Luận văn Thạc sĩ Hóa học: Nghiên cứu các hợp chất ngoại bào của một số vi sinh vật đáy biển Bắc Bộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIỆN HÓA HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ VĂN NAM

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA

MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIỆN HÓA HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ VĂN NAM

NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA

MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TSKH. Phạm Văn Cường

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TSKH. Phạm

Văn Cường đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình thực hiện của luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng Khoa học,

Bộ phận đào tạo và các phòng chức năng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hoá Sinh biển đã cổ vũ, động

viên, tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc để tôi có thể thực hiện tốt các công

việc của luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Thị Mai Hương và TS. Trịnh Thị Thanh

Vân cùng các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Tổng hợp Hữu cơ và Trung

tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ, đóng góp

nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên

tôi hoàn thành tốt bản luận văn này.

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Vũ Văn Nam

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………

DANH MỤC CÁC BẢNG…………………………………………………...

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ…………………………………………………..

DANH MỤC CÁC HÌNH……………………………………………………

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC……………………………………………….

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3

1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển ................................................................................ 3

1.1.1. Vi sinh vật ..................................................................................................... 3

1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên ............................................................. 4

1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống ............................................................. 5

1.1.4. Vi sinh vật biển .............................................................................................. 5

1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam ............................................... 6

1.3. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới .. 11

1.3.1. Hoạt tính kháng lao ...................................................................................... 13

1.3.2. Hoạt tính chống ung thư............................................................................... 14

1.3.3. Hoạt tính khác.............................................................................................. 16

1.4. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam .............. 18

1.5. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium. ....................... 20

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22

2.1. Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học .................................................... 22

2.2. Phương pháp lấy mẫu........................................................................................... 22

2.3. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển ................................................... 22

2.4. Phương pháp nuôi cấy .......................................................................................... 22

2.5. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi

sinh vật ......................................................................................................................... 24

2.6. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp. ................... 24

2.7. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ

dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật. ................................................................ 25

2.8. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật

kiểm định ............................................................................................................. 25

2.8.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 25

2.8.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ............................... 26

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 28

3.1. Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng

vi khuẩn Photobacterium sp. ....................................................................................... 28

3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch

ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. ........................................... 31

3.2.1. Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH ................................................ 31

3.2.2. Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat .......................................... 33

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 37

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch

chiết MeOH ................................................................................................................. 37

4.1.1. Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) ... 37

4.1.2. Hợp chất Uracil (FM7.3).............................................................................. 42

4.1.3. Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) .............................................................. 42

4.2. Các chất phân lập được từ cặn Etyl acetat ......................................................... 43

4.2.1. N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) ....................................................... 44

4.2.2. Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) ................................................................. 48

4.2.3. Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) ................................................................. 49

4.2.4. Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1) ........................................................ 50

4.2.5. Hợp chất Thymine (F7.2) ............................................................................. 51

4.2.6. Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2)............................................. 52

4.2.7. Hợp chất Axit benzoic (F2.2) ....................................................................... 53

4.2.8. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2) ............................................... 53

4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được .......................................... 54

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập .................................... 54

4.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập ..................... 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 55

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN ....................................... 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 58

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NMR:

Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

1H-NMR:

Phổ cộng hưởng từ proton

13C-NMR:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

DEPT:

Distortionles Enhancement by Polarization Transfer (phổ DEPT)

COSY:

Homonuclear Correlated Spectroscopy

HMBC:

Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC)

HMQC:

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (phổ HMQC)

HSQC:

Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC).

NOE:

Nuclear Overhauser Effect (hiệu ứng NOE)

NOESY:

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (phổ NOESY)

s: singlet

qui: quintet

b: broad

d: doublet

sxt: sextet

dd: doublet of doublets

t: triplet

sep: septet

dt: doublet of triplets

q: quartet

o: overlapping

dq: doublet of quartets

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon.

δH, δC:

part per million (phần triệu).

ppm:

Electron Inoniziation Mass Spectroscopy (phổ khối phun mù điện tử).

EIMS:

HRMS:

High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối phân giải cao)

DMSO:

Dimethylsulfoxide

đnc:

Điểm nóng chảy

TLC:

Thin Layer Chromatography (sắc ký bản lớp mỏng)

Column Chromatography (sắc ký cột)

CC:

Reverse Phase (sắc ký pha đảo)

RP:

Nồng độ tác dụng ức chế 50% tế bào thử nghiệm

IC50

Nồng độ ức chế tối thiểu

MIC

HKTS

Hiếu khí tổng số

Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích

tại Cát Bà ................................................................................................................ 7

Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà ........................... 8

Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà8

Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển

Việt Nam ........................................................................................................ 9

Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà ......................................................................... 11

Bảng 4.1. Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125

MHz) của FM8.4 ................................................................................................... 39

Bảng 4.2. Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125

MHz) của F5.5 ...................................................................................................... 45

Bảng 4.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập ............................. 54

Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập ................ 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật ....................................................................... 4

Hình 2.1. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật .................... 23

Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. ................ 28

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH ............................................................. 29

Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc .............................................................. 30

Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cặn MeOH ................................ 37

Hình 4.2. Phổ khối của FM8.4 ............................................................................... 38

Hình 4.3. Phổ 1H-NMR giãn rộng của FM8.4 ........................................................ 39

Hình 4.4. Phổ 13C-NMR giãn rộng của chất FM8.4 ............................................... 40

Hình 4.5. Phổ COSY của chất FM8.4 ................................................................... 40

Hình 4.6. Phổ HMBC của chất FM8.4 ................................................................... 41

Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất FM8.4 ....... 41

Hình 4.8. Một số tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất FM4.2 ............... 43

Hình 4.9. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cặn Etyl acetat .......................... 44

Hình 4.10. Phổ khối của chất F5.5 ......................................................................... 45 Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của chất F5.5 .................................................................. 46 Hình 4.12. Phổ 13C-NMR của chất F5.5 ................................................................ 47

Hình 4.13. Phổ COSY của chất F5.5...................................................................... 47

Hình 4.14. Phổ HMBC của chất F5.5 .................................................................... 47

Hình 4.15. Tương tác chính trên phổ COSY ( ) , HMBC ( ) của chất F5.5 ..... 48

Hình 4.16. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.4 ........................... 49

Hình 4.17. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.1 ........................... 50

Hình 4.18. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F3.3.1 ........................ 51

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ của hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide

(FM8.4) .............................................................................................................. PL1

Phụ lục 2. Phổ của hợp chất Uracil (FM7.3) ....................................................... PL5

Phụ lục 3. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) ....................................... PL7

Phụ lục 4. Phổ của hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) ................ PL11

Phụ lục 5. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) ......................................... PL15

Phụ lục 6. Phổ của hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) ........................................ PL19

Phụ lục 7. Phổ của hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) ............................... PL23

Phụ lục 8. Phổ của hợp chất Thymine (F7.2) .................................................... PL27

Phụ lục 9. Phổ của hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) .................... PL29

Phụ lục 10. Phổ của hợp chất Axit benzoic (F2.2) ............................................ PL31

Phụ lục 11. Phổ của hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) .................... PL34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về

sinh học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động

thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường

biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên

nhiên, nó như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá.

Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình

thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt

tính sinh học quý giá [1,2].

Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên

thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số rất nhiều các hợp chất thứ

cấp với cấu trúc hóa học đặc biệt đã có nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học

rất phong phú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu

hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Trong khi đó, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ

nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu

đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn nhờ vị trí

địa lý tiếp giáp với biển [1,2,10].

Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa

dạng và phong phú. Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển [1]. Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu các hợp chất thứ

cấp của nguồn vi sinh vật biển Việt Nam nhằm phát hiện các chất có hoạt tính sinh

học cao có thể nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược là hướng nghiên cứu cần

thiết, hứa hẹn nhiều triển vọng. Ngoài ra, trong rất nhiều nghiên cứu về các đối

tượng sinh vật biển như hải miên, san hô..., các hợp chất phân lập được đã được xác

định là do chính các vi sinh vật cộng sinh tạo ra. Việc thu lượng lớn các đối tượng

sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và

kinh phí. Do vậy, nếu tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật, chỉ cần thu 1

lượng mẫu nhỏ phục vụ việc phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với

lượng lớn trong phòng thí nghiệm phục vụ việc nghiên cứu hóa học.

Trong khuôn khổ của Đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu phát hiện

các hợp chất chống lao từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng đông bắc bộ Việt

Nam”, mã số: VAST. TĐ. ĐAB .04/13-15. Kết quả sàng lọc cho chủng vi khuẩn

Photobacterium sp. được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long thể hiện hoạt tính

kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng Staphylococcus aureus, Echerichia coli

và nấm Fusarium oxysporum [50]. Cho đến nay, trên thế giới chưa có công trình

nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất ngoại

bào của các loài thuộc chi Photobacterium. Do vậy, chúng tôi lựa chọn chủng vi

khuẩn Photobacterium sp. này làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục tiêu:

- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các chất từ dịch ngoại bào của

chủng vi khuẩn Photobacterium sp.

- Khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm

định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên

cứu ứng dụng các hợp chất này.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển

1.1.1. Vi sinh vật

Vi sinh vật (Microorganism) là những sinh vật có kích thước rất nhỏ từ vài

trăm nm đến vài nm, muốn thấy rõ chúng phải sử dụng kính hiển vi. Vi sinh vật

phân bố ở khắp mọi nơi trên trái đất. Chúng có mặt trên cơ thể người, động vật,

thực vật, trong đất, trong nước, trong không khí, trên mọi đồ dùng,vật liệu, từ biển

khơi đến núi cao, từ nước ngọt, nước ngầm cho đến nước biển.... Vi sinh vật tham

gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh - địa - hoá học

(biogeochemicalcycles) như vòng tuần hoàn cacbon, vòng tuần hoàn nitơ, vòng tuần

hoàn photpho, vòng tuần hoàn lưu huỳnh [2,7].... Dựa vào đặc điểm cấu tạo tế bào,

người ta chia ra làm 3 nhóm lớn như sau:

- Nhóm chưa có cấu tạo tế bào bao gồm các loại virút.

- Nhóm có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân rõ ràng (cấu trúc

nhân nguyên thủy) được gọi là nhóm Procaryotes, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn

và tảo lam.

- Nhóm có cấu tạo tế bào và có cấu trúc nhân phức tạp được gọi là Eukaryotes

bao gồm nấm men, nấm sợi (gọi chung là vi nấm) một số động vật nguyên sinh và

tảo đơn bào.

Như vậy, vi sinh vật không có mặt trong hai giới động vật và thực vật. Người

ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200000 loài vi sinh vật. Tuy

nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có

không ít loài vi sinh vật [2].

Vi khuẩn - Tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, đôi khi còn được gọi là

vi trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước

hiển vi) và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào

(cytoskeleton) và các bào quan như ty thể và lục lạp [2,7].

Virút là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể là những tác nhân gây

nhiễm trùng có kích thước nhỏ nhất (đường kính từ 20-300 nm) và trong bộ gen của

chúng chỉ chứa 1 loại axit nucleic (RNA hoặc DNA). Axit nucleic được bao bọc

trong lớp vỏ protein và bên ngoài cùng có thể được bao quanh 1 màng lipid. Toàn

bộ phân tử virút được gọi là virion. Có 3 loại virus chính là Viroid (ARN có tính

cảm nhiễm), Virusoid (ARN không có tính cảm nhiễm) và Virino. Số virút đã được

đặt tên là khoảng 4000 loài [2,7].

Xạ khuẩn - danh pháp khoa học là Actinobacteria, tiếng Anh là Actinomycetes

là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trước

kia được xếp vào tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi

khuẩn (Schizomycetes). Xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm nhưng giống vi

khuẩn: có giai đoạn đơn bào và có giai đoạn đa bào, kích thước rất nhỏ, nhân giống

với vi khuẩn, không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không chứa cellulose

hoặc chitin, giống với vi khuẩn, phân chia tế bào giống với vi khuẩn (kiểu

Amitose). Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), hoại sinh và ký

Vi khuẩn Escherichia

Nấm men

Nấm sợi Alternaria

Vi tảo Chlorella

coli

Saccharomyces

cerevisae

sinh [2,5].

Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật

1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên

Phân giải các hợp chất hữu cơ. Làm nguồn thức ăn bổ dưỡng cho các sinh

vật hóa dị dưỡng hữu cơ khác, tức là chuyển hóa nhanh các chất hữu cơ trong chu

trình thức ăn. Làm nguồn thức ăn cho các loại giun, sâu bọ tạo ra mạng lưới thức

ăn. Biến đổi các chất để các cơ thể khác nhau có thể sử dụng được. Biến đổi rất lớn

các chất bằng cách hình thành các chất hòa tan và khí, từ đó tạo ra các chất tham gia

vào con đường chuyển hóa trực tiếp hoặc biến đổi môi trường một cách gián tiếp.

Hình thành các chất ức chế làm giảm hoạt động của các vi sinh vật khác, của thực

vật và động vật. Số lượng và chủng vi sinh vật trong tự nhiên là rất lớn, rất đa dạng

và luôn biến đổi. Ở một số nơi, số vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn chất dinh dưỡng,

các chất độc hại và các tác nhân tới hạn khác. Vi sinh vật có vai trò quan trọng

trong vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, S, P… và có khả năng chuyển hóa các

hợp chất độc hại chứa kim loại nặng như bạc, vàng, thủy ngân, đồng… thành các

dạng không độc hại hoặc ít độc hơn đối với cơ thể người động vật và cây trồng [7].

1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống

Sử dụng vi sinh vật trong lên men đồ uống, lên men lactic, ủ chua thức ăn

gia súc, sử dụng những tác nhân ức chế vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm, giữ

vệ sinh môi trường làm việc và hoạt động sống.

Vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn – mô hình lý tưởng trong công nghệ di

truyền và công nghệ sinh học. Một số vi sinh vật là tác nhân gây bệnh trên người,

động vật và cây trồng. Hiện có khoảng 1000 loài virút gây bệnh trên thực vật, gần

90% các bệnh đường hô hấp ở người là do virút, trong đó có bệnh viên đường hô

hấp cấp (bệnh SARS), HIV/AIDS vẫn là đại dịch chưa có thuốc chữa khỏi, các

bệnh vi khuẩn trên người cũng rất nhiều như viên xoang mũi (Staphylococcus sp),

bạch hầu (Corynebacteriumdiphtheria), ho gà (Bordetella pertusis), lao phổi

(Mycobacterrium tuberculosis) [7].

1.1.4. Vi sinh vật biển

Biển là môi trường sống rất đặc biệt, vì ở đó nghèo chất dinh dưỡng và độ

mặn cao. Biển là một hệ sinh thái tự nhiên lớn nhất địa cầu vì hơn 70% bề mặt trái

đất được bao phủ bởi nước. Vi sinh vật biển có khả năng thích nghi với các điều

kiện môi trường biển luôn bị thay đổi, điều này mở ra các triển vọng phát triển các

hợp chất hữu cơ thứ cấp duy nhất. Số lượng vi sinh vật biển không cao như trên

cạn. Vi sinh vật biển có thể phân lập được từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối

tượng mà hoạt động hoặc bất động mà vi sinh vật có thể cộng sinh. Hiểu được qui

luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ làm dễ dàng và tạo điều kiện thuận lợi để thu

thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho việc phân lập định hướng các nhóm vi sinh

vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1,2,10].

Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai trò quan

trọng đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản. Những vi sinh vật

này có thể tìm thấy ở bất kỳ ngõ ngách nào ở đại dương từ trên bề mặt đến dưới

thềm đáy biển, trên các cơ thể sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu. Dưới

5% số tế bào vi khuẩn quan sát được ở các mẫu sinh vật lấy từ biển là có thể phát

triển trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo. Và người ta ước tính rằng số vi khuẩn

biển hiện giờ đã có thể nuôi cấy và phân lập chỉ chiếm dưới 1% số loài trong thực

tế. Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên

quan trọng sản sinh các chất với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính sinh học

mới. Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh

vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng [1,2].

1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam

Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa

dạng và phong phú. Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển. Kết quả thống kê đến nay đã thông báo 12000 loài động

thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc tính sinh học tiềm tàng.

Tuy nhiên, việc điều tra nghiên cứu để khai thác tiềm năng đó vẫn còn hạn chế.

Nghiên cứu, phát triển, khai thác những nguồn tài nguyên sinh vật biển đang là vấn

đề cấp bách không chỉ nước ta mà trên toàn thế giới [1].

Để có thể đánh giá và nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật biển, trong nghiên

cứu về đa dạng sinh học vi sinh vật biển thuộc vùng biển Cát Bà, Hải Phòng, tác giả

Lại Thúy Hiền và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN) đã khảo

sát, phân tích và thống kê sự có mặt của vi sinh vật từ các mẫu nước biển Cát Bà

[4]. Kết quả cho thấy khu hệ vi sinh vật ở vịnh Lan Hạ - Cát Bà rất đa dạng và

phong phú bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn, vi khuẩn

lên men, vi khuẩn chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, vi khuẩn sử dụng các

hyđrocacbon và vi khuẩn khử sulphat.

Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà

Tọa độ

Nấm

Sử dụng

Xạ

Nitrit

Nitrat

Khử

Hiếu khí

mốc

Men

khuẩn Lên men

hyđrocacbon

hóa

nitrat

sulphat

5x 101

5 x 101

20°43’820”

105

4 x 101

104

102

104

107°4’480”

2 x 107

8 x 104

105

102

105

20°45’263”

105

104

10l

103

105

107°04’02”

1,7 x 107

5 x 105

103

104

106

20°45’915”

106

2 x 102

5 x 104

102

104

107°03’519”

1,8 x 107

104

5 x 105

105

104

105

20°46’175”

106

2 x 102

102

5x102

5 x 104

102

105

107°04’906”

1,6 x 107

4 x 104

5 x 105

104

106

105

106

20°46’886”

106

5 x I04

102

103

102

105

107o06’001

1,7 x 107

2 x 102

5 x 105

104

106

5 x 105

107

20°47’563”

106

6x 101

5 x 104

102

10l

105

107o06’584”

3,4 x 107

4 x 102

106

5x105

5 x 105

105

104

106

20°45’702”

106

2 x 101

5 x 104

102

5x102

102

104

107°07’625”

1,7 X 107

105

104

5 x105

105

20°45’356”

105

4 x101

5 x104

102

105

107°07’758”

1,8 X 107

105

103

5 x 105

106

20°44’161”

106

2 x101

5 x 104

5 x104

102

104

102

107°03’853”

1,7 x 107

8 x102

5 x 105

103

106

5 x 105

107

20°44’496”

106

5 x 104

104

102

103

104

107°03’513

1,9 x 107

5 x 105

104

106

104

Đánh giá phân loại vi khuẩn từ một số mẫu nước và trầm tích chọn lọc cho

thấy các chủng vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế hơn các chủng Gram dương. Các

chủng Gram âm phân loại được thuộc các chi: Acinobacter, Pseudomonas,

Flavobacterium, Sphingomonas, Ochrobactrum còn vi khuẩn Gram dương chỉ có

Bacius, Janibacier. Các loài vi khuẩn phân lập đều có tỷ lệ tương đồng rất cao 93 -

100% so với các chủng trong ngân hàng dữ liệu. Trong khi đó, đối với các loại nấm

men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà chủ yếu bao gồm Candida, Rhodotorula,

Cladosporium, Penicillium và Steptomyces (bảng 1.2).

Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà

TT

Mẫu

Tên

Độ tương đồng

Nước bề mặt

Pseudomonas vesicularis

93,3%

Nước bề mặt

Flavobacterium indologenes

79,1%

Nước bề mặt

Pseudomonas vesicularis

93,3%

Nước bề mặt

Pseudomonas aeruginosa

99,9%

Nước bề mặt

Sphingomonas paucimobilis

99,7%

Nước bề mặt

Acinetobacter johnsonii

89%

Nước bề mặt

Pseudomonas cepacia

99%

Trầm tích

Ochrobactrum cytisis

100%

Trầm tích

Bacillus megatherium

100%

Nước bề mặt

Janibacter marinus

100%

Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà

TT 1

Mẫu Nước tầng giữa

Tên Penicillium duclauxe

Penicillium oxalicum

Cladosporium sphaerospermum

2 3

Trầm tích Nước bề mặt

4 5 6 7 8

Nước bề mặt Nước bề mặt Nước bề mặt Nước bề mặt Nước bề mặt

Penicillium oxalicum Candida parasilosis Rhodotorula mucilaginosa 2 Streptomyces celluloflavus Streptomyces sclerotialus

Cũng trong một nghiên cứu tương tự, Tống Kim Thuần và cộng sự (Viện

Công nghệ sinh học) đã công bố nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trên các mẫu nước

biển, động, thực vật và trầm tích ở các vùng biển khác nhau của Việt Nam, như

Quảng Bình, Bình Định, Phú Yên, Nha Trang, đảo Trường Sa, Hải Phòng và Nam

Định [11]. Từ 10 mẫu nước, 12 mẫu trầm tích, 2 mẫu san hô và 1 mẫu rong ở các

địa điểm và các vị trí lấy mẫu khác nhau của biển Việt Nam, tác giả đã phân lập và

xác định số lượng các nhóm vi sinh vật biển (bảng 1.4).

Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam

Vi khuẩn

Nấm sợi

Nấm men

Xạ khuẩn

Đặc điểm mẫu

Địa điểm lấy mẫu

CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ CFU/ml SCTĐ

Đà

Gần bờ, độ sâu 4,7 m, độ mặn 2,5%

3,3x101

3,7x101 9

2,3x101 10

Cửa Rằng

Xa bờ, độ sâu 1,7 m, độ mặn 3%

7,2x102

0,8x101

0,4x101 1

Vịnh Quy Nhơn

Xa bờ, độ sâu l,5 m, độ mặn 3%

5,1x102

1,1x101 9

0,3x101 1

Xa bờ, độ sâu 1,8 m, độ mặn 3%

3,4x102

3,3x101 8

0,5x101 2

Xa bờ, độ sâu 0,2 m, độ mặn 3%

7,6x103

0,7x101 5

5,0x101 1

Đảo Trường Sa

Ao nuôi rong tảo, nước lợ

1,0x103

2,0x101 5

Biển Hải Phòng

Nước ở độ sâu 6 m, độ mặn 3%

7,0x102

101

Đảo Cát Bà

Nước ven bờ, độ mặn 2%

Hạ Long

3,2x103

2 x102

Nước nuôi tôm, độ mặn 2%

Nam Định

1,2x101

4,2 x102 10

2,0x102 3

2,8x101 4

Nha Trang Cửa sông, nước lợ

5,2x103

2,6x101

3,2x102 9

Tổng số chủng: 314

215

Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được

Bảng 5. Số lượng và vi sinh vật tách được trong các mẫu trầm tích biển Việt Nam

Vi khuẩn

Nấm sợi

Nấm men

Xạ khuẩn

Đặc điếm mẫu

Địa điểm lấy mẫu

CFU/g

SCTD CFU/g

SCTĐ CFU/g SCTĐ CFU/g

SCTĐ

4,2x103

23 1,1x102

2x102

1,3x104

12 9,3x101

1,7x102

2x104

13 7,5x101

8,8x10l

2,2x104

2x102

2,2x104

1,1x102

1,1x103

3,7x102

1,3x102

Bình Định

1,3x104

44 3,2x102

9,6x103

2,2x102

2,1x1o4

3,7x103

7,8x102

5x101

5,6x104

2x103

1,2x104

18 6,9x101

2,5x101

Gần bờ, độ sâu 0,7 m, độ mặn 2% Gần bờ, ở độ sâu 0,9 m, độ mặn: 2% Gần bờ, độ sâu 2,1 m, độ mặn 2% Gần bờ, độ sâu 1,2 m, độ mặn 2% Độ sâu: 2,l m, độ mặn: 2% Xa bờ, độ sâu 9,1 m, độ mặn 2% Gần bờ, độ sâu 2 m, độ mặn 2% Xa bờ, độ sâu 10,3 m, độ mặn 2% Gần bờ, độ sâu 2,6 m, độ mận 2% Xa bờ, độ sâu 11,6 m, độ mặn 2% Xa bờ, độ sâu 33 m, độ mặn 2% Xa bờ, độ sâu 4,8 m, độ mặn 2%

Quảng Bình

Tổng số: 244

182

Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được

Nhóm xạ khuẩn từ lâu đã được biết đến như là nguồn sản sinh các hợp

chất có hoạt tính sinh học cao và luôn là đối tượng được quan tâm nghiên cứu

nhiều. Từ các mẫu đất và lá cây mục thu tại Cát Bà đã phân lập được 424 chủng xạ

khuẩn [2,6]. Trong số các chủng này, 353 chủng (83,25%) phân lập được từ đất và

71 chủng (16,75%) từ mẫu lá cây mục. Các chủng xạ khuẩn phân lập đã được xác

định tên và phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn

hiếm). Nhóm Streptomyces bao gồm 296 chủng (chiếm khoảng 69,81%) và 128

chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm non-Streptomyces (chiếm khoảng 30,19%). Như

vậy, có thể thấy các chủng thuộc nhóm Streptomyces chiếm số lượng đông đảo

hơn. Mặt khác, xét về mức độ đa dạng, có thể thấy các chi Micromonospora,

Nonomureae và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm

(non-Streptomyces) thu thập tại Cát Bà. Các loài thuộc ba chi này cũng thường

được phân lập ở các địa điểm khác ở Việt Nam [20].

Tuy đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, nhưng đã cho thấy bức tranh

sơ bộ về đa dạng sinh học các chủng xạ khuẩn có tại đảo Cát Bà, một vườn quốc

gia có đa dạng sinh học cao ở Việt Nam.

Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà

Các nhóm xạ khuẩn Số lượng chủng %

69,81 Streptomyces 296

6,36 Micromonospora 27

4,00 Nonomuraea 17

2,83 Nocardia 12

1,90 Kineosporia 8

1,65 Microbispora 7

1,65 Actinomadura 7

1,42 Pseudonocardia 6

1,42 Nocardiopsis 6

1,18 Micrococcus 5

1,18 Streptosporangium 5

6,60 Khác (mỗi loại ít hơn1%) 28

Tổng cộng 100,00 424

1.3. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới

Vi sinh vật biển bao gồm vi khuẩn và nấm được xem là nguồn mới nhiều

tiềm năng cho việc cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Nhiều loại vi

sinh vật biển sinh sống trong các điều kiện khắc nghiệt, chính bởi vậy chúng thường

sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú [1,2,10,11]. Từ dòng vi khuẩn

dưới biển sâu, người ta tách được một hợp chất Macrolid (1) mới gây độc tế bào.

Khi nuôi cấy chúng, sản sinh ra một loại chất mới mà trên cạn chưa từng có như

Macrolactin A (2), có tác dụng ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào limpho T,

chống virút HIV [40]. Tuy nhiên, nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật biển là công

việc rất khó khăn. Nguyên nhân việc khó nuôi cấy là do ở biển khơi nghèo chất

dinh dưỡng, có độ muối khác nhau, vi sinh vật biển đã thích nghi với việc đói và

môi trường nghèo nên không phát triển trên môi trường giầu chất dinh dưỡng hơn.

Người ta đã sử dụng các môi trường và các phương pháp khác nhau để tách các

nhóm vi sinh vật biển khác nhau [10].

Vi sinh vật cộng sinh với thực vật và động vật không xương sống có ý nghĩa rất

lớn trong việc tách chiết các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Một trong những

loài vi khuẩn cộng sinh với bọt biển là Rhopaloeides odorabile. Ngoài ra rất nhiều loài

vi khuẩn lạ thường và chưa được mô tả thường cộng sinh với tảo biển. Khoảng 30% vi

khuẩn cộng sinh với tảo xanh (Hamimeda sp.) và tảo nâu (Lopophora sp.) có thể nuôi

cấy được là vi khuẩn Gram dương (+). Các vi khuẩn Gram (+) thường gặp ở trầm tích

biển và chúng có khả năng sinh các chất thứ cấp có hoạt tính diệt côn trùng, các

enzyme gây độc cho tế bào [37]. Từ nấm sợi cộng sinh với tảo nâu biển Roseuvuigea

cũng tách được chất kháng sinh mới Pestanlone ức chế sinh trưởng vi khuẩn [35]. Các

chất chống oxy hóa Superoxidase glutathione (SOD) và một số dẫn suất mới

Hydroquinone, Oxepinamides A-C, Fumiquinazolines H-1 cũng được tách chiết từ vi

khuẩn biển và nấm sợi biển Acremonium sp. [12]. Xạ khuẩn biển cũng là nguồn tách

chiết các chất có hoạt tính sinh học mới mà các nguồn trên cạn không có. Ngoài các

hợp chất kháng sinh được tách từ nhóm xạ khuẩn Streptomyces. Diazepinomicin- một

hợp chất alkaloid mới kháng khuẩn cũng được tách ra từ xạ khuẩn biển

Micromonospora [10].

Do đó, các loài sống dưới đáy biển thường rất đặc biệt và có chứa các hợp chất

có khung cacbon rất khác biệt, đồng thời các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính

sinh học đa dạng.

1.3.1. Hoạt tính kháng lao

Một trong những hợp chất chống lao đầu tiên được phát hiện từ loài vi khuẩn

biển là hợp chất streptomycin (3) được phân lập từ loài xạ khuẩn Streptomyces

griseus vào năm 1944 [22]. Tiếp theo phải kể đến là rifampicin (4) (một kháng sinh

chủ yếu dùng để điều trị lao hiện nay) là một kháng sinh bán tổng hợp từ rifamycin,

một hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ Streptomyces mediterranei vào năm

1959 [43]. Trong một nghiên cứu gần đây, Zhang và cộng sự đã phân lập hai hợp

chất có hoạt tính chống lao rất đáng quan tâm là actinomycin X2 (5) và actinomycin

D (6) từ loài Streptomyces sp. MS449 có trong bùn biển [17].

Trong một nghiên cứu khác, khi nghiên cứu về một số loài vi sinh vật biển

Pseudomonas, hai dipeptide vòng là massetolide A (7) và viscosin (8) đã được phân

lập và xác định cấu trúc hóa học. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng lao trên

Tubercle bacillus và Mycobacterium avium-intracellulare cho thấy massetolide A

thể hiện hoạt tính ức chế với giá trị MIC là 5–10 và 10–20 mg/mL. Trong khi

viscosin thể hiện giá trị MIC 2,5–5 và 5–10 mg/mL tương ứng đối với Tubercle

bacillus và Mycobacterium avium-intracellulare [21]. Các chủng thuộc

Streptomyces luôn là đối tượng quan tâm nghiên cứu của nhiều nhóm trên thế giới

do có thể sản sinh nhiều các hợp chất có cấu trúc lý thú và hoạt tính sinh học đa

dạng. Hai hợp chất peptide vòng là cyclo-D-Pro-D-Leu và cyclo-D-Pro-D-Val được

phân lập từ loài vi khuẩn biển LS247 tương đồng với chủng Streptomyces puniceus

thể hiện hoạt tính kháng lao đối với chủng Tubercle bacillus với giá trị MIC lần lượt

là 7,1 và 18,5 mg/mL [48]. Cũng trong một nghiên cứu của chương trình sàng lọc

về loài vi khuẩn biển Streptomyces platensis, hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học

rất lý thú là platensimycin (9) đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các

khảo sát về hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này rất có tiềm năng trong nghiên

cứu ứng dụng trong y dược do có hoạt tính rất mạnh với việc kháng các chủng vi

khuẩn gram (+) với phổ rất rộng [14].

1.3.2. Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất thứ cấp được các loài vi sinh vật biển

sản sinh cũng cho thấy vi sinh vật biển là nguồn quan trọng trong nghiên cứu tìm

kiếm các chất có hoạt tính sinh học. Trong số các hợp chất này, nhiều hợp chất có

chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt, chưa từng phát hiện từ các nguồn khác. Các

hợp chất lagunapyrones A-C (10-12), được phân lập từ xạ khuẩn (actinomycete,

CNB-984) từ bùn biển cho thấy khả năng chống ung thư rất đáng quan tâm [51].

Bisucaberin (13) là một dimer vòng của 2 phân tử l-hydroxy-l,6-diazaundecane-

2,5-dione đã được phân lập từ loài khuẩn đáy biển Alteromonas haloplanktis SB-

112. Cấu trúc hóa học của hợp chất này đã được khẳng định bằng phương pháp

nhiễu xạ tia X. Hoạt tính chống ung thư của bisucaberin được biết đến nhờ khả năng

ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA của tế bào ung thư [32].

Nghiên cứu về loài khuẩn biển Alteromonas sp., Kobayashi và cộng sự đã phân

lập và xác định cấu trúc của hợp chất alkaloid là alteramide A (14). Các kết quả

khảo sát hoạt tính chống ung thư cho thấy alteramide A có khả năng ức chế sự phát

triển của các dòng tế bào ung thư P-388, L-1210 và KB [30]. Halobacillin (15) là

một acylpeptide vòng mới thuộc lớp chất iturin được phân lập từ loài khuẩn

Bacillus lấy từ mẫu bùn biển. Hợp chất này cũng cho thấy khả năng ức chế sự phát

triển của một số dòng tế bào ung thư [31].

Một hợp chất có hoạt tính chống ung thư khác đã được biết đến là dolastatin

10 (16). Hợp chất này được phân lập từ loài khuẩn lam có nguồn gốc biển ở Palau,

Symploca sp. VP642. Nghiên cứu hoạt tính sinh học cho thấy dolastatin 10 (16) là

tác nhân ức chế microtubule và đây chính là cơ chế chống ung thư của hợp chất này

[29]. Ngoài ra, salinosporamide A (17), cũng được phân lập từ loài khuẩn lam

Salinispora tropica. Hợp chất này cũng có khả năng ức chế sự phát triển của một số

tế bào ung thư. Hoạt tính chống ung thư của hợp chất này được cho là nhờ khả năng

ức chế proteasome 20S. Hiện tại hợp chất này đang được thử nghiệm lâm sàng

trong điều trị bệnh ung thư [24].

1.3.3. Hoạt tính khác

Trong các công trình nghiên cứu về các hợp chất có tác dụng kháng sinh từ các

chủng của chi Streptomyces, rất nhiều các hợp chất với cấu trúc đa dạng đã được

phát hiện. Chẳng hạn từ chủng thuộc chi Streptomyces, được phân lập từ mẫu bùn

biển ở San Diego, dãy lớp chất quinone mà điển hình là marinone (18) đã được xác

định. Cấu trúc hóa học của lớp chất này cho thấy chúng được sinh tổng hợp từ các

phần polyketide và terpenoid. Cũng từ một số chủng khác của chi Streptomyces,

người ta còn phân lập được napyradiomycin (19) và azamerone (20) là những hợp

chất có thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt [54].

Cũng có nguồn gốc từ loài khuẩn từ bùn biển, hợp chất maduralide (21)

được phân lập từ loài vi khuẩn biển Maduromycete. Kết quả khảo sát hoạt tính cho

thấy hợp chất này thể hiện hoạt tính đối với chủng Bacillus subtilis [39].

Các hợp chất thuộc lớp chất phenazine với hoạt tính kháng khuẩn cũng được

phát hiện từ chủng vi khuẩn Streptomyces sp. của bùn biển. Đây là các hợp chất có

chứa khung cacbon rất hiếm trong tự nhiên với phần L-quinovose ester (22;23)

[16]. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều chủng vi

khuẩn. Cũng cần nhấn mạnh rằng, hiện nay một số sản phẩm là các dẫn chất của

phenazine đang được nghiên cứu sử dụng khai thác hoạt tính kháng khuẩn của

chúng trong các lĩnh vực y dược và nông nghiệp.

1.4. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam

Như đã trình bày phần trên, đa dạng vi sinh vật nước ta rất dồi dào, tuy nhiên

cho tới nay, ở nước ta chưa có nhiều công trình nghiên cứu các hợp chất thứ cấp

được sinh tổng hợp từ các vi sinh vật biển. Một trong các nghiên cứu điển hình về

lĩnh vực này có thể kể đến công bố của tác giả Nguyễn Văn Hùng, Jimmy Orjala và

cộng sự. Nghiên cứu đã được tiến hành trên đối tượng khuẩn lam Lyngbya

majuscula tại vịnh Nha Trang. Khảo sát các hoạt chất thứ cấp của loài vi khuẩn này,

các tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của bốn hợp chất (24 – 27).

Trong đó hợp chất 24 và 25 là các hợp chất mới và được đặt tên tương ứng là

Nhatranggin A và B [25]. Các hợp chất này có cấu trúc hóa học tương đồng với lớp

chất aplysiatoxins đã được phân lập từ nhiều loài khuẩn lam biển. Nhiều hợp chất

thuộc lớp aplysiatoxins thể hiện hoạt tính chống ung thư thông qua sự hoạt hóa

protein kinase C. Như vậy, có thể nói đây là những nghiên cứu đầu tiên về các hợp

chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam [2].

Trong một nghiên cứu về loài vi tảo biển dị dưỡng mới của Việt Nam,

Labyrinthula sp. ND50, các tác giả Hoàng Minh Hiền và Đặng Diễm Hồng đã

nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa của enzyme elongase tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp các axit béo như DHA (axit docosahexaenoic) (28), DPA (axit

docosapenatenoic) (29) và EPA (axit eicosapentaenoic) (30) [3]. Đây là các

hợp chất axit béo Omega-3 đã được nghiên cứu và cho thấy chúng có chứa

nhiều hoạt tính sinh học quý giá đã được ứng dụng trong dược phẩm, thực

phẩm và mỹ phẩm.

Cũng trong cùng hướng quan tâm về nhóm vi sinh vật biển có khả năng sản

sinh DHA, Phạm Thị Miền và cộng sự (Viện Hải dương học, Nha Trang) đã tiến

hành nghiên cứu đánh giá tỷ lệ cacbon (C) và nitơ (N) trong thành phần môi trường

nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Schizochytrium mangrovei lên sự sinh trưởng và sản

sinh DHA. Kết quả cho thấy, trong môi trường đường cao nấm men bổ sung MnCl2,

Schizochytrium mangrovei có khả năng tạo được 4,92 g/l DHA. Trong môi trường

dùng nguồn natri (Na2SO4) thay thế cho muối biển nhân tạo, sau 5 ngày nuôi cấy

Schizochytrium mangrovei sinh được 0,52 g/l DHA. Trong khi ở môi trường dùng

thành phần muối biển thay thế cho muối biển nhân tạo, Schizochytrium mangrovei

sinh được 3,12 g/1 DHA. Như vậy, MnCl2 có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh

DHA từ Schizochytrium mangrovei [8].

Nhóm tác giả Quyền Đình Thi đã tiến hành nghiên cứu chủng vi sinh vật

biển Acinetobacter sp. QN6 có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào. Protease

là một nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh

vực, như công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc [9].

Gần đây, các nhà khoa học Nga đã phát hiện một loài vi sinh vật biển

Pseudomonas aeruginosa 1242 phân lập tại vùng biển Nha Trang có khả năng

chống gỉ. Việc sử dụng các tổ hợp enzyme và các hợp chất thứ cấp của chủng

Pseudomonas aeruginosa 1242 đã cho phép nghiên cứu chế tạo lớp sơn phủ

chống gỉ thân thiện với môi trường. Đây là hướng nghiên cứu đang được quan

tâm hiện nay [53].

Như vậy, các công bố đã cho thấy vi sinh vật biển Việt Nam rất đa dạng về

chủng loại. Trong số các loài đã được phát hiện là những loài mới, chưa được nhận

biết ở khu vực biển khác. Chính vì vậy, đây là đối tượng có nhiều tiềm năng khai

thác do các vi sinh vật biển đóng vai trò rất quan trọng trong môi trường sinh thái

biển. Các nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển của Việt Nam cho tới

nay hết sức khiêm tốn. Cho tới nay, các loài vi sinh vật biển của nước ta chưa được

khai thác về mặt hoạt tính sinh học, mặc dù đây là nguồn sản sinh các hợp chất thứ

cấp quan trọng đối với các sinh vật biển cộng sinh. Tuy nhiên, việc thu lượng lớn

các đối tượng sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi

nhiều công sức và kinh phí. Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi

sinh vật sẽ là hướng tiếp cận độc đáo và sáng tạo do chỉ cần thu 1 lượng mẫu nhỏ

phục vụ việc phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với lượng lớn trong

phòng thí nghiệm phục vụ việc nghiên cứu hóa học.

1.5. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium.

Photobacterium là một chi vi khuẩn gram âm, thuộc họ Vibrionaceae, một số

loài có khả năng phát quang. Hiện tại có khoảng 20 loài được biết đến trong

chi Photobacterium bao gồm: P.angustum, P. aplysiae, P.damselae, P. fischeri,

P.frigidiphilum, P. ganghwensem, P. halotolerans, P. histaminum, P. iliopiscariumal ,

P. indicum, P. leiognathi, P. lipolyticum, P. logei, P. phosphoreum, P.profundum,

P. rosenbergii, P. kishitanii ,P. lutimaris , P. aquimaris , P. gaetbulicola. Nhiều loài

trong chi này thường sống cộng sinh với sinh vật biển [49].

Một số loài của chi Photobacterium đã phát triển thành tác nhân gây

bệnh của sinh vật biển. Một số các bệnh ảnh hưởng đến loài cá và do đó có thể gián

tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe con người thông qua tiêu thụ cá thể nhiễm bệnh này.

Năm 2004, nhà khoa học Nhật Bản, Masashi Kanki đã tìm ra nguyên nhân gây bệnh

histamine ở loài cá là do loài Photobacterium phosphoreum [34]. Các

loài Photobacterium damselae là một trong những loài nguy hiểm nhất và được chia

thành hai phân loài: piscicida và damsel. Loài P. damselae gây bệnh tụ huyết

trùng trên loài cá. Chúng phát triển trên lá lách và thận cá, gây bệnh,cuối cùng gây

tử vong [56].

Năm 2010, Toshiki Mine đã nghiên cứu phản ứng enzym để chuyển N-

acetylneuraminic axit thành inositols (là chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình

phản ứng sinh hóa) sử dụng chất nền mang chủng vi khuẩn Photobacterium [52].

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long

(năm 2012) thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng

Staphylococcus aureus, Echerichia coli và nấm Fusarium oxysporum [50]. Trên thế

giới chưa có công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học và nghiên cứu các hợp chất

ngoại bào từ các loài thuộc chi Photobacterium.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long

(năm 2012) thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng

Staphylococcus aureus, Echerichia coli và nấm Fusarium oxysporum. Chủng vi

khuẩn này được PGS.TS Quyền Đình Thi (Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn

lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam) định tên.

2.2. Phương pháp lấy mẫu

Các mẫu bùn biển sẽ được lấy tại các địa điểm và độ sâu khác nhau tại vùng

Vịnh Hạ Long được lưu giữ trong các túi vô trùng. Sau đó, các mẫu này được bảo

quản trong đá lạnh trong thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm và được tiến

hành phân lập để thu các chủng vi sinh vật.

2.3. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển

+ Mẫu bùn biển nhận về sau khi để rã đông được cân 1g vào ống Fancol 50 ml.

+ Bổ xung 9 ml nước muối sinh lý, votex đều và lắc trên máy lắc trong 60 phút

sau đó mẫu được pha loãng ở các nồng độ cần thiết.

+ Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp.

+ Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.

+ Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri tiếp

theo từ nồng độ pha loãng thấp đến nồng độ pha loãng cao.

+ Đặt các đĩa petri trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian nhất

định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ.

+ Lựa chọn các khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ đặc trưng cho các mẫu sau đó cấy

ria các khuẩn lạc đó ra đĩa môi trường để làm thuần.

+ Các chủng vi sinh vật sau khi được làm thuần được giữ giống trong thạch

nghiêng và trong glycerol bảo quản -80°C.

2.4. Phương pháp nuôi cấy

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được hoạt hóa từ -800C bằng cách để rã

đông từ từ trong đá trong 30 phút. Sau đó được hút 0,2 ml vào trong ống nghiệm

10ml chứa 2 ml môi trường lỏng HKTS. Nuôi ở 28oC trong 24h lắc ở 200

vòng/phút. Hút 0,01 ml lên đĩa peptri chứa môi trường đặc và chải đều lên bề mặt thạch cho đến khô, nuôi ở 28oC trong 24h. Chọn khuẩn lạc mọc tốt cấy chuyển vào

ống nghiệm 15ml có chứa 6ml môi trường lỏng HKTS, nuôi ở trên máy lắc rung ở

28°C trong 24h lắc ở 200 vòng/phút, ta được giống cấp 1 để chuẩn bị cho việc nuôi

giống cấp 2.

Hình 2.1.Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật

Hút 6 ml dịch nuôi giống cấp 1 vào bình tam giác 100 ml có chứa 60 ml môi trường lỏng HKTS 28oC trong 24h, lắc ở 200 vòng/phút. Kết quả thu được 60 ml

giống cấp 2. Từ đây chuyển 50 ml giống cấp 2 vào bình tam giác 1000 ml có chứa 500 ml môi trường lỏng HKTS ở 37oC trong 5 ngày, lắc ở 200 vòng/phút. Kết quả

thu được 5 lít dịch tế bào, tiến hành ly tâm thu dịch ngoại bào để chuẩn bị cho

nghiên cứu thành phần hóa học chủng vi sinh vật nghiên cứu.

Thành phần môi trường HKTS (g/lít)

Peptone

Cao thịt

Cao men

0,2

NH4NO3

NaCl

KH2PO4

1,2

Agar

MgSO4

Glucose

+ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: HKTS (Hiếu Khí Tổng Số):

2.5. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được nuôi cấy thu được 5 lít dịch, dịch

nuôi cấy của chủng vi khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng trong 10

phút, thu dịch bỏ cặn tế bào. Sau đó cô dịch nước dưới áp suất giảm thu được 105 g

cặn thô, ngâm chiết bằng Etyl axetat 5 lần (3h/lần), sau đó ngâm chiết bằng MeOH

5 lần (5h/lần), loại dung môi thu được cặn chiết EtOAc và MeOH tương ứng. Các

phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ dịch

ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp.

Để phân tích và phân tách dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật, chúng tôi

đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát),

sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh với pha tĩnh là silicagel (Merck), sắc ký

cột pha đảo với chất hấp phụ là RP-18 và sắc ký rây phân tử sephadex LH-20.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silica gel

60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp

của một trong số các dung môi thường dùng như: n-hexan, diclorometan, etylaxetat,

axeton, metanol, cồn….

Sắc ký cột chỉ dùng cột thường với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200

mm (70-230 Mesh) của hãng Merck, rửa giải chủ yếu bằng các hệ dung môi n-

hexan/diclorometan, n-hexan/etylaxetat, n-hexan/axeton, diclorometan/metanol,

diclorometan/etyl axetat… với các tỷ lệ khác nhau.

Sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP-18 và hệ dung môi rửa giải là

MeOH/H2O.

Sắc ký cột sử dụng LH-20 làm pha tĩnh thường được rửa giải bằng metanol

hoặc hệ metanol/diclorometan (9/1 hoặc 8/2).

2.6. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ

dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật.

Việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch từ dịch

ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. nhờ sự phối hợp các dữ kiện

thu được từ các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phun mù

điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều

(COSY, HSQC, HMBC, NOESY).

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 (tại Viện Hóa học)bằng

phương pháp viên nén KBr. Phổ khối được đo trên máy Quardrupole LC/MS-

Agilent Technologes theo kiểu phun mù điện tử (ESI) tại Viện Hóa Sinh biển-Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

và hai chiều được đo trên máy Brucker Avance 500 (500 MHz), sử dụng TMS làm

chất chuẩn nội tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Độ quay cực được đo bằng máy Tasco P-2000 của hãng Jassco - Mỹ, điểm

nóng chảy được đo trên máy Mel Temp 3.0 của hãng Thermo Scientific - Mỹ tại

Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.7. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật

kiểm định

2.7.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Các chất được phân lập từ dịch ngoại bào chủng vi khuẩn Photobacterium sp.

được thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Viện

Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp thử độ

độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử

độc chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB-ung thư biểu mô (CCL-17TM) ở điều kiện in vitro. Sử dụng phương

pháp MTT assay: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh ở điều kiện 37oC, 5% CO2, độ ẩm 95%. Nồng độ tế bào dùng cho thử độc tính là 3x104/ mL. Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ thích hợp và được ủ cùng tế bào nuôi ở 37oC, 5% CO2/ 3 ngày. Sau 72 giờ nuôi cấy ủ với MTT

0,2 mg/mL trong 4 giờ. Dừng phản ứng với DMSO. Đọc OD trên máy quang phổ

bước sóng 540 nm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào)

được tính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào bằng phần

mền máy tính table curve [37].

2.7.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng

đa nồng độ F. Hadacek và H. Greger [29]. Vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở

người được sử dụng trong phép thử gồm:

- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử không gây bệnh.

- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (-), gây mủ các vết thương, vết

bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.

- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột

lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hóa của người và động vật.

- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hóa

như viên dạ dầy, viên đại tràng, viên ruột, viên lỵ trực khuẩn.

- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây

nhiễm trùng đường huyết gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng

trong tim, viêm ruột.

- Salmonella enteric: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn,

nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.

- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các

bệnh phụ khoa.

Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton

Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB

(Sabouraud - 2% dextrose broth) và SA (Sabouraud - 4% dextrose agar) cho nấm

men. Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành 1 dãy

5 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết

256 µg/ml và với chất sạch là 128 µg/ml. Lấy 10 µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 5.105 CFU/ ml, ủ ở 37oC/24h. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử

thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số

liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mền

raw data.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy

chủng vi khuẩn Photobacterium sp.

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được nuôi cấy sau 5 ngày thu được 5 lít

dịch, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào sau đó cô dịch

nước dưới áp suất giảm thu được 105 g cặn thô. Cặn chiết thô được tiến hành ngâm

chiết với etyl axetat và MeOH như được trình bày ở sơ đồ dưới đây (hình 3.1).

Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩnPhotobacterium sp.

Quá trình phân lập các chất từ cặn MeOH được trình bày trong hình 3.2.

Cặn chiết MeOH (23,5g) được tách thô trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi

etyl acetat/MeOH gradient thu được 9 phân đoạn ký hiệu từ FM1-FM9. Từ phân

đoạn FM4, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/

MeOH gradient thu được 8 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F4.1- F4.8. Tinh chế phân

đoạn F4.2 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/ CH2Cl2= 90/10 thu được

11 mg chất FM4.2.

Từ phân đoạn FM7, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung

môi CH2Cl2/MeOH/H2O gradient thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F7.1- F7.6.

Tinh chế FM7.3 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/CH2Cl2= 80/20, sau đó

tinh chế tiếp phân đoạn này bằng bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH gradient thu được 8 mg chất FM7.3.

Từ phân đoạn FM8, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung

môi CH2Cl2/ MeOH/ H2O gradient thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F8.1-

F8.6. Tinh chế phân đoạn F8.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/

MeOH/ H2O gradient thu được 15 mg chất FM8.4.

Các phân đoạn FM1, FM2, FM3 được gom vào cặn etyl acetat.

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH

Quá trình phân lập các chất cặn EtOAc được trình bày trong hình 3.3. Tiến

hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 9 phân

đoạn ký hiệu từ F1-F9. Từ phân đoạn F2, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel

với hệ dung môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu

từ F2.1- F2.5. Tinh chế phân đoạn F2.2 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung

môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 4,5 mg chất F2.2.

Từ phân đoạn F3, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

n-hexan/ aceton gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F3.1- F3.5. Tinh chế

phân đoạn F3.3 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ diclometan

gradient thu được 4 mg chất F3.3.1 và 3 mg chất F3.3.2.

Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc

Gộp 2 phân đoạn F4 và F5 (ký hiệu lại là F4-5), từ phân đoạn F4-5, sau khi

tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient thu

được 7 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F5.1- F5.7. Tinh chế phân đoạn F5.1 bằng cột sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient thu được 6 mg chất

F5.1.Tinh chế phân đoạn F5.4 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được chất F5.4, chất này được kết tinh lại bằng hệ n-

hexan/ Aceton: 85/15 thu được 4 mg chất F5.4. Tinh chế phân đoạn F5.5 bằng cột

sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được chất F5.5,

chất này được kết tinh lại bằng hệ n-hexan/ Aceton: 85/15 thu được 4 mg chất F5.5.

Từ phân đoạn F7, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 3 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F7.1- F7.3. Tinh chế

phân đoạn F7.2 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/ CH2Cl2: 85/15 thu được

4 mg chất F7.2.

Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 4 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F8.1- F8.4. Tinh chế

phân đoạn F8.2 bằng bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ EtOAc

gradient thu được thu được 7 mg chất F8.2.

3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch

ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp.

3.2.1. Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH

1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4)

25-97,5o (c 0,52; MeOH).

Chất dầu màu vàng; Rf= 0,35 (CH2Cl2/ MeOH: 80/20);

Độ quay cực [α]D

ESI-MS: m/z 212 [M+H]+ (C10H17N3O2).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 2,05 (4H, m, CH2-4 + H-3’α + H-

IR (KBr) νmax (cm-1) 3461; 3297; 1645; 1586; 1388; 583; 493.

4’α); 2,20 (1H, m; H-4’β); 2,37 (1H, m, H-3’β); 2,39 (2H, m, CH2-3); 3,68 (2H, m;

CH2-5); 4,35 (1H, m, H-5’α); 4,43 (1H, m, H-5’β); 4,47 (1H, dd, J= 2,5; 9,0 Hz; H-

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC (ppm) 22,2 (C-4); 24,0 (C-4’); 29,3 (C-

2’); 5,12 (1H, dd, J= 3,0; 8,5 Hz; H-2).

3’); 30,3 (C-3); 47,1 (C-5); 51,6 (C-5’); 61,7 (C-2’); 65,7 (C-2); 175,0 (C-6’);

177,1 (C-6).

Uracil (FM7.3)

Chất rắn màu trắng; đnc. 320- 323oC; Rf= 0,45 (CH2Cl2/ MeOH/ H2O:

77/20/3 ).

ESI-MS: m/z 111 [M-H]- (C4H4N2O2).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD &CDCl3): δH (ppm) 5,63 (1H, d, J= 8,0 Hz; H-

IR (KBr) νmax (cm-1) 3484; 1721; 1650; 1416; 1233; 539; 508.

13C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC (ppm) 100,3 (C-5); 142,2 (C-6);

5); 7,35 (1H, d, J= 8,0 Hz; H-6).

151,6 (C-2); 164,4 (C-4).

Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2)

Chất rắn màu trắng; đnc. 213oC; Rf= 0,55 (CH2Cl2/ MeOH: 90/10); Độ quay 25 -153,6o (c 0,46; MeOH). cực [α]D

ESI-MS: m/z 155 [M+H]+ (C7H10N2O2).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,98 (1H, m, H-4α); 2,01 (1H, m,

IR (KBr) νmax (cm-1) 3406; 2929; 1744; 1650; 1431; 1382; 707; 543.

H-5α); 2,05 (1H, m, H-4β); 2,34 (1H, m, H-5β); 3,56 (2H, m, CH2-3); 3,76 (1H,

d, J= 17,0 Hz; H-9α); 4,13 (1H, dt, J= 17,0 Hz; H-9β); 4,25 (1H, td, J= 2,0; 9,0

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 23,3 (C-4); 29,4 (C-5); 46,3 (C-3);

Hz; H-6).

46,9 (C-9); 59,8 (C-6); 166,5 (C-1); 172,0 (C-7).

3.2.2. Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat

N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5)

Chất rắn màu trắng; đnc. 155- 156oC; Rf= 0,45 ( CH2Cl2/ MeOH: 9/1); [α]D

+12o (c 0,20; MeOH).

ESI-MS: m/z 193 [M+Na]+ (C8H14N2O2).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,42 (1H, m, H-6a); 1,49 (1H, m,

IR (KBr) νmax (cm-1) 3409; 2939; 1642; 1441; 542; 440; 483.

H-4a); 1,87 (2H, m, H-6b + H-5a); 2,00 (1H, m, H-5b); 2,01 (3H, s, CH3); 2,09

(1H, m, H-4b); 3,27 (2H, m, CH2-7); 4,52 (1H, m, CH-3); 6,92 (1H, s, NH); 7,29

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 23,3 (CH3); 27,9 (C-5); 28,9 (C-6);

(1H, s, NH).

31,7 (C-4); 42,2 (C-7); 52,2 (C-3); 169,3 (C-9); 175,7 (C-2).

Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4)

25 -78,2o (c 0,32; MeOH).

Chất rắn màu trắng; đnc. 140- 141oC; Rf= 0,35 (CH2Cl2/ EtOAc: 80/20); Độ

quay cực [α]D

ESI-MS: m/z 207 [M+K]+ (C8H12N2O2).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,47 (3H, d, J= 7,0 Hz, CH3-10);

IR (KBr) νmax (cm-1) 3421; 2929;1660; 1558; 1440; 1180; 607.

1,91 (1H, m, H-4α); 2,04 (1H, m, H-4β); 2,14 (1H, m, H-5α); 2,35 (1H, m, H-5β);

3,57 (2H, m, CH2-3); 4,12 (2H, m, H-6 + H-9).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 16,0 (CH3-10); 22,8 (C-4); 28,2 (C-

5); 45,5 (C-3); 51,2 (C-9); 59,3 (C-6); 166,3 (C-1); 170,3 (C-7).

Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1)

Chất rắn màu trắng; đnc. 147- 148oC; Rf= 0,41 (n-hexan/ Aceton: 70/30); Độ

25 -83,8o (c 0,18; MeOH). ESI-MS: m/z 249 [M+K]+(C11H18N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3475; 2929;1663; 1557; 1180; 607. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 0,95 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-13);

quay cực [α]D

1,00 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-12); 1,52 (1H, ddd, J= 5,0; 9,5; 14,5 Hz; H-10α); 1,73

(1H, m, H-11); 1,91 (1H, m, H-4α); 2,05 (1H, m, H-4β); 2,08 (1H, m, H-10β); 2,13

(1H, m, H-5α); 2,34 (1H, m, H-5β); 3,56 (2H, m, CH2-3); 4,02 (1H, dd, J= 3,5; 9,5

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 21,2 (C-13); 22,7 (C-4); 23,3 (C-12);

Hz; H-9); 4,12 (1H, t, J= 8,0 Hz; H-6).

24,7 (C-11); 28,1 (C-5); 38,7 (C-10); 45,5 (C-3); 53,4 (C-9); 59,0 (C-6); 166,2 (C-

1); 170,2 (C-7).

Indole-3-carbonitrile (F3.3.1)

Chất rắn màu trắng; đnc. 178- 179oC; Rf= 0,35 (n-hexan/ CH2Cl2: 3/7)

ESI-MS: m/z 143 [M+H]+ (C9H6N2).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 7,31 (1H, dt, J= 1,5; 7,5 Hz; H-6);

IR (KBr) νmax (cm-1) 3413, 3265, 2918, 2219, 1626, 1436

7,35 (1H, dt, J= 1,0; 7,5 Hz; H-5); 7,47 (1H; d, J= 7,5 Hz; H-7); 7,74 (1H; d, J= 3,0

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 87,9 (C-3); 111,9 (C-7); 115,7

Hz; H-2); 7,79 (1H; J= 7,5 Hz; H-4).

(C-8); 119,8 (C-4); 122,5 (C-6); 124,4 (C-5); 127,0 (C-3a); 131,7 (C-2); 134,9

(C-7a).

Thymine (F7.2)

Chất rắn màu trắng; đnc. 320- 323oC; Rf= 0,35 (CH2Cl2/ MeOH: 90/10).

ESI-MS: m/z 127 [M+H]+ (C5H6N2O2).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD &CDCl3): δH (ppm) 1,87 (3H, s, CH3); 7,15

IR (KBr) νmax (cm-1) 3442; 2926; 1731; 1673; 1436; 1206; 854; 547; 483.

13C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC (ppm) 12,2 (CH3); 110,3 (C-5);

(1H, s, H-6).

138,6 (C-6); 156,5 (C-2), 168,9 (C-4).

3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2)

25 -68,3o (c 0,36; MeOH).

Chất rắn màu trắng; đnc. 228-229oC; Rf= 0,55 (CH2Cl2/ EtOAc: 20/80); Độ

quay cực [α]D

ESI-MS: m/z 129 [M+H]+ (C5H8N2O2).

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δH (ppm) 1,25 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3); 3,72 (2H, s, CH2-6); 3,84 (1H, quartet, J=7,0 Hz; CH-3); 7,97 (1H, s, NH); 8,15

IR (KBr) νmax (cm-1) 3461; 2930; 1662; 1464; 1102; 598; 546; 468.

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δC (ppm) 18,7 (CH3); 44,5 (CH2-6); 49,7

(1H, s, NH).

(CH-3); 166,3 (C-5); 168,9 (C-2).

Axit benzoic (F2.2)

Tinh thể hình kim không màu, đnc. 122-123 oC, Rf = 0,34 (n- hexan/

EtOAc: 70/30).

IR (KBr) νmax ( cm-1): 3060- 2565, 1682, 1577, 1423, 1291, 1186, 1054, 935,

803, 714, 652, 543, 466.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD & CDCl3): δH (ppm) 7,98 (2H, d, J=7,5 Hz, H-

ESI-MS: m/z 121 [M-H]- (C7H6O2).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC (ppm) 127,30 (C-3 + C-5);

2+ H6); 7,42 (1H, t, J=7,0 Hz, H-4); 7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-3+H-5).

128,78 (C-1); 130,49 (C-2 + C6); 135,1 (C-4); 172,3 (C=O).

4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2)

Chất rắn màu trắng; đnc. 91-92oC; Rf= 0,35 ( n-hexan/ CH2Cl2: 70/30).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 3,32 (2H, t, J = 7,5 Hz; H-7); 4,57 (2H, t, J = 7,0 Hz; H-8); 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-2+ H-6); 7,07 (2H, d, J = 8,5

ESI-MS: m/z 139 [M+H]+ (C8H10O2).

Hz; H-3+ H-5).

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch

chiết MeOH

Quá trình xử lý mẫu, chiết và phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi

cấy chủng Photobacterium sp. đã được trình bày chi tiết trong mục 3.1. Từ cặn chiết

MeOH, đã có 3 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học gồm 1-

(pyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4); Uracil (FM7.3);

Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) (hình 4.1).

Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cặn MeOH

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được xác định nhờ phân tích các

dữ liệu phổ bao gồm phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài

liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết.Việc xác định cấu trúc của

các hợp chất được trình bày dưới đây.

4.1.1. Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4)

Hợp chất FM8.4 được phân lập dưới dạng chất dầu màu vàng; Độ quay cực 25 -97,5o (c 0,52; MeOH). Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân [α]D tử proton hóa ở m/z 212 [M+H]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3461 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1645 và 1586 (cm-1) đặc trưng cho

dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (C=O).

CTPT:C10H17N3O2

Hình 4.2. Phổ khối của FM8.4

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm metin có độ chuyển dịch

hóa học ở trường thấp tại δH 4,47 (1H, dd, J= 2,5; 9,0 Hz; H-2’); 5,12 (1H, dd, J=

3,0; 8,5 Hz; H-2). Điều này cho phép xác định 2 nhóm metin này gắn với dị nguyên

tử. Đồng thời, tín hiệu của 12 proton trong vùng δH 2,05-4,43 cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR.

Phổ 13C-NMR với sự trợ giúp của HSQC cho phép xác định có 10 nguyên tử cacbon trong phân tử tương ứng với 2 nhóm metin lai hóa sp3 ở δC 61,7 (C-2’); 65,7

(C-2); 6 nhóm metylen trong đó có 2 nhóm metylen liên kết với nitơ ở δC 47,1 (C-

5); 51,6 (C-5’) và 4 nhóm metylen ở δC 22,2 (C-4); 24,0 (C-4’); 29,3 (C-3’); 30,3

(C-3) và 2 cacbon nhóm cacbonyl ở δC 175,0 (C-6’); 177,1 (C-6).

Bảng 4.1. Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz) của FM8.4

Vị trí

H m (J, Hz)

C

1’

2’

65,7; CH

61,7; CH

5,12 (1H, dd, J= 3,0; 8,5 Hz)

4,47 (1H, dd, J= 2,5; 9,0 Hz)

2,39 (2H, m)

3’

2,05 (1H, m)

30,3; CH2

29,3; CH2

2,37 (1H, m)

2,05 (2H, m)

4’

2,05 (4H, m)

22,2; CH2

24,0; CH2

2,20 (1H, m)

3,68 (2H, m)

5’

4,35 (1H, m)

47,1; CH2

51,6; CH2

4,43 (1H, m)

6’

177,1; C=O

175,0; C=O

H-2

CH2-5

H-2’

Hình 4.3. Phổ 1H-NMR giãn rộng của FM8.4

C-4

C-3’

C-5’

C-3

C-4’

C-5

C-2

C-2’

Hình 4.4. Phổ 13C-NMR giãn rộng của chất FM8.4

Hình 4.5. Phổ COSY của chất FM8.4

Hình 4.6. Phổ HMBC của chất FM8.4 Phổ COSY cho phép xác định 2 chuỗi tương tác spin-spin: H-2’/CH2-

3’/CH2-4’/CH2-5’ và chuỗi tương tác của các proton từ H-2/CH2-3/CH2-4/CH2-5

(được biểu diễn bằng các liên kết đậm trên) (hình 4.7).

Trên phổ HMBC cho tương tác giữa H-2’ với C-3’, C-4’ và C-6’ cho phép

xác định nhóm cacbonyl C-6’ liên kết với vòng pyrrolidin tại vị trí C-2’ và tương

tác giữa H-2 với C-3, C-4, C-6 cho phép xác định cacbonyl C-6 gắn với vòng pyrrolidin thứ 2 tại C-2. Phân tích chi tiết dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, 25 -97,5o (c 0,52; MeOH) và so sánh với tài liệu HSQC, HMBC, độ quay cực [α]D

tham khảo cho phép xác định chất FM8.4 là 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)

pyrrolidine-2-carboxamide, cấu hình tuyệt đối được xác định là 2S, 2’S [15]. Hợp

chất này đã được tổng hợp toàn phần năm 2012 và đây là lần đầu tiên hợp chất này

được phân lập từ thiên nhiên [15].

Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất FM8.4

4.1.2. Hợp chất Uracil (FM7.3)

Hợp chất FM7.3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 320- 323oC. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa ở m/z 111 [M-H]-. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3413 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1721 và 1651 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị

của 2 nhóm cacbonyl (C=O).

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton metin olefinic ở δH 5,63 (1H, d, J = 8,0 Hz; H-5); 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz; H-6). Trên phổ 13C-NMR của

FM7.3 cho tín hiệu của 2 cacbon nhóm metin olefin tại δC 100,3 (C-5); 142,2 (C-6)

và 2 cacbon bậc 4 ở δC 151,6 (C-2); 164,4 (C-4).

Từ các dữ liệu phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định

chất FM7.3 là uracil [18].

4.1.3. Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2)

Hợp chất FM4.2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc 213oC, độ 25 -153,6o (c 0,46; MeOH). Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic quay cực [α]D ion phân tử proton hóa ở m/z 155 [M+H]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3421 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1744; 1660 (cm-1) đặc

trưng cho dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (C=O).

Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của chất FM4.2 cho thấy phân tử có 7

cacbon bao gồm 4 nhóm metylen ở δC 23,3 (C-4); 29,4 (C-5); 46,3 (C-3); 46,9 (C-

9). Độ chuyển dịch hoá học của 2 nhóm metylen ở δC 46,3 (C-3); 46,9 (C-9) cho

phép xác định 2 nhóm metylen này có liên kết với nguyên tử nitơ; 1 nhóm metin sp3

liên kết với nitơ ở δC 59,8 (C-6); 2 nhóm cacbonyl tại δC 166,5 (C-1); 172,0 (C-7).

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metin gắn với nitơ tại δH 4,25

(1H, td, J = 2,0; 9,0 Hz; H-6). Tín hiệu của 8 proton ở δH 1,98 (1H, m, H-4α); 2,01

(1H, m, H-5α); 2,05 (1H, m, H-4β); 2,34 (1H, m, H-5β); 3,56 (2H, m, CH2-3); 3,76

(1H, d, J = 17,0 Hz; H-9α); 4,13 (1H, dt, J = 17,0 Hz; H-9β) cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR. Dựa vào phổ HSQC cho phép xác định 8 proton này thuộc

về 4 nhóm metylen, đồng thời dựa vào độ chuyển dịch hóa học của chúng cho phép

xác định có 2 nhóm metylen liên kết với nitơ (CH2-3 và CH2-9).

Trên phổ HMBC cho tương tác xa giữa H-6 với C-5, C-3 và C-7; tương tác

giữa H-3 với C-6, C-5, C-4, C-1 cho phép xác định liên kết giữa C-6 với C-1 và C-3

qua nguyên tử nitơ. Đồng thời tương tác giữa H-9 với cacbonyl C-1 và C-7 cho

phép xác định liên kết giữa C-9 với C-7 qua nguyên tử nitơ. Từ các dữ liệu phổ 1D, 25 -153,6o (c 0,46; MeOH) và so sánh với tài liệu tham 2D-NMR, độ quay cực [α]D

khảo cho phép xác định chất FM4.2 là Cyclo-(Pro-Gly), cấu hình tuyệt đối được

xác định là 6S [19, 41].

Hình 4.8. Một số tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất FM4.2

4.2. Các chất phân lập được từ cặn Etyl acetat

Từ cặn chiết Etyl acetat đã có 8 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu

trúc hóa học gồm N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5); Cyclo-(Pro-Ala)

(F5.4); Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1); Indole-3-carbonitrile (F3.3.1); Thymine (F7.2);

3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2); Axit benzoic (F2.2); 4-(2-hydroxy ethyl)

phenol (F3.3.2) (hình 4.9).

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này đã được xác định nhờ phân tích các

dữ liệu phổ bao gồm phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài

liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết. Việc xác định cấu trúc của

các hợp chất được trình bày dưới đây.

Hình 4.9. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cặn Etyl acetat

4.2.1. N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5)

Hợp chất F5.5 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 155- 156oC, 25 +12o (c 0,20; MeOH). Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho độ quay cực [α]D pic ion giả phân tử ở m/z 193 [M+Na]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3409 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1642 (cm-1) đặc trưng

cho dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (C=O).

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metin sp3 về phía trường thấp ở

δH 4,52 (1H, m, CH-3), tín hiệu của nhóm metylen gắn với nitơ ở δH 3,27 (2H, m,

CH2-7), tín hiệu 1 nhóm metyl tại δH 2,01 (3H, s, CH3), tín hiệu singlet của 2 nhóm

[M+Na]+

NH ở δH 6,92 và 7,29.

Hình 4.10. Phổ khối của chất F5.5

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy phân tử có 8 cacbon tương ứng với 1 nhóm methyl ở δC 23,3 (CH3); 1 nhóm metin sp3 ở 52,2 (C-3); 4 nhóm metylen sp2 ở 27,9 (C-5); 28,9 (C-6); 31,7 (C-4); 42,2 (C-7); 2 nhóm cacbonyl ở δC

169,3 (C-9); 175,7 (C-2).

Bảng 4.2. Dữ kiện phổ 1H-NMR (CDCl3; 500 MHz) và 13C-NMR (CDCl3; 125 MHz) của F5.5

Vị trí 1

C -

H m (J, Hz) -

Vị trí 6

H m (J, Hz) 1,42 (1H, m)

C 28,9; CH2

7 8 9

42,2; CH2 - 169,3; C=O

1,87 (1H, m) 3,27 (2H, m) - -

2 3 4

- 4,52 (1H, m) 1,49 (1H, m)

175,7; C=O 52,2; CH 31,7; CH2

2,01 (3H, s)

2,09 (1H, m) 1,87 (1H, m)

27,9; CH2

23,3; CH3

2,00 (1H, m)

CH3

CH2-7

CH-3

CH2-4

CH2-7

CH2-5

CH-3

CH3

C=O

Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của chất F5.5

Hình 4.12. Phổ 13C-NMR của chất F5.5

Hình 4.13. Phổ COSY của chất F5.55

Hình 4.14. Phổ HMBC của chất F5.5

Phân tích phổ COSY cho phép xác định chuỗi tương tác spin-spin của các

proton từ H-3 đến CH2-7 được biểu diễn bằng các liên kết đậm trên hình 4.15. Trên

phổ HMBC, cho thấy tương tác xa của H-3 và H-7 với C-2 chứng tỏ C-7 liên kết với

C-2 qua nguyên tử nitơ; tương tác của CH3-10 và H-3 với C-9 chứng tỏ nhóm acetyl cũng liên kết với C-3 qua nguyên tử nitơ. Từ các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, 25 +12o (c 0,20; MeOH) và so sánh với tài COSY, HSQC, HMBC, độ quay cực [α]D

liệu tham khảo cho phép xác định chất F5.5 là N-(2-oxoazepan-3-yl)acetamide, cấu

hình tuyệt đối được xác định là 3R [23,33]. Hợp chất này đã được tổng hợp năm 1989

và đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ thiên nhiên [33].

Hình 4.15. Tương tác chính trên phổ COSY ( ) , HMBC ( ) của chất F5.5

4.2.2. Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4)

Hợp chất F5.4 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 140- 141oC, 25 -78,2o (c 0,32; MeOH). Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho độ quay cực [α]D pic ion phân tử ở m/z 207 [M+K]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3421 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1660 (cm-1) đặc trưng cho

dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (C=O).

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của F5.4 rất giống với chất FM4.2. Khác với chất FM4.2, trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của F5.4 thấy mất đi tín hiệu của 1

nhóm metylen gắn với nitơ, thay vào đó thấy xuất hiện thêm tín hiệu của 1 nhóm metyl và 1 nhóm metin sp3.

Trên phổ 13C-NMR cho thấy sự có mặt của 8 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nhóm metin lai hóa sp3 ở δC 51,2 (C-9); 59,3 (C-6); 1 nhóm metylen gắn với nguyên

tử nitơ ở δC 45,5 (C-3) và 2 nhóm metylen ở δC 22,8 (C-4); 28,2 (C-5); 1 nhóm

metyl ở δC 16,0 (C-10); 2 nhóm cacbonyl ở 166,3 (C-1); 170,3 (C-7).

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm methyl ở δH 1,47 (3H, d, J = 7,0

Hz, CH2-10), tín hiệu của nhóm metin gắn với nitơ ở δH 4,12 (1H, m, H-9); 4,12

(1H, m, H-6); tín hiệu của nhóm metylen tại δH ở 1,91 (1H, m, H-4α); 2,04 (1H, m,

H-4β); 2,14 (1H, m, H-5α); 2,35 (1H, m, H-5β); 3,57 (2H, m, CH2-3) cũng được xác định dựa vào phổ 1H-NMR và phổ HSQC.

Tương tác xa giữa nhóm metyl (CH3-10) với C-9 và C-1 trên phổ HMBC chứng tỏ rằng nhóm metyl này được gắn với cacbon C-9. Từ các dữ liệu phổ 1H- 25 -78,2o (c 0,32; MeOH) và so NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, độ quay cực [α]D

sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất F5.4 là Cyclo-(Pro-Ala), cấu

hình tuyệt đối được xác định là 6S, 9S [55, 57].

Hình 4.16. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.4

4.2.3. Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1)

Hợp chất F5.1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 147- 148oC, 25 -83,8o (c 0,18; MeOH). Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho độ quay cực [α]D pic ion phân tử ở m/z 249 [M+K]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3475 (cm-1) đặc

trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1663 (cm-1) đặc trưng cho

dao động hóa trị của nhóm cacbonyl (C=O).

Phổ 13C-NMR và 1H-NMR của F5.1 rất giống với chất F5.4. Điều này cho

phép xác định chất F5.1 có bộ khung tương tự F5.4, khác với chất F5.4 là thấy xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm isobutyl thay vì 1 nhóm metyl. Phổ 13C-NMR cho thấy phân tử có 11 cacbon, trong đó có 3 nhóm metin lai hóa sp3 ở δC 24,7 (C-11); 53,4

(C-9); 59,0 (C-6); 1 nhóm metylen liên kết trực tiếp với nitơ ở δC 45,5 (C-3); 3

nhóm metylen ở δC 22,7 (C-4); 28,1 (C-5); 38,7 (C-10); 2 metyl ở δC 21,2 (C-13);

23,3 (C-12); 2 nhóm cacbonyl ở 166,2 (C-1); 170,2 (C-7).

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl ở δH 0,95 (3H, d, J = 6,5

Hz, CH3-13); 1,00 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-12), tín hiệu của nhóm metin gắn với

nitơ ở δH 4,02 (1H, dd, J = 3,5; 9,5 Hz; H-9); 4,12 (1H, t, J = 8,0 Hz; H-6); tín hiệu

nhóm metylen ở δH 3,56 (2H, m, CH2-3).

Phổ HMBC cho tương tác xa giữa H-10 với CH3-12, CH3-13, C-11, C-9 và C-1 cho phép xác định nhóm isobutyl gắn với cacbon C-9. Từ các dữ liệu phổ 1H- 25 -83,8o (c 0,18; MeOH) và so NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, độ quay cực [α]D

sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất F5.1 là Cyclo-(Leu-Pro), cấu

hình tuyệt đối được xác định là 6S, 9S [18].

Hình 4.17. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.1

4.2.4. Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1)

Hợp chất F3.3.1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 178- 179oC. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 143 [M+H]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3413 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 2219 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm nitril (CN).

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm ở δH 7,31 (1H, dt,

J = 1,0; 7,0 Hz; H-5); 7,35 (1H, dt, J = 1,0; 7,0 Hz; H-6); 7,47 (1H; J = 7,5 Hz; H-7); 7,74 (1H; J = 3,0 Hz; H-2); 7,79 (1H; J = 7,5 Hz; H-4). Phổ13C-NMR kết

hợp với phổ HSQC cho thấy phân tử có 9 cacbon tương ứng với 5 nhóm metin lai hóa sp2 ở δC 111,9 (C-7); 119,8 (C-4); 122,5 (C-6); 124,4 (C-5); 131,7 (C-2);

4 cacbon bậc 4 ở δC 87,9 (C-3); 127,0 (C-3a); 134,9 (C-7a) và 1 nhóm nitril (CN)

ở δC 115,7 (C-8).

Trên phổ HMBC của F3.3.1 cho thấy tương tác xa giữa H-2 với C-3, C-

3a, C-7a; chứng tỏ C-2 liên kết với vòng benzen ở C-3a và C-7a qua C-3 và nguyên tử nitơ tạo thành vòng pyrole. Từ các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR,

HSQC, HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất F3.3.1

là indole-3-carbonitrile [45].

) của chất F3.3.1 Hình 4.18. Tương tác chính trên phổ HMBC (

4.2.5. Hợp chất Thymine (F7.2)

Hợp chất F7.2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 320- 323oC.

Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 127

[M+H]+. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3441 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ νmax 1731 và 1673 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị của

2 nhóm cacbonyl (C=O).

Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metin sp2 ở δH 7,15 (1H, s, H-6) và 1 nhóm metyl ở δH 1,87 (3H, s, CH3). Phân tích phổ 13C-NMR của F7.2 cho tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon, trong đó có 1 nhóm metin sp2 ở δC 138,6 (C-6); 1

cacbon bậc 4 ở δC 110,3 (C-5) và 1 nhóm metyl ở δC 12,2 (CH3) và 2 nhóm

cacbonyl liên kết với nitơ ở 156,5 (C-2), 168,9 (C-4).

Từ các dữ liệu phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định

chất F7.2 là Thymine [42].

4.2.6. Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2)

25 -68,3o (c 0,36; MeOH). Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho

Hợp chất F8.2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc 228-229oC,

độ quay cực [α]D pic ion phân tử proton hóa ở m/z 129 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử C5H8N2O2. Phổ IR có dải hấp thụ ở νmax 3461 và 1662 (cm-1) đặc trưng cho dao

động hóa trị nhóm NH và nhóm cacbonyl (C=O).

Phân tích phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metyl tại δH (ppm)

1,25 (3H, d, J = 7,0 Hz; CH3), nhóm metyl này bị phân tách thành doublet chứng tỏ

nhóm này liên kết với nhóm metin tại δH 3,84 (1H, quartet, J = 7,0 Hz; H-3), dựa

vào độ chuyển dịch hóa học của nhóm metin này cho phép xác định nhóm này liên kết với nguyên tử nitơ. Ngoài ra, tín hiệu của 1 nhóm metylen sp3 tại δH 3,72 (2H, s, CH2-6) cũng được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR.

Phổ 13C-NMR của F8.2 cho tín hiệu của 5 nguyên tử cacbon, trong đó có 1 nhóm metyl ở δC 18,7 (CH3); 1 nhóm metylen sp2 ở δC 44,5 (CH2-6), 1 nhóm

metin sp3 ở δC 49,7 (CH-3) và 2 nhóm cacbonyl gắn với nitơ ở δC 166,3 (C-5) và

25 -68,3o (c 0,36; MeOH) và so

168,9 (C-2).

Từ các dữ liệu phổ NMR, độ quay cực [α]D

sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất F8.2 là 3-metyl pipererazine-2,5

dion, cấu hình tuyệt đối được xác định là 3S [58].

4.2.7. Hợp chất Axit benzoic (F2.2)

Hợp chất F2.2 phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa ở m/z 121 [M-H]- phù

hợp với công thức phân tử C7H6O2. Trên phổ IR có các đỉnh hấp phụ đặc trưng cho các nhóm chức ở νmax( cm-1): 3060- 2565 (OH của axit), 1682 (C=O).

Phổ 13C-NMR của F2.2 cho tín hiệu của 7 nguyên tử cacbon trong đó có 1

nhóm cacbonyl ở δC 172,3; 5 cacbon vòng thơm ở δC 127,30 (C-3 + C-5); 130,49 (C-2 + C6); 135,1 (C-4) và 1 cacbon thơm bậc 4 ở δC 128,78 (C-1). Trên phổ 1H-

NMR, xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng thơm ở δH 7,98 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2+

H6); 7,42 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-4); 7,35 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-3+H-5).

Từ các dữ liệu phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định

chất F2.2 là axit benzoic [26].

4.2.8. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2)

Hợp chất F3.3.2 phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, đnc 91-92oC. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 139 [M+H]+

phù hợp với công thức phân tử C8H10O2.

Phân tích phổ 1H-NMR, nhận thấy tín hiệu các proton vòng thơm dạng A2B2

ở δH 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-2+ H-6); 7,07 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-3+ H-5), chứng tỏ vòng benzen có các nhóm thế ở vị trí para với nhau. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR

xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm metylen lai hóa sp3 liên kết với nhau ở δH 3,32 (2H, t,

J = 7,0 Hz; CH2-7); 4,57 (2H, t, J = 7,0 Hz; CH2-8). Từ các dữ liệu phổ NMR và so

sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất F3.3.2 là 4-(2-hydroxy ethyl)

phenol [47].

4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập

Một số hợp chất được phân lập từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng

Photobacterium sp. được thử hoạt tính độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư biểu

mô KB tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết

quả cho thấy các hợp chất phân lập được không có hoặc có hoạt tính rất yếu với

dòng tế bào ung thư biểu mô KB (bảng 4.3).

Bảng 4.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập

Nồng độ phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào dòng KB (%)

STT

Tên mẫu

IC50 (µg/ml)

128 µg/ml

32 µg/ml

8 µg/ml

2 µg/ml

0,5 µg/ml

F3.3.1

>128

F5.1

21,5

>128

F5.4

15,5

>128

F5.5

55,5

26,5

109,7

F7.2

>128

F4.2

28,5

21,5

>128

FM7.3

42,5

>128

FM8.4

35,5

93,8

F8.2

>128

Ellipticine

0,35

4.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập

Một số hợp chất được phân lập từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn

Photobacterium sp. được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Viện Hóa

học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả cho thấy các hợp

chất phân lập được không có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Kết quả được

trình bày trong (bảng 4.4). Có thể thấy rằng, các hợp chất phân lập được từ dịch

ngoại bào của chủng vi khuẩn Photobacterium sp. không thể hiện hoạt tính kháng vi

sinh vật kiểm định trên các chủng thử nghiệm.

Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vât và nấm kiểm định - IC50 (g/ml)

Gram (+)

Gram (-)

Nấm

Tên

STT

mẫu

Pseudomonas

Staphylococcus

Bacillus

Lactobacillus

Salmonella

Escherichia

Candida

aureus

subtilis

fermentum

enterica

coli

albican

aeruginosa

F 33.1

> 128

F 5.1

> 128

F 5.4

> 128

F5.5

> 128

F 7.2

> 128

FM4.2

> 128

FM7.3

> 128

FM8.4

> 128

F 8.2

> 128

Như vậy, quá trình phân lập chưa nhận diện được hợp chất thể hiện hoạt tính

ở dịch chiết ban đầu. Điều này cho thấy hợp chất mang hoạt tính có hàm lượng quá

thấp nên chưa phân lập được, hoặc hợp chất có hoạt tính đã bị phân hủy chuyển hóa

thành các chất không còn hoạt tính trong quá trình xử lý dịch chiết và tinh chế.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong quá trình thực hiện luận văn này, chúng tôi đã thu được các kết quả

nghiên cứu mới như sau:

Về nghiên cứu hóa học

Lần đầu tiên nghiên cứu về các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy của chủng vi

khuẩn Photobacterium sp.

Từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. ở Vịnh Hạ

Long- Việt Nam, bằng cách sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp với các

phương pháp phổ, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 11 hợp chất.

Đó là 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4); Uracil

(FM7.3); Cyclo-(Pro-Gly (FM4.2); N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5); Cyclo-

(Pro-Ala) (F5.4); Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1); Indole-3-carbonitrile (F3.3.1); Thymine

(F7.2); 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2); Axit benzoic (F2.2); 4-(2-hydroxy

ethyl) phenol (F3.3.2)

Trong số 11 hợp chất trên thì 2 hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-

2-carboxamide (FM8.4) và N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) là các hợp chất

lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên.

Về hoạt tính sinh học

Đã thử hoạt tính các hợp chất phân lập được hoạt với dòng tế bào ung thư

biểu mô KB và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Tuy nhiên, các hợp chất phân

lập được đều không hoặc có hoạt tính yếu với dòng tế bào ung thư biểu mô KB và

hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.

Kiến Nghị

Các kết quả nghiên cứu trong luận văn cho thấy dịch ngoại bào nuôi cấy

chủng vi khuẩn Photobacterium sp. có cấu trúc hóa học thú vị. Tuy nhiên chưa

xác định được hợp chất có hoạt tính trong dịch chiết ban đầu. Do vậy, cần tiến

hành nghiên cứu hóa học trên lượng dịch sinh khối lớn hơn, đồng thời cần thực

hiện phân lập theo phép thử sinh học dẫn đường để có thể xác định được sự có

mặt của hợp chất mang hoạt tính trong từng công đoạn của quá trình xử lý và

phân tách.

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN

Vũ Văn Nam, Trịnh Thị Thanh Vân, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai

Hương, Châu Văn Minh, “Phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy của

chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp.”, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ,

2014 (đang gửi đăng).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Hải Đăng (2007), Các hợp chất

có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật,

Hà Nội.

2. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Hoài Nam,

Phạm Văn Cường (2012), Dược liệu biển Việt Nam thực trạng và cơ hội phát

triển, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.

3. Hoàng Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng (2008), “Biểu hiện đoạn gien mã hóa

cho enzyme elongages tham gia vào quá trình tổng hợp DHA của

Labyrinthula-một loài tảo biển dị dưỡng giàu axit béo không bão hòa omega-

3”, Tạp chí Hóa học, 46, 736-771.

4. Lại Thúy Hiền, Vương Thị Nga, Nguyễn Thị Yên, Nguyễn Bá Tú (2007),

“Đa dạng vi sinh vật tại biển đảo Cát Bà. Phần 1. Số lượng và sự phân bố”,

Tạp chí Sinh học, 29, 70-79.

5. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành

vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm, Hà Nội.

6. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), Điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất

có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn, Đại

học Quốc gia Hà Nội.

7. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2008), Giáo trình vi sinh vật học, Nhà

xuất bản Đại học Sư phạm, Hà Nội.

8. Phạm Thị Miền (2007), Comel Verduyn, Tuyển tập báo cáo hội nghị quốc gia

Biển Đông, 175-186.

9. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), “Tối ưu

một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp.QN6 sinh

tổng hợp protease”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5, 187-196.

10. Tống Kim Thuần (2009), Nghiên cứu thăm dò khả năng sinh các chất có

hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển - Báo cáo tổng kết khoa học đề tài

nhánh cấp nhà nước mã số KC-09/06-10, Viện Công nghệ Sinh học- Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

11. Tống Kim Thuần, Đặng Thị Mai Anh, Lê Thị Thanh Xuân, Phạm Công Hoạt

(2007), Hội nghị Khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần

thứ 2, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

Tiếng Anh

12. Belofsky G.N., Anguera M., Fenical W., and Kock M. (2000), “Oxepinamides

A-C and fumiquinazolines H-I: bioactive metabolites from a marine isolate of a

fungus of genus Acremonium”, European Journal of Chemistry,6, 1355-1360.

13. Bernan V.S., Montenegro D.A., Korshalla J.D., Maiese W.M., Steinberg

D.A., Greenstein M. (1994), “Bioxalomycins, new antibiotics produced by

the marine Streptomyces sp. LL-31F508: taxonomy and fermentation”,

Journal of Antibiotics, 47, 1417-1424.

14. Brown A.K., Taylor R.C., Bhatt A., Futterer K,.and Besra G.S. (2009),

“Platensimycin activity against mycobacterial b-ketoacyl-ACP synthases,

PLoS One, 2009, 4, 6306; Michael J. Smanski, Ryan M. Peterson, Scott R.

Rajski, Ben Shen. Engineered Streptomyces platensis Strains That

Overproduce Antibiotics Platensimycin and Platencin”, Antimicrob Agents

Chemother, 1299–1304.

15. Cecilia A., Marcel O., Gregorio A. (2012), “Effect of addition of Lewis/

Bronsted acids in the asymmetric aldol condensation catalyzed by

trifluoroacetate salts of proline-based dipeptides”, Tetrahedron Letters, 68,

7966.

16. Charles P., Paul R.J., Ryan D., William F., (1992), “Rare phenazine L-

quinovose esters from a marine actinomycete”, Journal of Organic

Chemistry, 57, 740–742.

17. Chen C., Song F., Wang Q., Abdel-Mageed W.M., Guo H., Fu C., Hou W.,

Dai H., Liu X., Yang N., Xie F., Yu K., Chen R, Zhang L .,(2012), “A

marine-derived Streptomyces sp. MS449 produces high yield of actinomycin

X2 and actinomycin D with potent anti-tuberculosis activity”, Applied

Microbiology and Biotechnology, 95, 919-927.

18. Chung-Yun W., Lei H., Kai K., Chang-Lun S., Yu-Xi W., Cai- Juan Z. and

Hua-Shi G (2010),“Secondary metabolites from green algae Ulvapertusa”,

chemistry of Natural Compounds, 46 (5) 828.

19. Daniela H., Sabine L., Angelika B., and Wolfgang F. (2006),

“Diastereoselective Alkylation of a proline, Derived Bicyclic Lactim Ether”,

Helvetica Chimica Acta, 89, 1894.

20. Duong V. H., Ando K. (2010), Taxonomic and ecological studies of

microorganisms in Vietnam and the utilization, Joint research project

between IMBT-VNU and NITE-DOB, Japan, final report, 315 – 358.

21. El Sayed K.A., Bartyzel P., Shen X., Perry T. L., Zjawiony ., J. K., and

Hamann M. T. (2000), “Marine natural products as antituberculosis agents”,

Tetrahedron Letters, 56, 949–953.

22. Elizabeth J.A., Chengzhang F., Xiangyang L., Huanqin D., Fuhang S., Hui

G., Lixin Z., (2010), “Bioprospecting for antituberculosis leads from

microbial metabolites”, Natural product and natural product, 27, 1709–

1719.

23. Evonne M., Ronald R., Warren J., Mark J., Pamela J.,Trevor W. (1997),

“Preparation, characterization, DNA binding, and in vitro cytotoxicity of the

enantiomers of the Platium (II) complexes N-methyl, N-ethyl and N,N-

dimethyl -(R)-and–(S)-3-aminohexahydroazepinedicloro platium(II)”,

American Chemical Society, 40, 3508-3515.

24. Feling R.H., Buchanan G.O., Mincer T.J., Kauffman C.A., Jensen P.R.,

Fenical W. (2003), "Salinosporamide A: a highly cytotoxic proteasome

inhibitor from a novel microbial source, a marine bacterium of the new genus

salinospora", Angewandte Chemie International Edition, 42, 355–357.

25. George E.C., Pham H.T., Nguyen V.H., Aleksej K., Sang H.S., Doel S.,

Jimmy O., (2010), “Nhatrangins A and B, Aplysiatoxim-Related Metabolites

from the marine Cyanobacterium Lyngbya from Viet Nam”, Journal of

Natural Products, 73, 784-787.

26. Getahun T., Reneela P., and Dekebo A. (2012), “Isolation and

characterization of natural products from Helinus mystachnus

(Rhamnaceae)”, Chemical and Pharmaceutical research, 4, 1756-1762.

27. Getahun T., Reneela P., and Dekebo K. (2012), “Isolation and Characterization

of natural products from Helinus mystachnus (Rhamnaceae)”, Journal of

Chemical and Pharmaceutical Research, 4, 1756.

28. Hadacek F., Greger H., (2000), “Testing of antifungal natural products:

methodogies comparability of results and assay choice”, Phytochemical

Analysis, 11 (3), 137-147.

29. Hendrik L., Richard E.M., Valerie J.P., Susan L.M., Thomas H.C. (2013),

“Isolation of Dolastatin 10 from the Marine Cyanobacterium Symploca

Species VP642 and Total Stereochemistry and Biological Evaluation of Its

Analogue Symplostatin”, Journal of Natural Products, 64, 907–910.

30. Hideyuki S., Myung A.B., Kazunaga Y., Takuma S., Junichi K. (1992),

“Alteramide A, a new tetracyclic alkaloid from a bacterium Alteromonas sp.

associated with the marine sponge Halichondria”, Journal of Organic

Chemistry, 57, 4317–4320.

31. Jacqueline A.T., Paul R.J, William F.H. (1994), “A cytotoxic cyclic

acylpeptide of the iturin class produced by a marine Bacillu”, Tetrahedron

Letters, 5571–5574.

32. Kameyama T., Takahashi A., Kurasawa S., Ishizuka M., Okami Y.,

Takeuchi T., Umezawa H., Bisucaberin (1987), “A new siderophore,

sensitizing tumor cells to macrophage-mediated cytolysis. I. Taxonomy of

the producing organism, isolation and biological propertie”, Journal of

Antibiotics, 40, 1664-1670.

33. Madeline A., Emilio Q., Philip C. (1989), “ Novel Sponge - Derived Amino

Acides. Structures Stereochemistry, and Synthesis of several new

heterocycles”, American Chemical Society, 111, 647-654.

34. Masashi K., Tomoko Y., Masanori I., Teizo T. (2004), “Photobacterium

phosphoreum caused a histamine fish poising incident”, Internation Journal

of Food microbiology, 92, 79-87.

35. Mercedes C., Paul R.J., Chris K. (2001), “Pestalone, a new antibiotic

produced by a marine fungus in response to bacterial chanllenge”, Journal of

Natural Products, 64, 1444-1446.

36. Monks S.D., Skehan P., Shoemake R., Paull K., Vistica D., Hose C.,

Langley J., Cronise P., Camplell H., Mayo L., Boyd M. (1991), “Feasibility

of a high-flux anticancer drug screen use a diverse panel of cultured human

tumor cell lines”, Journal of the National Cancer Institute, 83 (11), 757-766.

37. Monro M.H.G., Blunt J.W., Dumdei E.J. (1999), “The discovery and

development of marine compounds with pharmaceutical potential”, Journal

of Biotechnology,70, 15-25.

38. Orena M., Gianni P., Sergio S. (1992), “Diastereoselective alkylation of

(3S)- and (3R)-3-methylpiperazine-2,5-dione derivatives. A convenient

approach to both (S)- and (R)-alanine”, Journal of Organic Chemistry, 57,

6532–6536.

39. Pathirana C., Tapiolas D.M., Jensen P.R., Dwight R., Fenical W., (1991),

“Structure determination of maduralide: A new 24-membered ring macrolide

glycoside produced by a marine bacterium”, Tetrahedron Letters, 32, 2323–

2326.

40. Paul R.J., William F. (1994), “Strategies for the discovery of secondary

metabolites from marine bacteria”, Annual Review of Microbiology, 48, 599-

584.

41. Riming H., Xuafeng Z., Tunbai X., Xianwen Y., and Jonghong L.

(2010), Diketopiperazines from marine organisms,Chemistry &

Biodiversity, 7, 235.

42. Santosh K., Joonseok K., Hyerim K., Gupta M.K., Dutta P.K. (2012), “A

new chitosan- thymine conjugate: synthesis characterization and biological

activity”, International Journal of Biological Macromolecales, 50, 493.

43. Sensi P., Margalith P., Timbal M.T. (1959), “a new antibiotic”, Farmaco

Pavia Education Science, 14, 146-147.

44. Soejarto, D. D.; Pezzuto, J. M.; Fong, H. H. S.; Tan, G. T.; Zhang, H. J.;

Tamez, P.; Aydogmus, Z.; Chien, N. Q.; Franzblau, S. G.; Gyllenhaal, C.;

Regalado, J. C.; Hung, N. V.; Hoang, V. D.; Hiep, N. T.; Xuan, L. T.; Hai,

N. V.; Cuong, N. M.; Bich, T. Q.; Loc, P. K.; Vu, B. M.; Southavong, B. H.;

Sydara, K.; Bouamanivong, S.; O’Neill, M. J.; Lewis, J.; Dietzman, G

(2002), “Ethnobotany/ethnopharmacology and mass bioprospecting: Issues

on intellectual property and beneﬁt-sharing”, Natural Product Sciences, 8, 1-

15.

45. Soledade M., Pedras C., Abbas A. (2013), “Metabolism of the phytoalexins

camalexins, their bioisosteres and analogues in the plant pathogenic fungus

Alternaria brassicicola”, Bioorganic & Medicial Chemistry, 21, 4541.

46. Somepalli V., Gopala K.P & Gottumukkala V.S. (2006), “Synthesis and

biological activities of prenylated tyrosine derivatives, the metabolites of

pithomyces ellis”, Indian Journal of chemistry, 45, 1063.

47. Somepalli V., Gopala K.P., Gottumakkala V.S. (2006), “Synthesis and

biological activities of prenylated tyrosine derivatives, the metabolites of

pithomyces ellis”, Indian Journal of Chemistry, 45B, 1063-1066.

48. Song F.H., Pei G., Fu C.Z. N., Sunn H.Guo, Stanley S., Dai H., H.L. Chen

H.L., Hung D., and Zhang L.X. (2009), Iketopiperazines with

antituberculosis activity from Streptomycices puniceius strain Ls247, 15th

International Symposium on the Biology of Actinomycetes, Shanghai, China,

20–25th August,

49. Srinivas T.N.R., Vijaya B.V., Bhumika V., Anil K.P. (2013),

“Photobacterium marine sp. Nov, a marine bacterium isolated from a

sediment sample from Palk Bay, India”, Systematic and applied

microbiology, 36, 160-165.

50. Thi Tuyen Do, Dinh Quyen Le, Dinh Thi Quyen, Van Cuong Pham (2012),

“Isolation and indentification of marine bacteria from marine mud in Vietnam

with antimicro-bial activity”, Journal of Vietnamese environment, 3 (2), 71.

51. Thomas L., Paul R.J., William F. (1996), “Lagunapyrones A-C: Cytotoxic

acetogenins of a new skeletal class from a marine sediment bacterium”,

Tetrahedron Letters, 37, 1327-1330.

52. Toshiki M., Tatsuo M., Hitomi K., Naoya T., Katsumi A. (2010), “A

recombinant α –(2-3)- sialytransferase with an extremedy broad acceptor

substrate specificity from photobacterium sp. JT-ISH-224 can transfer N-

acetylneuraminic acid to inositols”, Carbohydrate research, 345, 2485-2490.

53. Ulayana K., Irina B., Elena D., (2012), “Antifouling potential of a marine

strain Pseudomonas aeruginosa 1242, isolated from brass microfouling in

Vietnam”, International Biodeterioration & Biodegradation, 75,187-196.

54. William F., Paul R.J. (2006), “Developing a new resource for drug

discovery: marine actinomycete bacteria”, Nature Chemical Biology, 2,

666-673.

55. Xiao J.L., Qiang Z., AnLing Z., and Jin M.G. (2012), “Metabolites from

Aspergillus fumigates, an Endophytic Fungus Associated with Melia

azedarach,and Their Antifungal, Antifeedant, and Toxic Activities”, Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 60, 3424.

56. Yoang O.K., Vivia K., BoHye N., Sang J.L., Antonius S., and Hyung K.K.,

(2012), “Gene cloning and catalytic characterization of cold- adapted lipase

of photobacterium sp. MA1-3 isolated from blood clam”, Journal of

Bioscience and Bioengineering, 114, 589-595.

57. Zhen F., Shi S.Y., Wan Q.Z., Xiao G.C., Shuang G.M., Yong., Jing Q.

(2012), “A new isocoumarin from metabolites of the endophytic fungus

Alternaria tenuissima Wiltshire”, Chinese Chemical letters, 23, 317-320.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ của hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-

carboxamide (FM8.4)

PL-1

PL-2

PL-3

PL-4

Phụ lục 2: Phổ của hợp chất Uracil (FM7.3)

PL-5

PL-6

Phụ lục 3: Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2)

PL-7

PL-8

PL-9

PL-10

Phụ lục 4: Phổ của hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5)

PL-11

PL-12

PL-13

PL-14

Phụ lục 5: Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4)

O 7 NH 8

PL-15

O 7 NH 8

PL-16

O 7 NH 8

PL-17

O 7 NH 8

PL-18

Phụ lục 6: Phổ của hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1)

PL-19

PL-20

PL-21

PL-22

Phụ lục 7: Phổ của hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1)

PL-23

PL-24

PL-25

PL-26

Phụ lục 8: Phổ của hợp chất Thymine (F7.2)

PL-27

PL-28

Phụ lục 9: Phổ của hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2)

PL-29

PL-30

Phụ lục 10: Phổ của hợp chất Axit benzoic (F2.2)

PL-31

PL-32

PL-33

PL-34

Phụ lục 11: Phổ của hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2)

PL-35