Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:86

Thêm vào BST

Báo xấu

88
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và sửa chữa MetO thông qua những hiểu biết về các protein giàu Met là đích tác động của Msr sẽ cho phép tiếp cận vấn đề này, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi. Tuy nhiên, các protein giàu Met hiện chưa được công bố một cách hệ thống ở cả những nghiên cứu trong và ngoài nước. Xuất phát từ những lý do trên, tác giả chọn đề tài: “Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana”.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lê Thị Ngọc Quỳnh NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng PGS. TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội  2015
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Tiến Dũng và PGS.TS. Nguyễn Quang Huy, những người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Cuối cùng, nhưng không kém phần quan trọng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong thời gian qua. Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia tài trợ mã số 106-NN.02-2013.46. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên Lê Thị Ngọc Quỳnh
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các ROS trong cơ thể sinh học .................................................................. 9 Bảng 1.2. Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi. ....................................... 12 Bảng 1.3. Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật ............................. 17 Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu. ................................ 23 Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu. ............................................ 24 Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen đáp ứng với điều kiện bất lợi ................................................................................... 27 Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN .. 31 Bảng 3.2. Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp ................... 35 Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao ...................... 38 Bảng 3.4. Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi.................................................................................. 41 Bảng 3.5. Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP..................... 42
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quá trình sinh tổng hợp Methionine ........................................................... 4 Hình 1.2. Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met ................................... 13 Hình 1.3. Phản ứng khử MetO về Met của các Msr ................................................. 16 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu .................................... 25 Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của Arabidopsis.............................................................................................................. 31 Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học. ............ 32 Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào .............. 33 Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử ..................... 33 Hình 3.5. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO .................................................................. 34 Hình 3.6. Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm Blast2GO ............................................................................................... 36 Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán ........................................... 37 Hình 3.8. Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau...................... 44 Hình 3.9. Dòng cây RBC1 được nảy mầm, A. môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B. môi trường ½ MS đặc ......................................................... 45 Hình 3.10. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch........ 46 Hình 3.11. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất ................... 48 Hình 3.12. Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trường ½ MS ......... 50 Hình 3.13. Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. . .......... 51 Hình 3.14. Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. ............ 52 Hình 3.15. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1........ 54
BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt, Tiếng Anh Tiếng Việt kí hiệu ABA Abscisic acid Axit abscisic ABRE ABA responsive element Yếu tố đáp ứng ABA Arabidopsis thaliana Protein giàu Methionin trên AtMRP Methionine-rich protein Arabidopsis thaliana ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphotphat bHLH basic Helix loop helix Cấu trúc xoắn vòng xoắn bZIP Basic region-leucine zipper Khóa kéo cơ bản vùng leucine subCELlular LOcalization Dự đoán vị trí cư trú trong tế CELLO predictor bào Cystathionine gamma- CgS Cystathionin gamma-synthaza synthase cs Cộng sự Full-length cDNA Over- Biểu hiện quá mức cDNA FOX eXpressing hoàn chỉnh Induction of CBF Vùng 2 biểu hiện cảm ứng bởi ICEr2 Expression region 2 CBF Met Methionine Methionin MetO Methionine sulfoxide Methionin sufoxit MetO2 Methionine sulfone Methionin sulfone MRP Methionine-rich protein Protein giàu methionin MS Murashige & Skoog Môi trường MS Methionine sulfoxide Msr Methionin sulfoxit reductaza reductase OPH O-phosphohomoserine O-phosphohomoserine PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PEL Pseudo-Etiolation in Light Sự giả vàng úa dưới ánh sáng Protein Subcellular Dự đoán vị trí cư trú của PSORT lOcalization pRedicTion protein trong tế bào Dòng cây chuyển gen từ TT RBC1 RIKEN Bioresource Center Tài nguyên Sinh học RIKEN ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy phản ứng Rapid Stress Response Yếu tố đáp ứng nhanh với điều RSRE Element kiện lạnh SAM S - Adenosyl Methionine S - Adenosyl Methionine TS Threonine synthase Threonine synthaza
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 Chương 1- TỔNG QUAN ......................................................................................... 2 1.1. Methionine và protein giàu Methionine .............................................................. 2 1.1.1. Tổng quan chung về Methionine................................................................... 2 1.1.2. Các protein giàu Methionine ......................................................................... 5 1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine ............................................ 7 1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng ................ 7 1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng ......................... 12 1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine ..................................................... 15 1.3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy phản ứng.................................................................................................................. 19 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 19 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam............................................................... 21 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................ 23 2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 23 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 23 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................... 23 2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................... 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 24 2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học ...................................................... 24 2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm .................................................... 28 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 30
3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP ............................................... 30 3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis .............. 30 3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi ................................................................................... 37 3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp ứng điều kiện bất lợi.................................................................................................... 41 3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen At3G55240 (dòng RBC1) ........................................................................................................... 44 3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen ................... 44 3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen .............................................. 45 3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi ....... 49 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 59 Tài liệu tiếng Việt .................................................................................................... 59 Tài liệu tiếng Anh .................................................................................................... 59 PHỤ LỤC................................................................................................................... i
MỞ ĐẦU Ở thực vật, sự hình thành và loại bỏ các dạng oxy phản ứng (ROS) được kiểm soát chặt chẽ thông qua con đường dẫn truyền tín hiệu. Tuy nhiên, trong tình trạng môi trường bất lợi, nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột do mất kiểm soát, gây ra tổn thương cho các chất phân tử lớn trong tế bào như lipit, protein, axit nucleic dẫn đến giảm tuổi thọ hoặc sức sống của sinh vật. Các dạng oxy phản ứng ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng của tế bào thông qua nhiều quá trình khác nhau, trong đó bao gồm cả oxy hóa Methionine (Met), một axit amin chứa lưu huỳnh có mặt trong phân tử protein, tạo thành Met sulfoxide (MetO). Đây là một trong những nguyên nhân gây mất hoạt tính, mất đi khả năng điều hòa trao đổi chất của protein, dẫn đến làm giảm sức đề kháng, giảm sức sống của cây trồng. Trong cơ thể sinh vật, MetO được sửa chữa bằng enzyme Methionine sulfoxide reductase (Msr). Quá trình sửa chữa này tạo ra những tác động tích cực, đặc biệt là tăng khả năng đề kháng cao, chống lại sự oxy hóa gây ra bởi các điều kiện bất lợi từ môi trường trên thực vật. Nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và sửa chữa MetO thông qua những hiểu biết về các protein giàu Met là đích tác động của Msr sẽ cho phép tiếp cận vấn đề này, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi. Tuy nhiên, các protein giàu Met hiện chưa được công bố một cách hệ thống ở cả những nghiên cứu trong và ngoài nước. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana”. Luận văn nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia tài trợ. 1
Chương 1- TỔNG QUAN 1.1. Methionine và protein giàu Methionine 1.1.1. Tổng quan chung về Methionine Methionine (Met) là một α – axit amin chứa lưu huỳnh, được sử dụng trong nhiều con đường chuyển hóa tế bào như thành phần cấu tạo nên protein, bộ ba mở đầu (AUG) mã hóa cho tín hiệu bắt đầu quá trình sinh tổng hợp chuỗi polypeptide. Ngoài ra Met đóng vai trò như một phân tử tham gia vào quá trình điều hòa thông qua dạng dẫn xuất là S - Adenosyl Methionine (SAM) [40]. SAM đóng vai trò chìa khóa cho nhiều con đường chuyển hóa khác nhau thông qua việc cung cấp nhóm methyl (-CH3) trong tế bào. Bên cạnh đó, SAM cũng là tiền chất cho các hợp chất chuyển hóa như: ethylene (CH2=CH2) - hormone quan trọng liên quan đến sự kiểm soát của nhiều quá trình ở thực vật như làm chín và già hóa, vitamin B1, 3- dimethylsulphoniopropionate (chất bảo vệ thẩm thấu, giúp thực vật chống lại những điều kiện bất lợi về thẩm thấu), và đóng vai trò như là nguồn sulfur của khí quyển: dimethylsulphide [8]. SAM là hợp chất cung cấp nhóm propyl amin cho quá trình sinh tổng hợp các polyamine, spermidine, spermine, những chất đóng vai trò quyết định cho quá trình phát triển của thực vật bao gồm sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào, tế bào chết theo chương trình (apoptosis), cân bằng nội môi và điều hòa biểu hiện gen [7]. Dẫn xuất của Met, S-methylmethionine, được sử dụng như phân tử vận chuyển chính để giảm lượng sulfur trong một số loài động vật, đây cũng là hợp chất liên quan đến việc hình thành dạng lưu động và dạng dự trữ của Met [14]. Met là một axit amin thiết yếu, được cung cấp thông qua thức ăn của động vật không nhai lại. Động vật có vú nói chung và con người nói riêng chỉ có thể tổng hợp ra khoảng một nửa số axit amin trong tổng số 20 axit amin cơ bản cấu tạo nên protein. Do đó, những axit amin không thể tổng hợp được cần phải được bổ sung qua chế độ ăn uống. Cây trồng phổ biến như ngũ cốc (lúa, gạo...) và các loại đậu thường có hàm lượng Met thấp [40]. Ở các nước đang phát triển, cải thiện chất lượng dinh dưỡng là cách để giải quyết nhiều vấn đề khi mà thức ăn có nguồn gốc từ thực vật là nguồn 2
cung cấp protein chủ yếu cho con người cũng như cho gia súc và gia cầm. Để giải quyết nhu cầu cung cấp các axit amin thiết yếu trong thức ăn chăn nuôi, các phụ gia có thể được thêm vào hoặc là sử dụng đa dạng nguồn thực vật. Do đó, nâng cao hàm lượng các axit amin thiết yếu trong cây trồng nông nghiệp là mong muốn của nhiều nhà nghiên cứu, người chăn nuôi và người tiêu dùng [29]. Met, axit amin chứa sulfur (methionine và cysteine) và các axit amin khác như lysine, threonine và isoleucine đều được tổng hợp từ họ aspartate. Aspartate kinase là enzyme đầu tiên trong con đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine, threonine, Met và isoleucine. Enzyme này xúc tác quá trình phosphoryl hóa aspartate bằng cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate [77]. Thông thường, có ít nhất hai dạng aspartate kinase được tìm thấy trong thực vật. β-aspartyl phosphate sẽ được chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde và sau đó là homoserine, bởi sự xúc tác tương ứng của aspartic semialdehyde dehydrogenase và homoserine kinase. Trong vi khuẩn và nấm, homoserine là điểm trung gian tạo thành threonine và Met [77]. Tuy nhiên, trong thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine và sinh tổng hợp Met là O- phosphohomoserine (OPH), cơ chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS) và cystathionine gamma-synthase (CgS). OPH có thể chuyển hóa trực tiếp thành threonine bởi sự tham gia của TS hoặc là tham gia vào cơ chế ba bước để tạo thành Met: phản ứng trùng ngưng cysteine và OPH tạo thành cystathionine, sau đó thành homocysteine và cuối cùng là thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β- lyase và homocysteine methyltransferase [40] (Hình 1.1). Cuối cùng, chỉ có khoảng 20% Met được sử dụng làm thành phần tạo nên protein, trong khi có đến 80% Met sẽ được biến đổi để tạo thành SAM, cũng là sản phẩm cuối cùng trong con đường sinh tổng hợp Met [32]. 3
Hình 1.1. Quá trình sinh tổng hợp Methionine [40] Việc tạo cây trồng biến đổi gen tác động vào hoạt động của các enzyme đã giúp tăng cường hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp các amino axit chứa sulfur [73]. Các nghiên cứu hiện nay đều khẳng định rằng có thể kiểm soát quá trình sinh tổng hợp Met trong thực vật thông qua mức độ cạnh tranh giữa CgS và TS với cơ chất chung của chúng là OPH [10, 40, 93]. Khi hoạt động của TS giảm: thể đột biến Arabidopsis (mto2) thể hiện hoạt tính của enzyme TS thấp, Met tự do được tạo thành 4
trong lá non tăng gấp 20 lần, kèm theo giảm 6% lượng threonine so với đối chứng, nhưng không có sự khác biệt ở cây trưởng thành [10]. Kết quả này khẳng định rằng, cây Arabidopsis non điều hòa sinh tổng hợp Met thông qua tương tác qua lại giữa CgS và TS [10]. Trên khoai tây (Solanum tuberosum), Zeh và cs đã sử dụng RNA đối mã (RNA antisense) của TS dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35S. Kết quả cho thấy các dòng chuyển gen có hoạt tính của TS giảm xuống 6%, đồng thời giảm 45% mức độ threonine, trong khi mức độ của Met tăng lên gấp 239 lần so với cây không chuyển gen. Kết quả này đã tái khẳng định tỉ lệ enzyme TS đóng vai trò là điểm kiểm soát chính trong quá trình sinh tổng hợp Met trong khoai tây. Điều này góp phần xây dựng chiến lược tăng cường hàm lượng Met và cải thiện chất lượng protein trong thực vật [93]. 1.1.2. Các protein giàu Methionine Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA. Do đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N (N-terminal) trong chuỗi peptide. Tuy nhiên, Met có khả năng bị loại bỏ trong quá trình cải biến protein sau dịch mã. Trung bình một protein chứa khoảng 1,5% gốc Met trong toàn bộ chuỗi polypeptide [26]. Trong Escherichia coli, hàm lượng Met trung bình khoảng từ 1-3% (các protein giàu Met nhất: nhân tố kéo dài chuỗi polypeptide TU: 2,8%; các protein liên quan đến các điều kiện bất lợi oxy hóa KatE: 1,3%; HypT: 2%; MsrA: 3,3%) [26]. Giá trị Met tương tự cũng đã được công bố với các protein nấm men và protein ở động vật [26]. Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được nghiên cứu từ rất sớm trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của Brazil [5], hạt hướng dương [50], ngô [49, 66], và lúa [60]. Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm lượng Met trong khoảng 11-22% [6]. Prolamin từ ngô (Zea mays) được gọi là zein, trong đó chiếm số lượng lớn là α-zein, các nhóm nhỏ hơn là β, γ, δ-zein [22]. β-zein và δ-zein là MRP với các gốc Met tập trung chủ yếu gần đầu C của phân tử . Trong 5
đó, β-zein trong ngô có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kDa với 160 axit amin, với 18 gốc Met và 7 gốc cysteine [76]. δ-zein được hình thành từ hai tiểu phần có trọng lượng phân tử khoảng 14,4 kDa và 21,1 kDa. Cả hai tiểu phần này đều giàu Met: tiểu phần 21,2 kDa có chứa 26,9% Met, tiểu phần 14,4 kDa có chứa 22,8% Met [76]. Phân tử β-zein do một gen quy định trong khi đó δ-zein do 2 gen khác nhau mã hóa [76]. Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá kỹ do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các axit amin chứa sulfur như Met. 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18% methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine [7]. Protein 2S albumin cũng được biểu hiện trong một số loài thực vật như thuốc lá, hạt cải dầu và đậu tương [7]. Hạt của một số loài đậu đã được tăng gấp đôi hàm lượng Met trong các protein do chuyển gen 2S albumin từ hoa hướng dương. Tuy nhiên, việc cải thiện hàm lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met cần thiết trong thức ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, protein 2S albumin từ quả hạnh nhân Brazil và hoa hướng dương đã được biết là nguyên nhân gây dị ứng trong một số trường hợp [47]. Chính vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu protein giàu Met còn là cơ sở để ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm cải thiện hàm lượng Met ở cây trồng. Năm 2000, Chakraborty và cs đã tinh sạch được protein mã hóa bởi gen AmA1 tách chiết từ hạt rau dền đỏ (Amaranthus hypochondriacus) [20]. Protein AmA1 có hàm lượng cân bằng các axit amin thiết yếu gồm lysine, tryptophan, tyrosine, và axit amin chứa lưu huỳnh. Đặc biệt là AmA1 không gây dị ứng do không tạo ra phản ứng với IgE. Biểu hiện quá mức gen này trên khoai tây làm tăng hàm lượng Met 3-7 lần so với kiểu dại [20]. Năm 2005, Izquierdo và Godwin đã tách dòng trình tự cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho δ-Kafirin, protein dự trữ giàu Met có mặt trong hạt cây cao lương (Sorghum bicolor L.) và biểu hiện thành công. Protein δ-Kafirin có trọng lượng phân tử khoảng 16 kDa với 147 axit amin trong đó 17% là Met [44]. Sử dụng PCR phiên mã ngược và Realtime PCR cho thấy δ-kafirin chỉ biểu hiện ở những hạt đang trong giai đoạn 6
phát triển [44]. So sánh trình tự DNA cho thấy gen mã hóa cho δ-Kafirin có độ tương đồng cao với gen mã hóa cho tiểu phần 14,4 kDa của δ-zein ngoại trừ thiếu đi một phần quy định vùng giàu Met. Do vậy, hàm lượng Met có mặt trong δ-Kafirin thấp hơn trong δ-zein [76]. Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên sự cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein. Met được tìm thấy nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong khi ở các protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép. Tuy nhiên, đối với các protein có chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met sulfoxide (MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng [15]. Do đó, MRP được xem như protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài sinh vật khác nhau. 1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine 1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng Quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất tối ưu của thực vật chịu ảnh hưởng nghiêm trọng bởi điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong bối cảnh khí hậu trái đất có nhiều thay đổi bất thường như hiện nay. Gần đây, tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) đã chỉ ra rằng, điều kiện bất lợi từ môi trường sống ảnh hưởng đến 37% năng suất cây trồng trên toàn thế giới [46]. Hạn hán và mặn hóa là nhân tố bất lợi chính mà cây trồng gặp phải. Quá trình sống của thực vật và tạo sản phẩm thứ cấp phụ thuộc chủ yếu vào nước. Gần 20% diện tích đất trên toàn thế giới đang bị thiếu nước cho sản xuất cây trồng và con số này sẽ ngày càng tăng lên khi diện tích đất trồng ngày càng bị sa mạc hóa [17]. Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, dẫn đến quá trình sinh trưởng chậm lại. Do khí khổng đóng nên lượng CO2 trong lá bị giảm xuống, ức chế quá trình cố định carbon nhưng lại làm tăng lượng các dạng oxy phản ứng (ROS) có mặt trong thực vật, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa [38]. Đất nhiễm mặn cũng gây ảnh hưởng lớn đến cây trồng, làm giảm đến 23% năng suất 7
cây trồng trên toàn thế giới [86]. Tăng cường nồng độ muối trong đất làm giảm khả năng hấp thụ nước của thực vật. Khi một lượng lớn Na+ và Cl- được đưa vào cây thông qua rễ, cả hai ion Na+ và Cl- đều gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển do giảm quá trình trao đổi chất và giảm hiệu suất quang hợp [25]. Do quá trình công nghiệp hóa tăng nên tình trạng đất bị nhiễm ion kim loại nặng cũng là một vấn đề đáng được đề cập đến. Các kim loại nặng cadmium (Cd), bạc, thủy ngân xâm nhập vào các hệ sinh thái từ nhiều nguồn khác nhau: khói bụi, nước thải của các xí nghiệp sản xuất chì, thiếc, sắt, thép, nước thải trong ngành đúc điện, trong phân lân bón cho cây trồng, trong các nhiên liệu diesel [34]. Cd dễ dàng được cây hấp thụ và chuyển lên mạch xylem của lá, gây ức chế tăng trưởng, ảnh hưởng đến khả năng quang hợp, sự hấp thu các hợp chất vi lượng và đa lượng dẫn đến giảm năng suất cây trồng [11]. Điều quan trọng là Cd sẽ đi vào chuỗi thức ăn và gây ra mối đe dọa cho sức khỏe con người cũng như các nhóm động vật khác [21]. Kim loại này có thể gây độc tế bào theo cách trực tiếp hay gián tiếp và có thể được giải thích thông qua cấu trúc hóa học của nó. Cd có thể liên kết với nhóm -SH của các protein và enzyme, làm cho protein, enzyme bị mất đi cấu hình, không hoạt động được chức năng, đặc biệt là với nhóm enzyme làm nhiệm vụ thu dọn ROS [24]. Bên cạnh đó, cơ chế gây độc quan trọng của cadmium với tế bào thực vật do sự tương đồng về mặt hóa học của Cd2+ và các ion kim loại liên kết với vị trí hoạt động của enzyme hay các yếu tố truyền tin. Cd2+ ảnh hưởng đến cơ chế nội cân bằng của các ion kim loại thiết yếu và các ion kim loại hóa trị 2 như Fe và Zn, giải phóng ion Fe/Cu tự do gây kích thích hiệu ứng Fenton gây ra ROS, tăng các quá trình tổn thương do oxy hóa [24]. Chính vì vậy, Cd cũng như các ion kim loại nặng khác, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa và tăng cường hàm lượng ROS trong thực vật bằng cách gây rối loạn quá trình loại bỏ ROS của các chất chống oxy hóa [24]. Paraquat (1,1 dimethyl-4,4’-bipyridynium dichloride) là thuốc diệt cỏ dạng bipyridinium, lần đầu tiên được công nhận hoạt tính diệt thực vật vào năm 1955 [39]. Cho đến nay, paraquat vẫn giữ được tầm quan trọng của nó bên cạnh các loại thuốc diệt cỏ khác có nguồn gốc từ glyphosate và glufosinate. Paraquat là thuốc diệt cỏ có 8
hoạt lực nhanh, làm đảo chiều chiều dòng điện tử của quang hệ I (PSI) xảy ra trong lục lạp. Kết quả là gây nên sự tích lũy superoxide trong lục lạp [39]. Superoxide được tạo ra một cách liên tục và nhanh chóng sẽ lấn át các cơ chế bảo vệ nội sinh của thực vật và gây ra hàng loạt ảnh hưởng tiêu cực đến thực vật. Paraquat có thể dễ dàng thâm nhập xuyên qua lớp biểu bì lá, làm giảm khả năng quang hợp một cách nhanh chóng, gây mất sức trương và làm vỡ màng tế bào. Các dấu hiệu này được nhận thấy chỉ sau vài giờ xử lý với paraquat trong điều kiện ánh sáng liên tục và cuối cùng là các mẫu mô bị mất nước và mất màu hoàn toàn [39]. Lá cây Arabidopsis thaliana 3 tuần tuổi kiểu dại được ngâm trong dung dịch paraquat 4 µM. Sau 2 ngày thí nghiệm dưới điều kiện ánh sáng liên tục, lá cây bị mất màu hoàn toàn do paraquat là hợp chất sản sinh ROS làm phân hủy diệp lục và phá vỡ các tế bào [91]. Các dạng oxy phản ứng (ROS) là khái niệm để chỉ các dẫn xuất của oxy có khả năng oxy hóa mạnh. ROS được chia thành hai nhóm: nhóm các gốc tự do (có chứa electron liên kết chưa cặp đôi) và nhóm các dẫn xuất không phải gốc tự do. Các ROS không phải gốc tự do dễ dàng chuyển hóa thành các gốc tự do trong quá trình phản ứng oxy hóa. Một số ROS là gốc tự do điển hình bao gồm hydroxyl, superoxide và nitric oxide; trong khi oxy mức đơn và peroxynitrile là các ROS không phải gốc tự do thường gặp trong các quá trình sinh hóa (Bảng 1.1). [19]. Bảng 1.1. Các ROS trong cơ thể sinh học [19] ROS Ký hiệu Gốc hydroxyl ∙OH Gốc superoxide ∙O2- Oxy mức đơn 1 O2 Nitric Oxide ∙NO Peroxynitrite ONOO- ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể và đóng vai trò quan trọng trong liên lạc tế bào và cân bằng nội môi. ROS được tạo ra ở nhiều bào quan khác nhau 9
trong tế bào, những nơi xảy ra chuỗi dẫn truyền điện tử như lục lạp, ti thể, peroxisome [31], có khoảng 1-2% oxy trong các mô tế bào thực vật sẽ tạo thành ROS [31]. Dưới điều kiện ánh sáng, lục lạp và peroxisome là nơi hình thành đa số ROS có mặt trong các mô, tế bào thực vật, nhưng trong điều kiện không có ánh sáng thì ty thể lại là bào quan chính tạo nên ROS [31]. Khi được duy trì ở nồng độ thấp, ROS đóng vai trò như tín hiệu phân tử để kiểm soát quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật, kích thích các con đường giúp cây chống chịu lại với các điều kiện bất lợi, tín hiệu cho quá trình già hóa và đưa tế bào vào con đường chết theo chu trình [13]. Tuy nhiên, khi gặp điều kiện sống bất lợi từ môi trường (như hạn hán, lạnh, nóng, nấm bệnh...), nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột, có thể làm tổn thương các cấu trúc tế bào do tác động tiêu cực làm thay đổi tính thấm, độ dẫn điện, phân giải thành phần phospholipid, dẫn đến phá hủy màng nội chất, gây chết các tế bào, tổn thương các cơ quan [31]. Khi nồng độ ROS càng tăng cao thì càng đem lại nhiều hậu quả nghiêm trọng. Nghiên cứu cũng chỉ ra ROS có thể đóng các vai trò phá hủy, bảo vệ hoặc truyền tín hiệu, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng giữa sự sản sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian [31]. Khi điều kiện môi trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao gồm: tăng tỷ lệ ion đi qua màng tế bào, tăng cường Ca2+ có mặt trong bào tương, kích hoạt protein MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị kích thích bởi các tác nhân sinh học và phi sinh học. ROS được sinh ra ở các bào quan khác nhau và dẫn đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy thông tin phải được chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào. Các tín hiệu thông qua ROS cần phải được tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay phosphatase. Cuối cùng, sự thay đổi trong biểu hiện gen xảy ra nhờ hoạt động của các nhân tố phiên mã và các yếu tố có mặt trên promoter. Vùng promoter của một số gen cảm ứng bởi điều kiện bất lợi chứa yếu tố cis [90]. Các nhân tố phiên mã khác nhau tương tác với yếu tố cis và hình thành phức hệ khởi đầu quá trình phiên mã. Phức hệ khởi đầu phiên mã hoạt hóa RNA polymerase để bắt đầu quá trình phiên mã của gen đáp ứng khi bị tổn thương [90]. Axit abscisic (ABA) đóng vai 10
trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với điều kiện bất lợi như hạn hán và chịu mặn, cũng như đóng vai trò trong quá trình nảy mầm và trạng thái ngủ của hạt [25]. Vùng promoter của một số gen cảm ứng bởi ABA khi so sánh với các promoter của gen khác thì được nhận thấy là thường chứa vùng trình tự bảo toàn ACGTGGC, được gọi là yếu tố đáp ứng với ABA (ABRE) [2]. ABRE đầu tiên được tìm thấy trên gen Em của lúa mì, có chức năng chính trong quá trình phát sinh phôi của hạt, và gen RAB16 của lúa gạo, đóng vai trò trong quá trình trưởng thành của hạt và các mẫu mô thực vật bị mất nước [90]. ABRE là yếu tố cis chính có mặt trong các gen cảm ứng với ABA [2]. Bên cạnh đó, các yếu tố điều hòa trên promoter của những gen phụ thuộc vào phản ứng với ABA còn chứa trình tự nhận biết cho các protein MYB và MYC. Trình tự DNA đặc hiệu MYC và MYB là CACATG (MYCR) và (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C (MYBR), được phát hiện trên vùng promoter của gen RD22. Các nhân tố phiên mã AtMYC và AtMYB bám vào trình tự DNA đặc hiệu MYCR và MYBR và hoạt hoá biểu hiện gen chức năng trong điều kiện mất nước [2]. Trong khi ABRE, MYBR, MYCR là trình tự cis cảm ứng điều kiện khô hạn thì ICEr2 – cảm ứng biểu hiện CBF vùng 2 (Induction of CBF Expression region 2) lại là yếu tố cis cảm ứng trong điều kiện lạnh [90]. Cuối cùng, khi gây tổn thương cho mô lá A. thaliana bằng cách tạo ra các điều kiện cực đoan, một số gen đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi đã được tìm thấy. Trên vùng promoter của các gen phản ứng nhanh với điều kiện bất lợi, người ta đã tìm thấy một yếu tố cis mới và được gọi là yếu tố đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi (RSRE - Rapid Stress Response Element) [12]. Các yếu tố cis tham gia điều hòa biểu hiện gen trong điều kiện bất lợi được thể hiện qua Bảng 1.2. 11
Bảng 1.2. Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi Nhân tố phiên Tài liệu Tên yếu tố Đáp ứng trong Trình tự mã bám vào tham cis điều kiện bất lợi yếu tố cis khảo ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) bZIP Hạn hán, đáp ứng [90] phụ thuộc ABA MYBR (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYB Hạn hán, đáp ứng [90] phụ thuộc ABA MYCR CACATG bHLH Hạn hán, đáp ứng [90] phụ thuộc ABA ICEr2 ACTCCG Chưa biết Chịu lạnh [90] RSRE CGCGTT CBF1, CBF2, Chịu lạnh, hạn CBF3, TGA3, hán, bị côn trùng [12] CAMTA và vi khuẩn tấn công Hydrogen peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu huỳnh là Cys và Met. Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi khác nhau đối với protein [23, 88]. Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan tâm hơn. Trong thực vật, chức năng của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met đã từng được công bố [45]. 1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone (MetO2) khi gắn thêm các nguyên tử oxy (Hình 1.2) [26]. MetO tồn tại với hai dạng đồng phân quang học là methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và methionine-R- sulfoxide (Met-R-O). Ngược lại với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính thuận nghịch . 12
Hình 1.2. Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met [26] Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do so với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa trong tế bào [70]. Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ protein cũng như các đại phân tử khác. Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong protein có thể cùng bị oxy hóa đồng thời. Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met trong protein có cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc vào việc các tác nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong cấu trúc protein như nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein. Shechter đã phát hiện chỉ các gốc Met trong chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn toàn, trong khi đối với các protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có thể bị oxy hóa [74]. Glutamine synthetase có nguồn gốc từ Escherichia coli đã được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến các gốc Met. Kết quả cho thấy là những gốc Met nằm trên bề mặt đều bị oxy hóa trong khi những gốc nằm trong phần lõi hầu như không bị ảnh hưởng bởi H2O2. Trong tổng số 16 gốc Met có mặt trong glutamine synthetase thì có đến 8 gốc bị oxy hóa nhưng hoạt tính của enzyme lại không hề bị thay đổi [26]. Điều này được giải thích là do glutamine synthetase có các gốc Met ở tập trung xung quanh trung tâm hoạt động của enzyme để bảo vệ chúng khỏi các dạng 13