Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc, hàm lượng của zerumbon được phân lập từ củ gừng gió bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:76

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn này tập trung vào nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc và phương pháp định lượng zerumbon bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. Để hiểu rõ hơn mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của Luận văn này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Phân tích cấu trúc, hàm lượng của zerumbon được phân lập từ củ gừng gió bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ OANH PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA ZERUMBON ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CỦ GỪNG GIÓ BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Thái Nguyên-2018
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn: Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Thắm cô đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, cô đã tận tình hướng dẫn để em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trường THPT Nguyễn Trãi - An Dương- Hải Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn. Em xin cảm sự hỗ trợ của nhóm nghiên cứu công ty TNHH Công nghệ cao Hải Anh đã hỗ trợ cùng hoàn thành các kết quả thực nghiệm. Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã dạy dỗ em nên người! Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ em hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Oanh a
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... a MỤC LỤC ..................................................................................................... b DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... c DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... d DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... e DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................... f MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chương 1 TỔNG QUAN .............................................................................. 2 1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc ................................. 2 1.1.1. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4] ........................................... 2 1.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1] ................................................ 4 1.1.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................ 5 1.2. Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC [23]................................... 10 1.3. Đặc điểm thực vật cây gừng gió .......................................................... 14 1.4. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) ............. 14 1.5. Các đặc trưng của zerumbon.................................................................. 20 1.5.1. Phân lập và chuyển hóa zerumbon ...................................................... 20 1.5.2. Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbon ................................. 22 1.6. Mục tiêu của luận văn .......................................................................... 23 Chương 2 THỰC NGHIỆM ........................................................................ 24 2.1. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị................................ 24 2.1.1. Phương pháp nghiên cứu................................................................... 24 2.1.2. Hóa chất và dung môi ....................................................................... 24 2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng ........................................................................................... 24 2.1.4. Xác nhận cấu trúc .............................................................................. 24 2.2. Chuẩn bị mẫu zerumbon ...................................................................... 25 2.2.1. Chuẩn bị mẫu gừng gió ..................................................................... 25 b
2.2.2. Chưng cất tinh dầu gừng gió ............................................................. 25 2.2.3. Phân lập zerumbon ............................................................................ 26 2.3. Phân tích cấu trúc zerumbon bằng các phương pháp phổ.................... 27 2.3.1. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR ................................. 27 2.3.2. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ MS................................ 27 2.3.3. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 1H-NMR ....................... 27 2.3.4. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 13C-NMR...................... 28 2.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ 2D (HSQC, HMBC, NOESY) ...................................................................................................... 28 2.5. Phân tích độ sạch của zerumbone bằng LC ......................................... 29 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 30 3.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................... 30 3.2. Kết quả chuẩn bị mẫu nghiên cứu ........................................................ 30 3.2.1. Phân tách tinh dầu ............................................................................. 30 3.2.2. Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu .......................................... 30 3.2.3. Phân tách zerumbone bằng sắc ký cột .............................................. 31 3.3. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR .................................... 31 3.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ MS ................................. 33 3.5. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR ............................. 34 3.6. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC .......... 37 3.7. Phân tích độ sạch của zerumbone bằng phương pháp LC ................... 41 KẾT LUẬN ................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 44 c
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS Phương pháp phổ khối lượng EI Phương pháp bắn phá bằng dòng electron CI Phương pháp ion hóa hóa học FAB Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh GC Phương pháp sắc ký khí LC Phương pháp sắc ký lỏng IR Phương pháp phổ hồng ngoại SKLM Sắc kí lớp mỏng TMS Chất chuẩn HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều biểu hiện tương tác trực tiếp giữa H với C mà nó liên kết trực tiếp. 1H-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hiđro 13C-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cacbon COSY Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương tác của các proton gần nhau trong không gian DEPT Phương pháp ghi phổ HMBC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương tác xa của nguyên tử 1H với 13C c
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Sự va chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của phân tử. .......................................................................................................... 2 Sơ đồ 1.2: Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion ........................................................................................................... 3 Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử ........................................................... 3 d
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 ) .................................... 4 Hình 1.2. Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic .......................................... 5 Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit ............................... 7 Hình 1. 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều ........................................................... 9 Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan ..................................................... 10 Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC .................................................... 11 Hình 1.7. Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.) ................................. 14 Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất zerumbon ................................................... 32 Hình 3.2. Phổ MS của hợp chất zerumbone ............................................... 33 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone....................................... 35 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone ............................... 35 Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất zerumbone...................................... 36 Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất zerumbone ........................................... 37 Hình 3.7. Phổ HSQC giãn của hợp chất zerumbone................................... 38 Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất zerumbone ......................................... 40 Hình 3.9. Phổ HMBC giãn của hợp chất zerumbone.................................. 40 Hình 3.10. Một số tương tác của H với C trong HMBC............................. 41 Hình 3.11. Phổ LC và dữ liệu MS bắn phá đỉnh 2.18 ................................. 42 Hình 3.12. Đường chuẩn LC của zerumbone ............................................. 42 e
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió ....................... 15 Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió .......................... 16 Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió .................. 17 Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế ................ 19 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát TDZ bằng SKLM ............................................. 31 f
MỞ ĐẦU Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ. Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng. Mỗi phương pháp cho ph p xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) là cây thuốc quen thuộc của các dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên Việt Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước nhiệt đới Châu Á, được sử dụng làm các bài thuốc chữa đau bụng, bồi dưỡng cho phụ nữ sau khi sinh nở, chống nôn, cảm gió… Gần đây, những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy Gừng gió có hàm lượng zerumbon rất cao (73,2% trong tinh dầu củ). Kết quả nghiên cứu in vivo và in vitro cho biết zerumbon không những có khả năng kháng khuẩn mà còn có khả năng chống ung thư mạnh và đang được đưa vào thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn III. Do có cấu trúc phức tạp, hoạt tính sinh học mạnh nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Luận văn này tập trung vào nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc và phương pháp định lượng zerumbon bằng các phương pháp hóa lý hiện đại. 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về c c phƣơng ph p c nh cấ c 1.1.1. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4] Phổ khối lượng là phương pháp công cụ xác định cấu trúc khác nhiều nhất so với các phương pháp sẽ được nói đến ở chương này. Phương pháp phổ khối lượng không phụ thuộc vào sự hấp thụ chọn lọc các tần số cụ thể của bức xạ điện từ mà chú trọng nhiều hơn những gì xảy ra với phân tử khi nó bị bắn phá bởi các electron có năng lượng cao. Nếu một electron có năng lượng khoảng 10 electronvolt ( 10 eV = 230,5 kcal/mol) va chạm với một phân tử hữu cơ thì năng lượng được chuyển giao do kết quả của sự va chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của phân tử. A:B + e →. + 2e- Phân tử electron cation gốc Hai electron Sơ đồ 1.1: Sự va chạm để làm bật ra một trong các electron của phân tử. Chúng ta nói phân tử AB bị ion hóa bởi sự va chạm electron. Dạng thu được gọi là ion phân tử mang điện tích dương và có số lẻ electron, được gọi là cation gốc. Ion phân tử có cùng khối lượng (k m hơn một khối lượng không đáng kể của một electron) như phân tử mà từ đó nó được tạo thành. Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ: 2
ABC 2e (1) > 95% ABC e 2 ABC 3e (2) ABC- Sơ đồ 1.2: Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV. ABC A BC ABC AB B AB A B Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Các ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.1). 3
Hình 1.1. Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 ) Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau. 1.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1] Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất. Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có hai loại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết. Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định (Hình 1.2). 4
Hình 1.2. Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau. Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ khoảng 3000 cm-1 đến 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay. 1.1.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [1] Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến 5
được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13 C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [2]. Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13 C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:  TMS  x 6  .10 ( ppm) o Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:  chuan  x 6  .10 ( ppm) o Trong đó: νchuẩn, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3]. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm. 6
Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi là vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [3]. Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [2]. Phổ 2D-NMR NMR (nuclear magnetic resonance) là kỹ thuật có giá trị nhất để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR có hạn chế là chỉ áp dụng cho các hạt nhân nguyên tử với số hiệu nguyên tử (số thứ tự Z) lẻ 7
hoặc số khối (A) lẻ vì các nguyên tử loại này có spin hạt nhân thì mới có tính chất từ như 1H, 13C, 15N, 19F, 31P… Các hạt nhân không có tính từ như 2 D, 12C, 16O, 32S… không thể hiện trên phổ NMR. Ngày nay phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là công cụ hữu hiệu cho nhiều ngành khoa học như vật lý, hóa học, sinh học, dược học, y học, v.v. Nó đã đạt được nhiều thành công trong phạm vi chế tạo thiết bị, cải tiến phương pháp đo và ứng dụng. Một trong những hành động gần đây nhất là xây dựng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D- NMR), ba chiều (3D-NMR), bốn chiều (4D-NMR). Sự phát triển của phương pháp 2D-NMR đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích cấu trúc các phân tử phức tạp. Trước đây nhờ nâng cao cường độ từ trường nam châm, chế tạo các máy cộng hưởng từ hạt nhân có tần số cao từ 300 đến 1000 MHz đã làm giảm nhẹ đi một số khó khăn cho việc phân tích phổ 1H- NMR của các phân tử phức tạp, tuy nhiên trong nhiều trường hợp vẫn chưa giải quyết được chính xác được cấu tạo của chất, ngày nay phương pháp phổ 2D-NMR cho ta một lượng lớn thông tin, giúp cho việc phân tích phổ một cách dễ dàng hơn, đặc biệt phổ 3D-NMR cho ph p xác định cấu trúc các phân tử sinh học phức tạp. 8
Hình 1. 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều Cơ sở của phương pháp 2D-NMR dựa theo phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier do đó được gọi là phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier hai chiều (2D-FT-NMR). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều COSY hay HHCOSY chỉ ra sự tương tác của các proton ở hai nguyên tử C cạnh nhau. Khi có hai nhóm proton tương tác với nhau sẽ tạo ra hình vuông, hai đỉnh hình vuông nằm trên đường ch o, đó là vị trí hai tín hiệu của chúng còn hai đỉnh khác nằm phía ngoài đường ch o. Ví dụ phổ COSY của 2-clorobutan CH3-CH2-CH(Cl)-CH3 9
Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan Trên phổ thấy H-1(CH3, t) tương tác với H-3(m) tín hiệu của chúng tạo thành hình vuông, H-2 (CH3, d) tương tác với H-4 (m) tín hiệu của chúng cũng tạo thành hình vuông và H-3 tương tác với H-4 tương tự như vậy. 1.2. Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [23] Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High - Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các hợp chất không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC. 10
Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược nói riêng. Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC (1) Bình chứa pha ộng: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho ph p chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%. Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải. Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các pic tạp trong quá trình phân tích. (2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:  Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. 11
 Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC. Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích. (3) Bơm cao p: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút. (4) Bộ phận iêm mẫ : Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper). (5) Cộ sắc ký: Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng th p không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0,3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký. (6) Đầ dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp. Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360nm để phát hiện UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dò thông dụng nhất. - Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang. - Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng qu t chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất. - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường. - Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn. 12