Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc Pu-AgNPs có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

------------------------------

Nguyễn Mai Linh

“NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH”

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

------------------------------

Nguyễn Mai Linh

“NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hƣớng dẫn 1: TS. Đỗ Hữu Nghị

Hƣớng dẫn 2: PGS.TS Ngô Kim Chi

Hà Nội - 2021

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS Ngô Kim Chi và TS. Đỗ Hữu Nghị và không trùng lặp với bất kỳ công trình khoa học nào khác. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào, chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả

Nguyễn Mai Linh

Lời cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Ngô Kim Chi và TS. Đỗ Hữu Nghị

đang công tác và làm việc tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, động viên tôi

trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin cảm ơn Học Viện Khoa Học và Công nghệ, phòng Đào tạo, các

thầy giáo, cô giáo và cán bộ thuộc Khoa Công nghệ Sinh học tại Học Viện

Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

đã nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại học viện.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh chị nhân viên phòng thí

nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân trong gia đình

đã luôn là điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi, và toàn thể

bạn bè đã cộng tác giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Học viên

Nguyễn Mai Linh

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

AgNPs: Các hạt nano bạc

Pu-AgNPs: Các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định

Danh mục các bảng

Bảng 1.1: Tính chất điển hình của pullulan ...................................................... 9

Bảng 2.1: Tỷ lệ pha loãng đƣờng glucose…………………………………...39

Bảng 2.2: Pha dung dịch Pullulan ở các nồng độ khác nhau .......................... 41

Bảng 3.1: So sánh quá trình thu hồi sản phẩm rắn bằng…………………….52

Bảng 3.2: Khả năng thu hồi pullulan bởi các dung môi khác nhau ................ 53

Bảng 3.3: Kết quả đo độ nhớt của dung dịch pullulan 10% ........................... 54

Bảng 3.4: Kết quả đo độ hấp thụ quang của ................................................... 55

Bảng 3.5: So sánh phổ FT-IR của mẫu thử nghiệm và mẫu chuẩn ................ 57

Bảng 3.6: So sánh phổ FT-IR của mẫu thử nghiệm với mẫu chuẩn và các nghiên cứu khác .............................................................................................. 62

Bảng 3.7: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc Pu- AgNPs ............................................................................................................. 64

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1: Sản phẩm pullulan dạng bột .............................................................. 7

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học đơn giản của pullulan ............................................ 8

Hình 1.3: Các sản phẩm thực phẩm có sử dụng pullulan ............................... 10

Hình 1.4: Vỏ bao thuốc sử dụng pullulan ....................................................... 11

Hình 1.5: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh phải) và hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm (ảnh trái)................. 14

Hình 1.6: Cơ chế sinh tổng hợp pullulan giả định từ nghiên cứu của ............ 15

Hình 1.7: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch và thu nhận pullulan ...................... 18

Hình 1.8: Cơ chế kháng khuẩn của vật liệu nano bạc ..................................... 21

Hình 2.1: Giới hạn của định luật Beer về sự hấp thụ quang…………………36

Hình 2.2: Đƣờng chuẩn của pullulan .............................................................. 42

Hình 2.3: Hệ đo độ nhớt bằng nhớt kế ............................................................ 43

Hình 2.4:Mô tả thí nghiệm .............................................................................. 45

Hình 3.1: Sản phẩm thu đƣợc sau quá trình lên men………………………..49

Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đối với quá trình tẩy màu ............. 50

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ H2O2 đối với quá trình tẩy màu ............... 51

Hình 3.4: Hiệu suất thu nhận pullulan khi sử dụng 2 dung môi khác nhau .... 53

Hình 3.5: Mẫu giấy chạy sắc ký ...................................................................... 54

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại FT-IR của pulluulan tinh sạch .............................. 56

Hình 3.7: Phổ hồng ngoại FT-IR của pullulan tiêu chuẩn .............................. 56

Hình 3.8: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các ................. 58

Hình 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP58

Hình 3.10: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các ............... 59

Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP ......................................................................................................................... 59

Hình 3.12: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các ............... 60

Hình 3.13: Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP .......... 60

Hình 3.14: Kích thƣớc hạt nano Pu-AgNPs .................................................... 61

Hình 3.15: Kết quả phân tích phổ FT-IR của nano bạc Pu-AgNPs ................ 62

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 5

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 7

1.1. TỔNG QUAN VỀ PULLULAN............................................................ 7

1.1.1. Cấu trúc hóa học của pullulan ..................................................... 7

1.1.2. Tính chất của pullulan .................................................................. 8

1.1.3. Ứng dụng của pullulan ............................................................... 10

1.1.3.1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm ........................ 10

1.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y học ............ 11

1.1.3.3. Ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác ...................... 12

1.2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN TRÊN THẾ GIỚI ............. 13

1.2.1. Tình hình sản xuất pullulan trên thế giới ................................. 13

1.2.2. Giới thiệu chủng giống Aureobasidium pullulans..................... 13

1.2.3. Cơ chế lên men sinh tổng hợp pullulan ..................................... 15

1.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch và thu hồi pullulan.............................. 17

1.3. TỔNG QUAN VỀ NANO BẠC .......................................................... 19

1.3.1. Tính chất của nano bạc ............................................................... 19

1.3.2. Nano bạc đối với sức khỏe con ngƣời. ....................................... 22

1.3.3. Ứng dụng của nano bạc .............................................................. 23

1.3.3.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm ................................... 24

1.3.3.2. Ứng dụng trong đồ gia dụng, sản xuất hàng tiêu dùng ............. 24

1.3.3.3. Ứng dụng trong y tế ................................................................... 24

1.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP TẠO NANO ...................... 25

1.4.1. Các phƣơng pháp tạo hạt nano từ polysaccharide .................. 25

1.4.1.1. Tổng hợp hạt nano từ sự hóa keo các giọt nhũ tương ............... 25

1.4.1.2. Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết cộng hóa trị ............................. 26

1.4.1.3. Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết ion ........................................... 27

1.4.2. Các phƣơng pháp chế tạo nano bạc .......................................... 27

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ LỰA CHỌN PHƢƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI ................................................................. 28

PHÁP NGHIÊN CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG CỨU ................................................................................................................ 32

2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................... 32

2.1.1. Nguyên liệu sử dụng .................................................................... 32

2.1.2. Hóa chất ....................................................................................... 32

2.1.3. Trang thiết bị sử dụng ................................................................ 32

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 33

2.2.1. Phƣơng pháp tinh sạch pullulan ................................................ 33

2.2.2. Phƣơng pháp tẩy màu sản phẩm của quá trình lên men ........ 34

2.2.3. Phƣơng pháp kết tủa thu hồi sản phẩm .................................... 37

2.2.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng sót bằng DNS ........................... 38

2.2.5. Phƣơng pháp xác định và kiểm tra chất lƣợng pullulan ......... 40

2.2.5.1. Xác định pullulan theo phương pháp enzyme đặc hiệu pullulanase .............................................................................................. 40

2.2.5.2. Định lượng pullulan theo phương pháp phenol sulfuric axit .... 41

2.2.5.3. Xác định độ nhớt bằng nhớt kế .................................................. 42

2.2.5.4. Định lượng đường Mono-, di-, và oligosaccharide theo phương pháp anthrone-sulfuric axit ..................................................................... 43

2.2.5.5. Xác định khối lượng pullulan bằng phương pháp sấy ............... 44

2.2.6. Phƣơng pháp tạo nano bạc Pu-AgNPs ...................................... 45

2.2.7. Phƣơng pháp xác định sản phẩm .............................................. 46

2.2.7.1. Phương pháp xác định cấu trúc đặc trưng của sản phẩm bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR ................................................................ 46

2.2.7.2. Phương pháp xác định kích thước hạt nano bạc Pu-AgNPs bằng phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) ................................................ 46

2.2.8. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật ................. 46

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 49

3.1. KẾT QUẢ TINH SẠCH, THU NHẬN, XÁC ĐỊNH VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG PULLULAN .................................................................... 49

3.1.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tẩy màu sản phẩm lên men .................................................................................. 49

3.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đối với quá trình tẩy màu......... 49

3.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đối với quá trình tẩy màu .......... 50

3.1.2. Kết quả lựa chọn dung môi thu nhận pullulan ........................ 52

3.1.3. Kết quả kiểm tra chất lƣợng pullulan ....................................... 54

3.1.3.1. Kết quả phân tích định tính ........................................................ 54

3.1.3.2. Kết quả xác định độ nhớt ........................................................... 54

3.1.3.3. Xác định hàm lượng pullulan ..................................................... 55

3.1.3.4. Kết quả phân tích cấu trúc phổ hồng ngoại FT-IR của pullulan ................................................................................................................. 56

3.2. KẾT QUẢ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs ........................................... 57

3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs .................................................... 57

3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 tới quá trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs .............................................................. 59

3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian tới phản ứng tạo nano bạc Pu-AgNPs ............................................................................... 60

3.2.4. Kết quả xác định kích thƣớc hạt nano bạc Pu-AgNPs ............ 61

3.2.5. Kết quả xác định cấu trúc của hạt nano bạc Pu-AgNPs ......... 62

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NANO BẠC Pu-AgNPs .............................................................................. 63

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 65

4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 65

4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 67

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các công nghệ hiện đại để đáp ứng nhu cầu của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng cao. Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần đƣợc thay thế cho các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên đƣợc tổng hợp từ vi sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu.

Bên cạnh đó, công nghệ nano hiện nay đang trở thành một công nghệ mới nổi và đang tạo ra một cuộc cách mạng trong những ứng dụng y sinh học nhờ vào khả năng giúp con ngƣời can thiệp tại kích thƣớc nano đƣợc sử dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Các nhà khoa học mong muốn có đƣợc sự giao thoa giữa công nghệ sinh học và công nghệ nano bởi lẽ công nghệ nano mang lại cho sinh học những công cụ mới trong khi sinh học cho phép công nghệ nano đạt đƣợc các hệ thống có chức năng mới.

Bạc từ lâu đã thể hiện tính chất kháng khuẩn và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, tuy nhiên khi ở trạng thái phân tán với kích thƣớc nano thì tính kháng khuẩn lại thể hiện mạnh mẽ hơn. Việc tổng hợp các hạt có kích thƣớc nano từ trƣớc đến nay đều đƣợc thực hiện theo các phƣơng pháp vật lý, hóa học truyền thống độc hại, chi phí cao, không thân thiện với môi trƣờng. Bên cạnh đó, các polysaccharide đƣợc nấm bài tiết dƣới dạng các chất polyme tái tạo là các hợp chất sinh học an toàn, thân thiện với môi trƣờng đƣợc chứng minh là có tính khử và ổn định các hạt nano đƣợc tổng hợp. Các phƣơng pháp tƣơng thích sinh học này đã đƣợc nghiên cứu ở một số nơi trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu theo hƣớng này.

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế cấp thiết đặt ra, tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc Pu-AgNPs có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định”. Nghiên cứu đƣợc thực hiện với các nội dung chính sau:

1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tinh sạch và thu nhận pullulan đƣợc lên men sinh tổng hợp từ chủng nấm Aureobasidium pullulans.

2. Nghiên cứu tổng hợp các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo nano bạc Pu- AgNPs.

3. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc Pu-AgNPs tổng

hợp đƣợc.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ PULLULAN

Pullulan là một polymer sinh học phân tử lƣợng lớn, có công thức hóa học (C6H10O5)n sản xuất bằng lên men hiếu khí từ tinh bột, đƣờng với chủng nấm Aureobasidium pullulans [1]. Pullulan có khả năng tạo liên kết sợi, tạo màng mỏng phân hủy tốt. Pullulan tan tốt trong nƣớc lạnh, tạo dịch keo nhớt, độ dính cao, trong suốt, chịu môi trƣờng pH dao động từ 2-12. Màng pullulan ngăn không khí thâm nhập, phủ bên ngoài sản phẩm chống oxy hóa, chống chảy nƣớc, tăng cƣờng khả năng chống mất màu của sản phẩm, sản xuất màng bao gói kẹo, bánh, thực phẩm. Trong công nghệ mỹ phẩm, với khả năng kết dính cao pullulan đƣợc ứng dụng trong sản xuất dầu gội đầu, làm chất tạo sợi, tạo bọt. Pullulan đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, và các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, và đang đƣợc ứng dụng trong y sinh học nhƣ trong công nghệ chuyển gen, dẫn thuốc tới đích, kỹ thuật mô, kỹ thuật hình ảnh, làm vỏ thuốc, làm chất cân bằng áp suất trong máu [2]…

Hình 1.1: Sản phẩm pullulan dạng bột

1.1.1. Cấu trúc hóa học của pullulan

Pullulan là một polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo bởi chủ yếu các đơn vị maltotriose và một phần nhỏ các đơn vị maltotetraose theo liên kết

α-1,6 glucoside. Các đơn vị này đƣợc cấu tạo từ các đơn vị glucose theo liên kết α-1,4 glucoside [3].

Polysaccharide ngoại bào của chủng nấm A. pullulans có hai dạng sản phẩm: polysaccharide dị hình và glucan trung hòa. Glucan trung hòa đƣợc gọi là pullulan, chứa liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside. Pullulan đƣợc xác định dựa trên cơ sở quay cực, thủy phân axit fomic, phổ hồng ngoại, phƣơng pháp phân tích methyl hóa. Ngƣời ta đã đƣa ra tỷ lệ liên kết α-1,4 : α- 1,6 glucoside trong phân tử pullulan là 3:2 dựa trên phƣơng pháp methyl hóa và oxy hóa [4].

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học đơn giản của pullulan

Khối lƣợng phân tử của pullulan dao động trong khoảng 2,5.105 –

4,5.105 dalton tùy thuộc vào thời gian lên men, pH và nồng độ photphat [4].

1.1.2. Tính chất của pullulan

Pullulan bị phá hủy ở nhiệt độ cao 250-280oC. Pullulan không mùi, không vị, hòa tan trong nƣớc, không hòa tan trong dung môi hữu cơ trừ dimethylfocmandehide và dimethylsulfoxide [2]. Dung dịch pullulan nhớt nhƣng không tạo gel và ổn định. Độ nhớt của pullulan phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của pullulan. Pullulan có khả năng hình thành 1 màng film trong suốt. Dung dịch pullulan có sức căng bề mặt cao và ổn định tốt, độ nhớt của nó không thay đổi khi có mặt các ion kim loại khác nhau có trong dung dịch. Với khả năng kết dính cao nên có thể nén trực tiếp dƣới nhiệt có ẩm.

Pullulan có thể tạo thành các loại vật liệu có hình dạng khác nhau. Pullulan tạo thành màng có tính chất ngăn ngừa, không cho không khí thấm qua [5].

Nhiều viên nang đƣợc làm từ pullulan đƣợc sử dụng thay cho gelatin phù hợp cho bệnh nhân tiểu đƣờng và bệnh nhân có chế độ ăn hạn chế, Pullulan tan rất cao trong nƣớc do đó đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang thuốc và giúp kiểm soát nồng độ trong huyết tƣơng. Pullulan đã đƣợc nghiên cứu nhƣ là chất nền tảng để xây dựng chế phẩm keo phân phối thuốc nhạy cảm với pH, tạo hạt nano, quá trình khớp nối lắp ráp với các hợp chất sinh học phân phối thuốc chống ung thƣ. Hiện nay việc ứng dụng pullulan trong lĩnh vực y sinh học đang gia tăng nhờ có tính không độc hại, không kích thích miễn dịch, tƣơng thích sinh học và có tính trơ tự nhiên. So với dextran, tốc độ phân huỷ của pullulan trong huyết thanh nhanh hơn so với dextran [5].

Bảng 1.1: Tính chất điển hình của pullulan [4]

Tính chất Giá trị

Dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng Trạng thái

Sự hòa tan trong nƣớc (25oC) Dễ tan

Độ ẩm < 6%

Chất tro < 3%

Protein < 0,5%

Kim loại nặng < 5pp

Arenic < 2ppm

Độ nhớt của dung dịch 10% ở 30oC 132-179 mm2/s

Trọng lƣợng phân tử 10-3000 kDa

1.1.3. Ứng dụng của pullulan

1.1.3.1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm

Với tính chất tạo đƣợc màng mỏng, ngăn cản đƣợc sự tiếp xúc của oxy với sản phẩm, pullulan đƣợc coi là chất lý tƣởng để bao gói bảo quản, phủ bên ngoài hoàn hảo cho các sản phẩm thực phẩm chống oxy hóa nhất là các sản phẩm có dầu, làm nổi trội màu và tăng cƣờng khả năng chống mất màu của sản phẩm. Do có khả năng ngăn cản không khí thấm qua nên màng pullulan còn đƣợc dùng nhiều trong việc giữ hƣơng, làm giảm mất mùi vị của sản phẩm và đồng thời tránh đƣợc sự oxy hóa chất béo và các chất dầu có trong thực phẩm, làm tăng thời hạn sử dụng. Ngoài ra do màng pullulan giữ đƣợc hình dạng trong suốt nên còn đƣợc ứng dụng để trang trí, vẽ tranh lên sản phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo. Dịch pullulan không màu, không mùi, có thể tạo lớp áo bóng, đẹp, bền màu cho sản phẩm. Pullulan tiêu hóa chậm không làm tăng glucoza trong máu khi ăn, ít calo có thể sử dụng khi pha chế làm thực phẩm cho ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng. Khả năng kết dính cao nên dùng để giữ hình dạng khác nhau của các sản phẩm: viên thịt, viên cá trong chế biến đồ hộp, thức ăn nhanh, xúc xích. Pullulan dùng cho đồ uống, cream, nƣớc sốt làm tăng độ nhớt, độ ổn định, ức chế nấm phát triển và là nguyên liệu tuyệt vời cho bảo quản thực phẩm [6].

Hình 1.3: Các sản phẩm thực phẩm có sử dụng pullulan

1.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y học

Hình 1.4: Vỏ bao thuốc sử dụng pullulan

Ứng dụng trong kỹ thuật mô và cấy ghép: Heparin kết hợp với pullulan ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn và do đó có thể đƣợc sử dụng nhằm mục đích gia tăng các tế bào nội mô mạch máu và ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn [7].

Pullulan được coi như một vật liệu để phân phối thuốc: Các hydrogel pullulan nhƣ các hệ thống phân phối thuốc, đặc biệt ở dạng gel nhỏ và gel nano. Lợi ích điều trị đạt đƣợc bằng cách phân phối thuốc chậm vào huyết tƣơng, và do đó làm thay đổi nồng độ các cấu hình thuốc. Hạt nano hydrogel của liên kết chéo giữa pullulan với glutaraldehyde đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp để phát triển một hệ thống vận chuyển DNA tƣơng thích sinh học và sự ổn định. Đặc biệt, pullulan amphiphilic thu đƣợc từ cholesteryl, acetyl hoặc chloroacetyl ghép với nhóm hydroxyl tạo thành nanogel có khả năng bẫy các phân tử kị nƣớc, các protein hoặc các peptide và axit nucleic [7].

Thuốc chống ung thư dựa vào pullulan: Các hợp chất sinh học đƣợc tổng hợp bởi các dẫn xuất pullulan với doxorubicin hoặc doxorubicin với axit folic. Những phát hiện này cho thấy rằng các hợp chất sinh học doxorubicin- pullulan phù hợp cho mục đích tiêu khối u thụ động. [7].

Ứng dụng của pullulan trong chuyển gen [7]: Liệu pháp gen là một lĩnh vực mà các ứng dụng của pullulan đang đƣợc nghiên cứu. Chuyển gen thƣờng đƣợc chuyển trung gian qua đƣờng nội bào. Những cố gắng sử dụng liệu pháp gen virus đã đƣợc thực hiện nhƣng nhƣợc điểm lớn mà virus đƣợc biết đến nhƣ là miễn dịch, gây bệnh và có thể nguy hiểm.Vì vậy, cố gắng để phát triển vectơ không virus đƣợc thực hiện và các dẫn xuất của các cation polyme tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu. Pullulan trở thành chất sinh học thích hợp và không độc hại đƣợc nghiên cứu để áp dụng chuyển gen. Dẫn xuất pullulan trong đó có dƣ lƣợng kim loại và trộn với một DNA plasmid trong dung dịch chứa các ion Zn2+ để có đƣợc sự kết hợp của dẫn xuất pullulan và DNA plasmid phối hợp với Zn2+.

Ngoài ra, trong y học Pullulan còn đƣợc sử dụng để duy trì áp suất thẩm thấu ở trong máu và mô tế bào và có thể làm tăng cung cấp huyết tƣơng. Nó đƣợc tạo ra bằng cách hòa tan pullulan có phân tử lƣợng từ 3000-9000 trong dung dịch muối sinh lý để tạo nên dịch pullulan 4-10%. Sau đó đem tiệt trùng, dung dịch này đƣợc tiêm vào tĩnh mạch một cách lặp đi lặp lại với sự an toàn tuyệt đối. Pullulan có thể đƣợc chuyển hóa và bài tiết hoàn toàn.

Gần đây, aureobasidins là những chất kháng sinh tự nhiên đƣợc tách ra từ dịch lên men của chủng A. pullulans R106 đƣợc phân lập từ lá cây của Nhật Bản. Aureobasidins có hoạt tính chống mốc cao, chống lại bệnh nấm Candida albicans [8].

1.1.3.3. Ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác

Các dẫn xuất của pullulan đƣợc este hóa có thể đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất hồ dán, sử dụng làm chất nền cho các loại giấy khác nhau. Giấy pullulan có tính thấm cao nên phù hợp cho việc in ấn và viết. Ứng dụng cụ thể nhƣ sau:

- Trong công nghiệp dệt: là tác nhân hồ vải.

- Trong công nghiệp sản xuất chất kết dính: Pullulan có trong chất dán

khô và chất dán giữ ẩm cho các nhãn hàng, tem thƣ, phong bì…

- Trong công nghiệp sản xuất sơn: Pullulan có trong sơn nƣớc tạo với

sự tạo thành các màng có thể tô màu, trang trí.

- Trong công nghiệp sản xuất in ấn: Pullulan có trong thành phần thấm

nƣớc.

1.2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN TRÊN THẾ GIỚI

1.2.1. Tình hình sản xuất pullulan trên thế giới [4]

Năm 1938, R.Bauer là ngƣời đầu tiên nghiên cứu về pullulans. Có

nhiều nƣớc sử dụng chủng A. pullulans để sinh tổng hợp pullulan.

Năm 1977, Nhật Bản sử dụng chủng A. pullulans IFO 4464 để sinh tổng hợp pullulan, nguồn cacbon sử dụng là siro glucose DE 45, lên men trong 4 ngày thu đƣợc dịch pullulan 6%.

Năm 1987, Hàn Quốc cũng sử dụng chủng trên nhƣng với nguồn cacbon là saccaroza 5%, nhiệt độ lên men 28oC, lắc 200 vòng/phút thì chỉ thu đƣợc lƣợng pullulan là 27,5 g/l.

Năm 2003, các nhà khoa học tại trƣờng Đại học Ege – 35000 Bernova Izmin – Turkey sử dụng chủng A. pullulans P56 với nguồn cacbon là 50 g/l saccaroza, lắc 200 vòng/phút thì thu đƣợc lƣợng pullulan là 21,4 g/l.

Năm 2009, tại Ấn Độ sử dụng chủng A. pullulans MTCC 2195 với nguồn nguyên liệu là nƣớc dừa, sau 6 ngày lên men lƣợng pullulan thu đƣợc là 58 g/l.

1.2.2. Giới thiệu chủng giống Aureobasidium pullulans

Aureobasidium pullulans thuộc ngành nấm túi Ascomycota nhƣng hình thái giống với nấm men, có màu đen và có thể đƣợc phân lập ở các vùng ôn đới, vùng nhiệt đới và vùng khô cằn, ở các môi trƣờng khác nhau: nƣớc bẩn, không khí, biển và các loại đất khác nhau. Trong tự nhiên, chúng đƣợc biết là những loại nội ký sinh của nhiều cây thực vật (nhƣ táo, nho, dƣa chuột, đậu đỗ, bắp cải) mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào của bệnh. A. pullulans có những thuộc tính của nấm nhƣ sự sắp xếp bào tử đính, ngƣời ta đã thấy nó có hình dạng, cấu tạo giống với Ascomycotina.

A. pullulans là loại hiếu khí bắt buộc, ƣa ấm, sinh bào tử, sinh sản hữu tính bằng bào tử. Thay đổi kiểu hình của loài này cũng rất đáng chú ý. Hình thái khuẩn lạc có thể bị ảnh hƣởng bởi nguồn cacbon, tuổi của khuẩn lạc, nhiệt độ, ánh sáng và cơ chất với các khuẩn lạc thay đổi từ đồng nhất đến phân cụm. Bên cạnh đó những hình thái của chúng cũng thích nghi với điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt nhƣ: khoảng pH rộng, độ muối cao, axit và kiềm, nhiệt độ thấp và nghèo dinh dƣỡng, lƣợng tia UV cao. Do đó chúng đƣợc coi là loài có khả năng chịu đa điều kiện khắc nghiệt.

Hình 1.5: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh phải) và hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm (ảnh trái) [9]

Glucose 6-phosphate

Glucose 1-phosphate

UDP-Glucose

Fructose 6-phosphate

Fructose 1,6- diphosphate

LPh

UDP

Fructose 1-phosphate

LPh-Glc

UDPG

Fructose

UDP

LPh-Glc-(6 1)-Glc (isomaltosyl)

Monosaccharide

Polysaccharide

LPh-Glc-(6 1)-Glc-(4 1)-Glc (isopanosyl)

Pullulan

1.2.3. Cơ chế lên men sinh tổng hợp pullulan

UDPG : uridin diphosphate glucose

UDP : uridin diphosphate

Hình 1.6: Cơ chế sinh tổng hợp pullulan giả định từ nghiên cứu của

Catley và cộng sự [10]

Con đƣờng sinh tổng hợp pullulan vẫn chƣa đƣợc giải thích rõ ràng. Các nhà nghiên cứu đƣa ra giả thuyết rằng chất vận chuyển – lipid có liên quan tới sự sinh tổng hợp pullulan. Catley và cộng sự, những ngƣời đã tách đƣợc glycolipid từ A. pullulans đã mở rộng giả thuyết cơ chế tạo thành pullulan từ chủng giống này và đƣa ra giả thuyết để tạo thành pullulan cần có chất mang lipid - phosphate. Glycolipid liên kết với glucose và các oligosaccharide khác nhƣ isomaltose, panose, isopanose bởi liên kết pyrophosphate. Do vậy, để tạo thành mạch polysaccharide, A.pullulans không phải chỉ tạo liên kết α-1,4 và α-1,6-glucoside để đơn giản nối các monome lại với nhau. Giai đoạn đầu nhờ có lipid – phosphate sẽ biến đổi cơ chất thành lipid – pyrophosphate – isopanose và lipid – pyrophosphate – panose. Sau đó chất mang đƣợc tách ra và tạo thành panose và isopanose, hai chất này đƣợc trùng hợp tạo oligosaccharide trong phân tử pullulan. Ông đã chứng minh những chất đó là chất trung gian để sinh tổng hợp pullulan [11].

Có thể dự đoán rằng lipid kỵ nƣớc giúp vận chuyển các chất qua màng tế bào chất, đây là yêu cầu cơ bản cho các polysaccharide ngoại bào. Tuy nhiên, nơi sinh tổng hợp pullulan là ở trong màng tế bào chất hay bên ngoài màng tế bào và tầm quan trọng của thành tế bào vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ.

Thêm nữa, enzyme liên quan đến sự sinh tổng hợp pullulan vẫn chƣa đƣợc biết đến dù rằng chắc chắn chúng có tồn tại. Việc nghiên cứu về cơ chế sinh tổng hợp pullulan vẫn đang tiếp tục. Nếu có thể làm sáng tỏ cơ chế đó sẽ đƣa việc sản xuất pullulan lên một bƣớc tiến cao hơn, tăng độ tinh sạch của pullulan và loại trừ vấn đề nhiễm bẩn melanin.

Catley và cộng sự cho rằng sự tạo thành pullulan ở bên trong hay bên ngoài tế bào chất trong quá trình tổng hợp là chƣa rõ ràng. Tuy nhiên họ khẳng định sự tạo thành pullulan phụ thuộc nhiều vào thành tế bào vì sản phẩm đƣợc tạo ra bởi chủng A.pullulans ở trong thành tế bào nhiều hơn. Nhƣng Frinkleman và Vardanis thì cho rằng thể nguyên sinh và cả tế bào có thể tổng hợp nên pullulan mặc dù kích thƣớc phân tử khác nhau [12].

1.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch và thu hồi pullulan [11]

Một số tác giả sử dụng phƣơng pháp sau để thu hồi pullulan sau quá trình lên men bởi chủng A.pullulans: Dịch lên men nhận đƣợc chứa pullulan đƣợc ly tâm để tách tế bào nấm mốc, tẩy màu. Sau đó pullulan đƣợc tách ra bằng phƣơng pháp kết tủa pullulan bởi dung môi methanol, etanol, axeton.

Tuy nhiên với phƣơng pháp này pullulan nhận đƣợc vẫn chứa 40-60% nƣớc, thậm chí cả dung môi bổ sung vào, ngoài ra còn chứa một lƣợng tạp chất đƣờng, tri-, di-, monosaccharide, các chất vô cơ, protein, chất màu. Các chất này tồn tại trong kết tủa pullulan khó tách ra và làm sạch, đặc biệt lƣợng nƣớc lớn nằm trong khối bầy nhầy, rất khó để xử lý nhiệt. Các phƣơng pháp này đòi hỏi bổ sung một lƣợng rất lớn các dung môi hữu cơ, thƣờng gấp từ hai đến ba lần thể tích dịch lên men. Mặc dù các dung môi có thể thu hồi bằng chƣng cất nhƣng đó vẫn là một bất lợi trong chi phí sản xuất. Việc bổ sung methanol gấp khoảng ba lần thể tích dịch lên men cho kết tủa pullulan dễ dàng và gần nhƣ hoàn toàn đƣợc ghi nhận.

Các sắc tố hiện diện trong dung dịch lên men đƣợc hấp phụ vào và kết tủa với pullulan gây khó khăn cho việc tẩy màu pullulan này. Hơn nữa, ngay cả bổ sung than hoạt tính hoặc H2O2 để tẩy màu trƣớc khi lọc cũng rất khó vì dịch lên men có độ nhớt cao, do đó đòi hỏi phải pha loãng đến mức độ nào đó. Hiện nay chƣa có tài liệu nào nói về tỷ lệ than hoạt tính hoặc H2O2 cần thiết trong quá trình tẩy màu. Tuy nhiên trong sản xuất maltodextrin, có nguồn gốc từ tinh bột nhƣ pullulan thì đều đƣợc tẩy màu bằng than hoạt tính hoặc H2O2 ở 800C, thời gian từ 20-30 phút. Dịch đƣờng fructose thu hồi đƣợc sau quá trình đƣờng hóa đƣợc tẩy màu bằng than hoạt tính hoặc H2O2 ở 800C trong thời gian 30 phút rồi lọc bằng máy lọc chân không là các kinh nghiệm tốt khi áp dụng trong việc tinh sạch và thu nhận pullulan.

Hình 1.7 sau đây thể hiện quy trình tinh sạch và thu nhận pullulan của dự án SXTN “Hoàn thiện công nghệ sản xuất pullulan và ứng dụng trong sản xuất một số sản phẩm thực phẩm” của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Lên men

Tách sinh khối

Sinh khối

C hoạt tính/H2O2

Tẩy màu

Lọc

Ethanol

Kết tủa

Lọc

Nƣớc

Hòa tan

Lọc

Sấy phun

Pullulan

Hình 1.7: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch và thu nhận pullulan

1.3. TỔNG QUAN VỀ NANO BẠC

Bạc thể hiện tính độc đối với nhiều loại vi khuẩn, virus, tảo và nấm. Nhƣng khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân), bạc không để lại ảnh hƣởng rõ ràng tới sức khỏe và sự sống của các động vật bậc cao. Từ xa xƣa, con ngƣời đã biết tận dụng đặc tính vƣợt trội này của bạc để phòng bệnh. Ở thời cổ đại, ngƣời ta thƣờng thấy nhiều đồng bạc ở dƣới các giếng nƣớc, mục đích là khử trùng nƣớc.

Sau khi nhiều loại thuốc kháng sinh ra đời và đƣợc đƣa vào ứng dụng đạt hiệu quả cao, tác dụng kháng khuẩn của bạc dần bị lãng quên. Tuy nhiên, thực trạng những năm gần đây cho thấy hiện tƣợng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, các nhà khoa học đã quan tâm trở lại với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc. Một số loại hợp chất của bạc đƣợc bán nhƣ là thuốc điều trị một số bệnh.

1.3.1. Tính chất của nano bạc

Bạc kim loại từ lâu đã đƣợc sử dụng làm chất diệt khuẩn, nhƣng khi ở trạng thái phân tán với kích thƣớc nanomet thì khả năng diệt khuẩn của bạc đƣợc tăng lên gấp bội. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hạt nano bạc cho hiệu quả diệt khuẩn rất cao (khoảng 99%) chỉ với liều lƣợng nhỏ. Tính kháng khuẩn của nano bạc thể hiện mạnh nhất ở kích thƣớc 1-100nm.

Bạc là một kim loại có khả năng kháng khuẩn tuyệt vời nhất trên thế giới nhờ ion Bạc (Ag+). Mặc dù, ion kim loại qúy khác nhƣ Au, Pt, Pd, Ir và một số kim loại chuyển tiếp khác nhƣ Cu, Zn, Fe, Co, Ni cũng đều có khả năng diệt khuẩn, nhƣng chỉ có ion bạc thể hiện tính năng đó mạnh nhất cho tới nay.

Ion Ag+ trong bạc chính là yếu tố trực tiếp có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật. Khi ở dạng muối bạc, dung dịch có Ag+ nên có tác dụng diệt khuẩn mạnh. Ở dạng Nano bạc, diện tích tiếp xúc của Bạc trở nên lớn hơn rất nhiều so với dạng thông thƣờng chính vì vậy khả năng diệt khuẩn hiệu quả gấp bội.

Ƣu điểm của nano bạc so với thuốc kháng sinh: nano bạc giết chết vi khuẩn ngay lập tức bằng cơ chế ức chế hô hấp nên vi khuẩn không có khả

năng kháng lại nano bạc. Các tế bào của con ngƣời ở dạng mô nên không bị ảnh hƣởng bởi quá trình này. Không nhƣ các thuốc kháng sinh bị hấp thụ trong quá trình diệt khuẩn, nano bạc hoạt động nhƣ chất xúc tác mà không bị hấp thụ hoặc hấp thụ lƣợng rất nhỏ và không ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe [13].

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+. Hiện nay tồn tại một số quan điểm giải thích cơ chế diệt khuẩn của hạt nano bạc đƣợc nhiều ngƣời ủng hộ nhƣ sau:

- Các nhà khoa học Hàn Quốc cho rằng: Các ion Ag+ vừa mới đƣợc giải phóng ra từ bề mặt các hạt nano bạc sẽ tƣơng tác với các nhóm peptidoglycan (thành phần cấu tạo nên màng tế bào của vi khuẩn) và ức chế khả năng vận chuyển oxy của chúng vào bên trong tế bào, dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Các tế bào động vật thuộc nhóm sinh vật đa bào có lớp màng bảo vệ hoàn toàn khác so với tế bào sinh vật đơn bào (nấm, vi khuẩn và virus). Tế bào động vật có hai lớp lipoprotein giàu liên kết đôi bền vững có khả năng cho điện tử, do đó không cho phép các ion Ag+ xâm nhập, vì vậy chúng không bị tổn thƣơng khi tiếp xúc với các ion Ag+ [14].

- Các nhà khoa học Trung Quốc mô tả cơ chế nhƣ sau: khi ion Ag+ tƣơng tác với lớp màng của tế bào vi khuẩn gây bệnh, nó sẽ phản ứng với nhóm sulphohydryl (-SH) của phân tử enzyme vận chuyển oxy và vô hiệu hóa enzyme này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn [15].

- Ngoài ra, ion Ag+ hút mạnh các nhóm mang điện tích âm trong các phân tử sinh học nhƣ sulfohydryl, carboxyl, phosphate phân bổ ở khắp nơi trên các tế bào vi khuẩn. Phản ứng ràng buộc này làm thay đổi cấu trúc phân tử của các phân tử lớn, tạo ra các lỗ hổng làm thay đổi tính thấm và sự hô hấp của tế bào. Đồng thời, ion Ag+ tấn công vào rất nhiều vị trí trong tế bào làm mất khả năng hoạt động của các chức năng nhƣ sự tổng hợp thành tế bào, màng vận chuyển, sự tổng hợp các axit nucleic, gây bất hoạt enzyme và làm rối loạn quá trình sao mã DNA. Không có các chức năng này, các vi sinh vật bị kiềm chế hoặc bị chết [16].

Vật liệu nano bạc đã đƣợc nhiều công trình nghiên cứu và công bố là có tính kháng khuẩn cao, cơ chế kháng khuẩn chính của vật liệu nano bạc vì chúng có khả năng nhƣ sau [17-22]:

- Vô hiệu hóa enzyme: Các enzyme do vi sinh vật sinh ra thƣờng chứa các cầu nối disunfit (S-S), các cầu nối này đóng vai trò nhƣ một công tắc đóng, mở thuận nghịch để tạo ra protein khi tế bào vi khuẩn gặp các phản ứng oxy hóa. Các hạt nano bạc liên kết các cầu nối này trong cấu trúc tế bào của vi sinh vật và giải phóng ion bạc từ các hạt nano bằng cách tƣơng tác với các nhóm thiol của nhiều enzyme quan trọng và vô hiệu hóa chúng nên có khả năng diệt khuẩn, vi nấm.

- Phá vỡ thành tế bào: Vật liệu nano bạc hỗ trợ quá trình tạo ra các oxy hoạt tính trong không khí hoặc trong nƣớc, những oxy hoạt tính này phá vỡ màng tế bào hoặc thành tế bào của vi khuẩn bằng cách tạo ra các phản ứng oxy hóa. Các phản ứng này hình thành các gốc bạc tự do làm cho màng tế bào bị xốp.

- Ngăn cản sinh trƣởng của vi khuẩn: các hạt nano bạc có thể neo bám vào bề mặt tế bào vi khuẩn rồi xuyên qua màng tế bào và điều chỉnh các tín hiệu chuyển hóa trong vi khuẩn, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.

Hình 1.8: Cơ chế kháng khuẩn của vật liệu nano bạc

(nguồn: http://congnghenano.infornano-bac-dong-diet-vi-khuan-nam)

Nano bạc có thể tác động lên 650 loài vi khuẩn. Trong khi phổ tác động của bất kỳ chất kháng sinh nào cũng chỉ từ 5 – 10 loài. Hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp nhƣ vi khuẩn gây viêm họng, viêm phổi, vi khuẩn uốn ván, gây bệnh ngoài da, viêm khuẩn hiếm khí và kỵ khí, gram âm và gram dƣơng đều bị tiêu diệt bởi ion Bạc có trong Nano bạc. Nhờ cơ chế tác động không phân biệt giữa vi khuẩn này với vi khuẩn khác nên Nano bạc hầu nhƣ không bị kháng giống nhƣ kháng sinh, do đó, thƣờng là một giải pháp hiệu quả thay thế kháng sinh khi không thực sự cần thiết, nhất là các nhiễm trùng tại chỗ, trên da, niêm mạc [23].

Ion bạc trong các hạt Nano bạc có khả năng vô hiệu hóa các loài virut gây bệnh đậu mùa, bệnh cúm A-1, B, adenovirus và HIV. Nano bạc cũng có điều trị hiệu quả các bệnh virus Marburg, virus bệnh đƣờng ruột (enterit) và virut bệnh dại. Tuy nhiên, để có thể vô hiệu hóa hoàn toàn virut bacteriophage đƣờng ruột N163, virut Koksaki serotyp A-5, A-7, A-14 cần đến nồng độ bạc cao hơn (0.5 – 5.0mg/lít – tƣơng đƣơng 5ppm Nano bạc plasma tinh khiết) so với trƣờng hợp xử lý Escherichia, Salmonella, Shigellia và các loài virut đƣờng ruột khác (0.1 – 0.2 mg/lít – tƣơng đƣơng 0.1-0.2ppm Nano bạc Plasma tinh khiết) [23].

Số liệu công bố của Kulskii A. L. cho thấy khả năng diệt nấm của ion bạc. Tại nồng độ 0.1mg/lít (tƣơng đƣơng 0.1ppm) bạc thể hiện rõ khả năng diệt nấm. Với mật độ 105 tb/lít nấm Candida albicans bị vô hiệu hóa hoàn toàn sau 30 phút tiếp xúc. Nấm Candida albicans thƣờng gây bệnh trên ngƣời, đặc biệt là viêm nhiễm phụ khoa sinh dục, viêm miệng lở loét. Ngoài ra, Nano bạc cũng có phổ tác dụng trên nhiều loại nấm khác đã đƣợc thử nghiệm sử dụng hiệu quả [23].

1.3.2. Nano bạc đối với sức khỏe con ngƣời.

Ảnh hƣởng của bạc đối với sức khỏe con ngƣời vẫn đang là vấn đề gây tranh cãi trong thời gian gần đây. Một kết quả nghiên cứu lâm sàng đối với bệnh nhân đƣợc cho uống nƣớc ion bạc điện hóa thay nƣớc uống với nồng độ 30-50 mg/l trong thời gian 7-8 năm, cho thấy hiện tƣợng tích tụ bạc dƣới da làm cho da bệnh nhân có màu xám, gọi là bệnh Argiria, là hậu quả của quá

trình khử quang hóa của các ion bạc. Tuy nhiên không phát hiện đƣợc ở các bệnh nhân này bất kỳ thay đổi nào về chức năng của các cơ quan nội tạng, không những thế các bệnh nhân còn thể hiện tính đề kháng đối với nhiều loại vi khuẩn và virus. Argiria có thể không làm ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời, song nó làm mất thẩm mỹ. Dù vậy, bệnh Argiria chỉ có thể xuất hiện khi hấp thụ một lƣợng lớn nano bạc trong một khoảng thời gian rất dài. Không có nghiên cứu nào cho thấy nano bạc ảnh hƣởng tới mạch máu, bàng quang, dạ dày của ngƣời. Khảo sát liều độc cấp tính trên chuột nhắt trắng của dung dịch nano bạc 20-25 nm theo phƣơng pháp hóa học nồng độ 5000 ppm cho thấy liều sử dụng lên tới 1,5ml/10g cũng không thấy chuột bị chết sau 72 giờ [23].

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xác định liều lƣợng bạc tối đa không gây ảnh hƣởng đối với sức khỏe con ngƣời là 10g. Nghĩa là, nếu một ngƣời trong toàn bộ cuộc đời của mình (70 tuổi) hấp thụ từ từ vào cơ thể 10g bạc vẫn đảm bảo không có vấn đề gì về sức khỏe. Tổ chức EPA (Cơ quan Bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ) xác lập liều chuẩn RfD – lƣợng bạc đƣợc phép hấp thụ mỗi ngày mà không có ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe trong suốt cuộc đời là 5mg/kg/ngày [24]. Tổ chức FDA (Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ) cũng công nhận rằng bạc là kháng sinh tự nhiên và không có tác dụng phụ [25].

Thông tin về độc tính của nano bạc rất ít, chủ yếu là các thí nghiệm trong ống nghiệm với kích thƣớc hạt 1-100 nm. Hiện vẫn chƣa xác định đƣợc chính xác nồng độ nano bạc tối đa đƣợc phép sử dụng mà không hại đến sức khỏe. Các sản phẩm ứng dụng công nghệ nano bạc chỉ sử dụng lƣợng nano bạc ở nồng độ rất thấp để kháng khuẩn và khả năng kháng khuẩn này có tác dụng trong suốt quá trình tồn tại của sản phẩm. Nên khi chúng ta ăn uống, sử dụng các sản phẩm chứa nano bạc thì hàm lƣợng nano bạc hấp thụ vào cơ thể rất ít và không đáng lo ngại về sức khỏe.

1.3.3. Ứng dụng của nano bạc

Ứng dụng chủ yếu của nano bạc là sử dụng để làm vật liệu kháng khuẩn. Ứng dụng này sử dụng bạc dƣới dạng hạt nano hay dung dịch ion Ag+.

1.3.3.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Những năm gần đây, công nghệ nano bạc đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong đời sống nói chung cũng nhƣ trong ngành thực phẩm nói riêng, ví dụ điển hình nhƣ sản phẩm nƣớc rửa rau sống, các loại gói đóng, bao bì đựng thực phẩm, bình sữa, thực phẩm chứa các hạt nano dinh dƣỡng…Nano bạc sẽ giúp ngăn cản và tiêu diệt những vi khuẩn có hại làm hỏng thực phẩm, giúp thực phẩm tƣơi lâu hơn. Ngoài ra, với các loại rau, nano bạc còn khử bớt dƣ lƣợng thuốc trừ sâu còn sót lại trên rau, đảm bảo an toàn trong quá trình sử dụng.

1.3.3.2. Ứng dụng trong đồ gia dụng, sản xuất hàng tiêu dùng

Công nghệ nano bạc ra đời tạo nên hƣớng phát triển sản xuất mới cho ngành thiết bị gia dụng. Các sản phẩm ứng dụng nano bạc ngày càng đƣợc ra đời nhiều hơn và trở thành xu thế phát triển công nghệ chung của một số sản phẩm nhƣ máy giặt, điều hòa, tủ lạnh, các dụng cụ đựng thực phẩm nhƣ bát đĩa, máy khử độc hoa quả, bình sữa trẻ em…Nano bạc tác động có thể giúp điều hòa tiêu diệt mầm bệnh, nấm mốc, mang đến không khí trong lành hơn, quần áo đƣợc giặt bằng máy giặt có khử khuẩn bằng nano bạc cũng trở nên sạch hơn…

Hạt nano đƣợc trộn vào trong vật liệu polymer, ceramic để lọc nƣớc, giấy, sơn kháng khuẩn [26] hay ứng dụng trong dệt may nhƣ bít tất, miếng lót giày chống mùi hôi. Dạng ion của bạc (Ag+) đƣợc sử dụng để tẩm thiết bị lọc nƣớc trên nền đất sét để kháng khuẩn.

1.3.3.3. Ứng dụng trong y tế

Hạt nano bạc đƣợc sử dụng để tráng lên bề mặt thiết bị y tế [27] hay quần áo sử dụng trong môi trƣờng y tế. Tính kháng khuẩn của bạc còn có tác dụng quan trọng trong chữa bệnh vì hiện nay hiện tƣợng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn ngày càng trầm trọng [28-30]. Các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của bạc với thuốc kháng sinh nhƣ gentamicin, ofloxacin và ampicilin làm tăng khả năng diệt khuẩn lên hai lần so với trƣờng hợp chỉ sử dụng thuốc kháng sinh [31-34]. Điều này cho thấy bạc có tác dụng tích cực trong ứng

dụng kháng khuẩn chữa bệnh. Ngoài ra, nano bạc còn đƣợc khảo sát cho các ứng dụng kháng nấm [27], kháng virus, chống sƣng tấy, chống ung thƣ [35] và hạn chế sự phát triển mất cân bằng của mô [36].

Nano bạc đƣợc sử dụng rộng rãi chủ yếu nhờ vào đặc tính kháng khuẩn. Hiện nay nano bạc đƣợc dùng trong xử lý nƣớc, cảm biến, điện tử, y học, nông nghiệp, dệt may, công nghệ sinh học và xúc tác. Với nhiều ứng dụng nhƣ vậy, nano bạc có mặt trong nhiều môi trƣờng sống của con ngƣời và các loài sinh vật khác. Tính kháng khuẩn của bạc cũng có thể gây những rủi ro đến con ngƣời và các sinh vật. Do đó, việc khai thác sử dụng vật liệu này cần đƣợc nghiên cứu nhiều hơn để có thể sử dụng hiệu quả và bền vững hơn. Hạn chế sự phân tán ra môi trƣờng là cách làm hiệu quả để ngăn chặn ảnh hƣởng tiêu cực của nano bạc. Một số chủ đề cần đƣợc quan tâm nghiên cứu đó là cơ chế kháng khuẩn của nano bạc đến nay vẫn chƣa đƣợc biết triệt để; nhƣ vai trò của gốc tự do có tính oxy hóa cao trong diệt khuẩn, tƣơng tác của hạt nano bạc với màng tế bào ở cấp độ phân tử.

1.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP TẠO NANO

1.4.1. Các phƣơng pháp tạo hạt nano từ polysaccharide [37]

1.4.1.1. Tổng hợp hạt nano từ sự hóa keo các giọt nhũ tương

Phƣơng pháp gồm hai bƣớc, bƣớc đầu tiên là chuẩn bị một hệ thống nhũ tƣơng trong đó các hạt nano đƣợc tạo khuôn để chuẩn bị cho bƣớc thứ hai. Các hạt nano có thể thu đƣợc từ phƣơng pháp tạo nhũ tƣơng bằng việc hóa keo các giọt nhũ tƣơng, dạng mà polymer có thể hòa tan đƣợc, và tạo thành từ bƣớc một của quy trình tạo nhũ tƣơng. Polysaccharide thể hiện tính chất tạo gel tốt cũng nhƣ khả năng hòa tan tốt trong nƣớc, làm cho chúng trở thành ứng cử viên lý tƣởng để sử dụng cho việc tổng hợp các hạt nano bằng phƣơng pháp này. Những cơ chế khác nhau của sự tạo gel có thể đƣợc áp dụng tùy thuộc vào tính chất tạo gel của polyme. Những thay đổi về nhiệt độ của hệ nhũ tƣơng hoặc sự tạo gel đƣợc gây ra bởi liên kết cộng hóa trị hoặc liên kết ion. Một trong số những cơ chế này gây ra sự hóa keo những giọt nhũ tƣơng và cho phép thu đƣợc các hạt nano. Hạt nano alginate và pectin đã đƣợc

tổng hợp bằng cách sử dụng một hệ nhũ tƣơng biến tính/phƣơng pháp tạo gel bên trong. Sự chuẩn bị hai hệ nhũ tƣơng khác nhau đòi hỏi: một là chứa các polyme tạo đƣợc gel trong pha phân tán và một là tác nhân chứa gel hoặc chất kiểm soát pH trong pha phân tán. Cả hai hệ nhũ tƣơng đƣợc kết hợp với nhau dƣới điều kiện khuấy trộn mạnh để đạt đƣợc sự va chạm giữa các giọt, đó là điều kiện cần thiết để kích thích sự tạo gel của polyme và do đó hình thành các hạt nano. Hạt nano chitosan đã đƣợc tạo thành từ một hệ nhũ tƣơng bởi phƣơng pháp kết nối nhũ tƣơng hoặc phƣơng pháp hóa hợp giọt nhũ tƣơng. Trong phƣơng pháp đầu tiên diễn ra phản ứng của gốc amin của chitosan với gốc aldehyde của tác nhân liên kết, thƣờng là glutaraldehyde. Một hỗn dịch nƣớc-dầu đƣợc chuẩn bị bởi sự tạo thành nhũ tƣơng của dung dịch chitosan trong pha dầu. Nhũ tƣơng có tính bền là do liên kết của glutaraldehyde làm cho các giọt đông tụ lại. Phƣơng pháp hóa hợp các giọt nhũ tƣơng có thể thu đƣợc các hạt nano chitosan với kích thƣớc khoảng 400nm, phƣơng pháp này đã đƣợc giới thiệu bởi Tokumitsu và cộng sự, áp dụng nguyên tắc liên kết giữa nhũ tƣơng và chất kết tủa. Một nhũ tƣơng có tính bền chứa dung dịch chitosan và thuốc bao gói đƣợc tạo ra trong chất lỏng paraffin. Nhũ tƣơng khác gồm dung dịch NaOH đƣợc tạo ra giống nhƣ phƣơng pháp trên và cuối cùng kết hợp với tốc độ khuấy trộn mạnh. Các giọt nhũ tƣơng va chạm ngẫu nhiên với nhau và hóa hợp, kết tủa thành những giọt chitosan trở thành những hạt rắn nhỏ. Với một polyme giống nhƣ agarose, giọt gel có thể hình thành bởi sự làm lạnh nhanh dung dịch đƣợc chuẩn bị có nhiệt độ cao. Kết quả gel hình thành cấu trúc xoắn không gian 3 chiều trong đó có một lƣợng lớn nƣớc đƣợc giữ lại. Hydrogel trở thành hydrophilic, bất động và tƣơng thích sinh học, là khung ma trận thích hợp cho đại phân tử có thể đƣợc giữ lại trong gel mới đƣợc hình thành.

1.4.1.2. Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết cộng hóa trị

Trong số các poysaccharide khác nhau, chitosan là 1 trong số các polysaccharide dễ sử dụng để tổng hợp các hạt nano dựa vào liên kết cộng hóa trị. Glutaraldehyde thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một chất liên kết để thu đƣợc các hạt nano bằng phƣơng pháp liên kết nhũ tƣơng, nhƣng khả năng gây

độc của nó làm hạn chế tiện ích của nó trong lĩnh vực phân phối thuốc. Tuy nhiên, một số hạt nano chitosan vẫn đang đƣợc sản xuất bằng cách sử dụng glutaraldehyde nhƣ tác nhân liên kết. Để vƣợt qua vấn đề về độc tính của glutaraldehyde, một số liên kết chéo tƣơng thích sinh học nhƣ tricarboxylic axit bao gồm axit succinic, axit malic, axit tartaric và axit citric đƣợc sử dụng để liên kết ngang giữa các phân tử của hạt nano chitosan. Bằng phƣơng pháp này, các gốc amin của chitosan phản ứng với các gốc carboxylic của axit tự nhiên trong môi trƣờng nƣớc, đƣợc hoạt hóa bởi một carbondimide tan trong nƣớc, thu đƣợc polycations, polyanions và hạt nano polyampholyte với kích thƣớc trung bình vào khoảng 270-370nm tùy thuộc vào pH.

1.4.1.3. Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết ion

Quy trình tạo gel ion để thu đƣợc các hạt nano là phƣơng pháp độc lập bao gồm một vài dung môi hữu cơ, hạt nano hoàn toàn đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng lỏng. So sánh với liên kết cộng hóa trị, đây là phƣơng pháp thể hiện nhiều ƣu điểm nhƣ quy trình đơn giản và môi trƣờng êm dịu. Hạt nano có thể thu đƣợc từ dung dịch có chất mang polysaccharide có mặt của các ion nhỏ của chất mang đối lập. Nhƣ vậy, polycation và polyanion hoạt động nhƣ cầu nối lần lƣợt với polyanionic và polycationic của polysaccharide. Dung dịch polysaccharide loãng đƣợc sử dụng để thực hiện quá trình tạo gel.

1.4.2. Các phƣơng pháp chế tạo nano bạc

Nhiều đề tài nghiên cứu khoa học trong và ngoài nƣớc đã chế tạo thành

công nano bạc bằng nhiều phƣơng pháp vật lý, hóa học khác nhau nhƣ:

- Phƣơng pháp ăn mòn laser: đây là phƣơng pháp chế tạo từ trên xuống. Vật liệu ban đầu là một tấm bạc đƣợc đặt trong một dung dịch có chứa chất hoạt động bề mặt. Nhờ xung động của một chùm tia laser, các hạt nano bạc có kích thƣớc khoảng 10nm đƣợc hình thành và đƣợc bao phủ bởi chất hoạt động bề mặt. [38].

- Phƣơng pháp khử hóa học: đây là phƣơng pháp chế tạo từ dƣới lên, sử dụng các tác nhân hóa học để khử ion bạc thành bạc kim loại. Các tác nhân hóa học thƣờng ở dạng dung dịch lỏng nên còn gọi là phƣơng pháp hóa ƣớt.

Nguồn cung cấp ion bạc thƣờng là dung dịch muối của bạc, nhƣ AgNO3. Tác nhân khử thƣờng là sodium borohydride, ethanol, ethylene glycol,…Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp tĩnh diện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng diện tích và đẩy nhau hoặc dùng phƣơng pháp bao bọc bằng chất hoạt động bề mặt. Các hạt nano bạc tạo thành bằng phƣơng pháp này có kích thƣớc từ 10nm đến 100nm [39].

- Phƣơng pháp khử hóa lý: đây là phƣơng pháp trung gian giữa hóa học và vật lý, cũng là phƣơng pháp chế tạo từ dƣới lên. Nguyên lý là dùng phƣơng pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano bạc. Phƣơng pháp điện phân thông thƣờng chỉ có thể tạo đƣợc màng mỏng kim loại. Trƣớc khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử bạc sau khi đƣợc điện hóa sẽ tạo các hạt nano bạc bám lên điện cực âm. Lúc này ngƣời ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano bạc sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch [40].

- Phƣơng pháp sinh học (tổng hợp xanh): đây là phƣơng pháp chế tạo từ dƣới lên, chủ yếu liên quan đến quá trình oxy hóa khử. Muối bạc sẽ đƣợc khử thành các hạt nano bạc bởi các tác nhân khử có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, men hay dịch chiết thực vật, có thể sử dụng thêm chất ổn định không độc hại. Hình dạng, kích cỡ và sự phân bố của hạt nano bạc phụ thuộc vào độ mạnh yếu của chất nền hữu cơ để khử muối bạc. Phƣơng pháp này đem lại hiệu quả tốt và rất thân thiện với môi trƣờng [41].

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ LỰA CHỌN

PHƢƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI

Trong nhiều thập kỷ qua, nano bạc luôn thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới, xuất phát từ những tính chất độc đáo cũng nhƣ phạm vi ứng dụng rộng lớn của vật liệu này. Đặc biệt, nhờ vào hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả, nano bạc đƣợc xem là giải pháp tiềm năng cho nhiều vấn đề về nhiễm khuẩn sinh học, bao gồm cả vi khuẩn kháng kháng sinh [42]. Vì vậy, rất nhiều phƣơng pháp tổng hợp từ vật lý đến hóa học đã đƣợc đề xuất để điều chế nano bạc. Một trong những phƣơng pháp truyền thống phổ biến đƣợc

nhiều nghiên cứu đề cập là sử dụng các tác nhân khử hóa học nhƣ hydrazine [43], sodium borohydride [44], axit ascorbic [45]…nhằm chuyển hóa ion bạc thành bạc kim loại. Tuy nhiên phƣơng pháp này vẫn có những hạn chế lớn, trong đó kể đến là độc tính từ các tác chất sử dụng cũng nhƣ khó khăn trong việc loại bỏ các tác chất trên [46]. Các hạt nano bạc đã thu hút đƣợc sự chú ý đặc biệt vì tính chất vật lý, hóa học và sinh học phổ biến của chúng. Các phƣơng pháp vật lý và hóa học khác nhau đã đƣợc sử dụng để tổng hợp và sản xuất nano bạc. Đối với phƣơng pháp khử hóa học, các chất khử hóa học nhƣ natri borohydride, trisodium citrate, natri hydroxit, N,N-dimethyl formamide, 2-mercaptobenzimidazole, sodium dodecyl sulfate, v.v., đã đƣợc sử dụng để sản xuất và ổn định các hạt nano. Một số phƣơng pháp vật lý nhƣ tia gamma và chiếu xạ mặt trời, lắng đọng hóa học sono, phƣơng pháp điện hóa, tia UV và hỗ trợ vi sóng cũng đƣợc sử dụng để tổng hợp các hạt nano. Tuy nhiên, những chất khử và quá trình vật lý này khá tốn kém và nguy hiểm. Do đó, những nghiên cứu đang hƣớng đến chế tạo và tổng hợp các hạt nano bạc bằng cách sử dụng các quy trình hoặc tài nguyên sinh học thân thiện với môi trƣờng, tƣơng thích sinh học và an toàn.

ra nhƣ protein, amino axit, enzyme, polysaccharide,

Trong số các phƣơng pháp hóa học xanh, phƣơng pháp điều chế nano bạc từ phản ứng giữa tiền chất bạc với các vi chất hữu cơ hoặc chiết xuất từ thực vật đang ngày càng cho thấy nhiều tiềm năng và ƣu thế do đây là những tác chất có giá thành thấp, hoạt tính cao, quy trình sử dụng đơn giản và thân thiện với môi trƣờng. Nhờ sở hữu các thành phần có khả năng khử sinh học nhƣ peptide, axit sorbis, axit citric, euphol, polyhydroxy limonoid, axit ascorbic, axit retinoic, tannins và axit ellagic, các nhà khoa học tin rằng có thể sử dụng tảo, nấm và nhiều loại thực vật để điều chế nano kim loại trong đó có nano bạc mà không cần bổ sung tác nhân khử [47]. Ngoài ra, thành phần của thực vật thƣờng hay chứa các hoạt chất giúp làm bền hóa nano bạc mới đƣợc tannin, sinh saponin…[48].

Các vật liệu sinh học nhƣ vi khuẩn, nấm, nấm men, xạ khuẩn, chiết xuất thực vật và một số phân tử sinh học đã đƣợc nghiên cứu là an toàn trong

việc tổng hợp các hạt nano ở cấp độ ngoại bào và nội bào. Gần đây, mối quan tâm trong việc tổng hợp nano bạc bằng phƣơng pháp sinh học ngày càng tăng, tổng hợp nano bạc với tính kháng khuẩn mạnh và các thuộc tính mới mà trong đó có sử dụng các polysaccharide nhƣ chitosan, tinh bột, agar, dextran, casein thủy phân…

Năm 2013, hai nhà khoa học của Đại học Hàn Quốc là Paulraj Kanmani và Seung Taik Lim đã nghiên cứu tổng hợp đƣợc các hạt nano bạc (AgNPs) có cấu trúc hình que và hình lục giác, trong đó các hạt hình cầu và hình lục giác có đƣờng kính trung bình là 24 – 40nm và có sự hiện diện của các phân tử pullulan. Các AgNPs đã hấp thụ bức xạ ở vùng có thể nhìn thấy 400 – 450nm. Nghiên cứu cũng cho thấy nồng độ pullulan đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành và ổn định của AgNPs. Các yếu tố khác nhƣ nhiệt độ, pH, tính chất điện môi, kích thƣớc và hình dạng của các hạt quyết định độ hấp thụ và vị trí của các dải hấp thụ. Đỉnh hấp thụ cực đại đƣợc quan sát ở nồng độ AgNO3 12mM. Các AgNPs đƣợc khử bởi pullulan ổn định đến 3 tháng ở nhiệt độ phòng. Các hoạt động kháng khuẩn của chúng đƣợc phân tích bằng cách sử dụng khuếch tán giếng thạch, kết quả cho thấy vi khuẩn và nấm bệnh nhƣ Aspergillus spp. Và Penicillum spp. đều bị ức chế phụ thuộc vào liều lƣợng. Kết quả này cho thấy rằng AgNPs sử dụng pullulan làm chất khử có thể đƣợc sử dụng làm chất kháng khuẩn mạnh cho các ứng dụng y sinh khác nhau [49].

Một nghiên cứu khác vào năm 2016 của V.Ganduri và các cộng sự thuộc các trƣờng đại học và các trung tâm nghiên cứu của Ấn Độ cũng đã cho thấy các kết quả trong việc tổng hợp AgNPs sử dụng pullulan. Họ tiến hành phƣơng pháp trong các điều kiện thí nghiệm khác nhau nhƣ nồng độ pullulan, nồng độ AgNO3 sử dụng, thời gian phản ứng và pH. Các Pu-AgNP tổng hợp lần đầu tiên đƣợc sàng lọc và xác định bằng phản ứng plasmon bề mặt nhờ vào quang phổ UV-Vis. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cộng hƣởng plasmon bề mặt các đỉnh đƣợc quan sát trong khoảng bƣớc sóng 410 – 460nm. Hình thái của các AgNPs đƣợc tổng hợp có sự biến đổi về hình dạng hình cầu và nhiều phiến với kích thƣớc trung bình là 10 – 55nm. Hơn nữa, AgNPs tổng

hợp đƣợc đã thể hiện việc ức chế chống lại bốn mầm bệnh vi khuẩn là E. coli, S. aureus, B. subtilis và S. marescennes [50].

Tới năm 2018, KunZhang và các cộng sự thuộc trƣờng Đại học nông nghiệp Shandong, Trung Quốc cũng tiến hành tổng hợp AgNPs có sử dụng pullulan trong điều kiện khuấy trộn mạnh có gia nhiệt và điều kiện chiếu xạ vi sóng. Kết quả đạt đƣợc là các hạt nano đƣợc tổng hợp có kích thƣớc trong khoảng từ 10 – 50nm, hấp thụ phổ ở bƣớc sóng 400 – 450nm. Các AgNPs dạng keo có thể tồn tại ở dạng phân tán trong nƣớc rất ổn định và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả chống lại E. coli và S. aureus [51].

Một nhóm các nhà khoa học thuộc trƣờng Đại học Sultan Qaboos cũng đã tiến hành một nghiên cứu tƣơng tự trong năm 2019. Pullulan sử dụng trong nghiên cứu lần đầu tiên đƣợc phân lập từ nấm Aureobasidium mangrovei. Các ảnh chụp từ phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy hầu hết các hạt đƣợc tổng hợp có dạng phân tán, hình dạng không đều và hầu hết là hình cầu với kích thƣớc trung bình là 9,76nm. Độ hấp thụ của các dung dịch AgNPs cũng nằm trong dải 400 – 450nm. Các AgNPs đƣợc phát hiện có hoạt tính kháng nấm đối với Curvularia lunata, Fusarium dubnatum, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus và Penicillium sp. Thử nghiệm ANOVA cũng cho thấy có sự khác biệt đáng kể về hoạt tính kháng nấm giữa các hạt AgNPs sử dụng chất khử là pullulan có hoạt tính ức chế cao hơn pullulan. Do vậy pullulan và các hạt nano tổng hợp sử dụng pullulan làm chất khử có thể đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và an toàn hơn AgNO3 [52].

Tại Việt Nam, có một số nghiên cứu về chế tạo, thử hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc sử dụng chitosan làm chất khử/chất ổn định [53] và nghiên cứu chế tạo chế phẩm oligochitosan-bạc nano ứng dụng làm phân bón kháng bệnh héo vàng do nấm Fusarium oxyporum gây ra trên cà chua [54]. Tuy nhiên hiện chƣa có nghiên cứu về việc sử dụng pullulan nhƣ một chất khử và chất ổn định để tổng hợp và sản xuất các hạt nano kim loại nói chúng và nano bạc nói riêng.

CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1. Nguyên liệu sử dụng

Sinh khối pullulan thu đƣợc từ quá trình lên men và nuôi cấy chủng nấm Aureobasidium pullulans, Pullulan thƣơng mại, H2O2, các dung môi hữu cơ, Bạc nitrat (AgNO3), các chủng vi khuẩn Gram âm nhƣ Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923), vi khuẩn Gram dƣơng nhƣ Bacillus subtillis (ATCC 11774), Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC 11632), nấm sợi nhƣ Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42), nấm men nhƣ Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae (SH20).

2.1.2. Hóa chất

- Các dung môi hữu cơ: ethanol, methanol, isopropanol, …..

- H2O2

- AgNO3

- H2SO4

- NaOH

- Glucose

2.1.3. Trang thiết bị sử dụng

- Các loại cân điện tử

- Máy khuấy từ

- Máy voltex

- Máy siêu âm

- Máy đo phổ FI-IR Impact 410 (Mỹ)

- Máy li tâm

- Máy đo quang Shizmadu

- Phiến vi lƣợng 96 giếng

- Micropipet và pipet các loại

- Ống nghiệm, cốc đong, bình tam giác,….

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng pháp tinh sạch pullulan

Tinh sạch pullulan bao gồm loại bỏ các xác vi sinh vật, tế bào, các protein ngoại bào và sắc tố sinh ra khi lên men và loại đƣờng tan nhờ tủa với dung môi, loại dung môi tủa. Các bƣớc bao gồm:

- Lọc thô và lọc tinh lần một bằng màng lọc 0,3 - 0,45µm: bơm dịch vào cột lọc thô sau đó qua cột lọc tinh để loại hết các phần không tan trong nƣớc và các xác vi sinh vật. Dịch bơm vào thiết bị phản ứng hóa sinh để nâng nhiệt và thực hiện khử trùng lọc lần 2.

- Khử trùng và thực hiện lọc lần hai thu sản phẩm dạng dịch: sử dụng màng siêu lọc polycarbon kích thƣớc < 0,1µm để làm trong, cô đặc dịch lên men, tách một phần nƣớc, các chất phân tử lƣợng thấp, đƣờng dƣ, muối hòa tan.

- Đun nóng dịch lên men trong 10 phút để bất hoạt các enzym có khả năng làm suy thoái polyme. Làm lạnh tới nhiệt độ phòng, bổ sung vào 100ml pronase E (EC 3.4.24.31) 5% và ủ hỗn hợp trong 1 giờ ở 37oC. Sau khi protein hóa, thêm 250ml axit tricloaxetic 80% vào và trộn đều mẫu, làm lạnh ở 4oC trong 30 phút, ly tâm 8000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ các tế bào và protein.

- Quá trình tủa EPS pullulan và thu sản phẩm: Dịch lên men sau khi đƣợc làm sạch tế bào vi sinh vật, các protein ngoại bào, khử màu, loại bỏ tạp chất bắt đầu quá trình tủa với ethanol để thực hiện tinh sạch sâu loại bỏ đƣờng dƣ. Bổ sung ethanol 95% tỷ lệ 2 lần so với dịch ở 25oC. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 4oC trong vòng 12 giờ để kết thủa sản phẩm thô, sau đó ly tâm 3300

vòng/phút trong 30 phút. Tách dịch – thu tủa lọc chân không sử dụng màng 0,45µm.

- Tủa thu hồi pullulan: Pullulan tan tốt trong nƣớc do đó để hỗ trợ kết tủa thu hồi pullulan có muối vô cơ thƣờng đƣợc thêm vào dịch lên men sau khi đã loại xác tế bào, ví dụ nhƣ muối canxi clorua. Dung môi thu hồi pullulan có thể sử dụng ethanol hoặc isopropyl alcohol, có hoặc không bổ sung thêm các muối vô cơ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp thu hồi pullulan bằng IPA (isopropyl alcohol) bổ sung 0,1% CaCl2. IPA cho hiệu suất thu hồi pullulan tối đa ở thế tích IPA : dịch lên men là 2,5:1, trong khi hiệu suất tƣơng tự đạt đƣợc khi sử dụng ethanol ở thể tích 6:1 thể tích dịch lên men. Bổ sung CaCl2 ở nồng độ 0,1% cho hiệu suất thu pullulan tối đa ở tỷ lệ IPA : dịch lên men là 1,5:1, thay vì 2:1 khi sử dụng NH4Cl.

2.2.2. Phƣơng pháp tẩy màu sản phẩm của quá trình lên men

Có rất nhiều phƣơng pháp để tẩy trắng nhƣ dùng Cl2, ClO2, H2O2, than hoạt tính… Nhƣng Cl2, ClO2 là những hóa chất độc hại không đƣợc dùng trong thực phẩm và dƣợc phẩm, pullulan bị hấp thụ bởi than hoạt tính nên sử dụng H2O2 là tối ƣu nhất. Trong điều kiện tẩy do H2O2 thoát ra oxi nguyên tử (oxi sơ sinh) có khả năng oxi hóa rất mạnh, có tác dụng phá hủy màu của những tạp chất còn lại trên sản phẩm làm cho sản phẩm trắng hơn. Phản ứng thoát ra oxi nguyên tử đƣợc giải thích do trong môi trƣờng kiềm, H2O2 bị phân giải theo phản ứng dây chuỗi liên tiếp:

(1) H2O2 H+ + HO2

Do H+ bị ion OH- của kiềm thu hút nên phản ứng phân ly (1) tiếp tục

chuyển về phía tay phải, và sau đó:

- + H2O2 HO2 H2O2 + OH-

(3) H2O + OH- + 2O (2) H2O- + H2O

Cứ nhƣ vậy phản ứng liên tục xảy ra và oxi nguyên tử thoát ra có tác

dụng tẩy trắng.

H2O2 thƣờng tồn tại ở 2 dạng:

Trong môi trƣờng kiềm, nó ở dạng 2 nhiều hơn, dạng này kém bền

vững hơn dạng (1) và dễ thoát ra oxi nguyên tử.

H2O2 là hóa chất có tính oxi hóa mạnh, có khả năng tẩy trắng, khử trùng và thân thiện với môi trƣờng. Đƣợc sử dụng tẩy trắng trong ngành dệt, tẩy trắng giấy, quá trình chế biến thực phẩm, khoáng chất, hóa dầu và hàng tiêu dùng. Trong môi trƣờng kiềm H2O2 dễ dàng bị phân hủy tạo oxi nguyên tử và nƣớc. Đây là đặc điểm lý giải cho khả năng tẩy trắng của nó. H2O2 tẩy trắng tốt trong môi trƣờng pH từ 11 đến 13 và nhiệt độ tẩy trắng từ 80-90oC.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tẩy trắng

Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp để tẩy trắng là từ 80-90oC.

Độ pH: H2O2 tẩy trắng tốt trong môi trƣờng kiềm. Độ pH để quá trình

tẩy trắng đƣợc tối ƣu là từ 11-13.

Nồng độ của H2O2: Nồng độ của H2O2 càng lớn thì khả năng tẩy trắng

càng cao.

Để xác định hiệu quả tẩy trắng, ta tiến hành đo độ hấp thụ quang và

tuân theo định luật Beer.

Định luật Beer: A=.l.C

Trong đó: A: độ hấp thụ quang.

hệ số hấp thu phân tử.

l: độ dày truyền ánh sáng (cm).

C: nồng độ của dung dịch (mol/L).

Hình 2.1: Giới hạn của định luật Beer về sự hấp thụ quang

Cách tiến hành: Mẫu sau khi đƣợc loại bỏ protein ở dạng rắn, độ ẩm

cao, có màu tối, đƣợc đem hòa cùng với nƣớc cất. Sau đó đem ly tâm ở tốc độ

5000 vòng/phút trong vòng 15 phút loại bỏ cặn rắn, thu lấy dung dịch nổi ở

phía trên. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH và nồng độ H2O2. Chuẩn bị

các bình tam giác khác nhau. Cho vào mỗi bình 10ml mẫu vừa chuẩn bị ở

trên. Tiến hành nhƣ sau:

- Mẫu 1: Cho vào bình đã chứa mẫu 1ml H2O2 và tiến hành khuấy từ

với tốc độ 900 vòng/phút trong vòng 15 phút.

- Mẫu 2: Đun nóng bình đã chứa mẫu đến các nhiệt độ khác nhau từ 30-

90oC. Sau đó thêm vào 1ml H2O2 và tiến hành khuấy từ giống nhƣ mẫu 1.

- Mẫu 3: Đun nóng bình đã chứa mẫu đến nhiệt độ 80-90oC. Thêm vào

mẫu dung dịch NaOH để nâng pH của dung dịch lên các mức pH trong

khoảng từ 7-13. Sau đó thêm vào 1ml H2O2 và tiến hành khuấy từ giống nhƣ

mẫu 1.

- Mẫu 4: Đun nóng bình đã chứa mẫu đến nhiệt độ 80-90oC. Thêm vào

mẫu dung dịch NaOH để nâng pH của dung dịch lên các mức pH = 12. Thêm

vào 1ml H2O2 với các nồng độ khác nhau từ 9-13% và tiến hành khuấy từ

giống nhƣ mẫu 1.

Sau khi kết thúc quá trình khuấy, tiến hành định mức mẫu lên 25ml và đem so màu bằng máy quang phổ UV-Vis ở bƣớc sóng 320nm. Ghi lại các giá

trị Abs và lập biểu đồ so sánh. Từ đồ thị rút ra đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình tầy màu sản phẩm.

2.2.3. Phƣơng pháp kết tủa thu hồi sản phẩm

Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của polysaccharide phụ thuộc vào sự tƣơng tác của các nhóm tích điện trong phân tử polysaccharide với các phân tử nƣớc. Sự tƣơng tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch polysaccharide các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính.

Dung môi hữu cơ thƣờng dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn

hợp các loại rƣợu.

Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5oC trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dƣới 0oC và có thể đến -20oC, nhƣ vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của

polysaccharide.

Mục đích: Xác định dung môi thích hợp cần sử dụng cho quá trình kết

tủa thu hồi sản phẩm đạt hiệu quả cao nhất.

Nguyên tắc: Với cùng một lƣợng chất ban đầu, khi ta sử dụng các dung

môi khác nhau để kết tủa thì hiệu quả thu hồi sẽ khác nhau.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 3 chiếc cốc. Dùng pipet hút vào mỗi cốc 20 ml dung dịch

mẫu.

- Cốc 1: Cho từ từ ethanol vào và quan sát quá trình tủa. Nếu thấy quá

trình tủa diễn ra rất chậm thì tiến hành làm lạnh cốc thứ 2 và tủa lại bằng

ethanol.

- Cốc 2: Tiến hành làm lạnh sâu xuống nhiệt độ dƣới 4oC và tiến hành

tủa bằng ethanol. Cho từ từ ethanol vào và quan sát tốc độ của quá trình

tủa.Cho ethanol cho tới khi không thấy có xuất hiện kết tủa thêm nữa thì dừng

và ghi thể tích của ethanol tiêu tốn. Đem li tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 15

phút để thu lấy phần kết tủa rắn màu trắng sáng.

- Cốc 3: cho từ từ lƣợng isopropan vào dung dịch và quan sát tốc độ

của quá trình tủa. Cho isopropan cho tới khi nào thấy dung dịch không còn

xuất hiện thêm tủa nữa thì dừng lại và tiến hành ghi thể tích của isopropan đã

dùng để tủa. Đem li tâm với tốc độ 5000 rpm trong thời gian 15 phút để thu

lấy kết tủa màu trắng sáng.

Tiến hành so sánh hiệu quả quá trình tủa khi sử dụng 2 loại dung môi trên và rút ra kết luận lựa chọn dung môi nào là thích hợp nhất cho quá trình tủa thu hồi sản phẩm. Đem sản phẩm rắn thu hồi đƣợc tủa lại 2 lần bằng isopropanol. Rửa tủa bằng dung môi không hoà tan, sấy nhẹ ở 600C.

2.2.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng sót bằng DNS

Dịch lên men đƣợc ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ sinh khối. Sau đó, dịch trong đƣợc đem đi xác định lƣợng đƣờng sót còn dƣ.

- Nguyên tắc: Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu thí nghiệm.

- Chuẩn bị hóa chất:

+) Pha dịch đƣờng glucose chuẩn 1%: cân 0,5g glucose tinh khiết bằng cân phân tích cho bào bình định mức 50ml, cho nƣớc dần tới vạch định mức rồi lắc cho tan hết đƣờng.

+) Pha DNS: Cân 0,5g axit 3,5-dinitro salicylic và 150g muối tarat kép hòa tan trong 50ml NaOH 2N. Hòa tan hoàn toàn rồi cho vào bình định mức 500ml, thêm nƣớc cất tới vạch định mức. Đựng trong lọ thủy tinh màu sẫm, để từ 1 đến 2 ngày, nếu thấy xuất hiện lắng cặn thì đem đi lọc cặn.

- Cách tiến hành:

+) Dựng đồ thị đƣờng chuẩn glucose: pha loãng dung dịch glucose 1%

nhƣ sau:

Bảng 2.1: Tỷ lệ pha loãng đƣờng glucose

STT

1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ C% 0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,15 0,2 Thể tích dung dịch gốc Glucose 1% (ml) 0 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 Thể tích nƣớc (ml) 10 9,75 9,5 9,25 9 8,5 8

+) Tiến hành phản ứng với DNS trong ống nghiệm có nút xoáy theo các

bƣớc sau:

1ml dịch đƣờng + 3ml DNS

Lắc đều

Đun sôi 5 phút

Làm nguội

Đo OD ở λ = 570nm

Ghi kết quả

+) Vẽ đồ thị đƣờng chuẩn glucose: trục tung là OD (570nm) và trục

hoành là nồng độ đƣờng C (g/l).

+) Cách tính toán: Lƣợng đƣờng khử trong mẫu đƣợc tính theo đƣờng

glucose nhƣ sau: X = a × n × V

Trong đó: X: lƣợng đƣờng trong dung dịch cần xác định, g

a: lƣợng đƣờng khử trong mẫu đo (%)

n: hệ số pha loãng dịch

V: thể tích dịch đo, ml

2.2.5. Phƣơng pháp xác định và kiểm tra chất lƣợng pullulan

2.2.5.1. Xác định pullulan theo phương pháp enzyme đặc hiệu

pullulanase

Pullulan là một polysaccharide phân tử lƣợng cao khó có thể xác định trực tiếp đƣợc. Vì vậy để xác định pullulan ta phải thủy phân pullulan để tạo các đơn vị nhỏ là maltotriose và đƣợc xác định định tính trên sắc ký bản mỏng.

- Chuẩn bị mẫu: Để xác định thử xem dịch sau lên men có chứa pullulan hay không lấy khoảng 10ml dịch lên men và bổ sung 0,04ml enzym pullulanaza rồi thủy phân trong 20 giờ sau đó tiến hành chạy sắc ký bản mỏng.

+) Chọn hệ chạy: Etyl axetat: 30ml; Axit axetic: 10ml; H2O: 10ml

+) Hệ màu: Analin: 1g; Axeton: 100ml

- Cách tiến hành:

+) Dùng thƣớc và bút chì kẻ một vạch một đƣờng ngang trên mặt bản sắc ký, cách mép dƣới 1cm, trên đƣờng này chấm những chấm bằng bút chì, mỗi chấm cách nhau 1cm.

+) Dùng micropipet nhỏ chính xác 0,01ml dung dịch chuẩn (dung dịch maltotriose 1%) vào chỗ chấm trên bản sắc ký (tiến hành ít nhất 2 chấm) và có thể dùng bóng điện hoặc máy sấy để sấy ở dƣới tấm giấy.

+) Chạy sắc ký: Bản sắc ký đã chấm mẫu cho vào bình đựng dung môi cách điểm chấm khoảng 1-2cm, đợi dung môi chạy hết bản, lấy ra và để khô ở nhiệt độ phòng.

+) Phun dung dịch hiện màu tỏa đều khắp mặt bản sắc ký (phun dạng sƣơng mù) để yên trong 5 phút, sau đó đƣa giấy vào tủ sấy ở 105oC trong 10 phút và theo dõi sự hiện màu. Nếu dung dịch mẫu cũng thấy xuất hiện băng vạch giống dung dịch chuẩn chứng tỏ trong dung dịch mẫu sau thủy phân có maltotriose, do đó có thể khẳng định dung dịch trƣớc khi thủy phân có chứa pullulan.

2.2.5.2. Định lượng pullulan theo phương pháp phenol sulfuric axit

- Cách tiến hành:

+) Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha dung dịch pullulan gốc có nồng độ 0,1g/l,

dung dịch phenol 5%.

+) Dựng đồ thị đƣờng chuẩn: Cân 0,0129g pullulan thƣơng mại. Hòa tan mẫu trong 129ml nƣớc cất để tạo thành dung dịch có nồng độ 0,1 g/l. Sau khi quá trình hòa tan kết thúc, tiến hành pha mẫu thành các nồng độ từ 0,01 đến 0,07 g/l theo bảng sau:

Bảng 2.2: Pha dung dịch Pullulan ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 (g/l)

Pu (0,1g/l) 10 10 10 10 10 10 10 (ml)

Nƣớc cất 90 40 23,3 15 10 6,67 4,29 (ml)

- Tiến hành phân tích mẫu theo các bƣớc sau:

+) Lấy 1ml mỗi dung dịch đã pha loãng thêm vào 1ml phenol 5%, trộn

đều.

+) Thêm 5ml H2SO4 đặc.

+) Để yên trong 10 phút, đun cách thủy 2 phút ở 100oC, để nguội trong

30 phút.

+) Đƣa mẫu vào máy đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 490nm.

Hình 2.2: Đƣờng chuẩn của pullulan

Nồng độ của dung dịch mẫu thu đƣợc do tinh sạch (C g/l) sẽ đƣợc tính

bằng cách thay Abs đo đƣợc của nó vào phƣơng trình đƣờng chuẩn để tìm x.

Khối lƣợng của pullulan có trong mẫu tinh sạch đƣợc tính bằng công

thức: m = C × V (g)

Trong đó : V là thể tích của dung dịch (l).

Hàm lƣợng pullulan có trong mẫu đƣợc tính nhƣ sau:

% Pu = (m÷M) ×100

Trong đó : m là khối lƣợng pullulan có trong mẫu (g).

M là khối lƣợng cân của mẫu(g).

2.2.5.3. Xác định độ nhớt bằng nhớt kế

Sấy khô mẫu trong 6 giờ ở 90oC dƣới áp suất giảm (50mmHg). Cân 10g mẫu và hòa tan trong nƣớc để đƣợc 100g dung dịch. Dùng thiết bị đo độ nhớt Ubbelohde-type (falling-ball). Cách nạp mẫu vào nhớt kế tùy theo thiết kế của thiết bị. Nhúng nhớt kế thẳng đứng trong bể điều nhiệt ở 30oC ± 0,1oC

và để yên trong 20 phút để mẫu cân bằng với nhiệt độ của bể. Điều chỉnh mặt lõm của cột chất lỏng trong ống mao quản đến vị trí bên trên vạch thứ nhất khoảng 5mm. Để cho mẫu chảy tự do, đo thời gian, tính bằng giây, để mặt lõm chất lỏng từ vạch thứ nhất đến vạch thứ 2. Tiến hành lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình và tính độ nhớt theo công thức: V (mm2/s) = C. t

Trong đó:

C: Hằng số hiệu chỉnh của nhớt kế (mm2/s), C = 0,1219 mm2/s2

t: thời gian chảy (s)

Hình 2.3: Hệ đo độ nhớt bằng nhớt kế

2.2.5.4. Định lượng đường Mono-, di-, và oligosaccharide theo phương

pháp anthrone-sulfuric axit

- Nguyên tắc: Các mono-, di- và oligosaccharide của Pullulan đƣợc định lƣợng bằng cách sử dụng phƣơng pháp anthrone-sulfuric axit sau khi đã kết tinh lại pullulan bằng dung môi.

- Cách tiến hành:

+) Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác 0,2g Glucose hòa tan trong 1 lít

H2O

+) Định lượng mono-, di-, và oligosaccharide: Cân chính xác 0,8g mẫu và hòa tan trong 100ml H2O để đƣợc dung dịch gốc. Cho 1ml dung dịch gốc vào một ống ly tâm. Thêm 0,1ml dung dịch KCl bão hòa, 3ml metanol vào ống và khuấy trộn mạnh trong 20 giây. Ly tâm 10 phút ở tốc độ 11000 vòng/phút. Các kết tủa polysaccharide lắng xuống đáy ống ly tâm, còn phần dung dịch phía trên sẽ gồm các phần tử saccharide nhỏ hơn (mono-, di- và oligosaccharide). Lấy 0,2ml dịch này cho vào 5ml dung dịch anthrone biến tính (0,2g anthrone trong 100g dung dịch axit H2SO4 75%). Tƣơng tự thay mẫu phân tích bằng 0,2ml dung dịch mẫu chuẩn glucose và 0,2ml nƣớc (mẫu trắng để đối chiếu) vào 5ml dung dịch anthrone đã biến tính. Lắc nhanh. Đặt các mẫu trên trong bể điều nhiệt ở 90oC và ủ trong 15 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch cần kiểm tra ở λ = 620nm. Tính % mono-, di- và oligosaccharide theo công thức sau:

C% =

Trong đó:

At: Độ hấp thụ của dung dịch thử (dung dịch cần kiểm tra)

Ab: Độ hấp thụ của mẫu nƣớc trắng

As: Độ hấp thụ của dung dịch glucose chuẩn

G: Khối lƣợng Glucose (g)

W: Khối lƣợng mẫu (g)

2.2.5.5. Xác định khối lượng pullulan bằng phương pháp sấy

Pullulan sau khi đƣợc tinh sạch, kết tủa lại và rửa lại bằng cồn sau đó

sấy khô ở 60oC đến khối lƣợng không đổi.

Tính % Pullulan trong mẫu chất đã sấy khô, là chênh lệch giữa 100% và tổng % tạp chất đã biết (mono-, di- và oligosaccharide và nƣớc) theo công thức: P (%) = 100 – (L + C)

Trong đó: L: % khối lƣợng giảm khi sấy khô (% khối lƣợng nƣớc)

C: % khối lƣợng mono-, di- và oligosaccharide

2.2.6. Phƣơng pháp tạo nano bạc Pu-AgNPs

- Nguyên tắc: Sử dụng pullulan nhƣ một tác nhân khử trực tiếp bạc nitrat kết hợp với khuấy trộn mạnh có gia nhiệt và xử lý siêu âm. Hỗn hợp phản ứng không màu trong suốt có chứa AgNO3 và pullulan đƣợc chuyển sang màu từ vàng nhạt đến nâu vàng đặc trƣng (tùy thuộc vào nồng độ), điều này sẽ khẳng định sự hình thành của các hạt nano bạc. Khảo sát các ảnh hƣởng của nồng độ Pullulan, nồng độ AgNO3, thời gian tới quá trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs.

- Chuẩn bị các dung dịch:

+) Dung dịch AgNO3: Chuẩn bị các dung dịch AgNO3 với các nồng độ

lần lƣợt là 1 mmol/l, 3 mmol/l, 5 mmol/l, 7 mmol/l, 9 mmol/l, 12 mmol/l.

+) Dung dịch Pullulan: Chuẩn bị các dung dịch Pullulan với các nồng

độ lần lƣợt là 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 1%, 5%.

Cách tiến hành: Pullulan sau khi đƣợc hòa tan, đƣợc điều chỉnh pH hoạt động lên khoảng 7-9, sau đó đƣợc đặt lên máy khuấy từ, khuẩy ở 1200 vòng/phút, nâng nhiệt độ lên khoảng 70-80oC, sau đó nhỏ từ từ dung dịch AgNO3 vào, hỗn hợp phản ứng chuyển từ màu vàng sang nâu vàng đặc trƣng, tiếp tục nhỏ cho đến khi hết AgNO3, tỷ lệ thể tích của AgNO3 : pullulan là 1:1. Dung dịch tiếp tục đƣợc khuấy từ trong khoảng thời gian từ 15-45 phút.

Hình 2.4:Mô tả thí nghiệm

2.2.7. Phƣơng pháp xác định sản phẩm

2.2.7.1. Phương pháp xác định cấu trúc đặc trưng của sản phẩm bằng

phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR

Phổ hồng ngoại là phép phân tích đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc và nhận dạng các hợp chất hóa học. Phƣơng pháp này hoạt động dựa trên sự tƣơng tác của các bức xạ điện từ trong miền hồng ngoại (400-4000 cm-1) khi chiếu một chùm tia hồng ngoại vào các mẫu hoặc phân tử nghiên cứu. Mỗi nhóm chức sẽ hấp phụ tần số hồng ngoại đặc trƣng. Dựa vào tần số đặc trƣng, cƣờng độ đỉnh trong phổ hồng ngoại, ngƣời ta có thể phán đoán trực tiếp về sự có mặt của các nhóm chức, các liên kết xác định trong phân tử nghiên cứu, từ đó xác định đƣợc cấu trúc của chất nghiên cứu. Mẫu của đề tài đƣợc đo phổ hồng ngoại trên máy Impact 401 Nicolet FI-IR của Viện Hóa học trong đó KBr ở dài tần số 4000-1000cm-1.

2.2.7.2. Phương pháp xác định kích thước hạt nano bạc Pu-AgNPs

bằng phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM)

Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM) đƣợc sử dụng để xác định hình thái bề mặt và kích thƣớc hạt của các vật liệu đã chế tạo. Kính hiển vi điện tử quét SEM quét bề mặt mẫu bằng một chùm tia điện tử hội tụ cao trong chân không, thu thập thông tin (tín hiệu) từ mẫu phát ra, tái tạo thành một hình ảnh lớn hơn cấu trúc bề mặt của mẫu thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu. Mẫu của đề tài đƣợc đo tại Viện Khoa học vật liệu.

2.2.8. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật

Hoạt tính kháng vi sinh vật đƣợc tiến hành để đánh giá hoạt tính của các mẫu dung dịch nano bạc Pu-AgNPs tạo thành, đƣợc thực hiện trên phiến vi lƣợng 96 giếng theo phƣơng pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và McKane & Kandel (1996). Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của sản phẩm đƣợc kiểm tra thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ ức chế 50%) và MIC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).

Thử nghiệm với các chủng vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis (ATCC 6633), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), nấm sợi (mốc): Aspergillus niger (ATCC 9763), Fusarium oxysporum (ATCC 48112), nấm men: Saccharomyces cerevisiae (ATCC 16404), Candida albicans (ATCC 10231).

Chứng chuẩn (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) đƣợc cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng và lƣu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên).

Môi trƣờng: Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc. Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho vi khuẩn.

Kháng sinh chuẩn:

- Gentamycin cho vi khuẩn Gr(-), Doxycyclin cho vi khuẩn Gr(+) và Nystatin cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh đƣợc cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Tp.HCM.

- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc bằng nƣớc cất vô trùng. Từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ cần dùng: Gentamycon (16 – 8 - 4 IU/mg), Doxycyclin (0,4 – 0,2 – 0,1 IU/mg) và Nystatin ( 12 – 6 – 3 IU/mg).

Cách tiến hành:

- Pha loãng mẫu thử trong DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ). Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để đƣợc dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/ml (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ) với mẫu thô và 50-25-12,5-6,25 µg/ml với mẫu chất tinh sạch. Để trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC/48h đối với nấm.

- Mẫu đối chứng: sử dụng NaCl 0,9% tƣơng ứng với thể tích mẫu là

mẫu chứng âm tính (-) và chứng dƣơng tính (+) là các kháng sinh chuẩn.

- Mẫu đƣợc xác định có hoạt tính khi không có sự phát triển của vi sinh

vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng (-) (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU < 5). Mẫu biểu hiện hoạt tính đƣợc test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế.

- Mẫu đƣợc xác định có hoạt tính khi giá trị MIC ≤ 200µg/ml đối với

mẫu thô và ≤ 50µg/ml đối với mẫu tinh sạch.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TINH SẠCH, THU NHẬN, XÁC ĐỊNH VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG PULLULAN

3.1.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tẩy

màu sản phẩm lên men

Kết thúc quá trình lên men, tiến hành ly tâm dịch để loại bỏ xác tế bào vi sinh vật. Mẫu sau khi đã đƣợc loại bỏ protein ở dạng rắn, độ ẩm cao, có màu tối, đƣợc đem hòa cùng với nƣớc. Sau đó đem ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 15 phút loại bỏ cặn rắn, thu lấy dung dịch nổi ở phía trên.

Hình 3.1: Sản phẩm thu đƣợc sau quá trình lên men

3.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đối với quá trình tẩy màu

Sử dụng H2O2 có nồng độ 10% để tẩy trắng và dung dịch đệm NaOH pH = 13. Các mẫu đƣợc hòa tan bằng nƣớc, sau đó bổ sung H2O2 và tiến hành khuấy bằng máy khuấy từ với tốc độ 900 vòng/phút trong vòng 15 phút. Thay đổi nhiệt độ trong khoảng 80-90oC và pH = 7 - 13. Sau khi kết thúc quá trình tiến hành đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ UV-Vis ở bƣớc sóng 320nm.

Quá trình hòa tan mẫu để đƣợc dung dịch đồng nhất đem tẩy màu thì xác định đƣợc pH của dung dịch là từ 7 đến 9. Khi tiến hành tẩy màu ở nhiệt độ thƣờng và ở pH này thì thấy hiệu quả tẩy màu chƣa cao (quan sát màu sắc bằng mắt thƣờng) do đó tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ và

pH đến quá trình tẩy màu nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu để đạt đƣợc hiệu quả tẩy màu là tối ƣu nhất. Dựa trên các tài liệu tham khảo nghiên cứu về quá trình tẩy màu dịch lên men thu hồi sản phẩm thì lựa chọn nồng độ H2O2 tối ƣu

tạm thời là 10%.

Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đối với quá trình tẩy màu

Từ biểu đồ hình 3.2 ta thấy, khi độ hấp thụ quang của dung dịch giảm có nghĩa là nồng độ của các sắc tố mang màu melanin cũng giảm. Do đó, qua hình 3.2 ta có thể thấy các yếu tố nhiệt độ và pH có ảnh hƣởng rất lớn đối với quá trình tẩy màu. Nếu chỉ đơn thuần sử dụng H2O2 để tẩy màu thì hiệu quả của quá trình tẩy màu là rất nhỏ. H2O2 cho hiệu quả tẩy màu tốt nhất khi nhiệt độ của dung dịch ở 80-90oC và pH của dung dịch từ 11-13. Dựa vào các đặc điểm này mà ta thay đổi điều kiện làm việc của dung dịch pullulan đã cho hiệu quả rất rõ rệt.

Dựa vào kết quả khảo sát, chọn ra điều kiện tối ƣu cho quá trình tẩy màu là: Nhiệt độ của dung dịch cần tẩy màu là 80-90oC, pH 11-13, tại điều kiện này hiệu quả tẩy màu cao hơn so với chỉ sử dụng H2O2 thông thƣờng.

3.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đối với quá trình tẩy màu

Khi tiến hành tẩy màu trong cùng điều kiện nhiệt độ và pH nhƣng nồng độ H2O2 cần sử dụng khác nhau thì hiệu quả tẩy màu đạt đƣợc cũng khác

nhau. Đem mẫu hòa tan cùng với nƣớc sau đó tiến hành ly tâm để loại bỏ cặn và thu lấy dung dịch mẫu. Pha các dung dịch H2O2 có các nồng độ từ 7-12% và NaOH (pH=12).

Nâng nhiệt độ của dung dịch mẫu lên nhiệt độ 80-90oC. Dùng NaOH để nâng pH của dung dịch lên 12. Khảo sát các dung dịch đã bổ sung H2O2 có nồng độ từ 7-12%. Tiến hành khuấy từ với tốc độ 900 vòng/phút trong vòng 15 phút. Đem so màu bằng máy quang phổ UV-Vis ở bƣớc sóng 320nm.

Khi tăng nồng độ của H2O2 thì hiệu quả tẩy màu tăng, nhƣng nồng độ quá lớn gây mất an toàn cho ngƣời sử dụng, tốn hóa chất. Việc khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ H2O2 đến quá trình tẩy màu là rất quan trọng. Kết quả của quá trình nghiên cứu khảo sát đƣợc tổng hợp ở hình 3.3 sau:

Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ H2O2 đối với quá trình tẩy màu

Từ biểu đồ hình 3.3 trên ta nhận thấy khi nồng độ của H2O2 tăng thì hàm lƣợng melanin giảm. Khi nồng độ H2O2 tăng từ 9-12% thì độ hấp thụ cũng giảm từ 0,846 (9%) xuống còn 0,387 (12%), khi nồng độ H2O2 tăng lên 13% thì độ hấp thụ giảm ko đáng kể. Ta thấy hiệu quả tẩy màu bằng H2O2 12% lớn hơn rất nhiều so với các nồng độ khác và không tăng lên khi nồng độ đƣợc tăng lên, do đó chọn nồng độ H2O2 là 12% là tối ƣu nhất cho quá trình tẩy.

3.1.2. Kết quả lựa chọn dung môi thu nhận pullulan

Xác định dung môi thích hợp cần sử dụng cho quá trình kết tủa thu hồi sản phẩm đạt hiệu quả cao nhất. Với cùng một lƣợng chất ban đầu, khi ta sử dụng các dung môi khác nhau để kết tủa thì hiệu quả thu hồi sẽ khác nhau. Mẫu sau khi tiến hành tẩy màu sẽ đƣợc đƣa vào tinh sạch và kết tủa thu hồi sản phẩm dạng rắn. Hóa chất dùng để khảo sát thu hồi kết tủa là ethanol và isopropanol.

Bảng 3.1: So sánh quá trình thu hồi sản phẩm rắn bằng

ethanol và isopropanol

Đặc điểm Thu hồi sản phẩm rắn

Thu hồi sản phẩm rắn bằng ethanol so sánh bằng isopropanol

Thời gian Tủa chậm hơn Tủa nhanh hơn

Thể tích

Sử dụng gấp 2 lần so với tổng thể tích của dung dịch Sử dụng thể tích 1,5 lần so với tổng thể tích của dung dịch

Giá thành

Chi phí cao hơn do dùng thể tích lớn hơn Chi phí thấp hơn do dùng thể tích nhỏ hơn

Nhƣợc điểm Lƣợng muối kết tủa theo sẽ ít hơn.

Lƣợng muối kết tủa theo nhiều hơn. Do isopropanol kém bay hơi hơn ethanol, do vậy mà nhiều muối kém hòa tan hơn trong isopropanol sẽ bị kết tủa theo pullulan.

Làm khô Khô nhanh hơn Khô chậm hơn

Cần tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn rất nhiều Có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng Nhiệt độ làm lạnh

Hình 3.4: Hiệu suất thu nhận pullulan khi sử dụng 2 dung môi khác nhau

Bảng 3.2: Khả năng thu hồi pullulan bởi các dung môi khác nhau

Dung môi và 0,1% CaCl2

Thông số

Ethanol Methanol Isopropanol NH4Cl

1:6 1:6 1:2

Dịch sau lên men (v) 1:2.5 (DLM/DM) (DLM/DM)a (DLM/DM) (DLM/DM)

a DLM/DM, dịch lên men/dung môi; b,c 60-70%; d>95%; e < 60%

Hiệu suất +++b +++c ++++d ++e thu Pullulan (%)

Từ kết quả bảng 3.1, bảng 3.2 và hình 3.4 ta thấy rằng việc lựa chọn dung môi isopropanol là có lợi hơn rất nhiều. Bên cạnh nhƣợc điểm là quá trình sấy khô sản phẩm sẽ lâu hơn, quá trình tủa có thế kéo theo nhiều muối cùng tủa thì việc tủa bằng dung môi này mang lại rất nhiều lợi thế nhƣ thời gian tủa nhanh hơn, nhiệt độ tủa cao hơn, có thể tủa ngay ở nhiệt độ phòng mà không cần làm lạnh, thể tích isopropanol sử dụng để tủa cũng ít hơn do đó cũng sẽ tiết kiệm đƣợc chi phí để tủa hơn và đạt hiệu suất tủa cao hơn.

3.1.3. Kết quả kiểm tra chất lƣợng pullulan

3.1.3.1. Kết quả phân tích định tính

Hình 3.5: Mẫu giấy chạy sắc ký

G1(maltotriose chuẩn); G3 (glucose chuẩn); S: mẫu sau thủy phân

Qua hình 3.5 ta thấy, dung dịch mẫu cũng thấy xuất hiện băng vạch giống dung dịch chuẩn chứng tỏ trong dung dịch mẫu sau thủy phân có maltotrioza, do đó có thể khẳng định dung dịch trƣớc khi thủy phân có chứa pullulan.

3.1.3.2. Kết quả xác định độ nhớt

Kết quả đo độ nhớt của dung dịch pullulan 10% đƣợc trình bày ở bảng 3.3 nhƣ sau:

Bảng 3.3: Kết quả đo độ nhớt của dung dịch pullulan 10%

Lần Thời gian đo (giây)

1 2 3 Thời gian TB 1170.09 1261 1180.45 1203.84667

Vậy thời gian trung bình là: tTB= 1203,84667.

Độ nhớt tính đƣợc là: V= C.tTB = 0,1219. 1203,84667 = 146,75 cP

Ta có, độ nhớt của dung dịch pullulan 10% tiêu chuẩn là 100 – 180 cP. Trong khi đó, độ nhớt của dung dịch pullulan thu nhận đƣợc đo đƣợc là 146,75 cP nằm trong khoảng 100 – 180 cP. Vậy có thể khẳng định sản phẩm thu đƣợc sau lên men là pullulan.

3.1.3.3. Xác định hàm lượng pullulan

Kết quả đo độ hấp thụ của các dung dịch pullulan có nồng độ từ 0,01

đến 0,07 đƣợc tổng hợp ở bảng 3.4 nhƣ sau:

Bảng 3.4: Kết quả đo độ hấp thụ quang của

các dung dịch pullulan ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ pullulan (g/l) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 Độ hấp thụ tại λ = 315nm 0.07 0.141 0.2 0.364 0.331 0.426 0.515

Mẫu dung dịch pullulan sau tinh sạch đƣợc đem so quang cho kết quả Abs là y = 0,591. Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn cho kết quả nồng độ pullulan có trong dung dịch là 0,083 g/l.

Từ đó ta tính toán có đƣợc kết quả là:

- Khối lƣợng pullulan có trong 142 ml dung dịch là 0,011786 g.

- Phần trăm khối lƣợng của pullulan có trong 0,0142 g mẫu là 83%.

Vậy mẫu pullulan thu đƣợc sau quá trình tinh sạch có hàm lƣợng là

83%.

3.1.3.4. Kết quả phân tích cấu trúc phổ hồng ngoại FT-IR của pullulan

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR của sản phẩm tinh sạch đƣợc và

mẫu pullulan tiêu chuẩn đƣợc thể hiện ở hình 3.6 và hình 3.7 nhƣ sau:

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại FT-IR của pulluulan tinh sạch

Hình 3.7: Phổ hồng ngoại FT-IR của pullulan tiêu chuẩn

Bảng 3.5: So sánh phổ FT-IR của mẫu thử nghiệm và mẫu chuẩn

Hayashibara Mẫu chuẩn Mẫu kiểm tra Nhóm chức Pullulan ( cm-1) Sigma pullulan (cm-1) [18] ( cm-1) (cm-1) [18]

O-H 3200-3645 3299.52 3433.76 3434.16

C-H 2700-3100 2927.78 2928.32 2928.95

C=O 1000-1900 1650.40 1637.47 1641.63

C-O-C 1000-1300 1154.08 1154.97 1155.90

858 852.97 847.95 847.95 Cấu hình , α

Từ kết quả phân tích FT-IR hình 3.6, hình 3.7 và so sánh trong bảng 3.5 ta thấy có sự xuất hiện các nhóm chức đặc trƣng của pullulan. Theo tiêu chuẩn, các đỉnh hấp thụ mạnh đƣợc quan sát trong phạm vi bƣớc sóng từ 3200-3645cm-1 đặc trƣng cho nhóm O-H, kết quả phân tích FT-IR của pullulan trong nghiên cứu cho thấy hấp phụ mạnh ở bƣớc sóng 3299.52cm-1 chỉ ra rằng ở pullulan đã có một số đơn vị lặp đi lặp lại nhƣ -OH. Sự hấp thụ mạnh khác tại bƣớc sóng 2927.78cm-1 cho thấy sự hiện diện của nhóm C-H, 1650.40cm-1 cho liên kết C=O, 1154.08cm-1 cho liên kết C-O-C. Mẫu thu nhận đƣợc có các liên kết đặc trƣng cho các liên kết hoá học của pullulan tiêu chuẩn.

3.2. KẾT QUẢ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs

3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá

trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs

Khảo sát xác định sự ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs đƣợc tiến hành bằng cách thay đổi nồng độ pullulan trong khoảng 0,1-5% (w/v) và giữ nguyên nồng độ AgNO3 phản ứng là 9mmol/l. Sử dụng phép đo quang phổ UV-Vis trong phạm vi 380-480nm thể

hiện tính chất đặc trƣng cộng hƣởng Plasmon bề mặt (SPR) để khẳng định sự tổng hợp các AgNPs bằng việc khử AgNO3 bằng pullulan trong dung dịch.

Hình 3.8: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các

nồng độ pullulan khác nhau

Do sự kích thích của tính chất cộng hƣởng bề mặt Plasmon ở vùng nhìn thấy UV, các hạt nano thể hiện màu nâu vàng. Hiệu quả của việc tăng nồng độ của pullulan từ 0,1-5% (w/v) là sự thay đổi màu từ vàng sang nâu vàng đƣợc thể hiện trong hình 3.8.

Hình 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP

Tác dụng của pullulan đối với sự hình hành AgNPs đƣợc minh họa bằng phổ UV-Vis trong hình 3.9. Kết quả cho thấy sự gia tăng đáng kể của các dải SPR và các bƣớc sóng cực đại (430-455nm) đã đƣợc quan sát thấy khi tăng thêm pullulan vào dung dịch AgNO3 9mmol/l. Rõ ràng rằng việc tăng

nồng độ pullulan đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành và ổn định AgNPs tạo thành.

3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 tới quá

trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs

Để nghiên cứu ảnh hƣởng của AgNO3 đến quá trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs, tiến hành thay đổi AgNO3 ở các nồng độ khác nhau (1-12mmol/l) trong dung dịch pullulan 5%. Các dung dịch Pu-AgNP đƣợc hình thành có sự thay đổi màu sắc từ vàng đến vàng nâu nhƣ hình 3.10 đƣợc cho hấp thụ bức xạ ở các vùng khả kiến.

Hình 3.10: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các

nồng độ AgNO3 khác nhau

Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP

Có sự gia tăng đáng kể của λmax đƣợc quan sát thấy trong các dung dịch AgNO3 nồng độ khác nhau. Hầu hết cực đại hấp thụ của các dung dịch nằm trong khoảng 440-460nm. Ta thấy nồng độ của AgNO3 khác nhau cũng ảnh hƣởng đến quá trình hình thành và ổn định Pu-AgNPs và thể hiện mạnh nhất ở nồng độ AgNO3 9mmol/l.

3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian tới phản ứng tạo

nano bạc Pu-AgNPs

Hình 3.12: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các

thời gian khác nhau

Hình 3.13: Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP

Trong nghiên cứu này, sự tổng hợp các hạt nano Pu-AgNPs cũng đƣợc nghiên cứu và đánh giá ở các thời điểm phản ứng khác nhau. Lựa chọn nồng

độ phản ứng tối ƣu của dung dịch pullulan là 5% và nồng độ AgNO3 là 9mmol/l, sau đó tiến hành phản ứng tạo các hạt nano bạc ở các thời gian lần lƣợt là 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 phút. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.12 và hình 3.13, nhận thấy màu sắc của dung dịch phản ứng thay đổi từ vàng đến vàng nâu và độ hấp thụ tăng lên theo thời gian. Điều này cho thấy nồng độ của các hạt nano bạc tăng lên. Tuy nhiên, sau 30 phút phản ứng nồng độ nano bạc có tăng nhƣng tăng không đáng kể. Vậy thời gian phản ứng tối ƣu trong khoảng 30-35 phút.

3.2.4. Kết quả xác định kích thƣớc hạt nano bạc Pu-AgNPs

Hình 3.14: Kích thƣớc hạt nano Pu-AgNPs

Các quan sát qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) các hạt nano bạc tổng hợp đƣợc cho kết quả các kích thƣớc hạt nano đƣợc tạo thành. Kết quả cho thấy đã có sự xuất hiện của các hạt có kích thƣớc khoảng 500nm, tuy nhiên

kích thƣớc các hạt vẫn chƣa đồng đều và vẫn có những hạt có kích thƣớc lớn do quy trình tổng hợp vẫn còn đơn giản, chƣa đƣợc công nghiệp hóa.

3.2.5. Kết quả xác định cấu trúc của hạt nano bạc Pu-AgNPs

Hình 3.15: Kết quả phân tích phổ FT-IR của nano bạc Pu-AgNPs

Bảng 3.6: So sánh phổ FT-IR của mẫu thử nghiệm với mẫu chuẩn và các nghiên cứu khác

Mẫu chuẩn

Nhóm chức P.Kanmani, 2013 [47] Mẫu nghiên cứu ( cm-1) V.S.Rama Krish Ganduri, 2016 [48]

O-H 3200-3645 3345 3259.92-3371.29 3471.18

C-H 2700-3100 2914 ---- 2928.14

C=O 1000-1900 1649 1635.62-1638.48 1635.21

C-O-C 1000-1300 1015 1020.95-1154.26 1027.04

C=C 2040-2260 ---- 2088.08-2164.66 2056.65

Phổ FT-IR của các Pu-AgNPs tạo thành đƣợc so sánh với phổ FT-IR của pullulan tiêu chuẩn để phân tích các nhóm chức năng có thể có. Trong đó ta thấy, đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng 3471.18cm-1 cho thấy sự xuất hiện của nhóm –OH. Một đỉnh hấp thụ khác ở bƣớc sóng 1635.21cm-1 cho thấy sự hiện diện của nhóm carbonyl C=O đặc trƣng. Các đỉnh hấp thụ đặc trƣng cho các nhóm chức khác so với mẫu chuẩn cũng xuất hiện lần lƣợt là đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng 2928.14cm-1 đặc trƣng cho nhóm C-H, đỉnh hấp thụ ở bƣớc sóng 1027.04cm-1 đặc trƣng cho nhóm C-O-C, một đỉnh hấp thụ khác ở bƣớc sóng 2056.65cm-1 đặc trƣng cho liên kết của nhóm C=C. Một đỉnh hấp thụ bổ sung ở bƣớc sóng 1383.89cm-1 cho thấy việc bị ảnh hƣởng bởi sự hiện diện của AgNPs.

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NANO BẠC Pu-AgNPs

Pha loãng mẫu thử trong DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ). Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để đƣợc dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/ml (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ). Để trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC/48h đối với nấm. Quan sát bằng mắt thƣờng để xác định giá trị ức chế tối thiểu (MIC) của từng mẫu thử. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.7: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc Pu-AgNPs

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, g/ml)

Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men STT Ký hiệu mẫu

E. coli P. aeruginosa B. subtillis S. aureus A. niger F. oxysporum S. cerevisiae C. albicans

1 M1 - - - - - - - -

2 M2 - - - - - - - -

3 M3 - - - 200 - - 200 -

(-): không xác định (không biểu hiện hoạt tính tại nồng độ thử nghiệm)

4 M4 - - - - - - - -

Ghi chú: M1: Mẫu Pullulan; M2: Mẫu AgNO3

M3: Mẫu Pu-AgNPs dạng rắn

M4: Mẫu Pu-AgNPs sau phản ứng dạng dung dịch

Kết luận: Các mẫu M1 và M2 không biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật, tuy nhiên khi kết hợp với nhau ở dạng nano (mẫu M3) đã biểu hiện hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn S. aureus và nấm men S. cerevisiae với giá trị MIC = 200µg/ml, tuy nhiên vì kích thƣớc của nano tổng hợp đƣợc vẫn còn lớn nên chƣa biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Mẫu M4 là sản phẩm sau phản ứng tổng hợp nano bạc dạng dung dịch, thử nghiệm không cho thấy biểu hiện ức chế vi sinh vật có thể do nồng độ nano bạc Pu-AgNPs trong dung dịch thấp, không đủ để ức chế vi sinh vật.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Luận văn đƣợc thực hiện dựa trên việc tiếp nối kết quả của dự án SXTN “Hoàn thiện công nghệ sản xuất pullulan và ứng dụng trong sản xuất một số sản phẩm thực phẩm”. Kết quả của dự án là quá trình lên men sinh tổng hợp pullulan thu đƣợc hàm lƣợng sinh khối khô là 20g/l. Đề tài tếp tục tiến hành nghiên cứu tinh sạch, thu nhận pullulan từ quá trình lên men sinh tổng hợp chủng nấm Aureobasididum pullulans và tổng hợp hạt nano bạc có sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định, từ đó đánh giá đƣợc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hạt nano bạc tạo thành. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:

- Sử dụng H2O2 nồng độ 12% để tiến hành tẩy màu sản phẩm lên men ở nhiệt độ 80-90oC và pH=11-13, hiệu suất đạt > 95% khi sử dụng dung môi isopropanol với tỷ lệ 1:2,5 để kết tủa thu hồi sản phẩm. Mẫu pullulan sau tinh sạch có độ nhớt là 146,75cP (nằm trong khoảng 100 – 180cP) và độ tinh sạch đạt khoảng 83%. Đã chứng minh bằng hình ảnh phổ FT-IR cho thấy các nhóm chức đặc trƣng của pullulan.

- Tổng hợp thành công hạt nano bạc Pu-AgNPs với dung dịch pullulan 5%, dung dịch AgNO3 9mmol/l ở điều kiện khuấy từ có gia nhiệt kết hợp siêu âm vi sóng và trong thời gian 30-35 phút. Kết quả đạt đƣợc là dung dịch nano bạc tạo thành có màu sắc đặc trƣng từ vàng đến nâu vàng, hấp thụ các bƣớc sóng cực đại trong khoảng 400-460nm, kích thƣớc hạt đo đƣợc là 500nm, tuy nhiên vẫn chƣa đồng đều và thể hiện các nhóm chức đặc trƣng thông qua phổ FT-IR.

- Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của nano bạc Pu-AgNPs tổng hợp đƣợc cho kết quả là mẫu có biểu hiện hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm men Saccharomyces cerevisiae với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 200µg/ml.

4.2. KIẾN NGHỊ

Do khuôn khổ nghiên cứu của luận văn có hạn, các nghiên cứu của luận văn có tính chất là các nghiên cứu cơ bản. Để có thể áp dụng rộng rãi các kết quả nghiên cứu của luận văn vào thực tế cần phải có những nghiên cứu toàn diện và chuyên sâu hơn nhằm mục đích nâng cao ứng dụng. Từ những kết quả nghiên cứu đã đạt đƣợc ở trên, một số nội dung nghiên cứu cần đƣợc thực hiện tốt bao gồm:

- Nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hƣởng khác đến quá trình tổng hợp các hạt nano bạc Pu-AgNPs. Sử dụng các phƣơng pháp chuyên sâu hơn để đánh giá kỹ càng hơn về các hạt nano tạo thành.

- Nghiên cứu về các phƣơng pháp sinh học khác tạo nano bạc Pu- AgNPs để tạo hạt có kích thƣớc nhỏ hơn, biểu hiện hoạt tính ức chế nhiều chủng vi sinh vật kiểm định khác nhau.

- Đánh giá thêm về các hoạt tính sinh học khác của nano bạc Pu-AgNPs

để ứng dụng cho các lĩnh vực khác nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Mishra.B and Vuppu.S, 2013, A study on Downstream Processing for the production of Pullulan by Aureobasidium pullulans–SB–01 from the Fermentation borth, 2 (ISC – 2012), pp. 16-19.

[2] He.J.H, Kunitake.T, and Nakao.A, 2003, Facile insitu synthesis of noble metal nanoparticles in porous cellulose fibers, Chem.Master, 15, pp. 4401- 4406.

[3] Raveendran.P, Fu.J, and Wallen.S.L, 2003, Completely "green" synthesis and stabilization of metal nanoparticles, J.Am.Chem.Soc,125(46), pp. 13940- 13941.

[4] Catley.B.J, Whelan.W.J, 1971, Observation on the structure of pullulan, Arch.Biochem.Biophys, (143), pp. 138-142.

[5] Leathers.T.D, 2003, Biotechnological production and applications of pullulan, Applied Microbiology and Biotechnology, 62, pp. 468-473.

[6] Yuen.S, 1974, Pullulan and its applications, Process Biochem, 22, pp. 7-9.

[7] Mishra.B, Vuppu.S, and Rath.K, 2011, The role of microbial pullulan, a biopolymer in pharmaceutical approaches: A review, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), pp. 45-50.

[8] Dumitrui.S, 1996, Polysaccharides in medicinal aplications. CRC Press, Part I, 3:59-87.

[9] Nguyễn Hà Bích Huyền, 2016, Nghiên cứu, tách chiết và tinh sạch enzyme acetyl esterase từ nấm Aureobasidium pullulans var namibiae, Khóa luận tốt nghiệp khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, Hà Nội.

[10] Cheng.K, Demirci.A & Catchmark.J.M, 2011, Pullulan: biosynthesis, production, and applications, Appl Microbiol Biotechnol, 92, pp. 29–44

[11] Phạm Thị Hằng, 2010, Nghiên cứu điều kiện tối ưu sinh tổng hợp pullulan và khảo sát điều kiện thu hồi pullulan từ Aureobasidium pullulans IFO 4594, Luận văn thạc sĩ khoa học công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội.

[12] Dumitrui.S, 1996, Polysaccharides in medicinal aplications, CRC Press, Part I, 3:59-87.

[13] Duong T.T, Le T.S, Tran T.T.H, Nguyen T.K, Ho T.C, Dao T.H, Le T.P.Q, Nguyen H.C, Dang D.K, Le T.T.H, Ha P.T, 2016, Inhibition effect of engineered silver nanoparticles to bloom forming cyanobacteria, Advances in Natutral Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, 7(3).

[14] Kim.J.S, Kuk.E, Yu.K.N, Kim.J.H et al, 2007, Antimicrobial effects of silver nanoparticles, Nannomedicine. 3(1), pp. 95-101.

[15] Li.P, et al, 2005, Synergistic antibacterial effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles, Nanotechnology, 16(9).

[16] Morones.J.R, et al, 2005, The bactericidal effect of silver nanoparticles, Nanotechnology, 16(10), pp. 2346-2353.

[17] Oğuzhan.P and Yangılar.F, 2013 Pullulan: Production and usage in food

ındustry, 4(3) pp. 57-63.

[18] Trần Thị Thu Hƣơng, Dƣơng Thị Thủy, Đặng Đình Kim, Hà Phƣơng Thƣ và cs, 2015, Ảnh hƣởng của một số vật liệu nano kim loại Đến sinh trƣởng của chủng VKL Microcystis aeruginosa KG, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 53 (3A), pp. 65-79

[19] Trần Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Trung Kiên, Dƣơng Thị Thủy và cs, 2016, Ảnh hƣởng của các vật liệu nano bạc lên sinh trƣởng của bèo Lemma sp, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 14(2), pp. 1-8.

nanocomposite properties based novel of a

[20] Moghaddam.MG, Eslahi.H, 2014, Synthesis, characterization and antibacterial on polyaniline/polyvinylalcohol/Ag, Arabian Journal of Chemistry, 7(5), pp. 846-855.

[21] Prabhu.S, Poulose.E.K, 2012, Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications and toxicity effects, Int. Nano Lett, 2, pp. 1-10.

[22] Nguyễn Thị Ngoan, 2016, Nghiên cứu, tổng hợp, đặc trưng vật liệu lai vô cơ (Ag, Fe3O4) - hữu cơ (chitosan) cấu trúc nano định hướng ứng dụng trong y sinh, Luận án tiến sỹ hóa học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.

[23] Trần Thị Ngọc Dung, Nguyễn Hoài Châu, Đào Trọng Hiền, Nguyễn Thúy Phƣợng, Ngô Quốc Bƣu, Nguyễn Gia Tiến, 2011, Nghiên cứu tác dụng của băng nano bạc lên quá trình điều trị vết thƣơng bỏng, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 49(3).

[24] U.S. U.S.Environmental Protection, 1996, Silver; CASRN 7440-22-4.

[25] Nguyễn Thị Thanh Bình và cs, 2016, Nghiên cứu điều chế tiểu phân nano chứa bạc để ứng dụng trong dƣợc phẩm, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 32(2), pp. 32-47.

[26] Kumar.A, Vemula.P.K, Ajayan.P.M, John.G, 2008, Sliver-nanoparticle- embedded antimicrobial paints based on vegetable oil, Nat Mater, 7(3), pp. 236-41.

[27] Zhang.X-F, Liu.Z-G, Shen.W, Gurunathan.S, 2016, Sliver Nanoparticles: Synthesis, Characterization, Properties, Applications, and Therapeutic, Apporoaches, Int J Mol Sci, 17(9), p. 1534.

[28] Neu.H.C, 1992, "The crisis in antibiotic resistance", Science, 257(5073), pp. 1064-1073.

[29] Ventola.C.L, 2015, The Antibiotic Resistance Crisis Part1: Cause sand Threats, P&T, 40(4), pp. 277–83.

[30] Ventola.C.L, 2015, The Antibiotic Resistance Crisis Part 2: Management Strategies and New Agents, P&T, 40(4), pp.344–352.

[31] Ruben.J, Morones-ramirez.J.Z, Winkler.J.A et al, 2013, Silver Enhances Antibiotic Activity Against Gram-Negative Bacteria. Sci.Transl.Med, 5(190), pp.1–11.

[32] Isok.H, Hwang.J.H, Choi.H, et al, 2012, Synergistic effects between silver nanoparticles and antibiotics and the mechanisms involved, J.Med. Microbiol, 61(Pt12), pp.1719–1726.

[33] Li.P, et al, 2005, "Synergistic antibacterial effects of β-lactam antibiotic combined with silver nanoparticles", Nanotechnology, 16(9).

[34] Li.R, Chen.J, et al, 2016, Synergistic reaction of silver nitrate, silver nanoparticles, and methylene blue against bacteria, Proc Natl Acad Sci USA, 113(48), pp.13612–13617

[35] Venugopal.K, et al, 2017, Synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) for anticancer activities (MCF7 breast and A549 lung celllines) of the crude extract of Syzygium aromaticum, J Photochem Photobiol B Biol, 167, pp. 282–289.

[36] Gurunathan.S, Lee.K.J, et al, 2009, Antiangiogenic properties of silver nanoparticles, Biomaterials, 30(31), pp. 6341–6350.

[37] A. Martínez, A. Fernández, E. Pérez, M. Benito, J.M.Teijón and

M.D.Blanco, 2012, Polysaccharide-Based Nanoparticles for Controlled

Release Formulations, The Delivery of Nanoparticles, pp.185-222

[38] Abid.J.P, Wark.A.W, et al, 2002, Preparation of silver nanoparticles in solution from a silver salt by laser irradiation, Chemical Communications, (7), pp. 792-793.

[39] Choy.K.S, Ren.C.Y, 2000, Synthesis of nanosized silver particles by chemical reduction method, Materials Chemistry and Physics, 64(3), pp. 241- 246.

[40] Đoàn Thị Kim Bông, 2012, Nghiên cứu điều chế dung dịch nano bạc bằng kỹ thuật điện hóa siêu âm, Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Hóa học, Đại Học Bách Khoa TP.HCM, TP.Hồ Chí Minh.

[41] Vigneshwaran.N, Ashtapure.N.M, et al, 2007, Biologycal synthesis of silver nanoparticles using the fungus Aspergillus flavus, Materials Letters, 61(6), pp. 1413-1418.

[42] Cho.K.H, Park.J.E, Osaka.T, Park.S.G, 2005, The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient, Electrochim. Acta, 51(5), pp.956-960.

[43] Taleb.A, Petit.C, Pileni.M, 1997, Synthesis of highly monodisperse silver nanoparticles from AOT reverse micelles: a way to 2D and 3D selforganization, Chem. Mater., 9(4), pp.950-959.

[44] Zhang.Z, et al, 2000, Stable silver clusters and nanoparticles prepared in polyacrylate and inverse micellar solutions, J. Phys. Chem. B, 104(6), pp.1176-1182.

[45] Lee.G.J, Shin.S.I, Kim.Y.C, Oh.S.G, 2004, Preparation of silver nanorods through the control of temperature and pH of reaction medium, Materials Chemistry and Physics, 84(2-3), pp.197-204.

[46] Nabikhan.A, Kandasamy.K, Raj.A, Alikunhi.N.M, 2010, Synthesis of antimicrobial silver nanoparticles by callus and leaf extracts from saltmarsh plant, Sesuvium portulacastrum, Colloid Surf B Biointerfaces, 79(2), pp.488- 493.

[47] Rajan.R, Chandran.K, et al, 2015, Plant extract synthesized silver nanoparticles: an ongoing source of novel biocompatible materials, Industrial Crops and Products, 70, pp.356-373.

[48] Kulkarni.N and Muddapur.U, 2014, Biosynthesis of Metal Nanoparticles: A Review, Journal of Nanotechnology, pp. 1-8.

[49] Kanmani.P and Lim.S.T, 2013, Synthesis and characterization of pullulan-mediated silver nanoparticles and its antimicrobial activities, Carbohydrate Polymers, 97(2), pp. 421-428.

[50] Ganduri.V.S.R.K, et al, 2016, Pullulan-Stabilized Silver Nanoparticles - Their Synthesis, Characterization and Application as Bactericidal Agents, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 6(7), pp. 27-37.

[51] Zhang.K, et al, 2017, Comparison of direct synthesis of silver nanoparticles colloid using pullulan under conventional heating and

microwave irradiation, Inorganic and Nano-Metal Chemistry, 47(6), pp. 938- 945.

[52] Nallusamy.S and Bahry.S.A, 2019, Synthesis of Pullulan-Mediated Silver Nanoparticles (AgNPs) and their Antimicrobial Activities, SQU Journal for Science, 24(2), pp. 88-94.

[53] Trần Vĩnh Hoàng, Nguyễn Xuân Mạnh, Vƣơng Thị Kim Oanh, Lê Thị Mai Hoa, Trần Đại Lâm, 2011, Nghiên cứu chế tạo và thử hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc sử dụng chitosan làm chất khử/chất ổn định, Tạp chí khoa học và công nghệ, 49(6), 102-106.

[54] Nguyễn Thanh Vũ, Huỳnh Quyền, Dƣơng Hoa Xô, Lê Quang Luân, 2017, Nghiên cứu chế tạo chế phẩm oligochitosan-bạc nano ứng dụng làm phân bón kháng bệnh héo vàng do nấm fusarium oxysporum gây ra trên cà chua, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 15(1): 141-149.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Tiêu chuẩn chất lƣợng của pullulan sau quá trình lên men, tinh sạch thu hồi sản phẩm

TT

Tên chỉ tiêu

Đơn vị

Phương pháp thử

Chỉ tiêu theo JECFA

Chỉ tiêu công bố

pH

4,5-6,5

1 Đo máy Titrando 907

(dung dịch 10%)

<10%

Độ ẩm

%

2 QCVN 4- 21:2011/BYT

mg/kg

<1mg/g

3 Hàm lƣợng Chì (Pb)

AOAC 999.10:2012

%

95+-1

4 Hàm lƣợng Carbonhydrate

Không quy định

Theo HD của FDA và phƣơng pháp phenol –sulphuric

Nhớt kế

mm2/s

100-180

5 Độ nhớt dung dịch 10%, 30C0C

Đo ở dung dịch 10%, 300C

Coliforms

MPN/g

ISO 4831:2006

Không có

6 Không có (*)

MPN/g

<10

<1,0 x 101

7 Tổng số nấm men, mốc

ISO 21527- 1,2:2008

8 Salmonella/25g

ISO 6579:2002

Không phát hiện

Phụ lục 2: Một số hình ảnh thiết bị và quy trình tinh sạch và kiểm tra chất lƣợng pullulan

Máy so quang UV-Vis Thiết bị lọc DLM

Kiểm tra độ nhớt của dịch lên men EPS Tinh lọc bằng vật liệu hấp phụ và màng lọc

Pullulan thu nhận được sau tinh sạch

Phụ lục 3: Phổ cộng hƣởng từ NMR của pullulan tinh sạch

Phụ lục 4: Hình ảnh minh họa quá trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs

Phụ lục 5: Hình ảnh kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn sử dụng phƣơng pháp đĩa thạch

M3 M3

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc Pu-AgNPs có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Nguyễn Mai Linh

“NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH”

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội – 2021

Nguyễn Mai Linh

“NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hƣớng dẫn 1: TS. Đỗ Hữu Nghị

Hƣớng dẫn 2: PGS.TS Ngô Kim Chi

Hà Nội - 2021

1.2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN TRÊN THẾ GIỚI

Sinh khối

C hoạt tính/H2O2

Ethanol

Nƣớc

1.3. TỔNG QUAN VỀ NANO BẠC

1.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP TẠO NANO

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ LỰA CHỌN

PHƢƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI

3.2. KẾT QUẢ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs

TT

Tên chỉ tiêu

Đơn vị

Phương pháp thử

Chỉ tiêu theo JECFA

Chỉ tiêu công bố

pH

4,5-6,5

4,5-6,5

1

Đo máy Titrando 907

(dung dịch 10%)

<10%

<10%

Độ ẩm

%

2

QCVN 4- 21:2011/BYT

mg/kg

<1mg/g

<1mg/g

3

Hàm lƣợng Chì (Pb)

AOAC 999.10:2012

%

95+-1

4

Hàm lƣợng Carbonhydrate

Không quy định

Theo HD của FDA và phƣơng pháp phenol –sulphuric

Nhớt kế

mm2/s

100-180

100-180

5

Độ nhớt dung dịch 10%, 30C0C

Đo ở dung dịch 10%, 300C

Coliforms

MPN/g

ISO 4831:2006

Không có

6

Không có (*)

MPN/g

<10

<1,0 x 101

7

Tổng số nấm men, mốc

ISO 21527- 1,2:2008

8

Salmonella/25g

ISO 6579:2002

Không phát hiện

Không phát hiện

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới