ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
ĐÀM ĐÌNH TIẾP
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ LOÀI CƠM CHÁY
(SAMBUCUS JAVANICA REINW)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
THÁI NGUYÊN - 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
ĐÀM ĐÌNH TIẾP
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ LOÀI CƠM CHÁY
(SAMBUCUS JAVANICA REINW)
Ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8.44.01.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Phạm Văn Khang
THÁI NGUYÊN - 2020
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2020
Học viên
Đàm Đình Tiếp
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc của
mình tới PGS.TS Phạm Văn Khang - người thầy đã tin tưởng giao đề tài, tận
tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm
ơn tới các thầy, cô giáo và các học viên cao học K26 trong phòng thí nghiệm
Hóa hữu cơ đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn
thành các kế hoạch nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các em sinh viên nghiên cứu đề tài khoa học
hợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong trong việc tiến hành các thí
nghiệm thuộc đề tài luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạo
khoa Hóa và phòng Đào tạo sau đại học - trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2020
Học viên
Đàm Đình Tiếp
ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN .......................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN .................................... ix
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN ............................................. x
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Khái quát về loài Cơm cháy (Sambucus javanica) ...................................... 3
1.1.1. Tên khoa học ............................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 3
1.1.3. Phân bố ...................................................................................................... 6
1.1.4. Công dụng .................................................................................................. 6
1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số loài trong chi
Cơm cháy ............................................................................................................ 9
1.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa ............................................................................ 9
1.2.2. Hoạt tính kháng viêm, giảm đau .............................................................. 12
1.2.3. Hoạt tính kháng ung thư .......................................................................... 16
1.2.4. Hoạt tính hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, tim mạch và béo phì ............. 18
1.2.5. Tác dụng hạ đuờng huyết ........................................................................ 19
1.2.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm ..................................................... 20
1.2.7. Hoạt tính chống loãng xương .................................................................. 20
1.2.8. Hoạt tính kháng vi-rút.............................................................................. 21
iii
1.3. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài trong chi
Cơm cháy ........................................................................................................... 22
1.3.1. Hợp chất phenol ....................................................................................... 22
1.3.2. Flavonoid ................................................................................................. 22
1.3.3. Acid hữu cơ ............................................................................................. 26
1.3.4. Đường khử ............................................................................................... 28
Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 30
2.1. Hóa chất và thiết bị phân lập ...................................................................... 30
2.1.1. Hóa chất ................................................................................................... 30
2.1.2. Thiết bị ..................................................................................................... 31
2.2. Phương pháp sử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập được ............................................................................................. 31
2.2.1. Thu hái ..................................................................................................... 31
2.2.2. Xử lý và bảo quản .................................................................................... 32
2.3. Chiết xuất cao ............................................................................................. 32
2.4. Phương pháp định tính nhóm hợp chất hữu cơ trong cao chiết cồn ........... 32
2.4.1. Định tính polyphenol ............................................................................... 32
2.4.2. Định tính alkaloid .................................................................................... 33
2.4.3. Định tính các flavonoit ............................................................................ 33
2.4.4. Định tính các cumarin .............................................................................. 34
2.4.5. Phản ứng của Steroid (Phản ứng Liebermann - Burchardt) .................... 34
2.5. Chiết phân đoạn từ cao chiết tổng số .......................................................... 34
2.6. Phân lập hợp chất ........................................................................................ 35
2.6.1. Phân lập hợp chất 1-2 .............................................................................. 35
2.6.2. Phân lập hợp chất 3 .................................................................................. 36
2.7. Phương pháp xác định cấu trúc các chất .................................................... 37
2.8. Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa và ức chế phản ứng peroxy
hóa lipit não chuột ............................................................................................. 37
iv
2.8.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................. 37
2.8.2. Phương pháp ............................................................................................ 38
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 41
3.1. Kết quả định tính các nhóm chất của cao chiết tổng số ............................. 41
3.2. Kết quả xác định cấu trúc ........................................................................... 42
3.2.1. Chất 1 ....................................................................................................... 42
3.2.2. Chất 2 ....................................................................................................... 46
3.2.3. Chất 3 ....................................................................................................... 50
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết cồn tổng số .................. 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 57
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS : 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic
acid) diammonium
A23187 : Đại thực bào được kích thích
13C-NMR
CD4 : Tế bào lympho T được sinh ra từ tế bào gốc của
tủy xương. : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C
COSY : Phổ tương quan hai chiều H-H
DEPT : Phổ DEPT
DMBA : 7,12-Dimethyl benz[A]anthracene
DPPH : 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
END : Enterodiol
ENL : Enterolactone
ESI-MS : Phổ khối lượng
FRAP : Khả năng khử sắt của plasma khảo nghiệm
HMBC 1H-NMR : Phổ tương quan hai chiều H-C : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC-DAD-ESI-MSn : Sắc ký lỏng hiệu năng cao với phát hiện mảng diode
và khối phổ đa tầng ion hóa-tan-dem phun điện
HSQC : Phổ tương tác C-H
: Nồng độ ức chế 50% số cá thể IC50
IFN : Protein được sản xuất bởi tế bào của hệ miễn dịch
người và động vật nhằm chống lại tác nhân ngoại lai
như vi-rút, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư
IL-1α : Một dạng cytokine tiền viêm
IL-1β : Một dạng cytokine tiền viêm
IL-6 : Một dạng cytokine tiền viêm
IL-8 : Một dạng cytokine tiền viêm
IL-10 : Cytokine chống viêm
vi
IL-12 : Một cytokine được sản xuất bởi các đại thực bào và tế
bào đuôi gai hoạt hóa, kích thích sản xuất IFN-
LC : Sắc ký lỏng
LDL : Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp
: Liều chết 50% số cá thể LD50
LPS : Lipopolysacarit
LNCaP : Tế bào ung thư tiền liệt tuyến
: Dòng tế bào nguyên bào, có khả năng biệt hóa MC3T3-E1
thành nguyên bào xương và tế bào hủy xương
NP : Sắc ký pha thường
ORAC : Khả năng hấp thụ gốc oxi hóa
PBMC : Máu ngoại vi tế bào Mononuclear
PC-3 : Ung thư tiền liệt tuyến
ROS : Phản ứng oxi hóa
RP : Sắc ký pha đảo
SEM : Kính hiển vi điện tử quét
SKC : Sắc kí cột
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
SPF : Định mức đo lường khả năng chống lại tia UVB
(dùng trong kem chống nắng)
SW480 : Ung thư đại tràng
Tế bào T : Tế bào lympho miễn dịch
TNF-α : Yếu tố hoại tử khối u alpha
TRAP : Tổng tham số chất chống oxi hóa bẫy gốc
UV-VIS : Quang phổ tử ngoại - khả kiến
UMR-106 : Tế bào u xương ác tính ở chuột
UVA : Tia có bước sóng từ 320 nm đến 400 nm
UVB : Tia có bước sóng từ 290 nm đến 320 nm
UVR : Bức xạ tia cực tím
VIS : Quang phổ khả kiến
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng 1.1. Đặc điểm thực vật loài Cơm cháy ..................................................... 3
Bảng 1.2. Một số bài thuốc về cây Cơm cháy theo kinh nghiệm dân gian ở
Việt Nam ............................................................................................ 7
Bảng 1.3. Các nghiên cứu trong nước về hoạt tính chống oxy hóa ................. 10
Bảng 1.4. Các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính chống oxy hóa ............... 11
Bảng 1.5. Các nghiên cứu trong nước về hoạt tính kháng viêm, giảm đau ..... 12
Bảng 1.6. Các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng viêm, giảm đau ... 14
Bảng 1.7. Các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng ung thư ................ 17
Bảng 1.8. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất phenol từ các loài trong chi Cơm cháy .................................... 22
Bảng 1.9. Nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất flavonoid từ một số loài trong chi Cơm cháy .......................... 23
Bảng 1.10. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất flavonoid từ một số loài trong chi Cơm cháy .......................... 24
Bảng 1.11. Nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất acid từ một số loài trong chi Cơm cháy ................................... 26
Bảng 1.12. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất acid từ một số loài trong chi Cơm cháy ................................... 27
Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong quá trình phân lập các chất ......... 30
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng ........................................................................... 31
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ ..................................... 41
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất 1 ............................................................. 42
Bảng 3.3. Hoạt tính chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit của
mẫu nghiên cứu ................................................................................ 54
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG LUẬN VĂN
Hình 1.1. Hình ảnh loài Cơm cháy ...................................................................... 6
Hình 1.2. Cấu trúc của Kaemferol ..................................................................... 24
Hình 1.3. Công thức của các hợp chất thuộc nhóm anthocyanin phân lập
được từ loài Sambucus javanica ...................................................... 26
Hình 1.4. Công thức của các acid hữu cơ được phân lập được từ loài loài
Sambucus javanica .......................................................................... 28
Hình 1.5. Công thức của các đường khử được phân lập được từ loài loài
Sambucus javanica .......................................................................... 29 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của chất 1 .................................................................... 43 Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất 1 ................................................................... 44
Hình 3.3. Phổ HSQC của chất 1 ........................................................................ 45
Hình 3.4. Phổ HMBC của chất 1 ....................................................................... 45
Hình 3.5. Phổ khối lượng của chất 1 ................................................................. 46
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất 1 ............................................................... 46 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của chất 2 .................................................................... 47 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của chất 2 ................................................................... 47
Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của chất 2 ................................................................. 48
Hình 3.10. Phổ HSQC của chất 2 ...................................................................... 49
Hình 3.11. Phổ HMBC chất 2 ........................................................................... 49
Hình 3.12. Phổ khối lượng của 2 ....................................................................... 50
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của 2 .................................................................. 50 Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của chất 3 .................................................................. 51 Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của chất 3 ................................................................. 51
Hình 3.16. Phổ DEPT-135 của chất 3 ............................................................... 52
Hình 3.17. Phổ HSQC của chất 3 ...................................................................... 52
Hình 3.18. Phổ HMBC của chất 3 ..................................................................... 53
Hình 3.19. Phổ khối lượng của 3 ....................................................................... 53
Hình 3.20. Công thức cấu tạo của 3 .................................................................. 54
ix
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tạo cao chiết cồn tổng số ........................................................ 32
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tạo cao chiết phân đoạn .......................................................... 35
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập chất 1-2 .................................................................... 36
Sơ đồ 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất 3 ................................................................ 37
x
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những
hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh
học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh.
Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có
hệ thực vật đa dạng và phong phú. Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng,
chữa bệnh và nâng cao sức khỏe cho con người đã có một quá trình lịch sử
hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng. Việc khai thác và sử dụng
các loài thực, động vật để làm thuốc và hỗ trợ chữa bệnh đã được thực hiện từ
lâu. Tuy nhiên, nhiêu cây thuốc mới chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân
gian mà chưa được nghiên cứu một cách toàn diện. Vì vậy, việc nghiên cứu các
cây thuốc, làm sáng tỏ kinh nghiệm dân gian trên phương diện khoa học hiện
đại để nâng cao giá trị cây thuốc là rất cần thiết.
Hiện nay, xu hướng nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt
tính sinh học cao từ các loài động thực vật làm dược phẩm chữa bệnh ngày
càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học. Từ thực tế, nhận thấy các
hợp chất thiên nhiên thường có hoạt tính mạnh, độ ổn định cao và có độc tính
thấp so với các hợp chất nguồn gốc tổng hợp.
Loài Cơm cháy (Sambucus javanica) thuộc họ Ngũ phúc hoa
(Adoxaceae). Trong Đông y, các loài thuộc chi cơm cháy đã được sử dụng từ
lâu để chữa một số bệnh như: Khứ phong trừ thấp, hoạt huyết, tan ứ, nhuận
tràng, lợi tiểu [15]. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết cao
tổng số và hợp chất hóa học được phân lập từ các loài thực vật này có tác dụng:
Kháng viêm, hạ đường huyết, chống oxi hóa, ức chế tế bào ung thư [5].
Với mục tiêu nghiên cứu nhằm bổ sung một cách toàn diện hơn về loài
Cơm cháy (Sambucus javanica) ở Việt Nam về thành phần hóa học, bước đầu
thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được, cũng như đánh giá
1
khả năng chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit não chuột từ cao
chiết lá cây Cơm cháy, chúng tôi chọn đề tài “Xác định thành phần hóa học
và đánh giá hoạt tính của một số hợp chất hóa học từ loài Cơm cháy
(Sambucus javanica Reinw)”
Đề tài được hoàn thành sẽ cung cấp các thông tin khoa học giá trị làm cơ
sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh và
sàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
2. Mục tiêu của đề tài
2.1. Đánh giá thành phần hóa học bằng phản ứng định tính
2.2. Phân lập và xác định cấu trúc ít nhất 3 hợp chất từ lá loài cơm cháy
(Sambucus javanica)
2.3. Tiến hành thử hoạt tính chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit
não chuột từ cao chiết của lá loài Cơm cháy (Sambucus javanica)
2
Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về loài Cơm cháy (Sambucus javanica)
Chi Cơm cháy (Sambucus) thuộc bộ tục đoạn (Dipsacales) họ Ngũ phúc
hoa (Adoxaceae). Chi này gồm nhiều loài, phổ biến nhất là các loài sau:
Sambucus chinensis Lindl; Sambucus nigra; Sambucus javanica Reiwn;
Sambucus simpsonii Rehder và Sambucus williamsii.Ở Việt Nam đã ghi nhận
sự có mặt của các loài Sambucus chinensis Lindl; Sambucus nigra; Sambucus
simpsonii Rehder và Sambucus javanica Reiwn. Trong luận văn này, chúng tôi
tiến hành các nghiên cứu trên loài Sambucus javanica Reiwn.
1.1.1. Tên khoa học
Tên khoa học: Sambucus javanica Reinw, Họ: Adoxaceae (Ngũ phúc
hoa), chi: Sambucus.
Tên khác: Cây cơm cháy [2],[11], [15] sambucus hookeri Rehder [6], cơm
cháy Hooker [6], Javanese elder berry [6].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Mô tả [2]: Một số đặc điểm thực vật của loài Cơm cháy được mô tả trong
bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm thực vật loài Cơm cháy
Đặc điểm Loài Cơm cháy
Cây Kích thước của lá kép
Số lượng lá chét Kích thước của lá chét
Hình thái
Cây bụi nhỡ, cao từ 1 đến 3 mét. Chiều dài: 25-28cm Chiều rộng: 12-14 cm 7 hoặc 9 lá, ít gặp 5 lá Chiều dài: 9-10 cm Chiều rộng: 3-4 cm Mỏng, mền, sờ cảm thấy ráp tay. 9 đến 12
5 đến 10 mm
Phiến lá Số đôi ngân phụ của lá chét Chiều dài của cuống lá chét
3
Đặc điểm Loài Cơm cháy
Đường kính của hoa 1,5 đến 2,5 mm
Đài hoa Có đỉnh nhọn
Cánh hoa Có đỉnh nhọn
Số ô của bầu 3
Số thùy của núm nhụy 3
Thể tuyến
Cụm hoa có các thể tuyến hình chén, đường kính 2-3 mm, màu vàng hoặc xanh.
Lông che chở Chỉ có ở biểu bì phía trên.
Gồm có 3 đến 4 hàng tế bào. Mô dày
Vi phẫu lá libe-gỗ hình 1
Số đám vòng cung ở gân chính
Mô dày
Phân bố đều đặn, tạo thành vòng theo thiết diện của thân. Vi phẫu thân
Lớp bần không bị bong ra. Bần
Không có. Vi phẫu rễ Các khuyết trong phần mô mền vỏ
Tia ruột
Tia ruột rộng gồm từ 2 đến 4 dãy tế bào.
Mô mền ruột Có
Bột lá Lông che chở đơn bào Có đầu tù
Hạt tinh bột Bột thân Có các hạt tinh bột với hình dạng đặc trưng.
Từ 18 đến 21 µm. Bột hoa Đường kính của hạt phấn hoa
Hạt tinh bột
Hạt đơn, không có hạt kép đôi hoặc kép ba.
Không tìm thấy
Bột rễ Tinh thể canxi oxalat hình khối
Có
Tế bào có thành dày hóa gỗ
4
Dưới đây là tiêu bản và một số hình ảnh của loài Cơm cháy
B A
D C
F E
5
H G
(A) Tiêu bản của loài Cơm cháy [3] (B) Hoa của loài Cơm cháy (C,D) Quả của loài Cơm cháy (E,F) Lá của loài Cơm cháy (G,H) Thân của loài Cơm cháy
Hình 1.1. Hình ảnh loài Cơm cháy
1.1.3. Phân bố
Cây mọc hoang ở miền núi, ven suối, bờ khe từ Lai Châu, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Thái tới Lâm Đồng [2],[6], [15]. Ngoài ra, cây Cơm cháy
còn được trồng làm cây cảnh [15].
1.1.4. Công dụng
Cơm cháy là một cây thảo dược đã được sử dụng từ lâu trong dân gian ở
nước ta cũng như một số nước trên thế giới. Thảo dược Cơm cháy có tính ấm,
có vị chua có tác dụng hỗ trợ điều trị đau nhức xương khớp, bong gân, phong
thấp, đau nhức, viêm khí quản… do thời tiết [15]. Việc điều trị các bệnh khác
nhau thì liều lượng cũng như cách dùng loại thảo dược này cũng có sự khác
nhau nhất định. Dưới đây là một số tài liệu nói về công dụng cũng như cách sử
dụng cây Cơm cháy trong điều trị bệnh một số bệnh thường gặp.
Theo tài liệu của Võ Văn Chi [1], rễ của cây Cơm cháy (sambucus
javanica) được dùng để chữa gẫy xương, phong thấp, ngã tổn thương. Thân và
lá trị viêm phù thũng, dùng ngoài chữa ngứa, eczema. Ngoài ra, vỏ cây và dễ
cây được dùng cho người thần kinh bị kích động.
6
Theo tài liệu của GS Đỗ Tất Lợi [10], lá cây Cơm cháy (Sambucus
javanica) dùng để tắm cho phụ nữ mới sinh. Quả có tác dụng lọc máu, thông
tiểu, nhuận tràng, giải độc, điều trị kiết lỵ, thấp khớp. Vỏ có tác dụng nhuận
tràng và thông tiểu. Hoa có tác dụng lợi tiểu, ra mồ hôi.
Theo tài liệu của Phạm Hoàng Hộ [6], lá trị tê thấp, đấp dập; hoa, trái
có tác dụng lọc máu, xổ và lợi tiểu, trị bình da; cây có tác dụng lợi tiểu,
trấn luyến súc.
Theo sách Cây thuốc và vị thuốc của lương y Hy Lãn Hoàng Văn Vinh
[15], cây Cơm cháy có vị chua, tính ấm, có tác dụng khử phong trừ thấp, hoạt
huyết tán ứ. Dùng chữa phong thấp đau nhức, cước khí phù thũng, kiết lị,
hoàng đản, viêm khí quản mãn, phong chẩn, mụn nhọt lở loét sưng đau, đòn
ngã chấn thương.
Theo TS Nguyễn Thu Hằng [2], cây Cơm cháy có nhiều ở khắp nơi trên
đất nước, được nhân dân sử dụng để làm lành vết thương, chữa chấn thương,
gãy xương và các bệnh về đường tiêu hóa...
Một số nước trên thế giới đã biết sử dụng các sản phẩm từ cây cơm cháy
từ lâu. Tại Thái lan, cây Cơm cháy được dùng để chữa trị các vết thương, gẫy
xương, phù thũng và các chứng phù nề cơ thể.
Một số bài thuốc có sử dụng vị Cơm cháy được tổng hợp trong bảng 1.2
Bảng 1.2. Một số bài thuốc về cây Cơm cháy theo kinh nghiệm dân gian
ở Việt Nam
Bài thuốc Cách làm
Tên truyền thống Bộ phận đƣợc sử dụng
Dùng rễ cây cơm cháy 90 – Tài liệu tham khảo
Chữa tiểu 120 g, hầm với 200 g thịt lợn, [15]
tiện nhỏ chia 2 lần ăn nhiều lần trong
giọt ngày. Mỗi liệu trình 10 ngày.
7
Bài thuốc Cách làm
Tên truyền thống Bộ phận đƣợc sử dụng
Tài liệu tham khảo Dùng rễ cây cơm cháy 20 g,
sắc 500 ml nước và 200 ml
Chữa chấn rượu, đun nhỏ lửa còn 200 [15]
thương ml, lọc bỏ bã, thêm 30 g
Rễ bầm tím, đường trắng trộn đều uống. Cây
đau nhức Dùng mỗi liệu trình 5 ngày. Cơm
người do Ngoài ra, dùng rễ cây cơm cháy
ngã cháy 20 g phần, giã nát, cho
thêm ít rượu, trộn đều, sao
nóng, đắp lên những chỗ
sưng rồi dùng băng cố định
lại, sau 3 giờ thay thuốc,
ngày đắp 2 lần.
Hỗ trợ điều Dùng rễ cây cơm cháy 20 -
trị phong 30 g sắc nước 700 ml nước, [15]
thấp, khớp uống trong ngày; đồng thời
xương nấu lấy nước đặc rửa chỗ
sưng đau đau.
Chữa ghẻ Dùng lá cơm cháy 20 g, sắc
lở, vết lấy nước đặc, rửa vào vết [15]
thương thương. Dùng liền 5 ngày.
Chữa mẩn Dùng cành lá cây cơm cháy
ngứa do 30 g, đổ 800 ml nước, đun [15] Lá thời tiết nhỏ lửa, sắc lấy nước đặc rửa
chỗ da tổn thương hoặc tắm.
8
Bài thuốc Cách làm
Tên truyền thống Bộ phận đƣợc sử dụng
Tài liệu tham khảo Kinh Cầm máu Nghiền nát lá, thêm vài hạt
vết thương muối trắng, đắp vào chỗ nghiệm
của đồng hở chảy máu
bào vùng
Tây Bắc
Chữa đau Dùng lá cây cơm cháy hơ Kinh nhức nóng, rải lên chiếu cho bệnh nghiệm nhân nằm sẽ đở đau nhức tứ dân gian chi.
Kết hợp Chữa gãy Dùng vỏ, rễ và lá cây cơm Kinh vỏ, rễ, lá xương cháy giã nát đắp vào chỗ nghiệm xương gãy rồi băng lại cho dân gian cố định.
1.2. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số loài trong chi
Cơm cháy
1.2.1. Hoạt tính chống oxi hóa
Chất chống oxi hóa là các chất có khả năng bảo vệ tế bào tránh khỏi sự tác
động của gốc tự do, ngăn ngừa hoặc làm chậm quá trình oxi hóa trong cơ thể,
giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư, tim mạch. Các gốc tự do có chứa các
electron đơn độc nên hoạt tính oxi hóa rất mạnh, nó lấy electron của các chất
mà nó tiếp xúc để ghép đôi với electron đơn độc của nó. Các chất chống oxi
hóa sẽ nhường electron cho các gốc tự do để trung hòa các gốc tự do đó và các
gốc tự do sẽ trở lên không hoạt động.
Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới đã chỉ ra khả năng
chống oxi hóa của một số loài trong chi Cơm cháy. Dưới đây là một số ví dụ về
khả năng chống oxi hóa của một số loài trong chi Cơm cháy.
9
Bảng 1.3. Các nghiên cứu trong nƣớc về hoạt tính chống oxi hóa
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Sambucus Lá Flavonoid toàn phần còn có Tài liệu tham khảo
Nguyễn Xuân Vinh; chinensis [5],
tác dụng ức chế phản ứng peroxy hóa lipid trong hệ Fe2+- Lindl [16],
acid ascorbic của dịch đồng thể Phạm Thanh Kỳ; Nguyễn [9]
tế bào gan chuột nhắt trắng; có Thu Hằng
tác dụng dọn gốc tự do.
Sambucus Hoa và lá Flavonoid chiết từ hoa, lá cây Nguyễn Thu [2]
nigra Sambucus nigra có tác dụng Hằng
chống oxi hóa trên 3 mô hình
thực nghiệm khác nhau.
Sambucus Lá Dịch chiết từ lá cây Cơm cháy Nguyễn Thu [2]
javanica có tác dụng ức chế sự hình Hằng
-
thành gốc tự do anion
supeoxyde O2
tương đối sắp xỉ 62,22 µg/ml. mạnh, IC50
Flavonoid chiết từ lá cây Cơm
cháy có tác dụng ức chế phản
ứng peroxy hóa lipit dịch đồng
thể tế bào gan và não chuột.
Flavonoid chiết từ lá cây Cơm
cháy có tác dụng bảo vệ tế bào
lympho lách chuột thí nghiệm,
chống lại tổn thương gây bởi H2O2 10-6M.
10
Bảng 1.4. Các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính chống oxi hóa
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Hạt
Sambucus williamsii
H.H.Xiao; C.Hyemin và S.S.Won
Tài liệu tham khảo [25], [20], [43]
Acid linoleic được chiết xuất từ hạt của cây S. williamsii với hiệu suất 65,81% sở hữu các hoạt động chống oxi hóa. Nó tạo ra hoạt động khử gốc tự do ở mức 61,9 mg/mL.
Sambucus nigra Hoa, lá và quả
chiết xuất hoa gốc các quét (HO); gốc 2,2-
[18], [33] và [41] A.Sidor; M.M.Bratu và P.M.Abuja
ứng phản
Quả [34]
Sambucus javanica
Maja Mikulic- Petkovsek và cộng sự
Các Eldberry hydroxyl diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) và ức chế peroxid hóa lipid trong nhũ tương acid linoleic (liên hợp dienes và các chất acid thiobarbituric-TBARS). Các chiết xuất từ trái cây Eldberry rất hiệu quả trong quá dọn O2 trình quang hóa (PCL) khảo nghiệm. Các nghiên cứu còn cho thấy chiết xuất từ lá của Eldberry cũng có tác dụng chống oxi hóa. Các đặc tính chống oxi hóa của quả cơm cháy được đánh giá bằng hoạt động dọn rác triệt để của ABTS. Hoạt động nhặt rác của ABTS khác nhau đáng kể giữa các loài Cơm cháy. So với các loài trái cây khác, quả cây Cơm cháy thể hiện hoạt động chống oxi hóa rất cao.
11
1.2.2. Hoạt tính kháng viêm, giảm đau
Viêm là phản ứng của cơ thể đối với kích thích, nhiễm trùng và chấn
thương. Viêm cấp tính có chức năng bảo vệ cơ thể, trong khi viêm mãn tính có
thể dẫn đến đau và tổn thương lâu dài. Các nghiên cứu trong nước cũng như
trên thế giới đã chứng minh tác dụng kháng viêm và giảm đau của một số loài
trong chi Cơm cháy. Việc ứng dụng chi Cơm cháy trong điều trị viêm và giảm
đau có nhiều cách khác nhau. Dưới đây là một số tổng hợp về hoạt tính kháng
viêm và giảm đau từ các bộ phân khác nhau trong các loài thuộc chi Cơm cháy.
Bảng 1.5. Các nghiên cứu trong nƣớc về hoạt tính kháng viêm, giảm đau
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Tài liệu tham khảo [14]
Dịch chiết từ lá
Nguyễn Thị Thái Vân và cộng sự
Sambucus chinensis Lindl Còn gọi là cây Tiếp cốt thảo [6], [16] hoặc cây Kháng sinh [16]
Dịch chiết từ lá khô cây Tiếp cốt thảo có tác dụng tiêu viêm, giảm đau. Tác dụng kháng viêm của lá cây Tiếp cốt thảo được đánh giá khách quan bằng khả năng hạn chế phù tai bởi croton oil (dầu 3 đậu) và hạn chế mức độ sưng đau do fomandehit trên động vật thực nghiệm. Khi sử dụng uống dịch chiết nóng kết hợp với đắp ngoài, đạt hiệu quả cao hơn so với dùng đơn lẻ uống dịch chiết nóng hoặc đắp ngoài
Lá [17]
Vũ Văn Vụ và cộng sự
Cây Tiếp cốt thảo được nhân dân một số địa phương dùng để làm lành vết thương và chữa một số bệnh đường tiêu hóa rất hiệu quả
12
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Sambucus Lá Lá của cây Sambucus nigra Nguyễn Tài liệu tham khảo [2]
nigra có tác dụng chống viêm cấp Thu Hằng
khi cho chuột cống trắng uống
với liều 20 gam dược liệu/kg
chuột/ngày.
Sambucus Lá Tác dụng chống viêm cấp Nguyễn [2]
javanica được thử trên chuột cống trắng Thu Hằng
theo mô hình của Fontaine
(1962), tác nhân gây viêm là
dung dịch Carragenin 1%.
Kết quả thu được như sau:
Với liều uống 20g dược liệu/
kg, lá cây Cơm cháy cho thấy
tác dụng chống viêm, thể hiện
ở chỗ: Độ phù bàn chân chuột
giảm đi so với lô chứng. Liều
uống 15g dược liệu/kg, không
thể hiện tác dụng kháng viêm.
13
Bảng 1.6. Các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng viêm, giảm đau
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Sambucus Hạt Tác dụng chống viêm của H.H.Xiao; Tài liệu tham khảo [25],
williamsii chiết xuất giàu lupeol (chiết C.Hyemin [20],
xuất từ hạt của loài Sambucus và [43]
williamsii) tương tự như tác S.S.Won
dụng của thuốc ức chế
cyclooxygenase chọn lọc
indomethacin.
[26]
Sambucus Quả và lá Tiến hành nghiên cứu khả Anna
nigra năng kháng viêm của cao chiết Olejnik và
từ quả và lá của loài Sambucus cộng sự
nigra. Kết quả thu được cho
thấy chiết xuất từ trái cây
S.nigra có khả năng ức chế con
đường viêm trong kích thích
LPS đại thực bào.
Lá và hoa Chiết xuất của Sambucus P.M.Abuja [41]
nigra đã kích thích sản xuất các và cộng sự
cytokine tiền viêm IL-1β, IL-6,
IL-8 và TNF-α (yếu tố hoại tử
khối u) cũng như cytokine
chống viêm IL-10. Tùy thuộc
vào loại dịch chiết (lá, hoa và
loại dung môi sử dụng) sinh
tổng hợp IL-1α, IL-1β và TNF-
α, tác dụng ức chế của chiết
xuất đã được ghi nhận.
14
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu khả năng Wira Eka Tài liệu tham khảo [39]
Sambucus Quả và lá kháng viêm của cao chiết từ Putral,
javanica quả và lá của loài Sambucus
Muhaimin Rifa javanica. Động vật sử dụng thí
nghiệm là dòng chuột nhắt
trắng (BALB/c). Khối u được
gây bởi chất DMBA (7,12-
đimetylbenz(A)antracene), kết
hợp với điều trị bằng cách cho
chuột uống dung dịch cao chiết
từ lá và quả của loài Sambucus
javanica đã được pha loãng với
các nồng độ khác nhau. Sử
dụng phương pháp phân tích
dòng chảy tế bào học để đánh
giá tỷ lệ viêm ở động vật thí
nghiệm thông qua đo số lượng
tương đối của khối u bị hoại tử
(TNF- α) và miễn dịch (IFN-
). Theo kết quả phân tích, số
lượng tương đối của TNF-α và
IFN- được sản xuất bởi các tế
bào T trợ giúp CD4 đã tăng lên.
15
1.2.3. Hoạt tính kháng ung thƣ
Ung thư là nhóm căn bệnh biểu thị đặc trưng bởi sự phát triển của tế bào
bất thường từ “neoplastic clone”, trong trường hợp ung thư rắn có thể sờ mó
được và mô tả thông qua sự phát triển của u, bướu. Hiện nay, ung thư là căn
bệnh gây tỉ lệ tử vong cao, trong khi các liệu pháp điều trị hiện có vẫn còn
nhiều hạn chế do những tác dụng phụ độc hại, không mong muốn. Vì vậy các
sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thu hút được nhiều quan tâm và nghiên cứu.
Qua tổng hợp các nghiên cứu trong và ngoài nước, nhận thấy các bộ phận
khác nhau của một số loài trong chi Cơm cháy có tác dụng ức tế sự phát triển
của khối u và một số dòng ung thư như ung thư vú, ung thư ruột kết, ung thư
tuyến tiền liệt. Dưới đây là một số nghiên cứu về hoạt tính này.
Trong nước, các tác giả Nguyễn Thu Hằng [5], Phạm Thanh Kỳ [9],
Nguyễn Xuân Vinh [16], đã nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển khối u
thực nghiệm ở da chuột của flavonoid toàn phần được chiết từ lá loài Sambucus
chinensis Lind. Kết quả cho thấy, Flavonoid toàn phần có tác dụng ức chế sự
phát triển của khối u thực nghiệm ở da chuột.
Kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của một số loài trong chi
Cơm cháy trên Thế giới được thể hiện qua bảng 1.7.
16
Bảng 1.7. Các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng ung thƣ
Tên cây Tác giả Phần thực vật Phƣơng pháp và kết quả nghiên cứu
Sambucus Vỏ Một số nghiên cứu cho H.H.Xiao; Tài liệu tham khảo [25],
williamsii thấy rằng việc tăng lượng C.Hyemin [20],
lignan trong chế độ ăn uống có và [43]
thể bảo vệ chống lại hoặc giảm S.S.Won
nguy cơ ung thư vú, ruột kết và
ung thư tuyến tiền liệt. Các
lignan này được chiết xuất từ
vỏ của thân cây Sambucus
williamsii.
Sambucus Quả và lá Chiết xuất từ quả và lá Andrzej [18]
nigra Eldberry ức chế vừa phải sự
Sidor và công sự phát triển khối u trong xét
nghiệm cảm ứng khối u và
bệnh bạch cầu. Thole và cộng
sự đã xác định hoạt tính chống
độc của các phần khác nhau
trong chiết xuất Eldberry.
Nghiên cứu chỉ ra rằng
polyphenolic (ví dụ, quercetin,
proanthocyanidin) và có lẽ là
Sesquiterpenes, phytosterol
cũng như monoterpen iridoid
glycoside chịu trách nhiệm cho
các hoạt động nêu trên.
17
1.2.4. Hoạt tính hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng, tim mạch và béo phì
Bệnh tiểu đường là “Trạng thái lượng glucose trong máu (lượng đường
trong máu) vượt quá tỷ lệ nhất định”, có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình
trạng này.
Béo phì được coi là một tình trạng bất thường đối với cơ thể con người.
Mức độ béo phì càng cao, các bệnh về lối sống như bệnh tiểu đường và xơ vữa
động mạch càng dễ khởi phát, tỷ lệ tử vong càng cao. Đặc trưng lớn nhất của
tình trạng béo phì đó là càng béo phì, sức khỏe và tuổi thọ của người đó càng
ngắn. Bệnh tiểu đuờng và bệnh béo phì có liên quan mật thiết với nhau.
Sử dụng các sản phẩm từ thảo dược để hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đuờng và
bệnh béo phì hiện nay đang rất được quan tâm. Nghiên cứu của Andrzej Sidor và công sự [18] cho thấy việc sử dụng chiết xuất từ hoa của loài Sambucus
nigra (còn có tên là Elderberry) làm giảm đáng kể tỷ lệ glycosyl hóa huyết sắc
tố (HbA1c) ở chuột bị tiểu đường và mức độ giảm cho thấy giảm nguy cơ biến
chứng của bệnh tiểu đuờng. Elderberry có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh
khác khi trong cơ thể có bệnh nền là tiểu đường, bằng cách giảm nồng độ
fibrinogen, tăng khả năng bảo vệ chống oxy hóa của sinh vật, giảm quá trình
oxy hóa lipit. Vai trò của cơm cháy trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu
đường có thể liên quan đến sự gia tăng hấp thu glucose cơ bắp (GU) chuyển
hóa và tăng tiết insulin. Nghiên cứu đã chứng minh rằng khả năng kích thích
GU của các hợp chất polyphenolic có trong hoa cơm cháy (5-O-cafeoylquinic
acid, naringenin, kaempferol, acid ferulic, acid caffeic) một cách đa dạng, tùy
theo nồng độ. Từ các phân tích kể trên, nhóm tác giả đi đến kết luận: Các
polyphenol tự nhiên được chiết xuất từ Sambucus nigra điều chỉnh sự bảo vệ
miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu trong bệnh tiểu đường thiếu insulin.
Một nghiên cứu khác của H.H.Xiao và cộng sự [25] chỉ ra rằng: Acid 4-
Hydroxybenzoic được chiết xuất từ hạt của loài Sambucus williamsii Hancecó
tác dụng hạ đường huyết, làm tăng nồng độ insulin huyết thanh và hàm lượng
18
glycogen ở gan chuột bình thường sau khi uống với liều 5 mg/kg thể trọng.
Acid linoleic được chiết xuất từ hạt của cây S. williamsii với hiệu suất 65,81%
sở hữu các hoạt động làm hạ đường huyết, ức chế hoạt động của α-glucosidase
ở mức 2525 mg/mL và cải thiện đáng kể nồng độ lipit huyết thanh ở chuột bị
tăng lipit máu.
Năm 2015, nghiên cứu của nhóm tác giả Andrzej Sidor và công sự [18],
cho thấy tác dụng có lợi của các thành phần chiết xuất từ quả của loài
Sambucus nigra đối với huyết áp, giảm stress oxi hóa, tăng hoạt động của các
enzyme chống oxi hóa trong huyết tương, bao gồm glutathione (GSH) và giảm
nồng độ acid uric (UA). Kết quả của Moros¸anu và cộng sự cho thấy tổng giá
trị hoạt động chống oxi hóa (TAA) cao hơn và lipit thuận lợi hơn trong huyết
thanh của chuột tăng huyết áp được nuôi bằng thức ăn có chứa polyphenol từ
Sambucus nigra. Tổng hàm lượng cholesterol và triacylglycerol cũng như
lipoprotein LDL và hàm lượng dialdehyd malonic giảm sau khi sử dụng các sản
phẩm từ cây Sambucus nigra. Kiểm tra mô học của thận và cơ tim của chuột
dùng mẫu vật Eldberry đen đã chứng minh tác dụng bảo vệ của nó. Một trong
những cơ chế chịu trách nhiệm về tác dụng bảo vệ của chiết xuất từ quả của
loài Sambucus nigra chống lại các bệnh tim mạch là khả năng xâm nhập của
poliphenol vào các tế bào nội mô.
1.2.5. Tác dụng hạ đuờng huyết
Đái tháo đường (ĐTĐ) týp 2 là phổ biến, đang có khuynh hướng gia tăng
ở nhiều nước. Hiện nay, thuốc điều trị bệnh ĐTĐ rất phong phú, trong đó,
thuốc có nguồn gốc thảo dược đang được quan tâm do ít tác dụng phụ so với
các thuốc hóa dược. Chính vì vậy, các nhà khoa học đang nghiên cứu nhằm tìm
kiếm những chế phẩm trị liệu ĐTĐ hiệu quả có nguồn gốc từ dược liệu sẵn có,
rẻ tiền, dạng sử dụng tiện lợi để gười bệnh và thầy thuốc có thêm lựa chọn.
Nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng [2] cho thấy: Chiết xuất từ hoa của cây
Sambucus nigra có tác dụng hạ đường huyết ở mô hình thí nghiệm trên chuột
19
nhắt trắng. Đi sâu nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trên chuột thực nghiệm
thu đuợc kết quả như sau: Cao lỏng với tỷ lệ 1/1 của hoa Sambucus nigra có tác
dụng hạ đường huyết trên chuột thí nghiệm với liều 0,4g/kg thể trọng/ngày x 5
ngày ở mô hình gây tăng đường huyết bằng Streptozotocin (P ≤ 0,05). Với lô
điều trị kéo dài 10 ngày có tác dụng hạ đường huyết tốt hơn lô uống thuốc
trong 5 ngày (P ≤ 0,01).
1.2.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
Những hoạt tính này gây ra từ sự đa dạng của hợp chất trong các loài của
chi Cơm cháy. Nguời ta chú ý đặc biệt là các flavonoid chiết xuất từ các loài
trong chi này. Mặc dù các flavonoid có ở tất cả các bộ phận của cây nhưng nổi
bật nhất trong lá và vỏ cây.
Nghiên cứu trong nước của nhóm tác giả Nguyễn Xuân Vinh [16], Phạm
Thanh Kỳ [9] và Nguyễn Thu Hằng [5] nhận thấy flavonoid toàn phần chiết
xuất từ lá cây Sambucus chinensis Lindl có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn
gram (-) và gram (+); tác dụng lên vi khuẩn Escherichia coli (vi khuẩn đường
ruột); trực khuẩn Bacillus subtilis.
Trên thế giới, các nghiên của các tác giả C.Hyemin [20]; S.S.Won [43] đã
đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất Pinoresinol, lariciresinol, (-) -
olivil-9′-O-D-glucopyranoside và glochidioboside đều được phân lập từ
Sambucus williamsii, chúng thể hiện tác dụng kháng nấm đối với các chủng
gây bệnh ở người thông qua hành động phá vỡ màng tế bào. (+) - Medioresinol,
một loại lignan (loại furofuran), được phân lập từ vỏ của thân cây Sambucus
williamsii, cũng có tác dụng kháng nấm, nhưng thông qua sự tích tụ của các
loại phản ứng oxy hóa trong ty thể.
1.2.7. Hoạt tính chống loãng xƣơng
Bệnh loãng xương là tình trạng mật độ khoáng chất của xương giảm dưới
ngưỡng bình thường làm cho xương mất đi sự khoẻ mạnh và dễ bị gãy. Bệnh
20
loãng xương thường gặp ở phụ nữ tuổi trung niên trở ra, nhưng bệnh cũng có
thể gặp ở nam giới và trẻ em.
Điều trị chứng loãng xương bằng các chiết xuất từ thảo dược được nhiều
nhà khoa học quan tâm. Trên thế giới các nghiên của tác giả H.H.Xiao và cộng
sự [25], cho thấy: Chiết xuất ethanol từ thân cây Sambucus williamsii có tác
dụng chống loãng xương. Hơn nữa, các chất hữu cơ bao gồm lignan, acid
phenolic và triterpenoids trong chiết xuất ethanol của thân cây Sambucus
williamsii kích thích sự tạo xương bằng cách thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa
của nguyên bào xương.
1.2.8. Hoạt tính kháng vi-rút
Hoạt tính này đuợc cho là có liên quan trực tiếp đến sự phong phú của các
hợp chất flavonoid trong chi Cơm cháy, đặc biệt là chiết xuất từ quả mọng của
loài Sambucus nigra. Những phát hiện ban đầu này có ý nghĩa quan trọng trong
việc tìm kiếm nguồn kháng sinh mới và thuốc kháng vi rút.
Năm 2018, nghiên cứu của Jessie Hawkins và cộng sự [26] về khả năng
kháng vi-rút của loài Sambucus nigra (Eldberry) cho thấy việc bổ sung
Eldberry đã làm giảm đáng kể các triệu chứng hô hấp trên. Những phát hiện
này cho thấy khả năng kháng vi-rút của loài Sambucus nigra đối với bệnh cảm
lạnh và cúm thông thường.
Năm 2029, Golnoosh Torabian và cộng sự [45], đã nghiên cứu xác định cơ
chế hoạt động của dịch chiết từ quả cây Sambucus nigra và hợp chất hoạt động
chính của nó (cyanidin-3-glucoside (cyn 3-glu)) trong việc chống lại vi-rút
cúm. Chiết xuất từ quả Sambucus nigra có tác dụng ức chế nhẹ ở giai đoạn đầu
của chu kỳ vi-rút cúm, có tác dụng mạnh hơn đáng kể (chỉ số điều trị là 12 ±
1,3) trong giai đoạn sau nhiễm trùng. Cơ chế được xác định là ngăn chặn
glycoprotein của vi-rút cũng như làm tăng số lượng của IL-6, IL-8 và TNF
trong cơ thể.
21
1.3. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài trong chi
Cơm cháy
1.3.1. Hợp chất phenol
Hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ phong phú nhất trong chi Cơm
cháy. Chúng là một trong số các tác nhân chính quyết định nhều hoạt tính sinh
học cho các loài trong chi này. Trong số các hợp chất phân lập được từ loài này
thì một lượng lớn tồn tại trong cấu trúc lignan và các acid phenolic. Ngoài ra
còn tồn tại dưới cấu trúc các coumarin.
Trong nước, theo nghiên cứu của Vũ Văn Vụ và cộng sự [17], trong cây
Sambucus chinensis Lindl có chứa coumarin.
Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần của các hợp chất phenol từ
một số loài trong chi Cơm cháy được trình bày trong các bảng 1.8 dưới đây.
Bảng 1.8. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất phenol từ các loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Hợp chất Tác giả Tài liệu tham khảo
[37], [20], [43] Phần của thực vật Toàn bộ cây Lignan
Sambucus williamsii 13 acid phenolic Toàn bộ cây [37], [20], [43] O.Fu; C.Hyemin và S.S.Won O.Fu; C.Hyemin và S.S.Won
1.3.2. Flavonoid
Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có hoạt tính sinh học cao.
Một số tác dụng sinh học của nhóm chất này đã được công bố như: Tác dụng
kháng khuẩn, chống viêm, chống oxi hóa, bảo vệ gan, điều hòa miễn dịch,
phòng và điều trị ung thư...
Flavonoid là lớp chất hữu cơ thường gặp trong các loài của chi Cơm cháy.
Chúng tồn tại trong hầu hết các bộ phận của cây, nhưng có nhiều nhất trong
quả mọng. Flavonoid trong chi Cơm cháy thường tồn tại dưới cấu trúc của
22
anthocyanin. Dưới đây là một số nghiên cứu trong nuớc và Quốc tế về nhóm
hợp chất này trong chi Cơm cháy.
Bảng 1.9. Nghiên cứu trong nƣớc về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất flavonoid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tác giả Tên loài Hợp chất Phần của thực vật
Tài liệu tham khảo [3]
Nguyễn Thu Hằng flavonoid (khoảng 1,294 ± 0,068%)
[17]
Sambucus chinensis Lindl Bộ phận trên mặt đất của cây Lá, rễ, hoa
Vũ Văn Vụ và cộng sự
[11]
Thân, lá, hoa Trần Thị Thoa
Sambucus simpsonii Rehder
Hàm lượng cao nhất ở lá cây (3,628 ± 0,017% chất khô) và thấp nhất ở thân rễ (0,756 ± 0,032% chất khô), trong hoa chiếm (2,281 ± 0,031% chất khô) Trong thân chứa 0,402 ± 0,074%; trong lá chứa 3,054 ± 0,113%; trong hoa chứa 7,194 ± 0,104%.
Hoa [2]
Nguyễn Thu Hằng
Sambucus nigra
Flavonoid ở hoa là 7,19%; ở lá là 3,06%; ở thân là 3,40%. Từ dịch chiết flavonoid toàn phần của hoa loài Sambucus nigra đã phân lập được 3 chất tinh khiết: Quercetin; Quercetin- 3-α-rhamno-pyranosyl-β- glucopyranose; n-hexacosane .
Kaemferol (1) Lá [2]
Sambucus javanica Nguyễn Thu Hằng
23
(1)
Hình 1.2. Cấu trúc của Kaemferol
Bảng 1.10. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất flavonoid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Tên hợp chất Tác giả Phần của thực vật
Cyanidin-3-O- Maja Tài liệu tham khảo [35]
Sambucus sambubiosyl-5-O- glucoside; Quả Mikulic- [42]
nigra Cyanidin-3,5-O-diglucoside; Petkovsek
và Cyanidin-glycoside 4
R.Veberic (cyanidin- pentoside-hexoside
4); Cyanidin-3-O-galactoside;
Cyanidin-3-O-sambubioside;
Cyanidin-3-O-glucoside,
sterol
Cyanidin-3-O- Quả Maja [35]
Sambucus sambubiosyl-5-O- glucoside Mikulic-
javanica (2); Cyanidin-3,5-O- Petkovsek
và cộng diglucoside (3); Cyanidin-
sự glycoside 4 (cyanidin-
pentoside-hexoside 4) (4); );
Cyanidin-3-O-galactoside (5);
Cyanidin-3-O-sambubioside
(6); Cyanidin-3-O-glucoside
(7)
24
(2)
(3)
(4)
(6)
25
(7) Hình 1.3. Công thức của các hợp chất thuộc nhóm anthocyanin phân lập
đƣợc từ loài Sambucus javanica
1.3.3. Acid hữu cơ
Acid hữu cơ là nhóm hợp chất được tìm thấy ở hầu hết các bộ phân của
các loài trong chi Cơm cháy như lá, thân, hoa, quả...đặc biệt có nhiều trong quả
mọng. Một số acid được phân lập từ chi này thể hiện hoạt tính sinh học cao
(như trình bày trong phần hoạt tính sinh học ở trên). Tổng hợp một số nghiên
cứu nhằm xác định thành phân và cấu trúc một số acid hữu cơ trong chi Cơm
cháy được trình bày dưới đây.
Bảng 1.11. Nghiên cứu trong nƣớc về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất acid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tên loài Tên hợp chất Tác giả Phần của thực vật
Lá Tài liệu tham khảo [12]
Acid 1,2-Benzenedicarboxylic
Sambucus chinensis Lindl
[11]
Nguyễn Thị Thanh Thuỷ Trần Thị Thoa Thân, lá, hoa và quả Acid hữu cơ
[2]
Lá, thân, hoa và quả Nguyễn Thu Hằng Sambucus simpsonii Rehder Sambucus nigra Acid hữu cơ
26
Bảng 1.12. Nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của nhóm hợp
chất acid từ một số loài trong chi Cơm cháy
Tài
Phần của liệu Tên loài Tên hợp chất Tác giả thực vật tham
khảo
Toàn bộ [13] Sambucus
chinensis Acid chlorogenic cây Triệu Tú Trinh
Lindl
Acid palmitic Hoa Bernard [19] Sambucus
williamsii Toulemonde1
và Hubert M.
J. Richard
Bernard [19]
Sambucus 16 acid hữu cơ Hoa Toulemonde1
nigra
và Hubert M. J. Richard
Acid oleanolic Vỏ William [48]
lawrie và cộng sự
Sambucus Acid Citric (8); acid Quả Maja [34]
javanica Malic (9); acid Tartaric Mikulic-
(10); acid Fumaric (11);
acid Shikimic (12). Petkovsek và cộng sự
27
(8)
(10) (9)
(12) (11)
Hình 1.4. Công thức của các acid hữu cơ đƣợc phân lập đƣợc từ loài loài
Sambucus javanica
1.3.4. Đƣờng khử
Đường khử là loại đường có chứa nhóm aldehyd (-CHO) hoặc nhóm
ketone (-CO-). Chúng là những hợp chất phổ biến, được tìm thấy trong các loài
thực vật khác nhau.
Tổng hợp các nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài trong chi
Cơm cháy, nhận thấy đường khử tập trung nhiều trong quả mọng.
Trong nước, nghiên cứu của Trần Thị Thoa [11], cho biết trong thân, lá,
hoa và quả cây Sambucus simpsonii Rehder có đường khử tự do.
Trên thế giới, tác giả Maja Mikulic-Petkovsek và cộng sự [34], đã chiết
xuất các chất chính trong quả mọng của loài Sambucus javanica thu được 3
đường khử: Sucrose (13); Glucose (14); Fructose (15).
28
(13)
(14)
(15)
Hình 1.5. Công thức của các đƣờng khử đƣợc phân lập đƣợc từ loài loài Sambucus
javanica
29
Chƣơng 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất và thiết bị phân lập
2.1.1. Hóa chất
Các loại dung môi sử dụng để phân lập các chất đều tinh khiết, silicagel và
lớp mỏng sạch.
Bảng 2.1. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong quá trình phân lập các chất
Xuất xứ Hóa chất STT
Trung Quốc Dichloromethane 1
Trung Quốc n - Hexan 2
Trung Quốc Acetone 3
Trung Quốc Ethyl acetate 4
Trung Quốc Ethanol 5
Trung Quốc n - Butanol 6
Đức Silica gel cỡ hạt 230-400/mesh (Merck) 7
Đức Silica gel C18 (5-10/mesh, Merck) 8
Thuốc hiện màu là dung dịch Trung Quốc 9 C2H5OH/H2SO4-Valilin
30
2.1.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng
STT Thiết bị đã sử dụng Nơi sử dụng
1 Máy cất quay chân không Trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên
2 Máy đo khối phổ Mass Spectrometter Khoa Hóa học - Đại học
(LC-MS) Khoa học tự nhiên - Đại học
Quốc gia Hà Nội
3 Máy Bruker 500MHz để đo Phổ cộng Khoa Hóa học - Đại học
hưởng từ hạt nhân Khoa học tự nhiên - Đại học
Quốc gia Hà Nội
4 Cột sắc ký, cốc, ống nhiệm, bông... Trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên
5 Đèn UV 254nm Trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên
6 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích Trường Đại học Sư phạm
được tiến hành trên bản mỏng kính Thái Nguyên
và bản mỏng nhôm silica gel tráng
sẵn (dài 0.2 mm)
7 Cân phân tích Trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên
8 Các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm Trường Đại học Sư phạm
phân lập chất hữu cơ Thái Nguyên
2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các
chất phân lập đƣợc
2.2.1. Thu hái
Lá cây Cơm cháy được thu hái vào sáng ngày 20 tháng 6 năm 2019 tại gia
đình Lương y Hoàng Văn Phiến, số nhà 017, tổ 43, phường Pom Hán, thành
31
phố Lào Cai, tỉnh Lào Cai (điện thoại liên hệ: 0356269373). Sau đó, mẫu được
gửi đến PGS.TS Sỹ Danh Thường, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm -
Đại học Thái Nguyên định danh.
2.2.2. Xử lý và bảo quản
Lá cây Cơm cháy, sau khi lá được thu hái, loại bỏ phần lá sâu, lá già úa,
lá giập lát, lá quá non, làm sạch, phơi ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50-600, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời gay gắt vì tia tử
ngoại (UV) có trong ánh nắng mặt trời sẽ kích thích các phản ứng sinh hóa
trong thực vật làm biến đổi thành phần hóa học.
Mẫu khô được bảo quản trong túi nilon dùng để nghiên cứu.
2.3. Chiết xuất cao
Cho 1500 gam (1.5kg) lá khô cây Cơm cháy, thêm 5 lít cồn 90%, cho vào dụng cụ chiết, nắp ống sinh hàn và duy trì nhiệt độ ở 700C. Chiết liên tục trong
4 giờ, lặp lại 3 lần. Cô quay dưới áp suất thấp, thu 200 gam cao đặc. Cao được
được bảo quản trong tủ lạnh.
Etanol 90%
Cô quay
Dịch chiết
1.5kg lá khô Cây Cơm cháy
Cao chiết cồn (200g)
t0 = 70 , chiết trong 4h, lặp lại 3 lần
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tạo cao chiết cồn tổng số
2.4. Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất hữu cơ trong cao chiết cồn
2.4.1. Định tính polyphenol
Phản ứng với muối sắt (III): Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl
trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
Tác dụng với H2SO4 đặc: Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavon và
flavonol thì cho màu vàng đậm; đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm
và đỏ tươi; flavanon cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcon.
32
2.4.2. Định tính alkaloid
Thuốc thử Dragendorff
+ Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml
dung dịch axit axetic 20%.
+ Dung dịch B: 5 ml dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng,
trộn 20 ml dung dịch A, 5 ml dung dịch B và 70 ml H2O.
Thuốc thử Mayer
+ Dung dịch A: hòa tan 1.36 g HgCl2 trong 60 ml H2O.
+ Dung dịch B: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml H2O. Trộn hai dung dịch lại,
thêm nước vừa đủ 100ml.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều, lọc
qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml nước lọc axit rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản
ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính.
Hiện tƣợng:
+ Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam.
+ Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.
2.4.3. Định tính các flavonoit
Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại.
Thí nghiệm: Lấy 0.05 g cặn chiết thêm 10 ml CH3OH, đun nóng cho tan
và lọc qua giấy lọc. Lấy 2 ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg
kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút
đến và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với
các flavonoit.
Hiện tƣợng: Dịch chiết có màu hồng nhạt. Khi thêm thuốc thử thì có màu
hồng hơn.
33
2.4.4. Định tính các cumarin
Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một
trong hai ống đó 0.5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ
đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4 ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm
trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá ống
nghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốt
hoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính.
2.4.5. Phản ứng của Steroid (Phản ứng Liebermann - Burchardt)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cặn glycosid tim 1ml anhydrid
axetic, lắc đều cho tan hết cặn. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống
0.5 ml axit sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Hiện tƣợng: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng
màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
2.5. Chiết phân đoạn từ cao chiết tổng số
Sử dụng phương pháp chiết Lỏng-Lỏng với các dung môi có độ phân cực
tăng dần DCM (dichloromethane), ethyl acetate (EA) và n-BuOH.
Cao chiết tổng số được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc
phần dung dịch này lần lượt với các dung môi: Dichlomethanr (DCM) (01 lít x
3 lần); ethyl acetate (01 lít x 3 lần); n-butanol (01lít x 3 lần).
- Các phân đoạn thu được đem cô quay dưới áp suất thấp, tới cao đặc.
34
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tạo cao chiết phân đoạn
2.6. Phân lập hợp chất
2.6.1. Phân lập hợp chất 1-2
Phần cao chiết DCM (45 gam) tiến hành phân lập các chất trên sắc ký cột
silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm), cột sắc ký kích thước 7 x100 cm với 600
g silica gel. Ổn định cột bằng dung môi n – hexan. Hệ dung môi rửa giải là: n –
hexan: acetone với tỉ lệ từ 15:1 – 1:2 (v/v), thu được 4 phân đoạn.
Tại phân đoạn 2, lọc chất rắn thu được 27 mg chất rắn 1, không màu.
Tại phân đoạn 3, lọc chât rắn ở phân đoạn 3 và rửa lại với acetone thu
được chất rắn 2, màu trắng, sấy khô, cân thu 35 mg.
35
Cao DCM
45g
SKC Rửa giải với hệ dung môi n-hexan:axeton từ 15:1-1:2(v/v)
Phân đoạn 2
Phân đoạn 1
Phân đoạn 3
Phân đoạn 4
(Có chất rắn)
(Không có chất rắn)
(Có chất rắn)
(Có chất rắn)
Rửa lại bằng axeton, sấy khô
Chất rắn 2 Màu trắng, 35mg
Chất rắn 1 Không màu, 27mg
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ phân lập chất 1-2
2.6.2. Phân lập hợp chất 3
Phần cao chiết n-butanol (35 gam) tiến hành phân lập các chất trên sắc
ký cột silica gel (Merck, cỡ hạt 63-20 µm), cột sắc ký kích thước 6x50 cm với
500g silica gel. Hệ dung môi rửa giải là: chloroform : metanol với tỉ lệ từ 9:1 –
2:1 (v/v) thu được 5 phân đoạn.
Tại phân đoạn 2, tiến hành lọc chât rắn rửa lại với axeton thu được chất
rắn 3, màu vàng nhạt, sấy khô, cân thu 10 mg chất 3.
36
Cao n-Butanol
35g
SKC Hệ dung môi rửa giải: Chloroform: metanol
với tỉ lệ từ 9:1– 2:1 (v/v)
Phân đoạn 2
Phân đoạn 4
Phân đoạn 3
Phân đoạn 1
(Có chất rắn)
(có chất rắn)
(có chất rắn)
(Có chất rắn)
Phân đoạn 5 (Có chất rắn)
Rửa lại bằng axeton, sấy khô
Chất rắn 3 Màu vàng nhạt, 10mg
Sơ đồ 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất 3
2.7. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp
phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai
chiều HSQC và HMBC và phổ khối lượng ESI-MS tại Khoa Hóa học - Đại
Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.8. Phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy
hóa lipit não chuột
2.8.1. Vật liệu và hóa chất
Mẫu nghiên cứu là cao chiết ethanol.
37
Hóa chất:
+ DPPH, Trolox (Sigma Aldrich): acid ascorbic (Fisher)
+ Đệm phosphat hoặc đệm KCl, Acid tricloacetic (TCA, Fisher)
+ Acid thiobarbituric (TBA) (Sigma Aldrich), FeSO4, H2O2
+ Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf),
Thiết bị: Cân phân tích, máy đo máy đọc ELISA 96 giếng (Biotek)
Động vật: Chuột thuần chủng dòng BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh,
đạt tiêu chuẩn thí nghiệm có khối lượng từ 23-26g.
2.8.2. Phƣơng pháp
* Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH
Được tiến hành theo phương pháp của Abramovič và cộng sự (2018) có
chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm, cụ thể như sau:
Mẫu thử được pha dung dịch gốc trong methanol, sau đó được pha thành
dải nồng độ thử mẫu với nước cất khử ion. Acid Ascorbic được sử dụng như
chất đối chứng tham khảo và được pha thành dải nồng độ với nước cất khử ion.
DPPH pha trong methanol (100%) nồng độ 0,25 µM.
Hút mẫu nghiên cứu đã pha ở các nồng độ vào đĩa 96. Thêm dung dịch
DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các giếng đã có sẵn mẫu nghiên cứu (tỉ lệ 1:1)
Ống không có mẫu thử chỉ có 100 µl nước và 100 µl DPPH.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau
phản ứng tại bước sóng 517 nm.
Khả năng trung hòa gốc oxi hóa tự do (Scavenging Activities - SA) sinh ra
từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
% SA = (ODđối chứng – ODmẫu thử)*100/ODđối chứng (%)
Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử
ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử
Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được
50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính
TableCurve 2Dv4.
38
* Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa qua ức chế peroxy hóa lipid
Phương pháp chống oxi hóa thông qua ức chế quá trình peroxidation lipid
màng tế bào (thử nghiệm MDA) được thực hiện theo phương pháp của Stroev
EA, Makarova VG (1998), Jelili A Badmus et al., (2011) và của Viện Dược
liệu - Bộ Y Tế (2006), có sự thay đổi nhỏ cho phù hợp với điều kiện của phòng
thí nghiệm. Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid của mẫu nghiên cứu
qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá
trình peroxy hoá lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid
thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (có màu hồng) có đỉnh hấp thu
cực đại ở λ = 532 nm.
Pha mẫu thử: Cân mẫu sau đó pha thành các nồng độ 10.000 µg/ml, 2000
µg/ml, 400 µg/ml, 80 µg/ml, 16µg/ml nên sau khi cho 0,1 ml mẫu thử ở các nồng
độ thử nghiệm được cho phản ứng với 1 ml dịch đồng thể não và thêm 0,8 ml đệm
phosphat, 0,1 ml hệ Fenton vừa đủ 2 ml thì nồng độ mẫu trong ống thử giảm
xuống 20 lần còn 500 µg/ml, 100 µg/ml, 20 µg/ml, 4 µg/ml; 0,8 µg/ml.
Cách tiến hành:
+ Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat
(pH=7,4) theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-4oC.
+ Lấy 1ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ và
0,8ml đệm phosphat thêm 0,1ml hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15mM theo tỉ lệ 1:1). Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 15 phút.
+ Dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Li tâm 12000 vòng
trong 5 phút.
+ Lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% (theo tỉ
lệ 2:1). Ủ ở nhiệt độ 100oC 15 phút.
+ Làm lạnh và tiến hành đo ở bước sóng λ = 532 nm.
+ Trolox được sử dụng làm chất đối chiếu tham khảo.
39
Tính toán kết quả
+ Công thức tính phần trăm hoạt tính chống oxi hoá (HTCO)
HTCO (%) = [(ODC – ODT)/ODC] × 100
ODC : Mật độ quang học của giếng chứng không có mẫu thử
ODT : Mật độ quang học của mẫu thử
+ Giá trị IC50 (Inhibition Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được
50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính
TableCurve 2Dv4.
40
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính các nhóm chất của cao chiết tổng số
Kết quả định tính nhóm chất trong dịch chiết etanol 90% của loài thực vật
này được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ
Số TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả
1 Phenolic Xanh dd FeCl3 5%
Màu hồng H2SO4 đặc
2 Alkaloid Dragendoff Không rõ
Mayer Không rõ
3 Flavonoid Mg/HCl đặc Xuất hiện màu đỏ nhạt
4 Coumarin Dung dịch NaOH Có vẩn đục màu vàng
10%. nhạt
5 Steroid Phản ứng Có nhiều bọt
Liebermann -
Burchardt
Từ kết quả ở Bảng 3.1 trên ta thấy trong dịch chiết etanol của loài thực
vật có mặt nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học, như phenolic,
flavonoid, coumarin, steroid. Các nhóm hợp chất này có ý nghĩa trong việc ứng
dụng làm thuốc chữa bệnh: flavonoid có tác dụng chống oxi hóa, tác động lên
enzim, các bệnh tim mạch; hợp chất phenol có tác dụng kháng sinh, chống
viêm; steroid có tác động tới hệ thần kinh, điều trị ung thư, diệt khuẩn, hạ huyết
áp; coumarin có tác dụng chống đông máu, giảm đau, loãng xương, làm giãn
động mạch vành và mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thắt, một số chất có
tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật…. Đây là cơ sở để tiến hành các nghiên
cứu tiếp theo.
41
3.2. Kết quả xác định cấu trúc 3.2.1. Chất 1 Kết quả dữ liệu phổ của chất 1 được tổng hợp ở Bảng 3.2 và các hình
dưới đây.
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của chất 1
Ví trí
1H NMR (ppm), J (Hz)
Số liệu đo 13C NMR (ppm) Số liệu tham khảo 13C - NMR (ppm) của β-Sitosterol [42, 19]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 37.10 35.99 71.64 42.16 140.59 121.55 31.75 31.63 49.97 36.35 20.94 39.79 42.17 56.60 24.14 28.11 55.9 11.88 19.24 33.77 25.83 45.68 22.91 11.89 29.0 19.66 18.88 18.62 11.70 1.55-1.75 (m) 1.18-1.68 (m) 3.48 (m) 1.47-1.57 (m) 5.27 (br d, 3.7) 1.45-1.65 (m) 1.77 (m) 1.76 (m) 1.56 (m); 1.67 (m) 1.56 (m); 1.64 (m) 2.04 (m) 0.76 (s) 0.94 (s) 0.73 (d, 6.7) 1.16 -1.19 (m) 1.76-1.84 (m) 1.87 (m) 1.86 (m); 1.89 (m) 0.8 (t, 6.6) 1.98 (m) 0.87 (d, 8.4) 0.62 (d, J = 6.7 Hz, 3H). 37.51 31.90 72.01 42.50 140.91 121.9 32.10 32.11 50.32 36.74 21.35 39.96 42.67 56.93 26.34 28.56 56.37 13.38 19.25 34.24 26.33 45.85 23.32 12.28 29.46 20.15 19.66 19.07 12.08
42
Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H-NMR của 1
thấy xuất hiện tín hiệu của nguyên tử H-3 liên kết với nhóm β-OH (δH 3.48,
m). Trên phổ cộng hưởng proton của 1 cũng xuất hiện của H trong liên kết bội
tại H-6 tại δH 5.29 (br d, 3.7). Tín hiệu cộng hưởng của 2 nhóm methyl bậc ba
cộng hưởng tại δH 0.77 (s), 0.96 (s); 3 nhóm methyl bậc hai cộng hưởng tại
δH 0.62 (d, J = 6.7 Hz), 0.73 (d, J = 6.7 Hz), δH 0.87 (3H, d, J = 8.4 Hz) và 1
nhóm thế methyl bậc một tại δH 0.8 (t, J = 6.6 Hz). Các tín cộng hưởng của
các nguyên tử hidro khác của hợp chất 1 được thể hiện trong bảng 3.2.
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của chất 1
43
Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất 1
Phổ 13C-NMR của chất 1 xuất hiện 29 tín hiệu cacbon, đặc biệt, tín
hiệu của hai cặp olefin được xác nhận tại C-5 (δC 140.59)/C-6 (δC 121.55)
ppm. Nguyên tử cacbon ở vị trí số 3 cộng hưởng tại δC 71.65 ppm. Các nhóm
methyl bậc 3 cộng hưởng tại 11.88 (C-18) và 19.24 ppm (C-19). Qua phổ
HSQC, HMBC sự quy kết các tín hiệu của các nguyên tử hidro và cacbon
trong hợp chất 1 thể hiện chi tiết trong Bảng 3.2.
44
Hình 3.3. Phổ HSQC của chất 1
Hình 3.4. Phổ HMBC của chất 1
45
Hình 3.5. Phổ khối lƣợng của chất 1
Trên phổ khối lượng của chất 1 nhận thầy có píc m/z của [M+H]+ là
415,25, kết hợp với số nguyên tử cacbon của chất 1 là 29 ta có thể dự đoán
công thức phân tử là C29H50O. Dựa vào các phân tích trên và kết hợp so sánh số liệu phổ 13C-NMR của chất 1 với các số liệu đã được công bố của
β-Sitosterol [42, 19] thấy hoàn toàn phù hợp. Như vậy, chất 1 có thể được
khẳng định là β-Sitosterol. Đây là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ
loài thực vật này.
Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất 1
3.2.2. Chất 2
Chất 2 được xác định cấu trúc dựa trên số liệu thực nghiệm đo phổ NMR
và phổ MS, so sánh với tài liệu tham khảo.
46
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của chất 2
Phổ 1H-NMR của chất 2 cho một tín hiệu cộng hưởng dạng triplet tại δH
0.89 (t, J = 7.7 Hz, 3H) tương ứng với 3 proton của nhóm metyl liên kết với
một nhóm CH2. Một tín hiệu của triplet tại δH 3.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H) tương
ứng với 2 proton của nhóm metylen liên kết với một nhóm CH2 và liên kết với
nguyên tử oxy.
Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của chất 2
47
Trên phổ có các tín hiệu cacbon tương ứng với nguyên tử C liên kết với
oxi (δC = 62.93 ppm) và cacbon trong nhóm methyl (δC = 13.93 ppm) và các
nguyên tử cacbon của các nhóm metylen được xác định dựa trên dữ liệu phổ
DEPT-135.
Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của chất 2
Trên phổ tương quan hai chiều HSQC và HMBC ta nhận thấy các tín hiệu
tương tác trực tiếp và gián tiếp của các nguyên tử cacbon và hidro. Kết hợp với phổ 1H, 13C-NMR của chất 2 và so sánh với các tài liệu tham khảo có thể dự
đoán chất 2 là n-alcohol.
48
Hình 3.10. Phổ HSQC của chất 2
Hình 3.11. Phổ HMBC chất 2
Kết hợp với phổ khối lượng có peak ion m/z 481 [M+H]+ (100%) do đó
công thức phân tử của n-alchol chất là C33H68O
49
Hình 3.12. Phổ khối lƣợng của 2
Căn cứ các giá trị phổ 1H-NMR và 13C-NMR, và phổ tương quan hai chiều
DEPT, HSQC, HMBC và phổ khối của chất 2 có thể kết luận chất 2 là
tritriacontan-1-ol. Đây là hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài thực vật này.
Hình 3.13. Công thức cấu tạo của 2
3.2.3. Chất 3
Chất 3 là chất bột màu vàng nhạt, trên phổ 1H-NMR của chất 3 cho một
tín hiệu cộng hưởng dạng singlet tại δH 6.93 ppm (2H) tương ứng với 2 proton
trên nhân thơm, kết hợp với phổ HSQC của 3 nhận thầy 2 proton này liên kết
với nguyên tử cacbon δC 109.2 ppm. Trên phổ DEPT-135 của 3 nhận thấy 2
proton này thuộc dạng liên kết trong nhóm CH, nên 2 proton trên có trong hai
nhóm CH của nhân thơm. Nguyên tử hydro có δH 12.12 ppm có thể là proton
của nhóm COOH và 2 proton có δH 9,19 ppm, 01 proton có δH 8.82 là các
proton của nhóm OH trên nhân thơm.
50
Hình 3.14. Phổ 1H-NMR của chất 3
Hình 3.15. Phổ 13C-NMR của chất 3 Trên phổ 13C-NMR của chất 3 có 5 tín hiệu cộng hưởng, trong đó tín hiệu
cộng hưởng có δC 167.92 ppm có thể là nguyên tử C-8, δC 109.2 ppm là 2
nguyên tử cacbon tương đương tại C-2 và C-6; δC 120.91 là nguyên tử cacbon
51
bậc 4 tại C-1; δC 145.85 ppm là 2 nguyên tử cacbon tương đương tại C-3 và C-
5; δC 138.4 ppm là nguyên tử C-4.
Hình 3.16. Phổ DEPT-135 của chất 3
Hình 3.17. Phổ HSQC của chất 3
52
Hình 3.18. Phổ HMBC của chất 3
Hình 3.19. Phổ khối lƣợng của 3
. Kết hợp
Trên phổ khối lượng của 3 có pic ion có m/z là 193.12 [M+Na]+
với phổ 13-NMR của 3 có thể dự đoán 3 có công thức phân tử là: C7H6O5. Qua
phân tích phổ NMR 1D-, 2D-, kết hợp với tài liệu tham khảo [19, 34] ta có thể
kết luận 3 là acid gallic, có công thức cấu tạo là:
53
Hình 3.20. Công thức cấu tạo của 3
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết cồn tổng số
Khả năng khử gốc tự do và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit là những
phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa invitro thường gặp nhất
trong nghiên cứu [18], [24]. Ở luận văn này, chúng tôi cũng sử dụng các
phương pháp phổ biến trên.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khả năng làm sạch gốc tự do DPPH và ức
chế phản ứng peroxy hóa lipit tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Nồng độ cao
chiết càng cao thì khả năng quét gốc tự do và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit
càng lớn và ngược lại. Khả năng trung hòa 50% gốc tự do (SC50) và chỉ số ức
chế (IC50) của phản ứng peroxy hóa lipit được trình bày ở bảng 3.3. Đặc biệt,
các chỉ số SC50 và IC50 của mẫu thử trong 2 nghiên cứu đều thấp hơn chỉ số của
Trolox (acid ascorbic). Kết quả trên cho thấy mẫu cao chiết đã thể hiện hoạt
tính chống oxi hóa mạnh thông qua phép thử trung hòa gốc tự do DPPH và
phép thử ức chế phản ứng peroxy hóa lipit não chuột [18], [24].
Bảng 3.3. Hoạt tính chống oxi hóa và ức chế phản ứng peroxy hóa lipit của
mẫu nghiên cứu
Phần trăm ức chế MDA (%) Phần trăm trung hòa gốc tự do của DPPH (%)
Nồng độ (µg/ml) Mẫu chiết Mẫu chiết
90,47 90,37 47,83 19,68 4,25 ± 0,40 Ascorbic acid 91,62 91,30 27,96 1,51 7,80 ± 0,10 74,16 72,92 67,56 34,02 1,88 ± 0,25 Ascorbic acid 73,41 66,79 38,70 28,71 7,53 ± 0,12 100 20 4 0,8 SC50/IC50
54
Chỉ số IC50 trong phản ứng peroxy hóa lipit của Nguyễn Thu Hằng [2]
(IC50 sấp sỉ bằng 62,22 µg/ml) cao hơn rất nhiều so với IC50 trong luận văn này
(IC50 = 1,88 ± 0,25 µg/ml). Điều đó chứng tỏ mẫu thử trong luận văn thể hiện
hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn rất nhiều so với hoạt tính trong nghiên cứu
của Nguyễn Thu Hằng. Sự khác biệt đó có thể do sự khác nhau về mẫu thử:
Mẫu của Nguyễn Thu Hằng là dịch chiết nước từ lá của loài Sambucus
javanica, trong luận chúng tôi sử dụng cao khô với dung môi chiết là cồn 90%
và khác nhau về địa điểm thu hái nguyên liệu.
Khả năng quét gốc DPPH trong nghiên cứu này (SC50 = 4,25 ± 0,40
µg/ml) cao hơn rất nhiều khả năng quét gốc DPPH trong các nghiên cứu của
A.Sidor & A.G.Michałowska [18] (SC50 = 60,2 mg/ml/acid ascorbic) và nghiên
cứu của H.H.Xiao et al [25]. Nghĩa là hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết từ
lá cây Sambucus javanica cao hơn rất nhiều so với dịch chiết từ hoa, quả của
cây Sambucus nigra và acid linoleic chiết xuất từ dầu của hạt cây Sambucus
williamsii. Điều này được giải thích là do sự khác nhau về loài thực vật và
khác nhau về mẫu nghiên cứu (cao chiết cồn 90% trong luận văn với dịch chiết
nước từ hoa và quả trong nghiên cứu của A.Sidor & A.G.Michałowska).
55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Luận văn thạc sĩ “Xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính của
một số hợp chất hóa học từ loài Cơm cháy (Sambucus javanica reinw)” thực
hiện các nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất hữu cơ và thử
hoạt tính sinh học của cao chiết cồn tổng số từ lá cây Cơm cháy. Luận văn đã
hoàn thành các nhiệm vụ đề ra và đạt được các kết quả sau:
1- Đã định tính thành phần hóa học trong cao chiết cồn 90%.
2- Đã tiến hành sắc ký cột silica gel pha thuận, phân lập được 3 hợp chất từ
lá của cây Cơm cháy.
3- Đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất được phân lập từ mẫu nghiên cứu
4- Đã đánh giá hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế phản ứng
peroxy hóa lipit não chuột trong mô hình in vitro của cao chiết cồn.
2. Kiến nghị
Để cung cấp thêm thông tin khoa học, hữu ích về loài Cơm cháy, xin kiến
nghị một số ý kiến sau:
1- Tiếp tục nghiên cứu thêm về thành phần hóa học của loài Cơm cháy
(Sambucus javanica reinw).
2- Thử nghiệm thêm các hoạt tính sinh học khác.
56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Viêt Nam. Nxb Y học, 1997, Tr.314-315.
2. Nguyễn Thu Hằng, “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hoá học và
một số tác dụng sinh học của chi Sambucus L. ở Việt Nam”, Luận án tiến
sỹ, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, 2004.
3. Nguyễn Thu Hằng, Phan Thanh Kỳ và Chu Đình Kính, “Nghiên cứu thành
phần hóa học của cây Sambucus nigra ssp.canadensi (L.) R. Bolli (họ cơm
cháy Sambucaceae)”, Tạp chí dược liệu, tập 9, số 2/2004, Tr.39-42, 2004.
4. Nguyễn Thu Hằng, Phan Thanh Kỳ và Trần Vân Hiền, “Nghiên cứu tác dụng hạ
đường huyết của hoa cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp.canadensis (L.)
R.Bolli)”, Tạp chí dược học, số 3+4/2004, Tr.13-14, 2004.
5. Nguyễn Thu Hằng, Phan Thanh Kỳ và Trần Vân Hiền, “Thăm dò tác dụng
chống oxi hóa của flavonoid chiết từ cây tiếp cốt thảo (sambucus chinensis
lindl)”, Tạp chí dược liệu, tập 3, số 4/1998, Tr.118-120, 1998.
6. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Viêt Nam. Nxb Trẻ, tập 3, 2000, Tr.223.
7. Chu Đình Kính, Phan Thanh Kỳ và Nguyễn Thu Hằng, “Xác định cấu trúc
của hợp chất 2 (3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4H-chromen-3-
YL-6-deoxy-4-0-hexopyranosyl-hexopyranoside-một flavonoid được phân
lập từ hoa cơm cháy tròn (Sambucus nigra ssp.canadensis {L.} R.Bolli)
bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân”, Tạp chí dược liệu, số
12/2003, Tr.12-15, 2003.
8. Phan Thanh Kỳ và Nguyễn Thu Hằng, “Tổng quan về flavonoid của chi
Sambucus L.”, Tạp chí thông tin y học, số 1/2004, Tr.11-13, 2003.
9. Phan Thanh Kỳ, Bùi Kim Liên và Nguyễn Xuân Vinh, “Góp phần nghiên
cứu loài Sambucus chinensis Lindl mọc tại Hưng yên”, Tạp chí dược học,
số 11, Tr.7-11, 1997.
57
10. Đỗ Tất Lợi, Những vị thuốc và cây thuốc Viêt Nam. Nxb Khoa học Kỹ
thuật, 1977, Tr.297.
11. Trần Thị Thoan, “Nghiên cứu thành phần thực vật, Thành phần hóa học
của cây Sambucus sp. (Caprifoliaceae)”, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ Đại
học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, 2003.
12. Nuyễn Thị Thanh Thuỷ, “Tiếp tục nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành
phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Tiếp cốt thảo (Sambucus
chinensis Lindl. Caprifoliaceae)”, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học,
Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, 2001.
13. Triệu Tú Trinh, Thanh thảo dược thái sắc đồ phổ. Nxb Khoa hoc Kỹ thuật
Phúc Kiến, Tr 360 (tài liệu dich).
14. Nuyễn Thị Thái Vân, “Nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau của lá
cây tiếp cốt thảo”, Tạp chí Y học thực hành, số 4, 2006, Tr.6-9.
15. Lương Y Hy Lãn Hoàng Văn Vinh, Cây thuốc vị thuốc Đông y. Nxb Hà
Nội, 2001.
16. Nguyễn Xuân Vinh, “Bước đầu nghiên cứu dược liệu Sambucus chinensis
Lindl. Caprifoliaceae”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, Trường Đại
học Dược Hà Nội, Hà Nội, 1997.
17. Vũ Văn Vụ, Hà Thị Thanh Bình, Trần Dụ Chi, Lê Hồng Điệp và Khúc Thị
An, “Bước đầu khảo sát một số thành phần hóa học của cây Tiếp cốt thảo
(Sambucus chinensis LindL.)”, Hội nghị toàn quốc lần thứ hai nghiên cứu cơ
bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, tháng 07/2003, Tr. 417 - 420.
B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
18. A.Sidor & A.G.Michałowska “Advanced research on the antioxidant and
health benefit of elderberry (Sambucus nigra) in food – a review”, Journal
of Functional Foods, Volume 18, Part B, Pages 941-958, 2015.
19. B.Toulemonde & H.M.J.Richard, “Volatile Constituents of Dry Elder
(Sambucus nigra L.) Flowers”, Food Chem, Vol 31, Issue 2, 1983.
58
20. C.Hyemin, L.Y.June, C.S.Young, R.W.Young & L.G.Dong “Isolation of (-)-
olivil-9′-O-β-D-glucopyranoside from Sambucus williamsii and its
antifungal effects with membrane-disruptive action”, Biochimica et
Biophysica Acta, Volume 1828, Pages 2002–2006, 2013.
21. D.Beaux, J.Fleurentin & F.Mortier “Effect of extracts of Orthosiphon
stamineus Benth, Hieracium pilosella L., Sambucs nigra L. and
Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spring. In rats”, Phytotherapy Research,
Volume 13, Pages 222-225, 1999.
22. G.A.Hale, “Chapter 3.14: Elderberry (Sambucus nigra L.)”, Nonvitamin
and Nonmineral Nutritional Supplements, G.A.Hale, Elsevier Inc., 2019,
Pages 211-215.
23. GNT USA, Inc, “National List Petition for Elderberry Juice Color, Elderberry
Juice Color”, USDA National Organic Program, January 12, 2007.
24. H. X.Wang, H.Liu, M.J.Moore, ... & H.F.Wang, “Plastid phylogenomic
insights into the evolution of the Caprifoliaceae s.l. (Dipsacales)”, Molec.
Phyl.Evol, Vol. 142:106641, 2020. DOI:10.1016/j.ympev.2019.106641.
25. H.H.Xiao, Zh.Yan, C.Raymond, Y.Xin-Sheng & W.Man-Sao
“Phytochemicals and potential health effects of Sambucus williamsii Hance
(Jiegumu)”, Chin Med, Volume 11, Page 36, 2016.
26. H.Jessi, B.Colby, C.Lindsey & D.Elizabeth “Black elderberry (Sambucus
nigra) supplementation effectively treats upper respiratory symptoms: A
meta-analysis of randomized, controlled clinical trials”, Complementary
Therapies in Medicine, Volume 42, Pages 361-365, 2019. DOI:10.1016
/j.ctim. 2018.12.004
27. J.B.Jaumandreu, F. Xavier & C.de las Heras, “Allelochemicals and esters
from leaves and inflorescences of Sambucusnigra L.”, Phytochemistry
Letters, Volume 30, Pages 107-115, 2019.
28. J.D.Hooker, The Flora of british India, Vol 3, 1882, P. 2-3.
59
29. M.Badescu, O.Badulescu, L.Badescu & M.Ciocoiu, “ Effects of Sambucus
nigra and Aronia melanocarpa extracts on immune system disorders within
diabetes mellitus”, Pharmaceutical Biology, Volume 53, Issue 4, Pages 533-
539, 2015.
30. M.Ciocoiu, D.Serban, L.Bădescu, D.Tutunaru, O.Badulescu & M.Bădescu,
“The effects of Sambucus nigra extract in experimental arterial
hypertension”, Annals of the Romanian Society for Cell Biology, Volume
15, Pages 87-92, 2010.
31. M.Ciocoiu, L.Badescu, D. Badulescu & M.Badescu, “Intervention
of Sambucus nigra polyphenolic extract in experimental arterial
hypertension”, World Academy of Science, Engineering and
Technology, Volume 64, Pages 244-247, 2012a.
32. M.Groza, D.Jitaru, L.Bădescu, M.Ciocoiu & M.Bădescu, “Evaluation of the
immune defense in diabetes mellitus using an experimental model”,
Romanian Biotechnology Letters, Volume 16, Pages 5971-5979, 2011.
33. M.M.Bratu, E.Doroftei, T.Negreanu-Pirjol, C.Hostina & S.Porta
“Determination of antioxidant activity and toxicity of Sambucus nigra fruit
extract using alternative methods”, Food Technology and
Biotechnology, Volume 50, Pages 177-182, 2012.
34. M.M.Petkovsek, A.Ivancic, V.Schmitzer, R.Veberic & F.Stampar,
“Comparison of major taste compounds and antioxidative properties of
fruits and flowers of different Sambucus species and interspecific hybrids”,
food chemistry, Volume 200, Pages 134-140, 2016.
35. M.M.Petkovsek, V.Schmitzer, A.Slatnar,... & A.Ivancic “Investigation of
Anthocyanin Profile of Four Elderberry Species and Interspecific Hybrids”,
Food Chem, Volume 62, Pages 5573−558, 2014.
36. M.Senica , F.Stampar , R.Veberic & M.M.Petkovsek “The higher the
better? Differences in phenolics and cyanogenic glycosides in Sambucus
60
nigra leaves, flowers and berries from different altitudes”, Journal of the
Science of Food and Agriculture, Volume 97, Issue 8, Pages 2623–2632,
2016. DOI: 10.1002/jsfa.8085
37. O.Fu, L.Yuan, L.Rong, ... & Y.Xin-Sheng “Five Lignans and an Iridoid
from Sambucus williamsii”, Chinese Journal of Natural Medicines, Volume
9, Issue 1, Pages 0026−0029, 2011.
38. P.D.Picon, R.V.Picon, A.F.Costa, ... & A.T.Henriques “Randomized
clinical trial of a phytotherapic compound containing pimpinella anisum,
Foeniculum vulgare, Sambucus nigra and Casia augustifolia for chronic
constipation”, BMC Complementary and Alternative Medicine, Volume 10,
Pages 17, 2010.
39. P.E.Wira & R.Muhaimin “Immunomodulatory Activities of Sambucus
javanica Extracts in DMBA Exposed BALB/c Mouse”, Advanced
Pharmaceutical Bulletin, Volume 9, Issue 4, 2019.
DOI: 10.15171/apb.2019.071
40. P.Joana, S.Vitor, J.M.Eulogio & C.Paula “Polyphenolic profile and
antioxidant activities of Madeiran elderberry (Sambucus lanceolata) as
affected by simulated in vitro digestion”, Food Research International,
Volume 100, Pages 404–410, 2017. Doi: 10.1016/j.foodres.2017.03.044
41. P.M.Abuja, M.Murkovic & W.Pfannhauser, “Antioxidant and prooxidant
Activities of elderberry (Sambucus nigra) extract in low-density lipoprotein
oxidation”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Volume 46, Pages
4091-4096, 1998.
42. R.Veberic, J.Jerneja, S.France & S.Valentia “European elderberry
(Sambucus nigra L.) rich in sugars, organic acids, anthocyanins and selected
polyphenols”, Food Chemistry, Volume 114, Pages 511-515, 2009. DOI:
10.1016/ j.foodchem. 2008.09.080
61
43. S.S.Won, K.S.Chung, S.Lalita & L.R.Kang “Iridoid Glycosides from the
Twigs of Sambucus williamsii var. coreana and Their Biological Activitie”,
J. Nat. Prod, Volume 80, Pages 2502−2508, 2017.
44. T.Eriksson & M.J.Donoghue “Phylogenetic Relationships of Sambucus and
Adoxa (Adoxoideae, Adoxaceae) Based on Nuclear Ribosomal ITS
Sequences and Preliminary Morphological Data”, Systematic Botany,
Volume 22, Issue 3, Pages 555–573, 1997. DOI: 10.2307/2419828
45. T.Golnoosh, V.Peter, A.Qayyum & D.Fariba “Anti-influenza activity of
elderberry (Sambucus nigra)”, Journal of Functional Foods, Vol 54, Page
353, 2019. DOI: 10.1016/j.jff.2019.01.031
46. V. Schmitzer, V.Robert, S.Ana & S.Franci “Elderberry (Sambucus
nigra L.) wine: A product rich in health promoting compounds”, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, Vol 58, pages 10143-10146, 2010.
DOI: 10.1021/jf102083s
47. V.Barak, S.Birkenfeld, T.Halperin & I.Kalickman “effect of herbal
remedies on the production of human inflammatory and anti-inflammatory
cytokines”, The Israel Medical Association Journal, Volume 4, Pages 919-
922, 2002.
48. W.Lawrie, J.Mclean & A. C. Paton, “Triterpenoids in the bark of elder
(Sambucus nigra)”, Phytochemistry, Volume 3, Issue 2, Pages 267-268, 1964.
62
