ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------***--------------
Nguyễn Thị Thơi
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
1
Hà Nội – 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------***--------------
Nguyễn Thị Thơi
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ MỰC
(ECLIPTA PROSTRATA L., ASTERACEAE)
Chuyên ngành: Hóa Học Hữu Cơ Mã số: 60 44 27
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. Phan Minh Giang
Hà Nội – 2011
2
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... …….1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ................................................................................. …….2
1.1 Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae) .... …….2
1.1.1 Đặc điểm thực vật ............................................................................... …….2
1.1.2 Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam ....................................... …….3
1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata ................. …….3
1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần ..... …….8
Chƣơng 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... …...11
2.1. Nhiệm vụ của Luận văn........................................................................... …...11
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... …...11
2.2.1 Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất.11
2.2.2 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc ................................................... …...14
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ …...14
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. …...14
3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực ...................................... …...14
3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực ............. …...15
3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực.............. …...15
3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1) .................................................. …...16
3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2) ............................................. …...16
3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3) .............................................. …...16
3.3.5 Phân tách phần chiết nƣớc (EA4) ....................................................... …...17
3.4 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực
(EP)………………………………………………………………………………….19
3.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực
(EP) …......................................................................................................................19
3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)………………………………….19
7
3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3) ............................................... …...19
3.4.4 Phân tách phần chiết nƣớc (EP4) ....................................................... …...20
3.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập ................................. …...22
Chƣơng 4: THỰC NGHIỆM ............................................................................. …...31
4.1. Thiết bị và hóa chất ................................................................................. …...31
4.2. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. …...32
4.3. Điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực .................................................. …...32
4.4. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EA………………………………32
4.4.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1) ....................... …...32
4.4.2. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2) .................. …...34
4.4.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3) ................... …...34
4.4.4. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EA4) ............................ …...34
4.5. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết EP ........................................ …...35
4.5.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2) .................. …...35
4.5.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3) ..................... …...36
4.5.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EP4) ............................ …...36
4.6. Phân tách sắc ký các phần chiết EA ........................................................ …...37
4.6.1 Phần chiết n-hexan (EA1) .................................................................. …...37
4.6.2 Phần chiết điclometan (EA2) ............................................................. …...38
4.6.3 Phần chiết etyl axetat (EA3) ............................................................... …...38
4.6.4 Phần chiết nƣớc (EA4) ....................................................................... …...39
4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA .. …...39
4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết EP ........................................................ …...40
4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2) .............................................................. …...40
4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3) ............................................................... …...41
4.8.3 Phần chiết nƣớc (EP4) ........................................................................ …...41
4.9. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EP……..42
KẾT LUẬN ....................................................................................................... …...45
8
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. …...46
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng
CC (Column Chromatography): Sắc kí cột thường
FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh
Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế 1H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton 13C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT
ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi
4
điện tử
MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ
Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)
Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực
Bảng 2: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1)
Bảng 3: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2)
Bảng 4: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3)
Bảng 5: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EA4)
Bảng 6: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2)
Bảng 7: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)
Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4)
Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA)
5
Sơ đồ 2: Chiết và phân tách sắc ký phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)
MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Metyl gallat (II) Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II)
Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III) Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin I (III) Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III)
6
Phụ lục 6: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin II (IV) Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin II (IV) Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin II (IV) Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của Norwedelolacton (V) Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR và DEPT của Norwedelolacton (V) Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của Hesperidin (VI) Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR và DEPT của Hesperidin (VI)
LỜI MỞ ĐẦU
Trong các nghiên cứu y dược hiện đại các hợp chất thiên nhiên từ các cây
thuốc bao gồm các flavonoit, tecpenoit và ancoloit tiếp tục là nguồn cung cấp các
hợp chất có tiềm năng cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học. Eclipta prostrata L.,
syn. Eclipta alba L. (Asteraceae) là cây thuốc dùng phổ biến trong Y học cổ truyền
Việt Nam và một số nước trên thế giới. Các nghiên cứu hóa học các loài Eclipta
prostrata của Trung Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ đã xác định được các nhóm hợp
chất tritecpen (oleanan và taraxastan) glycozit, các flavonoit, các coumarin, các
ancaloit-steroit và các thiophen polyacetylen trong các bộ phận của cây Eclipta
prostrata. Dựa trên các kiến thức dược lý học dân tộc và các hoạt tính sinh học của
các phần chiết nhiều hoạt chất có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và chống
HIV của các chất được phân lập từ Eclipta prostrata đã được phát hiện.
Sự đa dạng về các nhóm cấu trúc lý thú của Eclipta prostrata, sự tương quan
của các cấu trúc này với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng và ý nghĩa khoa học và
thực tiễn của việc đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc Cỏ mực (Eclipta
prostrata L., Asteraceae) của Việt Nam đã thúc đẩy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu
một cách hệ thống về hóa thực vật của cây Cỏ mực. Luận văn này đặt mục tiêu
nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là
các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam. Các kết
quả nghiên cứu theo hướng này sẽ là các bước đầu tiên trong các chương trình hiện
đại hóa Y học cổ truyền Việt Nam. Các hợp chất phân cực chưa được xác định
trong một số nghiên cứu trước đã được phân lập trong nghiên cứu này sử dụng các
9
phương pháp sắc ký hiện đại.
Chƣơng 1:
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.) (Asteraceae)
1.1.1. Đặc điểm thực vật [1]
Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng
dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm. Họ Asteraceae phân bố rộng
khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới. Các chi
trong họ này được chia thành 13 tông. Chỉ có một trong số 13 tông này là Lactuceae, có
thể là có đủ khác biệt để có thể coi là một phân họ (phân họ Cichorioideae), các tông còn
lại, phần lớn là chồng ghép lẫn nhau, được đưa vào phân họ Asteroideae.
Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng sau: cụm hoa dạng đầu, bao
phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi
các bao phấn, tạo thành ống, bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa,
các noãn hoa trên một bầu nhụy, mào lông (chùm lông trên quả), quả là loại quả
bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín).
Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.), họ Cúc (Asteraceae), có tên thông dụng
ở Việt Nam là Cỏ mực, Cỏ nhọ nồi, Nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo.
10
Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae)
Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có
khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt
hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5 1,2 cm. Mép lá nguyên hay
có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay
đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa. Qủa bế
dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá
rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát.
1.1.2. Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam [1]
Cỏ mực được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu
cam, đái ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy
dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết
loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát
trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau
dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc.
Cách dùng: dùng tươi hay giã lấy nước uống, hoặc sao cháy đen với liều 15-
30 g sắc uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá. Trong trường hợp
sát trùng cũng dùng sắc uống hoặc giã tươi lấy nước uống, bã đắp. Có thể dùng tươi
xoa tay chữa rát do vôi, chữa nấm ngoài da và nhuộm tóc có màu tím đen.
Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc
tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt, mỗi ngày 1-3 ống (2 ml). Có nơi đã sản xuất thành
công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu.
1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata
Năm 1966: F. Bolhman và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức)
đã phân lập từ lá khô Eclipta alba 2 dẫn xuất thiophen 1 và 2 và polyacetylen 3 [5].
11
1
2 3
Sau đó năm 1966, N. R. Krishnaswamy và cộng sự (Đại học Delhi, Ấn Độ)
đã xác định được cấu trúc của một polythienyl, α-terthienyl methanol (4) từ Eclipta
alba [5].
4
Năm 1985: P. Sing và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã
phân lập được một thành phần dithienyl acetylen (5) từ rễ và phần trên mặt đất cây
Eclipta erecta (một tên gọi khác của Eclipta prostrata) [10].
5
Phân tách sắc kí cột phần trên mặt đất và rễ cây Eclipta erecta cho một hợp
chất dithienyl acetylen, 5-isovalennyloxymetylen-2-(4-isovalennyloxy-but-3-inyl)
dithiophen (6) và 5-angeloyloxy-methylen-2-(but-3-en-1-ynyl)-dithiophen (7);
stigmasterol (8) và sitosterol (9) là các thành phần từ phần trên mặt đất [8].
Năm 1985: T. R. Govindachari và M. S. Premila đã phân lập từ Eclipta alba
wedelolacton (10), norwedelolacton (11) và axit norwedelic (axit 5,6-dihydroxy-
2(2,4,6-trihydroxyphenyl)-benzofuran-3-carboxylic) (12) [4].
12
12
R1=Me, R2=H R1=R2=H 10 11
Năm 1992: P. Sihgh và S. Bhagrava (Đại học Rajasthan, Ấn Độ) đã phân lập
được một hợp chất từ phần rễ Eclipta erecta [9].
13
Năm 1997: S. Yahara và cộng sự (Đại học Kumamoto, Nhật Bản) đã phân
lập từ cây khô Eclipta alba ở Trung Quốc bốn taraxastan triterpen glycozit, các
eclalbasaponin VII-IX (14-17) cùng với các eclalbasaponin I-VI. Cấu trúc của các
eclalbasaponin đã xác định được là 3β,20β,16β- và 3β,20β,28-trihydroxytaraxastan
glycozit và các saponin sulfat của chúng [15].
15 17 R=H R=SO3H R=H R=SO3
14 16 Năm 1998: M. S. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã
phân lập từ phần chiết metanol Eclipta alba tám hoạt chất ancaloit có khung steroit
18-25. Ancaloid chính được phân lập là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)-
dien-3β-ol (verazin, 20); và các hợp chất khác là 20-epi-3-dehydro-4,5-
dehydroverazin (18), 20-epi-verazin (19), ecliptabin (21), 20-epi-4β-hydroxyverazin
(22), 4β-hydroxylverazin (23), 20-epi-25β-hydroxyverazin (24) và 25β-
13
hydroxyverazin (25) [3].
18 21
20 23 25 R1=R2=H R1=OH, R2=H R1=H, R2=OH R1=R2=H R1=OH, R2=H R1=H, R2=OH 19 22 24
Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã
phân lập được một flavonoit, diosmetin (26) và hai isoflavonoit, 3-
hydroxybiochanin (27) và 3-O-methylorobol (28) từ phần chiết metanol Eclipta
prostrata [7]
14
26 27 28 R1=OH, R2=OCH3 R1=OCH3, R2=OH
Năm 2008: M. K. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã
phân lập từ dịch chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata năm oleanan
tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I
(30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) [6].
30 31 32 33 R1=H, R2=GlC R1=H, R2=H R1=GlC, R2=GlC R1=SO3, R2=H 29
Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S. Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of
Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-
terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35), 5-
hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và
wedelolacton (39) [13].
15
34 35
38
36 37
39
1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần
1.3.1 Hoạt tính ức chế HIV-1 của các terthienyl, orobol và wedelolacton
Sáu hợp chất đã được phân lập từ phần chiết toàn cây Eclipta prostrata trong
một nghiên cứu phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học trong thử nghiệm ức
chế enzym HIV-1 integrase (IN) [12]. Các hợp chất này đã được xác định là 5-
hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-
terthyenyl angelat (35), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat
(37), orobol (38) và wedelolacton (39). Wedelolacton (39) đã được xác định là có
hoạt tính mạnh nhất đối với HIV-1 IN với IC50 là 4,0 ± 0,2 µm, tiếp đó là hợp chất
38 (IC50 = 8,1 ± 0,5 µm), các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính với IC50 >
100 µm. Đối với hoạt tính ức chế HIV-1 protease (PR) hợp chất 34 thể hiện hoạt
tính chống lại HIV-1 PR với IC50 = 58,3 ± 0.8 µm, hợp chất 37 (IC50 = 83,3 ± 1.6
µm) và hợp chất 36 (IC50 = 93,7 ± 0,8 µm) trong khi các hợp chất 33, 38 và 39
không thể hiện hoạt tính (IC50 > 100 µm). Các tác dụng ức chế HIV-1 IN của
wedelolacton, một dẫn xuất coumarin và orobol, một dẫn xuất isoflavon là các hoạt
16
tính đáng chú ý của nghiên cứu này.
1.3.2 Hoạt tính kháng viêm của các terthienyl, orobol và wedelolacton
Phần chiết toàn cây Eclipta prostrata và các hợp chất terthienyl, 5-
hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl tiglat (34), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-
terthienyl angelat (35), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl acetat (36), ecliptal
(37) cùng với falvonoit orobol (38) và coumestan wedelolacton (39) được phân lập
từ cây này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu ức chế sự
sản sinh nitơ oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và TNF-α trong các tế bào
RAW264.7 gây bởi lipopolisaccarit (LPS) [13]. Orobol (38) đã được phát hiện là có
hoạt tính mạnh nhất với NO ở IC50 = 4,6 µm, các hợp chất 34, 35 và 37 cho các giá
trị IC50 lần lượt là 12,7, 14,9 và 19,1 µm. Hợp chất 38 ức chế PGE2 với IC50 = 49,6
µm trong khi không có hoạt tính với TNF-α với IC50 > 100 µm. Cơ chế tác dụng của
orbol đã được xác định là ức chế enzym iNOs và sự biểu hiện của COX-2 mRNA.
1.3.3 Hoạt tính kháng nấm của các ancaloit khung steroit
Các hợp chất ancaloit khung steroit (18-25) được phân lập từ lá cây Eclipta
alba ở Suriname đã được thử nghiệm với bốn chủng vi nấm Saccharomyces
cerevisiae và một chủng vi nấm Candida albicans [2]. Các hợp chất 19-21 và 25 có
hoạt tính kháng nấm mạnh nhất. Hợp chất 25 có khả năng kháng nấm Candida
albicans và giá trị MIC của hợp chất này (< 3,1 g/ml) chỉ hơi yếu hơn các thuốc
kháng nấm đang được sử dụng lâm sàng là amphotericin B và ketoconazole. Các
chất còn lại có khả năng yếu chống tế bào độc hại M-109. Các hợp chất này được
xác định là có hoạt tính chủ yếu là kháng nấm do thử nghiệm hoạt tính gây độc
dòng tế bào M-109 của tất cả các hợp chất này đều cho giá trị IC50 > 10 g/ml.
1.3.4 Hoạt tính chống tăng sinh của các tritecpenoit
Phần chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata đã được phân lập
theo định hướng hoạt tính chống tăng sinh của các tế bào HS (Hepatic Stellate) in
vitro [5]. Các tế bào HS được biết đến là có vai trò chìa khóa trong sự phát sinh
bệnh xơ hóa. Năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất
glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III
17
(32) và eclalbasaponin V (33) đã được phân lập. Axit echinocystic và
eclalbasaponin II đã được phát hiện là có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh của
các tế bào HS. Nghiên cứu đã cho thấy nhóm axit cacboxylic tự do ở vị trí C-28 của
các dẫn xuất glycozit của axit echinocystic đối với hoạt tính chống u xơ. Trên cơ sở
nghiên cứu này hoạt tính chống u xơ của Eclipta prostrata và các tritecpenoit thành
18
phần có thể cho giả thiết về triển vọng điều trị sự u xơ gan.
Chƣơng 2:
NHIỆM VỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nhiệm vụ của luận văn
Đối tượng nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất cây Cỏ
mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae), một cây thuốc phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam và trên thế giới. Mặc dù đã có một số nghiên cứu được công bố
trên thế giới về các hợp chất hữu cơ từ cây Eclipta prostrata cho đến này chưa có
các nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cây thuốc này của Việt Nam, đặc
biệt là về các hợp chất phân cực. Tiếp tục các hướng nghiên cứu hóa thực vật của thế giới về E. prostrata, Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu các qui trình phân
tách sắc ký đặc biệt là đối với các hợp chất phân cực, phân lập các hợp chất thành
phần và xác định cấu trúc của chúng bằng các phương pháp phổ.
Các nhiệm vụ được đưa ra trong Luận văn này là:
- Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Cỏ
mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae);
- Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết để định tính các phần chiết và xác
định các hệ dung môi sắc ký điều chế thích hợp với chất hấp phụ silica gel;
- Phân tách sắc ký và phân lập các hợp chất thành phần chính đặc biệt là các
hợp chất phân cực bằng các phương pháp sắc ký điều chế;
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập bằng phương pháp
phổ.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất
Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp
chất, định hướng phân tách sắc ký, kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập sắc
ký, đặc trưng các hợp chất (TLC so sánh và co-TLC) và kiểm tra độ tinh khiết của
các hợp chất được phân lập.
19
Sắc kí cột thường (CC)
Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi và được
sử dụng để phân tách các phần chiết phân lập các hợp chất thiên nhiên. Sắc ký cột
CC được thực hiện trên silica gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ.
Sắc kí cột (CC) gradient trên nhựa polyme pha đảo có kích thước lỗ cao
Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản) theo cơ chế sắc ký phân bố được
sử dụng để phân tách sơ bộ các hợp chất phân cực trong phần chiết nước.
Sắc ký cột nhanh (FC)
Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí nén trên silica
gel theo cơ chế sắc kí hấp phụ.
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ.
Chất hấp phụ là silica gel có kích thước hạt nhỏ.
Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE)
Chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE) được sử dụng để tinh chế các hợp chất
phân cực. Chiết pha rắn trên pha đảo là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân
tích) từ pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu và làm
sạch mẫu phân tích. Pha rắn là loại chất hấp phụ kỵ nước kiểu silica biến cải (C-18) có kích thước 40 µm với đường kính lỗ xấp xỉ 60 Ao liên kết với nhóm octadecylsilan, pha động là dung môi phân cực thường là MeOH-H2O.
Sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC)
Sắc ký cột loại trừ theo kích thước được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng
lực của dung môi với chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100
µm). Sắc kí cột loại trừ theo kích thước phân tử được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic.
Phương pháp kết tinh
Phương pháp kết tinh để phân lập và tinh chế các chất rắn.
2.2.2. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc của hợp chất được phân lập được xác định bằng cách kết hợp các
phương pháp phổ. Phổ khố lượng (MS) cho các thông tin để xác định được khối
lượng phân tử và các con đường phân mảnh. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân
20
(NMR) vị trí của các tín hiệu NMR (nghĩa là các tần số cộng hưởng) được gọi là độ
chuyển dịch hóa học . Các giá trị của độ chuyển dịch hóa học H và C trên các phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho các thông tin về các phần cấu trúc và các nhóm chức có
trong các phân tử được nghiên cứu. Các hằng số tương tác giữa các proton cho phép
nhận biết các proton liên kết với nhau từ đó có thể xây dựng được các phần của
phân tử. Phổ DEPT cho tính bội của các nguyên tử cacbon.
Các kỹ thuật phổ được sử dụng trong Luận văn:
21
Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT.
Chƣơng 3:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguyên liệu cho nghiên cứu hóa học của Luận văn này là phần trên mặt đất
của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) dùng làm thuốc được thu mua ở
Gia Lâm, Hà Nội.
Mẫu được lấy làm hai lần:
Lần 1 vào tháng 4 năm 2009: nguyên liệu là phần thân được tách khỏi lá.
Lần 2 vào tháng 6 năm 2010: nguyên liệu là cả phần trên mặt đất.
Các kết quả nghiên cứu sơ bộ phần trên mặt đất mẫu cây Cỏ mực được thu
thập lần 1 cho thấy:
1) Các thành phần hóa học của phần lá và phần thân cây Cỏ mực có nhiều chất
giống nhau qua phân tích TLC;
2) Các phần ít phân cực chứa chủ yếu là các sterol;
3) Có khả năng phân tách tiếp các hợp chất phân cực hơn từ phần trên mặt đất.
Phần trên mặt đất có thể là bộ phận chứa nhiều hoạt chất của cây thuốc này
do đó phần trên mặt đất cây Cỏ mực đã được thu thập lần 2 cho một nghiên cứu hệ
thống về các hợp chất phân cực trong cây Cỏ mực.
3.2. Điều chế các phần chiết hữu cơ từ cây Cỏ mực
Phương pháp chiết có một ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp
chất hữu cơ thuộc các lớp chất hữu cơ mong muốn. Trong Luận văn này nhằm đạt
được sự làm giàu sơ bộ các hợp chất theo độ phân cực trong các phân chiết riêng
biệt, nguyên liệu cây Cỏ mực được xử lý theo một qui trình chiết và phân tách hai
pha lỏng chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Chiết hai pha rắn-lỏng: Bột nguyên liệu cây Cỏ mực (lần 1: phần thân
(phần trên mặt đất được tách lá); lần 2: phần trên mặt đất) được ngâm chiết với
metanol ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần trong 4 ngày). Các dịch chiết metanol được lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 50 oC thu được phần chiết
22
metanol.
Phân tách hai pha lỏng: Để phân tách các hợp chất có trong phần chiết
metanol phần chiết này được hòa với nước cất cho một dịch nước của phần chiết
metanol. Chiết dịch nước này với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan,
điclometan và etyl axetat cho các dịch chiết trong n-hexan, điclometan và etyl
axetat. Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, thu được các phần chiết hữu cơ tương
ứng. Dịch chiết nước còn lại được cô kiệt dưới áp suất giảm cho phần chiết nước.
Qui trình này phân tách các hợp chất trong phần trên mặt đất cây Cỏ mực
thành nhóm các hợp chất ít phân cực trong các phần chiết n-hexan và điclometan,
nhóm các hợp chất phân cực trung bình trong phần chiết etyl axetat và nhóm các
hợp chất phân cực trong phần chiết nước.
Qui trình điều chế các phần chiết từ thân (EA) và phần trên mặt đất (EP) cây
Cỏ mực đượctrình bày tóm tắt trong các Sơ đồ 1 và Sơ đồ 2.
Hiệu suất điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân cây Cỏ mực
STT Phần chiết Kí hiệu Khối lƣợng (g) Hiệu suất (%)
1 n-hexan
2 điclometan
3 etyl axetat
4 nước 2,76 107,2 1,34 4,90 3,42 4,90 3,40 12,09 0,46 3,15 0,22 0,14 0,57 0,14 0,57 0,36 EA1 EP1 EA2 EP2 EA3 EP3 EA4 EP4
3.3. Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết thân cây Cỏ mực
3.3.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết thân cây Cỏ mực
Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60F254
(TLC, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton cho các phần chiết ít
phân cực (n-hexan và điclometan) và hệ ba dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic
cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat.
Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần
23
chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient.
3.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (EA1)
Phần chiết n-hexan (EA1) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
silica gel với các hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA1 theo độ phân cực từ
EA1.1 đến EA1.4 (n-hexan-axeton 19:1), EA1.5 (n-hexan-axeton 9:1), EA1.6 (n-
hexan-axeton 6:1), EA1.7 và EA1.8 (n-hexan-axeton 3:1) và EA1.9 (n-hexan-
axeton 1:1).
Các nhóm phân đoạn chính từ EA1.2 đến EA1.5 (n-hexan-axeton 19:19:1)
được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (chất I) dưới dạng các tinh thể hình kim
màu trắng. Như vậy β-sitosterol đã được phân lập là thành phần chính của phần
chiết EA1.
3.3.3 Phân tách phần chiết điclometan (EA2)
Phần chiết điclometan (EA2) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với các hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton 6:1, 3:1, 2:1 và 1:1.
Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA2 theo độ phân
cực, từ EA2.1 đến EA2.4 (n-hexan-axeton 6:1), EA2.5 và EA2.6 (n-hexan-axeton
3:1), EA2.7 và EA2.8 (n-hexan-axeton 2:1) và EA2.9 (n-hexan-axeton 1:1).
Nhóm phân đoạn EA2.1 và EA2.2 (n-hexan-axeton 6:1) được rửa bằng n-
hexan cho β-sitosterol (I) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
3.3.4 Phân tách phần chiết etyl axetat (EA3)
Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1 và 10:19:1.
Phân tách đã phân bố các nhóm hợp chất trong EA3 theo độ phân cực thành
2 nhóm phân đoạn từ EA3.1 đến EA3.6 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1) và từ
EA3.7 đến EA3.10 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 10:19:1).
Nhóm phân đoạn EA3.3 được phân tách sắc kí cột Sephadex LH-20 với
dung môi MeOH cho 5 nhóm phân đoạn từ EA3.3.1 đến EA3.3.5.Các nhóm phân
đoạn EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3 được rửa bằng điclometan cho metyl gallat
24
(chất II) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
3.3.5 Phân tách phần chiết nƣớc (EAT4)
Phần chiết nước (EA4) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
polime pha đảo Diaion HP-20 với gradient MeOH-H2O thành 5 phân đoạn EA4.1
(H2O), EA4.2 (20% MeOH), EA4.3 (40% MeOH), EA4.4 (60% MeOH) và EA4.5
(MeOH).
Phân đoạn 60% MeOH-H2O (EA4.4) được phân tách sắc kí cột Sephadex
LH-20 với dung MeOH, sau đó bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các hệ dung
môi CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1 cho saponin tritecpenoit eclalbasaponin I (chất
III). Chất này còn được phân lập từ phân đoạn MeOH (EA4.5) qua phân tách sắc kí
cột (CC) trên silica gel với các hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1 và 4:1.
Quy trình chiết và phân tách phần thân cây Eclipta prostrata (EA) được trình
25
bày trên Sơ đồ 1.
EA (0,6 kg)
1. Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng 2. Chiết với n-hexan, điclometan, etyl axetat
nước
EA1 2,7 g
EA2 1,3 g
EA3 3,4 g
EA4 3,4 g
CC, silica gel, n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1
CC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, 3:1, 2:1, 1:1
Diaion HP-20, 20%, 40%, 60% MeOH-H2O
CC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1, 10:19:1
EAT3.4-3.10 1,44 g
EA2.1-2.2 0,28 g
EA1.4-1.5 0,15 mg
EA1.6-1.9 0,5g
EA2.3-2.9 1 g
EA4.1-4.3 1,79 g
EA3.1-3.2 64 mg
EA1.2 0,9g
EA3.3 0,51 g
EA4.4 0,72 g
EA4.5 0,89 g
EA1.1 0,4 g
1,2,3
Rửa, n-hexan
Rửa, n-hexan
Rửa, n-hexan
2,3
1. Sephadex, MeOH 2. Rửa CH2Cl2
III 10 mg
I 10 mg
I 0,27 g
II 0,3 g
III 0,1 g
I 0,14 g
1. Sephadex, MeOH 2. CC, silica gel CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1, 4:1 3. Rửa CH2Cl2
26
Sơ đồ 1: Chiết và phân tách sắc ký phần thân cây Cỏ mực (EA)
3.4 Phân tích và Phân tách sắc ký các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ
mực (EP)
3.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết phần trên mặt đất cây Cỏ mực
(EP)
Các phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng silica gel
60F254 (TLC, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton cho các phần
chiết ít phân cực n-hexan và điclometan và hệ ba dung môi n-hexan-etyl axetat-axit
fomic cho phần chiết phân cực hơn etyl axetat.
Sự phân giải trên sắc kí lớp mỏng cho thấy phân tách sắc kí cột các phần
chiết này cần được thực hiện với sự rửa giải gradient.
3.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (EP2)
Phần chiết điclometan (EP2) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 thành 12
nhóm phân đoạn: EP2.1 (phân đoạn 1-3), EP2.2 (phân đoạn 4-13), EP2.3 (phân
đoạn 14-15), EP2.4 (phân đoạn 16-24), EP2.5 (phân đoạn 25-30), EP2.6 (phân
đoạn 31-36), EP2.7 (phân đoạn 37-42), EP2.8 (phân đoạn 43-48), EP2.9 (phân
đoạn 49-51), EP2.10 (phân đoạn 52-60), EP2.11 (phân đoạn 61-62) và EP2.12
(phân đoạn 63-66).
Nhóm phân đoạn EP2.2 được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (chất I).
Nhóm phân đoạn EP2.11 được phân tách bằng cột chiết pha rắn SPE RP-18
với hệ dung môi MeOH-H2O 70%, chất nhận được được rửa bằng hệ dung môi n-
hexan-axeton 1:1 cho saponin tritecpenoit eclalbasaponin II (chất IV). Chất này
cũng nhận được từ phân đoạn EP2.12 sau khi phân đoạn này được tinh chế bằng
cách chiết pha rắn SPE RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 70%.
3.4.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (EP3)
Phần chiết etyl axetat (EP3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1 và 10:20:1 thành
10 nhóm phân đoạn: EP3.1 (phân đoạn 1-2), EP3.2 (phân đoạn 3-4), EP3.3 (phân
27
đoạn 5-6), EP3.4 (phân đoạn 7-11), EP3.5 (phân đoạn 12-15), EP3.6 (phân đoạn
16-17), EP3.7 (phân đoạn 18-22), EP3.8 (phân đoạn 23-27), EP3.9 (phân đoạn 28-
35) và EP3.10 (phân đoạn 35-37).
Các nhóm phân đoạn EP3.7, EP3.8 và EP3.9 được phân tách sắc kí cột
Sephadex LH-20 với dung môi MeOH sau đó được rửa bằng hệ dung môi n-hexan-
axeton 1:1 cho eclalbasaponin II (IV) đã phân lập được từ phần chiết điclometan
(EP2).
Nhóm phân đoạn EP3.10 được rửa bằng dung môi MeOH cho chất flavonoit
glycozit hesperidin (chất VI).
3.4.4 Phân tách phần chiết nƣớc (EP4)
Phần chiết nước (EP4) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient trên
nhưa polyme pha đảo Diaion HP-20 với gradient MeOH-H2O thành 4 phân đoạn:
EP4.1 (20%MeOH), EP4.2 (40%), EP4.3 (60%) và EP4.4 (MeOH).
Phân đoạn EP4.2 được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các
hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1 và 3:1. Phân đoạn EP4.2.4 được tinh chế
bằng Mini-C trên silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 7:3:0,5
thu được norwedelolacton (chất V).
Phân đoạn EP4.3 được tách bằng sắc kí cột (CC) trên silica gel với các hệ
dung môi CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1, 3:1 và rửa bằng MeOH cho hesperidin (VI)
đã được xác định từ phần chiết etyl axetat (EP3).
Quy trình chiết và phân tách phần trên mặt đất cây Eclipta prostrata (EP)
28
được trình bày trên Sơ đồ 2.
EP (3,4 kg)
1. Ngâm với MeOH ở nhiệt độ phòng 2. Chiết với n-hexan, điclometan, etyl axetat
nước
EP1 107,2 g
EP2 4,9 g
EP4 12,1 g
EP3 4,9 g
CC, silica gel, n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1
Diaion HP-20, H2O, 20%, 40%, 60% MeOH-H2O, MeOH
CC, silica gel,n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:1, 10:19:1
EP2.3-EP2.9 1,65 g
EP2.11-2.12 0,5 g
EP3.1-EP3.6 1,8 g
EP3.7-EP3.9 0,96 g
EP2.2 0,45 g
EP3.10 0,64 g
EP4.1 1,54 g
EP4.3 2,25 g
EP4.4 2,1 g
EP2.1 0,55 g
EP4.2 1,87 g
Rửa MeOH
1,2
1,3
Sephadex, MeOH
1, Sephadex, MeOH 2, Rửa n-hexan-axeton 1:1
Rửa, n-hexan
IV 40 mg
I 0,39 g
IV 0,5 g
VI 28 mg
V 10 mg
VI 26 mg
1. CC, silica gel, CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1, 6:1, 3:1 2. CC, silica gel, CH2Cl2-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 7:3:0,5 3. Rửa MeOH
29
Sơ đồ 2: Chiết và phân tách sắc ký phần trên mặt đất cây Cỏ mực (EP)
3.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập
Các phần chiết ít phân cực n-hexan (EA1) và điclometan (EA2) từ nguyên
liệu thân (EA) cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) được phân tách
gradient với hệ dung môi n-hexan-axeton cho thành phần chính β-sitosterol (I).
Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) gradient
trên silica gel với hệ ba dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH trong một qui trình
phân tách các hợp chất phenolic từ thực vật cho metyl gallat (II).
Một qui trình phân tách các hợp chất phân cực sử dụng kết hợp Diaion HP-
20 và silica gel đã được áp dụng cho phần chiết nước (EA4) để phân lập được
saponin tritecpenoit eclalbasaponin I (III).
Các phân tích TLC cho thấy sự tương đối trùng lặp giữa các thành phần của
các phần chiết thân và lá cây Cỏ mực (được tách từ phần trên mặt đất) của mẫu lấy
vào tháng 4 năm 2009 (lần 1). Do đó để có thể nghiên cứu hệ thống hơn các hợp
chất phân cực từ cây Cỏ mực nguyên liệu phần trên mặt đất (EP) của cây Cỏ mực
đã được thu mua vào tháng 6 năm 2010 (lần 2). Nguyên liệu này đã được nghiên
cứu theo các qui trình chiết, phân tách và phân lập tương tự. Kết quả là ngoài các
hợp chất β-sitosterol (I) được phát hiện trong các phần chiết ít phân cực n-hexan
(EP1) và điclometan (EP2) các hợp chất eclalbasaponin II (IV) và norwedelolacton
(V) đã được phân lập được từ phần chiết etyl axetat (EP3) và hesperidin (VI) từ
phần chiết nước (EP4). Một lượng saponin tritecpenoit eclalbasaponin II (IV) cũng
đã được phân lập từ phần chiết điclometan (EP2) sau khi các nhóm phân đoạn phân
cực nhất được phân tách trên pha đảo RP-18.
β-Sitosterol (chất I)
Hợp chất I được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim không màu, Rf = 0,38
(TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v), hiện màu tím với thuốc thử
30
vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Chất I được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở so sánh TLC và co-TLC với
chất chuẩn β-sitosterol.
Metyl gallat (chất II)
Hợp chất II được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,70
(TLC, silica gel, n-hexan-etyl axetat-axit fomic 10:10:1, v/v/v), vệt chất hiện màu
vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%, hiện màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3
5%.
Phổ 1H-NMR (CD3OD) của II cho thấy sự có mặt của hai nhóm tín hiệu
cộng hưởng từ proton, trong đó tín hiệu ở δH 3,83 (3H, s) của 3 proton của một
nhóm metoxy và tín hiệu ở δH 7,06 (2H, s) của 2 proton vòng thơm tương đương.
Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của II chỉ ra sự có mặt của các nhóm sau: một nhóm cacbonyl este ở δC 169,1 (s), 4 cacbon sp2 (4C) của một vòng benzen thế
31
4 lần trong đó có có 3 cacbon liên kết với oxi [δC 146,5 (s), 139,8 (2 s) và 121,5
(s)] và 2 nhóm metin sp2 (2CH) của vòng benzen thế [δC 110,1 (2 d)] và một
nhóm metoxy ở δC 52,3 (q).
Các dữ kiện phổ NMR cho thấy II có cấu trúc của metyl gallat phù hợp với
các dữ kiện phổ của chất chuẩn metyl gallat.
Eclalbasaponin I (chất III)
Hợp chất III được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,66
(TLC, silica gel, CH2Cl2-MeOH 2:1, v/v), vệt chất hiện màu đen với thuốc thử
vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Phổ ESI-MS (+) của III cho pic giả ion phân tử ở m/z 819,2 ([M + Na]+) cho
giả thiết về một công thức phân tử C42H68O14 của chất III.
Phổ 1H-NMR (CD3OD) của III cho thấy sự có mặt của 7 nhóm metyl bậc ba
dưới dạng singlet (7s) ở δH 0,80, 0,86, 0,89, 0,97, 0,98, 1,07 và 1,38; một nhóm
oxymetin ở δH 3,0 (1H, dd, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz), một proton olefinic của một nối
đôi thế ba lần ở δH 5,33 (1H, t, J = 3,0 Hz) và hai proton anomeric của 2 nhóm
glucopyranosyl ở δH 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,36 (1H, d, J = 8,0 Hz).
Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của III bao gồm 42 cacbon trong số đó có 30 cacbon của một khung tritecpenoit và 12 cacbon của 2 nhóm glucopyranosyl.
Tritecpenoit sapogenin chứa 7 nhóm metyl (7q) ở δC 33,3, 28,6, 27,3, 25,1, 17,8,
32
17,0 và 16,1; 9 nhóm metylen (9t) ở δC 47,8, 40,2, 36,4, 36,3, 34,2, 31,6, 27,1, 24,5
và 19,3; 5 nhóm metin (5d) ở δC 90,9, 74,0, 57,2, 48,2 và 42,2 trong số đó có 2
nhóm oxymetin (δC 90,9 và 74,0); 6 C bậc bốn (6s) 50,1, 42,7, 40,9, 39,9, 37,9 và
31,3; một nối đôi thế 3 lần ở δC 123,7 (d) và 144,6 (s) và một nhóm cacbonyl este ở
δC 177,3 (s). Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của hai nhóm glucopyranosyl
xuất hiện ở δC 106,7 (d), 78,7 (d), 78,2 (d), 75,7 (d), 71,7 (d) và 62,8 (t) và 95,8 (d),
78,3 (d), 77,7 (d), 74,9 (d), 71,2 (d) và 62,5 (t). Các cấu hình của 2 nhóm
glucopyranosyl được xác định dựa trên hằng số tương tác (J = 7,5 Hz và 8,0 Hz)
của các proton anomeric. Các dữ kiện phổ NMR của chất III xác định một cấu trúc
glycozit của một axit olean-12-en-28-oic. Các nhóm -D-glucopyranosyl được giả
thiết là liên kết với C-3 và C-28 dựa vào các giá trị δC-3 và δC-28 và hóa lập thể H-3
đã được xác định nhờ hằng số tương tác J = 14,5 Hz của H-3.
Các dữ kiện phổ NMR của chất III hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của
saponin tritecpenoit eclalbasaponin I [12]. Hợp chất này đã được phân lập lần đầu
tiên từ cây Eclipta alba của Nhật Bản.
Eclalbasaponin II (chất IV)
Hợp chất IV được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,65
(TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10, v/v/v), vệt
33
chất hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Phổ ESI-MS (+) của IV cho các pic giả ion phân tử ở m/z 635,3 ([M + H]+)
và 657,0 ([M + Na]+) cho giả thiết về một công thức phân tử C36H58O9 của IV.
Phổ 1H-NMR (CD3OD) của IV cho thấy sự có mặt của 7 nhóm metyl bậc ba dưới dạng singlet (7s) ở δH 0,80, 0,87, 0,90, 0,98, 0,99, 1,08 và 1,39; 2 nhóm
oxymetin ở δH 3,03 (1H, d, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz) và 4,56 (1H, s br); một proton
olefinic của một nối đôi thế ba lần ở δH 5,32 (1H, t, J = 3,5 Hz) và một proton
anomeric của một nhóm glucopyranosyl ở δH 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz).
Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của IV bao gồm 36 cacbon trong số đó có
30 cacbon của một khung tritecpenoit và 6 cacbon của một nhóm glucopyranosyl.
Tritecpenoit sapogenin chứa 7 nhóm metyl (7q) ở δC 33,4, 28,6, 27,3, 24,9, 17,8,
17,0 và 16,1; 9 nhóm metylen (9t) ở δC 47,7, 39,9, 36,6, 36,3, 34,3, 32,6, 27,1, 24,5
và 19,3; 5 nhóm metin (5d) ở δC 90,8, 75,3, 57,2, 48,2 và 42,1 trong số đó có 2
nhóm oxymetin (δC 90,8 và 75,3); 6 C bậc bốn (6s) ở δC 49,8, 42,7, 40,7, 40,2, 37,9
và 31,4; một nối đôi thế 3 lần ở δC 123,5 (d) và 145,1 (s) và một nhóm cacbonyl axit
cacboxylic ở δC 181,5 (s). Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của nhóm
glucopyranosyl xuất hiện ở δC 106,7 (d), 78,3 (d), 77,7 (d), 75,7 (d), 71,7 (d) và
62,9 (t). Cấu hình của nhóm D-glucopyranosyl được xác định dựa trên hằng số
tương tác (J = 7,5 Hz) của proton anomeric.
Sự phù hợp của các dữ kiện phổ NMR thuộc khung tritecpenoit của chất IV
với của eclalbasaponin I (III) và sự xuất hiện của một nhóm axit cacboxylic (δC
181,5) cho thấy nhóm glucopyranosyl duy nhất của IV phải ở vị trí C-3. Trên cơ sở
các phân tích độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác (J = 14,5 Hz và 4,0 Hz)
hóa lập thể ở C-3 và C-16 của hợp chất này phù hợp với của chất eclalbasaponin I.
Các dữ kiện phổ này hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của saponin tritecpenoit
eclalbasaponin II [12]. Hợp chất này đã được phân lập lần đầu tiên từ cây Eclipta
alba của Nhật Bản. Chất này cũng được thông báo là có trong cây Cỏ mực trồng ở
34
miền Nam [2].
Norwedelolactone (chất V)
Hợp chất V nhận được dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,21
(TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10, v/v/v), vệt
chất hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Phổ 1H-NMR (CD3OD) của V cho thấy sự xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng
của 2 proton vòng thơm tương tác octo (J = 2,0 Hz) ở δH 6,88 (1H, d, J = 2,0 Hz) và
6,97 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 2 proton vòng thơm ở vị trí para ở δH 7,18 (1H, s) và
7,36 (1H, s).
Phổ 13C-NMR và DEPT (CD3OD) của V cho thấy có 15 tín hiệu cacbon sp2
của một chất coumestan với các tín hiệu của bốn nhóm metin (4d) ở δC 99,6, 101,8, 105,2 và 106,1 phù hợp với các dữ kiện phổ 1H-NMR; 12 tín hiệu cộng hưởng còn
lại là của các tín hiệu cacbon singlet (12s) ở δC 100,9, 104,6, 115,6, 145,5, 147,0,
151,4, 155,8, 155,9, 156,9 và 160,6 và nhóm cacbonyl lacton ở δC 160,7 (s).
Các dữ kiện phổ NMR khi được so sánh với các dữ kiện phổ của một số chất
benzofuran [14] đã xác định được cấu trúc 1,3,8,9-tetrahydroxycoumestan
(norwedelolacton) của chất V. Các dữ kiện phổ NMR của V hoàn toàn phù hợp với
35
tài liệu đã công bố cho norwedelolacton [15].
Hesperidin (Hespentin 7-O-rutinosid) (chất VI)
Hesperidin được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng
Rf = 0,33 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH
85:15:10), vệt chất hiện màu đen với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của chất VI cho các tín hiệu của 2 proton tương
tác octo của vòng thơm ở δH 6,13 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz),
một vòng benzen thế ba lần với 3 tín hiệu proton cộng hưởng ở δH 6,90-6,96 (3H,
m), và một nhóm oxymetin ở δH 5,50 (1H, d, J = 12,0 Hz, 3,0 Hz) liên kết với một
nhóm metylen ở vị trí của một nhóm cacbonyl ở δH 2,78 (1H, dd, J = 17,0 Hz, 3,0
Hz) và 3,12-3,83 (1H, m). Các tín hiệu cộng hưởng từ proton này xác định một cấu
trúc flavanon cho chất VI. Các tín hiệu khác thuộc về hai gốc đường với các proton
anomeric ở δH 4,53 (1H, s) và 4,97 (1H, d, J = 7,5 Hz) và một nhóm metoxy ở δH
3,78 (3H, s).
Phổ 13C-NMR (DMSO-d6) của chất VI khẳng định cấu trúc flavanon với các
tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 đáng chú ý nhất của vòng A thế đioxy 5,7 [δC
95,6 (d, C-8), 96,5 (d, C-6), 103,4 (d, C-10), 162,6 (s, C-9), 163,1 (s, C-5) và 165,2
(s, C-7)], vòng B thế đioxi 3,4 [δC 112,2 (d, C-5), 114,2 (d, C-2), 117,9 (d, C-6),
36
131,0 (s, C-1), 146,5 (s, C-3) và 148,0 (s, C-4)], và vòng C của một flavanon với
nhóm –CH2CHO [δC 78,4 (d, C-2) và 42,1 (t, C-3)] và nhóm cacbonyl C-4 [δC
196,9 (s, C-4)]. Độ chuyển dịch hóa học (δC 196,9) của nhóm cacbonyl cho thấy
nhóm này liên kết với nhóm 5-OH qua một liên kết hiđro, trong trường hợp không
có liên kết hiđro δC-4 < 180. Các tín hiệu cacbon 13 còn lại phù hợp với của một
nhóm glucopyranosyl [δC 66,1 (t, C-6), 68,3 (d, C-5), 70,8 (d, C-4), 75,6 (d, C-
3), 76,3 (d, C-5), 99,6 (d, C-1)] và một nhóm rhamnopyranosyl [δC 17,8 (q, C-
6), 70,3 (d, C-2), 70,7 (d, C-3), 72,1 (d, C-4) và 100,6 (d, C-1)]. Nhóm
rhamnopyranosyl liên kết với nhóm glucopyranosyl ở vị trí C-6 gây ra sự chuyển
dịch về phía trường thấp của C-6 (δC 66,1). Các cấu hình cho nhóm
rhamnopyranosyl và cho glucopyranosyl đã được xác định từ hằng số tương tác
của các proton anomeric (J tương ứng là br s và 7,5 Hz). Vị trí của các nhóm
rutinozit (-L-rhmanopyranosyl(16)--D-glucopyranosyl) và metoxi [δC 55,8 (q)]
đã được xác định là ở C-7 và C-4 qua sự so sánh các dữ kiện phổ NMR với các hợp
chất flavanon glycozit. Do đó, cấu trúc của chất đã được xác định là hesperetin 7-O-
rutinozit (hesperidin) [9].
Các dữ kiện phổ 13C-NMR còn chứng minh sự tồn tại của đồng phân epime
2R của hesperidin (epime 2S). Các epime này trong thực tế không khác biết nhiều về các dữ kiện phổ 1H-NMR [9], tuy nhiên sự phân tích kỹ lưỡng các tín hiệu phổ
cacbon 13 cho thấy một số tín hiệu xuất hiện ở dạng kép (doublet) cho phép nhận
dạng sự tồn tại của epime 2R đặc biệt là các tín hiệu cộng hưởng ở vòng B [δC 112,1
(d, C-5), 114,1 (d, C-2), 117,8 (d, C-6), 130,96 (s, C-1), 146,48 (C-3) và 147,98
(s, C-4)], các tín hiệu ở vòng A [δC 162,5 (s, C-9), 163,0 (s, C-5) và 165,1 (s, C-7)]
và một số tín hiệu của các nhóm đường [δC 66,07 (t, C-6), 69,7 (d, C-2), 73,0 (d,
C-4), 99,5 (d, C-1)]. Sự xuất hiện của các chất chuyển hóa thứ cấp trong thiên
nhiên thường được cho là theo các con đường đặc thù về lập thể vì sự tham gia của
các enzym trong các bước của con đường sinh tổng hợp. Tuy nhiên các đồng phân
lập thể vẫn có thể cùng xuất hiện như ví dụ về các đồng phân epimeric 2R và 2S của
37
các flavanon do là sản phẩm phụ của các qua trình gây bởi các enzym nhất định và
cần có các phương pháp để nhận biết các chất này.Trong trường hợp của hesperidin (dạng 2S) và epime 2R F. Maltese sử dụng phổ 1H-NMR để nhận biết giữa 2 đồng
phân epime này [9]. Tuy nhiên, các giá trị δH chỉ phân biệt nhau ở đơn vị 0,01 ppm và không phân giải tốt trong trường hợp các chất của Luận văn này. Phổ 13C-NMR
đã được xác định trong trường hợp của hesperidin (epime 2S) là phương pháp
38
nhanh để nhận biết chất này và epime 2R của nó.
Chƣơng 4:
THỰC NGHIỆM
4.1. Thiết bị và hóa chất
Các phương pháp sắc ký
Phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng silica
gel Merck Alufolien 60 F254 (Darmstadt, CHLB Đức) chiều dày 0,2 mm trên nền
nhôm. Thuốc thử hiện màu là dung dịch vanillin/H2SO4 đặc 1% hoặc dung dịch
FeCl3 5% trong etanol.
Phân tách sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung
môi. Phân tách sắc kí cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất không khí nén.
Chất hấp phụ được dùng cho sắc kí cột là silica gel Merck (Darmstadt, CHLB Đức)
cỡ hạt 63-200 µm (các phần chiết n-hexan, CH2Cl2 và EtOAc) và nhựa polyme có
kích thước lỗ cao Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical, Nhật Bản) (phần chiết
nước). Cột sắc kí cho CC và FC là cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) với các
đường kính khác nhau tùy theo khối lượng mẫu được nhồi silica gel theo phương
pháp nhồi ướt đến chiều cao 20 cm.
Sắc kí cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện với chất hấp phụ silica gel
Merck (Darmstadt, CHLB Đức) cỡ hạt 63-200 µm, 40-63 µm và 15-40 µm. Cột
tách sắc kí cho Mini-C được nhồi silica gel theo phương pháp nhồi ướt đến chiều
cao 10 cm.
Cột tinh chế chiết pha rắn (RP-SPE) được sử dụng là C18 Sep-Pak Vac
Catridge (Waters, Hoa Kỳ).
Phổ khối lượng phun bụi điện tử (ESI-MS) được ghi trên thiết bị Agilent LC-
MS (Agilent Technologies, Hoa Kỳ).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) (500 MHz) được ghi trên
thiết bị Brucker AV 500 spectrometer.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (13C-NMR) (125 MHz) với chương
39
trình DEPT được ghi trên thiết bị Brucker AV 500 spectrometer.
Độ chuyển dịch hóa học (δ) được đo theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là
chất chuẩn nội zero (δ = 0,00) ppm.
4.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguyên liệu thực vật là phần trên mặt đất của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata
L., Asteraceae) làm thuốc được thu mua tại Hà Nội vào hai thời điểm tháng 4 năm
2009 (lần 1) và tháng 6 năm 2010 (lần 2).
Mẫu thực vật được lưu tiêu bản tại Phòng thí nghiệm Hóa hợp chất thiên
nhiên, Khoa Hóa học,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội.
4.3. Điều chế các phần chiết từ cây Cỏ mực
Nguyên liệu thực vật được phơi khô, sấy ở nhiệt độ 40-50 oC. Mẫu khô được
xay thành bột mịn.
Bột nguyên liệu khô được ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng. Sau 3
ngày lọc thu được dịch lọc metanol. Quá trình ngâm mẫu trong metanol được thực
hiện 4 lần. Các dịch chiết metanol sau 4 lần ngâm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ từ 60 oC cho phần chiết metanol
dưới dạng cặn tương đối sệt.
Hòa phần chiết metanol này trong nước cất, rồi lần lượt chiết dung dịch nước
nhận được với các dung môi hữu cơ n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết nhận được được cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 oC, thu
được các phần chiết tương ứng: n-hexan kí hiệu là EA1 từ thân (2,76g, 0,46%) và
EP1 từ phần trên mặt đất (107,2g, 3,15%), điclometan EA2 (1,34g, 0,22%) và EP2
(4,9g, 0,14%), và etyl axetat EA3 (3,42g, 0,57%) và EP3 (4,9g, 0,14%).
Quá trình điều chế các phần chiết từ nguyên liệu cây Cỏ mực được trình bày
tóm tắt ở Sơ đồ 1, Mục 3.3, Chương 3: Kết quả và Thảo luận.
4.4. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết (EA)
40
4.4.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1)
Phần chiết n-hexan (EA1) được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (Merck
TLC, silica gel) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1 và 3:1.
Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 2.
Bảng 2: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết n-hexan (EA1)
STT
Dạng vệt
Hiện màu
Rf
Hệ dung môi n-hexan-axeton
19:1
9:1
6:1
3:1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6
0,97 0,81 0,66 0,59 0,50 0,44 0,22 0,13 0,03 0,97 0,84 0,70 0,58 0,60 0,38 0,28 0,16 0,09 0,97 0,78 0,69 0,56 0,50 0,39 0,31 0,25 0,16 0,09 0,91 0,75 0,64 0,59 0,50 0,38
Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Dẹt Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn to Tròn Tròn Tròn Dẹt Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Dẹt
Tím Xanh Tím Tím đậm Tím Tím Tím Tím Xanh Tím Tím Tím Tím Tím Tím Xanh Xanh Xanh Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Xanh Xanh Tím Tím Tím Tím Tím Xanh Tím
41
4.4.2. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2)
Phần chiết CH2Cl2 được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (Merck TLC, silica
gel) với hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton 9:1, 6:1 và 3:1. Phát hiện các vệt
chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EA2)
STT
Dạng vệt Hiện màu
Rf
Hệ dung môi n-hexan-axeton
9:1
1 2
0,34 0,16
Tròn Tròn
Tím Xanh nhạt
3 1
0,09 0,45
Tròn Tròn
Xanh Tím
6:1
2 3
0,25 0,17
Tròn Tròn
Xanh Xanh
4 1
0,08 0,66
Dẹt Tròn
Tím Tím
3:1
2 3
0,58 0,56
Tròn Tròn
Tím Tím
4
Tròn
Xanh
0,47
4.4.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3)
Phần chiết etyl axetat (EA3) được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC,
silica gel, Merck) với hệ dung môi triển khai n-hexan-etyl axetat-axit fomic
20:19:1. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử FeCl3 5%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 4.
Bảng 4: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EA3)
STT
Dạng vệt Hiện màu
Rf
Hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH
1
0,38
Tròn to
Đen
20:19:1
2
0,18
Tròn to
Đen
42
4.4.4. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EA4)
Phân tích sắc kí lớp mỏng các phân đoạn phân tách (EA4.3, EA4.4 và
ET4.5) từ phần chiết nước (EA4) sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC
Alufolien 60 F254 (Merck) với các hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 6:4:1,
CH2Cl2-MeOH 4:1 và 7:3 và CHCl3-MeOH 7:3 (EA4.3, EA4.4 và EA4.5). Phát
hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày ở Bảng 5.
Bảng 5: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EA4)
Phần chiết
Hệ dung môi
STT
Dạng vệt Hiện màu
Rf
EA4.3
1
0,54
Dẹt
Tím
CH2Cl2-MeOH 7:3
1
0,82
Tròn
Tím
1
0,85
Tròn
Tím
CHCl3-MeOH-H2O 8:2:0,2 CHCl3-MeOH-H2O 6:4:1
CH2Cl2-MeOH 7:3
1 2
0,84 0,41
Tròn Tròn
Tím Tím
EA4.4
1 2
0,81 0,66
Tròn Tròn
Tím Tím
CH2Cl2-MeOH 4:1
3 4
0,5 0,34
Tròn Tròn
Tím Tím
EA4.5
1 2
0,88 0,47
Tròn Tròn
Tím Tím
CH2Cl2-MeOH 4:1
3
0,09
Tròn
Tím
4.5. Phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết (EP)
4.5.1. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2)
Phần chiết CH2Cl2 được phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (TLC, silica gel,
Merck), với hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton 9:1, 6:1 và 3:1. Phát hiện các
vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phân tích TLC phần chiết điclometan (EP2) được trình bày trên
43
Bảng 6.
Bảng 6: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết điclometan (EP2)
STT
Dạng vệt Hiện màu
Rf
Hệ dung môi n-hexan-axeton
1 2
0,88 0,61
Tròn Tròn
Tím Tím
9:1
3 4
0,45 0,24
Tròn Tròn
Tím Xanh
5 1
0,15 0,97
Tròn Tròn
Tím Tím
6:1
2 3
0,82 0,61
Tròn Tròn
Tím Tím
4 5
0,45 0,24
Dẹt Tròn
Xanh Tím
1 2
0,97 0,83
Tròn Tròn
Tím Tím
3:1
3 4
0,63 0,45
Tròn Tròn
Xanh Tím
4.5.2. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)
Phần chiết etyl axetat (EP3) được phân tách bằng sắc kí lớp mỏng (TLC,
silica gel, Merck) với các hệ dung môi triển khai n-hexan-etyl axetat-axit fomic
20:19:1và 10:20:1. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử FeCl3 5%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 7.
Bảng 7: Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EP3)
STT
Dạng vệt Hiện màu
Rf
Hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH
20:19:1
1 2
0,50 0,27
Tròn Tròn
Đen Đen
10:20:1
1 2
0,94 0,62
Dẹt Dẹt
Đen Đen
3
0,54
Dẹt
Đen
44
4.5.3. Phân tích sắc kí lớp mỏng phần chiết nƣớc (EP4)
Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254
(Merck), hệ 3 dung môi EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10 và CHCl3-MeOH-H2O
7:3:0,5 (EP4.1, EP4.2 và EP4.3). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc
thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phân tích TLC được trình bày ở Bảng 8.
Bảng 8: Phân tích TLC các phân đoạn của phần chiết nước (EP4)
Phần chiết
Hệ dung môi
STT
Dạng vệt Hiện màu
1
Rf 0,85
Dẹt
Xanh
2
0,68
Dẹt
Tím
EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10
3
0,34
Dẹt
Vàng
EP4.1
1
0,65
Dẹt
Tím
CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5
2
0,34
Dẹt
Vàng
1
0,82
Tròn
Xanh
2
0,68
Tròn
Vàng
3
0,62
Dẹt
Tím
EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10
4
0,54
Dẹt
Tím
EP4.2
5
0,41
Dẹt
Vàng
1
0,79
Dẹt
Vàng
2
0,63
Dẹt
Tím
CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5
3
0,26
Dẹt
Vàng
1
0,68
Tròn
Vàng
2
0,46
Tròn
Vàng
EtOAc-H2O-HCOOH 85:15:10
3
0,37
Tròn
Tím
EP4.3
1
0,85
Dẹt
Vàng
CHCl3-MeOH-H2O 7:3:0,5
2
0,65
Dẹt
Tím
4.6. Phân tách sắc ký các phần chiết từ nguyên liệu thân cây
4.6. 1 Phần chiết EA1
Phần chiết n-hexan EA1 (2,7 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên
45
silica gel (Merck, 63-200 µm), kích thước cột tách 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với
hệ dung môi gradient n-hexan-axeton tỉ lệ 19:1, 9:1, 6:1 và 3:1. Mẫu được đưa lên
cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel (Merck, 63-200 µm).
Các phân đoạn phân tách được thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân
đoạn có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 9
nhóm phân đoạn: EA1.1 (4 mg), EA1.2 (0,9 g), EA1.3 (0,27 g), EA1.4 (0,12 g),
EA1.5 (33 mg), EA1.6 (90 mg), EA1.7 (0,26 g), EA1.8 (0,11 g) và EA1.9 (29 mg).
Các nhóm phân đoạn EA1.2, EA1.4 và EA1.5 được rửa bằng n-hexan cho
chất β-sitosterol (EA1.2, EA1.4 và EA1.5) (chất I) (khối lượng tương ứng là 10 mg,
0,11 g và 30 mg) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
4.6.2 Phần chiết EA2
Phần chiết điclometan EA2 (1,3 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên
silica gel (Merck, 63-200 µm), kích thước cột tách 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với
hệ dung môi gradient n-hexan-axeton tỉ lệ 6:1, 3:1, 2:1 và 1:1. Mẫu được đưa lên
cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel (Merck, 63-200 µm).
Các phân đoạn được tách thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn
có TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 9 nhóm
phân đoạn: EA2.1 (0,1 g), EA2.2 (0,18 g), EA2.3 (63 mg), EA2.4 (56 mg), EA 2.5
(60 mg), EA2.6 (54 mg), EA2.7 (0,11 g), EA2.8 (0,13 g) và EA2.9 (0,53 g).
Các nhóm phân đoạn EA2.1 và EA2.2 được rửa bằng n-hexan cho chất β-
sitosterol (EA2.1 và EA2.2) (chất I) (khối lượng 0,27g) dưới dạng các tinh thể hình
kim màu trắng.
4.6.3 Phần chiết EA3
Phần chiết etyl axetat EA3 (3,4 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel
(Merck cỡ hạt 63-200µm) (kích thước 3 cm i.d. 20 cm) được nhồi theo phương
pháp nhồi cột ướt. Mẫu được đưa lên cột sắc ký CC theo phương pháp tẩm mẫu trên
silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200µm). Cột sắc ký được rửa giải gradient bằng hệ 3
dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 và 10:19:1, thu được 10 phân đoạn
chính từ EA3.1 đến EA3.10 từ các phân đoạn phân tích (20 ml/phân đoạn) qua phân
46
tích TLC.
Nhóm phân đoạn EA3.3 được tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20, rửa
giải gradient bằng metanol. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả
thu được 3 nhóm phân đoạn từ EA3.3.1 đến EA3.3.5. Các nhóm phân đoạn
EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3 được rửa bằng điclometan, thu được metyl gallat
(EA3.3.1, EA3.3.2 và EA3.3.3) (chất II) (khối lượng tương ứng là 10 mg, 0,15 g và
0,13 g) dưới dạng các tinh thể hình kim màu trắng.
4.6.4 Phần chiết nƣớc (EA4)
Phần chiết nước EA4 được phân tách bằng cột Diaion HP-20 (Mitsubishi
Chemicals) (3 cm i.d. 20 cm), rửa giải bằng gradient H2O, MeOH-H2O 20%,
MeOH 40%, MeOH 60% và MeOH. Các phân đoạn được thu theo hệ dung môi rửa
giải cho 5 phân đoạn từ EA4.1 đến EA4.5. Các phân đoạn này được cất kiệt dung
môi dưới áp suất giảm.
Phân đoạn EA4.4 (60%MeOH-H2O) được chạy sắc ký cột Sephadex LH-20,
rửa giải bằng metanol. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu
được 3 nhóm phân đoạn từ EA4.4.1 đến EA4.4.3. Phân đoạn EA4.4.1 được phân
tách bằng CC (1 cm i.d. x 25 cm) trên silica gel (40-63µm), hệ dung môi gradient
CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1, 4:1 và 2:1. Kết quả thu được 4 nhóm phân đoạn chính được
ký hiệu từ EA4.4.1 đến EA4.4.1.4. Phân đoạn EA4.4.1.2 được rửa nhiều lần bằng
điclometan thu được chất eclalbasaponin I (EA4.4.1.2) (chất III) (khối lượng 10
mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Phân đoạn EA4.5 (MeOH) được chạy CC (1 cm i.d x 25 cm, silica gel (40-
63µm)), hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 9:1, 7:1, 4:1 và 2:1, thu được 7 nhóm phân
đoạn, được ký hiệu từ EA4.5.1 đến EA4.5.7. Nhóm phân đoạn EA4.5.6 được rửa
nhiều lần bằng điclometan, thu được chất EA4.5.6 (chất III) (khối lượng là 0,1
gam) dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt.
4.7. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EA
47
β-Sitosterol (I) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 141-142 oC.
Rf = 0,38 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1, v/v). Vệt chất
hiện màu hồng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
= 0,27 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-HCOOH
Metyl gallat (II) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 201-203 oC.
Rf
20:19:1, v/v/v), vệt chất hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%, hiện
1H-NMR (CD3OD): δ 3,83 (3H, s, 7-OCH3), 7,06 (2H, s, H-2, H-6). 13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 169,1 (s, C-7), 146,5 (s, C-4), 139,8 (s, C-3, C-
màu xanh thẫm với thuốc thử FeCl3 5%.
5) 121,5 (s, C-1), 110,1 (d, C-2, C-6), 52,3 (q, C-8).
Eclalbasaponin I (III)
Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,66 (TLC, silica gel, hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 2:1, v/v), vệt chất
hiện màu đen với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. ESI-MS: m/z 819,2 [M + Na]+ (C42H68O14Na). 1H-NMR (CD3OD): δ 0,80 (3H, s), 0,86 (3H, s), 0,89 (3H, s), 0,97 (3H, s),
0,98 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,38 (3H, s) (23-CH3, 24-CH3, 25-CH3, 26-CH3, 27-CH3,
29-CH3, 30-CH3), 3,0 (1H, dd, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz, H-3), 3,17-3,43 (8H, m, H-2,
H-3, H-4, H-5, H-2, H-3, H-4, H-5), 3,68 (2H, dd, J = 12,0 Hz, 5,5 Hz, H-6,
H-6), 3,83 (1H, t, J = 12,0 Hz, H-6), 3,84 (1H, t, J = 12,0 Hz, H-6), 4,34 (1H, d, J
= 7,5 Hz, H-1), 4,9 (1H, tín hiệu bị che khuất, H-16), 5,33 (1H, t, J = 3,0 Hz, H-
13C-NMR/DEPT (CD3OD): δ 16,1 (q, C-25), 17,0 (q, C-24), 17,8 (q, C-26),
12), 5,36 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1).
19,3 (t, C-6), 24,5 (t, C-11), 25,1 (q, C-30), 27,1 (t, C-2), 27,3 (q, C-27), 28,6 (q, C-
23), 31,3 (s, C-20), 31,6 (t, C-22), 33,3 (q, C-29), 34,2 (t, C-7), 36,3 (t, C-21), 36,4
(t, C-15), 37,9 (s, C-10), 39,9 (s, C-8), 40,2 (t, C-1), 40,9 (s, C-4), 42,2 (d, C-18),
42,7 (s, C-14), 47,8 (t, C-19), 48,2 (d, C-9), 50,1 (s, C-17), 57,2 (d, C-5), 62,5 (t, C-
48
6), 62,8 (t, C-6), 71,2 (d, C-4), 71,7 (d, C-4), 74,0 (d, C-16), 74,9 (d, C-2), 75,7
(d, C-2), 77,7 (d, C-5), 78,2 (d, C-5), 78,3 (d, C-3), 78,7 (d, C-3), 90,9 (d, C-3),
95,8 (d, C-1), 106,7 (d, C-1), 123,7 (d, C-12), 144,6 (s, C-13), 177,3 (s, C-28).
4.8. Phân tách sắc ký các phần chiết từ nguyên liệu phân trên mặt đất
4.8.1 Phần chiết điclometan (EP2)
Phần chiết điclometan (EP2) (4,9 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC)
trên silica gel (Merck, 63-200 µm), kích thước cột tách 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải
với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton tỉ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1. Mẫu được
đưa lên cột sắc ký theo phương pháp tẩm trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Các
phân đoạn phân tách được thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn có
TLC giống nhau được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 12 nhóm
phân đoạn từ EP2.1 đến EP2.12.
Nhóm phân đoạn EP2.2 ( 0,45 g) được rửa nhiều lần bằng silica gel thu được
β-sitosterol (EP2.2) (0,39 g) tinh thể hình kim màu trắng.
Các nhóm phân đoạn EP2.11-EP2.12 (0,5 g) được phân tách bằng cột chiết
pha rắn RP-18 với MeOH, thu được eclalbasaponin II (EP2.11 và EP2.12) (chất
IV) (40 mg) dưới dạng các tinh thể màu trắng.
4.8.2 Phần chiết etyl axetat (EP3)
Phần chiết etyl axetat (EP3) (4,9 g) được phân tách bằng sắc kí cột (CC) trên
silica gel (Merck, 63-200 µm), kích thước cột tách 3 cm i.d. 30 cm, rửa giải với
hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic 20:19:1 và 10:20:1. Mẫu được đưa lên
cột sắc ký theo phương pháp tẩm trên silica gel (Merck, 63-200 µm). Các phân đoạn
được tách thu theo 20 ml, phân tích bằng TLC, các phân đoạn có TLC giống nhau
được gộp lại, cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 10 nhóm phân đoạn từ EP3.1
đến EP3.10.
Các nhóm phân đoạn EP3.7-EP3.9 (0,96 g) được gộp lại và tinh chế bằng
sắc ký cột Sephadex LH-20, rửa giải với metanol. Các phân đoạn chứa chất thu
được rửa bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 1:1 cho chất eclalbasaponin II
49
(EP3.7.2) (chất IV) (0,5 g) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Phân đoạn EP3.10 được rửa bằng metanol cho hesperidin (EP3.10) (chất VI)
(28 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
4.8.3 Phần chiết nƣớc (EP4)
Phần chiết nước EP4 được hòa tan trong metanol rồi đưa lên phân tách bằng
cột Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals) (3 cm i.d. 20 cm). Rửa giải bằng H2O,
MeOH-H2O 20%, 40% và 60% và MeOH. Các phân đoạn được thu theo hệ dung
môi rửa giải cho 4 phân đoạn từ EP4.1 đến EP4.4. Các phân đoạn này được cất loại
dung môi dưới áp suất giảm.
Phân đoạn EP4.2 (40% MeOH-H2O) được phân tách cột CC (1 cm i.d. 25
cm) trên silica gel (Merck, 40-63 µm), hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH 15:1,
9:1, 6:1 và 3:1, thu được 5 nhóm phân đoạn chính EP4.2.1 đến EP4.2.5 từ các phân
đoạn phân tách (20 ml/phân đoạn) qua phân tích TLC. Nhóm phân đoạn EP4.2.4
(1,87 g) được phân tách sắc ký cột trên silica gel (Merck, 40-63 µm) với hệ dung
môi CH2Cl2-MeOH-H2O 8:2:0,2 và 7:3:0,5 cho norwedelolacton (EP4.2.4) (10 mg)
(chất V) dưới dạng bột vô định hình màu vàng.
Phân đoạn EP4.3 (60% MeOH-H2O) được phân tách CC (1 cm i.d. 25 cm)
trên silica gel (Merck, 40-63µm)), hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH 15:1, 9:1,
6:1 và 3:1, thu được 5 nhóm phân đoạn EP4.3.1 đến EP4.3.5 từ các phân đoạn phân
tách (20 ml/phân đoạn). Nhóm phân đoạn EP4.3.4 (0,4 g) được rửa nhiều lần với
MeOH cho hesperidin (EP4.3.4) (26 mg) (chất VI) dưới dạng bột vô định hình màu
trắng.
4.9. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ EP
β-Sitosterol (I) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 141-142 oC.
Rf = 0,38 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1 (v/v). Vệt chất
hiện màu hồng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
Eclalbasaponin II (IV)
50
Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,65 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH
85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
1H-NMR (CD3OD): δ 0,80 (3H, s, 26-CH3), 0,87 (3H, s, 24-CH3), 0,90 (3H,
ESI-MS: m/z 635,3 ([M + H]+) (C36H59O9), 657,0 ([M + Na]+) (C36H58O9Na).
s, 25-CH3), 0,98 (3H, s, 29-CH3), 0,99 (3H, s, 30-CH3), 1,08 (3H, s, 24-CH3), 1,39
(3H, s, 27-CH3), 3,03 (1H, d, J = 14,5 Hz, 4,0 Hz, H-3), 3,19-3,38 (4H, H-2, H-3,
H-4, H-5), 3,68 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 5,0Hz, H-6a), 3,86 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 2,0
Hz, H-6b), 4,34 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 4,56 (1H, s br, H-16), 5,32 (1H, t, J = 3,5
13C-NMR (CD3OD): δ 16,1 (q, C-25), 17,0 (q, C-24), 17,8 (q, C-26), 19,3 (t,
Hz, H-12).
C-6), 24,5 (t, C-11), 24,9 (q, C-30), 27,1 (t, C-2), 27,3 (q, C-27), 28,6 (q, C-23),
31,4 (s, C-20), 32,6 (t, C-22), 33,4 (q, C-29), 34,3 (t, C-7), 36,3 (t, C-15), 36,6 (t, C-
21), 37,9 (s, C-10), 39,9 (t, C-1), 40,2 (s, C-4), 40,7 (s, C-8), 42,1 (d, C-18), 42,7 (s,
C-14), 47,7 (t, C-19), 48,2 (d, C-9), 49,8 (s, C-17), 57,2 (d, C-5), 62,9 (t, C-6), 71,7
(d, C-4), 75,3 (d, C-16), 75,7 (d, C-2), 77,7 (d, C-5), 78,3 (d, C-3), 90,8 (d, C-3),
106,7 (d, C-1), 123,5 (d, C-12), 145,1 (s, C-13), 181,5 (s, C-28).
Norwedelolactone (V)
Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,21 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH
1H-NMR (CD3OD): δ 6,88 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,97 (1H, d, J = 2,0 Hz,
85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
13C-NMR (CD3OD): δ 99,6 (d, C-10), 100,9 (s, C-6a), 101,8 (d, C-7), 104,6
H-4), 7,18 (1H, s, H-10), 7,36 (1H, s, H-7).
(s, C-11b), 105,2 (d, C-2), 106,1 (d, C-4), 115,6 (s, C-6b), 145,5 (s, C-8), 147,0 (s,
C-10a), 151,4 (s, C-9), 155,8 (s, C-11a), 155,9 (s, C-4a), 156,9 (s, C-3), 160,6 (s, C-
1), 160,7 (s, C-6).
Hesperidin (VI)
51
Bột vô định hình màu trắng.
Rf = 0,33 (TLC, silica gel Merck, hệ dung môi EtOAc-H2O-HCOOH
1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,09 (3H, d, J = 6,0 Hz, 6-CH3), 2,78 (1H, dd, J =
85:15:10, v/v/v), vệt chất hiện màu đen với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
17,0 Hz, 3,0 Hz, H-3a), 3,12-3,83 (11H, m, H-3b, H-2, H-3, H-4, H-5, 2H-6,
H-2, H-3, H-4, H-5), 3,78 (3H, s, 4-OCH3), 4,53 (1H, s, H-1), 4,97 (1H, d,
J = 7,5 Hz, H-1), 5,50 (1H, d, J = 12,0 Hz, 3,0 Hz, H-2), 6,13 (1H, d, J = 2,0 Hz,
13C-NMR (DMSO-d6) (2S): δ 17,8 (q, C-6), 42,1 (t, C-3), 55,8 (q, 4-
H-6), 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,90-6,96 (3H, m, H-2, H-5, H-6).
OCH3), 66,1 (t, C-6), 68,3 (d, C-5), 70,3 (d, C-2), 70,7 (d, C-3), 70,8 (d, C-4),
72,1 (d, C-4), 75,6 (d, C-3), 76,3 (d, C-5), 78,4 (d, C-2), 95,6 (d, C-8), 96,5 (d,
C-6), 99,6 (d, C-1), 100,6 (d, C-1), 103,4 (d, C-10), 112,2 (d, C-5), 114,2 (d, C-
2), 117,9 (d, C-6), 131,0 (s, C-1), 146,5 (s, C-3), 148,0 (s, C-4), 162,6 (s, C-9),
13C-NMR (DMSO-d6) (2R): δ 17,8 (q, C-6), 42,1 (t, C-3), 55,8 (q, 4-
163,1 (s, C-5), 165,2 (s, C-7), 196,9 (s, C-4).
OCH3), 66,07 (t, C-6), 68,3 (d, C-5), 69,7 (d, C-2), 70,7 (d, C-3), 73,0 (d, C-
4), 72,1 (d, C-4), 75,6 (d, C-3), 76,3 (d, C-5), 78,38 (d, C-2), 95,6 (d, C-8),
96,5 (d, C-6), 99,5 (d, C-1), 100,6 (d, C-1), 103,4 (d, C-10), 112,1 (d, C-5),
114,1 (d, C-2), 117,8 (d, C-6), 130,96 (s, C-1), 146,48 (C-3), 147,98 (s, C-4),
52
162,5 (s, C-9), 163,0 (s, C-5), 165,1 (s, C-7), 196,9 (s, C-4).
KẾT LUẬN
Luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu thành phần cây Cỏ mực (Eclipta prostrata
L., Asteraceae)” thực hiện các nhiệm vụ nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc
các hợp chất từ cây Cỏ mực. Luận văn đã đạt được các kết quả nghiên cứu sau :
1. Đã xây dựng được qui trình chiết và phân tách để điều chế được các
phần chiết n-hexan, điclometan, etyl axetat và phần chiết nước chứa các hợp chất
phân cực từ phần trên mặt đất cây Cỏ mực.
2. Đã phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết n-hexan,
điclometan và etyl axetat để xác định điều kiện sắc ký định tính và xác định các hệ
dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký gradient các phần chiết này.
3. Bằng các phương pháp sắc ký cột gradient đã phân lập được 4 hợp
chất β-sitosterol, metyl gallat, eclalbasaponin II và hesperidin từ các phần chiết n-
hexan, điclometan và etyl axetat và 3 chất eclalbasaponin I, norwedelolacton và
hesperidin từ phần chiết nước.
4. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập đã được xác định bằng cách
kết hợp các phương pháp phổ hiện đại: ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
5. Nghiên cứu của Luận văn đã dẫn đến các phát hiện lý thú. β-Sitosterol
đã được xác định là thành phần chính trong các phần chiết n-hexan và điclometan.
Các saponin tritecpenoit eclalbasaponin I và II cùng với chất coumarin
norwedelolacton và flavanon rutinozit hesperidin có chủ yếu trong các phần chiết
phân cực (etyl axetat và nước). Eclalbasaponin I và eclalbasaponin II là các hoạt
chất saponin tecpenoit quan trọng của cây Cỏ mực ; chúng đã lần đầu tiên được tìm
thấy trong cây Cỏ mực trồng ở miền Bắc Việt Nam. Metyl gallat và hesperidin đã
được phân lập lần đầu tiên từ cây Eclipta prostrata L.. Sự xuất hiện đồng thời của
hỗn hợp epimeric 2R và 2S (hesperidin) của chất 3,5,7-trihydroxy-4-
53
metoxyflavanon 7-O-rutinozit đã được phát hiện và nghiên cứu đã chứng tỏ là có thể xác định nhanh hỗn hợp này bằng phổ 13C-NMR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Thành phố Hồ
Chí Minh.
2. Trần Vũ Thiên, Phùng Văn Trung, Nguyễn Ngọc Hạnh (2009) “Phân lập
echino cystic axit và eclabasapnin II từ cây Cỏ mực Eclipta prostrata. Họ
cúc (Asteraceae)”, Tạp chí Khoa học, 11, 278-283.
Tiếng Anh
3. Abdel-Kader M. S., Bahler B. D., Malone S., Werkhoven M. C. M., Troon
F., David, Wisse J. H., Bursuker I., Neddermann K., Mamber S. W.,
Kington D. G. I. (1998), “DNA-damaging steroidal alkaloids from
Eclipta alba from the Suriname rainforest”, J. Nat. Prod., 61, 1202-1208.
4. Govindachari T. R., Premila M. S. (1985), “The benzofuran norwedelic acid
from Wedelia calendulaceae”, Phytochemistry, 24, 3068-3069.
5. Krishnaswamy N. R., Seehadri T. R., Sharma B. R. (1966), “The structure of
a new polythienyl from Eclipta alba”, Tetrahedron Letters, 35, 4227-
4230.
6. Lee M. K., Ha N. R., Yang H., Sung S. H., Kim G. H., Kim Y. C. (2008),
“Antiproliferative activity of triterpenoids from Eclipta prostrata on
hepatic stellate cells”, Phytomedicine, 15, 775-780.
7. Lee M. K., Ha N. R., Yang H., Sung S. H., Kim Y. C. (2009), “Stimulatory
constituent of Eclipta prostrata on mouse osteoblast differentiation”,
Phytother. Res., 23, 129-131.
8. Li C. C., Xie Z. X., Zhang Y. D., Chen J. H., Yang Z. (2003), “Total
synthesis of wedelolactone”, J. Org. Chem., 68, 8500-8504.
9. Maltese F., Erkelans C., Vander Kooy F., Choi Y. H., Verpoorte R. (2009),
“Identification of natural epimeric flavanone glycosides by NMR
54
spectroscopy”, Food Chemistry, 116, 575-579.
10. Michels M. G., Bertolini L. C. T., Esteves A. F., Moreira P., S. Franca C.
(2010), “Anticoccidial effects of coumestans from Eclipta alba for
sustainable control of Eimeria tenella parasitosis in poultry production”,
Veterinary Parasitology, 1873-2550.
11. Sing P., Sharma A. K., Joshi K. C., Bohlmann F. (1985), “A futher
dithienylacetylene from Eclipta erecta”, Phytochemistry, 24, 615-616.
12. Sing P., Bhargava S. (1992), “A dithienylacetylene ester from Eclipta
erecta”, Phytochemistry, 31, 2883-2884.
13. Tewtrakul S., Subhadhirasakul S., Cheenpracha S., Karalai C. (2007), “HIV-
1 protease and HIV-1 integrase inhibitory substances from Eclipta
prostrata”, Phytother. Res., 21, 1092-1095.
14. Tewtrakul S., Subhadhirasakul S., Tansakul P., Cheenpracha S., Karalai C.
(2011), “Antiinflammatory constituents from Eclipta prostrata using
RAW264.7 macrophage cells”, Phytother. Res.,25, 1313-1316.
15. Yahara S., Ding N., Nohara T. (1994), “Oleanane glycosides from Eclipta
alba”, Chem. Pharm. Bull., 42, 1336-1338.
16. Yahara S., Ding N., Nohara T., Masuda K., Ageta H. (1997), “Taraxastane
55
glycosides from Eclipta alba”, Phytochemistry, 44, 131-135.
PHẦN PHỤ LỤC
56
57
Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của Metyl gallat (II)
58
Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR và DEPT của Metyl gallat (II)
59
Phụ lục 3: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin I (III)
60
Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin I (III)
61
Phụ lục 5: Phổ 1C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin I (III)
62
Phụ lục 6: Phổ ESI-MS của Eclalbasaponin II (IV)
63
Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR của Eclalbasaponin II (IV)
64
Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR và DEPT của Eclalbasaponin II (IV)
65
Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR của Norwedelolacton (V)
66
Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR và DEPT của Norwedelolacton (V)
67
Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của Hesperidin (VI)
68
Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR và DEPT của Hesperidin (VI)
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
