Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

71
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC; áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu rau trên thị trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN XUÂN TRUNG Hà Nội – 2015
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi in được g i lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện ki m nghiệm An toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia, các anh chị trong Khoa chất lượng ph gia và chất h trợ chế biến th c ph m - Viện Ki m nghiệm an toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên c u trong môi trường hiện đại. Tôi in bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã cho tôi những kiến th c quý giá trong quá trình học tập và th c hiện đề tài này. Cuối c ng, tôi in g i lời biết ơn sâu s c tới gia đình, bạn b đã luôn bên cạnh chia s kh khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian th c hiện đề tài c hạn nên không tránh những thiếu s t, rất mong nhận được ý kiến đ ng g p c a thầy cô và các bạn đ luận văn này được hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015 Học viên Vũ Thị Hƣơng Quỳnh
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3 1.1.Giới thiệu chung về anthocyanin ................................................................................ 3 1.1.1. Cấu trúc h a học c a anthocyanin ................................................................3 1.1.2. Tính chất c a anthocyanin ............................................................................5 1.1.3. Tác d ng c a anthocyanin ............................................................................6 1.1.4. S phân bố c a anthocyanin .........................................................................7 1.2.Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin ............................................................. 8 1.2.1. Phương pháp pH vi sai ..................................................................................8 1.2.2. Phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .........................................9 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................................13 2.1. Mục tiêu ........................................................................................................................ 13 2.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 13 2.3. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................. 13 2.4. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị ................................................................................... 13 2.4.1. Chất chu n ..................................................................................................13 2.4.2. Hoá chất ......................................................................................................13 2.4.3. Thiết bị ........................................................................................................14 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 15 2.6. Thẩm định phƣơng pháp .......................................................................................... 16 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................17 3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC ..................... 17 3.1.1. Chọn detector ..............................................................................................17 3.1.2. Chọn bước s ng phát hiện ..........................................................................18 3.1.3. Chọn cột tách ..............................................................................................19 3.1.4. Chọn th tích bơm mẫu ...............................................................................20 3.1.5. Khảo sát thành phần pha động ...................................................................21 3.1.6. Khảo sát nồng độ a it trong pha động ........................................................22
3.1.7. Khảo sát chương trình r a giải ...................................................................23 3.1.8. Khảo sát tốc độ pha động ............................................................................27 3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ................................................................................. 28 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng c a thời gian đến quá trình th y phân .......................30 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến quá trình th y phân .........................31 3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu .............................................................33 3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ........................................................................ 34 3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ................................................................................34 3.3.2. Khoảng tuyến tính .......................................................................................36 3.3.3. Độ lặp lại .....................................................................................................38 3.3.4. Độ thu hồi ...................................................................................................40 3.4. Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin trong một số rau củ ............... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46 PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc c a 6 chất phổ biến nhất trong nh m anthocyanin ......................4 Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên c u .......................................................4 Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng c trong một số mẫu th c vật tại Việt Nam [7] ................................................................................................................................8 Bảng 3.1: Ảnh hưởng c a cột tách đến độ rộng đáy pic (W) và thời gian lưu (tR) ...20 Bảng 3.2: Ảnh hưởng c a thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) c a del, cya, pel. .............................................................21 Bảng 3.3: R a giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng ........................................23 Bảng 3.4: Chương trình gradient 1............................................................................24 Bảng 3.5: Chương trình gradient 2............................................................................25 Bảng 3.6: Chương trình gradient 3............................................................................25 Bảng 3.7: Chương trình gradient 4............................................................................26 Bảng 3.8: Ảnh hưởng c a chương trình gradient đến hệ số đối ng pic ................27 Bảng 3.9: Ảnh hưởng c a tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic ..............27 Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian th y phân ........................................31 Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ th y phân khác nhau ....................32 Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau ..................33 Bảng 3.13: Nồng độ và diện tích pic trung bình c a các chất...................................36 Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 c a phương trình đường chu n c a 3 anthocyanin ......................................................................................................38 Bảng 3.15: Độ lặp lại trên nền mẫu b p cải tím ........................................................39 Bảng 3.16: Độ lặp lại trên nền mẫu khoai lang tím ..................................................39 Bảng 3.17: Độ thu hồi trên nền mẫu rau dền đỏ ......................................................40 Bảng 3.18: Độ thu hồi trên nền mẫu c dền .............................................................41 Bảng 3.19: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng c a các chất phân tích ........43 Bảng 3.20: Kết quả phân tích một số mẫu rau c .....................................................43
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon c a anthocyanin ..................................................3 Hình 1.2: S ph thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH ................................................5 Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ...................................................................14 Hình 3.1: Phổ hấp th c a delphinidin ......................................................................18 Hình 3.2: Phổ hấp th c a cyanidin ..........................................................................18 Hình 3.3: Phổ hấp th c a pelargonidin ....................................................................18 Hình 3.4: S c ký đồ c a dung dịch chu n 3 chất với cột s c kí 1 .............................19 Hình 3.5: S c ký đồ c a dung dịch chu n 3 chất với cột s c kí 2 .............................20 Hình 3.6: S c ký đồ r a giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và ACN ..........................................................................................................................21 Hình 3.7: S c ký đồ del, cya tại các nồng độ a it trifloa etic khác nhau .................22 Hình 3.8: S c ký đồ c a h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 1......24 Hình 3.9: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 2 ...........25 Hình 3.10: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 3 ..........25 Hình 3.11: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 4 ..........26 Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi th y phân trong thời gian khác nhau (60, 90, 120, 150 phút). ..........................................................................................................30 Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ th y phân khác nhau ...........................32 Hình 3.14: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 N trong dung môi chiết mẫu ...................................................................................................................................33 Hình 3.15: S c ký đồ dung dịch chu n h n hợp .......................................................35 Hình 3.16: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin ....................................35 Hình 3.17: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin được thêm chu n h n hợp .............................................................................................................................35 Hình 3.18: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ delphinidin.................................................................................................................36 Hình 3.19: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ cyanidin .....................................................................................................................37 Hình 3.20: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ pelargonidin...............................................................................................................37
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân AOAC Community tích chính th c CYA Cyanidin Cyanidin DEL Delphinidin Delphinidin High performance liquid HPLC S c ký lỏng hiệu năng cao chromatography High performance thin layer S c ký lớp mỏng hiệu năng HPTLC chromatography cao LC- Liquid chromatography tandem mass S c ký lỏng ghép khối phổ MS/MS spectrometry hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol Metanol PDA Photodiod array Detector mảng đi-ốt quang PEL Pelargonidin Pelargonidin ppm Parts per million Phần triệu R Relative coefficient Hệ số tương quan RSD Relative standard deviation Độ lệch chu n tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chu n Tỷ lệ tín hiệu chia cho S/N Signal to noise ratio nhiễu TFA Trifloroacetic acid Axit Trifloaxetic UV-VIS Ultraviolet-Visible T ngoại và khả kiến
MỞ ĐẦU Ngày nay, do ảnh hưởng c a điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo l ng hay s d ng các th c ph m ch a nhiều chất o y h a đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc t do, kéo theo sau đ là s gia tăng các dạng o y hoạt động. Các dạng o y hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ng bất lợi, tổn thương cho cơ th và là nguyên nhân c a nhiều căn bệnh nan y. Những nghiên c u tìm hi u về các chất c khả năng chống o y h a mang lại những tác d ng tốt, c lợi cho s c khỏe con người đang ngày càng phát tri n. Chất chống o y h a là những “chiến binh tốt” chống lại các chất độc hại - các gốc t do. Chúng được hình thành một cách t nhiên như là một sản ph m ph c a quá trình sống liên quan tới o y. Các chất chống o y h a c khả năng giải ph ng ra những điện t , chúng vô hiệu h a khả năng oxy h a c a các gốc t do và ngăn chặn chúng tấn công các tế bào khỏe mạnh. Đ bảo vệ chính mình, cơ th luôn t sản sinh ra các cơ chế chống o y h a thiết yếu, nhưng với thời gian chúng dần trở nên kém hiệu quả theo tuổi tác. Đây là lý do tại sao mà việc s d ng các chất chống o y h a cũng như các th c ph m ch a chất chống o y h a là rất quan trọng [3], [11]. Ngày nay, th c ăn không chỉ đảm bảo đ calo, ngon, sạch, mà còn phải ch a các hoạt chất sinh học t nhiên cần cho s c kho và s c đẹp, không chỉ điều khi n được các ch c năng hoạt động c a từng bộ phận trong cơ th , tạo cho con người khả năng miễn dịch cao, chống s lão hoá, tăng tuổi thọ, mà còn giúp phòng chống được một số bệnh, k cả ung thư. Theo các nghiên c u thì các hợp chất anthocyanin có các hoạt tính rất tốt như: chống viêm, chống ơ vữa động mạch, c chế đông t ti u cầu, chống ung thư, thúc đ y hình thành cytokin điều hòa phản ng miễn dịch, c hoạt tính chống o y h a rất mạnh [21], [22], [28]. Trên thế giới đã c nhiều quy trình ác định hàm lượng tổng anthocyanin hay hoạt chất nh m anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LC- MS [17], [24], [31]. Tại Việt Nam cũng công bố một số nghiên c u ác định hàm lượng anthocyanin trong th c vật hay th c ph m [2], [7]. Hầu hết các phương pháp phân tích này ác định anthocyanin tổng bằng phương pháp UV-VIS c độ chính 1
ác không cao. Việc phân tích riêng l từng hợp chất trong nhóm anthocyanin trong đối tượng mẫu th c vật là cơ sở đ đánh giá hoạt tính chống o y hoá c a từng chất trong nhóm, đề uất nguồn nguyên liệu cho chế biến th c ph m ch c năng. Xuất phát từ th c tiễn trên, chúng tôi đặt vấn đề nghiên c u đề tài: “Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký” Với các m c tiêu sau đây: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. 2. Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu rau trên thị trường. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về anthocyanin Các anthocyanin thuộc một trong những nh m các chất màu t nhiên flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới th c vật. Thuật ngữ anthocyanin b t nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đ anthocyanin là s kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là anh thẫm [27]. Tuy nhiên, không chỉ c màu anh, anthocyanin còn mang đến cho th c vật nhiều màu s c r c rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian [30]. 1.1.1. Cấu trúc hóa học của anthocyanin Anthocyanin là những glycozit do gốc đường glucozơ, glactozơ... kết hợp với gốc aglycon c màu (anthocyanidin). Các anthocyanin khi mất hết nh m đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon. M i anthocyanidin c th bị glycosyl h a acylate bởi các loại đường và các axit khác tại các vị trí khác nhau. Aglycon c a chúng c cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1. Các gốc đường c th được g n vào vị trí 3,5,7; thường được g n vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân t anthocyanin g n đường vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 5 và 7 gọi là diglycozit. S khác biệt giữa chúng là số lượng các nh m hydro y, bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc c a chúng. Đến nay c những báo cáo c a hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy nhiên trong đ chỉ c sáu chất phổ biến nhất là pelargonidin, peonidin, cyanidin, malvidin, petunidin và delphinidin [30]. Trong đề tài này, chúng tôi ác định pelargonidin, cyanidin, delphinidin trong rau c . Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin 3
Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin R3’ R5’ Anthocyanidin R3 R5 Anthocyanin H H Pelargonidin Glucozơ Pelargonidin 3-glucozit H H Pelargonidin Glucozơ Glucozơ Pelargonidin 3,5-diglucozit OH H Cyanidin Glucozơ Cyanidin 3-glucozit OH H Cyanidin Glucozơ Glucozơ Cyanidin 3,5-diglucozit OH OH Delphinidin Glucozơ Delphinidin 3-glucozit OH OH Delphinidin Glucozơ Glucozơ Delphinidin 3,5-diglucozit OCH3 OH Petunidin Glucozơ Petunidin 3-glucozit OCH3 OH Petunidin Glucozơ Glucozơ Petunidin 3,5-diglucozit OCH3 H Peonidin Glucozơ Peonidin 3-glucozit OCH3 H Peonidin Glucozơ Glucozơ Peonidin 3,5-diglucozit OCH3 OCH3 Malvidin Glucozơ Malvidin 3-glucozit OCH3 OCH3 Malvidin Glucozơ Glucozơ Malvidin 3,5-diglucozit Các aglycon c a anthocyanin khác nhau chính là do các nh m g n vào vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3. Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên cứu Delphinidin Cyanidin Pelargonidin Tên hóa học 3,5,7,3’,4’,5’- hexa 3,5,7,3’,4’- penta 3,4’,5,7-tetra hydroxy flavylium hydroxy flavylium hydroxy flavylium Công thức phân tử C15H11O7+ C15H11O6+ C15H11O5+ Công thức cấu tạo Khối lƣợng phân tử 303,24 287,24 271,24 (g/mol) 4
1.1.2. Tính chất của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh th hoặc vô định hình là hợp chất khá phân c c nên tan tốt trong dung môi phân c c. Anthocyanin hòa tan tốt trong nước, etanol, metanol,… Trong đ khả năng tan trong CH3OH – HCl và C2H5OH – HCl là tương đương nhau và cao nhất [6]. Màu s c anthocyanin thay đổi ph thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nh m OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm. M c độ metyl h a các nh m OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ. Nếu nh m OH ở vị trí th ba kết hợp với các gốc đường thì màu s c cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [30]. Các anthocyanin cũng ph thuộc rất mạnh vào pH c a môi trường: - Khi pH > 7 các anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ. - Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối o onium màu cam đến đỏ. - Ở pH = 4÷5 chúng c th chuy n về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu. - Ở pH = 7÷8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh. Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH Màu s c c a anthocyanin còn c th thay đổi do hấp th ở trên polysaccarit. Khi đun n ng lâu dài các anthocyanin c th phá h y và mất màu. 5
Anthocyanin c bước s ng hấp th trong miền nhìn thấy, khả năng hấp th c c đại tại bước s ng 510–540 nm. Độ hấp th quang là yếu tố liên quan mật thiết đến màu s c c a các anthocyanin, ph thuộc vào pH c a dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc v ng axit mạnh c độ hấp th quang lớn. Nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp th quang càng mạnh. Như vậy, trong môi trường axit, các anthocyanin là những bazơ mạnh và c th tạo muối bền vững với axit. Anthocyanin cũng c khả năng cho muối với bazơ. Như vậy chúng c tính chất lưỡng tính. Muối với axit thì c màu đỏ, còn muối với kiềm thì c màu anh. 1.1.3. Tác dụng của anthocyanin Trong th c vật, anthocyanin c tính kháng khu n, kháng nấm, c vai trò tạo điều kiện cho s th phấn, phát tán do hình thành nên màu s c sặc sỡ trên cành hoa và quả. Mặt khác, anthocyanin là chất c khả năng hấp th tia UV cho phép bảo vệ bộ gen c a th c vật trước nh m tác nhân c th gây đột biến gen này. Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ được tăng cường đ đáp ng ph hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phốt pho, nhiễm nấm, vi khu n, tổn thương, côn tr ng, ô nhiễm…[20], [36]. Đối với s c khỏe c a con người, theo nghiên c u c a G. C. Cretu và cộng s [15], các anthocyanin c th c t được cơn đau tim, giảm thi u các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản s tạo thành các c c máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến t c mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế s suy giảm s c đề kháng. Các nhà khoa học cũng đã ch ng minh được rằng anthocyanin c tác d ng tốt trong chống lão h a, ngăn ngừa s phát tri n c a các khối u, bướu, hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ m c ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin chiết uất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất này đã ch ng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát tri n. Các nhà nghiên c u cũng phát hiện trong một số trường hợp về s biến đổi cấu trúc c a các phân t anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư c a chúng. Các nghiên c u còn cho thấy anthocyanin còn c tác d ng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết c a những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa 6
bệnh c a anthocyanin vẫn đang được nghiên c u đ tìm hi u cơ chế và ng d ng trong y học. Các ng d ng trên đã mở ra một tri n vọng về việc sản uất th c ph m, dược ph m ch c năng chữa bệnh c hiệu quả [14]. Trong lĩnh v c th c ph m, với khả năng chống o y h a cao, anthocyanin được s d ng đ bảo quản th c ph m, kháng khu n, kháng nấm, chống o y h a cho th c ph m [35]. Kết quả nghiên c u cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản c a các sản ph m th c ph m c ch a mỡ được kéo dài khá lâu và c th so sánh với chất chống o y h a tổng hợp butylated hydro yanisol là chất chống o y hoá, h n hợp hai đồng phân: 2-tert-butyl-4- hydroxy anisole và 3-tert-butyl-4-hydroxy anisole [35]. Ngoài các tác d ng chống oxy hóa, anthocyanin còn được s d ng như chất màu t nhiên tạo ra nhiều màu s c hấp dẫn cho th c ph m và khá an toàn. Ví d , dịch chiết anthocyanin từ các loại rau c c màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được d ng đ làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản uất kẹo c ng [36]. Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được s d ng trong th c ph m, còn là hợp chất c nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống o y h a cao, chống lão h a, tăng cường s c đề kháng, làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế s phát tri n c a các tế bào ung thư, tác d ng chống các tia ph ng ạ [19], [20]. 1.1.4. Sự phân bố của anthocyanin Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng c ở lá và rễ. Trong những loại th c vật này, anthocyanin được tìm thấy ch yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như bi u bì. Các hợp chất anthocyanin uất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống th c vật s d ng làm th c ph m [20]. Các họ th c vật như vitaceae (họ nho) và rosaceae (họ hoa hồng) là các nguồn anthocyanin ch yếu. Bên cạnh đ còn c các họ th c vật khác như solanaceae (cà tím), sa ifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quất) và brassicaceae (b p cải tím). Các loại anthocyanin phổ biến nhất là các glycozit c a cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đ petuidin và maldivin. Số lượng các 3–glycozit nhiều gấp 2,5 lần các 3,5–glycozit. Loại anthocyanin hay gặp nhất chính là cyanidin-3- 7
glycozit [33]. Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam [7] Hàm lƣợng STT Mẫu anthocyanin tổng (%) 1 Thân c a loài ngô (Zea mays L.) 0,59 2 Lá chua, b p giấm (Hibiscus sabdariffa L.) 1,49 3 Hoa c a loài chuối tiêu (Musa pardisiaca L.) 0,34 4 Quả c a loài dâu tằm (Mosrus alba L.) 1,75 5 Lá c a loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) 1,72 6 C c a loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.) 0,46 7 Vỏ c a loài nho (Vitis vinifera L.) 1,27 8 Lá c a loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) 1,05 Merr.) 9 Lá c a loài rau dền tía (Amaranthucs tricolor L.) 1,74 1.2. Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin Ở Việt Nam và trên thế giới, việc ác định hàm lượng anthocyanin trong th c ph m n i chung và trong rau c n i riêng là vấn đề đang rất được quan tâm. Nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên c u ác định hợp chất này bằng nhiều phương pháp khác nhau. Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được tiến hành th c nghiệm. 1.2.1. Phương pháp pH vi sai Tác giả Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự [2] đã ác định hàm lượng anthocyanin tổng trong một số nguyên liệu rau quả (quả dâu, b p cải tím, lá tía tô, trà đỏ, vỏ quả nho, vỏ quả cà tím) bằng phương pháp pH vi sai. Hàm lượng anthocyanin trong quả dâu là 1,188%; b p cải tím: 0,909%; lá tía tô: 0,397%; trà đỏ: 0,335%; vỏ quả nho: 0,564%; vỏ cà tím: 0,441%. Tác giả Phạm Thị Thanh Nhàn và cộng sự [7] đã tách chiết và phân tích hàm lượng anthocyanin trong một số loài th c vật. Tác giả đã trình bày một số dung môi tách chiết anthocyanin và kết quả ác định hàm lượng anthocyanin trong một số 8
nguyên liệu tươi bằng phương pháp pH vi sai. Hàm lượng anthocyanin toàn phần ở thân cây ngô non là 0,59%; lá chua 1,49%; hoa chuối 0,34%; lá cây hoa s i 0,56%; lá huyết d 1,28%; quả dâu ta 1,75%; lá tía tô 1,72%; c khoai lang tím 0,46%; vỏ quả nho 1,27%; lá mơ 1,05%; lá rau dền tía 1,74%. Tác giả Nguyễn Thị Hiển và cộng sự [5] đã nghiên c u chiết uất chất màu anthocyanin từ đài hoa b p giấm bằng phương pháp so màu và phương pháp pH vi sai, đã ác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết chất màu là dung môi etanol:nước = 50:50 bổ sung 1% HCl; tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14 ml/g; thời gian chiết 6 ngày, tiến hành ở nhiệt độ phòng. Bằng phương pháp chiết phân đoạn, các tác giả đã tách được chất màu thô anthocyanin từ dịch chiết c a đài hoa b p giấm và ác định được hàm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%, tương ng trong nguyên liệu tươi là 1,06%. 1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Hiện nay, HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được s d ng rộng rãi và phổ biến nhất. Do phương pháp này c độ nhạy tương đối cao, c khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất kh bay hơi hoặc dễ bị phân h y nhiệt. Đồng thời phương pháp này cũng c phạm vi ng d ng trải rộng trong nhiều lĩnh v c từ nghiên c u khoa học, trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh v c khác. Phương pháp này rất ph hợp cho việc ác định anthocyanin trong th c ph m n i chung. Do đ , n được s d ng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm. Đã c rất nhiều công trình nghiên c u ng d ng phương pháp này đ ác định anthocyanin. Bhornchai Harakotr [12] đã ác định 4 anthocyanin, 7 hợp chất phenolic trong ngô tím s d ng HPLC/DAD. Các anthocyanin chính được tìm thấy trong ngô tím bao gồm: cyanidin-3-glucozit, cyanidin-3-(6’-malonyl glucozit) và cyanidin-3- (3’,6’-dimalonyl glucozit). Hầu hết các anthocyanin được tìm thấy ở dạng acylated anthocyanin (chiếm 46,2-88% hàm lượng tổng anthocyanin) mà được s d ng rất hiệu quả làm chất màu th c ph m bởi tính bền màu c a chúng. Nghiên c u cũng chỉ ra ngô tím là nguồn cung cấp các chất c hoạt tính sinh học và nguồn cung cấp hiệu quả các chất chống o y h a t nhiên ph c v hữu ích cho một số ngành công 9
nghiệp: th c ph m ch c năng, ph gia th c ph m và mỹ ph m. Nafiz Oncu Can và cộng sự [29] đã nghiên c u phương pháp ác định nhanh 6 anthocyanin phổ biến nhất trong th c ph m. Các dạng 3-glycozit c a pelargonidin, cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin và malvidin được tách và định lượng bằng HPLC-DAD trong 18 phút s d ng nội chu n aglycon cyanidin. Quá trình lý mẫu đơn giản với việc hòa tan trong nước, lọc và bơm vào máy s c ký. Tác giả tập trung l a chọn điều kiện s c ký tối ưu đ tách và định lượng các chất. Giới hạn phát hiện cho 6 anthocyanin trong khoảng 3,92-19,26 ng/ml. Hàm lượng anthocyanin trong các mẫu rau, quả tươi và sản ph m chế biến trong khoảng 0-1837 µg/g và hàm lượng anthocyanin trong rau quả tươi cao hơn trong các sản ph m đã qua chế biến. Phương pháp ph hợp đ ác định nhanh anthocyanin trong các sản ph m c hàm lượng trong khoảng 80-420 ng/ml với độ đúng 99,2 ± 0,2% và độ ch m trung bình 0,8%. Yafang Shao [37] ác định các axit phenolic, anthocyanin và hoạt tính chống o y h a c a chúng trong gạo (Oryza sativa). Tác giả đã ác định đồng thời 11 axit phenolic bằng HPLC/DAD và ác nhận bằng LC/MS/MS. Hàm lượng phenolic tổng trong các loại gạo khác nhau: gạo tr ng (14,6-33,4 mg/100 g), gạo đỏ (66,8- 422,2 mg/100 g), gạo đen (56,5-82,0 mg/100 g). Chỉ c gạo đen được phát hiện ch a anthocyanin (26,5-174,7 mg/100 g) bao gồm 2 loại chính: cyanidin-3-glucozit và peonidin-3-glucozit. Antonieta Ruiz [10] đã ác định đồng thời 22 anthocyanin dạng liên kết trong một số loại bery dại ở phía nam Patagonian bằng HPLC-DAD-ESI-MS/MS. Chiếm hàm lượng cao nhất là delphinidin (22,91-35,99 µmol/g), petunidin (16,11-21,40 µmol/g ) và malvidin (13,70 µmol/g). Francesca Leri [18] đã ác định đồng thời anthocyanin, coumarin và axit phenolic trong quả, hạt và rượu c a các loài cây họ mơ mận (Prunus mahaleb L). Tác giả s d ng các kỹ thuật HPLC/DAD, HPLC/MS và HPLC/MS/MS đ nhận biết và ác định được ba nh m phenolic đặc trưng gồm: các dẫn uất axit phenolic (hợp chất chính là o-coumaric axit glucozit), quercetin glycozit và anthocyanin (cyanidin 3,5-diglucozit, cyanidin 3-sambubiozit, cyanidin 3-xylosyl-rutinozit và cyanidin 3-rutinozit). Coumarin chiếm hàm lượng cao trong hạt (0,87 mg/g), 10
flavonoid tập trung trong vỏ và thịt quả (0,55 mg/g). Trong sản ph m truyền thống sản uất từ P.mahaleb, anthocyanin chiếm tới 16,5%, axit phenolic chiếm 43,3%, coumarin 36,2% và flavonoid 4% c a tổng các chất. ` Fumi Tatsuzawa và cộng sự [32] đã khảo sát một dãy liên tiếp 8 giống hoa c màu s c khác nhau ch a anthocyanin đ ác định mối quan hệ giữa màu s c hoa và thành phần anthocyanin trong một họ. Tác giả s d ng các điều kiện phân tích như sau: cột C18Waters (250 x 4,6 mm, 5 µm); pha động: A (H3PO4 1,5%) B (H3PO4 1,5%, CH3COOH 20% trong h n hợp CH3CN-H2O (25-75); tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; nhiệt độ cột: 400C; detector: PDA ở bước s ng 530 nm. Mẫu được th y phân bằng HCl ở nhiệt độ 900C trong 2 giờ, lọc sau đ chạy s c ký. Zhe Zhang và cộng sự [38] đã phát tri n phương pháp HPLC đ phân tích các anthocyanin và anthocyanidin trong dịch chiết quả việt quất. D a trên việc kết hợp phương pháp HPLC với detector khối phổ đã ác định được 11 anthocyanin trong dịch chiết quả việt quất, trong đ chuy n đổi được 5 aglycon anthocyanin lớn là: delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin và malvidin. M i một aglycon c th tách rời hoàn toàn và phân tích định lượng chính ác với các tiêu chu n bên ngoài. Tác giả s d ng cột Beckman Ultrasphere ODS (250 x 4,6 mm, 5 µm). Pha động A: 0,4% TFA trong nước và B: 0,4% TFA trong acetonitril. Các điều kiện gradient là: 0-6 phút, 15% B; 6 - 20 phút, 15-22% B; và 20-35 phút, 22-30% B. Các điều kiện s c ký như sau: tốc độ dòng chảy 1 ml/phút; nhiệt độ cột 35°C; bước s ng phát hiện 525 nm; th tích tiêm mẫu 20 µl. Phương pháp cho độ chính ác cao, độ lệch chu n tương đối (RSD) cho tổng anthocyanidin là 1,8% đối với phương pháp HPLC và 0,3% cho phương pháp th y phân. Tác giả Veridiana Vera de Rosso và các cộng sự [31] đã tiến hành nghiên c u các anthocyanin từ hai loại trái cây nhiệt đới nổi tiếng là quả sơ ri và quả acai bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao kết nối với mảng đi-ốt quang và detector khối phổ 2 lần (HPLC–PDA–MS/MS). Cột: Shim-pack CLCODS C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm); pha động: axit fomic 5% - MeOH (85:15); tốc độ dòng: 1ml/phút; nhiệt độ cột: 250C; th tích tiêm: 20 µL. Chiết bằng MeOH c 0,5% HCl đ qua đêm ở 500C; lọc trước khi chạy s c ký. Kết quả chỉ ra hàm lượng anthocyanin tổng 11
trong trái cây sơ ri là 6,5-7,6 mg/100 g. Delphinidin, cyanidin, pelargonidin là 3 anthocyanin trong số 6 anthocyanin phổ biến nhất. Trong t nhiên, chúng thường tồn tại dưới dạng glucozit, có nhiều tác giả l a chọn phân tích dạng glucozit c a các anthocyanin này. Khi đ quá trình x lý mẫu chỉ bao gồm giai đoạn hoà tan trong nước và phân tích tr c tiếp trên hệ thống s c ký lỏng. Tuy nhiên, các glucozit c a các anthocyanin rất đa dạng (vài ch c chất), đ phân tích được các dạng này khá ph c tạp. Do đ , l a chọn tối ưu hiện nay là chuy n các dạng glucozit về dạng t do bằng quá trình thuỷ phân trong môi trường axit. Delphinidin, cyanidin, pelargonidin trong mẫu sau khi thuỷ phân về dạng t do thường c hàm lượng cao (khoảng mg/100 g), c bước sóng phát hiện chọn lọc trong vùng VIS nên l a chọn phương pháp HPLC với detector PDA đ tách và định lượng. Hệ thống HPLC-PDA phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện nay nên khả năng ng d ng cao. 12