LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng -
Trƣởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi chọn đề tài và tận tình hƣớng dẫn,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Và tôi cũng xin chân
thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện
Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi hoàn thành
tốt phần thực nghiệm của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng nhƣ hoàn thành mọi
thủ tục cần thiết.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô giáo Viện Nghiên cứu và
Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trƣờng Đại học Nha Trang, Trƣờng Đại
học Khánh Hòa đã dạy dỗ, cung cấp nhiều kiến thức bổ ích và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Tỉnh Khánh Hòa,
Trƣờng THPT Chuyên Lê Quý Đôn – Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có
thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019
Học viên
Trần Thị Hải Yến
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng
dẫn, chỉ bảo của Thầy hƣớng dẫn và sự giúp đỡ của cán bộ phòng Công nghệ
sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Các số
liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.
Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019
Học viên
Trần Thị Hải Yến
1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 12
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN ........................................................ 12
1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN ............................................................... 14
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin ............................................................. 14
1.2.2. Sự phân bố lectin trong sinh giới .................................................. 16
1.2.3. Vai trò sinh học của lectin ............................................................ 18
1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN ................................................................. 19
1.3.1. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trên thế giới .................. 19
1.3.1.1. Các phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển ......................... 19
1.3.1.2. Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin ................................ 21
1.3.1.3. Điểm đẳng điện và hàm lƣợng acid amin của lectin từ rong
biển. .................................................................................................... 23
1.3.1.4. Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong
biển. .................................................................................................... 24
1.3.1.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính của lectin rong biển
............................................................................................................ 25
1.3.1.6. Hàm lƣợng carbohydrate trong lectin từ rong biển.................. 25
1.3.1.7. Trọng lƣợng phân tử của lectin từ rong biển. .......................... 25
1.3.1.8. Cấu trúc của lectin từ rong biển. ............................................. 26
1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển ............................................ 29
1.3.2. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nƣớc .................... 32
2
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN .............................. 33
1.4.1. Sắc ký trao đổi ion ........................................................................ 33
1.4.2. Sắc ký lọc gel ............................................................................... 33
1.4.3. Sắc ký ái lực ................................................................................. 34
1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN
DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG .............................................................. 35
1.5.1. Nguyên tắc chung ......................................................................... 35
1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân tử khối của protein ........................... 36
1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG
LECTIN .................................................................................................... 36
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 39
2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ................. 39
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU . 40
2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................ 40
2.2.2. Hóa chất ....................................................................................... 40
2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 41
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 42
2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà
và các nhóm máu ngƣời A, B, O) : ......................................................... 42
2.3.2. Phân tích hoạt tính lectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu
(hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O). ............... 43
2.3.3. Xác định hàm lƣợng protein. ........................................................ 44
2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:............................................ 46
2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết lectin từ rong đỏ H.
eucheumatoides ...................................................................................... 47
2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết ............................. 48
3
2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết .............................................. 48
2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết ......................................................... 48
2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin từ dịch chiết.
............................................................................................................... 49
2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-
Sepharose ............................................................................................... 50
2.3.8. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S –
200 . ....................................................................................................... 51
2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lƣợng phân tử lectin bằng
phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 52
2.3.10. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng các đặc tính lý, hóa đến lectin
từ rong đỏ H. eucheumatoides ................................................................ 56
2.3.10.1. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính
ngƣng kết hồng cầu ............................................................................. 57
2.3.10.2. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng
kết hồng cầu ........................................................................................ 57
2.3.10.3. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của cation hóa trị 2, EDTA
đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu ........................................................ 58
2.3.10.4. Phƣơng pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của
lectin ................................................................................................... 58
2.3.11. Điều chế porcine stomach mucin đƣợc xử lý enzyme trypsin ..... 60
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 61
3.1. PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH NGƢNG KẾT HỒNG CẦU THỎ, CỪU,
GÀ VÀ CÁC NHÓM MÁU NGƢỜI A, B, O VỚI DỊCH CHIẾT TỪ
RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 61
3.2. PHÂN TÍCH CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG H.
eucheumatoides ......................................................................................... 61