Luận án Tiến sỹ: Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học Sâm đại hành Eleutherine bulbosa và Xạ can Belamcanda chinensis (họ La dơn Iridaceae)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

ĐỖ THỊ THANH HUYỀN

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH (ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.) URB.) VÀ XẠ CAN (BELAMCANDA CHINENSIS (L.) DC.) (HỌ LA DƠN (IRIDACEAE))

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HOÁ HỌC

HÀ NỘI – 2016

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

ĐỖ THỊ THANH HUYỀN

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH

(ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.) URB.) VÀ XẠ CAN

(BELAMCANDA CHINENSIS (L.) DC.) (HỌ LA DƠN

(IRIDACEAE))

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HOÁ HỌC

Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 62.44.01.17

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS Lê Minh Hà

2. PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hoá học các Hợp chất thiên

nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS. TS Lê Minh Hà

và PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn,

tận tình chỉ bảo, khích lệ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em

trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Em xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hoá học các Hợp chất

Thiên nhiên, GS. TS Phạm Quốc Long, PGS. TS Hoàng Thanh Hương, PGS. TS

Lê Mai Hương đã tạo điều kiện, có những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý

báu trong quá trình hoàn thiện luận án.

Em xin gửi lời cám ơn đến các cán bộ phòng Hoá Dược, Viện Hoá học

các Hợp chất Thiên nhiên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt

quá trình em thực hiện luận án.

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới toàn thể

gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm, cổ vũ, động viên em hoàn thành tốt bản

luận án này.

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả luận án

NCS. Đỗ Thị Thanh Huyền

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn khoa học của PGS. TS Lê Minh Hà và PGS. TS Nguyễn Mạnh

Cường. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được

công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

NCS. Đỗ Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Mở đầu ................................................................................................................... 1

Chương 1. Tổng quan ............................................................................................ 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ LA DƠN (IRIDACEAE) .............................................. 3

1.1.1 Giới thiệu về chi Eleutherine .................................................................... 4

1.1.1.1 Chi Eleutherine trên thế giới và ở Việt Nam .......................................... 4

1.1.1.2 Loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Miller.) Urb.) ........................ 4

1.1.2 Giới thiệu về chi Belamcanda và loài xạ can (Belamcanda chinensis (L.)

DC.) ........................................................................................................................ 9

1.1.2.1 Chi Belamcanda ................................................................................ 9

1.1.2.2 Loài xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) ................................... 9

1.2 KHÁI NIỆM VỀ VIÊM ............................................................................... 21

1.3 MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC THỰC VẬT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG

VIÊM ................................................................................................................. 26

1.3.1 Đặc điểm chung của các hợp chất phenolic ............................................ 26

1.3.2 Các hợp chất flavonoid .......................................................................... 28

1.3.3 Anthraquinone ....................................................................................... 31

1.3.4 Naphthoquinone ..................................................................................... 31

Chương 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu ......................................... 33

2.1 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT ...................................................................... 33

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT ......................................... 33

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC).......................................................................... 33

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế ...................................................................... 34

2.2.3 Sắc ký cột (CC) ...................................................................................... 34

2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT .................... 34

2.3.1 Điểm nóng chảy ..................................................................................... 34

2.3.2 Phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS) ............................... 34

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ......................................................... 34

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC........................ 34

2.4.1 Sàng lọc hoạt tính kháng viêm in vivo của các dịch chiết ....................... 34

2.4.1.1 Xác định khả năng kháng viêm theo đường bôi ............................... 34

2.4.1.2 Xác định khả năng kháng viêm theo đường uống ............................ 35

2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua

DC (dendritic cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bời LPS của các hợp chất

phân lập được từ cây sâm đại hành ........................................................................ 35

2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo và độ an toàn của tectorigenin phân

lập được từ thân rễ cây xạ can ............................................................................... 35

2.4.3.1 Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau của tectorigenin .......... 35

2.4.3.2 Nghiên cứu độ an toàn của tectorigenin .......................................... 36

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 37

Chương 3. Thực nghiệm ...................................................................................... 38

3.1 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT ........... 38

3.1.1 Xử lý nguyên liệu thực vật ..................................................................... 38

3.1.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây xạ can và củ sâm đại hành .......... 38

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG

VIÊM CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH . 39

3.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học ............................................................. 39

3.2.1.1 Quy trình phân lập các hợp chất ...................................................... 39

3.2.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được ....... 41

3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm từ loài sâm đại hành .......................... 47

3.2.2.1 Xác định khả năng kháng viêm của các cặn chiết theo đường bôi .... 48

3.2.2.2 Xác định khả năng kháng viêm của các cặn chiết theo đường uống . 48

iii

3.2.3 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua

DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập được từ

sâm đại hành.......................................................................................................... 49

3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ LOÀI XẠ CAN

VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TECTORIGENIN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ

LOÀI NÀY ........................................................................................................ 50

3.3.1 Nghiên cứu thành phần hoá học ............................................................. 50

3.3.1.1 Quy trình phân lập........................................................................... 50

3.3.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ cây

xạ can .................................................................................................................... 53

3.3.2 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết từ thân rễ xạ can .......... 57

3.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigenin ................ 57

3.3.3.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau in vivo của tectorigenin

.............................................................................................................................. 57

3.3.3.2 Nghiên cứu độ an toàn của TEC ...................................................... 60

Chương 4. Kết quả và thảo luận ......................................................................... 64

4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH ............................. 64

4.1.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành ........ 64

4.1.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm ........................................... 103

4.1.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết ......... 103

4.1.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm

từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS ....................... 105

4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI XẠ CAN ......................................... 108

4.2.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ cây xạ can . 108

4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm ........................................ 133

4.2.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết ..... 133

4.2.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của

tectorigienin phân lập được từ thân rễ xạ can .......................................... 134

Kết luận .............................................................................................................. 146

Kiến nghị ............................................................................................................ 147

Các công trình đã được công bố liên quan đến luận án ................................... 148

Tài liệu tham khảo

Phụ lục phổ các hợp chất phân lập được

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C NMR 1H NMR 1H-1H COSY

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 1H-1H Chemical Shift Correllation Spectroscopy

ALT Alanin amino transferase

AST Aspartat amino transferase

CC Column Chromatography

CD Circular dichroism spectrum

Clorofoc CHCl3

COX Cyclooxygennase

DCs Dendritic Cells

DEPT Distortioless Enhancement by Polarisation Transfer

DMSO Dimethyl sulfoxide

EPP Ethyl-phenylpropiolate

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectra

EtOAc Ethyl acetat

EtOH Etanol

GC Gas Chromatography

Glc Glucose

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HR-ESI-MS High Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry

HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence

Inhibitory concentration 50% IC50

IL Interleukin

iNOS Inducible NO synthase

IR Infrared Spectroscopy

Lethal dose, 50% LD50

LPS Lypopolysaccharide

MeOH Metanol

MIC

Minimum inhibitory concentration

Mp Melting point

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide]

NaCMC Sodium carboxymethyl cellulose

NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drugs

RAW264,7 Murine macrophage cell line

SB203580 4-[4(4-fluorophenyl)-2(4-methylsulfinylphenyl)-1 H -imidazol-5-

yl] pyridin

Thin Layer Chromatography TLC

Tetramethylsilane TMS

Tumour Necrosis Factor α TNFα

Ultraviolet UV

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các nhóm hợp chất phenolic cơ bản ...................................................... 27

Bảng 3.1: Các nhóm thử uống hỗn dịch ở các liều khác nhau ................................ 61

Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-1 và aglycon EB-1a ...................... 66 Bảng 4.2: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-4 có so sánh với TLTK ...... 76 Bảng 4.3: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-5 có so sánh với TLTK ...... 79 Bảng 4.4: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-6 có so sánh với TLTK ...... 83 Bảng 4.5: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-10 có so sánh với TLTK .... 91 Bảng 4.6: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-11 có so sánh với TLTK .... 93 Bảng 4.7: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-12 có so sánh với TLTK .... 96 Bảng 4.8: Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-14 có so sánh với TLTK .. 102

Bảng 4.9: Bảng tổng hợp các hợp chất EB-1→EB-14 phân lập được từ củ sâm đại hành .................................................................................................................... 102

Bảng 4.10: Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường bôi của các cặn chiết từ củ sâm đại hành ..................................................................................... 104

Bảng 4.11: Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống của các cặn chiết từ củ sâm đại hành ..................................................................................... 104

Bảng 4.12: Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất trên tế bào tua sinh ra từ tuỷ xương được kích thích bởi LPS ........................................................................... 107

Bảng 4.13: Bảng tổng hợp các hợp chất BS-1→BS-14 phân lập được từ thân rễ xạ can ....................................................................................................................... 132

Bảng 4.14: Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường bôi các cặn chiết thân rễ xạ can ..................................................................................................... 133

Bảng 4.15: Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống các cặn chiết thân rễ xạ can ..................................................................................................... 133

Bảng 4.16: Ảnh hưởng của TEC lên số cơn đau quặn .......................................... 134

Bảng 4.17: Tỷ lệ giảm đau của các lô uống thuốc so với lô không uống thuốc qua các giai đoạn ........................................................................................................ 136

Bảng 4.18: Tác dụng chống viêm cấp của TEC ................................................... 137

Bảng 4.19: Tỷ lệ % ức chế phù chân chuột của thuốc so với lô chứng trắng ........ 138

Bảng 4.20: Tác dụng chống viêm mạn của TEC trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng viêm amida ................................................................................................. 139

Bảng 4.21: Kết quả theo dõi động vật thí nghiệm ................................................ 139

Bảng 4.22: Ảnh hưởng của TEC đến mức độ tăng cân của chuột (%) .................. 140

viii

Bảng 4.23: Ảnh hưởng của TEC trên các thông số huyết học của chuột thực nghiệm ............................................................................................................................ 141

Bảng 4.24: Ảnh hưởng của TEC đến các thông số AST, ALT, cholesterol toàn phần và protein toàn phần ............................................................................................ 141

Bảng 4.25: Ảnh hưởng của TEC đến thông số creatinin huyết thanh của chuột thực nghiệm ................................................................................................................ 143

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây sâm đại hành (Eleutherine bulbosa ). ................................................ 5

Hình 1.2: Cây xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC). ......................................... 10

Hình 1.3: Các cytokine được sản sinh từ đại thực bào ........................................... 24

Hình 2.1: Thân rễ cây xạ can và củ sâm đại hành khô ............................................ 33

Hình 3.1: Sơ đồ điều chế các phần chiết từ thân rễ xạ can và củ sâm đại hành ....... 38

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl-axetat của củ sâm đại hành .............................................................................................................................. 39

Hình 3.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của củ sâm đại hành ............... 40

Hình 3.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat cây xạ can.............. 52

Hình 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước cây xạ can ...................... 52

Hình 3.6: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigienin trên mô hình giảm đau quặn ................................................................................................................ 58

Hình 3.7: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigienin trên mô hình gây viêm bằng carrageenin .................................................................................... 59

Hình 3.8: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng amian .................................................................................................................... 60

Hình 4.1a: Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất EB-1 ....................... 64 Hình 4.1b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất EB-1 .......................... 65 Hình 4.1c: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất EB-1 .......................... 65

Hình 4.1d: Cấu trúc của hợp chất EB-1a .............................................................. 66

Hình 4.1e: Phổ HMBC của hợp chất EB-1 ............................................................ 67

Hình 4.1f: Các tương tác HMBC chính của hợp chất EB-1 .................................... 68

Hình 4.1g: Phổ CD của hợp chất EB-1 .................................................................. 68

Hình 4.1h: Cấu trúc của hợp chất EB-1 ................................................................ 69 Hình 4.2a: Phổ 1H-NMR của chất EB-2 ................................................................ 69 Hình 4.2b: Phổ 13C-NMR của chất EB-2 ............................................................... 70

Hình 4.2c: Cấu trúc của hợp chất EB-2 (Eleutherinol) .......................................... 70 Hình 4.3a: Phổ 1H-NMR của chất EB-3 ................................................................ 71 Hình 4.3b: Phổ 13C-NMR của chất EB-3 ............................................................... 72

Hình 4.3c: Cấu trúc của hợp chất EB-3 (Eleutherinoside A) ................................. 72

Hình 4.4a: Phổ IR của hợp chất EB-4 .................................................................... 73

Hình 4.4b: Phổ ESI-MS của chất EB-4 .................................................................. 73

Hình 4.4c: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-4.......................................................... 74

Hình 4.4d: Phổ DEPT của hợp chất EB-4 .............................................................. 75

Hình 4.4e: Phổ HSQC (a) và HMBC (b) của hợp chất EB-4 .................................. 75

Hình 4.4f: Cấu trúc của hợp chất EB-4 (hongconin) ............................................. 76

Hình 4.5a: Phổ ESI-MS của hợp chất EB-5 ........................................................... 77 Hình 4.5b: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-5 ......................................................... 78

Hình 4.5c: Phổ DEPT của hợp chất EB-5 .............................................................. 78

Hình 4.5d: Cấu trúc của hợp chất EB-5 (eleutherin) ............................................. 79

Hình 4.6a: Phổ IR của hợp chất EB-6 .................................................................... 80

Hình 4.6b: Phổ ESI-MS của hợp chất EB-6 ........................................................... 80 Hình 4.6c: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-6.......................................................... 81 Hình 4.6d: Phổ a) 13C-NMR và b) phổ DEPT của hợp chất EB-6 .......................... 82

Hình 4.6e: Cấu trúc của hợp chất EB-6 (isoeleutherin) ......................................... 82 Hình 4.7a: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-7.......................................................... 84 Hình 4.7b: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-7 ........................................................ 84

Hình 4.7c: Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-7 ................. 85

Hình 4.7d: Cấu trúc của hợp chất EB-7 (eleuthoside C) ........................................ 85 Hình 4.8a: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-8 ........................................................ 85 Hình 4.8b: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-8 ......................................................... 86

Hình 4.8c: Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-8 ................. 87

Hình 4.9: Cấu trúc của chất EB-8 (eleutherinoside C) và EB-9(eleutherinoside B) .............................................................................................................................. 87

Hình 4.10a: Phổ ESI-MS của hợp chất EB-10 ....................................................... 88 Hình 4.10b: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-10 ..................................................... 88 Hình 4.10c: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-10 ..................................................... 89

Hình 4.10d: Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-10............. 89

Hình 4.10e: Phổ HMQC (a) và HMBC (b) của hợp chất EB-10 ............................ 90

Hình 4.10f: Cấu trúc của hợp chất EB-10 (7-acetyl-3,6-dihydroxy-8- methyltetralone) ................................................................................................... 90 Hình 4.11a: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-11 ...................................................... 92 Hình 4.11b: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-11 .................................................... 92

Hình 4.11c: Cấu trúc của hợp chất EB-11 (eleuthoside A) .................................... 93 Hình 4.12a: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-12 ...................................................... 94

Hình 4.12b: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-12 .................................................... 95

Hình 4.12c: Cấu trúc của hợp chất EB-12 (eleuthoside B) .................................... 96 Hình 4.13a: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-13 ...................................................... 97 Hình 4.13b: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-13 .................................................... 98

Hình 4.13c: Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-13 ............. 98

Hình 4.13d: Cấu trúc của hợp chất EB-13 (eleutherinoside D) ............................. 98

Hình 4.14a: Phổ ESI-MS của hợp chất EB-14 ....................................................... 99 Hình 4.14b: Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-14 ..................................................... 99 Hình 4.14c: Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-14 ................................................... 100

Hình 4.14d: Phổ HMQC (a) và HMBC (b) của hợp chất EB-14 .......................... 100

Hình 4.14e: Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-14 ........... 101

Hình 4.14f: Cấu trúc của hợp chất EB-14 (1,3,6-trihydroxy-8-methyl- anthraquinone) .................................................................................................... 101

Hình 4.15: Tác dụng của hợp chất EB-1-EB-15 ở nồng độ 25,0 µm đến sự sản sinh IL-12p40 từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS ........................................... 105

Hình 4.16: Tác dụng của hợp chất EB-1, EB-4, EB-5 và EB-6 ở nồng độ 6,3; 12,5; 25,0 và 50,0 µm đến sự sản sinh IL-12p40 (A), IL-6 (B) và TNF (α) (C) từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS ......................................................................... 106 Hình 4.17a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-1 ...................... 108

Hình 4.17b: Phổ DEPT của chất BS-1 ................................................................ 109

Hình 4.17c: Phổ HMBC của chất BS-1 ............................................................... 109

Hình 4.17d: Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-1 ........................................... 110

Hình 4.17e: Cấu trúc của hợp chất BS-1 (Irisflorentin) ....................................... 110 Hình 4.18a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-2 ...................... 111 Hình 4.18b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-2 ..................... 111

Hình 4.18c: Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-2 ........................................... 112

Hình 4.18d: Cấu trúc của hợp chất BS-2 (tectorigenin) ....................................... 112 Hình 4.19a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-3 ...................... 113 Hình 4.19b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-3 ..................... 113

Hình 4.19c: Cấu trúc của hợp chất BS-3 (iristectorigenin A) .............................. 113 Hình 4.20a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-4 ...................... 114 Hình 4.20b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-4 ..................... 114

Hình 4.20c: Cấu trúc của hợp chất BS-4 (irigenin) ............................................. 115

xii

Hình 4.21a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-5 ..................... 115 Hình 4.21b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-5 ...................... 116

Hình 4.21c: Phổ HMBC của chất BS-5 ............................................................... 116

Hình 4.21d: Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-5 ........................................... 117

Hình 4.21e: Cấu trúc của hợp chất BS-5 (acetovanillone) ................................... 117 Hình 4.22a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-6 ...................... 118

Hình 4.22b: Cấu trúc của hợp chất BS-6 (rhamnocitrin) ..................................... 118 Hình 4.23a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-7 ....................... 119 Hình 4.23b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-7 ...................... 119

Hình 4.23c: Phổ khối ESI-MS của chất BS-7....................................................... 120

Hình 4.23d: Cấu trúc của hợp chất BS-7 (Irilin D) ............................................... 120 Hình 4.24a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-8 ....................... 121 Hình 4.24b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-8 ...................... 121

Hình 4.24c: Cấu trúc của hợp chất BS-8 (daucosterol) ......................................... 122 Hình 4.25a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-9 ....................... 123 Hình 4.25b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR và DEPT của chất BS-9 ....... 124

Hình 4.25c: Phổ HSQC của chất BS-9 ................................................................. 124

Hình 4.25d: Phổ HMBC của chất BS-9 ............................................................... 125

Hình 4.25e: Cấu trúc của hợp chất BS-9 (tectoridin) ............................................ 125 Hình 4.26a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-10 ..................... 126 Hình 4.26b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-10 .................... 126

Hình 4.26c: Cấu trúc của chất BS-10 (Tectorigenin 4’-O-β-D-glucopyranoside) . 127 Hình 4.27a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-11 ..................... 127 Hình 4.27b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-11 .................... 128

Hình 4.27c: Cấu trúc của chất BS-11 (Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside) ... 128 Hình 4.28a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-12 ..................... 129 Hình 4.28b: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất BS-12 .................... 129

Hình 4.28c: Cấu trúc của hợp chất BS-12 (issoquercetin) .................................... 130 Hình 4.29a: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất BS-13 ..................... 130

Hình 4.29b: Cấu trúc của hợp chất BS-13 (24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol) ........ 131

Hình 4.30a: Cấu trúc của hợp chất BS-14 (axit myristic) ..................................... 131

Hình 4.30b: Phổ GC-MS của hợp chất BS-14 ..................................................... 131

xiii

Hình 4.31: Biểu đồ số cơn đau quặn qua các giai đoạn của các lô chuột nghiên cứu ............................................................................................................................ 135

Hình 4.32: Biểu đồ tỷ lệ giảm đau của các lô chuột dùng thuốc so với lô chuột không dùng thuốc ................................................................................................ 136

Hình 4.33: Biểu đồ độ tăng thể tích chân chuột tại các thời điểm khảo sát ........... 138

Hình 4.34: Hình ảnh cấu trúc vi thể gan ............................................................... 142

Hình 4.35: Hình ảnh cấu trúc vi thể thận.............................................................. 143

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được

thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn

14.000 loài thực vật bậc cao. Trong đó, có khoảng gần 4.000 loài được sử dụng làm

thuốc trong y học cổ truyền [10]. Nước ta có nền y học cổ truyền hết sức đa dạng và

đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng

phát triển qua các thời kỳ đó. Nhiều bài thuốc, vị thuốc có tác dụng tốt trên lâm

sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý và

độc tính. Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật

làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở

nước ta.

Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên và rất nhiều

các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra, được nghiên cứu để phục vụ trong y học.

Các hợp chất thiên nhiên giữ vai trò chính trong việc phát hiện và phát triển các

dược phẩm mới. Giá trị của nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không

chỉ ở công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà còn vì chúng có thể dùng làm

các nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đường cho sự phát triển và phát hiện nhiều

dược phẩm mới. Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con

đường ngắn và hiệu quả nhất để tìm kiếm các hoạt chất từ nguồn tài nguyên tái tạo

này.

Trong chương trình sàng lọc các cây thuốc có hoạt tính kháng viêm từ nguồn

dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện thấy các cây thuốc họ La dơn có hoạt

tính kháng viêm khá tốt. Ngoài ra, chúng còn có một số hoạt tính khác như: kháng

nấm, kháng khuẩn, độc tế bào, chống oxy hoá... Trong đó, đáng chú ý nhất là hai

loài Belamcanda chinensis (L.) DC. (xạ can) và Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.

(sâm đại hành). Đây là hai cây thuốc mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân

gian, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh

học cả ở Việt Nam và trên thế giới. Trong y học dân gian, cây xạ can thường được

sử dụng để chữa viêm họng, viêm amidan, đau cổ, ho và khó thở do nhiều đờm,

chữa sốt, tắc tia sữa… Còn cây sâm đại hành thường được dùng để trị thiếu máu,

vàng da, hoa mắt, nhức đầu, mệt mỏi, ho ra máu, cầm máu, ho, ho lao [1]…

Vì vậy luận án đã lựa chọn cây xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) và

cây sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) làm đối tượng nghiên cứu với

mục tiêu làm sáng tỏ thành phần hoá học và hoạt tính sinh học (đặc biệt là hoạt tính

kháng viêm), nhằm nâng cao giá trị sử dụng và khai thác có hiệu quả nguồn hoạt

chất quý giá từ hai cây thuốc dân gian này.

Luận án: “ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài

sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis

(L.) DC.) (họ La dơn (Iridaceae))” có các nhiệm vụ sau:

1. Điều chế và đánh giá hoạt tính kháng viêm các dịch chiết của thân rễ cây

xạ can và củ sâm đại hành.

2. Chiết tách và phân lập các hợp chất từ 2 loài thực vật này.

3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập.

4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập được.

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HỌ LA DƠN (IRIDACEAE)

Họ Diên vĩ hay họ Lay ơn hoặc họ La dơn là một họ thực vật nằm trong bộ

Măng tây (Asparagales). Tên gọi Diên vĩ là lấy theo chi Diên vĩ (Iris), còn tên gọi

Lay ơn (lay dơn) là lấy theo chi Lay ơn (Gladiolus), bao gồm một số loài cây trồng

được nhiều người biết đến như cây diên vĩ (Iris japonica Thunb.), sâm đại hành

(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.), rẻ quạt (Belamcanda chinensis (L.) DC.) [6]…

Họ La dơn là họ nhỏ, gồm những cây thân thảo, sống dai, chủ yếu mọc ở các

vùng ôn đới, có thân rễ hay gò địa sinh. Lá từ đất đâm lên, hình kiếm hay hình dải,

thường xếp hai dãy và cách quãng nhau, bẹ lá trước phủ lên bẹ lá sau. Phiến lá gập

đôi theo đường gân giữa. Cụm hoa ở ngọn, hoa đẹp, thường kèm theo hai lá bắc có

hình cánh. Cụm hoa thường xim dích dắc ở ngọn, hoa thường đều, lưỡng tính. Bao

hoa gồm 6 bộ phận phân hình cánh xếp thành hai vòng, hàn liền với nhau ở phía

gốc, nhị ba đối diện với các thùy của vòng bao hoa ngoài. Bầu dưới ba ô với giá

noãn trụ giữa. Noãn nhiều, xếp hai dãy ở góc trong của các ô. Quả nang có ba góc,

gồm ba ô, hạt nhiều, nội nhũ sừng.

Trên thế giới, họ La dơn (Iridaceae) có khoảng 80-92 chi và bao gồm hơn 2000

loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở Đông Phi và Châu Mỹ nhiệt đới.

Ở Việt Nam có 8 chi là: Belamcanda, Crocosmia, Eleutherine, Freesia,

Gladiolus, Iris, Trimezia, Tritonia và mỗi chi chỉ có một loài như sau:

- Belamcanda chinensis (L.) DC.: rẻ quạt (hay lưỡi đòng, xạ can)

- Gladiolus hybridus Hort.: lay ơn, cây nhập nội, trồng làm cảnh. Do sự lai

giống mà ngày nay ta đã có nhiều thứ hoa có màu khác nhau: đỏ, hồng, tím,

trắng, vàng rất đẹp.

- Iris japonica Thunb.: Diên vĩ (hay huệ Nhật), hoa màu xanh tím, cây gặp ở

Sapa.

- Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.: sâm đại hành

- Tritonia crocosmaeflora (Lem.) Nich: nghệ hương

- Crocosmia crocosmiiflora (Nich.) N. E. Br.: hùng hoàng lan, nghệ hương

- Freesia refracta (Jacq.) Klatt.: hương tuyết lan

- Trimezia martinicensis Herb. Trong đó, chi Belamcanda (họ Iridaceae) chỉ gồm duy nhất một loài là

Belamcanda chinensis (L.) DC.. Sâm đại hành nằm trong chi bảo tồn [9], tên khoa

học là Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. là loài duy nhất thuộc chi Sâm đại hành có ở

Việt Nam..

Các cây thuộc họ La dơn là các cây có hoạt tính sinh học phong phú như: kháng

viêm, độc tế bào… và cũng được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc dân gian ở

Trung Quốc, Nhật Bản… để điều trị viêm họng, ho, ung thư [1, 3]…

1.1.1 Giới thiệu về chi Eleutherine và loài sâm đại hành

Chi Eleutherine gồm những cây thảo, có hành có áo. Lá mọc từ rễ, hình dải,

1.1.1.1 Chi Eleutherine trên thế giới và ở Việt Nam

gấp nếp. Thân tròn, ở ngọn có lá bắc dạng lá. Cụm hoa gồm nhiều nhóm hoa có

cuống, mỗi hoa ở nách một lá bắc dạng lá hoặc một lá tiêu giảm hình dải, xếp nếp,

gồm một lá bắc chung bao quanh và nhiều lá bắc dạng lá, hoa 6-12 trong mỗi nhóm.

Lá đài và cánh hoa không tạo ống ở trên bầu, hình trái xoan ngược - dạng nêm, trải

ra, gần bằng nhau. Nhị 3, ở gốc các cánh hoa, chỉ nhị rời, ngắn, bao phấn hình dải.

Bầu thuôn, có 3 ô, noãn nhiều, xếp chồng lên nhau, vòi nhụy ngắn, đầu nhụy 3, hình

mũi dùi. Quả nang thuôn, mở vách, thành 3 van.

Trên thế giới, chi Eleutherine gồm một số loài như: Eleutherine bulbosa

(Mill.) Urb., Eleutherine americana Merr., Eleutherine latifolia Standl. & Will.,

Eleutherine citriodora Rav. [1] và Eleutherine palmifolia (Linn.) Merr..

Ở Việt Nam chỉ có một loài duy nhất là Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.,

tên đồng nghĩa là Eleutherine subaphlla (Gagnep.) (hình 1.1). Và được gọi là sâm

đại hành, hay tỏi lào, sâm cau, hành lào (Hòa Bình), tỏi mọi, kiệu đỏ, cỏ nhọt (Lào).

Người ta dùng củ tươi hay phơi hoặc sấy khô của cây sâm đại hành làm thuốc với

tên thuốc là Bulbus Eleutherinis subaphyllae [10].

1.1.1.2 Loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa)

Sâm đại hành là một loại cỏ sống lâu năm, cao từ 30-60 cm, dò (củ) hình

trứng dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, ngoài phủ

vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu. Lá hình mác, gân lá song

song, chạy dọc, trông giống như lá cau non, củ lại có tác dụng bổ cho nên gọi là

Sâm cau (lá như lá cau, bổ như sâm); lá có thể dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm. Từ củ

mọc lên một cán mang hoa dài 30-40 cm, trên cán có một lá đài 15-25 cm, hoa mọc

thành chùm 3 lá đài, 3 cánh tràng màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng. Bầu

hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi

dùi.

Hình 1.1 Cây Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa)

Ở Việt Nam, sâm đại hành mọc hoang và được trồng lấy củ làm thuốc tại

nhiều nơi như Hà Tây cũ, Hòa Bình, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Đà

Nẵng, Hà Nội. Trồng sâm đại hành rất đơn giản: chỉ việc dùng củ vùi xuống đất như

trồng hành, tỏi. Khi thu hoạch, đào lấy củ về, rửa sạch, bóc lớp vỏ bên ngoài, thái

mỏng, dùng tươi hoặc phơi hay sấy khô, rồi để nguyên hay tán bột mà dùng [1].

Bên cạnh đó sâm đại hành cũng được sử dụng trong dân gian để trị thiếu máu, vàng

da, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi, băng huyết, ho ra máu. Nấu thành

cao rồi luyện viên uống sát trùng, chữa chàm, chốc và bệnh ngoài da. Sâm đại hành

đã phơi khô, sao qua, hãm uống làm thuốc an thần gây ngủ, bột dùng để cầm máu,

dùng uống trị ho, ho lao, thường phối hợp với Rẻ quạt làm thuốc trị ho, viêm họng.

Tác dụng dược lý

Tác dụng kháng sinh: dịch chiết sâm đại hành tẩm giấy có đường kính 10

mm đặt trên thạch có cấy vi trùng có tác dụng hạn chế sinh sản của vi trùng

Diplococcus pneumoniae, Strepcoccus hemolyticus, S. taphyllococcus. Tác dụng

yếu hơn đối với Shigella flexneri, Shiga, Bacillus mycoides, B. anthracis. Không có

tác dụng đối với Escherichia coli, Bacillus pyocyaneus, B. diphteriae.

Tác dụng chống viêm: làm giảm phản ứng phù thực nghiệm trên chuột (thí

nghiệm so sánh với hydrococtison thấy gần như tương tự).

Trên lâm sàng thấy có tác dụng tốt đối với chốc đầu trẻ em, nhọt đầu đinh,

viêm da mủ, viêm họng cấp và mãn tính, chàm nhiễm trùng, tổ đỉa, vẩy nến…

Độc tính: chuột nhắt uống với liều 169 g/kg (1 lần), thỏ uống 26 g/kg/ngày

(uống liền 3 ngày) không biểu hiện nhiễm độc, động vật sống bình thường. Cho thỏ

uống với liều 10 g/kg/ngày, liền trong 30 ngày, con vật khỏe mạnh bình thường,

giải phẫu không thấy tổn thương gan hay thận [1].

Sâm đại hành còn được một số nước trên thế giới sử dụng làm thuốc diệt

giun sán, thuốc chữa các bệnh về kinh nguyệt, các bệnh rối loạn hay nhiễm khuẩn

đường ruột và làm thuốc chống sinh sản quá nhanh và đẻ non [136]. Ở một số nơi

tại Brazin, lá và củ của Sâm đại hành được dùng làm thuốc xổ và điều trị ung thư.

a. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Eleutherine bulbosa

Năm 1951, lần đầu tiên cây Sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và

cộng sự, hai hợp chất là eleutherin và isoeleutherin đã được phân lập [131].

Năm 1975, C Bianchi và cộng sự đã phân lập từ củ của cây Sâm đại hành hai

hợp chất là eleutherin và eleutherol [23].

Năm 1982, từ củ Sâm đại hành người ta đã phân lập được một anthraquinon

mới là anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid

methyl ester [149].

Năm 1985, nghiên cứu của William & Harborne đã phân lập được xanthone

mangiferin và isomangiferin từ lá của Sâm đại hành [150].

Năm 2003, Helmut Kloos và cộng sự đã công bố kết quả phân lập được hợp

chất eleutherinone cũng từ thân rễ của cây Sâm đại hành [140].

Theo một công bố mới và đầy đủ nhất năm 2010 về thành phần hóa học của

cây Sâm đại hành, 4 hợp chất polyketit mới được phân lập gồm (R)-4-hydroxy

eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside và isoeleuthoside C

(dihydroisoeleutherin-5-O-D-gentiobioside) cùng với các chất đã được phân lập

trước đó gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherinol, eleutherol, eleuthoside B

(eleutherol-4-O-D-gentiobioside), eleuthoside C (dihydroeleutherin-5-O-D-

gentiobioside), elecanacin và hongconin (4-oxodihydroisoeleutherin) [44].

Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài

sâm đại hành, ngoài công bố phân lập được 4 hợp chất là eleutherin, isoeleutherin,

eleutherol và một chất tại thời điểm phân lập được vẫn chưa xác định được cấu trúc

của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn [7].

Như vậy trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây Sâm đại hành từ rất sớm.

Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại hành là các hợp

chất quinone và dẫn xuất.

b. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học loài Eleutherine bulbosa

Năm 2003, Tânia Maria Almeida Alves và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính

của eleutherin, eleutherinone, isoeleutherin và isoeleutherol. Eleutherin thể hiện

hoạt tính ức chế khối u thông qua cơ chế liên quan đến ức chế topoisomerase II.

Isoeleutherin và isoeleutherol thể hiện hoạt tính ức chế sự phân chia của virus HIV

trong tế bào lympho H9. Eleutherinone, eleutherin, isoeleutherin thể hiện hoạt tính

kháng lại chủng nấm hại cây C. sphaerospermum [140]. Ngoài ra, Betriz Goncalves

và cộng sự (2006) cũng đã chứng minh eleutherin thể hiện hoạt tính kháng lại các

chủng vi khuẩn Pycoccus aureus và Streptococcus haemolyticus A [17].

Nghiên cứu của Irawan Wijaya Kusuma và cộng sự (2010) về hoạt tính kháng

lại chủng nấm da T. mentagrophytes của eleutherin cho thấy eleutherin tuy thể hiện

hoạt tính kháng nấm thấp hơn so với chất chống nấm da miconazole đã được

thương mại hóa nhưng lại có ưu điểm là ít tác dụng phụ hơn. Eleutherin cũng thể

hiện hoạt tính ức chế sự hình thành sắc tố đen melanin ở 5 ppm với độc tính thấp

hơn so với arbutin, một chất làm trắng da thương mại. Như vậy, eleutherin được coi

như một chất bảo vệ da: chống nấm da và chống lại sự hình thành sắc tố đen cho da

[65].

Sujogya Kumar Panda và cộng sự (2010) đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm

candidal của các dịch chiết ethyl acetate, chloroform, buthanol, ethanol và nước của

sâm đại hành. Trong số các dịch chiết này, dịch chiết buthanol có hoạt tính kháng

nấm candidal cao hơn hẳn. Nồng độ ức chế tối thiểu của các dịch chiết trong

khoảng 0,046-1,5 mg/ml [134].

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Ngô Thị Minh Hiền và cộng sự cũng đã chứng

minh eleutherol ở nồng độ 30 ppm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi

khuẩn gây bệnh cho tôm Vibro parahaemoliticus [11].

1.1.2 Giới thiệu về chi Belamcanda và loài xạ can (Belamcanda chinensis)

1.1.2.1 Chi Belamcanda

Cây thảo sống lâu năm, thân to, mọc đứng, lá hình kiếm. Hoa mọc đứng, 2-3

cái thành nhóm trên cuống dài. Bao hoa trải ra, có 6 phiến, 3 phiến ngoài rộng hơn

và xoắn lại sau khi hoa nở. Nhị 3, đầu nhuỵ dạng cánh. Quả nang dạng quả lê. Chi

Belamcanda trên thế giới và ở Việt Nam chỉ gồm một loài duy nhất là Belamcanda

chinensis (L.) DC. (xạ can). Năm 2005, dựa trên nghiên cứu về chuỗi phân tử AND,

loài Belamcanda chinensis (L.) DC., loài duy nhất của chi Belamcanda được

chuyển sang cho chi Iris, và có tên là Iris domestica. Trong luận án này, tác giả vẫn

giữ tên thông dụng là Belamcanda chinensis (L.)DC. (chi Belamcanda) [51].

1.1.2.2 Loài xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.)

Cây Xạ can hay còn được gọi là cây Lưỡi đòng, Rẻ quạt có tên khoa học

Belamcanda chinensis (L.) DC.) thuộc họ Lay dơn (Iridaceae). Cây thảo, thân ngắn

bao bọc bởi những bẹ lá. Lá hình dải, dài 30 cm, rộng 2cm, gốc ốp lên nhau, đầu

nhọn, gân song song, hai mặt nhẵn, gần như cùng màu. Toàn bộ các lá xếp thành

một mặt phẳng và xoè ra như cái quạt. Cụm hoa phân nhánh, dài 30-40 cm. Quả

nang hình trứng, hạt nhiều, màu đen bóng. Cây thường mọc hoang, được trồng làm

cảnh, làm thuốc khắp nơi ở nước ta; cây ưa sáng và có khả năng chịu hạn tốt, sinh

trưởng và phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm (ở miền Nam) và mùa xuân hè (ở các

tỉnh phía Bắc) (hình 1.2). Cây Xạ can có sức sống dai, tái sinh dinh dưỡng khỏe từ

các phần của thân rễ và từ hạt. Cây còn mọc ở Trung Quốc, Nhật, Bản, Hàn Quốc,

Philippin [1]…

Hình 1.2 Cây Xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.)

Ở Phương Đông, xạ can đã được dùng làm thuốc từ 2000 năm về trước,

thường xếp vào loại thuốc “thanh nhiệt giải độc” của Đông Y. Ở Việt Nam, một số

cây thuộc họ La dơn cũng đã được sử dụng trong những bài thuốc cổ truyền, tuy

nhiên phổ biến nhất vẫn là cây xạ can. Cây có tác dụng thanh hỏa, giải độc, tán

huyết, tiêu đờm, chữa yết hầu sưng đau, đờm nghẽn ở cổ họng. Chủ yếu dùng làm

thuốc chữa viêm họng, viêm amidan, đau cổ, ho và khó thở do nhiều đờm, ngoài ra

còn là một vị thuốc chữa sốt, đại tiểu tiện không thông, sưng vú, tắc tia sữa, đau

bụng khi thấy kinh, thuốc lọc máu, có nơi còn dùng chữa rắn cắn [1]. Thành phần

hóa học chính của cây Belamcanda chinensis gồm các hợp chất flavonoid như:

iridin, tectoridin và các hợp chất isoflavonoid như: dimetyltectorigenin,

irisflorentin, muningin, iristectorigenin.

Một số bài thuốc dân gian sử dụng xạ can:

- Bài thuốc chữa tắc cổ họng: xạ can 4 g, hoàng cầm 2 g, sinh cam thảo 2 g, cát

cánh 2 g. Các vị tán nhỏ, dùng thuốc đun sôi để nguội mà chiêu thuốc. Bài thuốc

này có tên gọi là đoạt mệnh tán.

- Chữa viêm họng: Xạ can 4 g, kinh giới 16 g, kim ngân, huyền sâm, sinh địa mỗi vị

12 g; bạc hà, cỏ nhọ nồi, tang bạch bì mỗi vị 8 g. Sắc uống ngày một thang.

Hoặc: Xạ can 6 g, sinh địa, huyền sâm mỗi vị 16 g; mạch môn, tang bạch bì, cam

thảo nam, kê huyết đằng, thạch hộc, mỗi vị 12 g; tằm vôi 8 g. Sắc uống ngày một

thang.

- Chữa viêm họng, ho đờm: Xạ can 6 g, sâm đại hành 15 g, mạch môn 15 g, cát

cánh 6 g. Sắc uống ngày một thang.

- Bài thuốc chữa các triệu chứng (báng bụng to, nước óc ách, da sạm đen): xạ can tươi giã nhỏ, vắt lấy nước uống, hễ thấy lợi tiểu tiện thì thôi.

a. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài Belamcanda chinensis

Thành phần hoá học của cây xạ can đã được nghiên cứu khá sớm, chủ yếu là

các lớp chất flavonoid và isoflavonoid như: tectoridin, tectorigenin, iridin,

irisflorentin… Tectoridin và tectorigenin là hai isoflavonoid chiếm hàm lượng lớn

trong thân rễ xạ can, tectoridin dễ bị thuỷ phân thành tectorigenin.

Năm 1991, ba iridal mới được phân lập từ thân rễ và rễ cây Belamcanda

chinensis bởi Fumiko Abe và cộng sự. Ba iridal được xác định là 28-acetoxy-14,15-

dihydro-26-hydroxy-19-methylidenespiroirida-15,17-dienal (belamcandal), 28-

deacetylbelamcandal và 16-O-acetyl-iso-iridogermanal [47].

Ha-Sook Chung và cộng sự (1991) đã phân lập được hai flavonoid là:

kanzakiflavone-2 và 2R:3R-dihydrokaempferol-7-methylther [52].

Won Sick Woo và Eun Hee Woo đã phân lập được một isoflavone mới,

noririsflorentin (5-hydroxy-6,7-methylenedioxy-3’,4’,5’-trimethoxyisoflavone) vào

năm 1993 [151].

Năm 1995, Katsura Seki và cộng sự đã phân lập từ hạt cây xạ can được bốn

enedione mới belamcandones A-D [78]. Trong đó, belamcandones A chiếm 38%,

belamcandones B chiếm 42%, belamcandones C chiếm 17% và belamcandones D

chỉ có 3%.

Hideyuki Ito và cộng sự (1999) đã phân lập được sáu hợp chất mới từ cây

Belamcanda chinensis là 3-O-tetradecanoyl-16-O-acetylisoiridogermanal, 3-O-

decanoyl-16-O-acetylisoiridogermanal, belachinal, anhydrobelachinal,

epianhydrobelachinal và isoanhydrobelachinal [58].

Hideyuki Ito và cộng sự đã phân lập từ thân rễ cây Belamcanda chinensis

bốn hợp chất isoflavonoid mới vào năm 2001, đó là 6”-O-p-hydroxybenzoyliridin,

6”-O-vanil-loyliridin, 5, 6, 7, 3’-tetrahydroxy-4’-methoxyisoflavone và 2, 3-

dihydroirigenin [59].

Một isoflavonoid mới là 5, 6, 7, 3′-terahydroxy-8, 4′, 5′-trimethoxyisoflavone

cùng với mười hợp chất isoflavonoid đã biết được phân lập từ thân rễ cây xạ can

bởi Min-Jian Qin và cộng sự (2005) [105].

Năm 2005, Orawan Monthakantirat cùng các cộng sự đã phân lập được 3

hợp chất mới: belalloside A, belalloside B, và belamphenone, cùng với 13 hợp chất

được biết: resveratrol, iriflophenone, irisflorentin, tectorigenin, irilin D, iristectorin

A và iristectorin B, tectoridin, hispiduloside, androsin, irigenin, iridin, và jaceoside

[107].

Từ thân rễ cây xạ can, hai isoflavonoid mới 6-methoxy-5,7,8,4’-

tetrahydryoxyisoflavone và 4’-methoxy-5,6-dihydroxyisoflavone-7-O-β-D-

glycopyranoside đã được phân lập bởi Zhi Jun Song và cộng sự (năm 2007) [158].

Masataka Moriyasu và cộng sự (2007) đã phân lập được bốn hợp chất

isoflavone mới từ thân rễ cây Belamcanda chinensis là: iristectrigenin A-7-

glucoside, 8-hydroxytectrigenin, 8-hydroxyiristectrigenin A và 8-hydroxyirigenin

[102].

Jin L. và cộng sự (2007) đã phân lập được năm isoflavone: 5,7,4’-

trihydroxy-6, 3’, 5’-trimethoxyisoflavone; isoirogenin; psi-tectorigenin; irisolone; 5,

7-dihydroxy-6, 3’, 4’, 5’ tetramethoxyisoflavone; hai isoflavone glycoside: 3’- hydroxytectoridin, tectorigenin-4’-O-β-glucoside; một flavone: kanzakiflavone-2 và một flavonol: 3, 5, 3’-trihydroxy-7, 4’, 5’-trimethoxyflavone từ rễ cây xạ can. Trong đó có một chất mới là 5,7,4’-trihydroxy-6, 3’, 5’-trimethoxyisoflavone và tất cả các hợp chất còn lại lần đầu được phân lập từ cây này [71].

kanzakiflavone-2

H3CO

OCH3

3,5,3'-trihydroxy-7,4',5'-trimethoxyflavone

Năm 2008, từ thân rễ cây Belamcanda chinensis, Li Jin và các cộng sự đã

phân lập được một flavone mới là 5,4’-dihydroxy-6,7-methylenedioxy-3’-

methoxyflavone và một isoflavone mới là 3’,5’-dimethoxy irisolone-4’-O-β-D-

glucoside [72].

Năm 2011, Yan Chen và cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết nước từ lá cây

Belamcanda chinensis và phân lập được sáu hợp chất trong đó có hai hợp chất là

swertisin và 2”-O-rhamnosyl swertisin lần đầu tiên được phân lập từ họ iridaceae

[155].

Năm 2012, lần đầu tiên các hợp chất quercetin, kampferol, axit shikimic, axit

gallic, axit ursolic, betulin, axit betulonic, betulone, 4’,5,6-trihydroxy-7-

methoxyisoflavone và irilins A được phân lập từ cây xạ can bởi Mingchuan Liu và

cộng sự [106].

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về loài xạ can chưa nhiều. Năm 2013, Hoàng

Lê Tuấn Anh và cộng sự đã phân lập được ba hợp chất từ rễ cây Belamcanda

chinensis là: irisflorentine, irilin D và (trans)-resveratrol [2].

Như vậy trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học cây

Belamcanda chinensis. Các nghiên cứu về loài này chủ yếu tập trung ở Hàn Quốc,

Nhật Bản và Trung Quốc và cho thấy trong thân cây xạ can có các lớp chất iridal-

tritecpenoid, flavonoid và trong thân rễ có isoflavonoid, trong hạt có các phenol,

benzoquinon và benzofural. Đặc biệt tectorigenin và tectoridin là hai isoflavonoid

chiếm hàm lượng lớn trong thân rễ cây xạ can.

b. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài Belamcanda chinensis

Ki-Bong-Oh và cộng sự (2001) lần đầu tiên đã phát hiện ra hoạt tính kháng nấm của cây Belamcanda chinensis bằng phương pháp thử nghiệm sinh học đơn bào và phát hiện hợp chất có hoạt tính tốt là tectorigenin. Hoạt tính kháng vi sinh vật đã được nghiên cứu với 17 chủng nấm và 6 chủng vi khuẩn. Trong đó, tectorigenin thể hiện hoạt tính kháng nấm ngoài da trichophyton, với nồng độ ức chế tối thiểu MIC trong khoảng 3,12-6,25 mg/ml [80].

Năm 2001, Wang và cộng sự đã phân lập được chất isorhapontigenin là dẫn xuất của stilbene từ thân rễ của B.chinensis có hoạt tính chống oxy hóa mạnh [147].

Để đánh giá các nguyên tắc hoạt động của sự ức chế enzyme khử aldose từ

thân rễ cây xạ can, Sang Hoon Jung và cộng sự (2002) đã phân lập được mười hai

hợp chất và kiểm tra tác động của chúng trên enzyme khử aldose thủy tinh thể của

chuột. Các isoflavone như tectorigenin, irigenin và các glucoside có khả năng ức

chế mạnh enzyme khử aldose, một enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc gây

ra biến chứng bệnh tiểu đường. Tectoridin và tectorigenin thể hiện tiềm năng ức chế enzyme khử aldose cao nhất với giá trị IC50 tương ứng là 1,08×10-6 M và 1,12×10-6

M với chất nền là DL-glyceraldehyde. Cả hai hợp chất trên, khi dùng đường uống

với liều 100 mg/kg trong 10 ngày liên tục với chuột bị tiểu đường gây ra bởi

streptozotocin, ức chế đáng kể sự tích tụ sorbitol trên các mô như thủy tinh thể, dây

thần kinh hông và các tế bào hồng cầu. Tectorigenin thể hiện hoạt tính ức chế mạnh

hơn tectoridin. Từ những kết quả trên, tectorigenin được gợi ý là một hợp chất hứa

hẹn để ngăn chặn và điều trị các biến chứng của bệnh tiểu đường [130].

Sang Hoon Jung và cộng sự (2004) đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa

của các isoflavone phân lập từ thân rễ cây Belamcanda chinensis đến tổn thương

gan của chuột bởi CCl4 in vitro và in vivo. Tectorigenin và tectorin thể hiện sự giảm

đáng kể hoạt động của enzyme vận chuyển huyết thanh ở chuột bị tổn thương gan

do nhiễm độc CCl4. Cả hai hợp chất cũng cho thấy sự gia tăng mạnh mẽ các enzyme

chống oxy hóa như cytosolic superoxide dismutase, catalase và glutathione

peroxidase trên chuột nhiễm độc CCl4. Do đó, tectorigenin và tectoridin phân lập

được từ cây xạ can không chỉ có hoạt tính chống oxy hóa mà còn có hoạt tính bảo

vệ gan trên chuột nhiễm độc CCl4 [129].

D. Seidlová-Wuttke và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và chỉ ra rằng cây

Belamcamda chinensis và tectorigenin có hoạt tính điều biến thụ thể estrogen chọn

lọc. Tectorigenin và dịch chiết từ cây xạ can có chứa tectorigenin ảnh hưởng mạnh

đến hypothalamotropic và osteotropic nhưng không có tác dụng trên tử cung hay

tuyến sữa. Do đó, tectorigenin có thể điều biến thụ thể estrogen chọn lọc có ích

trong tương lai [29].

Năm 2005, Orawan Monthakantirat cùng các cộng sự đã nghiên cứu hoạt

tính của các hợp chất phân lập được từ cây xạ can. Kết quả cho thấy các hợp chất

thu được có hoạt tính kháng các dòng ung thư vú MCF-7 và T-47D ở người. Trong

đó các chất resveratrol, iriflophenone, tectorigenin, telamphenone, tectoridin được

chỉ ra rằng không chỉ kháng lại dòng tế bào ung thư vú MCF-7 mà cả dòng tế bào

T-47D. Những kết quả này đã mở ra khả năng có thể ứng dụng B.chinensis làm

thuốc chữa ung thư mới [107].

Paul Thelen và cộng sự (2005) đã chứng minh tiềm năng của các thành phần

được chiết xuất từ cây Belamcanda chinensis như thuốc chữa ung thư, trong đó quy

định các biểu hiện bất thường của các gen có liên quan tới sự phát triển, xâm lấn,

bất diệt và sự chết tế bào. Các thử nghiệm trên động vật đã chứng minh rằng

B.chinensis ức chế rõ rệt sự phát triển của các khối u in vivo. Do đó, các hợp chất

này có ích để ngăn chặn hoặc điều trị ung thư tuyến tiền liệt [115].

Năm 2006, các nhà khoa học người Ba Lan đã nghiên cứu hoạt tính chống

đột biến và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cây Belamcanda chinensis. Ba

thử nghiệm chất chống oxy hóa khác nhau và thử nghiệm chống đột biến

Salmonella đã được sử dụng. Dịch chiết thể hiện tác dụng tiêu diệt gốc tự do mạnh

ở thử nghiệm bằng DPPH với EC50 là 63,4 µg/mL. Đồng thời dịch chiết có khả

năng làm giảm các ion kim loại chuyển tiếp với thuốc thử phosphomolybdenum

cũng như ngăn chặn có hiệu quả gốc hydroxyl gây ra bởi axit peroxy linoleic. Ở thử

nghiệm chống đột biến trên hai chủng Salmonella typhimurium (TA98 và TA100),

tỉ lệ ức chế của dịch chiết với TA98 là 62,8% đối với gây đột biến trực tiếp và

94,4% đối với gây đột biến bằng enzyme hoạt tính, trong khi với TA100 thì tỉ lệ

tương ứng là 82,7% và 73,5% [35].

Kwang Seok Ahn và cộng sự (năm 2006) đã nghiên cứu tác dụng kháng

viêm của sáu flavonoid phân lập được từ thân rễ cây xạ can trên tế bào RAW

264,7. Kết quả cho thấy sự ức chế nitơ oxit (NO) và sản sinh prostaglandin(PG) E2

gây ra bởi lipopolysaccharide (LPS) phụ thuộc vào nồng độ irigenin. Các nghiên

cứu chứng tỏ irigenin phân lập từ thân rễ cây xạ can có thể được đề nghị là một hợp

chất kháng viêm tiềm năng [88].

Dorota Wozniak và cộng sự (2010) đã nghiên cứu hoạt tính chống đột biến

và chống oxy hóa của các hợp chất isoflavonoid từ cây Belamcanda chinensis. Các

phân đoạn chứa isoflavonoid từ dịch chiết methanol của thân rễ cây xạ can ức chế

sự đột biến đối với chủng vi khuẩn Salmonella typhimurium TA98 và TA100 trong

thử nghiệm Ames. Các hoạt tính được báo cáo này có thể được coi là có giá trị khi

sử dụng cây xạ can như là một phytoestrogen và tác nhân ngăn ngừa ung thư [36].

Wanchai De-Eknamkul và cộng sự (2011) đã phát hiện từ cây Belamcanda

chinensis, được sử dụng truyền thống trong điều trị rối loạn kinh nguyệt, có chứa

lượng lớn các hợp chất như estrogen tiềm năng. Nghiên cứu bằng kỹ thuật tính toán

các mối quan hệ cấu trúc định lượng –hoạt tính (QSAR), có thể kết luận rằng sự

tương tác đồng thời và khả năng cạnh tranh của các hợp chất với thụ thể estrogen α

và β (ERα và ERβ) có thể xác định các hiệu lực estrogen của các chất chiết suất từ

thực vật [146].

Hee-Jin Jun và cộng sự (2012) đã phát hiện ra hợp chất iristectorigenin B

phân lập từ cây B.chinensis có thể được sử dụng trong phát triển thuốc để điều trị

tăng cholesterol máu và xơ vữa động mạch [57].

Năm 2012, Chongming Wu và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng ức chế

enzyme α-glucosidase của dịch chiết nước lá cây xạ can (BCL) và dịch thô

isoflavones (BIF). 13 hợp chất isoflavone phân lập được từ lá cây Belamcanda

chinensis được sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase in vitro và in vivo.

Kết quả là dịch chiết nước lá cây xạ can BCL (500 và 1000 mg/kg) và dịch thô BIF

(250 và 500 mg/kg) ức chế rất tốt sự tăng đường huyết sau khi chuột được ăn tinh

bột 5g/kg. Sáu isoflavone: swertisin, 2”-O-rhamnosylswertisin, genistein, genistin,

mangiferin và daidzin trong số 13 chất phân lập được ức chế mạnh enzyme α-

glucosidase in vitro với IC50 tương ứng lần lượt là 119, 333, 74, 83, 112 và 97

µg/mL [25].

Mingchuan Liu và cộng sự (2012) đã phân lập được 18 hợp chất từ rễ cây xạ

can và nghiên cứu hoạt tính kháng u của chúng. Kết quả cho thấy các hợp chất

kampferol, ursolic acid, betulin, betulonic acid và betulone có hoạt tính gây độc tế

bào mạnh trên các dòng tế bào PC3, MGC-803, Bcap-37 và MCF-7 [106].

Như vậy, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy cây xạ can có nhiều hoạt tính

sinh học vô cùng phong phú như: hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm,

chống oxy hoá, kháng u, điều trị biến chứng của bệnh tiểu đường… Trong đó, hoạt

tính kháng viêm là hoạt tính nổi trội nhất và đáng được quan tâm.

Các hợp chất phân lập được từ sâm đại hành và xạ can đều có hoạt tính

kháng viêm tốt và thuộc lớp chất phenolic. Do vậy, phần dưới đây tác giả trình bày

một số khái niệm về viêm và một số hợp chất phenolic thực vật có hoạt tính kháng

viêm.

1.2 KHÁI NIỆM VỀ VIÊM [62], [74]

Hiện nay, viêm nhiễm đang là căn bệnh rất phổ biến ở Việt Nam cũng như

trên thế giới. Viêm là một đáp ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước sự tấn công

của tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý, cơ) hoặc của tác nhân bên

trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn). Đây là một đáp ứng miễn dịch tự

nhiên. Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và đau, do

các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu đến nơi tổn thương. Các bạch cầu cũng theo

mạch máu xâm nhập vào mô, tiết các chất prostaglandin, cytokine nhằm tiêu diệt

hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn thương. Khi viêm không lành sẽ có thể trở

thành viêm mãn tính.

Phân loại viêm

- Theo nguyên nhân: viêm nhiễm khuẩn và viêm vô khuẩn. Viêm nhiễm

khuẩn hình thành do tác nhân gây bệnh như: virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng…

có thể khư trú hay lan toả toàn thân.

- Theo vị trí: viêm nông và viêm sâu

- Theo dịch rỉ viêm: viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ…

- Theo diễn biến: viêm cấp và viêm mãn

Viêm là hiện tượng bệnh lý bao gồm một loạt những thay đổi tại chỗ và toàn

thân, bắt đầu ngay khi tác nhân gây viêm xâm nhập vào cơ thể. Trong phản ứng

viêm, các tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, bạch cầu ưa axit,

bạch cầu ưa bazơ, tế bào nội mô sản xuất ra các chất trung gian hoá học như

prostaglandin, histamine, leucotrien… Các chất trung gian hoá học vừa giải phóng

lại hoạt hoá một số tế bào khác, giải phóng các polypeptide gọi là các cytokine.

Những thay đổi về hình thái và sinh hoá gặp trong quá trình viêm diễn biến

theo quy luật. Mặc dù mức độ và thời gian của các giai đoạn viêm có thể thay đổi,

nhưng quá trình viêm thường diễn biến qua 3 giai đoạn: giai đoạn tổn thương tổ

chức, giai đoạn rối loạn vận mạch và thoát dịch rỉ viêm, giai đoạn tăng sinh tổ chức

để hàn gắn tổn thương.

Các tác nhân gây viêm tác động lên cơ quan và mô gây ra 2 hậu quả chủ yếu

là:

- Gây tổn thương tế bào mô làm giải phóng ra các chất trung gian hoá học

như histamine, PG… gọi là các chất trung gian gây viêm. Các chất trung gian gây

viêm bao gồm: các acid amin (như histamine, serotonin gây ra phản ứng dị ứng);

các dẫn xuất của axit béo (gồm các prostaglandin PG là các chất trung gian gây

viêm quan trọng nhất gây ra phản ứng viêm); các men lysosom (collagenase,

elastase, hyaluronidase, chymotrysinase…); các lymphokin (yếu tố ức chế di tản đại

thực bào (MIF), yếu tố hoá ứng động); các kinin (bradykinin, kalidin…có nguồn

gốc từ các protein huyết tương).

- Gây rối loạn tuần hoàn và chuyển hoá các sản phẩm chuyển hoá trung gian,

chính các sản phẩm này cũng đóng vai trò như các chất trung gian gây viêm.

Các đáp ứng viêm xảy ra giống nhau cho dù nguyên nhân ban đầu khác nhau

cho thấy có thể có một con đường sinh lý bệnh chung cho tất cả các quá trình bệnh

lý này. Đó là sự sản xuất các cytokine gây viêm, các phân tử bám dính, các chất

trung gian vận mạch và các gốc tự do oxy hoá ROS trong tiến trình đáp ứng miễn

dịch-viêm.

Yếu tố nhân kappa B, NF-κB, được phát hiện lần đầu tiên là vào năm 1986

từ tế bào B. Sau đó, NF-κB được tìm thấy trong nhiều loại tế bào khác nhau. NF-κB

là một yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hoá của các

cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh viêm. Yếu tố NF-κB có thể được

hoạt hoá bởi nhiều tín hiệu viêm khác nhau, dẫn tới sự biểu hiện phối hợp của các

gen quy định nhiều cytokine, chemokine, các enzyme và các tế bào kết dính. Sự

hoạt hoá NF-κB bao gồm sự photphoryl hoá và giảm phân giải protein tiếp sau của

protein ức chế IκB bởi các IκB kinaza đặc hiệu. NF-κB tác động lên các gen quy

định các cytokine, lên các chemokine có lợi cho quá trình viêm, lên các gen quy

định các enzyme gây sản sinh các chất trung gian của quá trình viêm, lên các gen

quy định các thụ thể miễn dịch, cũng như các phần tử dính kết có vai trò mấu chốt

trong sự tập hợp ban đầu các bạch cầu đến các vị trí viêm. Trong bệnh lý viêm,

TNF-α có thể kích hoạt yếu tố NF-κB và NF-κB thể hiện như một nhân tố điều hoà

gien quan trọng đối với các gien liên quan đến viêm, nhiễm trùng và đáp ứng miễn

dịch bao gồm iNOS, IL-1B, IL-6 và TNF-α. NF-κB từ lâu đã được coi là như là một

mục tiêu cho các loại thuốc kháng viêm mới. NF-κB không điều tiết sản xuất các

cytokine tiền viêm, bạch cầu trung tính hoặc tế bào, mà đóng góp quan trọng đối

với các phản ứng viêm. Tuy nhiên, các chức năng chống sự chết rụng của tế bào của

NF-κB có thể vừa bảo vệ chống lại viêm nhiễm vừa duy trì các phản ứng viêm

nhiễm thông qua hoạt hoá các bạch cầu.

Các cytokine là các protein hay glycoprotein hoà tan tham gia vào các phản

ứng miễn dịch và phản ứng viêm. Các cytokine đóng vai trò truyền tin qua lại giữa

các bạch cầu với nhau và giữa các bạch cầu với các tế bào khác. Các cytokine tham

gia vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp

ứng miễn dịch, viêm và cũng đóng vai trò quan trọng trong nhiều bệnh lý như :

bệnh tự miễn, nhiễm khuẩn huyết, ung thư, nhiễm HIV, viêm gan siêu vi… Phần

lớn các cytokine được gọi là interleukin dựa theo vai trò của nó trong việc truyền

thông tin giữa các tế bào bạch cầu. Các cytokine được phân loại dựa vào nguồn gốc

của tế bào phân tiết và kết quả xét nghiệm sinh học. Chúng được phân làm 4 nhóm:

interleukine, interferon, cytotoxin, growth factor (yếu tố kích thích tăng trưởng tế

bào) và chemokine. Có hơn 100 các yếu tố khác nhau trong nhóm cytokine đã được

biết đến, trong đó có 22 loại interleukin và TNF như: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,

IL-6, IL-12… Đáp ứng viêm bình thường là sự điều hoà quá trình tập trung, kết

dính, xuyên mạch, hoá hướng động, thực bào của các bạch cầu đa nhân trung tính

và tiêu diệt các vi khuẩn xâm nhập. Các quá trình này được kiểm soát chặt chẽ

thông qua sự điều hoà các cytokine trợ viêm và kháng viêm được phóng thích bởi

các đại thực bào được hoạt hoá. Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ thống, phản ứng

viêm phụ thuộc vào nồng độ của các cytokine [132].

Đại thực bào là những tế bào bạch cầu có vai trò quan trọng trong hệ miễn

dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động vật có xương sống. Vai

trò của chúng là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các tác nhân gây

bệnh. Ngoài ra, nó còn đóng vai trò các tế bào trình diện kháng nguyên khởi động

đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể. Đại thực bào có thể lưu hành tự do trong

máu hay cố định tại các tổ chức. Một khi đại thực bào được hoạt hoá bởi sự hiện

diện của các tác nhân gây bệnh như: vi khuẩn, endotoxin, leukotrien…, nó sẽ phóng

thích một loạt các cytokine. Đại thực bào sản xuất 5 loại cytokine chính là: IL-1, IL-

6, IL-12, IL-18 và TNF-α.

Hình 1.3: Các cytokine được sản sinh từ đại thực bào

IL-6 là một cytokine được giải phóng bởi nhiều loại tế bào, không những

được sản sinh từ đại thực bào hoạt động mà còn có nguồn gốc từ các tế bào T, B, tế

bào gốc tuỷ xương, nội mạc thành mạch, nguyên sợi bào, tế bào keratin. IL-6 có tác

dụng ở hầu hết các tế bào, có vai trò quan trọng trong biệt hoá tế bào B thành các tế

bào tạo kháng thể, tập hợp các bạch cầu đã được biệt hoá, kích thích gan sản xuất

các protein trong giai đoạn cấp tính của bệnh. Mặc dù chủ yếu được coi là một tác

nhân gây viêm, IL-6 cũng có hoạt tính kháng viêm. IL-6 hoạt hoá các tế bào

lympho, tăng sản xuất kháng thể [76].

IL-12 là một cytokine hetorodimeric (dimer dị thể), mã hoá bởi hai gen riêng

biệt IL-12A(p35) và IL-12B (p40), được sản sinh từ các tế bào trình diện antigen

chính như monocyte, đại thực bào, tế bào răng cưa, tế bào B, tế bào keratin. IL-12

đóng vai trò trung tâm trong việc khởi đầu và điều tiết của các tế bào miễn dịch

[100, 101].

TNF-α (yếu tố hoại tử u) là một cytokine có nguồn gốc chủ yếu từ các đại

thực bào, có vai trò quan trọng trong cơ chế đáp ứng của các cơ quan trong cơ thể

với các tổn thương và nhiễm trùng. TNF-α có cấu tạo trimer đồng thể được phân tiết

từ đại thực bào, tế bào T, B, nguyên sợi bào. Chúng có tác động sinh học trên hầu

hết các tế bào có nhân và có thể ở dạng hòa tan trong dịch chất hoặc ở dạng liên kết

trên bề mặt màng. Nó có tác dụng gây độc trực tiếp đối với tế bào ung thư mà

không có tác dụng đối với các tế bào bình thường. TNF-α không chỉ có tác dụng

gây hoại tử khối u mà nó còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của

một đáp ứng viêm hữu hiệu, có tác dụng thanh lọc các tác nhân gây bệnh khác nhau

xâm nhập vào cơ thể.

Phản ứng đáp ứng viêm được khởi nguồn từ sự xâm nhập của mầm bệnh hay

sự tổn thương mô gây ra bởi các gốc tự do, là một chuỗi các phản ứng trong mạch

và tế bào. Một số chất trung gian hoá học quan trọng gây viêm là interleukin IL-1,

IL-6, IL-12, TNF-α (tumor necrosis factor-α), prostaglandin… Các thuốc kháng

viêm đều nhằm mục tiêu là hạn chế sự sản sinh các cytokine tiền viêm này. Dưới

tác dụng của LPS, các tế bào tua DCs sinh ra từ tuỷ xương được biết đến là sản sinh

ra các cytokine: IL-6, IL-12p40 và TNF-α [112].

Các thuốc kháng viêm hiện nay được chia làm hai loại: loại steroid và loại

không steroid. Trên thị trường hiện nay chủ yếu là các thuốc kháng viêm không

steroid (NSAIDs-Nonsteroidal anti-inflammatory drugs), đa số là các thuốc tổng

hợp và có tác dụng hầu hết trên các loại viêm không phân biệt nguyên nhân. Cơ chế

hoạt động của các thuốc này là kìm hãm hoạt động của các enzyme cyclooxygenase

COX-1 và COX-2, làm giảm tổng hợp các prostaglandin (PG-yếu tố trung gian

quan trọng nhất gây nên phản ứng viêm) [135]. COX-1 được tìm thấy nhiều nhất ở

thành mạch máu, dạ dày và thận, trong khi đó COX-2 cảm ứng bởi các cytokine

thường tham gia vào phản ứng viêm và có tác dụng xúc tác tạo ra các PG. Sự ức chế

tổng hợp các PG của thuốc một mặt là yếu tố quyết định tác dụng kháng viêm của

thuốc nhưng lại có tác dụng bất lợi ở đường tiêu hoá và thận khi sử dụng thuốc kéo

dài. Hiện nay, các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 được xem là ít tác dụng phụ trên

dạ dày. Tuy nhiên, đối với các thuốc này, không có thuốc nào hoàn toàn ức chế

COX-2 mà không tác động trên COX-1 [68]. Do đó, bên cạnh các thuốc tổng hợp

thì xu hướng tìm kiếm các thuốc kháng viêm có nguồn gốc từ thiên nhiên đang

được đẩy mạnh bởi những tác dụng ưu việt của nó như: tác dụng nhanh, an toàn và

ít gây ra các phản ứng phụ.

1.3 MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC THỰC VẬT CÓ HOẠT TÍNH

KHÁNG VIÊM

1.3.1 Đặc điểm chung của các hợp chất phenolic

Hợp chất phenolic là nhóm các hợp chất hóa học mà trong phân tử có chứa

nhóm chức hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydro cacbon thơm. Hợp chất phenolic là

các nhóm chất khác nhau rất phổ biến trong giới thực vật, chúng được phân bố rộng

rãi trong giới thực vật và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật. Hơn

8000 cấu trúc phenolic được tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như axit phenolic

đến các hợp chất polymer như tannin. Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng

chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và

động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các sắc màu của thực vật. Chúng có ở khắp các

bộ phận của cây, do đó chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn

uống của con người.

Các hợp chất phenolic rất đa dạng về cấu trúc, dưới đây là một số nhóm

chính [56]:

Bảng 1.1 Các nhóm hợp chất phenolic cơ bản

Nhóm Nhóm chất Cấu trúc cơ bản

phenol đơn giản và C6 benzoquinone

Axit phenolic và

các hợp chất liên C6-C1

quan

acetophenol, axit C6-C2 phenylacetic

axit cinnamic,

Coumarin, C6-C3 isocoumarin và

chromone

Naphthoquinone C6-C4

Xanthone C6-C1-C6

stilbene, C6-C2-C6 anthraquinone

Flavonoid C6-C3-C6

lignan, neolignan (C6-C3)2

tannin thuỷ phân (C6-C1)n

Lignin (C6-C3)n

Vì trong luận án, các hợp chất phân lập được thuộc nhóm chất flavonoid,

anthraquinone và naphthoquinone nên chúng tôi giới thiệu sâu hơn về các lớp chất

này.

1.3.2 Các hợp chất flavonoid

Các hợp chất flavonoid là nhóm hợp chất có ý nghĩa thực tiễn lớn trong số

các polyphenol thiên nhiên vì chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật, ít

độc và có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị. Chúng đa dạng về cấu trúc hóa học và

tác dụng sinh học, có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên và được phân loại theo cấu

trúc hóa học. Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản kiểu C6-C3-

C6’, gồm hai vòng benzen (vòng A và B) và một vòng pyron (vòng C), trong đó

phần nửa C6 là vòng benzen, sự biến đổi thể trạng oxy hóa của phần giữa liên kết C3

sẽ định rõ tính chất, hạng của mỗi lớp chất đó [28]. Cấu trúc tổng quát như sau:

Dựa vào vị trí liên kết của vòng thơm với phần benzopyran (khung

chroman), có thể chia các hợp chất này thành 3 nhóm:

- Flavonoid (2-phenylbenzopyran)

- Isoflavonoid (3-phenylbenzopyran)

- Neoflavonoid (4-phenylbenzopyran)

Trong thực vật flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng:

- Dạng tự do (aglycol): thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete,

axeton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước.

- Dạng liên kết với gluxit: tan trong nước nhưng không tan trong các dung

môi không phân cực như axeton, chloroform. Tùy theo số lượng gốc đường có mặt

trong phân tử, phân biệt thành monoglycoside, bioside…

Dưới tác dụng của acid, glycoside bị thủy phân thành đường và aglycon:

Glycoside → aglycon + đường

* Hoạt tính sinh học của hợp chất flavonoid

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “những người thợ sửa chữa

sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại

các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thư. Nhờ vậy

chúng có đặc tính kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus và ngăn ngừa ung thư.

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa do các gốc tự do gây ra, đây có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động

khác thường.

Flavonoid có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như

những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có

tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, thoái

hóa gan, tổn thương do bức xạ...

Các flavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng

như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận...

Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng

gan.

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp

các catechin của chè có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim. Các flavonoid có tác

dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu

qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó. Hay nói

cách khác nó duy trì độ mềm dẻo của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối

loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch [70].

* Hoạt tính kháng viêm của flavonoid [20], [25], [39]

Các hợp chất flavonoid đã được nghiên cứu và chứng minh và có tác động

kháng viêm in vitro theo nhiều cơ chế khác nhau. Các nghiên cứu tác động kháng

viêm in vitro của các hợp chất flavonoid đã được các tác giả rút ra nhận xét rằng các

flavonoid chứa nhiều nhóm hydroxyl và chalcon cũng cho tác động ức chế sinh

tổng hợp các chất tiền viêm (prostaglandin E2, cytokine) tốt hơn các hợp chất

flavonoid khác [145]. Hiện nay, các flavonoid được nghiên cứu có tác dụng tốt đa

phần là các flavonoid thiên nhiên như kaempferol, quercetin, chrysin… Tác dụng

sinh học của chúng nhờ vào sự có mặt của nhiều nhóm OH phenol tự do [104]. Các

flavonoid có khả năng ức chế sinh tổng hợp nitơ oxit, cyclooxygenase và

lypooxygenase mà tạo ra lượng lớn nitric oxide, prostanoids và leukotrienes, cũng

như các chất trung gian khác của quá trình viêm như cytokine, chemokine [97].

Các nhà nghiên cứu Hàn Quốc (2014) đã nghiên cứu tác dụng của 12

flavonoid phân lập được từ loài Astragalus membranaceus trên tế bào tua sinh ra từ

tuỷ xương được kích thích bởi LPS. Kết quả cho thấy hai hợp chất flavonoid là

isoliquiritigenin, liquiritigenin có tác dụng ức chế cytokine IL-6 và IL-12 p40 với

IC50 trong khoảng 2,7-6,1 µM và hợp chất isoliquiritigenin có tác dụng với TNF-α

với giá trị IC50 là 20,1 µM [148]

Một số hợp chất flavonoid như hesperidin, apigenin, luteolin và quercetin đã

được chứng minh là có tác dụng chống viêm và giảm đau. Các flavonoid có thể có

tác dụng đặc biệt đến hệ enzyme tham gia vào việc gây ra các quá trình viêm, đặc

biệt là protein tyrosine và serine-threonine kinase [139], [145]. Flavonoid có khả

năng ức chế hoạt động của các enzyme cyclooxygenase COX, lipooxygenase, các

chất trung gian của quá trình viêm như các cytokine, chemokine [97]… Flavonoid

cũng có khả năng ức chế phosphodiesterases (tham gia hoạt hoá tế bào), hầu hết các

tác dụng chống viêm của flavonoid là dựa trên việc sinh tổng hợp các cytokine

protein. Một số flavonoid có khả năng ức chế mạnh việc sản xuất các prostaglandin

[66].

Hợp chất tectoridin và tectorigienin là các hợp chất isoflavonoid có nhiều

hoạt tính đáng quý như: khả năng kháng viêm mạnh, hoạt tính chống oxy hoá, ức

chế sự phát triển của u ác tính, hoạt tính estrogen…

1.3.3 Anthraquinone

Anthraquinone

Anthraquinone là những dẫn chất của 9,10-dixeton-anthraxen:

Các hợp chất anthraquinone được phát hiện chủ yếu trong các họ:

Caesalpiniaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae, Rubiaceae; Tuy nhiên, trong các thực

vật thuộc họ khác vẫn có thể phân lập được các hợp chất anthraquinone này. Các

hợp chất anthraquinone tự nhiên với một lượng lớn cấu trúc đã được phân lập, thể

hiện phổ hoạt tính sinh học rộng và độc tính thấp. Có thể kể đến một số các hoạt

tính như: kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế khối u. Chúng cũng được

dùng làm thuốc xổ hay thuốc có tác dụng làm se. Ngày nay, có nhiều các nghiên

cứu mới đã chỉ ra một số các dẫn xuất của anthraquinone có hoạt tính chống loãng

xương, chống sốt rét, chống ô xi hóa, giảm đau, và đặc biệt là chống ung thư [78].

Các dẫn xuất của anthroquinone phân lập được từ cây đại hoàng đã được đánh giá

ảnh hưởng trên đại thực bào RAW 264,7 được kích thích bởi LPS. Các

anthroquinone đã được xác định hoạt tính ức chế với sự sản sinh NO và các protein,

và mRNA của iNOS và COX-2. Kết quả cho thấy các anthraquinone này có hoạt

tính kháng viêm tốt.

1.3.4 Naphthoquinone

Các hợp chất naphthoquinone có màu từ vàng đến đỏ, có 4 loại

naphthoquinone là: 1,2-naphthoquinone (a), 1,4-naphthoquinone (b), 2,6-

naphthoquinone (c) và pyranonaphthoquinone (d):

Naphthoquinone phân bố rộng rãi trong thiên nhiên. Chúng được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm và là chất chuyển hóa thứ cấp ở thực vật bậc cao, được biết đến nhiều

nhất là vitamin K. Hiện có hơn 350 hợp chất naphthoquinone đã được tìm thấy

trong tự nhiên [46]. Những cây cỏ có chứa thành phần naphthoquinone được sử

dụng làm thuốc ở Trung Quốc và các nước Nam Mỹ. Các hợp chất naphthoquinone

thể hiện nhiều hoạt tính dược lý quan trọng như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

virus, kháng viêm, hạ sốt, tác dụng trên tim mạch và hệ sinh sản [79]. Hợp chất 1,4-

naphthaquinone có khả năng ức chế mạnh yếu tố hoại tử khối u TNF-α [79].

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

Nguyên liệu nghiên cứu: thân rễ cây xạ can và củ cây sâm đại hành.

Củ cây sâm đại hành (Eleutherin bulbosa (Mill.) Urb.) được thu hái tại Chí

Linh, Hải Dương vào tháng 1 năm 2011. Mẫu cây đã được TS. Nguyễn Quốc Bình,

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, giám định tên khoa học và tiêu bản số SĐH/1-

2011 được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

Thân rễ cây xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) được thu hái từ tháng 1

đến tháng 3 năm 2010 tại Lạng Sơn. Mẫu thực vật do TS Trần Huy Thái - Viện sinh

thái và tài nguyên sinh vật giám định. Tiêu bản số BS-1/3-2010 được lưu giữ tại

Viện hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ

Việt Nam.

Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. Belamcanda chinensis (L.) DC.

Hình 2.1 Thân rễ cây xạ can và củ sâm đại hành khô

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1,05715), RP18 F254 (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai

bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được

phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng thủy tinh tráng sẵn

Merck 60 F254, RP18 F254 (Merck) kích cỡ 20x20 cm. Phát hiện vệt chất bằng đèn tử

ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử

là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ

để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại

trong dung môi thích hợp.

2.2.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel Merck pha thường và

pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (240-430 mesh).

Silica gel pha đảo RP-18 F254 (Merck 5559; 0,2 mm) hoặc YMC có cỡ hạt là 30-50

µm (Fujisilisa Chemical Ltd.)

2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các thông

số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham

khảo.

2.3.1 Điểm nóng chảy

Điểm nóng chảy được đo trên máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) của Đức.

2.3.2 Phổ khối lượng

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT

1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530

Accurate-Mass Q-TOF LC/MS của Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Avance 500, 1H- (500 MHz)

và 13C- (125 MHz) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.4.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vivo của các dịch chiết

2.4.1.1 Xác định khả năng kháng viêm theo đường bôi

a. Phương pháp gây viêm cục bộ bằng hoạt chất EPP

Phương pháp gây viêm cục bộ bằng hoạt chất EPP được tiến hành theo

phương pháp của Mrudula Kale (2007) [108], Jaijoy K (2010) [77].

b. Phương pháp xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường bôi

Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo

phương pháp của Jaijoy K (2010) [77].

2.4.1.2 Xác định khả năng kháng viêm theo đường uống

a. Phương pháp gây viêm cục bộ bằng Fomalin 1%

Phương pháp gây viêm được tiến hành theo phương pháp của Miklos Gabor

(2009) [48].

b. Phương pháp xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường uống

Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo

phương pháp của Miklos Gabor (2009) [48].

2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua

DC (dendritic cells) sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS

(lipopolysaccharide) của các hợp chất phân lập được từ cây sâm đại hành [84]

- Được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học Hàn Quốc.

- Đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất đến khả năng sống sót của tế bào bằng

cách sử dụng thiết bị đo màu MTT.

- Nghiên cứu ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua sinh ra ở tuỷ

xương.

2.4.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo và độ an toàn của Tectorigenin

(TEC-01) phân lập được từ thân rễ cây xạ can

2.4.3.1 Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, giảm đau của tectorigenin

Được tiến hành tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Dược Hà Nội.

a. Nghiên cứu tác dụng giảm đau theo phương pháp gây đau bằng acid acetic

(Afzal M.) [12]

b. Nghiên cứu tác dụng chống viêm

(cid:1) Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình

gây phù thực nghiệm bằng carrageenin [12].

(cid:1) Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên chuột

cống gây u hạt thực nghiệm.

2.4.3.2 Nghiên cứu độ an toàn của TEC-01

Phương pháp đánh giá độ an toàn của TEC-01 được tiến hành tại Bộ môn

Dược lý, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương.

a. Phương pháp đánh giá độc tính cấp [141]

Nguyên lý của thử nghiệm: Thử độc tính cấp là xác định các mức liều gây

độc (chết) động vật thí nghiệm sau khi cho dùng một lần hoặc vài lần mẫu thử trong

ngày. Trong trường hợp các mẫu thử ít độc hoặc không độc, có thể xác định mức

liều dung nạp tối đa.

Tiến hành đánh giá độc tính cấp theo đường uống: Cho từng lô chuột nhắt

trắng (từ 6-10 chuột/lô) uống chế phẩm thử với liều tăng dần, theo dõi chuột liên tục

trong vòng 4 giờ, tỷ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau

khi dùng chế phẩm thử.

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai,

đuôi), lông, phân ...

- Tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ.

- Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng.

LD50 được tính theo công thức của Behrens

( 50 – a) x d

LD50 = A + ----------------

b – a

Trong đó: A - liều gây chết a% động vật thí nghiệm (ĐVTN)

a - % ĐVTN chết sát dưới 50%

b - % ĐVTN chết sát trên 50%

d - khoảng cách giữa các liều (g)

Sai số chuẩn tính theo công thức:

kSd (SLD50)2 = ------------- n

Trong đó:

k: hệ số Behrens = 0,66

d: khoảng cách giữa các liều

n: số chuột trong mỗi nhóm.

LD84 - LD16

S = ----------------

Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Behrens.

b. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương pháp của

OECD [142]. Theo dõi các thông số: tình trạng toàn thân, huyết học, chức năng gan,

chức năng thận và mô bệnh học.

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các giá trị được mô tả dưới dạng TB ± SE (TB: giá trị trung bình, SE: sai số

chuẩn), và áp dụng phân tích một chiều (ANOVA), kết hợp phương pháp t-test-

Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá trị p<0.05.

CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM

3.1 ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT

3.1.1 Xử lý nguyên liệu thực vật

Mẫu thực vật sau khi được thu hái về được xử lý theo phương pháp thông thường trong hóa học: sau khi làm sạch cơ học mẫu được diệt men ở 110oC và sấy khô ở nhiệt độ 40oC, sau đó đem nghiền nhỏ và ngâm chiết với methanol ở 50oC.

Quá trình chiết được lặp lại 3-4 lần. Gộp các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp

suất giảm thu được cặn chiết tổng methanol dùng làm nguyên liệu để điều chế các

phần chiết.

3.1.2 Điều chế các cặn chiết từ củ sâm đại hành và thân rễ cây xạ can

Các cặn chiết từ củ sâm đại hành và thân rễ xạ can được điều chế theo sơ đồ

Bột khô thân rễ xạ can/củ sâm đại hành

- Chiết methanol 70%, 500C - Cất loại dung môi

Cặn methanol tổng

- Bổ sung nước - Chiết n-hexan, cất loại dung môi

Dịch còn lại

hình 3.1:

Chiết etyl axetat, cất loại dung môi

Dịch còn lại

Cặn ethyl acetate BS-Et/EB-Et

Cất loại dung môi

Cặn nước BS-W/EB-W

Cặn n-hexan BS-Hx/EB-Hx

Hình 3.1 Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ củ sâm đại hành và thân rễ cây xạ can

Thực hiện quá trình chiết kết hợp siêu âm và gia nhiệt, 5kg bột khô củ sâm đại hành trong dung môi methanol 70% ở 50oC (3 lần x 2 giờ mỗi lần). Dịch chiết

methanol được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 200

g cặn chiết methanol tổng. Hòa tan cặn methanol tổng trong nước và lần lượt chiết

với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate thu được các

dịch chiết tương ứng. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 40 g cặn chiết

n-hexane (ký hiệu EB/Hx), 53 g cặn chiết ethyl acetate (ký hiệu EB/Et) và 67 g cặn

nước (ký hiệu EB/W).

Bột khô thân rễ Xạ can (2 kg) được ngâm chiết với methanol 70% ở nhiệt độ 500C, quá trình chiết được lặp lại 3 lần, dịch chiết được lọc, gộp lại và cất loại dung

môi dưới áp suất giảm thu được 33 gam cặn chiết methanol. Cặn methanol này

được bổ sung nước và chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate, sau khi

loại dung môi thu được các cặn chiết tương ứng là: 4,5 gam n-hexane (BS/Hx), 23

gam ethyl acetate (BS/Et) và 4,7 gam cặn nước (BS/W).

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG

VIÊM CỦA CỦ SÂM ĐẠI HÀNH

3.2.1 Nghiên cứu thành phần hoá học

3.2.1.1 Quy trình phân lập các hợp chất

- Từ cặn chiết ethyl acetate:

SKC, SiO2, gradient HX:Aceton(40:1 -1:1)

EB-A

EB-B

EB-C

EB-D

SKC, SiO2 HX:Aceton (5:1)

SKC, SiO2 CHCl3:Aceton 10:1)

Cặn EB/Et

EB-14 (10mg)

EB-B1

EB-B3

EB-B4

EB-B2 SKC, YMC RP-18, MeOH:H2O (6:1)

SKC, YMC RP-18 Aceton:H2O (3:1)

EB-10 (8mg)

EB-2 (12mg)

EB-5 (9mg)

EB-6 (15mg)

EB-4 (5mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat của củ sâm đại hành

Cặn chiết ethyl acetate EB/Et (53 g) của củ sâm đại hành được tiến hành chạy

sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:aceton (40:1 → 1:1, v/v) thu được

bốn phân đoạn nhỏ EB-A, EB-B, EB-C, và EB-D. Tiến hành chạy sắc ký cột silica

gel phân đoạn EB-B với hệ dung môi rửa giải CHCl3-aceton (10:1, v/v) thu được

bốn phân đoạn từ EB-B1 đến EB-B4. Từ phân đoạn EB-B1, chạy sắc ký cột pha

đảo YMC-18 RP với hệ dung môi rửa giải MeOH- H2O (6:1, v/v) thu được chất

EB-2 (12,0 mg) và EB-10 (8,0 mg). Bằng phương pháp tương tự chạy sắc ký cột

pha đảo với chất hấp phụ YMC-18 RP đối với phân đoạn EB-B3, hệ dung môi rửa

giải là aceton:H2O (3:1, v/v) thu được chất EB-4 (5,0 mg), EB-5 (9,0 mg), và EB-6

(15,0 mg). Tiếp tục xử lý phân đoạn EB-D bằng cách chạy sắc ký cột silica gel và

hệ dung môi n-hexane:aceton (5:1, v/v) thu được chất EB-14 (10,0 mg).

- Từ cặn nước:

SKC, Dianion HP-20P, dd MeOH

(0%, 25%, 50%, 75%, 100%)

EB-E

EB-F

EB-G

EB-H

EB-K

SKC, LH-20

MeOH

SKC, SiO2 CHCl3:MeOH:H2O (5:1:0,15)

EB-G1

EB-G2

EB-G3

Cặn EB-W

EB-3 (9mg)

EB-1 (5mg)

SKC, YMC RP- 18,Aceton:H2O (1:2)

SKC, YMC RP-18 MeOH:H2O (1:1)

EB-11 (19mg)

EB-8 (15mg)

EB-7 (12mg)

EB-12 (9mg)

EB-13 (14mg)

EB-9 (8mg)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của củ sâm đại hành

Từ phần cặn nước (EB/W, 67 g) chạy sắc ký cột Dianion HP-20 với dung dịch

MeOH có nồng độ tăng dần (0%, 25%, 50%, 75%, và 100%) thu được 5 phân đoạn:

EB-E, EB-F, EB-G, EB-H và EB-K. Phân đoạn EB-G chạy sắc ký cột silica gel với

hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O (5:1:0,15, v/v/v) thu được 3 phân đoạn: EB-G1,

EB-G2, và EB-G3. Từ phân đoạn EB-G1, chạy sắc ký cột pha đảo, chất hấp phụ

YMC-18 RP và hệ dung môi rửa giải acetone:H2O (1:2, v /v) thu được chất EB-7

(12,0 mg), EB-8 (15,0 mg), và EB-9 (8,0 mg). Phân đoạn EB-G3 chạy sắc ký cột

YMC RP-18 YMC, hệ dung môi MeOH:H2O (1:1, v/v) thu được chất EB-12 (9,0

mg) và EB-13 (14,0 mg). Với phân đoạn EB-K, chúng tôi chạy sắc ký cột sephadex

LH-20 với chất rửa giải MeOH thu được chất EB-1 (5,0 mg), EB-3 (9,0 mg), và

EB-11 (19,0 mg).

3.2.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được

25]

Hợp chất EB-1 (1)

Dα –58,1 (MeOH, c = 0,3); ESI-MS m/z 419 [ [M‒H]–; HR-ESI-MS m/z 455,1126 [M+Cl]– (C21H24O9Cl; 455,1114), m/z 419,1338 [M‒H]– (C21H23O9; 419,1348), m/z 257,0818 [M‒Glc]– (C15H13O4; 257,0819).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,87 (1H, ddq, J=4,0; 6,1; 12,0 Hz,

Chất bột màu vàng nhạt;

H-2); 2,57 (1H, dd, J=4,0; 16,8 Hz, Hb-3); 2,62 (1H, dd, J=12,0; 16,8 Hz, Ha-3);

6,85 (1H, s, H-6); 6,67 (1H, s, H-7); 6,45 (1H, s, H-9); 1,46 (1H, d, J=6,1 Hz, 2-

Me); 2,45 (1H, s, 5-Me); 4,93 (1H, d, J=7,2 Hz, H-1′); 3,40 (1H, H-2′); 3,47 (1H,

H-3′); 3,31 (1H, d, J=8,5 Hz, H-4′); 3,42 (1H, H-5′); 3,62 (1H, dd, J=5,6; 12,2 Hz,

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,4 (C-1); 78,0 (C-2); 45,9 (C-3);

Hb-6′); 3,83 (1H, dd, J=2,2; 12,2 Hz, Ha-6′).

194,3 (C-4); 114,6 (C-4a); 137,6 (C-5); 124,2 (C-6); 141,4 (C-6a); 103,6 (C-7);

161,4 (C-8); 103,5 (C-9); 158,7 (C-10); 109,9 (C-10a); 20,7 (2-Me); 23,3 (5-Me);

101,7 (C-1′); 74,8 (C-2′); 78,0 (C-3′); 71,4 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,5 (C-6′).

Thuỷ phân hợp chất EB-1

Hoà tan hợp chất EB-1 trong dung dịch HCl 0,1 N (dioxane/H2O, 1:1, v/v, 1,0 ml) rồi đun cách thuỷ ở 800C trong 3h. Sau đó, dung dịch axit được trung hoà

bởi Ag2CO3, và dung môi được loại bỏ triệt để bởi khí N2, sau đó chiết với CHCl3

được lớp CHCl3 và lớp nước. Lớp CHCl3 đem tiến hành sắc ký lớp mỏng điều chế

với hệ dung môi CHCl3-MeOH (8:1, v/v) thu được hợp chất EB-1a.

Lớp nước được làm khô kiệt bởi khí N2, phần cặn hoà tan trong 0,1 ml

pyridine khô rồi thêm vào đó este L-cysteine methyl hydrochloride trong pyridin (0,06 M, 0,1 mL). Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt đến 600C trong 2 giờ rồi bổ

sung thêm 0,1 ml dung dịch trimethylsilylimidazole và tiếp tục gia nhiệt đến 600C

trong 1,5 giờ. Sản phẩm sau khi được làm khô được phân bố với n-hexan (0,1 ml)

và H2O (0,1 ml), lớp n-hexan được phân tích bằng sắc ký khí lỏng GC (cột SPB-1 (0,25 mm×30 m), detector FID, nhiệt độ cột 2100C, nhiệt độ tiêm 2700C, nhiệt độ detector 3000C, khí mang He (2,0 ml/phút)). Thời gian lưu của peak được phát hiện

ở 14,11 phút. Với những điều kiện trên thì peak của đường chuẩn D-glucose và L-

glucose có thời gian lưu tương ứng là 14,11 và 14,26 phút. Do đó, có thể xác định

được gốc đường của EB-1 là D-glucose.

25]

Hợp chất EB-1a

Dα – 38,3 (MeOH, c = 0,3); HR-ESI-MS m/z [

Chất bột màu vàng nhạt;

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 4,88 (1H, H-2); 2,72 (1H, dd, J=3,7;

257,0810 [M-H]‒ (C15H13O4; 257,0819).

16,8 Hz, Hb-3); 2,80 (1H, dd, J=12,0; 16,8 Hz, Ha-3); 6,90 (1H, s, H-6); 6,48 (1H,

d, J=2,2 Hz, H-7); 6,35 (1H, d, J=2,2 Hz, H-9); 1,60 (1H, d, J=6,1 Hz, 2-Me); 2,59

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 163,8 (C-1); 77,9 (C-2); 46,0 (C-3);

(1H, s, 5-Me).

194,0 (C-4); 113,7 (C-4a); 137,3 (C-5); 123,3 (C-6); 141,7 (C-6a); 102,6 (C-7);

162,0 (C-8); 102,9 (C-9); 158,9 (C-10); 108,3 (C-10a); 20,8 (2-Me); 23,4 (5-Me).

Hợp chất EB-2 (2)

1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,19 (1H, s, H-6);

Chất bột màu trắng, mp.>3100C, C15H12O4, ESI-MS m/z 257 [M+H]+.

6,56 (1H, s, H-7); 6,58 (1H, s, H-9); 2,37 (1H, s, 2-Me); 2,71 (1H, s, 5-Me); 10,05

13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,8 (C-1a), 163,5 (C-2); 112,1 (C-

(1H, s, 8-OH); 10,15 (1H, s, 10-OH).

3); 178,6 (C-4); 116,3 (C-4a); 134,4 (C-5); 124,8 (C-6); 138,7 (C-6a); 102,9 (C-7);

156,9 (C-8); 101,2 (C-9); 159,3 (C-10); 107,2 (C-10a); 19,4 (2-Me); 23,0 (5-Me).

Hợp chất EB-3 (3)

1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 6,18 (1H, s, H-3); 7,27 (1H, s, H-6);

Chất bột màu trắng, mp. 175-1760C, C21H22O9, ESI-MS m/z 417 [M-H]¯ .

6,89 (1H, d, J=2,1 Hz, H-7); 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9); 2,35 (1H, s, 2-Me); 2,70

(1H, s, 5-Me); 4,98 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1′); 3,24 (1H, t, J=7,6 Hz, H-2′); 3,36 (1H,

m, H-3′); 3,19 (1H, t, J=8,3 Hz, H-4′); 3,28 (1H, m, H-5′); 3,69 (1H, dd, J=1,2; 11,4

13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 156,3 (C-1a), 163,7 (C-2); 112,1 (C-

Hz, Ha-6′); 3,49 (1H, dd, J=5,5; 11,4 Hz, Hb-6′).

3); 178,5 (C-4); 117,1 (C-4a); 134,7 (C-5); 125,5 (C-6); 138,1 (C-6a); 101,5 (C-7);

158,5 (C-8); 103,1 (C-9); 156,5 (C-10); 108,7 (C-10a); 19,5 (2-Me); 23,0 (5-Me);

100,0 (C-1′); 73,2 (C-2′); 77,1 (C-3′); 69,6 (C-4′); 76,7 (C-5′); 60,6 (C-6′).

Hợp chất EB-4 (4)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-176oC, C16H16O5, ESI-MS m/z

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 5,49 (1H, q, J=7,0 Hz, H-1); 4,69

289 [M+H]+.

(1H, q, J=7,0 Hz, H-3); 8,04 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7);

7,01 (1H, t, J=8,0 Hz, H-8); 1,64 (3H, d, J=7,0 Hz, 1-Me); 1,53 (3H, d, J=7,0 Hz, 3-

13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 69,5 (C-3); 202,9 (C-4);

Me); 4,07 (3H, s, 9-OMe); 12,82 (1H, s, 5-OH).

153,4 (C-5); 118,1 (C-6); 125,4 (C-7); 109,1 (C-8); 155,7 (C-9); 139,4 (C-10);

121,0 (C-11); 107,8 (C-12); 126,0 (C-13); 119,6 (C-14); 17,4 (CH3-1); 16,3 (CH3-

3); 56,4 (OCH3-9).

Hợp chất EB-5 (5)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp. 175-1770C, C16H16O4, ESI-MS m/z

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,36 (3H, d, J=6,5 Hz, 3-CH3); 1,54

273 [M+H]+.

(3H, d, J=6,5 Hz, 1-CH3); 2,20 (1H, dd, J=10,1; 18,1 Hz, 4-Hß); 2,75 (1H, dd,

J=2,1; 18,1 Hz, 4-Hα); 3,60 (1H, m, H-3); 3,96 (3H, s, 9-OCH3); 4,85 (1H, q, J=6,5

Hz, H-1); 7,27 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,64 (1H, dd, J=8,0; 8,5 Hz, H-7), 7,73 (1H,

13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 70,2 (C-1); 68,7 (C-3); 29,8 (C-4);

d, J=8,5 Hz, H-6).

183,9 (C-5); 117,7 (C-6); 134,5 (C-7); 118,9 (C-8); 159,3 (C-9); 183,7 (C-10);

148,6 (C-11); 139,9 (C-12); 133,9 (C-13); 120,2 (C-14); 20,7 (1-CH3); 21,2 (3-

CH3); 56,4 (9-OCH3).

Hợp chất EB-6 (6)

Tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, mp 174-175oC, C16H16O4, ESI-MS m/z

1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 1,35 (3H, d, J=6,0 Hz, 3-CH3); 1,53

273 [M+H]+.

(3H, d, J=7,0 Hz, 1-CH3); 2,24 (1H, dd, J=10,1; 16,0 Hz, 4-Hß); 2,71 (1H, dd,

J=3,5; 18,5 Hz, 4-Hα); 3,98 (1H, m, H-3); 4,01 (3H, s, 9-OCH3); 5,02 (1H, q, J=6,5

Hz, H-1); 7,28 (1H, d, J=7,5 Hz, H-8); 7,65 (1H, t, J=7,5 Hz, H-7); 7,74 (1H, d,

13C-NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 67,4 (C-1); 62,4 (C-3); 29,5 (C-4);

J=7,5 Hz, H-6).

182,7 (C-5); 117,7 (C-6); 134,7 (C-7); 119,0 (C-8); 159,7 (C-9); 184,2 (C-10);

148,0 (C-11); 139,4 (C-12); 134,0 (C-13); 119,6 (C-14); 19,7 (1-CH3); 21,5 (2-

CH3); 56,4 (9-OCH3).

Hợp chất EB-7 (7)

1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,02 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 3,42

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+.

(1H, H-3); 2,68 (1H, dd, J=11,7; 16,5 Hz, Hb-4); 3,00 (1H, Ha-4); 8,07 (1H, d,

J=8,9 Hz, H-6); 7,28 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-7); 6,86 (1H, d, J=7,6 Hz, H-8);

1,49 (1H, d, J=6,2 Hz, 1-Me); 1,23 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 3,99 (1H, s, 9-OMe);

9,60 (1H, s, 10-OH); 4,51 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,37 (1H, H-2′); 3,15 (1H, H-3′);

3,24 (1H, H-4′); 3,21 (1H, H-5′); 3,55 (1H, dd, J=5,5; 11,0 Hz, Hb-6′); 3,91 (1H, dd,

J=1,4; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,12 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 2,92 (1H, H-2ʺ); 3,10 (1H, H-

13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 70,0 (C-1); 69,0 (C-3); 33,1 (C-4);

3ʺ); 3,03 (2H, H-4ʺ, H-5ʺ); 3,39 (1H, Hb-6ʺ); 3,61 (1H, br d, J=11,6 Hz, Ha-6ʺ).

140,5 (C-5); 115,5 (C-6); 125,7 (C-7); 104,2 (C-8); 155,9 (C-9); 146,3 (C-10);

120,5 (C-11); 129,6 (C-12); 128,3 (C-13); 113,1 (C-14); 21,8 (1-Me); 21,7 (3-Me);

56,4 (9-OMe); 105,3 (C-1′); 74,1 (C-2′); 75,1 (C-3′); 69,9 (C-4′); 76,6 (C-5′); 68,6

(C-6′); 103,1 (C-1ʺ); 73,7 (C-2ʺ); 76,7 (C-3ʺ); 70,0 (C-4ʺ); 76,9 (C-5ʺ); 61,1 (C-6ʺ).

Hợp chất EB-8 (8)

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O14, ESI-MS m/z 599 [M+H]+.

1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,21 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4.11

(1H, m, H-3); 2.46 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, Hb-4); 3.50 (1H, Ha-4); 7,90 (1H, d,

J=8,0 Hz, H-6); 7,31 (1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,85 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,56 (1H,

d, J=6,8 Hz, 1-Me); 1,32 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,03 (1H, s, 9-OMe); 4,79 (1H,

H-1′); 3,51 (1H, H-2′); 3.16 (1H, H-3′); 3,57 (1H, H-4′); 3,52 (1H, H-5′); 3,94 (1H,

dd, J=4,8, 11,7 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H, Ha-6′); 3,95 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,30 (1H,

H-2ʺ); 3,22 (1H, H-3ʺ); 3,30 (1H, H-4ʺ); 3,30 (1H, m, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd, J=6,2;

13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,8 (C-1); 64,4 (C-3); 62,4 (C-4);

12,4 Hz, H-6aʺ); 3,53 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) .

141,8 (C-5); 117,0 (C-6); 126,7 (C-7); 105,2 (C-8); 157,2 (C-9); 147,0 (C-10);

121,0 (C-11); 127,3 (C-12); 130,3 (C-13); 114,4 (C-14); 19,5 (1-Me); 22,2 (3-Me);

56,9 (9-OMe); 105,2 (C-1′); 75,5 (C-2′); 74,7 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,3 (C-5′); 70,8

(C-6′); 103,8 (C-1ʺ); 74,7 (C-2ʺ); 77,3 (C-3ʺ); 71,2 (C-4ʺ); 77,3 (C-5ʺ); 62,4 (C-6ʺ).

Hợp chất EB-9 (9)

1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 5,1 (1H, q, J=6,8 Hz, H-1); 4,2 (1H,

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C28H38O15, ESI-MS m/z 615 [M+H]+.

m, H-3); 4,10 (1H, dd, J=11,0; 17,2 Hz, H-4); 8,24 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,37

(1H, t, J=8,0 Hz, H-7); 6,98 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 1,63 (1H, d, J=6,8 Hz, 1-Me);

1,06 (1H, d, J=6,2 Hz, 3-Me); 4,07 (1H, s, 9-OMe); 4,07 (1H, H-1′); 3,22 (1H, H-

2′); 3,30 (1H, H-3′); 3,25 (1H, H-4′); 3,29 (1H, H-5′); 3,30 (1H, dd, J=4,8; 11,7 Hz,

Hb-6′); 3,41 (1H, Ha-6′); 3,62 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 3,11 (1H, H-2ʺ); 3,16 (1H,

H-3ʺ); 3,22 (1H, H-4ʺ); 3,29 (1H, m, H-5ʺ); 3,30 (1H, dd, J=6,2; 12,4 Hz, H-6aʺ);

13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 69,9 (C-1); 67,0 (C-3); 62,6 (C-4);

3,33 (1H, dd, J=2,8; 12,4 Hz, H-6bʺ) .

144,0 (C-5); 117,7 (C-6); 127,0 (C-7); 106,2 (C-8); 157,6 (C-9); 148,0 (C-10);

120,8 (C-11); 128,0 (C-12); 130,4 (C-13); 116,2 (C-14); 17,8 (1-Me); 21,0 (3-Me);

56,9 (9-OMe); 106,2 (C-1′); 77,3 (C-2′); 75,0 (C-3′); 71,2 (C-4′); 77,8 (C-5′); 71,8

(C-6′); 104,2 (C-1ʺ); 75,4 (C-2ʺ); 77,6 (C-3ʺ); 71,6 (C-4ʺ); 77,7 (C-5ʺ); 62,6 (C-6ʺ).

Hợp chất EB-10 (10)

Dạng bột vô định hình màu trắng, C13H14O4, ESI-MS m/z 233 [M-H]¯ .

1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 2,52 (1H, dd, J=8,2; 16,5 Hz; Haq-2);

2,82 (1H, dd, J=3,4; 16,5 Hz, Heq-2); 4,22 (1H, m, H-3); 2,89 (1H, dd, J=7,5; 15,8

Hz, Haq-4); 3,14 (1H, dd, J=3,4; 15,8 Hz, Heq-4); 6,60 (1H, s, H-5); 2,40 (3H, s, 8-

13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 199,3 (C-1); 50,0 (C-2); 66,8 (C-3);

CH3); 2,42 (3H, s, 7-CH3).

40,4 (C-4); 114,7 (C-5); 158,8 (C-6); 132,2 (C-7); 140,4 (C-8); 124,9 (C-8a); 147,1

(C-4a); 19,2 (8-CH3); 208,4 (C=O); 32,6 (7-CH3).

Hợp chất EB-11 (11)

1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,05 (1H, q, J=6,6 Hz, H-1); 8,16

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C20H22O9, ESI-MS m/z 407 [M+H]+.

(1H, s, H-4); 7,60 (1H, d, J=8,3 Hz, H-5); 7,47 (1H, t, J=8,3 Hz, H-6); 7,11 (1H, d,

J=8,3 Hz, H-7); 1,70 (1H, d, J=6,6 Hz, 1-Me); 3,99 (1H, s, 8-Ome); 4,99 (1H, d,

J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (2H, H-2′, Ha-6′); 3,10 (1H, m, H-3′); 3,39 (1H, t, J=9,3 Hz,

H-4′); 3,47 (1H, t, J=9,3 Hz, H-5′); 3,68 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Hb-6′).

13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ

(ppm): 80,9 (C-1); 172,3 (C-3); 124,0 (C-

4); 123,7 (C-5); 128,4 (C-6); 109,8 (C-7); 157,4 (C-8); 147,9 (C-9); 140,7 (C-10);

125,9 (C-11); 139,3 (C-12); 124,0 (C-13); 19,4 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,2 (C-1′);

76,0 (C-2′); 77,8 (C-3′); 71,6 (C-4′); 78,3 (C-5′); 62,4 (C-6′).

Hợp chất EB-12 (12)

1H-NMR (500 MHz, MeOD), δ (ppm): 6,12 (1H, q, J=6,9 Hz, H-1); 8,15

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H32O14, ESI-MS m/z 569 [M+H]+.

(1H, s, H-4); 7,60 (1H, d, J=7,6 Hz, H-5); 7,46 (1H, t, J=7,6 Hz, H-6); 7,10 (1H, d,

J=7,6 Hz, H-7); 1,68 (1H, d, J=6,9 Hz, 1-Me); 3,98 (1H, s, 8-OMe); 4,98 (1H, d,

J=7,6 Hz, H-1′); 3,60 (1H, dd, J=7,6; 8,9 Hz, H-2′); 3,47 (1H, t, J=8,9 Hz, H-3′);

3,56 (1H, H-4′); 2,32 (1H, H-5′); 3,67 (1H, dd, J=4,9; 11,0 Hz, Hb-6′); 4,00 (1H, dd,

J=2,0; 11,0 Hz, Ha-6′); 4,16 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1ʺ); 3,12 (1H, dd, J=7,6; 8,3 Hz,

H-2ʺ); 3,25 (1H, H-3ʺ); 3,21 (1H, t, J=8,2 Hz, H-4ʺ); 3,17 (1H, H-5ʺ); 3,55 (1H, dd,

13C-NMR (125 MHz, MeOD), δ (ppm): 81,1 (C-1); 172,3 (C-3); 124,2 (C-4);

J=4,1; 11,7 Hz, Hb-6ʺ); 3,81 (1H, dd, J=2,1; 11,7 Hz, Ha-6ʺ).

109,8 (C-5); 128,4 (C-6); 123,7 (C-7); 157,5 (C-8); 147,8 (C-9); 140,8 (C-10);

126,0 (C-11); 139,3 (C-12); 124,1 (C-13); 19,2 (1-Me); 56,1 (8-OMe); 106,0 (C-1′);

76,2 (C-2′); 77,4 (C-3′); 71,1 (C-4′); 78,0 (C-5′); 69,0 (C-6′); 104,3 (C-1ʺ); 75,1 (C-

2ʺ); 76,6 (C-3ʺ); 71,7 (C-4ʺ); 78,0 (C-5ʺ); 62,9 (C-6ʺ).

Hợp chất EB-13 (13)

1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 5,33 (1H, q, J=6,2 Hz, H-1); 5,03

Dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, C26H34O14, ESI-MS m/z 571 [M+H]+.

(1H, d, J=13,1 Hz, Hb-3); 5,40 (1H, q, J=13,1 Hz, Ha-3); 8,03 (1H, d, J=8,2 Hz, H-

5); 7,31 (1H, t, J=8,2 Hz, H-6); 6,91 (1H, d, J=8,2 Hz, H-7); 1,45 (1H, d, J=6,2 Hz,

1-Me); 3,99 (1H, s, 8-OMe); 4,53 (1H, d, J=8,3 Hz, H-1′); 3,30 (2H, H-2′, H-5′);

3,08 (1H, m, H-3′); 3,20 (1H, H-4′); 3,56 (1H, dd, J=6,2; 11,0 Hz, Hb-6′); 3,95 (1H,

d, J=11,0 Hz, Ha-6′); 4,11 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1ʺ); 2,94 (1H, m, H-2ʺ); 3,01 (2H,

H-3ʺ, H-4ʺ); 3,20 (1H, H-5ʺ); 3,38 (1H, dd, J=4,8; 11,0 Hz, Hb-6ʺ); 3,62 (1H, dd,

13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 78,3 (C-1); 70.6 (C-3); 137,6 (C-4);

J=5,5; 11,0 Hz, Ha-6ʺ).

115,7 (C-5); 125,8 (C-6); 104,6 (C-7); 156,2 (C-8); 143,8 (C-9); 124,8 (C-10);

130,9 (C-11); 130,4 (C-12); 114,9 (C-13); 20,1 (1-Me); 56,2 (8-OMe); 104,6 (C-1′);

73,8 (C-2′); 76,6 (C-3′); 69,9 (C-4′); 75,2 (C-5′); 68,7 (C-6′); 103,2 (C-1ʺ); 73,5 (C-

2ʺ); 76,8 (C-3ʺ); 69,9 (C-4ʺ); 76,3 (C-5ʺ); 61,0 (C-6ʺ).

Hợp chất EB-14 (14)

1H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,61 (3H, s, 8-CH3); 6,40 (1H, d, J=2,7

Chất bột màu trắng, mp.>3100C, C15H10O5, ESI-MS m/z 271 [M+H]+.

Hz, H-2); 6,94 (1H, d, J=2,7 Hz, H-4); 6,80 (1H, d, J=2,7 Hz, H-7); 7,31 (1H, d,

13C-NMR (125 MHz, DMSO), δ (ppm): 166,2 (C-1); 109,3 (C-2); 165,3 (C-3);

J=2,7 Hz, H-5);

108,2 (C-4); 113,3 (C-5); 163,0 (C-6); 125,6 (C-7); 146,6 (C-8); 189,5 (C-9); 184,1

(C-10); 111,6 (C-9a); 135,8 (C-4a); 138,3 (C-10a); 124,3 (C-8a); 24,2 (8-CH3).

3.2.2 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết từ loài sâm đại hành

Các cặn chiết metanol (EB-Me), hexan (EB-Hx), etyl axetat (EB-Et) và cặn

nước (EB-W) của củ sâm đại hành được đánh giá hoạt tính kháng viêm sơ bộ theo

các bước sau:

3.2.2.1 Xác định khả năng kháng viêm của các cặn chiết theo đường bôi

a. Động vật thí nghiệm:

60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, có khối lượng từ 25- 30g, được nuôi tại khu

nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, chia làm 10 lô (6 chuột/lô). Trong đó 8

lô xác định hoạt tính của 8 dịch chiết, lô 9 đối chứng chuẩn (bôi Dexamethasone) và

lô 10 đối chứng âm (chỉ bôi acetone là dung môi hòa tan mẫu). Từ lô 1 đến lô 9

được gây viêm bằng cách bôi EPP vào cả 2 tai của chuột.

b. Gây viêm cục bộ bằng hoạt chất EPP

Phương pháp gây viêm được tiến hành theo phương pháp của Mrudula Kale

(2007), Jaijoy K (2010). Bôi vào mỗi tai chuột một lượng EPP là 1 mg/1 tai chuột

pha trong 20µl acetone.

c. Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường bôi

Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo

phương pháp của Jaijoy K (2010). Cách tiến hành:

- Bôi 1 gam EPP (pha với 20 µl acetone)/1 tai vào cả 2 tai.

- Bôi chất cần kiểm tra hoạt tính kháng viêm ở nồng độ 3 mg/tai vào một tai.

- Tai kia bôi acetone làm đối chứng 20 µl/tai.

- Dùng Dexamethasome 0,1 mg/tai trong 20 µl acetone (Sigma-Aldrich) làm

đối chứng chuẩn.

- Sau 45 phút gây viêm tiến hành cắt tai chuột, cân trọng lượng tai và tính

phần trăm ức chế khối viêm theo phương pháp của Delporte el al (2002)

(2005).

Phần trăm ức chế = 100 *(1 – (Ws-Wa)/(Wc-Wa))

Trong đó: Wc: trọng lượng của tai đối chứng chỉ bôi EPP

Ws: trọng lượng tai có bôi EPP và thử chất

Wa: trọng lượng tai bình thường, không bôi EPP và không thử chất

3.2.2.2 Xác định khả năng kháng viêm của các cặn chiết theo đường uống

a. Động vật thí nghiệm: 60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, có khối lượng từ 25- 30g,

được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học, được chia làm 10 lô

(6 chuột/lô), 8 lô xác định hoạt tính của 8 dịch chiết, lô 9 đối chứng chuẩn (cho

uống Indomethacine) và lô 10 đối chứng âm (chỉ uống dung môi hòa tan mẫu, là

dung dịch sinh lý). Cả 10 lô đều được gây viêm bằng cách tiêm Fomalin 1% vào

một gan bàn chân chuột.

b. Gây viêm cục bộ bằng Fomalin 1%

Phương pháp gây viêm được tiến hành theo phương pháp của Miklos Gabor

(2009): Tiêm dưới da gan bàn chân chuột 20 µl fomalin 1 % pha trong PBS.

c. Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất theo đường uống

Xác định khả năng kháng viêm của một hoạt chất được tiến hành theo phương

pháp của Miklos Gabor (2009). Theo đó, chuột uống hoạt chất ở nồng độ 60

mg/kgP. Sau 60 phút tiến hành tiêm dưới da gan bàn chân chuột 20 µl Fomalin 1 %

pha trong dung dịch PBS và theo dõi biểu hiện của chuột. Sau 5 giờ kể từ khi tiêm

fomalin thì tiến hành cắt cả bàn chân chuột, cân khối lượng để tính toán. Trong thí

nghiệm, indomethacine được dùng làm đối chứng chuẩn và cho uống ở nồng độ 60

mg/kgP. Phần trăm ức chế khối viêm theo phương pháp của Delporte el al (2005)

như sau:

Phần trăm ức chế = 100 *(1 – (Ws1-Ws2)/(Wc1-Wc2))

Trong đó:

- Ws1: trọng lượng chân tiêm fomalin 1% của những con thử chất

- Ws2: trọng lượng chân không tiêm fomalin 1% của những con thử chất

- Wc1: trọng lượng chân tiêm fomalin 1% của những con không thử chất

- Wc2: trọng lượng chân không tiêm fomalin 1% của những con không thử

chất.

3.2.3 Nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua

DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân lập

được từ cây sâm đại hành

Động vật thí nghiệm: chuột không thuần chủng C57BL/6 được cung cấp từ

Viện Công nghệ sinh học Hàn Quốc.

- Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại

hành đến khả năng sống sót của tế bào bằng phương pháp MTT: Bổ sung 20 µl

MTT (nồng độ 5mg/ml, trong đệm muối natri phosphate) vào mỗi giếng tế bào thử

nghiệm. Tiếp tục ủ trong tủ nuôi cấy duy trì nhiệt độ 37°C, không khí có chứa 10%

CO2. Sau 2 giờ, hút loại bỏ môi trường, thêm vào 50µl DMSO vào mỗi giếng để

hòa tan tinh thể. Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 550 nm bằng máy ELISA.

Chỉ tiêu đánh giá: tỷ lệ tế bào sống sót sau nuôi cấy 24 giờ.

- Tuỷ xương được lấy từ xương ống và xương đùi của chuột bằng cách

nhuộm màu với DMEM và được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có chứa

10% FBS (fetal bovine serum) (Gibco, NY, USA), 50 µM 2-ME và 2mM glutamine

bổ sung 3% J558L dịch tế bào nuôi cấy chứa bạch cầu hạt của đại thực bào GM-

CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating). Sau 6 ngày thu được các tế bào

tua DC rồi đưa vào môi trường RPMI đã bổ sung 5% FBS.

- Các tế bào tua DCs được ủ trong đĩa 48 giếng ở nồng độ là 2.105 tế bào/ml,

rồi được xử lý với các hợp chất ở nồng độ 25 µM trong 1 giờ trước khi kích thích

với 10 ng/ml LPS từ Salmonella minnesota (Alexis, NY, USA).

- Các hợp chất thể hiện hoạt tính sau đó được thử nghiệm tiếp ở các nồng độ

50,0, 25,0, 12,5 và 6,3 µM, dịch huyền phù được thu hoạch sau 16 giờ kích thích.

- Nồng độ murine IL-12p40, IL-6 và TNF-α trong dịch nuôi cấy được phát

hiện bằng máy ELISA (BD PharMingen, CA, USA).

Đối chứng dương là SB203580 ức chế sự sản sinh các cytokine IL-12p40,

IL-6 và TNF-α với giá trị tương ứng là 5,2±0,1, 3,5±0,2 và 7,5±0,2 µg/ml.

3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN RỄ LOÀI XẠ

CAN VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TECTORIGENIN PHÂN LẬP

ĐƯỢC TỪ LOÀI NÀY

3.3.1 Nghiên cứu thành phần hoá học

3.3.1.1 Quy trình phân lập

a. Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat

Cặn etyl axetat BS/Et (15gam) được tiến hành phân lập trên sắc ký cột với chất

hấp phụ là silica gel, hệ dung môi CHCl3 –MeOH (99:1 tới 50:50) cho 7 phân đoạn

chính (F1 đến F7). Phân đoạn F1 (1,5 gam) được tiếp tục phân tách trên sắc ký cột

thường, hệ dung môi n-Hexan: EtOAc (10:1, v/v) thu được chất BS-13 (5 mg) và

chất BS-14 (15 mg). Chất BS-2 (480 mg) thu được từ phân đoạn F4 bằng cách kết

tinh lại trong MeOH. Phân đoạn F3 (2,5gam) cũng được phân tách trên sắc ký cột

thường với hệ dung môi CHCl3-MeOH (20:1, v/v) cho 3 phân đoạn nhỏ (F3.1 đến

F3.3). Hợp chất BS-1 (8 mg) thu được từ phân đoạn F3.1 bằng sắc ký cột thường

với hệ dung môi CHCl3-MeOH (15:1). Hợp chất BS-5 (9 mg) thu được từ phân

đoạn F3.3 bằng cách kết tinh lại trong MeOH. Phân đoạn F5 được tiếp tục phân

tách bằng sắc kí cột, chất hấp phụ silica gel, hệ dung môi CHCl3-MeOH (20:1) thu

được 3 phân đoạn chính (F5.1 đến F5.3). Phân đoạn F5.2 được tiếp tục cho qua cột

sắc kí pha thường, hệ dung môi CHCl3-MeOH (15:1) thu được phân đoạn F5.2.1 và

hợp chất BS-4 (8 mg). Chất BS-3 (20 mg)thu được từ phân đoạn F5.2.1 bằng sắc kí

lớp mỏng điều chế pha đảo, hệ dung môi MeOH: H2O (7:3). Chất BS-6 (10 mg) và

chất BS-9 (42 mg) thu được từ phân đoạn F6 sau khi chạy qua cột pha đảo RP 18,

hệ dung môi MeOH: H2O (4:6). Chất BS-8 (12 mg) và chất BS-7 (5 mg) thu được

từ phân đoạn F7 bằng sắc kí cột pha đảo RP 18, hệ dung môi MeOH: H2O (1:1) và

sắc kí lớp mỏng điều chế RP 18, hệ MeOH: H2O (6:4).

Cặn BS-EtOAc

SKC, SiO2, gradient

CHCl3:MeOH (99:1 -50:50)

F1

F6

F7

F2

F4

F5

F3

SKC, SiO2,

HX:EtOAC 10:1

SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (20:1)

BS-2 (480 mg)

BS-14 ( 15 mg)

F5.3

F3.1

F3.2

F3.3

F5.1

F5.2

BS-13 (5 mg)

SKC, SiO2 CHCl3:MeOH (15:1)

SKC CHCl3:MeOH(15:1)

Kết tinh lại MeOH

F5.2.1

BS-5 (9 mg)

BS-1 (8 mg)

BS-4 (8 mg)

SKLMĐC MeOH:H2O (7:3)

BS-3 (20mg)

SKC, RP18 MeOH:H2O (4:6)

1.SKC, RP18, MeOH:H2O (1:1) 2.SKLMĐC, RP18, MeOH:H2O (6:4)

F7.1

F7.2

F7.3

F7 F6

BS-9 (42 mg)

BS-6 (10 mg)

BS-8 (12 mg)

BS-7 (5 mg)

Hình 3.4 Sơ đồ phần lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat cây xạ can

b. Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước

Cặn nước BS/W (4,7 gam) được tiến hành phân tách bằng sắc kí cột thường, hệ

dung môi CH2Cl2: MeOH (4:1) thu được 5 phân đoạn chính (E1 đến E5). Hợp chất

BS-11 (12 mg) và hợp chất BS-12 (11 mg) thu được từ phân đoạn E2 bằng sắc kí

cột thường với hệ dung môi CHCl3: MeOH: H2O (80:18:2). Phân đoạn E4 được tiến

hành sắc kí cột pha đảo RP 18, hệ dung môi MeOH: H2O (7:3) thu được 3 phân

đoạn chính (E4.1 đến E4.3). Hợp chất BS-10 (7 mg) nhận được từ phân đoạn E4.2

bằng sắc kí lớp mỏng điều chế pha đảo hệ MeOH: H2O (5:5).

SK cột, CH2Cl2 : MeOH (4:1)

Cặn BS/W (4,7gam)

E5

E2

E4

E3

SK cột

SK cột RP 18 MeOH: H2O (7:3)

CHCl3: MeOH : H2O (80:18:2)

E4.2

E4.3

E4.1

BS-12 (11 mg)

SKLMĐC RP 18 MeOH: H2O (5:5)

BS-11 (12 mg)

BS-10 (7 mg)

Hình 3.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước cây xạ can

3.3.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ cây xạ

can

Hợp chất BS-1 (15)

1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 7,77 (1H, s, H-2); 6,56 (1H, s, H-8); 6,67

Chất màu vàng nhạt, mp. 168-169oC, C20H18O8, ESI-MS m/z 385 [M-H]¯ .

13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,0 (OCH3-3′, 5′); 60,6 (OCH3-4′); 60,9

(2H, s, H-2′, H-6′); 5,99 (2H, s, -O-CH2-O-); 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3′, 5′), và 3,77 (3H, s, OCH3-4′).

(OCH3-5); 92,9 (C-8); 102,1 (-O-CH2-O-); 106,6 (C-2′, 6′); 113,4 (C-10); 125,4 (C-

3); 127,3 (C-1′); 135,2 (C-6); 137,9 (C-4′); 141,5 (C-5); 150,8 (C-2); 152,8 (C-3′,

5′); 152,9 (C-7); 154,5 (C-9); và 175,3 (C-4).

Hợp chất BS-2 (16)

1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,87 (3H, s, OCH3-6); 6,41 (1H, s, H-8); 6,84 (2H, dd, J=8,5; 1,5 Hz, H-3′, 5′); 7,35 (2H, dd, J=8,5; 1,5Hz, H-2′, 6′); và 7,99

Tinh thể màu vàng, mp. 235 - 236oC, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]¯

13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C- 10); 116,2 (C-2′,6′); 123,1 (C-3); 124,1 (C-1′); 131,3 (C-3′, 5′); 132,7 (C-6); 154,4

(1H, s, H-2).

(C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9); 158,6 (C-4′); và 182,4 (C-4).

Hợp chất BS-3 (17)

1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 3,90 (3H, s,

Tinh thể màu vàng nhạt, mp. 237-238°C, C17H14O7, ESI-MS m/z 329 [M-H]¯ .

OCH3-3′); 6,46 (1H, s, H-8); 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-2′); 6,96 (1H, dd, J=8,0; 2,0

13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 56,4 (OCH3-3′); 60,9 (OCH3-6); 94,9

Hz, H-6′); 7,14 (1H, J=2,0 Hz, H-5′); và 8,06 (1H, s, H-2).

(C-8); 106,6 (C-10); 113,8 (C-5′); 116,1 (C-2′); 122,7 (C-6′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-

1′); 132,7 (C-6); 147,7 (C-4′); 148,6 (C-3′); 154,4 (C-5); 154,7 (C-7); 154,8 (C-2);

158,6 (C-9); và 182,4 (C-4).

Hợp chất BS-4 (18)

Bột màu vàng, mp. 184-185°C, C18H16O8, ESI-MS m/z 359 [M-H]¯ .

1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ: (ppm) 3,88 (3H, s, OCH3-4′); 3,89 (3H, s,

OCH3-5′); 3,94 (3H, s, OCH3-6); 6,48 (1H, s, H-8); 6,68 (2H, dd, J=6,0; 2,0 Hz, H-

13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 55,7 (OCH3-6); 60,3 (OCH3-4′); 60,4

2′, 6′); và 7,90 (1H, s, H-2).

(OCH3-5′); 93,9 (C-8); 104,9 (C-10); 105,7 (C-2′); 109,4 (C-6′); 122,9 (C-3); 126,4

(C-1′); 131,2 (C-6); 136,2 (C-4′); 149,8 (C-3′); 152,7 (C-5′); 152,8 (C-5); 153,2 (C-

9); 153,3 (C-2); 156,7 (C-7); và 180,7 (C-4).

Hợp chất BS-5 (19)

1H-NMR (CDCl3) δ (ppm): 2,56 (3H, s, CH3-8); 3,96 (3H, d, J=7,5 Hz, OCH3-

Bột màu trắng, mp. 1130C, C9H10O3, ESI-MS m/z 167 [M+H]+.

9); 6,06 (1H, s, OH); 6,94 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6); 7,54 (1H, dd, J=1,8; 8,0 Hz, H-

13C-NMR (CDCl3) δ (ppm): 196,7 (C=O); 130,3 (C-2); 124,1 (C-3); 146,6 (C-4);

7); và 7,53 (1H, d, J=1,8 Hz, H-3).

150,4 (C-5); 113,8 (C-6); 109,8 (C-7); 26,17 (CH3-8) và 56,12 (CH3-9).

Hợp chất BS-6 (20)

1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3); 6,54 (1H, s, H-8);

Tinh thể màu vàng, mp.221-223°C, C16H12O6, ESI-MS m/z 299 [M-H]+.

6,56 (1H, s, H-6); 6,93 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3′, 5′); và 7,82 (2H, d, J=9,0 Hz, H-2′,

13C-NMR (CD3OD) δ (ppm): 60,9 (OCH3-7); 92,1 (C-8); 104,3 (C-10); 115,6 (C- 3′,5′); 135,6 (C-3); 121,8 (C-1′); 129,5 (C-2’, 6’); 97,6 (C-6); 160,3 (C-5); 164,8 (C- 7); 147,4 (C-2); 156,3 (C-9); 159,5 (C-4′); và 176,8 (C-4).

6′).

Hợp chất BS-7 (21)

1H-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 3,89 (3H, s, OCH3-6); 6,46 (1H, s, H-8); 6,85 (2H, d, J=2,0 Hz, H-2′, 6′), 7,02 (1H, d, J=,5 Hz, H-5′), và 8,01 (1H, s, H-2).

13C-NMR (CD3OD và CDCl3) δ (ppm): 60,9 (OCH3-6); 94,9 (C-8); 106,6 (C-10);

Chất bột vô định hình màu vàng, C16H12O7, ESI-MS m/z 315 [M-H]+.

116,2 (C-2′); 117,3 (C-5′); 121,6 (C-1′); 123,5 (C-3); 124,2 (C-6′); 132,6 (C-6);

146,0 (C-3′); 146,5 (C-4′); 154,4 (C-5); 154,6 (C-7); 154,8 (C-2); 158,5 (C-9) và

182,4 (C-4).

Hợp chất BS-8 (22)

1H-NMR (500MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 0,77 (3H, s, CH3-18); 0,81 (3H,

Dạng bột màu trắng, mp. 285-286oC, C35H60O6, ESI-MS m/z 575 [M-H]¯ .

d, J=7,0 Hz, CH3-27); 0,82 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-

29); 0,90 (3H, d, J=6,0 Hz, CH3-21); 0,96 (3H, s, CH3-19); 3,46 (1H, m, H-3); 5,33

(1H, d, J=5,0 Hz, H-6); 2,90 (1H, m, H-2′-glc); 3,02 (1H, m, H-4′-glc); 3,07 (1H, m,

H-5′-glc); 3,12 (1H, m, H-3′-glc); 3,41 (1H, m, H-6′a-glc); 3,65 (1H, m, H-6′b-glc);

4,22 (1H, d, J=7,0 Hz, H-1′-glc); 4,39 (1H, t, J=6,0 Hz, OH-6′-glc); 4,82 (1H, d,

J=2,0 Hz, OH-4′-glc); 4,83 (1H, d, J=2,0 Hz, OH-2′-glc) và 4,85 (1H, d, J=5 Hz,

13C-NMR (125MHz, DMSO-d6, TMS) δ (ppm): 11,7 (CH3-18); 19,0 (CH3-27);

OH-3′-glc).

19,7 (CH3-26); 11,73 (CH3-29); 18,6 (CH3-21); 18,90 (CH3-19); 20,6 (C-11); 22,6

(C-28); 23,2 (C-15); 25,4 (C-23); 27,7 (C-16); 28,7 (C-25); 29,2 (C-2); 31,3 (C-7);

31,4 (C-8); 33,3 (C-22); 35,4 (C-20); 36,2 (C-10); 36,8 (C-1); 38,3 (C-4); 39,2 (C-

12); 41,8 (C-13); 45,1 (C-24); 49,6 (C-9); 55,4 (C-17); 56,1 (C-14); 76,9 (C-3);

121,1 (C-6); 140,4 (C-5); 60,1 (C-6′-glc); 70,1 (C-4′-glc); 73,3 (C-2′-glc); 76,4 (C-

3′-glc); 76,7 (C-5′-glc); 100,7 (C-1′-glc).

Hợp chất BS-9 (23)

1H-NMR (500 MHz, DMSO) δ (ppm): 8,43 (1H, s, H-2), 7,40 (2H, d, J=8,5 Hz,

Dạng bột màu trắng, mp. 256-257oC, C22H22O11, ESI-MS m/z 463 [M+H]+

H-2′, H-6′), 6,83 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,88 (1H, s, H-8), 5,08 (1H, d, J=7,5

Hz, H-1ʺ), 3,73 (1H, d, J=7,5 Hz, Ha-6ʺ), 3,45 (1H, d, J=10,5 Hz, Hb-6ʺ), 3,36 (1H,

m, H-2ʺ), 3,34 (1H, m, H-3ʺ), 3,19 (1H, m, H-4ʺ), 3,44 (1H, m, H-5ʺ), 3,80 (3H, s,

13C-NMR (125 MHz, DMSO) δ (ppm): 154,6 (C-2), 121,09 (C-3), 180,7 (C-4),

OCH3).

152,8 (C-5), 132,4 (C-6), 156,5 (C-7), 94,0 (C-8), 152,4 (C- 9), 106,44 (C-10),

122,04 (C-1′), 130,11 (C-2′, 6′), 115,05 (C-3′, 5′), 157,40 (C-4′), 100,17 (C-1ʺ),

73,11 (C-2ʺ), 76,67 (C-3ʺ), 69,64 (C-4ʺ), 77,26 (C-5ʺ), 60,64 (C-6ʺ), 60,24 (OCH3).

Hợp chất BS-10 (24)

Dạng bột vô định hình màu vàng, C22H22O11, ESI-MS m/z 485 [M+Na]+

1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 3,75 (3H, s, 6-OCH3), 6,87 (1H, s, H-8),

6,83 (2H, dd, J=8,0; 1,5 Hz, H-3′, 5′), 7,38 (2H, dd, J=8,0; 1,5 Hz, H-2′, 6′), 8,43

(1H, s, H-2), 5,45 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″), 3,32 (m, H-2″), 3,41 (m, H-3″), 3,34 (m,

(ppm): 154,7 (C-2), 121,0 (C-3), 180,8 (C-4),

13C-NMR (125 MHz, DMSO) δC

H-4″), 3,38 (m, H-5″), 3,44 (m, Ha-6″) và 3,65 (m, Hb-6″).

152,9 (C-5), 132,5 (C-6), 157,5 (C-7), 94,1 (C-8), 152,5 (C-9), 106,5 (C-10), 122,1

(C-1′), 130,2 (C-2′), 115,1 (C-3′), 156,6 (C-4′), 115,1 (C-5′), 130,2 (C-6′), 100,2 (C-

1″), 73,3 (C-2″), 76,7 (C-3″), 69,7 (C-4″), 77,3 (C-5″), 60,7 (C-6″), 60,3 (OCH3 -6).

Hợp chất BS-11 (25)

1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH (ppm): 5,45 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″), 6,20 (1H,

Dạng bột vô định hình màu vàng, C21H20O11, ESI-MS m/z 471 [M+Na]+

d, J=2,0 Hz, H-6), 6,43 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 6,88 (2H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-3′,

13C- NMR (125 MHz, DMSO) δC (ppm): 158,5 (C-2), 135,3 (C-3), 179,5 (C-4),

H-5′) và 8,03 (2H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-2′, H-6′).

163,0 (C-5), 99,9 (C-6), 165,9 (C-7), 94,8 (C-8), 159,0 (C-9), 105,7 (C-10), 122,7

(C-1′), 132,3 (C-2′), 116,1 (C-3′), 161,5 (C-4′), 116,1 (C-5′), 132,3 (C-6′), 104,1 (C-

1″), 75,7 (C-2″), 78,0 (C-3″), 71,3 (C-4″), 78.0 (C-5″), 62,6 (C-6″).

Hợp chất BS-12 (26)

1H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 5,23 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″), 6,15 (1H,

Dạng bột màu vàng, mp. 240-242oC C21H20O12, ESI-MS m/z 487 [M+Na]+

d, J=2,0 Hz, H-6), 6,35 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5′), 7,71

13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm): 158,4 (C-2), 135,6 (C-3), 179,4 (C-4),

(1H, d, J=2,0 Hz, H-2′) và 7,56 (1H, d, J=2,0; 8,0 Hz, H-6′).

162,9 (C-5), 100,0 (C-6), 166,4 (C-7), 94,8 (C-8), 158,8 (C-9), 104,3 (C-10), 123,2

(C-1′), 115,9 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,9 (C-4′), 117,5 (C-5′), 123,0 (C-6′), 104,4 (C-

1″), 75,7 (C-2″), 78,3 (C-3″), 71,1 (C-4″), 78,0 (C-5″), 62,5 (C-6″).

Hợp chất BS-13 (27)

1H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH ppm: 3,51 (1H, tt, J=11,0; 5,0, H-3), 5,35 (1H,

Bột vô định hình màu trắng, C29H48O, ESI-MS m/z 412 [M+Na]+

brs, H-6), 0,70 (3H, s, H-19), 5,13 (1H, m, H-20), 5,35 (1H, m, H-21), 0,83 (3H, t,

J=6,0, H-24), 0,79 (3H, d, J=7,0, H-26), 0,82 (3H, d, J=6,5, H-27), 0,80 (3H, d,

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 11,2 (C-24), 11,7 (C-21), 18,4 (C-26),

J=6,0, H-28), 1,03 (3H, s, J=`6,0, H-29).

18,8 (C-27), 20,4 (C-18), 20,5 (C-19), 20,6 (C-11), 23,7 (C-16), 24,8 (C-15), 28,3

(C-24), 31,0 (C-20), 31,2 (C-8), 31,3 (C-7), 35,9 (C-25), 36,7 (C-12), 39,0 (C-1),

39,4 (C-2), 40,0 (C-10), 41,5 (C-13), 41,7 (C-24), 49,5 (C-9), 50,6 (C-4), 55,2 (C-

14), 56,2 (C-17), 70,5 (C-3), 120,6 (C-6), 128,5 (C-22), 137,7 (C-23), 140,4 (C-5).

Hợp chất BS-14 (28)

1H -NMR (500 MHz, CD3OD) δH ppm: 0,89 (t, H-1), 1,26 (m, H-2, 3, 4, 5, 6, 7,

Chất bột màu trắng, mp. 53-54oC, C14H28O2, EI-MS m/z 228 [M]+.

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC ppm: 180,62 (C-1), 34,20 (C-2), 24,74 (C-3), 29,72 (C-4), 29,42 (C-5), 29,49 (C-6, 7, 8, 9, 10), 29,31 (C-11), 31,99 (C-12), 22,74

8, 9, 10, 11), 1,64 (m, H-12), 2,36 (t, H-13).

(C-13), 14,12 (C-14).

3.3.2 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết từ thân rễ xạ can

Các cặn chiết metanol (BS-Me), hexan (BS-Hx), etyl axetat (BS-Et) và cặn

nước (BS-W) của thân rễ xạ can được đánh giá hoạt tính kháng viêm sơ bộ tương tự

như của cặn chiết củ sâm đại hành (mục 3.2.2).

3.3.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigienin phân lập

được từ thân rễ xạ can

3.3.3.1 Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau in vivo của tectorigienin

* Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoảng 4-5 tuần tuổi cả 2 giống, khoẻ mạnh, có

trọng lượng 18 - 22g. Chuột cống trắng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 180 –

200 g, do Học viện Quân Y cung cấp. Động vật phải chưa được dùng vào bất kỳ

một thí nghiệm nào trước đó, đạt tiêu chuẩn thử nghiệm, được nuôi tại phòng thí

nghiệm của Bộ môn Dược lý Trường Đại học Dược, Hà Nội bằng thức ăn chuẩn do

viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp, cho uống nước tự do.

a. Nghiên cứu tác dụng giảm đau theo phương pháp gây đau bằng acid acetic (Koster)

Chuột nhắt được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô 1 (chứng trắng): uống dung môi pha thuốc NaCMC 1%

- Lô 2 (chứng dương): uống aspirin với liều 240 mg/kg

- Lô 3 (uống thuốc thử liều 1): uống tectorigenin với liều 50 mg/kg

- Lô 4 (uống thuốc thử liều 2): uống tectorigenin với liều 100 mg/kg

- Lô 5 (uống thuốc thử liều 3): uống tectorigenin với liều 200 mg/kg

Cho chuột uống thuốc thử, 30 phút sau tiêm vào màng bụng mỗi chuột 0,1 ml

acid acetic 1%. Đếm số cơn đau quặn trong từng khoảng thời gian 5 phút một, kể từ

ngay sau khi tiêm acid acetic và theo dõi trong vòng 30 phút. Biểu hiện của cơn đau

quặn là cơ bụng co lại và chi sau duỗi thẳng.

Cách tính kết quả : Sc– St

X ( % ) = × 100 Trong đó: Sc: số cơn đau của lô chứng trắng

St: số cơn đau của lô thử thuốc X: tỷ lệ giảm đau

Sơ đồ nghiên cứu:

30 phút Ghi lại số cơn đau quặn trong 30 phút

Cho chuột uống thuốc Tiêm màng bụng acid acetic 1%

Hình 3.6 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigenin trên mô hình giảm đau quặn

b. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin trên mô hình gây phù

thực nghiệm bằng carrageenin:

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con.

- Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%

- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10mg/kg P

- Lô 3 (lô thử): uống tectorigenin với liều 60 mg/kg P

Chuột được uống thuốc hai lần, lần thứ nhất một ngày trước khi gây viêm, lần

thứ hai trước khi gây viêm 1 giờ. Tiến hành gây viêm bằng cách tiêm 0,1 ml

carrageenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) vào gan bàn chân sau, chân bên phải

của chuột.

Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng máy đo thể tích chân chuột

vào các thời điểm: trước khi gây viêm, sau khi gây viêm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 7

giờ, 24 giờ.

Sơ đồ nghiên cứu:

Đo thể tích chân chuột

Uống Gây 1 giờ 2 giờ 4 giờ 5 giờ 7 giờ 24 giờ

thuốc viêm

Hình 3.7 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin trên mô hình

gây viêm bằng carrageenin

Kết quả được tính toán theo công thức của Fontaine.

- Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:

Vt – V0

∆V ( %) = × 100 Trong đó: V0 : thể tích chân chuột trước khi gây viêm

Vt : thể tích chân chuột sau khi gây viêm

∆V: độ tăng thể tích chân chuột

- Tác dụng chống viêm cấp của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù:

∆Vc%–∆Vt% I (%) = × 100

∆Vc %

Trong đó: ∆Vc%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô chứng (%)

∆Vt%: giá trị trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô thử (%)

c. Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigenin trên chuột cống gây u

hạt thực nghiệm:

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 con.

Gây viêm mạn bằng cấy viên sợi amian (30±1mg/con chuột) đã được tiệt trùng

(ở 1200C trong 2 giờ) vào dưới da hai bên lưng chuột.

Sau khi cấy u hạt, cho chuột uống liên tục 7 ngày:

- Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%

- Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon với liều 5mg/kg

- Lô 4 (lô thuốc thử): uống tectorigenin với liều 60mg/kg

Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột bằng ether, bóc tách u hạt, cân khối lượng ướt của hạt rồi đem sấy ở 600C đến khối lượng không đổi (khoảng 18 giờ). Đem cân u

hạt tính khối lượng khô.

Tác dụng chống viêm được tính theo công thức (Okoli et al., 2007) [15]:

Tc― Tt I% = × 100

Tc Trong đó: Tc: trọng lượng khối u hạt lô chứng trắng

Tt: trọng lượng khối u hạt lô thử I: tỷ lệ ức chế u hạt

Sơ đồ nghiên cứu:

Uống thuốc liên tục trong 7 ngày

Gây viêm và uống thuốc Mổ chuột, cân u hạt

Hình 3.8 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng

amian

3.3.3.2 Nghiên cứu độ an toàn của tectorigenin

Được tiến hành tại bộ môn dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc TW.

a. Đánh giá độc tính cấp tính của tectorigenin

Chuẩn bị mẫu thử:

* Thử sơ bộ:

- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: Dùng hỗn dịch có chứa khoảng 0,1 g mẫu thử/ml

nước cất (hỗn dịch A).

- Thăm dò ở mức liều không làm chết chuột thí nghiệm:

Cho 10 chuột uống hỗn dịch A, mỗi chuột 0,2ml (tương đương mức liều 1,0g

mẫu thử/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi không có chuột thí nghiệm bị chết.

- Thăm dò mức liều làm chết 100% số chuột thí nghiệm:

Cho 10 chuột uống hỗn dịch A, mỗi chuột 0,6 ml (tương đương mức liều

3,0g mẫu thử/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi 100% chuột thí nghiệm bị chết.

* Thử nghiệm chính thức:

- Các mức liều thử nghiệm:

Mức liều 1: 1,0 g mẫu thử/kg chuột

Mức liều 2: 1,5 g mẫu thử/kg chuột

Mức liều 3: 2,0 g mẫu thử/kg chuột

Mức liều 4: 2,5 g mẫu thử/kg chuột

Mức liều 5: 3,0 g mẫu thử/kg chuột

- Cách xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử:

Cân chính xác một lượng mẫu thử, nghiền mịn, sau đó cho từ từ nước cất để

nghiền thành hỗn dịch đồng nhất. Thêm nước cất vừa đủ để thu được hỗn dịch chứa

0,1g mẫu thử/ ml nước cất (hỗn dịch thử).

Cách tiến hành:

- Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu. Kiểm

tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng được đưa vào

thử nghiệm.

- Cách dùng: Đưa mẫu thử dưới dạng hỗn dịch theo đường uống. Lấy thể tích mẫu

thử theo quy định đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.

- Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính

thức trên 50 chuột, chia thành 5 nhóm thử theo mức liều đã dự tính. Các nhóm thử

được uống hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần đưa mẫu thử như sau:

Bảng 3.1 Các nhóm thử uống hỗn dịch ở các liều khác nhau

Liều dùng Liều dùng Số chuột Nhóm chuột (ml hỗn dịch thử / chuột) (g mẫu thử / kg chuột) thí nghiệm

Mức liều 1 0,2 ml hd thử 1,0 g mẫu thử/ kg chuột 10

Mức liều 2

0,3 ml hd thử 1,5 g mẫu thử/ kg chuột 10

Mức liều 3 0,4 ml hd thử 2,0 g mẫu thử/ kg chuột 10

Mức liều 4 0,5 ml hd thử 2,5 g mẫu thử/ kg chuột 10

Mức liều 5 0,6 ml hd thử 3,0 g mẫu thử/ kg chuột 10

- Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống trong 24 giờ đầu và theo

dõi hoạt động của động vật thử nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi uống.

Theo dõi:

-Tiêu thụ thức ăn và uống của chuột:

Sau khi uống hỗn dịch thử ở mức liều 1 không nhận thấy biểu hiện ngộ độc.

Ở mức liều 2, 3, 4 và 5, sau khi uống hỗn dịch thử, chuột có biểu hiện thở gấp, co

giật và một số chuột chết trong khoảng 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24 giờ và 48

giờ.

Số chuột sống sót sau khi cho uống 48 giờ ở các nhóm đều ăn uống, hoạt

động bình thường, không nhận thấy còn biểu hiện ngộ độc.

-Quan sát dấu hiệu ngộ độc:

Sau khi uống hỗn dịch thử ở các mức liều 2, 3, 4 và 5, chuột có biểu hiện

nằm mệt, thở gấp, co giật, một số chuột chết trong khoảng 1-2 giờ, một số chuột

chết sau 24 giờ và 48 giờ. Chuột ở mức liều 1 không nhận thấy có biểu hiện ngộ

độc.

b. Đánh giá độc tính bán trường diễn

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương pháp của

OECD (2005).

Chuột nhắt trắng được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô 1 (lô chứng): cho uống dung môi pha thuốc NaCMC (Sodium

carboxymethyl cellulose) 1%.

- Lô 2 (lô thử 1): uống tectorigenin với liều 100 mg/kg cân nặng/ngày.

- Lô 3 (lô thử 2): uống tectorigenin với liều 300 mg/kg cân nặng/ngày.

Thuốc được pha để đảm bảo thể tích cho uống đồng đều ở tất cả các lô

(0,1ml/kg cân nặng/ngày).

Chuột nhắt trắng được cho uống dung dịch NaCMC 1% hoặc tectorigenin

hàng ngày vào 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày. Tại 3 thời điểm: trước uống

thuốc, sau 14 ngày và 28 ngày uống thuốc; giết chuột (mỗi thời điểm 10 con/lô) và

lấy máu để đánh giá các chỉ tiêu:

Những thông số được theo dõi:

- Tình trạng toàn thân: hàng ngày theo dõi các hoạt động của chuột, sự tiêu

thụ thức ăn, nước uống, sự bài tiết (tình trạng lông, phân và nước tiểu). Theo dõi

trọng lượng chuột tại các thời điểm trước lúc bắt đầu dùng thuốc (N0); giữa khoảng

thời gian dùng thuốc sau 14 ngày (N14) và ngay sau đợt dùng thuốc 28 ngày (N28).

- Huyết học: Theo dõi số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ huyết sắc tố (Hb)

tại các thời điểm: N14, N28.

-Chức năng gan: Theo dõi các thông số AST (aspartat amino transferase),

ALT (alanin amino transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời

điểm N14, N28.

-Chức năng thận: Xác định nồng độ creatinin huyết tương tại các thời điểm

N14, N28.

-Mô bệnh học: Sau 28 ngày thực nghiệm, giết 30% số chuột quan sát về đại

thể và vi thể gan, thận của chuột ở các lô thực nghiệm.

Xử lý số liệu: Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của

từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Excel theo

phương pháp thống kê y học, sử dụng t-test Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê khi p < 0,05.

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢ VÀ THÀO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH

4.1.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành

Từ cặn etyl axetat (EB-Et) và cặn nước (EB-W) củ sâm đại hành, 14 hợp chất

ký hiệu từ EB-1 đến EB-14 đã được phân lập, cấu trúc của các hợp chất đã được

xác định bằng cách kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện

đại như sau:

Hợp chất EB-1 (1) (Hợp chất mới)

25]

Dα –58,1 [

Hợp chất EB-1 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt;

(MeOH, c = 0,3); phổ tử ngoại UV (MeOH) có các cực đại hấp thụ tại λmax (log ε) 223 (4,2), 261 (4,0) nm. Phổ hồng ngoại IR cho các đỉnh hấp thụ tại 3495 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của nhóm –OH, 1640 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của nhóm C=O và 1610 cm-1 đặc trưng cho tín hiệu của C-O-C.

Hình 4.1a Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất EB-1

Phổ ESI-MS cho pic ion cơ bản negative ở m/z 419 [M–H]–. Phổ phân giải cao HR-ESI-MS với pic ion cluster tại m/z 419,1338 [M–H]– (C21H23O9, 419,1342)

phù hợp với công thức phân tử là C21H24O9.

Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của hợp chất EB-1 cho thấy các tín hiệu sau: 1

nhóm methyl bậc ba ở δH 245 ppm, 1 nhóm methyl bậc hai ở δH 1,46 ppm (d, J =

6,1 Hz), 3 proton thơm singlet ở δH 6,45 ppm (s, H-9), δH 6,67 ppm (s, H-7), và δH

6,85 ppm (s, H-6), và proton anomeric ở δH 4,93 ppm (d, J=7,2 Hz, H-1').

Hình 4.1b Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR của hợp chất EB-1

Hình 4.1c Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR của hợp chất EB-1

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-1 cho thấy tín hiệu của 21 nguyên tử

C, tín hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử cacbon thơm hoặc olefin, 1 tín hiệu của

nhóm cacbonyl ở δC 194,3 ppm (C-4), 5 tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon ở δC từ

62,5 đến 78,3 ppm và 1 tín hiệu của nguyên tử cacbon ở δC 101,7 ppm (C-1') thuộc

phần đường monosaccharide; 2 tín hiệu của hai nhóm methyl ở δC 20,7 ppm (2-Me)

và 23,3 ppm (5-Me). Phân tích các dữ liệu phổ trên cho thấy phần aglycone của EB-

1 được xác định là dihydroeleutherinol (EB-1a) (hình 4.1d).

Hình 4.1d Cấu trúc của hợp chất EB-1a

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-1 và aglycone EB-1a

EB-1a

Vị trí

a,b

a,c (mult., J in Hz)

δC

Aglycone

HMBC (H→C) δC

163,8 77,9

2, 2-Me, 4

1a 2 3

46,0

EB-1 a,b δH 163,4 ‒ 78,0 4,87 (ddq, 4,0; 6,1; 12,0) 1a, 2-Me,3, 4 45,9 2,57 (dd, 4,0; 16,8) 2,62 (dd, 12,0, 16,8)

194,3 ‒ 114,6 ‒ 137,6 ‒ 124,2 6,85 (s) 141,1 ‒ 103,6 6,67 (s) 161,4 ‒ 103,5 6,45 (s) 158,7 ‒ 109,9 ‒ 20,7 1,46 (d, 6,1) 23,3 2,45 (s)

194,0 113,7 137,3 5-Me, 4a, 7, 10a 123,3 141,7 102,6 6, 8, 9, 10a 162,0 102,9 7, 8, 10, 10a 158,9 108,3 20,8 2, 3 4a, 5, 6 23,4

δH ‒ 4,88* 2,72 (dd, 3,7; 16,8) 2,80 (dd, 12,0; 16,8) ‒ ‒ ‒ 6,90 (s) ‒ 6,48 (d, 2,2) ‒ 6,35 (d, 2,2) ‒ ‒ 1,60 (d, 6,1) 2,59 (s)

8 4', 5'

4 4a 5 6 6a 7 8 9 10 10a 2-Me 5-Me 8-O- Glc 1ʹ 2ʹ 3ʹ 4ʹ 5ʹ 6ʹ

101,7 4,93 (d, 7,2) 74,8 3,40* 78,0 3,47* 71,4 3,31 (d, 8,5) 78,3 3,42* 62,5 3,62 (dd, 5,6; 12,2) 3,83 (dd, 2,2; 12,2) a)đo trong CD3OD, b)400 MHz, c)100 MHz, *pic chồng

Phổ HMBC của EB-1 cho thấy tương tác giữa H-2 (δH 4,87) với C-1a (δC

163,4), C-3 (δC 45,9), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7); giữa H-3 (δH 2,57 và 2,62)

với C-2 (δC 78,0), C-4 (δC 194,3), và 2-Me (δC 20,7) gợi ý nhóm methyl và nhóm

carbonyl tương ứng ở vị trí C-2 và C-4 của vòng dihydropyrone. Mặt khác, trên phổ

HMBC còn xuất hiện tương tác giữa 5-Me (δH 2,45 ppm) với C-4a (δC 114,6 ppm),

C-5 (δC 137,6 ppm), và C-6 (δC 124,2 ppm); giữa H-7 (δH 6,67) với C-6 (δC 124,2),

C-8 (δC 161,4), C-9 (δC 103,5), và C-10a (δC 109,9); giữa H-9 (δH 6,45) với C-7 (δC

103,6), C-8 (δC 161,4), C-10 (δC 158,7), và C-10a (δC 109,9). Những dữ kiện này

chứng tỏ vị trí nhóm methyl và hai nhóm hydroxyl tương ứng ở các vị trí C-5, C-8,

và C-10.

Sự có mặt của một phân tử đường trong phân tử hợp chất EB-1 được khẳng định

thêm bằng việc thủy phân EB-1 trong môi trường axit thu được 1 đơn vị đường D-

glucose và aglycone EB-1a. Ngoài ra, vị trí của đường glucose ở C-8 được khẳng

định thêm bởi tương tác giữa H-1' glc (δH 4,93) và C-8 (δC 161,4) trên phổ HMBC.

Hình 4.1e Phổ HMBC của hợp chất EB-1

Hình 4.1f Các tương tác HMBC chính của hợp chất EB-1

Để xác định cấu hình tuyệt đối của C-2 trong phân từ hợp chất EB-1 chúng tôi

đã tiến hành ghi phổ CD của EB-1. Phổ CD của hợp chất EB-1 cho thấy hiệu ứng

cotton xung quanh 319 nm (Hình 4.1g), tương tự như hợp chất (2S)-5-hydroxy-6,8-

dimethoxy-2-methyl-4H-2,3-dihydronaphtho[2,3-b]-pyran-4-one, điều này gợi ý

cấu hình ở C-2 của EB-1 là cấu hình S.

1

200

250

300

350

400

3 0 1 ×××× ] θθθθ [ y t i c i t p

i l l

E r a l o M

4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5

Wavelength (nm)

Hình 4.1g Phổ CD của hợp chất EB-1

Thêm vào đó để khẳng định thêm cấu hình của EB-1, chúng tôi đã xác định cấu

25]

hình aglycone EB-1a bằng cách so sánh độ quay cực của EB-1a với hợp chất 2-

Dα = + 8,8) [95]. Độ [

25]

methylchroman-4-one và hợp chất (R)-dihydroeleutherinol (

Dα = – 38,3, trong khi đó hợp chất (S) 5,7- [

quay cực của EB-1a đo được là

dihydroxy-2-methylchroman-4-one có độ quay cực là

[α = – 58,6 và hợp chất (R)

[α = + 53,2 [115]. Điều này

7-methoxy-2-methylchroman-4-one có độ quay cực là

xác nhận hợp chất EB-1a có cấu hình ở C-2 là S. Do vậy, hợp chất EB-1 được xác

định là (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần

đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên.

EB -1

Hình 4.1h Cấu trúc của hợp chất EB-1

Hợp chất EB-2 (2)

Hợp chất EB-2 thu được dưới dạng bột, màu trắng. Phổ khối lượng của hợp chất EB-2 cho pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z 257 tương ứng với công thức phân tử

C15H12O4. Phổ UV hấp thụ các bước sóng cực đại tại λmax = 249, 270, 230 nm.

Hình 4.2a Phổ 1H NMR của hợp chất EB-2

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 proton olefin ở δH 6,18 ppm (1H,

s, H-3), 1 proton thơm ở δH 7,19 ppm (1H, s, H-6), 1 đôi proton thơm ở vị trí meta

so với nhau ở δH 6,56 ppm (1H, s, J=7,5Hz, H-7) và δH 6,58 ppm (1H, s, J=7,5 Hz,

H-9). Hai tín hiệu của 2 nhóm methyl ở δH 2,40 ppm (3H, s, CH3-2) và δH 2,71 ppm

(3H, s, CH3-5).

Tương ứng trên phổ 13C-NMR chỉ ra sự có mặt của 15 nguyên tử cacbon,

trong đó có 2 nguyên tử C nhóm methyl ở δC 19,41 (CH3-2) và δC 22,97 (CH3-5), 1

nguyên tử C nhóm metin olefin ở δC 112,10 (C-3), 3 nguyên tử C nhóm metin thơm

ở δC 124,84 (C-6), 102,92 (C-7), 101,19 (C-9), 8 nguyên tử C bậc 4 và 1 nguyên tử

C nhóm cacbonyl vòng lacton ở δC 178,62.

Hình 4.2b Phổ 13C NMR của hợp chất EB-2

Kết hợp các dữ liệu phổ thu được của EB-2 với các số liệu phổ của

eleutherinol của tài liệu tham khảo [49] thấy hoàn toàn trùng khớp, chúng tôi kết

10a

luận hợp chất EB-2 là eleutherinol.

Hình 4.2c Cấu trúc của hợp chất EB-2 (Eleutherinol)

Hợp chất EB-3 (3)

Hợp chất EB-3 thu được dưới dạng bột, màu trắng. phổ khối lượng MS cho

pic negative [M-H]¯ có m/z = 417 tương ứng với công thức phân tử C21H22O9.

Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl ở độ chuyển

dịch hóa học δH 2,35 (3H, s, Me-2) và δH 2,70 (3H,s, Me-5); 1tín hiệu proton olefin

ở δH 6,18 (1H, s, H-3); 3 tín hiệu proton thơm ở δH 7,27 (1H, s, H-6), δH 6,89 (1H, d,

2,1 Hz, H-7) và δH 6,66 (1H, d, J=2,1 Hz, H-9). Ngoài ra còn có tín hiệu của 6

proton có độ chuyển dịch hóa học trong khoảng 3,19 và 3,69 ppm và 1 tín hiệu

proton ở δH 4,98 (dublet) gợi ý sự có mặt của phần đường glucose. Các tín hiệu cộng hưởng thu được ở phổ 13C-NMR cũng hoàn toàn phù hợp.

Hình 4.3a Phổ 1H NMR của hợp chất EB-3

Trên phổ 13C-NMR thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 12 nguyên tử

cacbon thơm hoặc olefin ở δC từ 100 đến 163,7 ppm, 1 tín hiệu của nhóm cacbonyl

ở δC 178,5 ppm, 5 nguyên tử cacbon ở δC từ 60,6 đến 77,1 ppm và 1 nguyên tử

cacbon ở δC 100 ppm một lần nữa khẳng định sự tồn tại của gốc đường glucose; 2

tín hiệu nhóm methyl ở δC 19,5 (2-Me) và 23,0 (5-Me).

Hình 4.3b Phổ 13C NMR của hợp chất EB-3

Các liên kết giữa C và H được chỉ ra ở phổ HMQC đều phù hợp với các kết

luận trên. Cấu hình dạng β của C anomeric được xác định dựa vào JH-1’,H-2’= 7,6 Hz.

Phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa H-1’ (δH 4,98) và C-8 (δC 147,9) do đó phần

đường glucose gắn vào vị trí C-8 của phần khung aglycon.

So sánh với các dữ kiện phổ thu được của hợp chất EB-3 với hợp chất

eleutherinoside A trong tài liệu tham khảo [49] thấy hoàn toàn trùng khớp. Do đó,

1 O

10a

GlcO

có thể kết luận hợp chất EB-3 là eleutherinoside A.

Hình 4.3c Cấu trúc hoá học của hợp chất EB-3 (Eleutherinoside A)

Hợp chất EB-4 (4)

Hợp chất EB-4 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, có

nhiệt độ nóng chảy là 175-176oC.

Phổ hồng ngoại của hợp chất EB-4 cho thấy tín hiệu của các nhóm chức C=O với pic hấp thụ tại 1654 cm-1, nhóm OH với dải hấp thụ trong khoảng 3450 cm-1.

Hình 4.4a Phổ IR của hợp chất EB-4

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất EB-4 cho pic ion phân tử [M+H]+ tại

m/z 289 chỉ ra công thức phân tử của EB-4 C16H16O5 (M = 288).

Hình 4.4b Phổ ESI-MS của hợp chất EB-4

Hình 4.4c Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-4

Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-4 cho thấy sự xuất hiện của 3 proton thơm kề

nhau của vòng naphtho tại δH 8,04 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 7,38 (1H, t, J = 8,0 Hz,

H-7) và 7,01 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8); hai dublet tại δH 1,64 (3H, d, J = 7,0 Hz, 1-

CH3) và 1,53 (3H, d, J = 7,0 Hz, 3-CH3) cho thấy sự xuất hiện của hai nhóm metyl

tại C-1 và C-3; hai nhóm metin gắn với oxi của vòng pyran tại δH 5,49 (q, J = 7,0

Hz, H-1) và 4,69 (q, J = 7,0 Hz, H-3). Ngoài ra ở vùng trường thấp xuất hiện tín

hiệu singlet rộng cộng hưởng tại δH 12,82 ppm gợi ý sự có mặt của nhóm hydroxyl. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất EB-4 không thấy sự xuất hiện của hai proton nhóm

metylen tại vị trí C-4 do hai proton này đã được thay thế bởi nguyên tử O, điều này được khẳng định khi trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng tại δC 202,9

ppm của nhóm cacbonyl và phổ tương tác xa HMBC thấy xuất hiện tương tác giữa

H của nhóm metyl tại δH 1,53 (3H, d, J = 7,0 Hz, 3-CH3) với C-3 tại δC 69,5 ppm và

C=O tại δC 202,9 ppm.

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-4 cho thấy sự có mặt của 16

nguyên tử cacbon, trong đó có 10 cacbon thơm của khung naphtho (δC từ 107,8 đến

155,7 ppm), 1 nhóm cacbonyl tại δC 202,9 ppm (C-4), 2 nhóm metin gắn với oxi

hoạt động tại δC 67,4 (C-1) và 69,5 ppm (C-3), 2 nhóm metyl bậc 2 tại δC 17,4 (1-

CH3) và 16,3 ppm (3-CH3) và 1 nhóm metoxy tại δC 56,4 ppm (9-OCH3).

Hình 4.4d Phổ DEPT của hợp chất EB-4

Liên kết chính xác của C với H tương ứng cũng được khẳng định dựa vào

các tương tác thu được trên phổ HSQC của hợp chất EB-4. Tương tác xa giữa

proton nhóm metoxy (δH 4,07 ppm) với C-9 (δC 155,7 ppm) thu được trên phổ

HMBC chứng tỏ nhóm metoxy được gắn vào vị trí C-9.

Hình 4.4e Phổ HSQC (a) và HMBC (b) của hợp chất EB-4

Từ các dữ kiện phổ thu được, đồng thời đối chiếu dữ kiện phổ này với dữ

kiện phổ của hongconin trong tài liệu tham khảo [41] (bảng 4.2) đã xác định được

OMe

hợp chất EB-4 là hongconin (hình 4.4f).

Hình 4.4f Cấu trúc hóa học của hợp chất EB-4 (hongconin)

Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-4 có so sánh với TLTK [41]

hongconin [41] EB-4

δH, ppm (J, Hz) (500 MHz, CDCl3)

5,49 (q, 7,0) 4,69 (q, 7,0) 8,04 (d, 8,0) δC, ppm (125 MHz, CDCl3) 67,4 69,5 202,9 154,4 118,1 δH, ppm (J, Hz) (400 MHz, CDCl3) 5,48 (q, 6,7) 4,69 (q, 6,4) 8,04 (d, 8,5) δC, ppm (100 MHz, CDCl3) 67,4 69,5 202,9 153,4 118,1 1 3 4 5 6

125,4 109,1 155,7 139,4 121,0 7,38 (t, 8,2) 7,01 (d, 7,9) 125,4 109,1 155,7 139,4 120,9 7 8 9 10 11 7,38 (t, 8,0) 7,01 (d, 8,0)

107,8 107,8 12

126,0 126,0 13

119,6 17,4 16,3 56,4 1,63 ( d, 6,7) 1,53 (d, 6,4) 4,07 (s) 119,6 17,4 16,3 56,4 1,64 ( d, 7,0) 1,53 (d, 7,0) 4,07 (s) 14 1-CH3 3-CH3 9-OCH3

Hợp chất EB-5 (5)

Hợp chất EB-5 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, nhiệt

độ nóng chảy 178 - 179oC.

Phổ hồng ngoại của hợp chất EB-5 cho các đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng

cho nhóm chức cacbonyl ở v = 1657 cm-1 và vòng thơm ở v = 1471, 1585 cm-1.

Hình 4.5a Phổ ESI-MS của hợp chất EB-5

Phổ khối ESI-MS của EB-5 cho pic ion dương [M+H]+ tại m/z 273, chỉ ra

công thức phân tử C16H16O4 (M = 272).

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của một nhóm metoxy tại δH 3,96 (3H, s, 9-

OCH3), 2 nhóm metyl bậc 2 dưới dạng doublet tại δH 1,36 (3H, d, J = 6,5 Hz, 3-

CH3); 1,54 (3H, d, J = 6,5 Hz, 1-CH3), 2 nhóm oxi metin gắn với oxi tại δH 3,60

(1H, m, H-3) và 4,85 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-1), 1 nhóm metylen dưới dạng double

doublet tại δH 2,20 (1H, dd, J = 10,1; 18,1 Hz, H-4ß) và 2,75 (1H, dd, J = 2,1; 18,1

Hz, H-4α). Đồng thời trên phổ 1H-NMR còn có tín hiệu cộng hưởng của 3 proton

vòng thơm kề nhau tại δH 7,73 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 7,64 (1H, dd, J = 8,5; 7,5

Hz, H-7) và 7,27 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-8).

Hình 4.5b Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-5

Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, tương

ứng với 1 nhóm metoxy tại δC 56,4 ppm, 2 nhóm metyl tại δC 20,8 và 21,3 ppm, 1

nhóm metylen tại 29,8 ppm, 2 nhóm metin liên kết với oxi tại 68,7 và 70,2 ppm, 3

nhóm metin vòng thơm, 5 nhóm cacbon bậc bốn và 2 nhóm cacbonyl tại δC 183,7

và 184,0 ppm đặc trưng của khung naphthoquinone.

Hình 4.5c Phổ DEPT của hợp chất EB-5

Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-5 đem so sánh với dữ kiện phổ của

eleutherin trong tài liệu tham khảo [113] (bảng 4.3) thấy hoàn toàn trùng khớp. Do

vậy hợp chất EB-5 được xác định là eleutherin (hình 4.5d).

Hình 4.5d Cấu trúc của hợp chất EB-5

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-5 có so sánh với TLTK [113]

Eleutherin [113] EB-5

C δH, ppm (J, Hz) δC, ppm δC, ppm

(500MHz, CDCl3) (125MHz, CDCl3) (125MHz, CDCl3)

1 4,85 (q, 6,5) 70,2 70,2

3 3,60 (m) 68,7 68,7

2,75 (dd, 2,1, 18,1, 4-Hα); 4 29,8 29,9 2,20 (dd, 10,1, 18,1, 4-Hβ)

5 184,0 184,0

6 7,73 (d, 8,5) 117,7 117,7

7 7,64 (dd, 7,5, 8,5) 134,5 134,6

8 7,27 (d, 7,5) 118,9 119,0

9 159,3 159,3

10 183,7 183,7

11 148,6 148,6

12 139,9 139,9

13 133,9 133,9

14 120,2 120,2

1,54 ( d, 6,5) 20,7 20,8 1-CH3

1,36 (d, 6,5) 21,2 21,3 3-CH3

3,96 (s) 56,4 56,4 9-OCH3

Hợp chất EB-6 (6)

Hợp chất EB-6 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, nhiệt

độ nóng chảy 174-175oC.

Phổ hồng ngoại của hợp chất EB-6 cho tín hiệu của nhóm chức cacbonyl và

vòng thơm tương tự như hợp chất EB-5 với các đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm chức cacbonyl ở v = 1658 cm-1 và vòng thơm ở v = 1447, 1477 và 1584 cm-1.

Hình 4.6a Phổ IR của hợp chất EB-6

Phổ khối ESI-MS của EB-6 cho pic ion dương [M+H]+ tại m/z 273, tương

ứng với công thức phân tử C16H16O4 (M = 272) .

Hình 4.6b Phổ ESI-MS của hợp chất EB-6

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR thu được của hợp chất EB-6 cho các pic tương tự

như hợp chất EB-5.

Phổ 1H-NMR cũng cho tín hiệu singlet của một nhóm metoxy tại δH 4,07

ppm, 2 nhóm metyl dưới dạng doublet tại δH 1,35 (3H, d, J = 6,0 Hz, 3-CH3); 1,53

(3H, d, J = 7,0 Hz, 1-CH3), 2 nhóm metin gắn với oxi tại δH 3,98 (1H, m, H-3) và

5,02 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-1), 1 nhóm metylen dưới dạng double doublet tại δH 2,24

(1H, dd, J = 10,1; 18,5 Hz, H-4β) và 2,71 (1H, dd, J = 3,5; 18,5 Hz, H-4α), 3 proton

vòng thơm kề nhau tại δH 7,74 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6), 7,65 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-

7) và 7,28 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-8).

Hình 4.6c Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-6

Trên phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất EB-6 tương tự như hợp chất EB-

5, cho tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon, tương ứng với 1 nhóm metoxy tại δC 56,4

ppm, 2 nhóm metyl tại δC 19,7 và 21,5 ppm, 1 nhóm metylen tại 29,5 ppm, 2 nhóm

metin liên kết với oxi tại 62,4 và 67,4 ppm, 3 nhóm metin vòng thơm, 5 nhóm

cacbon bậc bốn và 2 nhóm cacbonyl tại δC 182,7 và 184,2 ppm đặc trưng của khung

naphthoquinone.

Hình 4.6d Phổ 13C NMR và DEPT của hợp chất EB-6

Điểm khác biệt của hợp chất EB-6 so với hợp chất EB-5 là tín hiệu cộng

hưởng của hai nguyên tử cacbon tại vị trí C-1 và C-3 (δC tại 67,4 và 62,4 ppm)

chuyển dịch về phía trường cao hơn so với ở hợp chất EB-5 (δC tại 70,2 và 68,7

ppm) cho thấy hai hợp chất này có sự khác biệt về cấu hình giữa nhóm metyl và

nguyên tử hidro tại vị trí C-1 và C-3.

Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-6 đem so sánh với dữ kiện phổ của

isoeleutherin trong tài liệu tham khảo [42] thấy phù hợp (bảng 4.4), do vậy hợp chất

OMe

EB-6 được xác định là isoeleutherin (hình 4.6e).

Hình 4.6e Cấu trúc hóa học của EB-6 (isoeleutherin)

Isoeleutherin [42]

Bảng 4.4 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-6 có so sánh với TLTK [42]

EB-6

δC, ppm

δH, ppm (J, Hz)

(100MHz

(125MHz,

(500MHz, CDCl3)

(400MHz, CDCl3)

, CDCl3)

CDCl3)

5,03 (q, 6,7)

67,4

5,02 (q, 6,5)

67,5

3,98 (m)

62,4

3,98 (m)

62,5

2,71 (dd, 3,5; 18,5 , 4-Hα);

2,72 (dd, 3,5; 19,1, 4-Hα);

29,5

29,6

2,24 (dd, 10,1; 18,5, 4-Hβ)

2,27 (dd, 10,2; 18,9, 4-Hβ)

184,3

117,8

7,74 (d, 7,5)

117,9

7,76 (d, 7,6)

134,7

7,65 (t, 7,5)

134,8

7,66 (t, 8,1)

119,1

7,28 (d, 7,5)

119,2

7,29 (d, 8,5)

159,7

159,8

182,8

148,0

148,1

139,4

139,5

134,0

134,2

119,7

119,8

19,8

1,55 (d, 6,7)

1,53 ( d, 7,0)

1-CH3

21,5

21,6

1,36 (d, 6,1)

1,35 (d, 6,0)

3-CH3

56,4

56,5

4,01 (s)

4,07 (s)

9-OCH3

Hợp chất EB-7 (7)

Hợp chất EB-7 thu được dưới dạng bột, màu vàng nhạt. Trên phổ 13C NMR

và DEPT cho tín hiệu của 10 cacbon thơm, hai cacbon của nhóm metyl, một cacbon

methoxy, một cacbon metylen và hai nhóm đường với 2 cacbon anomer tại δC 105,3 ppm (C-1') và δC 103,1 ppm (C-1ʺ). Phổ 1H NMR cho tín hiệu của hai nhóm metyl

tại δ 1,49 ppm (d, J=6,2 Hz, 1-Me) và δ 1,23 ppm (d, J= 6,2 Hz, 3-Me), proton của

nhóm methoxy tại δ 3,99 ppm (s, 9-OMe), hai methine tại δ 5,02 ppm (q, J=6,2 Hz,

H-1) và δ 3,42 ppm (H-3) gắn với oxi. Hai nhóm metylen dưới dạng doublet

doublet tại δ 2,68 ppm (dd, J=11,7; 16,5 Hz, H-4β) và δ 3,0 ppm (H-4α).

Hình 4.7a Phổ 1H NMR của hợp chất EB-7

Hình 4.7b Phổ 13C NMR của hợp chất EB-7

Vị trí các nhóm thế và hai nhóm đường được khẳng định dựa vào tương tác

xa trên phổ HMBC của hợp chất EB-7.

Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-7 đem so sánh với dữ kiện phổ của

eleuthoside C trong tài liệu tham khảo [133] thấy phù hợp, do vậy hợp chất EB-7

được xác định là eleuthoside C.

OMe

1-6

OGlc

Glc

Hình 4.7c Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-7

Hình 4.7d Cấu trúc hoá học của hợp chất EB-7 (eleuthoside C)

Hợp chất EB-8 (8) và EB-9 (9)

Hợp chất EB-8 thu được dưới dạng bột, màu vàng nhạt.

Hình 4.8a Phổ 13C NMR của hợp chất EB-8

Phổ 13C cho thấy tín hiệu của 10 cacbon thơm tại δC 141,8 ppm (C-5), δC

117,0 ppm (C-6), δC 126,7 ppm (C-7), δC 105,2 ppm (C-8), δC 157,2 ppm (C-9); δC

147,0 ppm (C-10); δC 121,0 ppm (C-11), δC 127,3 ppm (C-12), δC 130,3 ppm (C-

13), δC 114,4 ppm (C-14). Hai tín hiệu của nhóm metyl tại δC 19,5 ppm (1-Me) và

δC 22,2 ppm (3-Me) và một tín hiệu của nhóm methoxy tại δC 56,9 ppm (9-OMe).

Và 12 tín hiệu đặc trưng cho 12 cacbon của hai nhóm đường.

Phổ 1H NMR cho thấy tín hiệu của hai nhóm methyl tại δ 1,30 ppm (3H, d,

J=6,2 Hz), δ 1,55 ppm (3H, d, J=6,8 Hz), một nhóm methoxy tại δ 4.03 ppm (s), hai

proton methine tại δ 4,15 ppm (m) và δ 5,20 ppm (q, J=6,8 Hz) gắn với một nhóm

oxy, một cặp proton methylene tại δ 2,44 ppm (dd, J=11,0; 17,2 Hz) và δ 3,44 ppm,

ba proton thơm tại δ 7,87 ppm (d, J=8,0 Hz, H-6), δ 7,28 ppm (t, J=8,0 Hz, H-7), δ

6,85 ppm (d, J=8,0 Hz, H-8), và hai proton anomeric tại δ 4,79 ppm (H-1’), δ 4.11

ppm (d, J=7,6 Hz, H-1'').

Hình 4.8b Phổ 1H NMR của hợp chất EB-8

Các tương tác xa trên phổ HMBC có thể cho thấy liên kết giữa vòng benzene

và vòng dihydropyran cũng như vòng benzene với nhau tạo thành khung

naphthopyran và vòng dihydropyran đã được liên kết bởi benezene khác. Ngoài ra,

tương tác giữa 9-OMe (δ 4,03 ppm) và C-9 (δC 157,2 ppm), H-1’ (δ 4,79 ppm) và

C-5 (δC 141,8 ppm), H-1” (δ 4,11 ppm) và C-6’ (δC 69,0 ppm) đã khẳng định vị trí

của nhóm thế methoxy và hai nhóm đường.

Hình 4.8c Một số tương tác chính HMBC của hợp chất EB-8

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất EB-9 tương tự như hợp chất EB-8 ngoại trừ

hai proton của metylen 4-CH2 của hợp chất EB-8 được thay thế bởi một nhóm

hydroxyl và một proton metin.

Các dữ kiện phổ NMR thu được của hợp chất EB-8 và EB-9 so sánh với hợp

chất eleutherinoside C và eleutherinoside B trong tài liệu tham khảo [94] thấy hoàn

toàn phù hợp, có đôi chút sai khác là do dung môi. Do đó, hợp chất EB-8 được xác

OMe

Me(α)

ODsac

Dsac

định là eleutherinoside C và chất EB-9 được xác định là eleutherinoside B.

a b

Hình 4.9 Cấu trúc hoá học của hợp chất EB-8 (eleutherinoside C) (a) và EB-9

(eleutherinoside C) (b)

Hợp chất EB-10 (10)

Hợp chất EB-10 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất này (hình 4.10a) cho pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z

235 tương ứng với công thức phân tử C13H14O4 (M = 234).

Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-10 (hình 4.10b) cho tín hiệu cộng hưởng

dạng singlet của nhóm metyl gắn với vòng thơm tại độ chuyển dịch hóa học δH 2,40

ppm, nhóm acetyl tại δH 2,42 ppm; 1 proton thơm tại δH 6,60 ppm (s, H-5), và 5

proton của vòng no tại δH 2,52 (1H, dd, J= 8,2; 16,5 Hz, Haq-2); 2,82 (1H, dd, J =

3,4; 16,5 Hz, Heq-2); 4,22 (1H, m, H-3); 2,89 (1H, dd, J = 7,5; 15,8 Hz, Haq-4);

3,14 (1H, dd, J = 3,4; 15,8 Hz, Heq-4).

Hình 4.10a: Phổ ESI-MS của hợp chất EB-10

Hình 4.10b Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-10

Các tín hiệu thu được do tương tác C và H trên phổ hai chiều HMQC của

hợp chất EB-10 cũng khẳng định sự xuất hiện của hai nhóm metylen và một nhóm

metin tương ứng với 5 proton của vòng no.

Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-10 chỉ ra sự có mặt của 13 nguyên tử

cacbon, trong đó có 6 nguyên tử C thơm có δC từ 114,7 đến 158,8 ppm, 2 nhóm

C=O tại δC 199,3 và 208,4 ppm, 2 nguyên tử C nhóm metyl tại δC 19,2 và 32,6 ppm,

và 3 nguyên tử C của vòng no tại δC 40,4; 50,0 và 66,8 ppm.

Hình 4.10c Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-10

Ngoài ra, các tín hiệu tương tác xa giữa C và H thu được trên phổ hai chiều

HMBC của hợp chất EB-10 được thể hiện như trong hình 28 giúp khẳng định vị trí

của các nhóm thế metyl CH3 và acetyl COCH3. Dữ kiện phổ HMBC cho thấy xuất

hiện tương tác giữa proton của nhóm metyl (δH 2,40 ppm) với C-7, C-8 và C-8a (δC

132,2, 140,4, 124,9 ppm) khẳng định nhóm metyl này phải gắn vào C-8; tương tác

xa giữa proton của nhóm acetyl với C-7 (δC 132,2 ppm) và C=O (δC 208,4 ppm)

CH3

khẳng định nhóm acetyl phải gắn vào vị trí C-7.

Hình 4.10d Một số tương tác HMBC chính của hợp chất EB-10

Hình 4.10e Phổ HMQC (a) và HMBC (b) của hợp chất EB-10

Các dữ kiện phổ NMR thu được của hợp chất EB-10 so sánh với hợp chất 7-

acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone trong tài liệu tham khảo [94] thấy hoàn toàn

phù hợp (bảng 4.5). Có sự sai khác đôi chút là do ảnh hưởng của dung môi. Như

vậy, hợp chất EB-10 được xác định là 7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone

CH3

(hình 4.25f).

Hình 4.10f Cấu trúc của hợp chất EB-10(7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone)

7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-

Bảng 4.5 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-10 có so sánh với TLTK [94]

EB-10

methyltetralone [94]

δC, ppm

δH, ppm (J, Hz)

(125MHz,

(150MHz,

(500MHz, MeOD)

(600MHz, DMSO-d6)

MeOD)

DMSO-d6)

199,3

197,3

2,71 (dd, 16,0; 3,6)

2,82 (dd, 3,4; 16,5, Heq-2)

50,0

49,2

2,52 (dd, 8,2; 16,5, Haq-2)

2,45 (dd, 16,0; 6,8)

66,8

4,22 (m)

4,15 (m)

64,9

3,14 (dd, 3,4; 15,8, Heq-4)

3,03 (dd, 16,0; 3,6)

40,4

39,9

2,89 (dd, 7,5; 15,8, Haq-4)

2,77 (dd, 16,0; 6,8)

147,1

145,5

114,7

6,60 (s)

113,8

158,8

157,1

132,2

130,9

7-CO

208,4

205,7

32,6

2,42 (s)

2,36 (s)

32,4

7-CH3

140,4

137,7

19,2

2,40 (s)

2,29 (s)

18,5

8-CH3

124,9

123,4

Hợp chất EB-11 (11)

Hợp chất EB-11 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt. Phổ HR-ESI MS cho pic ion phân tử [M+Na]+ tại m/z 429,1264. Gợi ý công thức phân tử là

C20H22O9 với khối lượng phân tử là 406.

Trên phổ 1H-NMR đo trong dung môi MeOD cho thấy tín hiệu cộng hưởng

của 18 proton. Trong đó có 4 proton thơm ở độ chuyển dịch hóa học δH 7,11 (1H, d,

J=8,3 Hz, H-7), δH7,47 (1H, t, J=8,3 Hz, H-6), δH7,60 (1H, d, J=8,3 Hz, H-5), δH

8,16 (1H, s, H-4). 5 tín hiệu cộng hưởng của 6 proton ở độ chuyển dịch hóa học từ

3,10 đến 3,68 ppm và 1 tín hiệu cộng hưởng của 1 proton ở δH 4,99 ppm gợi ý trong

phân tử chất 1 chứa 1 gốc đường glucose. 1 tín hiệu cộng hưởng của nhóm methyl

gắn với CH do có pic dạng dublet δH1,70 (3H, d, J=6,6 Hz, 1-CH3). 1 tín hiệu cộng

hưởng của nhóm methyl gắn với O ở δH 3,99 (3H, s, 8-OCH3).

Hình 4.11a Phổ 1H NMR của hợp chất EB-11

Các dữ kiện thu được trên phổ 13C-NMR hoàn toàn phù hợp với phổ 1H-

NMR, cho thấy tín hiệu của 20 nguyên tử C.

Hình 4.11b Phổ 13C NMR của hợp chất EB-11

Trong đó có 1 nhóm cacbonyl ở δC 172,3 (C-3), 10 nguyên tử C thơm ở độ

chuyển dịch hóa học từ 109,8 đến 157,4 ppm gợi ý sự có mặt của khung naphtalen;

1 nhóm methyl δC 19,4 (CH3-1), 1 nhóm metoxy δC 56,1 (CH3O-8); 6 nguyên tử C

của bộ khung glucose ở δC 62,4 (C-6’), 71,6 (C-6’), 76,0 (C-2’), 77,8 (C-3’), 78,3

(C-5’), 106,2 (C-1’). Liên kết chính xác giữa C và H được khẳng định trong phổ

HMQC.

Cấu hình dạng β của C anomeric được xác định dựa vào JH-1’,H-2’= 7,6 Hz.

Phổ HMBC cho thấy sự tương tác giữa H-1’ (δH 4,99) và C-9 (δC 147,9) do đó phần

đường glucose gắn vào vị trí C-9 của phần khung aglycon.

Như vậy, cấu trúc hoàn chỉnh của hợp chất EB-11 được xác định bởi phổ 1D

và 2D-NMR, tên là eleuthoside A có công thức như hình vẽ so sánh với các dữ kiện

phổ thu được của hợp chất eleuthoside A trong tài liệu tham khảo [133] thấy hoàn

toàn trùng khớp.

Hình 4.11c Cấu trúc hoá học của hợp chất EB-11 (eleuthoside A)

δH

Position 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1-Me 8-OMe 4-OGlc

a (mult., J in Hz) 6,05 (q, 6,6) - 8,16 (s) 7,60 (d, 8,3) 7,47 (t, 8,3) 7,11 (d, 8,3) - - - - - - 1,70 (d, 6,6) 3,99 (s)

b δC 80,9 172,3 124,0 123,7 128,4 109,8 157,4 147,9 140,7 125,9 139,3 124,0 19,4 56,1

HMBC (H-C) 1-Me, C-3, C-9, C-10, C-11 C-3, C-10, C-13 C-7, C-12, C-13 C-8, C-12 C-5, C-8, C-13 C-1, C-10 C-8

[133] 80,9 172,3 124,1 123,7 128,4 109,8 157,4 147,9 140,7 125,9 139,3 124,0 19,4 56,1

Bảng 4.6 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-11 có so sánh với TLTK [133]

1ʹ 2ʹ 3ʹ 4ʹ 5ʹ

106,2 76,0 77,8 71,6 78,3

C-9

62,4

6ʹ

62,4

4,99 (d, 7,6) 3,60* 3,10 (m) 3,39 (t, 9,3) 3,47 (t, 9,3) 3,68 (dd, 2,1; 11,7) 3,60* *Overlapped signals, Measure at a600MHz, b150MHz

Hợp chất EB-12 (12)

Hợp chất EB-12 thu được dưới dạng bột, màu vàng nhạt. Phổ HR-ESI MS cho pic ion phân tử [M+Na]+ tại m/z 591,1792, Gợi ý công thức phân tử là

C26H32O14 với khối lượng phân tử là 568; độ quay cực -32º (c 0,45, MeOH). Phổ

UV-Vis của EB-12 đo trong dung môi MeOH cho cực đại hấp thụ λmax tại các bước

sóng: 341, 270, 248 nm. Phổ hồng ngoại IR của hợp chất EB-12 cho thấy các pic ở 3562 cm-1 (nhóm OH), 1751 cm-1 (nhóm cacbonyl CO), 1265 cm-1 (liên kết C-O).

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất EB-12 cho các tín hiệu cộng hưởng

hoàn toàn tương tự như hợp chất EB-11 ngoại trừ các tín hiệu trong khoảng 3 đến 4ppm trong phổ 1H-NMR và các tín hiệu trong khoảng 60 đến 80ppm trong phổ 13C-NMR.

Hình 4.12a Phổ 1H NMR của hợp chất EB-12

Như vậy, hai hợp chất này chỉ khác nhau phần đường. Phổ 1H-NMR của

hợp chất EB-12 cho thấy sự có mặt của 12 proton ở độ chuyển dịch hóa học nằm

trong khoảng 3,17 đến 4,00ppm; 1 proton ở 4,16ppm và 1 proton ở 4,98 ppm. Điều

này gợi ý rằng phần đường của hợp chất 7 là gentiobioside (-D-glucopyranosyl – D

glucopyranoside).

Hình 4.12b Phổ 13C NMR của hợp chất EB-12

Dạng cấu hình của 2 nguyên tử C anomeric được xác định dựa vào hằng số

tương tác JH-1’,H-2’ = 7,6Hz và JH-1’’,H-2’’ =8,3Hz nên chúng đều có cấu hình dạng β.

Các liên kết giữa C và H được khẳng định rõ ràng nhất trong phổ tương tác HMQC.

Các tín hiệu tương tác thu được trong phổ HMBC cho thấy có sự tương tác giữa H-

1' (4,98 ppm) với C-9 (147,8 ppm), H-1ʺ (4,16 ppm) với C-6' (69 ppm), H-6' (4,00

ppm) với C-1ʺ (104,3 ppm). Do vậy chúng tôi khẳng định gốc đường liên kết với bộ

khung aglycon ở vị trí C-9 và hai gốc glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,6-

glycosit.

So sánh các dữ kiện phổ thu được của hợp chất EB-12 với dữ kiện phổ của

Eleuthoside B cho trong tài liệu tham khảo [133] thấy hoàn toàn trùng khớp, chúng

tôi kết luận hợp chất EB-12 chính là eleuthoside B.

Hình 4.12c Cấu trúc hoá học của hợp chất EB-12 (eleuthoside B)

Position

a (mult., J in Hz)

HMBC (H-C)

[133]

δH

b δC

6,12 (q, 6,9)

1-Me, C-3, C-9, C-10, C-11

81,1

172,3

8,15 (s)

C-3, C-10, C-13

124,2

7,60 (d, 7,6)

C-7, C-12, C-13

109,8

123,7

7,46 (t, 7,6)

C-8, C-12

128,4

7,10 (d, 7,6)

C-5, C-8, C-13

123,7

109,8

157,5

147,8

147,9

140,8

126,0

139,3

124,1

19,2

1-Me

1,68 (d, 6,9)

C-1, C-10

19,3

56,1

8-OMe

3,98 (s)

C-8

56,2

4-OGlc

1ʹ

4,98 (d, 7,6)

106,0

C-9

106,0

76,2

2ʹ

3,60 (dd, 7,6; 8,9)

76,1

77,4

3ʹ

3,47 (t, 8,9)

77,4

71,1

4ʹ

3,56*

71,1

78,0

5ʹ

2,32*

78,0

3,67 (dd, 4,9; 11,0)

69,0

6ʹ

69,1

4,00 (dd, 2,0; 11,0)

6ʹ-OGlc

1ʹʹ

4,16 (d, 8,3)

104,3

C-6ʹ

104,3

75,1

2ʹʹ

3,12 (dd, 7,6; 8,3)

75,2

76,6

3ʹʹ

3,25*

76,6

71,7

4ʹʹ

3,21 (t, 8,2)

71,7

78,0

5ʹʹ

3,17*

78,0

Bảng 4.7 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-12 có so sánh với TLTK [133]

3,55 (dd, 4,1; 11,7)

6ʹʹ

62,9

3,81 (dd, 2,1; 11,7)

*Overlapped signals, Measure at a600MHz, b150MHz

Hợp chất EB-13 (13)

Hợp chất EB-13 thu được dưới dạng bột màu vàng nhạt. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất này cho pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z 571 tương ứng với

công thức phân tử C26H34O14 (M = 570).

Hình 4.13a Phổ 1H NMR của hợp chất EB-13

Phổ 1H NMR cho tín hiệu của một nhóm metyl δ1.45 ppm (3H, d, J=6,2 Hz),

một nhóm methoxy δ 3,99 ppm (3H, s), một proton methine δ 5.33 ppm (q, J=6,2)

gắn với 1 oxy, một cặp proton methylen δ 5.03 ppm (d, J=13,1 Hz) và δ 5,40 ppm (

d, J=13,1 Hz), ba proton thơm tại δ 8,03 ppm (d, J=8,2 Hz, H-5), δ 7,31 ppm (t,

J=8,2 Hz, H-6), δ 6,91 ppm (d, J=8,2 Hz, H-7), và hai proton anomeric δ 4,53 ppm

(d, J=8,3 Hz, H-1’), δ 4,11 ppm (d, J=7,6 Hz, H-1’’).

Phổ 13C NMR cho thấy sự có mặt của 26 cacbon, Trên phổ HMBC thấy có

tương tác giữa H-1 (δ 5,33 ppm) và C-3 (δ 70,6 ppm), H-3 (δ 5,40 ppm) và C-1 (δ

78,3 ppm); H-1, H-3 với C-11; 1-Me và C-10 cho thấy sự kết nối giữa vòng furan

với khung naphthalene.

Hình 4.13b Phổ 13C NMR của hợp chất EB-13

Tương tác giữa H-1' (δ 4,53 ppm) và C-4 (δ 137,6 ppm) và giữa H-1ʺ (δ 4,11

ppm) và C-6' (δ 68,7 ppm) cho ta biết được hai gốc đường liên kết với nhau như

OMe

hình dưới.

Hình 4.13c Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất EB-13

Mặt khác, so sánh dữ liệu phổ của hợp chất EB-13 với tài liệu tham khảo

[94] thấy hoàn toàn trùng khớp. Do đó có thể kết luận hợp chất EB-13 là

OMe

1-6

OGlc

Glc

eleutherinoside D.

Hình 4.13d Cấu trúc hoá học của hợp chất EB-13 (eleutherinoside D)

Hợp chất EB-14 (14)

Hợp chất EB-14 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất này cho pic ion phân tử [M+H]+ tại m/z 271 tương ứng

với công thức phân tử C15H10O5 (M = 270).

Hình 4.14a Phổ ESI-MS của hợp chất EB-14

Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-14 cho tín hiệu cộng hưởng dạng singlet của

nhóm metyl gắn với vòng thơm tại độ chuyển dịch hóa học δH 2,61 ppm; 4 proton

thơm tại δH 6,40 (1H, d, J = 2,7 Hz, H-2), 6,94 (1H, d, J = 2,7 Hz, H-4), 7,31 (1H, d,

J = 2,7 Hz, H-5), 6,80 (1H, d, J = 2,7 Hz, H-7) ở vị trí meta so với nhau.

Hình 4.14b Phổ 1H-NMR của hợp chất EB-14

100

Tương ứng trên phổ 13C-NMR của hợp chất EB-14 cho thấy sự có mặt của

15 nguyên tử cacbon, trong đó có 12 nguyên tử C thơm có δC từ 108,2 đến 166,2

ppm, 2 nhóm C=O tại δC 189,5 và 184,1 ppm gợi ý cấu trúc của hợp chất EB-14 có

khung anthraquinon; và 1 nguyên tử C nhóm metyl tại δC 24,2 ppm.

Hình 4.14c Phổ 13C-NMR của hợp chất EB-14

Các tín hiệu tương tác thu được từ phổ HMQC và HMBC của hợp chất EB-

14 giúp ta gán chính xác độ chuyển dịch hóa học cho các nguyên tử C và H tương

ứng. Trên phổ HMBC thấy xuất hiện tương tác của proton nhóm metyl (δH 2,61

ppm) với C-7 (δC 125,6 ppm) và C-8a (δC 124,3 ppm) chứng tỏ nhóm metyl gắn vào

C-8.

101

Hình 4.14d Phổ HMQC (a) và HMBC (b) của hợp chất EB-14

Các tương tác HMBC chính của hợp chất EB-14 được thể hiện như hình

CH3

10a

4.14e.

Hình 4.14e Một số tương tác HMBC chính của hợp chất EB-14

Mặt khác, các dữ kiện phổ NMR thu được của hợp chất EB-14 so sánh với

dữ kiện phổ của hợp chất 1,3,6-trihydroxy-8-methyl-anthraquinone trong tài liệu

tham khảo [111] thấy phù hợp (bảng 4.8). Vì vậy, hợp chất EB-14 được xác định là

1,3,6-trihydroxy-8-methyl-anthraquinone. Đây là lần đầu tiên hợp chất EB-14 được

CH3

10a

phân lập từ cây sâm đại hành.

Hình 4.14f Cấu trúc hóa học của EB-14 (1,3,6-trihydroxy-8-methyl-anthraquinone)

102

Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của hợp chất EB-14 có so sánh với TLTK [111]

EB-14

1,3,6-trihydroxy-8-methyl- anthraquinone [111]

δH, ppm (J, Hz) (500MHz, DMSO-d6)

δH, ppm (J, Hz) (300MHz, CD3COCD3)

δC, ppm (75MHz, CD3COCD3) 164,9

δC, ppm (125MHz, DMSO-d6) 166,2

6,40 (d, 2,7)

108,2

6,64 (d, 2,4)

6,94 (d, 2,7) 7,31 (d, 2,7)

109,3 165,3 108,2 113,3

2 3 4 5

163,9 106,9 112,2

7,19 (d, 2,4) 7,57 (d, 2,5)

163,0

161,7 124,5 145,4

7,09 (d, 2,4)

125,6 146,6

6 7 8

6,80 (d, 2,7)

188,6

189,5

184,1

182,4

111,6

110,7

135,8

134,9

10a

138,3

134,9

124,3

123,6

2,61 (s)

24,2

8-CH3

23,2

2,80(s)

10a

GlcO

Glc

Bảng 4.9 Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ củ cây sâm đại hành

Eleutherinoside A (EB-3)

Eleutherinol (EB-2)

Dihydroeleutherinol-8-O-β- D-glucopyranoside (EB-1) (Chất mới)

103

OMe

Me(α)

Isoeleutherin (EB-6)

OH (–)-hongconin (EB-4)

Eleutherin (EB-5)

OMe

Me(α)

Me(β)

ODsac

Dsac

Dsac Eleutherinoside C (EB-8)

Eleutherinoside B (EB-9)

Dsac Eleuthoside C (EB-7)

OMe

ODsac

OMe

OGlc

Glc

Dsac

(R) 7-acetyl-3,6-dihydroxy-8- methyltetral-1-one (EB-10)

Eleuthoside A (EB-11)

Eleuthoside B (EB-12)

OMe

O Deoxyerythrolaccin (EB- 14) Lần đầu tiên phân lập được từ cây sâm đại hành

ODSac Eleutherinoside D (EB-13)

4.1.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm

4.1.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của các cặn chiết

Củ sâm đại hành đã được tiến hành điều chế tạo các cặn chiết thô theo sơ đồ

hình 3.1 (chương 3). Các cặn chiết thu được là cặn metanol (EB-Me), cặn n-hexan

104

(EB-Hx), cặn etyl axetat (EB-Et) và cặn nước (EB-W) của loài sâm đại hành được

chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng viêm theo đường bôi và đường uống.

Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.10 và 4.11.

Bảng 4.10 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng viêm theo đường bôi của các cặn chiết từ củ sâm đại hành

Trọng lượng tai (mg) Tên mẫu % ức chế STT khối viêm Tai Thí nghiệm Tai đối chứng dương

8,70 Cặn metanol EB-Me 33,95 ± 0,49 34,85 ± 1,20 1

9,35 Cặn n-hexan EB-Hx 34,20 ± 0,42 35,20 ± 0,28 2

9,79 3 Cặn etyl axetat EB-Et 34,65 ± 1,20 35,75 ± 1,20

9,69 Cặn nước EB-W 33,25 ± 1,25 34,75 ± 1,08 4

56,39 Dexamethasone 5 29,15 ± 0,42 35,15 ± 0,52

0 ĐC (-) 6 24,51 ± 1,12

Với hoạt tính kháng viêm theo đường bôi, cả 4 cặn chiết của mẫu nghiên cứu

đều thể hiện hoạt tính yếu ức chế khối viêm cục bộ theo đường bôi so với đối chứng

Dexamethasone.

Bảng 4.11 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng viêm theo đường uống của các cặn

chiết từ củ sâm đại hành

Trọng lượng chân (mg) Tên mẫu % ức chế STT khối viêm Tiêm Fomalin Không tiêm Fomalin

Cặn metanol EB-Me 133,40 ± 2,26 115,55 ± 2,76 12,21 1

Cặn n-hexan EB-Hx 132,10 ± 9,19 116,55 ± 7,42 23,52 2

3 Cặn etyl axetat EB-Et 132,20 ± 3,16 122,35 ± 2,76 52,12

Cặn nước EB-W 131,25 ± 9,39 114,30 ± 9,61 16,64 4

Indomethacine 116,73 ± 7,77 109,53 ± 7,92 64,59 5

ĐC (-) 138,77 ± 2,30 118,43 ± 5,00 0,00 6

Kết quả nghiên cứu theo đường uống cho thấy chỉ có cặn chiết etyl axetat

(EB-Et) ức chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử

dụng hoạt chất) với % ức chế khối viêm là 52,12%. Chất đối chứng dương

Indomethacine có hoạt tính ổn định và ức chế được 64,59% khối viêm.

105

4.1.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây viêm từ tế

bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của các hợp chất phân

lập được từ củ sâm đại hành

Để đánh giá hoạt tính kháng viêm của 14 hợp chất phân lập được từ cây sâm

đại hành, đầu tiên chúng tôi đã sử dụng phương pháp nhuộm màu MTT để đánh giá

ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bào của 14 hợp chất này. Kết quả cho thấy

cả 14 hợp chất đều không thể hiện độc tính hoặc độc tính rất thấp với tế bào thử

nghiệm.

Sau đó, chúng tôi đã lựa chọn phép thử ức chế sự sản sinh các cytokine gây

viêm (IL-6, IL-12p40 và TNF-α) từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích

thích bởi LPS để đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất. Kết quả sàng lọc

hoạt tính kháng viêm của 14 hợp chất trên cytokine IL-12p40 được thể hiện ở hình

4.15. Kết quả cho thấy trong số 14 hợp chất thử nghiệm, có 4 hợp chất thể hiện hoạt

tính tốt ở nồng độ 25 µM là hợp chất EB-1 ((3S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-

glucopyranoside-chất mới), EB-4 (hongconin), EB-5 (eleutherine) và EB-6

(isoeleutherine).

Hình 4.15 Tác dụng của hợp chất EB-1-EB-14 ở nồng độ 25,0 µM đến sự sản

sinh IL-12 p40 từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS

Vì vậy các chất này (EB-1, EB-4, EB-5, và EB-6) cùng với cặn chiết tổng

methanol được chúng tôi lựa chọn để làm các thử nghiệm tiếp theo để xác định giá

trị IC50 ở các nồng độ 6,3; 12,5; 25,0; 50,0 µM. Chất SB203580 (4-[4(4-

fluorophenyl)-2(4-methylsulfinylphenyl)-1 H -imidazol-5-yl] pyridine) được sử

106

dụng làm đối chứng dương ức chế sự sản sinh IL-12 p40, IL-6, và TNF-α với giá trị

IC50 tương ứng là 5,2 ± 0,1; 3,5 ± 0,1; và 7,5 ± 0,2 µM (Bảng 4.12).

100

)

%

6.3 µM 12.5 µM 25.0 µM 50.0 µM

( n o i t i b i h n I 0 4 p 2 1 -

L I

Pos.

Compounds

100

6.3 µM 12.5 µM

25.0 µM 50.0 µM

)

%

( n o i t i b i h n I 6 -

L I

Pos.

Compounds

100

)

6.3 µM 12.5 µM 25.0 µM 50.0 µM

%

( n o i t i

b

i

h n I

αααα - F N T

Pos.

Compounds

Hình 4.16 Tác dụng của các hợp chất EB-1, EB-4, EB-5 và EB-6 ở nồng độ 6,3; 12,5; 25,0 và 50,0 µM đến sự sản sinh IL-12 p40 (A), IL-6 (B) và TNF-α (C)từ tế bào tua DC được kích thích bởi LPS .

107

Bảng 4.12 Hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành

trên tế bào tua sinh ra từ tủy xương được kích thích bởi LPS

IC50

IL-12 p40 (µg/mL) IL-6 (µg/mL) TNF-α (µg/mL)

0,1 ± 0,05 16,2 ± 0,3 >50

2,5 ± 0,1 1,7 ± 0,2 3,6 ± 0,2

IL-12 p40 (µM) IL-6 (µM) TNF-α (µM) Cặn chiết Metanol SB203580a) Hợp chất

1,0 ± 0,1 5,0 ± 0,2 >50 EB-1

5,0 ± 0,4 8,7 ± 0,3 61,2 ± 1,5 EB-4

0,1 ± 0,08 1,7 ± 0,1 39,6 ± 2,0 EB-5

0,2 ± 0,1 2,6 ± 0,4 >50

a)đối chứng dương.

5,2 ± 0,1 3,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 EB-6 SB203580a)

Kết quả ở hình 4.16 và bảng 4.12 cho thấy các hợp chất EB-1, EB-4, EB-5, EB-

6 và cặn chiết methanol EB-Me ức chế sự sản sinh IL-12 p40 được kích thích bởi

LPS với giá trị IC50 từ 0,1 ± 0,08 đến 5,0 ± 0,4 µM. Các hợp chất EB-1, EB-5 và

EB-6 cũng ức chế sự sản sinh IL-6 tiền viêm với giá trị IC50 từ 1,7 ± 0,1 tới 5,0 ±

0,2 µM. Tuy nhiên, chỉ có hai hợp chất EB-4 và EB-5 có hoạt tính ức chế ở mức độ

trung bình sự sản sinh TNF-α với giá trị IC50 tương ứng là 61,2 ± 1,5 và 39,6 ± 2,0

µM. Ngoài ra, các hợp chất (–)-hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), và

isoeleutherin (EB-6) được phân lập từ cây Eleutherine americana cũng ức chế sự

sản sinh nitric oxide ở dòng tế bào đại thực bào ở chuột RAW 264,7 được hoạt hóa

bởi LPS. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hợp chất mới EB-1 và 3 hợp

chất đã biết EB-4, EB-5 và EB-6 phân lập từ thân rễ cây E. bulbosa thể hiện hoạt

tính ức chế sự sản sinh của TNF-α, IL-6, và IL-12 p40 trong tế bào DCs được kích

thích bởi LPS khá tốt.

Kết quả nghiên cứu này cho thấy các hợp chất trên có thể được sử dụng như là

chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai. Tác dụng ức chế sự sản sinh các

cytokine gây viêm TNF-α, IL-6, IL-12 từ tế bào tua DCs được kích thích bởi LPS

của các hợp chất phân lập được từ củ sâm đại hành lần đầu tiên được chúng tôi

nghiên cứu và công bố.

108

4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ LOÀI XẠ CAN

4.2.1 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ thân rễ cây xạ can

Từ cặn chiết etyl axetat (BS-Et) và cặn chiết nước (BS-W) thân rễ cây xạ can

chúng tôi đã phân lập được 14 hợp chất ký hiệu từ BS-1 đến BS-14 (theo sơ đồ

phân lập hình 3.4 và hình 3.5), cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng

cách kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như sau:

Hợp chất BS-1 (15)

Chất BS-1 phân lập được ở dạng bột mầu vàng từ cặn chiết etyl axetat của thân rễ cây Xạ can. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR (Hình 4.17a) của chất BS-1 xuất

hiện 4 proton thơm tại δ 6,56 (1H, s, H-8); 7,77 (1H, s, H-2) và δ 6,67 (2H, s, H-2',

H-6'), sự có mặt của một nhóm dioxymethylene được xác định bởi tín hiệu singlet

tại δ 5,99 (2H, s, O-CH2-O) và bốn tín hiệu singlet của 4 nhóm methoxy gắn vào

vòng thơm tại δ 4,00 (3H, s, OCH3-5); 3,81 (6H, s, OCH3-3', 5') và 3,77 (3H, s,

OCH3-4'). Tương tác giữa proton tại δ 7,76 (H-2) với cacbon tại δ 150,8 (C-2) trong

phổ HSQC xác định tương tác giữa H-2/C-2 của vòng isoflavon trong phân tử chất

BS-1. Ngoài ra còn tín hiệu tương tác của proton tại δ 6,67 với các bon tại δ 106,6

và 2 nhóm metoxy tại δ 3,81/δ 56,0 cho thấy vòng B bị thế tại bốn vị trí và hai

nhóm metoxy gắn vào C-3′ và C-5′ [105].

Hình 4.17a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-1

109

Phổ 13C-NMR và DEPT (Hình 4.17b) của BS-1 chỉ ra tín hiệu của 20 nguyên

tử các bon gồm 4 nhóm methoxyl (δ 56,0x2; 60,9; và 60,6), 1 nhóm dioxymethylen

(δ 102,1) và 15 nguyên tử cacbon thuộc về khung isoflavone. Trên phổ HMBC

(Hình 4.3d) xuất hiện các tương tác xa giữa proton H-2 (δ 7,76) với cacbon C-4 (δ 175,3), C-9 (δ 154,5) và C-1′ (δ 127,3); giữa proton H-8 (δ 6,56) với C-9 (δ 154,5),

C-7 (δ 152,9), C-6 (δ 135,2) và C-10 (δ 113,4); và giữa proton dioxymethylene tại δ

5,99 với C-6 (δ 135,2) và C-7 (δ 152,9), điều này xác nhận sự có mặt của khung

isoflavon và nhóm thế dioxymethylene gắn vào vị trí C-6 và C-7.

Hình 4.17b Phổ DEPT của chất BS-1

Dữ liệu phổ HMBC cho thấy proton H-2′ tại δH 6,67 lại tương tác với C-3 (δ

125,4), C-3′ (δ 152,8) và C-4′ (δ 137,9), proton methoxyl tại δ 3,81 và 3,77 có

tương tác với C-3′ (δ 152,8) và C-4′ (δ 137,9), điều này cho thấy 3 nhóm methoxyl

được gắn vào C-3′, C-4′ và C-5′.

Hình 4.17c Phổ HMBC của chất BS-1

110

Từ các dữ liệu đã phân tích ở trên cấu trúc của chất BS-1 được chỉ ra như hình 4.17e với công thức phân tử là C20H18O8, với pic ion phân tử [M-H]¯ tại m/z 385 trong phổ ESI (Hình 4.17d). So sánh với tài liệu tham khảo [151], hợp chất BS-1

được xác định là 5,3′,4′,5′-tetramethoxy-6,7-methylenedioxyisoflavone hay

irisflorentin (hình 4.17e).

9 10

OCH3

3' 4'

OCH3

Hình 4.17d Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-1

Hình 4.17e Cấu trúc của hợp chất BS-1 (irisflorentin)

Hợp chất BS-2 (16) và BS-3 (17)

Chất BS-2 phân lập được dạng tinh thể màu vàng nhạt, điểm chảy 235-236°C.

Sự có mặt của khung isoflavon trong phân tử chất BS-2 được dự đoán qua phổ hấp thụ tử ngoại UV tại λmax 259, 320nm. Phổ 1H-NMR (Hình 4.18a) của BS-2 chỉ ra sự

có mặt một singlet tại δ 7,99 (1H, s) là của proton H-2, các tín hiệu singlet khác tại

δ 6,41 (1H, s) dự đoán vòng A là penta-substituted và một nhóm methoxyl tại δ

3,87 (3H, s, OCH3-6). Tín hiệu doublet doublet tại δ 6,84 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz,

111

H-3′, 5′) và 7,35 (2H, dd, J = 8,5; 1,5 Hz, H-2′, 6′) dự đoán nhóm thế của vòng

thơm là para-substitued,

Hình 4.18a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-2

Phổ 13C-NMR (Hình 4.18b) của BS-2 chỉ ra tín hiệu của 16 nguyên tử cacbon,

gồm một nhóm methoxyl và 15 cac bon của khung isoflavone, các tín hiệu này đã

được xác nhận thêm qua phổ DEPT 90, DEPT 135 và HSQC. Thêm vào đó, trên phổ ESI MS (Hình 4.18c) pic ion phân tử [M-H]+ của BS-2 xuất hiện tại m/z 299

hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C16H12O6.

Hình 4.18b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-2

112

Hình 4.18c Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-2

Khi so sánh với tài liệu tham khảo [113], tất cả dữ liệu phổ của chất BS-2 đồng

nhất với các dữ liệu phổ của 4′,5,7-trihydroxy-6-methoxyisoflavone hay

MeO

5 OH

tectorigenin vì vậy chất BS-2 được xác định là tectorigenin.

Hình 4.18d Cấu trúc của hợp chất BS-2 (Tectorigenin)

Chất BS-3 phân lập được dạng tinh thể màu vàng. Phổ UV, 1H- và 13C-NMR

của BS-3 tương tự như của chất BS-2 cho thấy chất BS-3 cũng là một isoflavonoid.

Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.19a) của BS-3 cho các tín hiệu proton tại δ 6,88 (1H, d,

J = 8,0 Hz, H-2′), 6,96 (1H, dd, J = 8,0; 2,0 Hz, H-6′), và 7,14 (1H, J = 2,0 Hz, H-

5′) cho thấy vòng B bị thế tại vị trí 1, 3, 4 tín hiệu của 2 singlet tại δ 6,46 và 8,06

được gán lần lượt cho proton H-8 và H-2, hai nhóm methoxyl xuất hiện tại δ 3,89

(3H, s, OCH3-6) và 3,90 (3H, s, OCH3-3′).

113

Hình 4.19a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-3

Phổ 13C-NMR của BS-3 xuất hiện tín hiệu của 17 nguyên tử cácbon bao gồm

hai nhóm methoxyl tại δ 56,4 (OCH3-3′) và 60,9 (OCH3-6), còn lại các nguyên tử

khác thuộc về khung isoflavone, điều này cũng được xác nhận trên phổ DEPT 90,

DEPT 135, HSQC và HMBC. Hơn nữa, phổ khối ESI MS của BS-3 chỉ ra pic ion [M-H]+ tại m/z 329 phù hợp với công thức phân tử C17H14O7.

Hình 4.19b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-3

Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, chất BS-3 được xác định là

OCH3

H3CO

iristectorigenin A hay (4′,5,7-trihydroxy-3′,6 dimethoxyisoflavone) [113].

Hình 4.19c Cấu trúc của hợp chất BS-3 (iristectorigenin A)

114

Hợp chất BS-4 (18)

Phổ 13C-NMR (Hình 4.20b) của chất BS-4 tương tự như chất BS-3 ngoại trừ có

xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm methoxy do vậy chất BS-4 cũng được dự

đoán là dẫn xuất của chất BS-3.

Hình 4.20a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-4

Tín hiệu proton và các bon của 3 nhóm methoxy tại δ 3,88/136,2; 3,89/152,7 và

3,94/131,2; bốn cacbon metin tại δ 7,90/153,3; 6,48/93,9; 6,68/105,7 và δ 6,68/109,4 được xác nhận từ phổ 13C-NMR, DEPT 90, DEPT 135 và HSQC. Vị trí

của các nhóm thế methoxy tại C-6, C-5′ và C-4′ được xác định qua phổ tương tác xa

HMBC.

Hình 4.20b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-4

115

Cấu trúc của chất BS-4 được chỉ ra ở hình 4.20c, các dữ liệu phổ cộng hưởng từ

của BS-4 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ của 3′,5,7-trihydroxy-4′,5′,6

trimethoxyisoflavone (hay irigenin) khi so sánh với tài liệu tham khảo [113]. Điều

này cũng hoàn toàn phù hợp với phổ khối ESI MS của BS-4 với pic ion phân tử [M- H]- tại m/z 359, phù hợp với công thức phân tử là C18H16O8. Do vậy, chất BS-4 được

9 10

H3CO

3' 4'

OCH3

5' OCH3

xác định là irigenin.

Hình 4.20c Cấu trúc của hợp chất BS-4 (irigenin)

Hợp chất BS-5 (19)

Phổ 13C-NMR (Hình 4.21a) của BS-5 xuất hiện tín hiệu của 9 nguyên tử các

bon. Trong đó có 6 tín hiệu của các bon vòng thơm tại δ 130,3 (C-2); 124,1 (C-3);

146,6 (C-4); 150,4 (C-5); 113,8 (C-6) và 109,8 (C-7), 3 tín hiệu khác tại δ 196,7;

26,17 và 56,12 lần lượt của nhóm cacbonyl, methyl, và methoxyl.

Hình 4.21a Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-5

116

Tín hiệu tại δ 6,94 (d, J = 8,0 Hz); 7,54 (dd, J = 8,0; 1;8 Hz), và 7,53 (d, J = 1,8 Hz) trong phổ 1H-NMR (Hình 4.21b) xác nhận vòng thơm bị thế tại vị trí 1, 3, 4.

Hình 4.21b Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-5

Trên phổ HMBC xuất hiện các tương tác giữa H-8 (δ 2,56) và C-2 (δ 130,3),

giữa H-6 (δ 6,94) và C-4 (δ 146,6), giữa H-7 (δ 7,54) và C-5 (δ 150,4), và giữa

proton methoxyl tại δ 3,96 và C-4 và không xuất hiện tương tác giữa H-7 và C-4.

Điều này xác nhận rằng nhóm hydroxyl, methoxy và cacbonyl lần lượt gắn vào các

vị trí C-5, C-4 và C-2 của vòng thơm.

Hình 4.21c Phổ HMBC của chất BS-5

117

Phổ ESI MS của BS-5 xuất hiện píc ion phân tử [M+H]+ tại m/z 167 hoàn toàn

phù hợp với công thức phân tử C9H10O3 .

Hình 4.21d Phổ khối lượng ESI-MS của chất BS-5

Từ các dữ liệu trên cho phép xác định chất BS-5 là acetovanillone. Hợp chất này

CH3

OCH3

lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can.

Hình 4.21e Cấu trúc của hợp chất BS-5 (acetovanillone)

Hợp chất BS-6 (20)

Hợp chất BS-6 nhận được ở dạng tinh thể màu vàng. Phổ tử ngoại UV-VIS

của nó cho đỉnh hấp thụ tại λmax 255 nm (dải I) và 365 nm (dải II) đặc trưng cho sự có mặt của khung flavonoit trong phân tử. Phổ 1H-NMR (Hình 4.22a) của BS-6

xuất hiện hai duplet tại δ 6,93 (2H, J = 8,5 Hz, H-3, 5′) và 7,82 (2H, J = 9,0 Hz, H-

2′, 6′) cho thấy vòng C bị thế tại para-, ngoài ra còn có hai singlet tại δ 6,54 (H-8)

và 6,56 (H-6) cùng với một singlet của nhóm methoxy tại 3,89 (OCH3-7).

118

Hình 4.22a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-6

Phổ 13C-NMR và DEPT 90, DEPT 135 của BS-6 chỉ ra tín hiệu của 16

cacbon gồm: 1xCH3 (δ 60,9); 6xCH và 9xCq trong đó tín hiệu của nhóm C=O (C-4)

tại δ 182,4; điều này được khẳng định thêm bởi các dữ liệu từ phổ HSQC. Phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) của BS-6 cho píc ion tại m/z 299 [M-H]+ tương ứng

với công thức phân tử C16H12O6. So sánh dữ liệu phổ của chất BS-6 với các dữ liệu

đã được công bố [59] là hoàn toàn phù hợp, do vậy chất BS-6 được xác định là

H3CO

9 10

rhamnocitrin hay 3, 4′, 5-trihydroxy-7-methoxyflavone.

Hình 4.22b Cấu trúc của hợp chất BS-6 (rhamnocitrin)

Hợp chất BS-7 (21)

Hợp chất BS-7 phân lập được ở dạng bột màu vàng. Phổ tử ngoại UV-VIS

của nó cho đỉnh hấp thụ tại λmax 259 và 320nm gợi ý cho sự có mặt của khung

isoflavonoit trong phân tử. Phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) (Hình 4.23c) với píc ion tại m/z 315 [M-H]- tương ứng với công thức phân tử C16H12O7 (M=316)

Phổ 1H-NMR (Hình 4.23a) của chất BS-7 cho các tín hiệu cộng hưởng của

vòng A tại δ 8,01 (1H, s, H-2); 6,46 (1H, s, H-8) và một nhóm methoxy tại δ 3,89

119

(3H, s, OCH3-6) cho thấy vòng A bị thế ở vị trí penta. Các tín hiệu cộng hưởng còn lại tại δ 6,85 (2H, d, J=2,0 Hz, H-2′, 6′) và 7,02 (1H, d, J =1,5 Hz, H-5′) cho thấy

vòng C bị thế tại hai vị trí meta- và para-.

Hình 4.23a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-7

Phổ 13C-NMR (Hình 4.23b) và DEPT 90, DEPT 135 của BS-7 chỉ ra tín hiệu

của 16 cacbon gồm: 1x CH3 (δ 60,9); 5xCH và 10xCq trong đó tín hiệu của nhóm

C=O (C-4) tại δ 182,4. So sánh số liệu phổ của BS-7 với các giá trị tương ứng đã

được công bố cho hợp chất 3′,4′,5,7- tetrahydroxy-6-methoxyisoflavone [95] cho

phép xác định cấu trúc chất BS-7 là 3′, 4′, 5, 7- tetrahydroxy-6-methoxyisoflavone

hay Irilin D.

Hình 4.23b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-7

120

H3CO

Hình 4.23c Phổ khối ESI-MS của chất BS-7

Hình 4.23d Cấu trúc của hợp chất BS-7 (Irilin D)

Hợp chất BS-8 (22)

Chất BS-8 nhận được ở dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-NMR

(Hình 4.24a) của BS-8 xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm metyl tại δ 0,77; 0,81; 0,82;

0,83; 0,90 và 0,96 trong đó có cặp tín hiệu dublet tại 0,82 (H-26) và 0,81 (H-27)

cùng có hằng số tương tác J=7,0 Hz thể hiện tương tác geminal của dimetyl trên

nhóm metin [-CH(CH3)2]. Tín hiệu của một dublet tại δ 5,33 với hằng số tương tác

J=5 Hz cho thấy sự có mặt của một nối đôi tại C5-C6, cùng với một multiplet tại δ

3,46 (1H, m, H-3) cho thấy BS-8 là dẫn xuất của sitosterol. Ngoài ra trên phổ còn

xuất hiện tín hiệu của một proton anomer tại δ 4,22 với hằng số tương tác lớn J=7,0

Hz cùng với 4 tín hiệu proton của 4 nhóm OH trong vùng 4,39 đến 4,85 cho phép

dự đoán sự có mặt của một phân tử đường glucose trong phân tử hợp chất.

121

Hình 4.24a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-8

Điều này được khẳng định thêm bởi tín hiệu trên phổ 13C-NMR (Hình 4.24b)

với 29 cacbon, trong đó tín hiệu của cacbon anomer tại δ 100,7 và 5 tín hiệu còn lại

của đường glucose tại 73,3; 76,4; 70,1; 76,7 và 60,1.

Hình 4.24b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-8

122

Từ các phân tích trên kết hợp với kết quả phổ khối lượng ESI-MS với pic ion tại m/z 575 [M-H]- tương ứng với công thức phân tử C35H60O6 (M = 576) và sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13C-NMR của BS-8 với tài liệu đã công bố [90] cho

phép xác định cấu trúc chất BS-8 là sitosterol-3-O- β-D-glucopyranoside hay

daucosterol.

Hình 4.24c Cấu trúc của hợp chất BS-8 (daucosterol)

Hợp chất BS-9 (23)

Hợp chất BS-9 thu được dưới dạng chất bột màu trắng, nóng chảy ở 256-

257oC.

Các tín hiệu trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân và cacbon có các tín hiệu

tương tự như các hợp chất isoflavonoid như BS-1, BS-2 cho phép chúng tôi dự đoán đây là môt hợp chất isoflavonoid. Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.25a) thấy sự có mặt

của một vòng thơm thế para- thông qua sự xuất hiện của hai tín hiệu doublet tại δH

7,40 (H-2′, 6′) và 6,83 (H-3′, 5′) với hằng số tương tác J=8,5 Hz và cường độ tích

phân của mỗi tín hiệu là 2H. Một tín hiệu singlet tại δH 8,43 của proton H-2 và một

tín hiệu singlet khác tại δH 6,88 của proton H-8 của vòng A bị thế tại 5 vị trí của

khung isoflavonoid. Sự có mặt một gốc đường glucose được xác định bởi các tín

hiệu tại δH 5,08 (d, J=7,5 Hz, H-1ʺ), 3,36 (m, H-2ʺ), 3,34(m,H-3ʺ), 3,19 (dd, J=9

Hz, J=8 Hz, H-4ʺ), 3,44 (m, H-5ʺ), 3,73 (d, J=10,5 Hz, Ha-6ʺ), 3,45 (d, J=7,5 Hz,

Hb-6ʺ), trong đó hằng số tương tác JH-1”/H-2” là 7,5 Hz cho thấy có sự hình thành liên

kết O-glucoside và cấu hình β của proton anome (vicinal H-1ʺ/H-2ʺ ở vị trí trans).

123

Hình 4.25a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-9

Trên phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện 20 tín hiệu tương ứng với 22 nguyên

tử cacbon do hai tín hiệu CH tại δC 130,11 và 115,05 xuất hiện với cường độ cao

gấp đôi các tín hiệu CH khác, đồng thời mỗi tín hiệu này có liên hệ với hai proton

tương ứng tại δH 7,40 (H-2′, H-6′) và 6,83 (H-3′, H-5′) trên phổ HSQC (Hình 4.25c). Các tín hiệu thu được trên phổ 13C-NMR kết hợp với các tín hiệu thu được

từ phổ DEPT-90 và DEPT-135 (Hình 4.25b) cho thấy 22 nguyên tử cacbon của hợp

chất BS-9 được xác định tương ứng với chín cacbon bậc 4, 11 nhóm metin, một

nhóm metylen và một nhóm metyl. Xem xét từng phần cấu hình của chất này có thể

thấy rằng phần khung flavon với 15 tín hiệu tại δC 154,6 (C-2); 121,1 (C-3); 180,70

(C-4); 152,8 (C-5); 132,4 (C-6); 156,5 (C-7); 94,0 (C-8); 152,4 (C-9); 106,4 (C-10);

122,0 (C-1′); 130,1 (C-2′, 6′); 115,0 (C-3′, 5′) và 157,4 (C-4′); 6 tín hiệu khác nằm

trong vùng trường cao của các tín hiệu của một gốc đường tại δC 100,17 (C-1ʺ); 73,

11 (C-2ʺ); 76,67 (C-3ʺ); 69,64 (C-4ʺ); 77,26 (C-5ʺ) và 60,64 (C-6ʺ). Một tín hiệu singlet khác trên phổ 1H-NMR tại δH 3,80 và tương ứng trên phổ 13C-NMR tại δC

60,24 chứng tỏ sự có mặt của một nhóm OCH3.

124

Hình 4.25b Phổ cộng hưởng từ 13C- và DEPT của chất BS-9

Phổ HMBC (Hình 4.25d) cho thấy H-1ʺ (δH 5,08) có tương tác với C-7 (δC

156,5), cho thấy rõ có liên kết O-glucoside tại C-7. Các proton của nhóm OCH3 (δH

3,80) có tương tác với C-5 (δC 152,8) và C-7 (δC 156,5) chứng tỏ nhóm OCH3 được

gắn vào vị trí C-6 của khung isoflavon. Phổ ESI-MS của hợp chất BS-9 cho pic ion phân tử tại m/z 463 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C22H22O11. So sánh các dữ liệu phổ thu được của hợp chất BS-9 với tài liệu tham khảo [34] thấy hoàn

toàn phù hợp. Vì vậy, hợp chất BS-9 được xác định là tectoridin.

Hình 4.25c Phổ HSQC của chất BS-9

125

OH H

MeO

Hình 4.25d Phổ HMBC của chất BS-9

Hình 4.25e Cấu trúc của hợp chất BS-9 (Tectoridin)

Hợp chất BS-10 (24)

Chất BS-10 phân lập được ở dạng bột vô định hình, màu vàng. Các dữ liệu phổ

NMR (Hình 4.26a) của BS-10 tương tự BS-9, cho thấy đây là một dẫn xuất

flavonoit glycoside với các tín hiệu đặc trưng của phần aglycon tại δH 8,43 (1H, s,

H-2); 6,87 (1H, s, H-8) và vòng B thế para tại δH 6,83 (2H, dd, J = 8,0; 1,5 Hz, H-3′,

5′); 7,38 (2H, dd, J = 8,0; 1,5 Hz, H-2′, 6′), tín hiệu của proton anome của đường

glucose tại 5,45 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-1″) và tín hiệu của nhóm metylen nối với oxi

tại δC 60,7 (C-6″). Tín hiệu H-2 chuyển dịch rất mạnh về trường thấp (δH 8,43) đồng

thời cacbon metin C-2 cũng có độ dịch chuyển về phía trường thấp (δC 154,7), do đó

phải nối với nguyên tử oxi chứng tỏ hợp chất BS-10 có khung isoflavon. Tín hiệu

singlet tại 6,87 cho thấy vòng A bị thế cả 5 vị trí. Ngoài ra còn tín hiêu của một

nhóm methoxy tại 3,75 (3H, s). Gía trị hằng số tương tác spin-coupling giữa H-1″

và H-2″của phân tử đường bằng 8,0 Hz cho thấy sự có mặt của liên kết O-glucoside

và cấu hình β của proton anome.

126

Hình 4.26a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-10

Phổ 13C-NMR (Hình 4.26b) của chất BS-10 tương tự của hợp chất BS-9 với tín

hiệu của 22 nguyên tử các bon. Điểm khác nhau giữa hai chất này là vị trí của phân

tử đường glucose. Trên phổ HMBC của chất BS-10 xuất hiện tương tác của H-1″ (5,45) với C-4' (156,6) cho thấy phân tử đường glucose được gắn vào C-4'. Các

proton của nhóm OCH3 (δH 3,75) có tương tác với C-5 (δC 152,9), C-6 (δC 132,5) và

C-7 (δC 157,5) chứng tỏ nhóm OCH3 được gắn vào vị trí C-6 của khung isoflavon. Phổ ESI-MS của hợp chất BS-10 cho pic ion phân tử tại m/z 485 [M+Na]+ tương

ứng với công thức phân tử C22H22O11. Vì vậy, hợp chất BS-10 được xác định là

Tectorigenin 4’-O-β-D-glucopyranoside.

Hình 4.26b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-10

127

MeO

HO HOHO

Hình 4.26c Cấu trúc của hợp chất BS-10 (Tectorigenin 4’-O-β-D-glucopyranoside)

Hợp chất BS-11 (25)

Chất BS-11 phân lập được dạng bột vô định hình, màu vàng. Các dữ liệu phổ

NMR (Hình 4.27a, b) cho thấy đây là một dẫn xuất flavonoid glycoside. Phần

aglycon được xác định là kaempferol với các tín hiệu tại δH 6,20 (1H, d, J=2,0 Hz,

H-6); 6,43 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8); 6,88 (2H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-3′, H-5′); và 8,03

(2H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-2′, H-6′).

Hình 4.27a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-11

Tín hiệu của một phân tử đường β-D-glucopyranoside được xác nhận bởi các

tín hiệu tại 5,45 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1″) và 101,0 (C-1″); 74,3 (C-2″); 76,5 (C-3″);

70,0 (C-4″); 77,6 (C-5″); 61,6 (C-6″).

128

Hình 4.27b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-11

Phổ HMBC xuất hiện tương tác của H-1″ tại δH 5,45 với C-3 tại δC 133,3 cho

thấy phân tử đường glucose phải được gắn vào vị trí C-3. Phổ ESI-MS của hợp chất BS-11 cho pic ion phân tử tại m/z 471 [M+Na]+ tương ứng với công thức phân tử

C21H20O11. Vì vậy, hợp chất BS-11 được xác định là Kaempferol-3-O-β-D-

glucopyranoside, các dữ liệu phổ thu được của hợp chất BS-11 phù hợp với tài liệu

tham khảo [69]. Đây cũng là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ Belamcanda

HO HOHO

chinensis.

Hình 4.27c Cấu trúc của hợp chất BS-11 (Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside)

Hợp chất BS-12 (26)

Chất BS-12 phân lập được ở dạng bột vô định hình, màu vàng. Dữ liệu phổ

NMR (Hình 4.28a, b) của chất BS-12 tương tự của chất BS-11 cho thấy đây cũng là

một dẫn xuất flavonoit glycoside. Điểm khác biệt của chất BS-12 so với chất BS-11

là tín hiệu cộng hưởng của proton tại C-3′ đã bị thế bởi nhóm hydroxy (OH) dẫn tới

129

tín hiệu của các proton của vòng B có độ chuyển dịch khác nhau: 7,71 (1H, d, J=2,0

Hz, H-2′), 6,88 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5′) và 7,56 (1H, d, J=2,0; 8,0 Hz, H-6′).

Hình 4.28a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-12

Hình 4.28b Phổ cộng hưởng từ 13C-NMR của chất BS-12

Phổ ESI-MS của hợp chất BS-12 cho pic ion phân tử tại m/z 487 [M+Na]+

tương ứng với công thức phân tử C21H20O12. Như vậy, hợp chất BS-12 được xác

định là isoquercetin, số liệu phổ thu được của hợp chất BS-12 phù hợp với tài liệu

tham khảo [69]. Hợp chất này cũng là lần đầu tiên phân lập được từ cây

Belamcanda chinensis.

130

OH 3'

HO HOHO

Hình 4.28c Cấu trúc của hợp chất BS-12 (Isoquercetin)

Hợp chất BS-13 (27) và BS-14 (28)

Chất BS-13 phân lập được ở dạng tinh thể hình kim, màu trắng.

Trên phổ 1H –NMR, thấy xuất hiện hai tín hiệu singlet của 2 nhóm metyl tại

δ 0,80 (3H, s, J=6,0, H-28), δ 1,03 (3H, s, 6,0, H-29), ba tín hiệu doublet của 3

nhóm metyl tại δ 0,70 (3H, s, H-19), δ 0,79 (3H, d, J=7,0, H-26), 0,82 (3H, d,

J=6,5, H-27), và 1 tín hiệu triplet tại δ 0,83 (3H, t, J=6,0, H-24). Ba tín hiệu tại δ

5,35 (1H, brs, H-6), δ 5,13 (1H, m, H-20), δ 5,35 (1H, m, H-21) cho thấy sự có mặt của liên kết đôi. Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 29 tín hiệu, các tín hiệu tại 140,4 (C-

5), 120,6 (C-6), 128,5 (C-22), 137,7 (C-23) là các cacbon thuộc về liên kết đôi.

Hình 4.29a Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của chất BS-13

Hợp chất BS-13 được xác định là 24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol bằng cách

so sánh dữ liệu phổ NMR của nó với tài liệu [89] và đối chiếu với mẫu thực.

131

8 7

Hình 4.29b Cấu trúc của hợp chất BS-13 (24E-stigmasta-5,22-dien-3β-ol)

Chất BS-14 phân lập được ở dạng bột màu trắng, được nhận dạng là axit

myristic bằng việc phân tích các dữ liệu phổ NMR và kết hợp với kết quả của phổ khối va chạm ion EI-MS (Hình 4.30b) với pic ion tại m/z 228 [M]+ tương ứng với

công thức phân tử C13H27COOH (M=228) với độ trùng lặp so với thư viện phổ là

99%.

Hình 4.30a Cấu trúc của hợp chất BS-14 (Axit myristic )

Hình 4.30b Phổ GC-MS của chất BS-14

Từ cặn chiết etyl axetat BS-Et và cặn nước BS-W của thân rễ cây xạ can,

chúng tôi đã phân lập và xác định cấu trúc của 14 hợp chất. Trong đó, có 7 hợp chất

isoflavonoid, 3 hợp chất flavonoid và 4 hợp chất khác. Hai hợp chất tectoridin và

tectorigenin là thành phần chính trong thân rễ thực vật này.

132

Bảng 4.13 Bảng tổng hợp các hợp chất BS-1→BS-14 phân lập được từ thân rễ

cây xạ can

Iristectorigenin A (BS-3)

Irisflorentin (BS-1)

Tectorigenin (BS-2)

Rhamnocitrin (BS6-)

Irigenin (BS-4)

Acetovanillone (BS-5) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

Tectoridin (BS9-)

Irilin D (BS-7)

Daucosterol (BS-8)

Tectorigenin 4’-O-β-D- glucopyranoside (BS-10)

Isoquercetin (BS-12) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

Kaempferol-3-O-β-D- glucopyranoside (BS-11) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

Axit myristic (BS-14) Lần đầu tiên phân lập được từ cây xạ can

24E-stigmasta-5,22-dien-3ββββ-ol (BS-13)

133

4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm

4.2.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm các cặn chiết thân rễ xạ can

Tiến hành điều chế tạo các cặn chiết thô từ thân rễ loài xạ can theo sơ đồ

hình 3.1 (chương 3). Các cặn chiết thu được là cặn metanol (BS-Me), n-hexan (BS-

Hx), cặn etyl axetat (BS-Et) và cặn nước (BS-W) được tiến hành đánh giá hoạt tính

kháng viêm theo đường bôi và đường uống. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.14

và 4.15.

Bảng 4.14 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng viêm theo đường bôi các cặn chiết thân rễ xạ can

Trọng lượng tai (mg) % ức chế STT Tên mẫu khối viêm Tai Thí nghiệm Tai đối chứng dương

Cặn metanol BS-Me 33,65 ± 0,64 34,75 ± 0,35 10,74 1

Cặn n-hexan BS-Hx 33,25 ± 0,92 34,85 ± 0,64 15,47 2

Cặn etyl axetat BS-Et 34,30 ± 0,85 35,35 ± 0,14 9,69 3

Cặn nước BS-W 32,70 ± 0,42 34,50 ± 0,57 18,02 4

Dexamethasone 56,39 9 29,15 ± 0,42 35,15 ± 0,52

10 ĐC (-) 0 24,51 ± 1,12

Cả 4 cặn chiết của mẫu nghiên cứu đều thể hiện hoạt tính yếu ức chế khối

viêm cục bộ theo đường bôi so với đối chứng Dexamethasone.

Bảng 4.15 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng viêm theo đường uống các cặn chiết

thân rễ xạ can

Trọng lượng chân (mg) Tên mẫu % ức chế STT khối viêm Tiêm Fomalin Không tiêm Fomalin

Cặn metanol BS-Me 130,30 ± 4,76 113,40 ± 5,36 16,89 1

Cặn n-hexan BS-Hx 130,33 ± 5,98 115,70 ± 8,05 28,03 2

Cặn etyl axetat BS-Et 126,47 ± 9,44 120,37 ± 9,05 70,00 3

Cặn nước BS-W 125,90 ± 8,94 118,63 ± 9,40 64,26 4

Indomethacine 116,73 ± 7,77 109,53 ± 7,92 64,59 9

10 ĐC (-) 138,77 ± 2,30 118,43 ± 5,00 0,00

Qua quá trình nghiên cứu hoạt tính kháng viêm theo đường uống cho thấy có

2 mẫu ức chế được trên 50,0 % thể tích khối viêm so với đối chứng âm (không sử

134

dụng hoạt chất), đó là cặn chiết Etyl axetat (BS-Et) và cặn chiết nước (BS-W) với

% ức chế khối viêm tương ứng là 70,0% và 64,26%. Chất đối chứng dương

Indomethacine ức chế được 64,59% khối viêm.

4.2.2.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học và độ an toàn của tectorigenin

phân lập được từ thân rễ xạ can

Hợp chất tectorigienin là thành phần chính trong cây xạ can và đã được

chúng tôi phân lập từ thân rễ với lượng tương đối lớn, 0,25-0,3% so với khối lượng

mẫu khô. Như đã trình bày ở phần tổng quan, hợp chất này đã được chứng minh có

hoạt tính sinh học phong phú như: kháng nấm [80], ức chế enzym khử aldose [130],

chống oxy hoá [129], điều biến thụ thể estrogen một cách chọn lọc [29], kháng u

[107] [115]. Nhằm định hướng tạo cơ sở để phát triển, khai thác và sử dụng hợp

chất này có hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sâu hơn về tác dụng kháng

viêm, giảm đau và độ an toàn của tectorigenin trên động vật thực nghiệm.

a. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm, giảm đau của tectorigenin

Tectorigenin được đánh giá tác dụng sinh học trên động vật thực nghiệm trên 3

mô hình: (cid:1) Nghiên cứu tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic (cid:1) Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù viêm chân chuột

bằng dung dịch carragenin 1%.

(cid:1) Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây viêm u hạt bằng

amian.

* Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau của tectorigenin

Tác dụng giảm đau của tectorigenin được tiến hành trên chuột nhắt theo

phương pháp gây đau bằng acid acetic. Kết quả được trình bày tại bảng 4.16 và hình

4.31.

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của tectorigenin lên số cơn đau quặn

Thời gian

Số cơn đau quặn

0 – 5 phút

5-10 phút 10-15 phút 15–20 phút 20–25 phút 25–30 phút

Mẫu thử

Lô 1 (Chứng trắng)

dung dịch NaCl

10 ± 0,61

18 ± 0,47 18,1± 0,39 13,77 ± 0,35 14± 0,28

11,3± 0.32

0,9%)

135

Lô 2 (Chứng +)

5,25± 0,54

11 ± 0,43 9,75± 0,45 7,5 ± 0,22 7,25 ± 0,26 6,87 ± 0,24

aspirin liều 240

p2/1> 0,05

p2/1< 0,05 p2/1< 0,05

p2/1< 0,05

p2/1 < 0,05

p2/1< 0,05

mg/kgP

8,2 ± 0,27

15,4±0,29 11,7 ± 0,33 10,3 ± 0,28 7,9 ± 0,36

6,3 ± 0,26

Lô 3

tectorigenin liều

p3/1 > 0,05

p3/1< 0,05

p3/1 < 0,05

50 mg/kgP

p3/4 > 0,05

p3/4 < 0,05

p3/4 <0,05

p3/4 > 0,05

5,57 ± 0,49 11,1±0,33 7,14 ± 0,54 8,4 ± 0,33 7,14 ± 0,40 6,0 ± 0,28

Lô 4

tectorigenin liều

p4/1>0,05

p4/1<0,05

p4/1 < 0,05

100 mg/kgP

p4/2>0,05

p4/2 > 0,05

7,77 ± 0,32 13,0±0,27 12,1 ± 0,20 10,2 ± 0,25 7,5 ± 0,35 5,5 ± 0,17

Lô 5

tectorigenin liều

p5/1 >0,05

p5/1 < 0,05

200 mg/kgP

p5/4 >0,05

p5/4 > 0,05

p5/4 < 0,05

p5/4 > 0,05

lô chứng trắng

Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y

20

lô chứng dương

18

16

lô tectorigenin liều 50mg/kg

14

lô tectorigenin liều 100mg/kg

12

10

lô tectorigenin liều 200mg/kg

8 n ặ u q u a đ n ơ c ố s

6

4

2

0 0-5

5.-10

10.-15

15-20

20-25

25-30

thời gian (phút)

Hình 4.31: Biểu đồ số cơn đau quặn qua các giai đoạn của các lô chuột nghiên cứu

Nhận xét: Từ bảng 4.16 và hình 4.31 cho thấy tectorigenin thể hiện tác dụng

giảm số cơn đau quặn rõ rệt ở cả 3 liều đã thử. Với liều 50 mg/kg cân nặng,

tectorigenin bắt đầu thể hiện tác dụng từ giai đoạn thứ 3 của quá trình nghiên cứu

136

(10-15 phút sau khi gây đau bằng acid acetic). Khi dùng liều 100 mg/kg và liều 200

mg/kg cân nặng, tectorigenin có tác dụng giảm đau sau 5 phút sau khi tiêm acid

acetic và tác dụng này vẫn còn thể hiện rõ tại thời điểm 30 phút sau khi gây đau.

Bảng 4.17 Tỷ lệ giảm đau của các lô uống thuốc so với lô không uống thuốc qua

các giai đoạn

Lô 0-5phút Liều dùng (mg/kg) Tỷ lệ giảm đau (%) ở các giai đoạn 20-25 5-10 phút phút 10-15 phút 15-20 phút 25-30 phút

240 47,50 40,00 46,17 45,56 48,21 39,34 Lô chứng dương uống aspirin

50 18,00 16,00 35,40 25,24 43,57

100 44,29 39,22 60,56 38,82 48,98 Lô thử uống tectorigenin 44,41 47,06

lô chứng dương

200 22,22 29,09 33,13 25,81 46,03 47,06

70

lô tectorigenin liều 50mg/kg

60

lô tectorigenin liều 100mg/kg

)

50 %

40

lô tectorigenin liều 200mg/kg

30 ( u a đ m ả i g ệ l ỷ t

20

10

0 0-5

5.-10

10.-15

15-20

20-25

25-30

thời gian (phút)

Hình 4.32 Biểu đồ tỷ lệ giảm đau của các lô chuột dùng thuốc so với lô chuột không

dùng thuốc

Nhận xét: Theo bảng 4.17 và hình 4.32, tectorigenin có tác dụng giảm đau với

tỷ lệ ức chế khá cao, cao nhất là tectorigenin liều 100mg/kg cân nặng ở giai đoạn

137

thứ 3 (10-15 phút), tác dụng giảm đau lên đến 60,56%. Với liều 100mg/kg cân

nặng, tectorigenin có khả năng giảm số cơn đau tốt hơn so với liều 50 mg/kg cân

nặng và liều 200 mg/kg cân nặng. Ở tất cả các giai đoạn và với liều này,

tectorigenin có tác dụng ức chế tương đương với aspirin liều 240mg/kg cân nặng.

Như vậy, tectorigenin có tác dụng giảm đau ngay từ liều 50 mg/kg cân nặng,

và thể hiện tác dụng tốt nhất khi dùng liều 100 mg/kg cân nặng. Với liều 100 mg/kg

cân nặng, tectorigenin có tác dụng giảm đau tương đương với tác dụng giảm đau

của aspirin khi dùng liều 240 mg/kg cân nặng. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo,

chúng tôi sử dụng liều 100 mg/kg cân nặng trên chuột nhắt để đánh giá tác dụng của

thuốc.

* Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin

Tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin được đánh giá qua tác dụng ức

chế khả năng gây phù bàn chân chuột cống bằng carragenin, với liều thử nghiệm là

60 mg tectorigenin/kg cân nặng chuột cống (mức liều này tương đương với 100 mg

tectorigenin/kgP chuột nhắt). Kết quả được trình bày tại bảng 4.18, 4.19 và hình

4.33.

Bảng 4.18 Tác dụng chống viêm cấp của tectorigenin

Tỉ lệ phù chân chuột tại các thời điểm nghiên cứu

Lô thí nghiệm

∆V1%

∆V3%

∆V4%

∆V5%

∆V7%

∆V24%

12,24 ± 1,67 40,27 ± 2,72 46,62 ± 2,71 46,9 ± 1,94 62,4 ± 2,20 20,1± 1,66

4,69 ± 0,80 12,7± 1,19 22,9 ± 1,13 25,3 ± 1,17 34,7 ± 1,91 11,3 ± 1,35

p2/1 > 0,05

p2/1 < 0,05

p2/1 > 0,05

Lô 1 (Chứng trắng) NaCMC 1% Lô 2 (Chứng+) Indomethacin liều 10mg/kgP

1,6 ± 0,85

18,6 ± 2,66 23,5 ± 2,84 19,7 ± 2,62 20,4 ± 2,77 7,6 ± 2,05

p3/1 > 0,05

p3/1 < 0,05

p3/1 > 0,05

Lô 3 tectorigenin liều 60mg/kgP

p3/2 > 0,05

Ghi chú: px/y: so sánh lô x và lô y.

138

70

lô chứng trắng

lô chứng dương

)

60 %

lô tectorigenin

50

40

30

20 ( t ộ u h c n â h c h c í t ể h t g n ă t ộ đ

10

0 1 giờ

3 giờ

4 giờ

5 giờ

7 giờ

24 giờ

các thời điểm

Hình 4.33 Biểu đồ độ tăng thể tích chân chuột tại các thời điểm khảo sát

Nhận xét: Bảng 4.18 và hình 4.33 cho thấy với liều 60 mg/kg cân nặng chuột

cống, tectorigenin thể hiện tác dụng chống viêm rõ nhất là sau 5-7 giờ gây viêm.

Bảng 4.19 Tỷ lệ % ức chế phù chân chuột của thuốc so với lô chứng trắng

Lô

1 giờ

2 giờ

4 giờ

5 giờ

7 giờ

24 giờ

68,39

44,32

43,89

61,69

50,86

46,31

53,77

67,32

62,27

86,93

49,58

58,04

Lô chứng dương uống indomethacin liều 10mg/kg Lô thử tectorigenin liều 60mg/kg

Nhận xét: Bảng 4.19 cho thấy tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigenin

liều 60mg/kg cân nặng khá cao và tương đương với tỷ lệ ức chế phù chân chuột của

indomethacin liều 10 mg/kg cân nặng. Tỷ lệ ức chế cao nhất ở thời điểm 1 giờ sau

gây viêm là 86,93% . Thậm chí, tỷ lệ ức chế phù chân chuột của tectorigenin liều 60

mg/kg cân nặng hầu như cao hơn tỷ lệ ức chế phù chân chuột của indomethacin ở

các thời điểm 1 giờ, 4 giờ và 5 giờ sau khi gây viêm.

* Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigenin

Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của tectorigenin trên mô hình

gây u hạt thực nghiệm bằng amian được thể hiện trong bảng 4.20.

139

Bảng 4.20 Tác dụng chống viêm mạn của tectorigenin trên mô hình gây u hạt thực

nghiệm bằng viên amian

Lô MTB ướt (mg) MTB khô (mg) % ức chế khi cân khô % ức chế khi cân ướt

- 100,06±12,92 - 487,33±65,87

42,53 44,55 280,05±24,43 p2/1<0,05 55,48±5,20 p2/1 <0,01

35,67 43,54

Lô chứng trắng uống NaCMC 1% Lô chứng dương uống prednisolon liều 5mg/kg Lô thử uống tectorigenin liều 60mg/kg 313,48±40,52 p3/1<0,05 p3/2>0,05 56,49±5,01 p3/1<0,01 p3/2>0,05

Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y

Nhận xét: Từ bảng 4.20 ta thấy tectorigenin thể hiện rõ tác dụng chống viêm

mạn khi cân khối lượng u hạt lúc ướt và lúc khô. Tỷ lệ ức chế u hạt của tectorigenin

tương đối cao, khi cân ướt là 35,67%, khi cân khô là 43,54%. Tác dụng chống viêm

của tectorigenin liều 60 mg/kg cân nặng tương đương với tác dụng chống viêm của

prednisolon liều 5 mg/kg cân nặng.

b. Nghiên cứu về tính an toàn của tectorigenin

* Độc tính cấp

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp của tectorigenin ở 5 mức liều

khác nhau. Số lượng chuột chết ở các lô thử cụ thể được trình bày trong bảng 4.21.

Bảng 4.21 Kết quả theo dõi động vật thí nghiệm

% Chết Mức liều Liều thử (g mẫu thử/kg chuột) Số chuột chết/ sống thực tế Số chuột chết/ sống kỳ vọng

1 1,0 0/10 0/21 0,00

2 1,5 4/6 4/11 26,67

3 2,0 7/3 11/5 68,75

4 2,5 8/2 19/2 90,48

5 3,0 10/0 29/0 100,00

Từ kết quả trên theo công thức tính của Behrens đã xác định được độc tính

cấp của tectorigenin là LD50 = (1,78 ± 0,13) gam / kg chuột.

140

* Độc tính bán trường diễn

Chúng tôi đã tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn của tectorigenin ở

2 mức liều: mức liều thấp là 100 mg tectorigenin/kgP, mức liều cao là 300 mg

tectorigenin/kgP. Kết quả cho thấy:

Về tình trạng chung: -

Trong thời gian thử nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh

nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống bình thường, phân khô, nước tiểu bình thường.

Không thấy biểu hiện đặc biệt ở cả 3 lô chuột trong suốt thời gian nghiên cứu. Tiến

hành cân chuột trước, trong và lúc kết thúc thí nghiệm. Mức độ tăng cân của chuột

so với trước khi uống thuốc tại các thời điểm nghiên cứu như sau:

Bảng 4.22 Ảnh hưởng của tectorigenin đến mức độ tăng cân của chuột (%)

p

Lô chứng (n = 10)

Thời điểm nghiên cứu

N0 24,00 ± 0,53 >0,05

N14 26,40 ± 0,52 >0,05

N28 27,96 ± 0,79 >0,05

Lô thử 1 (100 mg tectorigenin/kg P) (n = 10) 25,98 ± 0,63 ptr/s < 0,01 28,75 ± 0,64 ptr/s < 0,01 33,76 ± 0,97 ptr/s < 0,01

Lô thử 2 (300 mg tectorigenin/kg P) (n = 10) 25,94 ± 0,29 ptr/s < 0,01 28,38 ± 0,51 ptr/s < 0,01 31,24 ± 0,68 ptr/s < 0,01

Ghi chú: N0: lúc bắt đầu dùng thuốc; N14: thời gian dùng thuốc sau 14 ngày; N28: thời

gian dùng thuốc sau 28 ngày

p: so với lô chứng ptr/s: so với thời điểm N0

Chuột ở các lô thí nghiệm đều tăng cân rõ rệt sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc

(ptr/s <0,01). Không thấy có sự khác biệt về mức độ tăng trọng lượng giữa lô chứng

và các lô thử (p > 0,05).

Ảnh hưởng lên chức năng tạo máu -

Kết quả định lượng các thông số huyết học: số lượng hồng cầu (HC), nồng

độ hemoglobin (Hb), tỷ lệ hematocrit (HCT), số lượng tiểu cầu (PLT) và số lượng

bạch cầu (BC), tại các thời điểm sau khi cho uống thuốc 14 ngày (N14) và sau khi

uống thuốc 28 ngày (N28) được trình bày ở bảng 4.23.

141

Bảng 4.23 Ảnh hưởng của tectorigienin trên các thông số huyết học của chuột thực

nghiệm

p Lô chứng (n = 10) Chỉ số nghiên cứu Thời điểm nghiên cứu

8,16 ± 0,21 Lô thử 1 (100 mg tectorigenin/kg P) (n = 10) 7,92 ± 0,33 Lô thử 2 (300 mg tectorigenin/kg P) (n = 10) 6,87 ± 0,57 > 0,05 N14

7,99 ± 0,27 8,38 ± 0,22 8,51 ± 0,21 > 0,05 HC (1012/L) N28

13,35 ± 0,36 12,14 ± 0,49 11,34 ± 1,00 > 0,05 N14

Hb (g/100mL) 13,34 ± 0,31 12,56 ± 0,43 13,17 ± 0,39 > 0,05

N28 N14

37,59 ± 1,11 37,89 ± 1,29 35,57 ± 1,49 37,20 ± 1,13 32,72 ± 2,16 38,28 ± 0,88 > 0,05 > 0,05 HCT (%) N28

716,56±31,88 721,00 ± 40,46 694,60±47,05 > 0,05 N14 PLT 812,20±38,41 792,90 ± 35,59 793,78±33,35 > 0,05 N28

1,95 ± 0,20 1,64 ± 0,21 > 0,05 N14 1,80 ± 0,15

BC (109/L) 1,58 ± 0,19 1,48 ± 0,11 > 0,05 N28 1,99 ± 0,22

Nhận xét: Tại cả 3 thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự biến đổi về số

lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, số lượng tiểu cầu và số

lượng bạch cầu giữa các lô thực nghiệm (p>0,05).

- Đánh giá chức năng gan

Kết quả định lượng các thông số AST (aspartat aminotransferase), ALT

(alanin amino transferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần tại các thời điểm

N14, N28 được trình bày trong bảng 4.24.

Bảng 4.24 Ảnh hưởng của tectorigenin đến các thông số AST, ALT, cholesterol toàn

phần và protein toàn phần.

p Lô chứng (n = 10) Lô thử 1 (n = 10) Lô thử 2 (n = 10) Chỉ số nghiên cứu Thời điểm nghiên cứu

N14 176,28± 9,38 156,75 ± 7,11 155,13± 7,54 > 0,05

ALT (U/L) N28 194,58±17,27 173,91 ± 18,61 209,41± 22,02 > 0,05

N14 59,68 ± 4,79 64,74 ±3,15 64,80±5,93 > 0,05

AST (U/L) N28 75,04 ±3,99 82,66±5,48 74,09± 7,90 > 0,05

N14 1,88±0,10 2,06± 0,11 2,05 ± 0,12 > 0,05 Cholesterol

142

N28 2,04± 0,14 1,79±0,13 1,76 ± 0,10 > 0,05

N14 46,29±0,98 46,13±0,96 47,36 ± 1,11 > 0,05

N28 43,89±2,27 44,98±1,54 44,49± 2,61 > 0,05

toàn phần (mmol/L) Protein toàn phần (g/L)

p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg tectorigenin/kg P Nhận xét:

- Kết quả bảng 4.24 cho thấy: tại ba thời điểm nghiên cứu, không thấy có sự

khác biệt về thông số AST, ALT cholesterol toàn phần và protein toàn phần giữa

các lô chuột thực nghiệm (p > 0,05).

- Kết quả quan sát đại thể gan chuột sau 28 ngày uống thuốc như sau: ở cả 2

lô thuốc thử và lô chứng mặt gan nhẵn, mật độ bình thường, màu đỏ, không có sung

huyết, không có dấu hiệu tổn thương.

a) Lô chứng

b) Lô nghiên cứu Tetorigenin 60mg/kgP

c) Lô nghiên cứu Tetorigenin 180mg /kgP

Hình 4.34: Hình ảnh cấu trúc vi thể gan

143

- Đánh giá chức năng thận

Kết quả định lượng creatinin ở các lô chuột thí nghiệm được trình bày trong

bảng 4.25.

Bảng 4.25 Ảnh hưởng của tectorigenin đến thông số creatinin huyết thanh của

chuột thực nghiệm

Chỉ số Thời điểm Lô chứng Lô thử 1 Lô thử 2 p (n = 10) (n = 10) (n = 10) nghiên cứu nghiên cứu

N14 399,94±10,26 368,26±15,41 354,65±29,44 >0,05 Creatinin

(µmol/L) N28 417,54±12,38 419,83 ± 5,46 431,98±7,45 >0,05

p: so với lô chứng; Lô thử 1: 100 mg tectorigenin/kg P; Lô thử 2: 300 mg tectorigenin/kg P

Kết quả bảng 4.25 cho thấy: sau 2 tuần và 4 tuần uống thuốc liên tục, hàm

lượng creatinin trong máu chuột không có sự thay đổi khác biệt so với lô chứng (p

> 0,05).

- Về mô bệnh học:

Quan sát đại thể thận chuột sau 28 ngày uống thuốc cho thấy thận ở mức

bình thường, mật độ chắc bình thường, màu đỏ thẫm, mặt nhẵn, màu đỏ, không thấy

đám sung huyết và đám tổn thương.

Kết quả nghiên cứu cho thấy các chỉ số creatinin không có sự khác biệt so

với lô chứng, chứng tỏ tectorigenin không ảnh hưởng đến chức năng lọc của cầu

thận. Kết quả này phù hợp với hình ảnh cấu trúc vi thể của thận.

a) Lô chứng

144

b) Lô nghiên cứu Tectorigenin 60mg /kgP

c) Lô nghiên cứu Tetorigenin 180mg /kgP

Hình 4.35: Hình ảnh cấu trúc vi thể thận

* Kết luận về các nghiên cứu dược lí của tectorigenin

- Độc tính cấp tính:

Liều không gây chết chuột là 1,0g mẫu thử/ kg chuột, liều gây chết 100% số

chuột thử nghiệm là 3,0g mẫu thử/kg chuột và giá trị LD50 là (1,78 ± 0,13) g mẫu

thử/kg chuột

- Độc tính bán trường diễn:

Tectorigenin với các liều thử 100mg/kg cân nặng và 300mg/kg cân nặng, cho

chuột ống thuốc liên tục 28 ngày:

- Không ảnh hưởng đến quá trình phát triển về thể trọng so với lô chứng.

- Không làm thay đổi chức phận tạo máu so với chứng.

- Không làm thay đổi chức năng gan và chức năng thận so với chứng.

- Tác dụng kháng viêm, giảm đau:

+ Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt nhất ở liều 100 mg / kg cân nặng

chuột nhắt, ở mức liều này, tác dụng giảm đau của tectorigenin tương đương với tác

dụng của aspirin liều 240 mg/kg cân nặng.

+ Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tác dụng ức chế khả

năng gây phù chân chuột ở các thời điểm 5 giờ và 7 giờ sau khi gây viêm bằng

145

caragenin so với lô chứng. Tác dụng chống viêm của tectorigenin tương đương với

Indomethacin liều 10 mg/kg cân nặng.

+ Tectorigenin có tác dụng chống viêm mạn ở liều 60 mg/kg và mức độ tác

dụng là tương đương tác dụng chống viêm mạn của prednisolon liều 5 mg/kg.

146

KẾT LUẬN

1. Về thành phần hoá học

1.1 Từ củ sâm đại hành đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất là:

(2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside (EB-1), eleutherinol (EB-2),

eleutherinoside A(EB-3), hongconin (EB-4), eleutherin (EB-5), isoeleutherin (EB-

6), eleuthoside C (EB-7), Eleutherineoside C (EB-8), eleutherinoside B (EB-9),

(R)-7-acetyl-3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (EB-10), eleuthoside A (EB-11),

eleuthoside B (EB-12), eleutherinoside D (EB-13), 3,6,8-trihydroxy-1-

methylanthraquinone (EB-14). Trong số đó, (2S) dihydroeleutherinol-8-O-β-D-

glucopyranoside (EB-1) là hợp chất mới và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1-

methylanthraquinone (EB-14) lần đầu được phân lập từ loài này.

1.2 Từ thân rễ loài xạ can đã phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất

gồm: 7 hợp chất isoflavonoid là irisflorentin (BS-1), tectorigenin (BS-2),

iristectorigenin A (BS-3), irigenin (BS-4), irilin D (BS-7), tectoridin (BS-9) và

tectorigenin 4’-O-β-D-glucoside (BS-10); 3 hợp chất flavonoid là rhamnocitrin

(BS-6), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11) và isoquercetin (BS-12); và

4 hợp chất khác là acetovanillone (BS-5), daucosterol (BS-8), 24E-stigmasta-5,22-

dien-3β-ol (BS-13), axit myristic (BS-14). Trong số đó, 4 hợp chất lần đầu được

phân lập là: acetovanillone (BS-5), kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (BS-11),

isoquercetin (BS-12), axit myristic (BS-14). Hai hợp chất tectorigenin và tectoridin

là thành phần chính trong thân rễ thực vật này.

2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học

2.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các dịch chiết cho thấy chỉ có

cặn chiết ethyl acetat (EB-Et) của củ sâm đại hành, cặn chiết ethyl acetat (BS-Et) và

cặn nước (BS-W) của thân rễ xạ can có hoạt tính kháng viêm theo đường uống với

mức độ ức chế khối viêm tương ứng là 52,12%, 70%, 64,26%. Tất cả các cặn chiết

củ sâm đại hành và thân rễ xạ can không thể hiện hoạt tính khi thử nghiệm theo

đường bôi.

2.2 Lần đầu tiên nghiên nghiên cứu tác dụng ức chế sự sản sinh cytokine gây

viêm từ tế bào tua DC sinh ra ở tuỷ xương được kích thích bởi LPS của 14 hợp chất

phân lập được từ cây sâm đại hành. Kết quả cho thấy có 4 hợp chất: (2S)

147

dihydroeleutherinol-8-O-β-D-glucopyranoside

(EB-1), hongconin (EB-4),

eleutherine (EB-5), và isoeleutherin (EB-6) có hoạt tính tốt ức chế sự sản sinh các

cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC50 từ 0,1±0,08→5±0,4 µM) và IL-6 (với giá trị IC50 từ 1,7±0,1→8,7±0,3 µM) từ tế bào tua (DCs) sinh ra từ tủy xương. Kết quả này

cho thấy có thể sử dụng các hợp chất này như là các chất kháng viêm tiềm năng

trong tương lai.

2.3 Đã đánh giá hoạt tính kháng viêm và độ an toàn của tectorigenin là hợp chất

chính phân lập được từ thân rễ xạ can.

- Tác dụng kháng viêm, giảm đau:

Tectorigenin có tác dụng giảm đau rõ rệt nhất ở liều 100 mg/kg cân nặng chuột

nhắt. Với liều 60 mg/kg cân nặng chuột cống, tectorigenin có tác dụng chống viêm

cấp và viêm mạn.

- Độc tính cấp tính của tectorigenin được xác định với giá trị LD50 là (1,78 ±

0,13) g/kg P.

- Độc tính bán trường diễn: tectorigenin với các liều thử 100 mg/kg cân nặng và

300 mg/kg cân nặng, cho chuột ống thuốc liên tục 28 ngày không làm ảnh hưởng

đến cân nặng, không làm thay đổi chức phận tạo máu và chức năng gan, thận so với

lô chứng.

KIẾN NGHỊ

- Nghiên cứu hợp chất mới EB-1 (hợp chất kháng viêm tiềm năng) cùng một số

hợp chất khác để tạo sản phẩm có hoạt tính kháng viêm từ củ sâm đại hành.

- Nghiên cứu bán tổng hợp tạo dẫn xuất mới có hoạt tính cao hơn từ 2 thành phần

chính trong cây xạ can là tectorigienin và tectoridin.

148

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Le Minh Ha, Do Thi Thanh Huyen, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Nguyen

Thi Hong Van, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Pham Quoc Long, Bui Kim

Anh, Seung Hyun Kim, Hye-Jin Hong, Sohyun Kim, Young-Sang Koh, and

Young Ho Kim, Chemical Constituents of the Rhizome of Eleutherine bulbosa

and Their Inhibitory Effect on the Pro-Inflammatory Cytokines Production in

Lipopolysaccharide-Stimulated Bone Marrow-derived Dendritic Cells, Bull.

Korean Chem. Soc. (SCI), Vol. 34, No. 2, 633-636, 2013.

2. Le Minh Ha, Do Thi Nguyet Que, Do Thi Thanh Huyen, Pham Quoc Long,

Nguyen Tien Dat, Toxicity analgesic and anti-inflammatory activities of

tectorigenin, Immunopharmacology Immunotoxicology (SCI), vol.35, No. 3,

336-340, June 2013.

3. Đỗ Thị Thanh Huyền, Nguyễn Mạnh Cường, Ngọ Thị Phương, Nguyễn Thị

Hải Yến, Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Tuấn Anh, Lê Minh Hà, Các hợp chất

flavonoid glycoside từ thân rễ cây Xạ can, Tạp chí dược liệu, tập 18, số 4, 243-

248, 2013.

4. Đỗ Thị Thanh Huyền, Đỗ Thị Thảo, Ngọ Thị Phương, Nguyễn Thị Hoàng

Anh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Nguyễn Tuấn Anh, Nguyễn Mạnh Cường, Lê

Minh Hà, Khảo sát hoạt tính kháng viêm và độc tế bào của một số thực vật họ

lay dơn (Iridaceae) ở Việt Nam, Tạp chí hóa học, T.50(4A), 266-269, 2012.

5. Nguyễn Thị Hồng Vân, Đỗ Thị Thanh Huyền, Ngọ Thị Phương, Nguyễn Thị

Hoàng Anh, Bùi Kim Anh, Nguyễn Mạnh Cường, Nguyễn Tuấn Anh, Lê Minh

Hà, Một số dẫn xuất Naphthopyran phân lập từ củ sâm đại hành (Eleutherine

bulbosa) ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và công nghệ, T.50(3A), 8-13, 2012.

6. Lê Minh Hà, Đỗ Nguyệt Quế, Bùi Thị Thúy Luyện, Đỗ Thị Thanh Huyền,

Nguyễn Thu Hằng, Ngô Thanh Hoa, Nghiên cứu tác dụng chống viêm và giảm

đau của chế phẩm TEC-01 chiết tách từ cây xạ can (Belamcanda chinensis (L.)

DC), Tạp chí khoa học và công nghệ, tập 48, số 4A, trang 200-204, 2010.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1 Đỗ Tất Lợi (2001), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học,

trang 145-146.

2 Hoàng Lê Tuấn Anh, Bùi Hữu Tài, Phạm Hải Yến, Đan Thị Thuý Hằng,

Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, Nguyễn Xuân

Nhiệm, Phan Văn Kiệm, Lã Văn Kính (2013), “Các hợp chất isoflavonoid và

phenolic phân lập từ rễ cây xạ can (Belamcanda chinensis)”, Hội nghị khoa

học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, trang 934-938.

3 Lê Khả Kế (1975), “Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam”, Nhà xuất bản khoa

học và kỹ thuật, tập 5, trang 324-325.

4 Lê Khả Kế (1957), “Phân loại thực vật”, Trường đại học tổng hợp.

5 Lê Văn Truyền (2010), “Một số vấn đề về chiến lược nghiên cứu thuốc từ

dược liệu”, Tạp chí dược học, 413, 2-4, trang 46-51.

6 Nguyễn Tiến Bân (1997), “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật

hạt kín ở Việt Nam”, NXB Nông Nghiệp, 71.

7 Nguyễn Văn Đàn, Lê Văn Hồng, Lê Hùng Châu, Đào Hồng Vân (1978),

“Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học cây Sâm đại hành ở Việt Nam”,

Tạp chí hoá học, số 18, trang 29-33.

8 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tửu (1985), “Phương pháp nghiên cứu hóa

học cây thuốc”, Nhà xuất bản Y học.

9 Phạm Hoàng Hộ (1999), “Cây cỏ Việt Nam”, Nhà xuất bản Trẻ.

10 Võ Văn Chi (1997), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, NXB y học, trang 325.

11 Trương Minh Lương, Tô Trà My, Ngô Thị Minh Hiền (2006), “Góp phần

nghiên cứu về eleutherol trong sâm đại hành Việt Nam”, Tạp chí khoa học

trường ĐHSP Hà Nội, số 1, trang 104-109.

Tiếng Anh

12 Afzal M, Gupta G, Kazmi I, et al. (2012), “Anti-inflammatory and analgesic

potential of a novel steroidal derivative from Bryophyllum pinnatum.”,

Fitoterapia Vol. 83, pp.853–8.

13 Ali AA et al (1983), “Three isoflavonoids from Iris germanica”,

Phytochemistry, vol. 22, pp. 2061-2063.

14 Alison N. Hulme, Hamish McNab, David A. Peggie, Anita Quye (2005),

“Negative ion electrospray mass spectrometry of neoflavonoids”,

Phytochemistry, vol. 66, pp. 2766–2770.

15 Augusta Caligiani, Gerardo Palla, Annalisa Maietti, Martina Cirlini and

Vincenzo Brandolini (2010), “1H NMR Fingerprinting of Soybean Extracts,

with Emphasis on Identification and Quantification of Isoflavones”,

Nutrients, vol. 2, pp. 280-289.

16 Bich D. H., Chung D. Q., Chuong B. X., Dong N. T., Dam D. T., Hien P. V.,

Lo V. N., Mai P. D., Man P. K., Nhu D. T., Tap N., Toan T. (2004),

“Medicinal Plants and Animals in Vietnam”. Hanoi Science and Technology

Publishing House, Vol. 2, pp. 130 -517.

17 Betriz Goncalves, cow-workers (2006), “Antimicrobial and cytotoxic

activities screening of some Brazilian medicinal plants used in Governador

Valadares district”, Brazillian journal of pharmerceutical Sciences, vol.42

(2), pp. 198-200.

18 Bohm, B.A (1998), “Introduction to flavonoids”, Harwood Acadamic

publisher: Bangalore, vol. 2, pp244-256.

19 Beutler B, Cerami A. (1986), “Cachectin and tumour necrosis factor as two

sides of the same biological coin”, Nature., vol. 320(6063), pp. 584–588.

20 Bito T. et al (2002), “Flavonoids differentially regular IFN gamma induced

ICAM-1 expression in human keratinocytes: molecular mechanisms of

action”, FEBS Letters, vol. 520, pp. 145-152.

21 Byoung-Ho Moon, Youngshim Lee, Choonshik Shin, and Yoongho Lim (2005), “Complete Assignments of the 1H and 13C NMR Data of Flavone

Derivatives”, Bull. Korean Chem. Soc., vol. 26, No. 4, pp. 603-608.

22 Byung-Sun Min, Jong-Pill Lee, Min-Kyun Na, Ren-Bo An, Sang-Myung

Lee, Hyeong-Kyu Lee, KiHwan BAE, and Sam-Sik Kang (2003), “A New

Naphthopyrone from the Root of Pleuropterus ciliinervis”, Chem. Pharm.

Bull., vol.51(11), pp. 1322—1324.

23 Camillo Bianchi, Giovanni Ceriotti (1975), “Chemical and pharmacological

investigations of constituents of Eleutherine bulbosa (Miller) Urb.

(Iridaceae)”, J Pharm Sci, vol. 64(8), pp. 1305.

24 Chen F, Castranova V, Shi X. (2001), “New insights into the role of nuclear factor-kappaB in cell growth regulation”, Am J Pathol., vol. 159, pp. 387- 397.

25 Chongming Wu, Jingyao Shen, Pingping He, Yan Chen, Liang Li, Liang

Zhang, Ye Li, Yujuan Fu, Rongji Dai, Weiwei Meng, and Yulin Deng

(2012), “The α-Glucosidase inhibiting isoflavones isolates from Belamcanda

chinensis leaf extract”, Rec. Nat. Prod., vol. 6:2, pp. 110-120.

26 Cheong H., Ryu S. Y., Oak M. H., Cheon S. H., Yoo G. S., Kim K. M.

(1998), “Studies of structure activity relationship of flavonoids for the anti-

allergic”, Arch. Pharm. Res., vol. 21(4), pp. 478-480.

27 Chirinos R., H. Rogez, D. Campos, R. Pedreschi, Y. Larondelle (2007),

“Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds

from mashua (Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pavon) tubers.”, Separation

and Purifiaction Technology, vol. 55, pp. 217-225.

28 Ȼyvind M. Andersen, Kenneth R. Markham, “Flavonoids: Chemistry”,

Biochemistry and Applications, 2006

29 D. Seidlová-Wuttke, O. Hesse, H. jarry, G. Rimoldi, P. Thelen, V.

Christoffel, W. Wuttke (2004), “Belamcanda chinensis and the thereof

purified tectorigenin have selective estrogen receptor modulator activities”,

Phytomedicine, vol. 11, pp. 392-403.

30 Dae-Young Lee, Ha-Na Lyu, Ho-Young Kwak, Lakoo Jung, Youn-Hyung

Lee, Dae-Keun Kim, In-Sik Chung, Sung-Hoon Kim và Nam-In Baek

(2007), “Isolation of Flavonoids from the Fruits of Cornus kousa Burg.”,

J.Appl. Biol. Chem., vol. 50(3), pp. 144-147.

31 Daisuke Aki, Yasumasa Minoda, Hideyuki Yoshida, Satoko Watanabe,

Ryoko Yoshida, Giichi Takaesu, Takatoshi Chinen, Toshiya Inaba, Masaki

Hikida, Tomohiro Kurosaki, Kazuko Saeki and Akihiko Yoshimura (2008),

“Peptidoglycan and lipopolysaccharide activate PLCγ, leading to enhanced

cytokine production in macrophages and dendritic cells”, Genes to Cells, vol.

13, pp. 199–208.

32 Dieudonne Ngamga, Maurice D. Awouafack, Pierre Tane, Merhatibeb

Bezabih, Berhanu M. Abegaz (2007), “Two new anthraquinones from

Gladiolus psittascinus”, Biochemical Systematics and Ecology, vol. 35, pp.

709-713.

33 Doherty NS, Robinson BV. (1975), “The inflammatory response to

carrageenan.”, J Pharm Pharmacol, vol. 27, pp. 701–3.

34 Dong cai xi-a, Wu ke-si, Shi she-po, Tu peng-fei (2006), “Flavonoids from

Clematis hexapetala”, Journal of Chinese Pharmaceutical sciences, vol.

15(1), pp. 15-20.

35 Dorota Wozniak, Jan Oszmiansk and Adam Matkowski (2006),

“Antimutagenic and antioxidant activity of the extract from Belamcanda

chinensis (L.) DC.”, Acta Poloniac Pharmaceutica-Drug Research, Vol.63,

No.3, pp.213-218.

36 Dorota Wozniak, Bogdan Janda, Ireneusz Kapusta, Wieslaw Oleszek, Adam

Matkowski (2010), “Antimutagenic and anti-oxidant activities of

isoflavonoids from Belamcanda chinensis (L.) DC.”, Mutation research, vol.

696, pp. 148-153.

37 Duarte I, Nakamura M, Ferreira S. (1988), “Participation of the sympathetic

system in acetic acid-induced writhing in mice. Braz”, J Med and Bio Res,

vol. 21, pp. 341–3.

38 Dr Venketeshwer Rao (2012), “A Global Perspective of Their Role in

Nutrition and Health”, Phytochemicals, vol. 33-56.

39 Elliott Middleton J. R. et al. (2000), “The effects of flavonoids on

Mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease and cancer”,

Pharmacol. Rev., vol. 52, pp. 673-751.

40 F. Ferreres, A. Gil-Izquierdo, P.B. Andrade, P. Valentão, F.A. Tomás-

Barberán (2007), “Characterization of C-glycosyl flavones O-glycosylated

by liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of

Chromatography A, 1161, pp. 214–223.

41 Fernandes, R. A.; Chavan, V. P. Eur. (2010), “A Concise Asymmetric

Synthesis of (–)-Hongconin and (–)-1-epi-Hongconin”, Eur. J.Org. Chem.,

vol. 2010 (22), pp. 4306-4311.

42 Fernandes, R. A.; Chavan, V. P.; Mulay (2011), “A concise and improved

synthesis of (+)-eleutherin, (+)-allo-eleutherin and a formal synthesis of (+)-

nocardione B”, Tetrahedron-Asymmetr., vol. 2011(22), 487-492.

43 Filip Cuyckens and Magda Claeys (2004), “Mass spectrometry in the

structural analysisof flavonoids”, J. Mass Spectrom., vol. 39, pp. 1–15.

44 Francesca R Gallo and cow-workers (2010), “Polyketides from Eleutherine

bulbosa”, Natural Product Reseach, vol.24 (16), 1578-1586.

45 Francois Jacobus Oosthuizen (1995), “Synthesis of hongconin and related

naphtho[2,3-c]pyrans”, Cape Peninsula university of technology.

46 Francois Jacobus Oosthuizen (2002), “This thesis is presented for the degree

of doctor of philosophy of Murdoch University”, 1-2 (2002).

47 Fumiko Abe, Rong-fu Chen and Tatsuo Yamauchi (1991), “Iridals from

Belamcanda chinensis and Iris japonica”, Phytochemistry, Vol.30, No.10,

pp. 3379-3382.

48 Gábor Blazsó, Zsolt Rázga and Miklós Gábor (1999), “Effects of

cinnarizine on different experimentally induced oedemas”, Fundamental &

Clinical Pharmacology, Vol. 13, Issue 1, pp. 91–95.

49 Gallo, F. R.; Palazzino, G.; Federici, E.; Iurilli, R.; Galeffi, C.; Chifundera,

K.; Nicoletti (2010), “Polyketides from Eleutherine bulbosa”, Nat. Prod.

Res., vol. 24, 1578-86.

50 Gautam, R.; Jachak (2009), “Recent developments in anti-inflammatory

natural products”, Med. Res. Rev., vol. 29(5), pp. 767-820.

51 Goldblatt P, Mabberley DJ (2005), “Belamcanda Included in Iris, and the

New Combination I. domestica (Iridaceae: Irideae)”, Novon: A Journal for Botanical Nomenclature, Vol. 15, No. 1, pp. 128–132.

52 Ha, S.C.; Won, S.W. (1991), “Flavonoids from the Rhizomes of Belamcanda

chinesis”, Arch. Pharm. Res., vol. 14, pp. 357–358.

53 Han, A.-R.; Min, H.-Y.; Nam, J.-W.; Lee, N.-Y.; Wiryawan, A.; Suprapto,

W.; Lee, S. K.; Lee, K. R.; Seo, E.-K. (2008), “Identification of a new

naphthalene and its derivatives from the bulb of eleutherine americana with

inhibitory activity on lipopolysaccharide-induced nitric oxide production”,

Chem. Pharm. Bull., vol. 56, pp. 1314-6.

54 Han-Bing Han, Hui Li, Rui-Lin Hao, Ya-Fei Chen, He Ni, Hai-Hang (2014),

“One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed

by automatic separation of volatiles, flavonoids and polysaccharides from

Citrus grandis”, Food Chemistry, vol. 145, pp. 542–548.

55 Han T, Cheng G, Liu Y, et al. (2012), “In vitro evaluation of tectoridin,

tectorigenin and tectorigenin sodium sulfonate on antioxidant properties”,

Food Chem Toxicol, vol. 50, pp. 409–14.

56 Harborne, J.B. and Simmonds, N.W. (1964), “The natural distribution of the

phenolic aglycones”, In Biochemistry of Phenolic compounds, London:

academic Press., pp.77-128.

57 Hee-Jin Jun, Minh-Hien Hoang, Jin Woo Lee, Jia Yaoyao, Ji-Hae Lee,

Dong-Ho Lee, Hak-Ju Lee, Woo-Duck Seo, Bang Yeon Hwang, Sung-Joon

Lee (2012), “Iristectorigenin B isolated from Belamcanda chinensis is a liver

X receptor modulator that increases ABCA1 and ABCG1 expression in

macrophage RAW 264.7 cells”, Biotechnol Lett, vol. 34, pp. 2213-2221.

58 Hideyuki Ito, Satomi Onoue, Yoko Miyake and Takashi Yoshida (1999),

“Iridal-type triterpenoids with ichthyotoxic activity from Belamcanda

chinensis”, J. Nat. Prod, vol. 62(1), pp. 89-93.

59 Hideyuki Ito, Satomi Onoue and Takashi Yoshida (2001), “Isoflavonnoids

from Belamcanda chinensis”, Chem. Pharm. Bull., vol. 49(9), pp. 1229-

1231.

60 Hirotaka Shibuya, Toyoki Fukushima, Kazuyoshi Ohashi, Akihiro

Nakamura, Soedarsono Riswan, and Isao Kitagawa (1997), “Indonesian

Medicinal Plants. Chemical structures of eleuthosides A, B, C, Three new

aromatic glucosides from the bulbs of eleutherine palmifolia (Iridaceae)”,

Chem. Pharm. Bull, vol. 45, pp. 1130-1134.

61 Hiroyuki Minami, Aya Okubo, Mitsuaki Kodama and Yoshiyasu Fukuyama

Iris (1996), “Highly oxygenated isoflavones from japonica”,

Phytochemistry, vol.41, no.4, pp.1219-1221.

62 Hyun Pyo Kim, Kun Ho Son, Hyeun Wook Chang, and Sam Sik Kang

(2004), “Anti-inflammatory Plant Flavonoids and Cellular Action

Mechanisms”, J Pharmacol Sci, vol. 96, pp. 229 – 245.

63 Hyuk Yoon, Sunglock Eom, Jiye Hyun, Geunhyeong Jo, Doseok Hwang,

Sunhee Lee, Yeonjoong Yong, Jun Cheol Park, Young Han Lee, and Yoongho Lim (2011), “1H and 13C NMR Data on Hydroxy/methoxy

Flavonoids and the Effects of Substituents on Chemical Shifts”, Bull. Korean

Chem. Soc., vol. 32, no.6, pp. 2101-2104.

64 Ito H., Onoue S., and Yoshida T. (2001), “Isoflavonoids from Belamcanda

chinensis”, Chem. Pharm. Bull., vol. 49, pp. 1229-1231.

65 Irawan Wijaya Kusuma and cow-workers (2010), “Antidermatophyte and

antimelanogenesis compound from Eleutherine americana grown in

Indonesia”, Journal of natural medicines, vol. 64(2), 223-6.

66 J. A.Manthey (2000), “Biological properties of flavonoids pertaining to

inflammation”, Microcirculation, vol. 7, no. 1, pp. S29–S34.

67 J. Chen, Y.-H. Shi, M.-Y. Li, M.J. Adams, J.-P. Chen (2008), “A new

potyvirus from butterfly flower (Iris japonica Thunb.) in Zhejiang, China”,

Arch Virol, vol. 153, pp. 567-569.

68 Jackson LM., Wu K., Mahida YR., et al (1998), “COX-1 expression in

human gastric mucosa infected with Helicobacter pylori: constitutive or

induced?”, Gastroenterology, vol. 114(4), A160.

69 Jae-Taek Han et al (2004), “Flavonoid glycoside from the Aerial Parts of

aceriphyllum rossii and their antioxidant activities”, Arch Pharm Res, vol.

27(4), pp. 390-395.

70 Jeffrey B. harborne FBS and Herber Baxter (1999), The hand book of natural

flavonoids, Vol 2.

71 Jin, L.; Jin, S.; Chen, H.S.; Shen, Y.; Liang, S.; Xiang, Z.B. (College of

Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai, 200433, China)

(2007), “Phenolic constituensts of Belamcanda chinensis”, Chemistry of

Natural Compounds, vol. 43(6): pp. 700-701.

72 Jin, L.; Chen, H.S.; Jin, Y.S.; Liang, S.; Xiang, Z.B.; Lu, J. (College of

Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

(2008), “Chemical constituents from Belamcanda chinensis”, Journal of

Asian Natural Products Research, vol. 10(1-2): pp. 89-94.

73 Jin Dai and Russell J. Mumper (2010), “Review: Plant Phenolics: Extraction,

Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties”, Molecules, vol.

15, pp. 7313-7352.

74 Jin-Sun Park, Moon-Sook Woo, Dong-Hyun Kim, Jin-Won Hyun, Won-Ki

Kim, Jae-Chul Lee, and Hee-Sun Kim (2007), “Anti-Inflammatory

Mechanisms of Isoflavone Metabolites in Lipopolysaccharide-Stimulated

Microglial Cells”, JPET 320, pp. 1237–1245.

75 Joabe Gomes de Melo and cow-workers (2011), “Medicinal plants used as

antitumor agents in Brazil: an ethnobotanical approach, Evidence-based

complementary and alternative medicine”, Hindawi publishing corporation.

76 Jürgen Scheller, Athena Chalaris, Dirk Schmidt-Arras, Stefan Rose-John

(2011), “Review: The pro- and anti-inflammatory properties of the cytokine

interleukin-6”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell

Research, vol. 1813, Issue 5, pp. 878–888.

77 K Jaijoy, N Soonthornchareonnon, A Panthong, S Sireeratawong (2010),

“Anti-inflammatory and analgesic activities of the water extract from the

fruit of Phyllanthus emblica Linn.”, International Journal of Applied

Research in Natural Products, vol.3 (2), pp. 28-35.

78 Katsura Seki, Kazuo Haga and Ryohei Kaneko (1995), “Balamcandones A-

Belamcanda D, dioxotetrahydrodibenzofurans from chinensis”,

Phytochemistry, vol.38, No.3, pp.703-709.

79 Kazuki Kobayashi, Shin Nishiumi, Masayuki Nishida, Midori Hirai, Takeshi

Azuma, Hiromi Yoshida, Yoshiyuki Mizushina, and Masaru Yoshida (2011),

“Effects of Quinone Derivatives, such as 1,4-Naphthoquinone, on DNA

Polymerase Inhibition and Anti-Inflammatory Action”, Medicinal Chemistry,

vol. 7, pp. 37-44.

80 Ki-Bong Oh, Heonjoong Kang, and Hideaki Matsuoka (2001), “Detection of

antifungal activity in Belamcanda chinensis by a Single-cell bioassay

method and isolation of its active compound, Tectorigenin”, Biosci.

Biotechnol. Biochem., vol. 65(4), pp. 939-942.

81 Kidd BL, Urban LA. (2001), “Mechanisms of inflammatory pain”, Br J

Anaesth, vol. 87, pp. 3–11.

82 Kim YP, Yamada M, Lim SS, et al. (1999), “Inhibition by tectorigenin and

tectoridin of prostaglandin E2 production and cyclooxygenase-2 induction in

rat peritoneal macrophages”, Biochim Biophys Acta, vol. 1438, pp. 399–407.

83 Kitanaka, S., Takahashi, M., Takido (1990), “Dihydroeleutherinol, a

dihydronaphthopyran derivative from unripe seeds of Cassia torosa M.”,

Phytochemistry, vol. 29, pp. 350-351.

84 Koo, J.-E.; Hong, H.-J.; Dearth, A.; Kobayashi, K. S.; Koh, Y.-S. (2012),

“intracellular invasion of orientia tsutsugamushi activates inflammasome in

acs-dependent manner”, PLoS ONE, vol. 7, e39042.

85 Koppert W, Wehrfritz A, Korber N, et al. (2004), “The cyclooxygenase

isozyme inhibitors parecoxib and paracetamol reduce central hyperalgesia in

humans”, Pain, vol. 108, pp. 148–53.

86 Kutani, N. and Hayashi, K. (1944), Yakugaku Zasshi, vol. 64, 16.

87 Kyungsu Kang et al (2009), “Tectoridin, a poor ligand of estrogen receptor

α, exerts its estrogenic effects via an ERK-dependent pathway”, Molecules

and cells, vol. 27, pp. 351-357.

88 Kwang Seok Ahn, Eun Jung Noh, Kwang-hyun Cha, Yeong Shik Kim, Soon

Sung Lim, Kuk Hyun Shin, Sang Hoon Jung (2006), “Inhibitory effects of

Irigenin from the rhizomes of Belamcanda chinensis on nitric oxide and

prostaglandin E2 production in murine macrophage RAW 264.7 cells”, Life

Sciences, vol. 78, pp. 2336-2342.

89 L. John Goad and Toshihiro Akihisa (1992), “Analysis of Sterol”, Blackie

Academy & Proessional, Lodon. Tokyo, pp. 378.

90 Laurence Voutquenne, Catherine Lavaud, Georges Massoit, Thierry Sevenet

and Hamid A. Hadi (1999), “Cytotoxic polyisoprenes and glycosides of

long-chain fatty alcohols from Dimocarpus fumatus”, Phytochemistry, vol.

50, pp. 63-69.

91 Lee HU, Bae EA, Kim DH. (2005), “Hepatoprotective effect of tectoridin

and tectorigenin on tert-butyl hyperoxide-induced liver injury”, J Pharmacol

Sci vol. 97, pp. 541–4.

92 Lee KT, Sohn IC, Kim DH, et al. (2000), “Hypoglycemic and hypolipidemic

effects of tectorigenin and kaikasaponin III in the streptozotocininduced

diabetic rat and their antioxidant activity in vitro”, Arch Pharm Res, vol. 23,

pp. 461–6.

93 Lee KT, Sohn IC, Kim YK, et al. (2001), “Tectorigenin, an isoflavone of

Pueraria thunbergiana Benth., induces differentiation and apoptosis in human

promyelocytic leukemia HL-60 cells”, Biol Pharm Bull, vol. 24, pp. 1117–

21.

94 Li, X.; Ohtsuki, T.; Koyano, T.; Kowithayakorn, T.; Ishibashi (2009), “New

Wnt/beta-catenin signaling inhibitors isolated from Eleutherine palmifolia”,

Chem. Asian J., vol. 4, pp. 540.

95 M. Iqbal Choudhary, M. Nur-e-Alam, Irfan Baig, Farzana Akhtar, A. Majeed

Khan, Purev O. Ndognii, T. Badarchiin, G. Purevsuren, Nilufar Nahar, and

Atta-ur-Rahman (2001), “Four new flavones and a new isoflavone from Iris

bungei”, J. Nat. Prod., vol. 64, pp. 857-860.

96 M. J. Tunon, M. V. Garcia-Mediavilla, S. Sanchez-Campos and J. Gonzalez-

Gallego (2009), “Potential of Flavonoids as Anti-inflammatory Agents:

Modulation of Pro- Inflammatory Gene Expression and Signal Transduction

Pathways”, Curr Drug Metab, vol. 10(3), pp.256-71.

97 M. J. Tunon, M. V. Garcia-Mediavilla, S. Sanchez-Campos, and J.

Gonzalez-Gallego (2009), “Potential of flavonoids as anti-inflammatory

agents: modulation of pro-inflammatory gene expression and signal

transduction pathways”, Current Drug Metabolism, vol. 10, no. 3, pp. 256–

271.

98 Macief Heneczkowski, Maria Kopacz, Dorota Nowak and Anna Kuzniar

(2001), “Infrared spectrum analysis of some flavonoids”, Acta Poloniae

pharmaceutica-drug research, vol.58(6), pp. 415-420.

99 Macı'as, M.; Ulloa, M.; Gamboa, A.; Mata, R. (2000), “Phytotoxic

compounds from the new coprophilous fungus Guanomyces polythrix”, J.

Nat. Prod., vol. 63, pp. 757-761.

100 Malabendu Jana and Kalipada Pahan (2009), “IL-12 p40 homodimer,

but not IL-12 p70, induces the expression of IL-16 in microglia and

macrophages”, Mol Immunol., vol. 46(5), pp. 773–783.

101 Malabendu Jana and Kalipada Pahan et al. (2009), “IL-12 P40

Homodimer, the So-Called Biologically Inactive Molecule, Induces Nitric

Oxide Synthase in Microglia via IL-12Rβ1”, Glia., vol. 57(14), pp. 1553–

1565.

102 Masataka Moriyasu, Yukari Igi, Momoyo Ichimaru, Kinuko Iwasa,

Junko Kobayakawa, Fumiko Sato-Nishimori, Yoshizumi Matsukawa, Chiaki

Nagase (2007), “New isoflavones from Belamcandae rhizoma”, J. Nat. Med,

vol. 61, pp. 329-333.

103 Michael Pikulski and Jennifer S. Brodbelt (2003), “Differentiation of

Flavonoid Glycoside Isomers by Using Metal Complexation and

Electrospray Ionization Mass Spectrometry”, J Am Soc Mass Spectrom, vol.

14, pp. 1437–1453.

104 Miller, A.L. (1996), “Antioxidant Flavonoids: Structure, Function and

Clinical Usage”, Alternative Medicine Review, vol. 2(1), pp. 103-111.

105 Min-Jian QIN, Wen-Liang JI, Zheng-Tao WANG and Wen-Cai YE.

(2005), “A New Isoflavonoid from Belamcanda chinensis (L.) DC.”, Journal

of Integrative Plant Biology, vol. 47 (11), pp. 1404-1408.

106 Mingchuan Liu, Shengjie Yang, Linhong Jin, Deyu Hu, Zhibing Wu

and Song Yang (2012), “Chemical constituents of the ethyl acetate extract of

Belamcanda chinensis (L.) DC. Roots and their antitumor activities”,

Molecules, vol. 17, pp. 6156-6169.

107 Monthakantirat O, De-Eknamkul W, Umehara K, Yoshinaga Y,

Miyase T, Warashina T, Noguchi H (2005), “Phenolic Constituents of the

Rhizomes of the Thai Medicinal Plant Belamcanda chinensis with

Proliferative Activity for Two Breast Cancer Cell Lines”, J Nat Prod., vol.

68 (3), pp. 361-4.

108 Mrudula Kale, A V Misar, Vivek Dave, Maruti Joshi, A M Mujumdar

(2007), “Anti-inflammatory activity of Dalbergia lanceolaria bark ethanol

extract in mice and rats”, J Ethnopharmacol, vol. 112(2), pp. 300-4.

109 Naczk, M.; Shahidi, F. (2006), “Phenolics in cereals, fruits and

vegetables: occurrence, extraction and analysis”, J. Pharm. Biomed. Anal.,

vol. 41, pp. 1523-1542.

110 Nawal Al-Musayeib, Shagufta Perveen, Itrat Fatima, Muhammad

Nasir and Ajaz Hussain (2011), “Antioxidant, anti-glycation and anti-

inflammatory activities of phenolic constituents from Cordia sinensis”,

Molecules, vol. 16, pp. 10214-10226.

111 Ngamga, D.; Awouafack, M. D.; Tane, P.; Bezabih, M.; Abegaz, B.

M. (2007), “Two new anthraquinones from Gladiolus psittascinus”,

Biochem. Syst. Ecol., vol. 35, pp. 709.

112 Nhiem, N. X.; Kiem, P. V.; Minh, C. V.; Tai, B. H.; Quang, T. H.;

Soung, K. S.; Koo, J.-E.; Koh, Y.-S.; Kim (2011), “Anti-inflammatory

activity on LPS-stimulated dendritic cells of lupanetype triterpenoids from

the leaves of Acanthopanax koreanum”, Arch. Pharm. Res., vol. 34(10), pp.

1593-8.

113 P. K. Agarwal 1989, “Carbon – 13 NMR of flavonoids”, Elsevier

Science Publishers B. V., 203.

114 Pan CH, Kim ES, Jung SH, et al. (2008), “Tectorigenin inhibits IFN-

gamma/LPS-induced inflammatory responses in murine macrophage RAW

264.7 cells”, Arch Pharm Res, vol. 31, pp. 1447–56.

115 Paul Thelen, Jens-Gerd Scharf, Peter Berfeind, Bernhard Hemmerlein,

Wolfgang Wuttke, Barbara Spengler, Volker Christoffel, Rolf-Hermann

Ringert and Dana Seidlová-Wuttke (2005), “Tectorigenin and other

phytochemicals extracted from leopard lily Belamcanda chinensis affect new

and established targets for therapies in prostate cancer”, Carcinogenesis,

vol.26, no.8, pp.1360-1367.

116 Paunović, V.; Carroll, H. P.; Vandenbroeck, K.; Gadina (2008),

“Crossed signals: the role of interleukin (IL)-12, -17, -23 and -27 in

autoimmunity”, Rheumatology (Oxfort), vol. 47 (6), pp. 771-6.

117 Peter, Goldblatt, John, Manning (2008), “The Iris family natural

historys classification, Portland, Oregon”, Timber press, pp. 200-204.

118 Pompeu D. R., E. M. Silva, H. Rogez (2009), “Optimisation of the

solvent extraction of phenolic antioxidants from fruits of Euterpe oleracea

using Response Surface Methodology”, Bioresource Technology, vol. 100,

pp. 6076-6082.

119 Qui, F., Xu, J. Z., Duan, W. J., Qu, G. X., Wang, N. L. and Yao, X.

S.( 2005), “New Constituents from Eleutherine Americana”, Chem. J.

Chinese Universities - Chinese Edition 26, pp. 2057-2060.

120 Rao, A. V. R.; Gaitonde, A. S.; Prakash, K. R. C.; Rao, S. P., A

Concise (1994), “A concise synthesis of chiral 2- methyl chroman-4-ones-

stereo selective buildup of the chromanol moiety of anti-HIV agent,

calanolide-A”, Tetrahedron Lett., vol. 35, pp. 6347-6350.

121 Raymond E. March, Xiu-Sheng Miao, Chris D. Metcalfe, Maciej

Stobiecki, Lukasz Marczak (2004), “A fragmentation study of an isoflavone

glycoside, genistein-7-O-glucoside, using electrospray quadrupole time-of-

flight mass spectrometry at high mass resolution”, International Journal of

Mass Spectrometry, vol. 232, pp. 171–183.

122 Richard J. Hughes, Timothy R. Croley, Chris D. Metcalfe, Raymond

E. March (2001), “A tandem mass spectrometric study of selected

characteristic flavonoids”, International Journal of Mass Spectrometry, vol.

210/211, pp. 371-385.

123 Rodney A. Fernandes, and Vijay P. Chavan (2010), “A Concise

Asymmetric Synthesis of (–)-Hongconin and (–)-1-epi-Hongconin”, Eur. J.

Org. Chem., vol. 2010, pp. 4306–4311.

124 Rodney A. Fernandes, Vijay P. Chavan, Sandip V. Mulay (2011), “A

concise and improved synthesis of (+)-eleutherin, (+)-allo-eleutherin and a

formal synthesis of (+)-nocardione B”, Tetrahedron: Asymmetry, vol. 22,

pp. 487–492.

125 S. M. Husain, M. A. Schätzle, C. Röhr, S. Lüdeke, M. Müller (2012),

“Biomimetic Asymmetric Synthesis of (R)-GTRI-02 and (3S,4R)-3,4-

Dihydroxy-3,4- dihydronaphthalene-1(2H)-ones”, Org. Lett., vol. 14, pp.

3600-3603.

126 S. Paramapojn, M. Ganzera, W. Gritsanapan, H. Stuppner (2008),

“Analysis of naphthoquinone derivatives in the Asian medicinal plant

Eleutherine americana by RP-HPLC and LC–MS”, J. Pharm. Biomed., vol.

47, pp. 990–993.

127 Saiko Kazuno , Mitsuaki Yanagida, Noriko Shindo, Kimie Murayama

(2005), “Mass spectrometric identification and quantification of glycosyl

flavonoids, including dihydrochalcones with neutral loss scan mode”,

Analytical Biochemistry, vol. 347, pp. 182–192.

128 Salwa F. Farag, Yuka Kimura, Hideyuki Ito, Junko Takayasu,

Harukuni Tokuda, Tsutomu Hatano (2009), “New isoflavone glycosides

from Iris spuria L. (Calizona) cultivated in Egypt”, J. Nat. Med, vol. 63, pp.

91-95.

129 Sang Hoon Jung, Yeon Sil Lee, Soon Sung Lim, Sanghyun Lee, Kuk

Hyun Shin, and Yeong Shik Kim (2004), “Antioxidant activities of

isoflavones from the rhizomes of Belamcanda chinensis on carbon

tetrachloride-induced hepatic injury in rats”, Arch Pharm Res, vol.27, no.2,

pp. 184-188.

130 Sang Hoon Jung, Yeon Sil Lee, Sanghyun Lee, Soon Sung Lim,

Yeong Shik Kim, and Kuk Hyun Shin (2002), “Isoflavonoids from the

rhizomes of Belamcanda chinensis and their effects on aldose reductase and

sorbitol accumulation in streptozotocin induced diabetic rat tissues”, Arch

Pharm Res, vol.25, no.3, pp. 306-312.

131 Schmid, H. et al. (1951), “Über die Konfiguration der Eleutherine-

Chinone (Inhaltsstoffe aus Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. V.)”, Helv.

Chim. Acta, vol. 34 (4), pp. 1041-1049.

132 Schrier R W, Wang W (2004), “Acute renal failure and sepsis”, N

Engl J Med, 351(2), pp. 159-169.

133 Shibuya H, Fukushima T, Ohashi K, Nakamura A, Riswan S,

Kitagawa I (1997), “Indonesian medicinal plants. Chemical structures of

eleuthosides A, B, and C, three new aromatic glucosides from the bulbs

of Eleutherine palmifolia (Iridaceae)”, Chem Pharm Bull, vol. 45, pp. 1130-

1134.

134 Shu Pan, Hong Jun-Li, Wu Gang, Yu Bo-Yang, Qin Min-Jian (2010),

“Analysis of Flavonoids and Phenolic Acids in Iris tectorum by HPLC- DAD-ESI-MSn”, Chinese Journal of Natural Medicines, vol. 8(3), pp. 0202-

0207.

135 Seibert K., Zhang Y., Leahy K., et al (1994), “Pharmacological and

biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase-2 in inflammation

and pain”, Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 90, pp. 11693-11697.

136 Sompol Paramapojna, Markus Ganzerab, Wandee Gritsanapana,

Hermann Stuppnerb (2008), “Analysis of naphthoquinone derivatives in the

Asian medicinal plant Eleutherine americana by RP-HPLC and LC–MS”,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 47, pp. 990–993.

137 Sujogya Kumar Panda, Akshya Kumar Bastia, Sushil Kumar Dutta

(2010), “Anticandidal activity of Eleutherine bulbosa (Miller) Urban”,

Inventi Impact: Ethnopharmacology, vol. 29/10.

138 Suk Woo Kang, Min Cheol Kim, Chul Young Kim, Sang Hoon Jung,

and Byung Hun Um (2008), “The rapid identification of isoflavonoids from

Belamcanda chinensis by LC-NMR and LC-MS”, Chem. Pharm. Bull., vol.

56(10), pp. 1452-1454.

139 T. Hunter (1995), “Protein kinases and phosphatases: the yin and yang

of protein hosphorylation and signaling”, Cell, vol. 80, no. 2, pp. 225–236.

140 Tânia Maria Almeida Alves, Helmut Kloos, Kalos Leomar Zani

(2003), “Eleutherinone, a novel fungitoxic Naphthoquinone from

Eleutherine bulbosa (Iridaceae)”, Mem Inst Oswado Cruz, Rio de Janeiro,

vol. 98(5), pp. 709-711.

141 The Organisation of Economic Co-operation and Development

(OECD) (2001), “The OECD guideline for testing of chemical: 420 acute

oral toxicity”, Paris: OECD, pp. 1–14.

142 The Organisation of Economic Co-operation and Development

(OECD) (2001), “The OECD guideline for testing of chemical: 407 repeated

dose oral toxicity-rodent: 28-day or 14-day study”, Paris: OECD, pp. 1–7.

Thelen P, Scharf JG, Burfeind P, et al. (2005), “Tectorigenin and 143

other phytochemicals extracted from leopard lily Belamcanda chinensis

affect new and established targets for therapies in prostate cancer”,

Carcinogenesis, vol. 26, pp. 1360–7.

144 Toby Lawrence (2009), “The nuclear factor NF-κB pathway in

inflammation”, Cold Spring Harb Perspect Biol, vol. 1, a001651.

145 Tran. D. T, Kim H. P., Park H. (2005), “Synthesis and inhibitory

activity of prostaglandin production of 7-oxygenated-flavone analogs”, The

fourth Indochina conference on Pharnaceutical Sciences, Ho Chi Minh City

(VietNam), vol. 1, pp. 317-322.

146 Wanchai De-Eknamkul, Kaoru Umehara, Orawan Monthakantirat,

Radovan Toth, Vladimir Frecer, Lorena Knapic, Paolo Braiuca, Hiroshi

Noguchi, Stanislav Miertus (2011), “QSAR study of natural estrogen-like

isoflavonoids and diphenolics from Thai medicinal plants”, Journal of

Molecular Graphics and Modelling, vol. 29, pp. 784-794.

Wang QL, Lin M, Liu GT (2001), “Antioxidative activity of

natural isorhapontigenin”, Jpn J Pharmacol,vol. 87(1), pp. 61-66.

147

148 Wei Li, Ya Nan Sun, Xi Tao Yan, Seo Young Yang, Sohyun Kim,

Young Mi Lee, Young-Sang Koh, Young Ho Kim (2014), “Flavonoids from

Astragalus membranaceus and their inhibitory effects on LPS-stimulated

pro-inflammatory cytokine production in bone marrow-derived dendritic

cells”, Arch. Pharm. Res., vol. 37, pp. 186–192.

149 Weniger B, Haag-Berrurier M, Anton R (1982), “Plants of Haiti used

as antifertility agents”, J Ethnopharmacol, vol. 6(1), 67.

150 Williams CA, Harborne JB (1985), “Biflavonoids, quinones and

xanthones as rare chemical markers in the family Iridaceae.”, Z Naturforsch

Ser C, vol. 40, pp. 325-330.

151 Won Sick Woo and Eun Hee Woo (1993), “An isoflavone

noririsflorentin from Belamcanda chinensis”, Phytochemistry, vol.33, no.4,

pp. 939-940.

152 Xiaofan Li, Takashi Ohtsuki, Takashi Koyano, Thaworn

Kowithayakorn, and Masami Ishibashi (2009), “New Wnt/b-Catenin

Signaling Inhibitors Isolated from Eleutherine Palmifolia”, Chem. Asian J.,

vol. 4, pp. 540 – 547.

153 Xuefeng Guo, Yongde Yue, Feng Tang, Jin Wang, Xi Yao, Jia Sun

(2013), “A comparison of C-glycosidic flavonoid isomers by electrospray

ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry in negative

and positive ion mode”, International Journal of Mass Spectrometry, vol.

333, pp. 59– 66.

154 Y. Nishizuka (1988), “The molecular heterogeneity of protein kinase

C and its implications for cellular regulation”, Nature, vol. 334, no. 6184, pp.

661–665.

155 Yan Chen, Chong-Ming Wu, Rong-ji Dai, Liang Li, Yu-Hong Yu,

Yan Li, Wei-Wei Meng, Liang Zhang, Yongqian Zhang, Yu-Lin Deng

(2011), “Combination of HPLC chromatogram and hypoglycemic effect

identifies isoflavones as the principal active fraction of Belamcanda

chinensis leaf extract in diabetes treatmet”, Journal of chromatography B,

vol. 879, pp. 371-378.

156 Yang YI, Lee KT, Park HJ, et al. (2012), “Tectorigenin sensitizes

paclitaxelresistant human ovarian cancer cells through down regulation of

the Akt and NF-_B pathway”, Carcinogenesis, vol. 33, pp. 2488–98.

157 Yeo WH, Yun BS, Kim SS, Park EK, Kim YH, Yoo ID, Yu SH

(1998), “GTRI-02, A new lipid-peroxidation inhibitor from micromonospora

SP. SA246”, Journal of antibiotics, vol. 51, pp. 952-953.

158 Zhi Jun Song, Fan Luo, Yan Zhou, Bin Ru Bai, Shu Lin Peng, Li

Sheng Ding (2007), “Two new isoflavonoids from the rhizomes of

Belamcanda chinensis”, Chinese chemical letters, vol. 18, pp. 694-696.

159 Zuo, L. et al. (2003), “2D-IR correlation analysis of deteriorative

process of traditional Chinese medicine ‘‘Quing Kai Ling’’ injection”, J.

Pharm. Biomed. Appl., vol. 30 (5), 1491-8.

Luận án Tiến sỹ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) và xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.) (họ La dơn (Iridaceae))

Chủ đề:

Luận văn cao học

Luận văn thạc sĩ khoa học cây trồng

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH (ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.) URB.) VÀ XẠ CAN (BELAMCANDA CHINENSIS (L.) DC.) (HỌ LA DƠN (IRIDACEAE))

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HOÁ HỌC

HÀ NỘI – 2016

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI SÂM ĐẠI HÀNH

(ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.) URB.) VÀ XẠ CAN

(BELAMCANDA CHINENSIS (L.) DC.) (HỌ LA DƠN

(IRIDACEAE))

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HOÁ HỌC

Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 62.44.01.17

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS Lê Minh Hà

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

NCS. Đỗ Thị Thanh Huyền

LỜI CAM ĐOAN

NCS. Đỗ Thị Thanh Huyền

Các công trình đã được công bố liên quan đến luận án ................................... 148

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các nhóm hợp chất phenolic cơ bản ...................................................... 27

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây sâm đại hành (Eleutherine bulbosa ). ................................................ 5

MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN

- Freesia refracta (Jacq.) Klatt.: hương tuyết lan

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

THỰC NGHIỆM

EB-14 (10mg)

EB-10 (8mg)

EB-2 (12mg)

EB-5 (9mg)

EB-6 (15mg)

EB-4 (5mg)

EB-3 (9mg)

EB-1 (5mg)

EB-11 (19mg)

EB-8 (15mg)

EB-7 (12mg)

EB-12 (9mg)

EB-13 (14mg)

EB-9 (8mg)

Hợp chất EB-6 (6)

3.2.2.1 Xác định khả năng kháng viêm của các cặn chiết theo đường bôi

Cặn BS-EtOAc

F1

F6

F7

F2

F4

F5

F3

BS-2 (480 mg)

BS-14 ( 15 mg)

BS-13 (5 mg)

BS-5 (9 mg)

BS-1 (8 mg)

BS-4 (8 mg)

BS-3 (20mg)

BS-9 (42 mg)

BS-6 (10 mg)

BS-8 (12 mg)

BS-7 (5 mg)

E5

E2

E4

E3

E4.2

E4.3

E4.1

BS-12 (11 mg)

BS-10 (7 mg)

3.3.1.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ cây xạ