ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
DƯƠNG THỊ HOẠT
NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN
CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ
CÂY HOÀNG TINH HOA TRẮNG (DISPOROPSIS
LONGIFOLIA CRAIB) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
HÓA LÍ HIỆN ĐẠI
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Thái Nguyên-2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
DƯƠNG THỊ HOẠT
NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN
CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ
CÂY HOÀNG TINH HOA TRẮNG (DISPOROPSIS
LONGIFOLIA CRAIB) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP
HÓA LÍ HIỆN ĐẠI
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8 44 01 18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. KHIẾU THỊ TÂM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Thái Nguyên-2020
i
LỜI CẢM ƠN
Đề tài này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hóa học, khoa Hóa
học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô giáo hướng
dẫn đề tài khoa học TS. Khiếu Thị Tâm - Trường Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi tốt nhất, động viên và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.
Tôi cũng xin gửi lòng biết ơn chân thành tới tất cả các thầy cô giáo, người
đã đem lại cho tôi những kiến thức bổ trợ, vô cùng có ích trong những năm học
vừa qua.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo trường
Đại học khoa học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Hóa học và các cán bộ
nhân viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi thực
hiện đề tài khoa học này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới toàn thể gia đình,
bạn bè và những người thân đã luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
ii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chương 1 TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Một số phương pháp hóa lý dùng để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu
cơ ....................................................................................................................... 3
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại IR ......................................................... 3
1.1.2. Phổ khối lượng MS (Mass spectrometry) ........................................... 5
1.1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance) .. 7
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học của chi Disporopsis ................................................................... 10
1.2.1. Giới thiệu về chi Disporopsis ............................................................ 10
1.2.2. Đặc điểm thực vật chi Disporopsis.................................................... 10
1.2.3. Ứng dụng của chi Disporopsis trong y học cổ truyền ....................... 11
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Disporopsis ............ 11
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước về cây Hoàng tinh hoa
trắng (Disporopsis longifolia Craib) ............................................................... 16
1.3.1. Đặc điểm thực vật .............................................................................. 16
1.3.2. Ứng dụng của cây Hoàng tinh hoa trắng trong y học cổ truyền ................. 17
1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hoàng tinh hoa trắng . 18
1.4. Hợp chất terpenoid ................................................................................... 18
1.4.1 Khái niệm terpenoid ........................................................................... 18
1.4.2. Phân loại terpenoid ............................................................................ 18
1.4.3. Hoạt tính sinh học của terpenoid ....................................................... 19
Chương 2 THỰC NGHIỆM ............................................................................ 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ....................................................... 20
iii
2.2.2. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu
thực vật ........................................................................................................ 21
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc ........................................................ 22
2.3. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 23
2.4. Quy trình phân lập các hợp chất tự nhiên từ cây Hoàng tinh hoa trắng ...... 23
2.5. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được ........................................... 25
2.5.1. Hợp chất DL1: β-sitosterol ................................................................ 25
2.5.2. Hợp chất DL2: oleanolic acid............................................................ 25
2.5.3. Hợp chất DL3: -amyrin acetate ....................................................... 26
2.5.4. Hợp chất DL4: neoilexonol acetate ................................................... 26
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 27
3.1. Khảo sát cặn chiết ethylacetate bằng SKLM ........................................... 27
3.2. Các hợp chất phân lập từ cao chiết ethylacetate ...................................... 28
3.2.1. Hợp chất β-sitosterol (DL1) .............................................................. 28
3.2.2. Hợp chất oleanolic acid (DL2) .......................................................... 30
3.2.3. Hợp chất -amyrin acetate (DL3) ..................................................... 33
3.2.4. Hợp chất neoilexonol acetate (DL4) ................................................. 36
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46
iv
13C-NMR
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
1H-NMR
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
Proton Nuclear Magnetic resonance Spectroscopy
CC Column Chromatography Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H Sắc ký cột thường
COSY Correlation Spectroscopy
DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ tương tác hai chiều 1H -1H Phổ DEPT
ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Phổ khối ion hóa phun mù điện tử
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
HR-ESI- MS High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
Inhibitory Concentration 50% IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử
Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại IR
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY
Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng
TLC
Methanol
dichloromethane
EtOH: ethanol MeOH: CH2Cl2: CHCl3: Chloroform
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
s: singlet d: doublet t: triplet m: multiplet brs: broad singlet d: doublet of doublets td: triplet of doublets dt: doublet of triplets
v
EtOAc: ethyl acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Phổ hấp thụ hồng ngoại của ethyl acetate ......................................... 4 Hình 1.2. Phổ ESI-MS của bovine ubiquitin từ Protea Biosciences ................ 6 Hình 1.3. Hình ảnh loài D. pernyi ................................................................... 11 Hình 1.4. Hình ảnh loài D. aspersa ................................................................. 11 Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Disporopsis . 13 Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất steroid phân lập từ chi Disporopsis ...... 14 Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất alkaloid phân lập từ chi Disporopsis .... 15 Hình 1.8. Cấu trúc một số hợp chất khác từ chi Disporopsis ......................... 16 Hình 1.9. Cây Hoàng tinh hoa trắng ............................................................... 17 Hình 1.10. Cấu trúc của một số terpenoid....................................................... 19 Hình 2.1. Hình ảnh cây Hoàng tinh hoa trắng thu hái tại Sơn La ................... 20 Hình 2.2. Quy trình ngâm chiết mẫu cây Hoàng tinh hoa trắng ..................... 21 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết ethylacetate .................... 24 Hình 3.1. Cấu trúc của β-sitosterol ................................................................. 28 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của DL1 .................................................................... 29 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của DL1 ................................... 29 Hình 3.4. Cấu trúc của oleanolic acid ............................................................. 30 Hình 3.5. Phổ ESI-MS của DL2 ..................................................................... 31 Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của DL2 (500MHz, CDCl3) ..................................... 31 Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của DL2 (125 MHz, CDCl3) ................................... 32 Hình 3.8. Cấu trúc của -amyrin acetate ........................................................ 33 Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của DL3 (500MHz, CDCl3) ..................................... 33 Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của DL3 (125 MHz, CDCl3) ................................. 34 Hình 3.11. Cấu trúc của neoilexonol acetate .................................................. 36 Hình 3.12. Phổ IR của DL4 ............................................................................ 36 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của DL4 (500MHz, CDCl3) ................................... 37 Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của DL4 (125 MHz, CDCl3) ................................. 38 Hình 3.15. Phổ HSQC giãn của DL4 .............................................................. 39 Hình 3.16. Phổ HMBC giãn của DL4 ............................................................. 40
vi
Hình 3.17. Các tương tác chính trên phổ HMBC của DL4 ............................ 40
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Disporopsis ....................................................................... 10
Bảng 1.2. Phân loại terpenoid ........................................................................................... 18
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng cặn ethyacetate ....................................... 27
Bảng 3.2. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) (ppm) hợp chất DL3 và -amyrin acetate................................................................................... 35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Bảng 3.3. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) (ppm) hợp chất DL4 và neoilexonol acetate .............................................................................. 41
vii
DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của β-sitosterol (DL1)......................................................... I Phụ lục 2. Các phổ của oleanolic acid (DL2) ................................................. IV
Phụ lục 3. Các phổ của -amyrin acetate (DL3) ......................................... VIII
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phụ lục 4. Các phổ của neoilexonol acetate (DL4) ........................................ XI Phụ lục 5. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao chiết .......... XIX
1
MỞ ĐẦU
Nghiên cứu thành phần hoá học và cấu trúc hợp chất hữu cơ là một phần
rất quan trọng trong nghiên cứu phân tích hữu cơ vì chỉ khi biết được thành
phần và cấu trúc chúng ta mới có thể định tính, định lượng, khảo sát hoạt tính
sinh học và tổng hợp được các hợp chất có hoạt tính sinh học quý cho y dược.
Để phân lập các hợp chất hữu cơ người ta có thể sử dụng các phương
pháp như sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột, sắc kí gel, sắc kí khí, sắc kí lỏng hiệu
năng cao. Để xác định được cấu trúc các hợp chất phân lập này người ta có thể
dùng các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến,
phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều. Mỗi phương pháp cho phép
ta xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau
trong việc xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ.
Cho đến nay chi Disporopsis, chỉ có 2 loài Disporopsis aspera và
Disporopsis pernyi được nghiên cứu về thành phần hóa học. Những kết quả
nghiên cứu ban đầu cho thấy chúng chứa nhiều lớp chất phong phú gồm có
flavonoid, alkaloid, steroid và nhiều hợp chất trong đó thể hiện hoạt tính sinh
học lý thú. Điều này chứng tỏ chi Disporopsis là nguồn tài nguyên triển vọng
cho công cuộc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc mới và có hoạt tính sinh học
quý phục vụ cho quá trình tìm kiếm các hợp chất làm thuốc mới.
Cây Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) là một cây
thuốc thuộc chi Disporopsis. Theo y học dân gian, Hoàng tinh hoa trắng có tác
dụng chữa tỷ vị hư nhược, suy kiệt, mệt mỏi, miệng khô biếng ăn, tinh huyết
bất túc, nội nhiệt, tiêu khát, chữa lao phổi, ho ra máu, hạ lipid máu và làm giảm
xơ cứng mạch vành. Tuy nhiên, đến nay chưa có công bố nào về thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của loài này. Cấu trúc của các hợp chất phân lập
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
từ thực vật được xác định bằng các phương pháp hóa lí hiện đại.
2
Do đó đề tài “Nghiên cứu phân tích thành phần cấu trúc của một số hợp
chất phân lập từ cây Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) bằng
các phương pháp hóa lí hiện đại” là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn nhằm làm
sáng tỏ các cơ sở khoa học của cây thuốc, phát huy giá trị kinh tế và bảo tồn
nguồn gen cây thuốc quý hiếm góp phát triển ngành công nghiệp dược liệu và
nền y học cổ truyền Việt Nam.
Nội dung chính của đề tài:
+ Nghiên cứu quy trình tách cặn chiết cây hoàng tinh hoa trắng bằng các
loại dung môi phân cực đến không phân cực.
+ Nghiên cứu thành phần hóa học của cây hoàng tinh hoa trắng bằng sắc
ký lớp mỏng, sắc kí cột.
+ Nghiên cứu xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
này bằng các phương pháp hóa lí hiện đại.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Một số phương pháp hóa lý dùng để phân tích cấu trúc các hợp chất
hữu cơ
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại IR
Phương pháp phổ hồng ngoại dùng để xác định nhóm chức và một số
liên kết đặc trưng có mặt trong phân tử [1-4]. Nguyên tắc chung của phương
pháp phổ hồng ngoại là khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp
chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên
trạng thái dao động cao hơn [4-6].
Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tích các mẫu có liên kết cộng
hóa trị. Phổ đơn giản thu được từ các mẫu có ít liên kết hoạt động và độ tinh
khiết cao. Cấu trúc phân tử phức tạp hơn dẫn đến các dải hấp thụ nhiều hơn và
phổ phức tạp hơn [7, 8].
Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến quá trình
quay, dao động xung quanh vị trí cân bằng của nó. Tùy theo năng lượng kích thích
lớn hay nhỏ có thể xảy ra quá trình quay, dao động hay cả quay và dao động đồng
thời. Để kích thích các quá trình trên có thể sử dụng tia sáng vùng hồng ngoại (phổ
hồng ngoại) hoặc tia khuếch tán Raman (phổ Raman) [6, 7].
Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước
sóng khoảng 10-4 đến 10-6 m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến. Phần
của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong
giữa 2,5.10-4 và 16.10-6 m. Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại
là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là chúng tỷ lệ thuận với năng
lượng [3, 7].
Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao
4
động cao hơn. Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị
và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao
động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết [3, 4].
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ bức xạ hồng
ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng chính được gọi là phổ hấp thụ
hồng ngoại [8].
Máy phổ hồng ngoại có thể đo được các mẫu ở thể khí, lỏng, rắn nhưng
thông thường nhất được chuẩn bị là dạng rắn và dạng lỏng. Chất rắn thường
được nghiền nhỏ với KBr rồi ép thành viên mỏng. Chất lỏng được đo ở dạng
màng lỏng hoặc pha trong dung môi như tetrachloromethane, chloroform [7].
Hình 1.1. Phổ hấp thụ hồng ngoại của ethyl acetate
Sự hấp thụ hồng ngoại của một chất thường tập trung vào những vùng
hẹp tạo ra các vân hấp thụ (Hình 1.1) có rất nhiều vân hấp thụ như vân a, b, c,
d, e, g, h. Vân phổ hồng ngoại có ba đặc trưng cần được mô tả là: vị trí của vân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
phổ được chỉ bởi bước sóng hoặc số sóng của đỉnh phổ, cường độ của vân phổ
5
hồng ngoại thường được đánh giá theo diện tích của vân phổ: vân phổ càng
rộng và càng cao thì có cường độ càng lớn [4].
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng
của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một
phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân
tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay.
Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho
hai hợp chất giống nhau [7, 8].
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu đuợc chủ
yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các pic
nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng
này chứa các cực đại hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C=N...
nên được gọi là vùng nhóm chức [4, 7]. Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức tạp
hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm
chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp
chất kia vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay [8].
1.1.2. Phổ khối lượng MS (Mass spectrometry)
Phương pháp phổ khối lượng (MS) là kĩ thuật phân tích hiệu quả để
chứng minh hợp chất chưa biết bằng cách xác định khối lượng phân tử, xác
định định tính và xác định định lượng (khối lượng, bề mặt và phân tích sâu) của
các vết hợp chất hữu cơ có trong một mẫu bằng cách đo tỉ lệ khối lượng trên
điện tích và số lượng của các ion pha khí [9,10]. Đây là phương pháp hiện đại
được sử dụng phổ biến trong các phép phân tích cấu trúc và phân tích hàm
lượng các hợp chất hóa học. Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng đối với
hợp chất hữu cơ là bắn phá các hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân
tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion (có số khối z-m/e),
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử mang năng lượng cao [1, 2, 4].
6
ABC + 1e >95% → ABC+ + 2e
→ ABC2+ + 3e
→ ABC-
Sự bắn phá này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và
năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Ion phân tử và các
ion mảnh là các phần tử có khối lượng (m), điện tích của nó là z thì tỷ số m/z
được gọi là số khối [10].
Quá trình ion hóa có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau:
phương pháp va chạm e, phương pháp ion hóa hóa học, phương pháp ion hóa
photon, phương pháp ion hóa trường, phương pháp bắn phá ion, phương pháp
bắn phá nguyên tử nhanh. Tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và
xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan
giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ
khối lượng [4].
Hình 1.2. Phổ ESI-MS của bovine ubiquitin từ Protea Biosciences
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phân tích phổ khối là tìm mối liên quan giữa các số khối xuất hiện trên
7
phổ khối lượng và cấu tạo phân tử dựa trên cơ chế phá vỡ phân tử, gồm các
trường hợp sau:
Trường hợp một: có công thức dự kiến cần dựa vào phổ khối lượng để
xác minh công thức có đúng không [4].
Trường hợp thứ hai, biết khối lượng phân tử và công thức cấu tạo phân
tử phải dựa vào số khối m/z trên phổ và cấu tạo của các mảnh ion có số khối
đó để lắp ghép lại thành phân tử [4].
Trường hợp thứ ba: biết khối lượng phân tử phân giải cao có thể dựa vào
bảng tra cứu tìm ra công thức phân tử, sau đó tiến hành như trường hợp trên
[4].
Trường hợp thứ tư, biết khối lượng phần tử và các loại nguyên tố [4].
Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định
được cấu trúc phân tử và tìm ra quy luật phân mảnh [9, 10].
1.1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
Phổ NMR là phương pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và
hữu hiệu nhất hiện nay dựa trên sự ghi lại quá trình cộng hưởng từ sinh ra bởi
các hạt nhân có spin khác 0 được kích thích bởi năng lượng của tần số sóng
radio Rf dưới tác động của từ trường Bo bên ngoài. Với việc sử dụng kết hợp
các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, các nhà nghiên
cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất. Trong phổ NMR có
hai thông số có đặc trưng liên quan tương cấu trúc hóa học của một phân tử là
độ dịch chuyển hóa học (δ) và hằng số tác spin – spin (J) [2, 4].
1.1.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR
Được sử dụng rộng dãi nhất là proton NMR (1H-NMR). Proton có tỷ lệ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
phong phú tự nhiên và tỷ lệ từ tính lớn và phù hợp để quan sát NMR. Đối với
8
các hợp chất hữu cơ thông thường, phạm vi dịch chuyển hóa học là δ = 0 đến
10 ppm [1, 4, 7]. Giá trị của sự dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào môi trường
xung quanh proton, đó là sự lai hóa các nguyên tử carbon liên kết, loại và số
lượng các nhóm chức gần đó và các hiệu ứng không gian. Chia tách bằng khớp
nối spin giúp ước tính cấu trúc một phần. Các proton liền kề với hai
hydrogen tương đương (ví dụ CH3CH2OH) chia thành ba dòng với tỷ lệ cường
độ 1: 2: 1, trong khi các proton liền kề với ba hydrogen tương đương chia thành
bốn dòng với tỷ lệ cường độ 1: 3: 3: 1. Do đó, con số 2 b sự hiện diện của nhóm
ethyl có thể được ước tính dễ dàng từ phổ [9]. Độ lớn của hằng số ghép spin
cũng phụ thuộc vào hình dạng proton liên quan. [4, 9].
Trong trường hợp của proton NMR, diện tích (cường độ tích hợp) được
bao quanh bởi đường cong và đường cơ sở của mỗi đỉnh tỷ lệ thuận với số
lượng proton. Thông thường, một quang phổ kế được tích hợp sẵn, do đó cường
độ tích hợp được đo và ghi lại trên phổ [4].
Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được
xác định tùy thuộc vào mức độ lai hóa của các nguyên tử cũng như các đặc
trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác
nhau, vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau.
Dựa vào những đặc trưng của (δ) và tương tác J để có thể cung cấp các thông
tin giúp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất [4].
1.1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch carbon. Mọi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng
13C- NMR cũng được tính bằng ppm nhưng với độ dài rộng hơn phổ proton, từ
ở một trường khác nhau và cho một tính hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ
0-240 ppm. Ngoài ra, phổ 13C-NMR còn được ghi theo phương pháp DEPT.
Phổ này cho ta tín hiệu phân loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
của cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu của CH và CH3, nằm cùng một phía, tín
9
hiệu của CH2 nằm ở phía ngược lại đối với phổ DEPT 135. Trên phổ DEPT 90
chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các nhóm CH [1, 2, 4].
Hạt nhân carbon, cùng với các proton, là thành phần quan trọng nhất của
các hợp chất hữu cơ, nhưng sự phong phú tự nhiên của hạt nhân C-13, là hạt
nhân NMR, thấp tới 1,108%, khiến việc quan sát trở nên vô cùng khó khăn [1,
4, 9]. Với sự lan truyền của FT NMR bằng biến đổi xung-Fourier, người ta có
thể đo được NMR của hạt nhân C-13 và các hạt nhân khác như N-15 và Si-29.
Sự ra đời của FT NMR cho phép có được các thông số liên quan đến thời gian,
chẳng hạn như thời gian lưu [4,11,12].
1.1.3.3. Phổ HSQC (Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy)
Phổ HSQC cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu của H và C. Phổ HSQC
cho biết thông tin về liên kết trực tiếp giữa proton và cacbon. Phổ HSQC có thể
biểu diễn dưới dạng biểu đồ nổi hoặc biểu đồ đường viền. Biểu đồ đường viền
có ưu điểm hơn bởi vì thông tin về độ chuyển dịch hóa học là khác nhau nên
phổ HSQC không đối xứng qua đường chéo [4, 13].
1.1.3.4. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation)
Đây là phổ thể hiện tương tác xa (2 liên kết và 3 liên kết) giữa cacbon và
proton trong phân tử và nhờ đó mà từng phân của phân tử cũng như toàn bộ
phân tử được xác định. Phổ này đặc biệt thích hợp trong trường hợp phân tử
chứa cacbon bậc bốn vì nó thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton H ở một
nguyên tử C với tín hiệu của C khác ở cách xa nó 2-3 liên kết thậm chí trong
một số trường hợp là bốn liên kết [4].
1.1.3.5. Phổ COSY
Phổ COSY biểu diễn các tương tác giữa proton - proton. Các proton
tương tác với nhau trong phổ COSY là các proton liên kết với cùng một cacbon
hoặc với cacbon liền kề. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử ghép nối lại với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhau. Tín hiệu thu được trên phổ COSY có dạng dấu thập [4].
10
1.1.3.6. Phổ NOESY
Phổ NOESY biểu diễn các tương tác không gian của các proton không
kể đến độ dài các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách không gian của chúng
được phân bố trong phân tử (khoảng 4A◦). Dựa vào kết quả phổ này có thể xác
định cấu trúc không gian của phân tử. Trên phổ này khi 2 nhóm proton liên kết
với nhau thì tín hiệu của chúng thể hiện ở 4 đỉnh của hình vuông, trong đó 2
đỉnh nằm trên đường chéo [4]. Các đỉnh chéo của phổ NOESY chỉ ra các proton
nào gần nhau trong không gian. Về mặt này, NOESY khác với COSY dựa trên
1H này gần với 1H khác thông qua các liên kết hóa học của phân tử [14].
khớp nối J để cung cấp mối tương quan spin-spin và có các đỉnh chéo cho thấy
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của chi Disporopsis
1.2.1. Giới thiệu về chi Disporopsis
Chi Disporopsis thuộc họ Măng tây (Asparagaceae) gồm 7 loài (Bảng 1)
[15], phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Việt Nam, …[16].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Disporopsis
STT Tên loài
Disporopsis aspersa (Hua) Engl. ex Diels 1
Disporopsis fuscopicta Hance 2
Disporopsis jinfushanensis Z.Y.Liu 3
Disporopsis longifolia Craib 4
Disporopsis luzoniensis (Merr.) J.M.H.Shaw 5
Disporopsis pernyi (Hua) Diels 6
Disporopsis undulata Tamura&Ogisu 7
1.2.2. Đặc điểm thực vật chi Disporopsis
Về đặc điểm thực vật, các loài thuộc chi này thường là thân thảo, cao
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
khoảng 60-100 cm, thân cong, đường kính 2-3 cm, sống lâu năm, cây ưa bóng,
11
mọc hoang, thường thành bụi dưới các tán rừng núi cao. Lá hình mác mọc so
le, cuống ngắn. Hoa hình chuông, mọc ở nách lá, thường thành cụm hai hay
nhiều hoa, bao hoa hình chén, đầu chia 6 thuỳ tam giác, 6 nhị đính ở miệng
ống. Quả mọng, hình cầu. Sinh sản bằng thân rễ hoặc hạt [15,17].
Hình 1.3. Hình ảnh loài D. pernyi Hình 1.4. Hình ảnh loài D. aspersa
1.2.3. Ứng dụng của chi Disporopsis trong y học cổ truyền
Một số loài thực vật đặc hữu thuộc chi Disporopsis được sử dụng trong
y học dân gian để làm thuốc chữa bệnh. Ở Trung Quốc, thân rễ loài
Disporopsis aspersa được sử dụng làm thuốc bổ chữa cơ thể suy nhược, sốt
nóng, mồ hôi ra nhiều, mồ hôi trộm, đi tiểu nhiều, di tinh, ho khan, khát nước
[18]. Toàn bộ cây Disporopsis aspersa còn được dùng làm thuốc bổ máu, tăng
cường hệ miễn dịch cơ thể, điều trị sốt dai dẳng, đổ mồ hôi đêm, ho khan và
ung thư [18,19]. Disporopsis pernyi (Hua) Diels được sử dụng rộng dãi để điều
trị viêm thấp khớp, ho mãn tính, viêm amidan, viêm kết mạc, phụ nữ yếu sau
sinh và chu kỳ kinh nguyệt không đều, dùng làm thuốc bổ. Rễ cây giàu giá trị
y học, có hoạt tính điều trị ho, cao huyết áp, kháng viêm và khối u [20].
1.2.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Disporopsis
Cho đến nay, trong số 7 loài của chi Disporopsis, chỉ có 2 loài được
nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Đó là các loài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Disporopsis aspera và Disporopsis pernyi. Những kết quả nghiên cứu ban đầu
12
về các loài thuộc chi Disporopsis cho thấy chúng chứa nhiều lớp chất phong
phú gồm có flavonoid, alkaloid, steroid và nhiều hợp chất trong đó thể hiện
hoạt tính sinh học lý thú. Điều này chứng tỏ chi Disporopsis là nguồn tài nguyên
triển vọng cho công cuộc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc mới phục vụ cho
quá trình tìm kiếm thuốc mới.
1.2.4.1. Hợp chất flavonoid
Từ cặn chiết của rễ cây Disporopsis aspera Engl., Nguyễn Anh Thọ và các
cộng sự đã phân lập được 4 flavone là 3-(2′,4′-dihydroxy-benzyl)-5,7-dihydroxy-
chroman-4-one (1), 3-(4′-hydroxy-benzyl)-5,7-dihydroxy-6-methyl-chroman-4-
one (2), 3-(4′-hydroxy-benzyl)-5,7-dihydroxy-6,8-dimethyl-chroman-4-one (3) và
3-(4′-hydroxy-benzyl)-5,7-dihydroxy-6-methyl-8-methoxy-chroman-4- one (4) [19].
Từ loài Disporopsis pernyi (Hua) Diels nhóm tác giả Wang, Y., Li đã phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
lập được 3 hợp chất flavonoid gồm rutin (5), luteolin (6), quercetin (7) [21].
13
6 5
7
Hình 1.5. Cấu trúc của các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Disporopsis
1.2.4.2. Hợp chất steroid
Bốn saponin steroid mới được nhóm tác giả Qing-Xiong Yang phân lập từ
rễ tươi của loài Disporopsis pernyi (Hua) Diels, đặt tên là Disporoside A-D (8-11),
tương ứng là (3β,25R)-3-[(β-D- glucopyranosyl-(1- 2)-[β-D-glucopyranosyl-
(1-6)]-β-D-glucopyranosyl)oxy]-5β-spirostan (8), (3β,25R)-3-[(β-D-glucopyranosyl
-(1-2)-[6-O-hexadecanoyl-β-Dglucopyranosyl-(1-6)]-β-D-glucopyranosyl)oxy]-
5β-spirostan (9), (3β,22R,25R)-26-[(β-D-glucopyranosyl)oxy]-3-[(β-D-
glucopyranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosyl)-oxy]-5β-furostan (10), và
(3β,22R,25R)-26-[(β-D-glucopyranosyl)oxy]-3-[(β-D-glucopyranosyl-(1-2)-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
[β-D- glucopyranosyl-(1-6)]-β-D-glucopyranosyl)oxy]-5β-furostan (11) cùng
14
với 3 chất đã biết trước đó, là Ys-I (12), agavoside B (13), và (3β,25R)-3-[(β-
D-xylopyranosyl-(1-3)-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-D-galactopyranosyl)oxy]-
5α-spirostan-12-one (14) [20].
Cũng từ loài Disporopsis pernyi (Hua) Diels, nhóm tác giả Feng Zhu đã
phân lập được hai steroid mới là (22S,25S)-Spirost-5(6)-ene-3β,4β-diol-3-O-β-
D-glucopyranosid (15) và (22S,25S)-Spirost-5(6)-ene-3β,4β-diol-β-D-
glucopyranoside-(6→2)-3-O-β-D-glucopyranoside (16) [30]. Từ cặn chiết của
rễ cây Disporopsis aspera Engl., nhóm tác giả Nguyễn Anh Thọ đã phân lập
được 2 steroid là β-sitosterol (17) và β-sitosterylglucopyranoside (18) [19].
Hình 1.6. Cấu trúc của các hợp chất steroid phân lập từ chi Disporopsis
1.2.4.3. Hợp chất alkaloid
Từ dịch chiết của Disporopsis aspera Engl., Feng Zhu và các cộng sự đã
phân lập ra 3 hợp chất alkaloid là L-Pyroglutamic acid (19), (2R,3R,4S,5R)-2-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(6-amino-4,5-dihydropurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol (20) và
15
N-[2-(1H-indol-3yl)ethyl]phenyl-3-cacboxamide (21) [18]. Cũng từ loài
Disporopsis aspera, nhóm tác giả Nguyễn Anh Thọ đã phân lập được 2 alkaloid
là N-trans-feruloyl tyramine (22), adenine (23) [19].
Hình 1.7. Cấu trúc của các hợp chất alkaloid phân lập từ chi Disporopsis
1.2.4.5 Các hợp chất khác
Ngoài các lớp chất nêu trên, từ các loài thuộc chi Disporopsis đã phân lập được
các hợp chất khác. Từ cặn chiết rễ cây Disporopsis aspera Engl., Nguyễn Anh
Thọ và các cộng sự đã phân lập ra 5-(hydroxymethyl)-2-furfuran (24) [19].
Nhóm tác giả Yanqi Wang cũng đã tìm thấy hợp chất betulinic acid (25) từ loài
Disporopsis pernyi (Hua) Diels [21]. Năm 2018, nhóm tác giả Fang-Li Ganga
đã tìm thấy một este mới từ loài Disporopsis aspera Engl. 2-isopropyl-5-
methylphenyl 2-(naphthalen1-yl) acetate (26) và một hợp chất (3R,4S)-3,4-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
dihydroxy-3-methyldihydrofuran-2(3H)-one (27) [22].
16
Hình 1.8. Cấu trúc một số hợp chất khác từ chi Disporopsis
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước về cây Hoàng tinh hoa
trắng (Disporopsis longifolia Craib)
1.3.1. Đặc điểm thực vật
Hoàng tinh hoa trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia là một
loài thực vật có hoa trong họ Măng tây. Loài này được Craib mô tả khoa học
đầu tiên năm 1912. Hoàng tinh hoa trắng có tên gọi khác là hoàng tinh cách,
hoàng tinh lá mọc cách, hoàng tinh lá mọc so le [15,23].
Hoàng tinh hoa trắng là cây thảo, cao 0,5 - 1,2 m. Thân rễ nạc, gồm nhiều
cục gắn với nhau thành chuỗi, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 2 - 3 cm.
Thân mang lá nhẵn, lúc non có đốm tím hồng, sau xanh trắng, đường kính 0,3
- 0,6 cm. Lá mọc so le, cuống ngắn; phiến lá thuôn hay mác dài, nhọn 2 đầu,
10 - 20 x 2,5 - 3,5 cm, 5 gân chính hình cung. Cụm hoa gồm 5 - 7 cái, mọc ở
kẽ lá, có cuống dài 0,6 - 1cm. Hoa màu trắng, bao hoa hình chén, đầu chia 6
thuỳ tam giác. Nhị 6, đính ở miệng ống; chỉ nhị dẹp, có tai ở đầu. Quả thịt, hình
cầu, đường kính 0,4 - 0,5 cm. Khi chín từ màu xanh chuyển sang màu trắng.
Hạt nhỏ. Mùa hoa tháng 3 - 5, quả tháng 5 - 9. Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng,
thường mọc thành khóm trên đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dưới tán
rừng kín thường xanh ẩm đặc biệt là ở rừng núi đá vôi, ở độ cao khoảng 400 -
1500 m [17,23].
Ở Việt Nam, Hoàng tinh hoa trắng phân bố khắp nơi như Lai Châu, Điện
Biên, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Lạng
Sơn, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hoà Bình, Ninh Bình. Trên thế giới có nhiều ở Trung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Quốc, Thái Lan, Lào [23].
17
Hình 1.9. Cây Hoàng tinh hoa trắng
Cây Hoàng tinh hoa trắng đang được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996)
với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật
rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày
30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương
mại [23].
1.3.2. Ứng dụng của cây Hoàng tinh hoa trắng trong y học cổ truyền
Theo y học dân gian, Hoàng tinh hoa trắng được dùng để chữa tỷ vị hư
nhược, suy kiệt, mệt mỏi, miệng khô biếng ăn, tinh huyết bất túc, nội nhiệt, tiêu
khát, chữa âm hư, tỉnh tủy bất túc, suy lão sớm ở người cao tuổi, chữa lao phổi,
ho ra máu. Thân rễ (củ) là vị thuốc quý dùng nhiều trong y học cổ truyền, có
tác dụng bổ trung ích khí, mạnh gân xương, chữa phong thấp; làm đẹp da, đen
tóc. Thân rễ được dùng làm thuốc bổ, tăng lực, chữa mệt mỏi, kém ăn, đau lưng,
thấp khớp, khô cổ khát nước [24].
Khi kết hợp với nhiều vị thuốc đông y, củ Hoàng tinh hoa trắng còn có
nhiều công dụng như giảm mệt mỏi, chữa thiếu máu, chữa yếu sinh lý, ho ra
máu, đau thắt ngực, bệnh mạch vành tim, đái tháo đường, huyết áp thấp, chữa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
rối loạn thần kinh thực vật, hỗ trợ ngưng tăng độ và cận thị [23, 24].
18
1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hoàng tinh hoa trắng
Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của loài này.
1.4. Hợp chất terpenoid
1.4.1 Khái niệm terpenoid
Terpenoid là những hợp chất hữu cơ chứa C, H và O tồn tại trong thiên
nhiên mà có bộ khung cacbon gồm nhiều mắt xích giống với khung cacbon của
isopren, tức là có thể biểu diễn bởi công thức (C5H8)n với (n ≥ 2). Hầu hết là
các cấu trúc đa vòng với các nhóm chức có chứa oxy. Khoảng 60% các sản
phẩm tự nhiên được biết đến là terpenoid [25].
1.4.2. Phân loại terpenoid
Để phân loại terpenoid, người ta căn cứ vào số lượng đơn vị isoprene
hợp thành [25].
Bảng 1.2. Phân loại terpenoid
Số nguyên tử carbon Giá trị n Số lượng C
5 1 Hemiterpenoid
10 2 Monoterpenoid
15 3 Sesquiterpenoid
20 4 Diterpenoid
25 5 Sesterterpenoid
30 6 Triterpenoid
40 8 Tetraterpenoid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
> 40 >8 Polyterpenoid
19
Hình 1.10. Cấu trúc của một số terpenoid
1.4.3. Hoạt tính sinh học của terpenoid
Những công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học và dược học đã chứng
minh rằng terpenoid thể hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị. Theo những báo
cáo khoa học gần đây, các hợp chất terpenoid với cấu trúc đa dạng đã thể hiện
nhiều hoạt tính đáng chú ý như hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống ung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thư, chống oxy hóa, chống đái tháo đường… [26, 27].
20
Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib) thuộc chi
Disporopsis được thu hái ở huyện Mai Sơn tỉnh Sơn La vào tháng 5 năm 2019.
Tên khoa học do TS.Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam
VAST xác định.
Hình 2.1. Hình ảnh cây Hoàng tinh hoa trắng thu hái tại Sơn La
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu
Mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy
khô ở nhiệt độ 400C, sau đó đem xay nhỏ (1,3 kg). Mẫu lá và thân cây Hoàng
tinh hoa trắng ngâm chiết lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyacetate
và methanol bằng siêu âm trong 60 phút ở 450C/3 lần. Các dịch chiết được
gom lại và cất loại dung môi thu được các dịch chiết tương ứng lần lượt là
cặn n-hexane (12g), cặn EtOAc (18g) và cặn MeOH (32g). Quy trình ngâm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
chiết mẫu được trình bày ở hình 2.1.
21
Hình 2.2. Quy trình ngâm chiết mẫu cây Hoàng tinh hoa trắng
2.2.2. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu
thực vật
Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của mẫu thực vật được thực hiện
bằng các phương pháp sắc ký khác nhau: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột
(CC) với các chất hấp phụ khác nhau như silica gel, Sephadex LH-20, giải
hấp bằng các hệ dung môi thích hợp.
Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần được thực hiện trên bản
mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25
mm. Dung môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi như n-hexane,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
CH2Cl2, EtOAc, MeOH, H2O.
22
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm
(230-400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung
môi với tỉ lệ thích hợp.
Sắc ký Sephadex LH-20 được rửa giải bằng dung môi MeOH hoặc hỗn
hợp MeOH/CH2Cl2 (9/1, v/v).
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp
phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt
nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC).
2.2.3.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có
trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trưng của các
nhóm chức đó. Phổ hồng ngoại được đo trên máy Perkim Elmer UATR two tại
Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
2.2.3.2. Phổ khối lượng
Phổ khối là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định
khối lượng phân tử của các chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân
tử [M-H]-, [M+H]+… từ đó giúp xác định được công thức phân tử. Phổ khối
ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AMD 402 (Đức).
2.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hiện đại trong việc phân
tích cấu trúc các hợp chất hóa học dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt
nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Viện Hóa học, Viện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
23
2.3. Hóa chất và thiết bị
Các dung môi hữu cơ dùng để chiết mẫu, khảo sát sắc kí lớp mỏng và
sắc kí cột phải là dung môi tinh khiết (PA): dung môi dichloromethane, n-
hexane, methanol, ethyl acetate, chloroform.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được chạy trên những bản nhôm tráng sẵn
silica gel 60F254 độ dày 0,2 mm của hãng Merck.
Các sắc kí đồ lớp mỏng được nhận bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4 được
điều chế như sau: Hòa tan hoàn toàn 1,2 g vanilin trong 200 mL methanol , sau
đó thêm 25 mL acetic acid, tiếp theo làm lạnh 5 – 10 phút rồi thêm từ từ 11mL
sulfuric acid đặc.
Các dung môi được loại bỏ trên máy cất quay chân không với bộ làm
lạnh R-100 của Hãng Buchi, Thụy Sĩ tại Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa
học, Đại học Thái Nguyên.
Phổ hồng ngoại được đo trên máy Perkim Elmer UATR two tại Khoa
Hóa học, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại
Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy
AMD 402 (Đức).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance
500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. Quy trình phân lập các hợp chất tự nhiên từ cây Hoàng tinh hoa trắng
Quá trình phân lập các chất từ cặn ethyl acetate: 18 g cặn chiết ethyl
acetate (DLE) được tinh chế bằng cột silica gel, hệ dung môi gradient n-hexane:
EtOAc thu được 12 phân đoạn. Phân đoạn 2 (650 g) được tinh chế tiếp trên cột
silica gel, hệ dung môi n-hexane: CH2Cl2 (98:2) thu chất sạch DL1 (40 mg).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phân đoạn 3 (950 mg) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu
24
là n-hexane: EtOAc = 95:5 thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 3.1
đến 3.4). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel phân đoạn nhỏ 3.2 với hệ dung môi
ban đầu là n-hexane: CH2Cl2 = 9:1 thu được chất sạch DL2 (20 mg). Phân đoạn
3.4 tiếp tục được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane: EtOAc
(9:1) thu được chất sạch DL3 (30 mg). Phân đoạn 6 (950 mg) được chạy sắc
ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là n-hexane: EtOAc = 85:15 thu được
5 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 6.1 đến 6.5). Phân đoạn nhỏ 6.2 tiếp tục
được chạy sắc ký cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2: MeOH (15:85)
thu được chất sạch DL4 (25 mg). Sơ đồ phân lập được trình bày ở hình 2.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết ethylacetate
25
2.5. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được
2.5.1. Hợp chất DL1: β-sitosterol
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), H (ppm): 5,38-5,36 (1H, m); 3,56-3,52
Tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,45 (n-hexane: EtOAc 4:1, v/v)
(1H, m); 2,33-2,25 (2H, m); 2,05-1,97 (2H, m); 1,89-1,82 (3H, m); 1,70-1,65
(2H, m); 1,54-1,11 (24H, m); 1,07 (3H, s); 1,00 (3H, d, J = 6,7 Hz); 0,87 (3H,
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz), C (ppm): 140,79 (C-5); 121,72 (C-6);
t, J = 7,1 Hz); 0,86 (6H, br s); 0,70 (3H, s).
71,82 (C-3); 56,80 (C-14); 56,10 (C-17); 50,17 (C-9); 45,88 (C-24); 42,35 (C-
4); 42,33 (C-13); 39,81 (C-12); 37,28 (C-1); 36,53 (C-10); 36,16 (C-20); 33,98
(C-22); 31,93 (C-8); 31,69 (C-7); 29,20 (C-25); 28,26 (C-16); 26,14 (C-23);
24,32 (C-15); 23,10 (C-28); 21,11 (C-11); 19,82 (C-19); 19,41 (C-27); 19,06
(C-26); 18,80 (C-21); 12,00; 11,87 (C-29).
2.5.2. Hợp chất DL2: oleanolic acid
Là chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2: MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS
1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 5,27 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12);
m/z: 455,2 [M-H]-, công thức phân tử là C30H48O3.
3,20 (1H, dd, J = 4,0; 11,0 Hz, H-3); 2,81 (1H, dd, J = 4,0; 13,5 Hz, H-18);
1,12; 0,97; 0,91; 0,90; 0,89; 0,76; 0,74 (mỗi tín hiệu 3H, s, Me-23, 24, 25, 26,
13C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,43 (C-1); 27,71 (C-2); 79,05
27, 29, 30).
(C-3); 38,77 (C-4), 55,24 (C-5); 18,32 (C-6); 32,66 (C-7); 39,30 (C-8); 47,66 (C-
9); 37,10 (C-10); 22,98 (C-11); 122,66 (C-12); 143,61 (C-13); 41,65 (C-14);
27,21 (C-15); 23,42 (C-16); 46,52 (C-17); 41,09 (C-18); 45,91 (C-19); 30,69 (C-
20); 33,83 (C-21); 32,46 (C-22); 28,12 (C-23); 15,56 (C-24); 15,34 (C-25); 17,13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(C-26); 25,91 (C-27); 181,62 (C-28); 33,08 (C-29); 23,59 (C-30).
26
2.5.3. Hợp chất DL3: -amyrin acetate
Là chất rắn vô định hình, không màu
Phổ IR ( cm-1): 1732 (C=O), 1455 (C=C), 1243 (C-O)
Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz)
(ppm) được trình bày ở bảng 3.3.
2.5.4. Hợp chất DL4: neoilexonol acetate
Là chất rắn vô định hình, màu vàng nhạt
Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(ppm) được trình bày ở bảng 3.4.
27
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát cặn chiết ethylacetate bằng SKLM
Tiến hành khảo sát SKLM cặn chiết ethylacetate, chúng tôi tìm được hệ
dung môi tối ưu là hệ dung môi tối ưu là n-hexane: EtOAc= 9:1; v/v, phát hiện
vệt chất trên lớp mỏng bằng cách dùng thuốc thử vanilin/H2SO4. Kết quả khảo
sát cặn chiết ethylacetate bằng SKLM được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng cặn ethyacetate
STT Thuốc thử vanilin/ H2SO4 Rf
0,95 1 +
0,88 2 +
0,82 3 +
0,70 4 +
0,50 5 +
0,33 6 +
0,10 7 +
(+): có hiện màu
Kết quả khảo sát cặn chiết ethylacetate bằng SKLM cho thấy cặn chiết
ethylacetate có bẩy thành phần tương ứng với bẩy vệt chất trong đó có vệt thứ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhất không hiện đèn UV nhưng hiện thuốc thử vanilin/ H2SO4.
28
3.2. Các hợp chất phân lập từ cao chiết ethylacetate
3.2.1. Hợp chất β-sitosterol (DL1)
Hình 3.1. Cấu trúc của β-sitosterol
Hợp chất DL1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng. Tiến
hành phân tích trên sắc ký bản mỏng để so sánh DL1 với các chất thường gặp
trong tự nhiên thì thấy rắng DL1 và β-sitosterol hoàn toàn trùng nhau khi có
cùng Rf = 0,45 trong hệ dung môi triển khai là n-hexane: EtOAc = 4:1, v/v.
Phổ 1H- NMR của DL1 xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm methyl gồm hai
tín hiệu singlet của nhóm methyl bậc ba ở 1,07 (3H, s, CH3-19); 0,70 (3H, s,
CH3-18); 3 tín hiệu doublet của nhóm methyl bậc hai ở H 1,00 (3H, d, J = 7,0
Hz, CH3-21); 0,86 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26); 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-
27) và 1 tín hiệu triplet của nhóm methyl bậc một ở H 0,87 (3H, t, J = 7,1 Hz,
CH3-29). Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy các tín hiệu của một proton
olefin tại δH 5,38-5,36 (1H, m) và tín hiệu một nhóm hydroxymethine tại δH
3,56-3,52 (1H, m). Các tín hiệu của các proton còn lại trong khoảng δH 2,33-
1,11 ppm. Các tín hiệu này thường đặc trưng cho hợp chất có khung steroid.
Mặt khác, tín hiệu multiplet ở δC 3,56-3,52 đặc trưng cho các steroid có một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nhóm hydroxy liên kết tại C-3.
29
Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của DL1
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của DL1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
30
Phổ 13C-NMR cho biết phân tử có hai chín carbon, đa số trong đó thuộc
vùng chuyển dịch hóa học nằm trong khoảng 11-57 ppm, đây là vùng phổ 13C-
NMR đặc trưng của hợp chất steroid. Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của hai
carbon olefin ở δC 140,79 (C-5); 121,72 (C-6) và một nhóm hydroxymethine
tại δC 71,82. Tín hiệu của sáu nhóm methyl ở δC 19,82; 19,41; 19,06; 18,80;
12,00; 11,87. Tín hiệu còn lại của sáu nhóm methine và chín nhóm methylene
nằm trong khoảng δC 56,80-21,11. So sánh số liệu phổ NMR với tài liệu tham
khảo [28] cho phép kết luận hợp chất DL1 là β-sitosterol có công thức phân tử
là C29H50O. Đây là một sterol tồn tại khá phổ biến trong các loài thực vật, hợp
chất này có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng chống ung thư, kháng viêm,
chống ho, bảo vệ tim, chống ung thư, viêm khớp ... [29].
3.2.2. Hợp chất oleanolic acid (DL2)
Hình 3.4. Cấu trúc của oleanolic acid
Chất DL2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho
pic ion giả phân tử ở m/z 455,5 [M-H]-, kết hợp với phổ NMR cho phép dự
đoán công thức phân tử là C30H48O3.
Phổ 1H-NMR của chất DL2 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin ở δH
5,27 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12), một nhóm hydroxymethine ở δH 3,20 (1H, dd, J
= 4,0; 11,0 Hz, H-3), bảy tín hiệu singlet của nhóm methyl ở δH 1,12; 0,97;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
0,91; 0,90; 0,89; 0,76; 0,74 (mỗi tín hiệu 3H, s). Các tín hiệu của nhóm methyl
31
đặc trưng cho hợp chất terpenoid loại olealane.
Hình 3.5. Phổ ESI-MS của DL2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của DL2 (500MHz, CDCl3)
32
Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của DL2 (125 MHz, CDCl3)
Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt của ba mươi carbon trong
phân tử. Trên phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của một carbon carboxylic ở δC
181,62; một carbon hydroxymethine ở δC 79,05; hai carbon olefin dạng
>C=CH- ở δC 143,61 và 122,66; bảy carbon methyl ở δC 28,12; 15,56; 15,34;
17,13; 25,91; 33,08; 23,59. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR còn có các tín hiệu của
mười carbon methylene, ba carbon methine và sáu carbon bậc bốn nằm trong
khoảng δC 55,24 - 18,32 ppm. Từ các số liệu phổ phân tích trên kết hợp với so
sánh tài liệu tham khảo [30], cấu trúc của DL2 được khẳng định là oleanoic
acid, một triterpenoid loại olealane. Oleanolic acid là một trong những hợp chất
thể hiện nhiều hoạt tính sinh học và tồn tại tương đối phổ biến trong thực vật.
Các công bố cho thấy oleanoic acid thể hiện hoạt tính chống ung thư, bảo vệ gan,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
kháng viêm, kháng vi sinh vật…[31, 32].
33
3.2.3. Hợp chất -amyrin acetate (DL3)
Hình 3.8. Cấu trúc của -amyrin acetate
Hợp chất DL3 nhận được là một chất rắn không màu. DL3 có các tín hiệu
trên phổ NMR giống với DL2. Các tín hiệu của phổ 1 H- NMR xuất hiện tín hiệu
của tám nhóm methyl singlet ở δH 0,80; 0,83; 0,87; 0,88; 0,91; 0,97; 1,01; và 1,07;
một proton olefin ở δH 5,13 (t, J = 3,5, H-12), một proton oxygen ở δH 4,51 (1H,
dd, J = 8,0; 10,0 Hz, H-3). Sự chuyển dịch hóa học về phía trường thấp của proton
oxygen cho phép kết luận nhóm acetate gắn ở vị trí số ba. Tất cả các thông tin trên
là tín hiệu đặc trưng của một terpenoid loại olealane.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của DL3 (500MHz, CDCl3)
34
Hình 3.10. Phổ 13C-NMR của DL3 (125 MHz, CDCl3)
Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của ba mươi hai carbon bao gồm sự có
mặt của một nhóm carbonyl ketone ở δC 170,99 (CH3CO -3), hai carbon olefin
ở δC 124,34 (C-12) và 139,65 (C-13), một carbon oxygen ở δC 80,98 (C-3) và
tám carbon methyl ở δC 28,08; 16,74; 15,75; 16,88; 23,24; 28,75; 17,50; 21,39;
170,99. Ngoài ra, phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của mười carbon
methylene, ba carbon methine và sáu carbon bậc bốn. Tất cả các dữ liệu trên
khẳng định cấu trúc của hợp chất DL3 là một triterpenoid loại olealane. Từ các
số liệu phổ phân tích trên kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [33, 34], cấu
trúc của DL3 được khẳng định là -amyrin acetate có công thức phân tử là
C30H50O2. -amyrin acetate lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Disporopsis.
-amyrin acetate thể hiện hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa và gây độc tế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
bào [35].
35
Bảng 3.2. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) (ppm) hợp chất DL3 và -amyrin acetate
DL3
-amyrin acetate
STT 1 2
C 38,49 23,38
C 39,59 27,93
H
3
80,98
80,80
4,50 (t, J = 8,0)
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
H 4,51 (1H, dd, J = 8,0; 10,0) - 1,26-1,44 (m) - - 1,80-1,91 (m) 5,13 (1H, t, J = 3.5) - - - 1,98 (d, J=4,5 Hz) - 0,91 (s) 0,97 (s) 0,87 (s) 1,01 (s) 1,07 (s) 0,83 (s) 0,88 (s) 0,80 s - 2,05 (3H, s)
39,59 55,24 18,19 33,73 38,37 47,40 35,55 23,59 121,62 145,20 42,05 28,73 27,93 32,85 59,0 40,01 41,52 31,23 42,01 29,69 15,72 15,72 16,84 23,59 28,73 17,50 21,39 170,8 21,32
- 1,33-1,52 (m) - - 1,63-1,80 (m) 5,18 (t, J = 3,5 Hz) - - - 1,93 (d, J = 4,2 Hz) 0,88 (s) 0,96 (s) 0,86 (s) 0,97 (s) 1,13 (s) 0,83 (s) 0,88 (s) 0,87 (s) - 2,05 (s)
37,73 55,29 18,26 32,89 40,05 47,67 36,82 23,62 124,34 139,65 42,10 28,11 26,62 33,76 59,09 39,62 39,67 31,26 41,55 28,08 16,74 15,75 16,88 23,24 28,75 17,50 21,39 CH3CO 170,99 21,30 CH3CO
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
36
3.2.4. Hợp chất neoilexonol acetate (DL4)
Hình 3.11. Cấu trúc của neoilexonol acetate
Hợp chất DL4 nhận được là một chất rắn không màu. Phổ hồng ngoại FT-
IR cho các đỉnh hấp thụ tại (cm-1) 1732 (C=O), 1455 (C=C), 1243 (C-O).
Hình 3.12. Phổ IR của DL4
DL4 có các tín hiệu trên phổ NMR gần giống với DL3. Phổ 1 H- NMR cho
thấy tín hiệu của một proton olefin ở δH 5,54 (1H, s, H-12), một proton methine at
δH 4,52 (1H, dd, J = 4,5; 12,0 Hz), tám nhóm methyl singlet ở δH 0,82 (3H, s, H-
23) ; 0,88 (3H, s, H-24) ; 1,19 (3H, s, H-25), 1,17 (3H, s, H-26); 1,29 (3H, s, H-27);
0,95 (3H, s, H-28); 0,88 (3H, s, H-30) và 2,05 (3H, s, CH3CO) và một nhóm methyl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
doublet ở δH 0,80 (3H, d, J =6,0 Hz, H-29). Các tín hiệu methyl trên cung cấp thông
37
tin về sự có mặt của một terpenoid loại ursane.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của DL4 (500MHz, CDCl3)
38
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của DL4 (125 MHz, CDCl3)
39
Hình 3.15. Phổ HSQC giãn của DL4
Phổ 13C-NMR và phổ HSQC cho thấy tín hiệu của ba mươi hai carbon
bao gồm sự có mặt của hai nhóm carbonyl ketone ở δC 170,96 (CH3CO -3) và
199,66 (C-11), hai tín hiệu carbon olefin ở δC 130,41 (C-12) và 164,92 (C-13),
một nhóm oxymethine ở δC 80,67 (C-3), tám nhóm methyl ở δC 28,06 (C-23),
16,71 (C-24), 16,54 (C-25), 20,49 (C-26), 18,15 (C-27), 28,83 (C-28), 17,46
(C-29); 21,28 (C-30) và và một carbon oxygen ở δC 21,12 (CH3CO), tám carbon
methylene, ba carbon methine và năm carbon bậc bốn. Tất cả các dữ liệu trên
có thể kết luận cấu trúc của hợp chất DL4 là một triterpenoid loại ursane. Vị trí
của các nhóm thế trong hợp chất DL4 được khẳng định bằng các tương tác
trong phổ HMBC gồm tương tác giữa H-3 (H 4,52 ) với C-1 (C 38,91), C-23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(C 28,06), C-24 (C 16,71).
40
Hình 3.16. Phổ HMBC giãn của DL4
Hình 3.17. Các tương tác chính trên phổ HMBC của DL4
Cấu trúc của hợp chất DL4 được khẳng định là neoilexonol acetate khi
so sánh các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của DL4 với tài liệu tham khảo
[36]. Neoilexonol acetate lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Disporopsis.
Neoilexonol acetate thể hiện hoạt tính gây độc tế bào và tăng sinh đối với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
nguyên bào sợi [35].
41
Bảng 3.3. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C NMR (CDCl3, 125 MHz)
(ppm) hợp chất DL4 và neoilexonol acetate
neoilexonol acetate
STT
HSQC
H (ppm)
H (ppm)
1 2
DL4 C (ppm) 38,91 23,59
C (ppm) 38,9 23,6
CH2 CH2
3
CH
80,67
80,6
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
38,04 55,02 40,93 32,82 33,93 61,45 36,83 199,66 130,41 164,92 43,65 27,51 27,24 45,13 59,02 39,22 39,30 31,58 30,90 28,06 16,71 16,54 20,49 18,53 28,83 17,46 21,28 170,96 21,12
4,52 (dd, J = 4,5; 12,0) - - 2,35 (s) - - 5,54 (s) - - - 0,82 (s) 0,88 (s) 1,19 (s) 1,17 (s) 1,29 (s) 0,95 (s) 0,80 (d, J = 6,0 Hz) 0,88 (s) - 2,05 (s)
38,0 55,0 40,9 32,8 33,93 61,4 36,8 199,7 130,4 165,0 43,6 28,8 27,2 45,1 59,0 39,2 39,3 27,4 30,9 28,0 16,7 16,5 20,5 18,53 27,5 17,4 21,3 171,0 21,1
4,52 (dd, J = 5,4; 11,6 Hz) 5,54 (s) 0,82 (s) 0,88 (s) 1,04 (s) 1,17 (s) 1,29(s) 0,95 (s) 0,80 (d, J = 5,7 Hz) 0,88 (s) - 2,05 (s)
C CH CH2 CH2 C CH C C=O CH= C= C CH2 CH2 C CH CH CH CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CO C=O CH3CO CH3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
42
KẾT LUẬN
Sau một thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả sau:
- Đã phân tích được thành phần hóa học của cặn chiết ethyl acetate cây
Hoàng tinh hoa trắng cho bẩy vệt chất.
- Đã phân tích và xác định được cấu trúc của bốn chất tinh khiết là β-
sitosterol, oleanolic acid, -amyrin acetate và neoilexonol acetate được phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
lập từ cặn chiết ethyl acetate của cây Hoàng tinh hoa trắng bằng các phương pháp phổ hiện đại FT-IR, 1D-NMR và 2D-NMR.
43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. L.D. Field, S. Sternhell, J.R. Kalman, Organic structures from spectra, 4th
Ed., John Wiley and Sons, Ltd., England, 2008.
2. R.M. Silverstein, F.X. Webster, D.J. Kiemle, Spectrometric identification of organic compounds, 7th Ed., John Wiley & Sons, Inc., USA, 2005. 3. Nguyễn Đình Triệu, phương pháp phổ khối lượng và sắc ký - khối phổ,
NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội, 2018.
4. Nguyễn Đình Triệu, các phương pháp phổ trong hóa học hữu cơ và sinh
hóa, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội, 2007.
5. D.L. Pavia, G.M. Lampman, G.S. Kriz, Introduction to spectroscopy - A guide for students of organic chemistry, Thomson Learning, Inc, USA, 2001. 6. Từ Văn Mặc, Phân tích hóa lý - Phương pháp phổ nghiệm nghiên cứu cấu
trúc phân tử, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003.
7. Schrader B, Infrared and Raman Spectroscopy: Methods and Applications.
New York: VCH, Weinheim., 1995, 787.
8. Smith JG, "Chapter 13 Mass Spectrometry and Infrared Spectroscopy" (Book). Organic chemistry (3rd ed.). New York, NY: McGraw-Hill., 2011, 463–488.
9. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, NXB
ĐH QG TP. Hồ Chí Minh, 2005.
10. March RE, "Quadrupole ion trap mass spectrometry: a view at the turn of the century". International Journal of Mass Spectrometry, 2000, 200 (1–3): 285–312.
11. Lal Dhar Singh Yadav, Organic Spectroscopy, Springer, 2013, 197–199. 12. Keeler, James, Understanding NMR Spectroscopy, John Wiley & Sons,
2010, 457.
13. Geerten W. Vuister and Ad Bax, Resolution Enhancement and Spectral Editing of Uniformly 13CEnriched Proteins by Homonuclear Broadband 13C Decoupling, Journal of Magnetic Resonance, 1992, 98 (2), 428–435 14. Claridge, Timothy D.W., High Resolution NMR Techniques in Organic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Chemistry, 3rd ed. Elsevier, 2016, 315. 15. The Plant List, Retrieved 27 May, 2020. 16. https://en.wikipedia.org/wiki/Disporopsis
44
17. Zhu gen qi shu, Disporopsis Hance, J. Bot., 1883, vol 24, 232. 18. Zhu, F., Yuan, C., Gang, F., Yang, C., Wu, W., & Zhang, Bioassay-Guided Isolation of Antifungal Compounds from Disporopsis aspersa (Hua) Engl. ex Diels against Pseudoperonospora cubensis and Phytophthora infestans, Chemistry & Biodiversity, 2018, 15(7), 157-169.
19. T. Nguyen, J. Fontaine, H. Malonne, P. Duez, ‘Homoisoflavanones from
Disporopsis aspera’, Phytochemistry, 2006, 67, 2159 - 2163.
20. Yang, Q.-X., Xu, M., Zhang, Y.-J., Li, H.-Z., & Yang, C.-R., Steroidal Saponins from Disporopsis pernyi. Helvetica Chimica Acta, 2004, 87(5), 1248–1253.
21. Wang, Y., Li, S., Han, D., Meng, K., Wang, M., & Zhao, C. (2015). Simultaneous Determination of Rutin, Luteolin, Quercetin, and Betulinic Acid in the Extract of Disporopsis pernyi (Hua) Diels by UPLC. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2015, doi: 10.1155/2015/130873.
22. Gang, F.-L., Zhu, F., Yang, C.-F., Li, X.-T., Yang, H., Sun, M.-X., … Zhang, J.-W, Antifungal, anti-inflamatory and neuritogenic activity of newly-isolated compounds from Disporopsis aspersa, Natural Product Research, 2020, 34 (11), 1521-1527.
23. Nguyễn Tiến Bân, Trần Đình Lý, Nguyễn Tập, Vũ Văn Dũng, Nguyễn Nghĩa Thìn, Nguyễn Văn Tiến, Nguyễn Khắc Khôi, Sách đỏ Việt Nam. Phần II. Thực vật, 2007, 385.
24. Viện dược liệu, Cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kĩ thuật, 1990, 175. 25. Ludwiczuk, K. I. Georgiev, Terpenoid, Skalicka-Woźniak, M.
Pharmacognosy, 2017, 233-266
26. Sultana, S., Saleem, M., Sharma, S., and Khan, N., Indian J. Exp. Biol.,
2003, vol. 41, 827–831.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
27. Houghton, P. J., Mensah, A. Y., Iessa, N., & Yong Hong, L., Terpenoids in Buddleja: relevance to chemosystematics, chemical ecology and biological activity Phytochemistry, 2003, 64(2), 385–393.
45
28. V. S. P. Chartuvedula, I. Prakash, Isolation of stigmasterol and β-sitosterol the dichloromethane extract of Rubus shuavissimus, International Current Pharmaceutical Journal, 2012, 1 (9), 239-242.
29. S. Saiedina, A. Manayi, A. R. Gohari, M. Abdollahi, The Story of β- sitosterolA review, European Journal of Medicinal Plants, 2014, 4 (5), 590- 609.
30. Chi-Ren Liao, Yueh-Hsiung Kuo, Yu-Ling Ho, Ching-Ying Wang, Chang - Syun Yang, Cheng-Wen Lin and Yuan-Shiun Chang. Studies on Cytotoxic Constituents from the Leaves of Elaeagnus oldhamii Maxim. in Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells. Molecules, 2014, 19, 9515-9534.
31. Helen Alvarado, Guadalupe Abrego, Eliana Souto, et al., Nanoemulsions for Dermal Controlled Release of Oleanolic and Ursolic Ac-ids: In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Characterization. Colloids Surf. B Biointerfaces, 2015, 130, 40-47.
32. Juliane Liese, Behnaz Ahangarian Abhari, Simone Fulda, Smac Mimetic in Human
and Oleanolic Acid Synergize Toinduce Cell Death Hepatocellular Carcinoma Cells, Cancer Letters, 2015, 365, 47-56.
33. Rosnani nasution, Mustanir, Mariane and Iswani Marzuki, Isolation compound anti-obesity from the bark ara (Ficus racemosa) of aceh, Oriental journal of chemistry, 2016, 32(5), 2693-2699.
34. Virgilio D. Ebajo Jr., Chien-Chang Shen, Consolacion Y. Ragasa1, Terpenoids and Sterols from Hoya multiflora Blume, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2015, 5 (4), 033-039.
35. Tsutomu Warashina, Kaoru Umehara, and Toshio Miyase, Constituents from the Roots of Taraxacum platycarpum and Their Effect on Proliferation of Human Skin Fibroblasts, Chem. Pharm. Bull, 2012, 60(2), 205—212
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
36. Ogawa S., Wakatsuki Y., Makino M., Fujimoto Y., Yasukawa K., Kikuchi T., Ukiya M., Akihisa T., Iida T., Oxyfunctionalization of unactivated C–H bonds in triterpenoids with tert-butylhydroperoxide catalyzed by meso-5,10,15,20-tetramesitylporphyrinate osmium(II) carbonyl complex, Chem. Phys. Lipids, 2010, 163, 165—171.
46
PHỤ LỤC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
I
Phụ lục 1. Các phổ của β-sitosterol (DL1)
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của β-sitosterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR giãn của β-sitosterol
II
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR giãn của β-sitosterol
III
Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của β-sitosterol
Phổ 13C-NMR giãn của β-sitosterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ DEPT của β-sitosterol
IV
Phụ lục 2. Các phổ của oleanolic acid (DL2)
Phổ ESI-MS của oleanolic acid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR của oleanolic acid (500MHz, CDCl3)
V
Phổ 1H-NMR của giãn oleanolic acid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR giãn của oleanolic acid
VI
Phổ 13C-NMR của oleanolic acid (125 MHz, CDCl3)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 13C-NMR giãn của oleanolic acid
VII
Phổ DEPT của oleanolic acid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ DEPT giãn của oleanolic acid
VIII
Phụ lục 3. Các phổ của -amyrin acetate (DL3)
Phổ 1H-NMR của -amyrin acetate (500MHz, CDCl3)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR giãn của -amyrin acetate (500MHz, CDCl3)
IX
Phổ 1H-NMR giãn của -amyrin acetate (500MHz, CDCl3)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 13C-NMR của -amyrin acetate (125 MHz, CDCl3)
X
Phổ 13C-NMR giãn của -amyrin acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 13C-NMR giãn của -amyrin acetate
XI
Phụ lục 4. Các phổ của neoilexonol acetate (DL4)
Phổ IR của neoilexonol acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR của neoilexonol acetate (500MHz, CDCl3)
XII
Phổ 1H-NMR giãn của neoilexonol acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 1H-NMR giãn của neoilexonol acetate
XIII
Phổ 13C-NMR của neoilexonol acetate (125 MHz, CDCl3)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ 13C-NMR giãn của neoilexonol acetate
XIV
Phổ 13C-NMR giãn của neoilexonol acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ HSQC của neoilexonol acetate
XV
Phổ HSQC giãn của neoilexonol acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ HSQC giãn của neoilexonol acetate
XVI
Phổ HMBC của neoilexonol acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ HMBC giãn của neoilexonol acetate
XVII
Phổ HMBC giãn của neoilexonol acetate
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ HMBC giãn của neoilexonol acetate
XVIII
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phổ HMBC giãn của neoilexonol acetate
XIX
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Phụ lục 5. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao chiết
