gen. Trong điều kiện thiếu nước, promoter rd29A đã điều khiển gen chỉ thị

GUS biểu hiện khá mạnh và rõ ràng ở các dòng thuốc lá chuyển gen được xử lý bởi

hạn nhân tạo so với các dòng cây chuyển gen không xử lý và cây đối chứng.

1.6. Đối với các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM, có hiện

tượng tăng cao hàm lượng prolin sau khi gây hạn nhân tạo, dẫn đến khả năng sống sót

cao hơn các cây đối chứng (không chuyển gen). Khả năng phục hồi của các dòng cây

chuyển gen nhanh hơn các cây đối chứng.

1.7. Tối ưu được quy trình tái sinh và chuyển gen thông qua mô nách lá mầm ở đậu

tương. Bước đầu chuyển thành công cấu trúc gen rd29A::P5CSM vào giống đậu tương

DT84, và thu được một số dòng dương tính PCR đối với gen chuyển.

2. Đề nghị

- Tiếp tục nghiên cứu, phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn

phục vụ cho chọn tạo giống.

- Mở rộng sử dụng cấu trúc promoter rd29A::GUS và rd29A::P5CSM vào các

đối tượng cây trồng khác.

100

CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

1. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, Đinh Thị Kim Phương, Trần Thị Trường (2006), “Sưu tập, phân loại và đánh giá chất lượng hạt của một số giống đậu tương địa phương tại tỉnh Sơn La” Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn số 11 kỳ I tháng 6/2006. 28-32 2. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường (2006), “Thành phần axit amin và khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Sơn La” Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn số 20 kì II tháng 10/2006. 22-26. 3. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008) Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một số giống đậu tương (Glycine max L.Merrili) Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4): 459-466

4. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009) Phát triển hệ thống tái sinh invitro ở cây đậu tương (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen. Tạp chí Khoa học và Công nghệ . Đại học Thái Nguyên 52(4): 82-88.

5. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009) Tạo gen mã hóa enzym P5CS (Pyroline - 5 - carboxylate synthase) mang đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bằng kỹ thuật PCR . Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 191 - 193.

6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tách dòng và đánh giá hoạt động của promoter cảm ứng khô hạn RD29A từ Arabidopsis thaliana. Tạp chí Công nghệ sinh học. 8(4): 1805-1810.

7. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tạo cây thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược, làm tăng hàm lượng protein và khả năng chống chịu khô hạn. Hội nghị toàn quốc về khoa học sự sống Bio-Hà Nội 2010. Tạp chí Công nghệ sinh học 8 (3A): 539-544. 8. Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline – 5 – carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar ( Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010): 319-323

101

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo Tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Hỗ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật

trong cải tiến giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp.

2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu

ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa. NXB Đại học quốc gia Hà Nội.

3. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê

Trần Bình (2003), “Mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở

cây lúa′′ Tạp chí công nghệ sinh học, 1(1): 85-95.

4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành

hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội

5. Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi, Nguyễn Thị Tỵ (1998), “Xác định thành phần

axit amin bằng phương pháp dẫn xuất hoá với 0-phthalđialehyd và 9-fluorenlmthyl

chlorofomat trên hệ HP aminoquan series II”, kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học

1997. NXB khoa học kỹ thuật H, 454-461

6. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào

(1999), Cây đậu tương. NXB Nông Nghiệp.

7. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục.101-112

8. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương. NXB Nông Nghiệp.

9. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của

các giống đậu tương trồng ở Việt Nam“ Tạp chí Nông nghiệp và phát triển

nông thôn. 18: 11-16.

10. Nguyễn Như Khanh(2008), Sinh học phát triển thực vật. NXB Giáo dục.

11. Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng (2008), Sinh lý học thực vật. 2008, NXB

Giáo dục.

102

12. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân

tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam,

Luận án tiến sỹ sinh học. Viện Công nghệ sinh học: Hà Nội

13. Trần Thị Phương Liên (2010) Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB Khoa

học tự nhiên và công nghệ :82-140

14. Trần Đình Long, Đoàn Thị Thanh Nhàn (1995). Kết quả nghiên cứu giống đỗ

tương M103, Kết quả nghiên cứu khoa học cây đậu đỗ 1991-1995:52-56

15. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các

dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc Việt Nam, Luận

án tiến sỹ sinh học. Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội

16. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn

ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật. Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội.

17. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu

thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB Nông Nghiệp,

Hà Nội

18. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu và ứng

dụng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

19. Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2009) “Cây thuốc lá chuyển gen

mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm”. Tạp chí

Công nghệ Sinh học 7(2): 193- 201

Tài liệu tham khảo tiếng Anh

20. Armengaud P, Thiery L, Buhot N, Grenier-de March G, Savouré A (2004)

“Transcriptional regulation of prolin biosynthesis in Medicago truncatula

reveals developmental and environmental specific features“. Physiologia

plantarum 120(3), 442-450

21. Bates LS (1973), Rapid determination of free prolin for water stress studies.

Plant Soil. 39: 205-207

103

22. Baucher M, Andree BVM , Chabbert B, Michel BJ, Opsomer C, Van MM.

and Botterman J. (1999). “Down-regulation of cinnamyl alcohol

dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on

lignin composition and digestibility”. Plant Molecular Biology. 39: 437-447

23. Boggess SF and Stewart CR (1976), “Effect of water stress on prolin

synthesis from radioactive precursors”. Plant Physiol. 58(3): 398-401.

24. Borsani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK. (2005).

“Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts

regulate salt tolerance in Arabidopsis”. Cell 123: 1279–1291.

25. Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant

dehydrin proteins’’, Physiol.Plant , 795-803.

26. Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemieniak D, and

Slightom JL (1988), “Nucleotid sequence of a mutation in the proB gene of

Escherichia coli that confers prolin overproduction and enhanced tolerance

to osmotic stress”. Gene. 64(2): 199-205.

27. Curtis J, Shearer G, and Kohj DH (2004), “Bacteroid prolin catabolism

affects N(2) fixation rateof drought- stressed soybeans”. Plant Physiol.

136(92): 3313-3318.

28. Chen JB, Wang SM, Jing RL, and Mao XG (2009), “Cloning the PvP5CS

gene from common bean (Phaseolus vulgaris) and its expression patterns

under abiotic stresses”. J Plant Physiol, 166(1): 12- 19

29. Choudhary NL, Sairam RK, and Tyagi A (2005), “Expression of ∆1 -

Pyrroline - 5 - carboxylate synthetase gene during droght in rice

(Oryzasativa L)”. Indian J Biochem Bio, 42: 366-370

30. Delauney AJ, Hu CAA, and Kishor PB, Verma, D. P. S (1993). “Cloning of

ornithine δ- aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by trans-

complementation in Escherichia coli and regulation of prolin biosynthesis”.

J Biol Chem, 268: 18673-18678.

31. Dix PJ, (1986) “Plant cell culture technology”. Yeoman M.M. (eds), Oxford,

Blackwell Scientific Publications. 143-201.

104

32. Do TH, Jacob M, Angenon G, Hermans C, Tran TT, Le VS, and Roosens

NH (2003), “Prolin accumulation and ∆1 - Pyrroline - 5 - carboxylate

synthetase gene properties in three rice cultivars differing in salinity and

drought tolerance”. Plant Sci. 165: 1059-1068

33. Fior S, Vianelli A, and Gerola PD (2009), “A novel method for fluorometric

continuous measurement of β-glucuronidase (GUS) activity using 4-methyl-

umbelliferyl-β-d-glucuronide (MUG) as substrate”. Plant Sci. 176(1): 130-

135.

34. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A.,

Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J. (2005).

“EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates

secondary cell wall formation and lignin biosynthesis”. The Plant Journal.

43(4): 553-567

35. Hai L, Qingyin Z, Yan LZ, Shasheng W, Xiangning J (2003), “Xylem

specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic

tobacco”. Plant Growth Regulation. 41: p. 279-286

36. HamiltonIIIEW,HeckathornSA(2001)MitochondrialadaptationstoNaCl.Com

plexIisprotectedoxidantsandsmallheatshockproteins,whereascomplexIIisprot

ectedby prolineandbetaine.PlantPhysiol126:1266–1274

37. Hawkins S, Samaj J, Lauvergeat V, Boudet A, Grima-Pettenati J(1997),

Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter

Activity in Transgenic Poplar. Plant Physiol, 113(2): p. 321-325.

38. Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994) “Efficient transformation of

rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of

the boundaries the T-DNA”, The Plant J (271-282)

39. Hirasawa, T Tanaka K., Miyamoto D., Takei, M. and Ishihara K. (1994)

“Effects of preflowering moisture deficits on dry matter production and

ecophysiological characteristics in soybean plants under drought conditions

during grain filling”. Jpn. J. Crop Sci. 63: 721-730.

105

40. Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) An Autophosphorylation Site of

the Protein Kinase SOS2 Is Important for Salt Tolerance in Arabidopsis.

Molecular Plant, doi:10.1093/mp/ssn087

41. Hong HP, Zhang H, Olhoft P, Hill S, Wiley H, Toren E, Hillebrand H,

Jones T, Cheng M (2007),“Organogenic callus as the target for plant

regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max

(L.) Merriill”. In vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43: 558-568.

42. Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma DPS (2000) Removal of feedback

inhibition of -pyrroline -5- carboxylate synthetase results in increased

proline accumulation and protection of plants from osmotic stress”. Plant

Physiol,. 122: p. 1129-1136.

43. Hoogenboom G.Peterson, CM, Huck, MG (1987) “Shoot growth rate of

soybeans as affected by drought stress”. Agron. J. 79: 598-607.

44. Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS (1992) “A bifunctional D1-enzyme-

pyrroline-5-carboxylate synthetase catalyzes the ﬁrst two steps in prolin

biosynthesis in plants”. Proc Natl Acad Sci USA 89:9354– 9358

45. Hua X, Van De Cotte B, Van Montagu, M., Verbruggen N (1999) “A 69 bp

fragment in the pyrroline-5-carboxylate reductase promoter of Arabidopsis

thaliana activates minimal CaMV 35S promoter in a tissue-specific

manner”. FEBS Lett. 458:193–196.

46. Hua X-J, Van De Cotte B, Van Montagu M, Verbruggen N (1997)

Developmental regulation of pyrroline-5-carboxylate reductase gene

expression in Arabidopsis. Plant Physiol 114: 1215–1224

47. Huck MG, Ishihara K, Peterson C.M. and Ushijima T (1983) “Soybean

adaptation to water stress at selected stages of growth”. Plant Physiol. 73:

422-427.

48. Hufstetler EV, Boerma, HR, Carter TE, Earl HG (2007) “Genotypic

variation for three physiological traits affecting drought tolerance in

soybean”. Crop Sci. 47: 25-35.

106

49. James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008a) “Genotypic variation for drought

stress response traits in soybean. I. Variation in soybean and wild Glycine

spp. for epidermal conductance, osmotic potential, and relative water

content”. Aus. J. Agri. Res. 59: 656-669

50. James AT, Lawn RJ, Cooper M (2008b) “Genotypic variation for drought

stress response traits in soybean. II. Inter-relations between epidermal

conductance, osmotic potential, relative water content, and plant survival”.

Aus. J. Agri. Res. 59: 670-678.

51. Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987), “GUS fusion: β-

glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher

plants”. EMBO. 6: 3901-3907.

52. Jovanovi Z, Proki L, Stiki R, Peki S (1996) “Cuticular characteristics in

maize lines differing in drought resistance and maturity grouping”. J. Exp.

Bot. 47: 59-60.

53. Jun SS, Choi HJ, Yang JY, Hong YN (2001), “Photosynthetic response to

dehydration and high temperature in trehalose-producing transgenic tobacco

In PS2001 Proceedings, 12th International Congress on Photosynthesis”.

CSIRO Publishing, Canberra, S35-017.

54. Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC. (1984) “Taproot elongation rates of

soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting

depth”. Crop Sci. 24: 916-920.

55. Kavi Kishor PB, Hong Z, Miao G, Hu C, Verma DPS (1995)

Overexpression of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases

proline overproduction and confers osmoto lerance intransgenic plants.

Plant Physiol 108: 1387–1394

56. King CA, Purcell LC (2005) “Inhibition of N2 fixation in soybean is

associated with elevated ureides and aminoacids”. Plant Physiol. 137: 1389-

1396

107

57. Kishor PBK, Sangam S, Amrutha RN, Sri Laxmi P, Naidu KR, Rao K R S

S, Sreenath Rao, Reddy K J, Theriappan P, Sreenivasulu N (2005)

“Regulation of prolin biosynthesis, degradation, uptake and transport in

higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance”.

Current Science 88:3 424 – 438.

58. Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant

functional genomics. Erich Grotewold (Ed.)”, Humana Press. 189-204.

59. Kohl DH, Schubert KR, Carter MB, Hagedorn CH, Shearer G (1988)

Proline metabolism in N2-fixing root nodules: energy transfer and

regulation of purine synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 85: 2036–2040

60. Lambert N, Yarwood JN (1992), Engineering legume seed storage protein,

in Plant Protein Engineering. Cambridge University press, 167-187.

61. Liu F, Andersen MN, Jensen CR. (2003) “Loss of pod set caused by

drought stress is associated with water status and ABA content of

reproductive structures in soybean”. Funct. Plant Biol. 30: 271-280

62. Liu Y, Gai JY, Lu HN, Wang Y J, Chen SY (2005) “Identification of

drought tolerant germplasm and inheritance and QTL mapping of related

root traits in soybean [Glycine max (L.) Merr.]” Yi Chuan Xue Bao 32: 855-

863.

63. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (November

1951). "Protein measurement with the Folin phenol reagent". J. Biol.

Chem. 193 (1): 265–75.

64. Marino D, Frendo P, Ladrera R, Zabalza A, Puppo A, Arrese-Igor C (2007)

“Nitrogen fixation control under drought stress. Localized or systemic?”

Plant Physiol. 143: 1968–1974.

65. Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura MM, Costantino P, and Trovato

M (2009). “The prolin biosynthetic genes P5CS1 and P5CS2 play

108

overlapping roles in Arabidopsis flower transition but not in embryo

development”. Physiologia Plantarum 137: 72–85.

66. Matysik J, Ali Bhalu,B, Mohanty P (2002) “Molecular mechanism of

quenching of reactive oxygen species by prolin under water stress in

plants”. - Curr. Sci. 82: 525-532

67. Murakeozy EP, Nagy Z, Duhaz C, Buchereau A, Tuba Z (2003) “Seasonal

changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of

inland saline vegetation in Hungary”. J Plant Physiol 160:395–401

68. Nguyen HT, Babu RCBlum, A. (1997) “Breeding for drought resistance in

rice: physiology and molecular genetics considerations”. Crop Sci. 37:

1426-1434

69. Olhoft PM, Lin K, Galbraith J, Nielsen NC, Somers DA (2001), “The role

of thiol compound in increasing Agrobacterium-mediated transformation of

soybean cotyledonary-node cells”. Plant Cell Rep. 20: 731-737.

70. Olhoft PM (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated

transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-

node explants from seedlings”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 43: 536-549.

71. Olhoft PM, Somers DA (2001), “L-Cysteine increases Agrobacterium-

mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”. Plant

Cell Rep, 20: 706-711.

72. Paz1 MM, Shou H, Guo Z, Zhang Z, Banerjee AK, Wang K (2004),

“Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean

transformation using the cotyledonary node explant”. Euphytica 136: 167-

179.

73. Peng Z, Lu Q, Verma DPS (1996) Reciprocal regulation of D1- pyrroline-

5-carboxylate synthetase and proline dehydrogenase genes control levels

during and after osmotic stress in plants.Mol Gen Genet 253: 334–341

74. Porcel R, azconR,Ruiz- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes

encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in

109

arbuscular mycorrhizal Glycine max and Lactuca sativaplants”. J Exp

Bot.,56(417):1933-42.

75. Purcell LC, King CA (1996) “Drought and nitrogen source effects on

nitrogen nutrition, seed growth, and yield in soybean”. J. Plant Nutr. 19:

969-993

76. Ren-Gao X, Hong-Feng X, Zhang B (2006), “A multi-needle-assisted

transformation of soybean cotyledonary node cells”. Biotechnol Lett, 28:

1551-1557.

77. Riederer M, Schreiber L (2001) “Protecting against water loss: Analysis of

the barrier properties of plant cuticles”. J. Exp. Bot. 52: 2023-2032

78. SabehatA,LurieS,WeissD(1998)Expressionofsmallheatshockproteinsatlowte

mperatures.PlantPhysiol117:651–658

79. Sairam RV, Franklin G, Hassel R, Smith B, Meeker K N K, Parani M, Abed

DA, Ismail S, Berry K, Goldman SL (2003),” A study on the effect of

genotypes, plant growth regulators and sugars in promoting plant

regeneration via organogenesis from soybean cotyledonary nodal callus”.

Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 75: 79-85.

80. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press

81. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A

Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor, New York

82. Samoylov VM, Tucker DM, Thibaud-Nissen F, Parrott WA (1998), “A

liquid-medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic

soybean cultures”. Plant Cell Reports, 18: 49-54.

83. Satoh R, Nakashima K, Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K

(2002) “ACTCAT, a novel cis-acting element for prolin-and

hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding prolin

dehydrogenase in Arabidopsis”. Plant Physiol. 130, 709–719

110

84. Shinozaki K, Yamamguchi-Shinozaki K (2007), “Gene expression and

signal transduction in water-stress response”. Plant Physiol 115: 327-334.

85. Sinclair TR, Ludlow. MM (1986) “Influence of soil water supply on the

plant water balance of four tropical grain legumes”. J. Plant Physiol. 13:

329-341

86. Sinclair TR., Purcell L.C, King CA., Sneller CH., Chen P, Vadez V (2007)

“Drought tolerance and yield increase of soybean resulting from improved

symbiotic N fixation”. Field Crops Res. 101: 68-71

87. Specht JE, Williams JH (1985) Breeding for drought and heat resistance:

Prerequisites and examples. In: World Soybean Research Conference III.

Proceedings. Edited by Shibles, R. pp.468–475. Westview Press, Boulder,

Colarado

88. Sun XH, Chen MJ (2002) “A brief account of promoter cloning”. Acta

Edulis Fungi. 9(3): 57-62.

89. Szabados L, AouldSavoure (2009) “ Prolin: amultifunctionalaminoacid

”Trends in PlantScience 15 (2): 89-97

90. Szekely G, Abraham E, Cseplo A, Rigo G, Zsigmond L, Csiszar J, Ayaydin

F, Strizhov N, Jasik J, Schmelzer E (2008): “Duplicated P5CS genes of

Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental

control of prolin biosynthesis”. Plant Journal , 53(1):11-28.

91. Tae-Seok K and Korban SS (2004), “Enhancing the frequency of somatic

embryogenesis following Agrobacterium-mediated transformation of

immature cotyledons of soybean [ Glycine max(L.) Merrill.]”. In Vitro Cell.

Dev. Biol-Plant. 40: p. 552-558.

92. Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka

Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) “Comparative genomics in salt

tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress

using Arabidopsis microarray”. Plant Physiol 135:1697–1709

93. Taylor HM Burnett E, Booth GD (1978) “Taproot elongation rates of

soybeans”. Z. Acker-und Pflanzenbau Bd. 146

111

94. ThomashowMF(1998)Roleofcoldresponsivegenesinplantfreezingtolerance.P

lantPhysiol118:1–7

95. Topping JF (1988), Tobacco transformation. Methods Mol Biol, 81: 365

96. Turner NC, Wright GC, Siddique KHM (2001) “Adaptation of grain

legumes (pulses) to water limited environments”. Adv. Agron. 71: 193-23.

97. Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K,

Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein

kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress-responsive gene

expression in Arabidopsis thaliana. PNAS 101 (49):17306-17311

98. Valliyodan B and Nguyen HT. (2006) “Understanding regulatory networks

and engineering for enhanced drought tolerance in plants”. Curr. Opin.

Plant Biol. 9: 189

99. VierlingE,KimpelJA(1992)Plantresponsestoenvironmentalstress.CurrOpinB

iotech3:164–170

promoter Prd29A and its application in sugarcane drought resistance”. Sugar

Tech.10(1): 36-41

100. Wu Y ZH, Que YX, Chen RK, Zhang MQ (2008) “Cloning and identification of

101. Xu Q , Wen XP and Deng XX (2004). “A simple protocol for isolating

genomic DNA from chestnut rose (Rosa roxburghii Tratt ) for RFLP and

PCR Analyses”. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g

102. Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1993) “The plant hormone abscisic

acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific

expression of rd22, a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis

thaliana”. Mol.Gen.Genet. 2: p. 17-25

103. Zhang CS, Lu Q, Verma DPS (1995) “Removal of feedback inhibition of

D1 -pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzyme catalyzing

the ﬁrst two steps of prolin biosynthesis in plants”. J Biol Chem 270:20491–

20496

112

104. Zhang C-S, Lu Q, Verma DPS (1997) “Characterization of ∆1 – pyrroline -

5-carboxylate synthetase gene promoter in trangsgenic Arabidopsis thailana

subjected to water stress” Plant Scicnce 129 : 81-89

105. Zhang N, Si HJ, and Wang D (2005), “Cloning of rd29A gene promoter

from Arabidopsis thaliana and its application in stress-resistance transgenic

potato”. Acta Agronomica Sinica. 31(2): 159-164.

Tài liệu trang Web

106. .http://www.gso.gov.vn

107 http://faostat.fao.org

108.http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Promoter.

113

Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

HỢP PROLIN

Promoter là vùng DNA trong gen của sinh vật có chức năng khởi đầu quá

trình phiên mã của gen. Tận dụng chức năng tự nhiên của promoter, các nhà khoa

học có thể điều khiển hoạt động của các gen một cách có chủ đích ở các cá thể. Ở

các loài sinh vật nhân thực, cấu trúc của một promoter bao gồm các thành phần

chính như sau: Phần lõi (Core) promoter

1.4.3. Promoter rd29A

Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

pPTN289 chứa gen gus intron và gen chọn lọc bar kháng ppt do Đại học Tổng

hợp Nebraska, Hoa Kỳ cung cấp. Vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ tế bào

Ra cây Hình 2.2. Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1500bp

1000bp

SL5 .................................................................................................... A V G K L G A L C E Q I K E L N S L G Y E I I L V S S G A V G L G R

SL5 .................................................................................................... N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D F R D K D F

410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Glycine max. gaatgcagctcagcgaaactatgaaatcattgttagcattaaaagttattcccatattcaacgagaacgatgcagttagtactaggaaagctccatatga

2000bp

1800bp

500bp

400bp

2100bp

2770bp(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) 2100bp(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)

1 2

1 2

Sơ đồ nghiên cứu

.

i

/ l

) g m n m o m p ( U M g n ợ ư L

Mẫu

M 1 2 3 - +

1 2 3 M

A: sản phẩm clony- PCR với cặp mồi rd29A for /rd29A rev M: Thang DNA 1kb; Giếng 1-3: Các dòng khuẩn lạc (-) Đối chứng âm, ( + ) đối chứng dương Hình 3.23. Điện di sản phẩm clony- PCRvà cắt hạn chế vector pBI101::rd29A::P5CSM

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - +

3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 - +

451.77 297.21 286.10

259.54 315.55 343.84

/

l

) g e o m µ ( e n

i l

l

m à H

o r p g n ợ ư

Thời gian (ngày)

0mg/l 0,5mg/l 1mg/l 1,5mg/l

RM1

RM2

RM3

BN

GM

SEM

SIM

SIM

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010) Tách dòng và đánh giá hoạt động của promoter cảm ứng khô hạn RD29A từ Arabidopsis thaliana. Tạp chí Công nghệ sinh học. 8(4): 1805-1810.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

54. Kaspar TC, Taylor HM, Shibles RC. (1984) “Taproot elongation rates of

soybean cultivars in the glasshouse and their relation to filed rooting

depth”. Crop Sci. 24: 916-920.

Overexpression of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases

proline overproduction and confers osmoto lerance intransgenic plants.

Plant Physiol 108: 1387–1394

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng