Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập đoạn gen CYP79D1 liên quan đến sự tổng hợp Hydrogen cyanide của cây sắn (Manihot esculenta)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ THÙY

PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CYP79D1 LIÊN QUAN ĐẾN

SỰ TỔNG HỢP HYDROGEN CYANIDE CỦA CÂY SẮN (MANIHOT ESCULENTA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ THÙY

PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CYP79D1 LIÊN QUAN ĐẾN

SỰ TỔNG HỢP HYDROGEN CYANIDE CỦA CÂY SẮN (MANIHOT ESCULENTA)

Ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Phú Hiệp

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu

của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Hoàng Phú Hiệp. Các số liệu, kết

quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán bộ hướng

dẫn cùng nhóm nghiên cứu.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu trong

luận văn này.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Phú Hiệp đã tận

tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo để em có thể hoàn thành luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại &

Giáo dục Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã

tận tình giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn.

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sự động viên và giúp đỡ của gia đình và bạn bè trong

suốt thời gian học tập và thực hiện đề luận văn.

Trong quá trình nghiên cứu, do thời gian và khả năng có hạn, luận văn còn nhiều

hạn chế. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn.

Thái Nguyên, tháng 09 năm 2018

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thùy

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii

MỤC LỤC .......................................................................................................... iii

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v

DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Cây sắn (Manihot esculenta Crantz)............................................................. 3

1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây sắn ........................................... 3

1.1.2. Đặc điểm cây sắn ....................................................................................... 4

1.1.3. Hướng sử dụng sản phẩm từ sắn ............................................................... 6

1.1.4. Tình hình sản xuất - tiêu thụ sắn tại Việt Nam .......................................... 8

1.2. Độc tố trong sắn .......................................................................................... 11

1.3. Họ gen CYP79 và tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2 ...... 14

1.3.1. Đặc điểm họ gen CYP79 ......................................................................... 14

1.3.2. Tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2 ................................ 16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 18

2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 18

2.1.1. Vật liệu thực vật....................................................................................... 18

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18

2.2. Thiết bị và hóa chất .................................................................................... 18

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19

iii

2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ..................................................... 19

2.3.2. Phương pháp tạo cDNA ........................................................................... 20

2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ..................................................... 20

2.3.4. Phương pháp PCR ................................................................................... 20

2.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm PCR ....................................................... 22

2.3.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR .................................................... 22

2.3.7. Phương pháp đọc trình tự ........................................................................ 23

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 24

3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1 ............. 24

3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1 ............................... 25

3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh

Vĩnh Phú và KM94 ............................................................................................ 26

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 31

1. Kết luận .......................................................................................................... 32

2. Đề nghị ........................................................................................................... 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

STT

VIẾT TẮT

VIẾT ĐẦY ĐỦ

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

cDNA

CYP

Cytochrome P450

Complementary deoxyribonucleotide acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

HCN

Hydro cyanua

IAA

β - Indole acetic acid

IAOx

Indole - 3 - acetaldoxime

DNA Deoxyribonucleotide acid

ppm

Parts per million

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleotide acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tinh bột sắn ............... 7

Bảng 1.2. Sản lượng sắn theo vùng của Việt Nam giai đoạn 2000-2015 ........... 9

Bảng 1.3. Nồng độ cyanide trong sản phẩm thức ăn từ sắn ............................. 12

Bảng 1.4. Họ gen CYP79 ở thực vật ................................................................ 14

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR ............................................................... 21

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ....................................................... 22

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Phân bố và sản lượng sắn ở các nước trên thế giới (2013) ................. 4

Hình 1.2. Sản lượng sắn cả nước giai đoạn 1995-2016....................................... 8

Hình 1.3. Quá trình chuyển hóa HCN từ lá sắn xuống củ ................................. 15

Hình 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số ........................................................ 24

Hình 3.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số ................. 24

Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số ...................................................................... 25

Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1

Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa về trình tự đoạn gen CYP79D1 ....................... 27

Hình 3.6. Vị trí phân bố của một số gen CYP trên hệ gen sắn ............................ 31

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Nhóm chất cyanide gồm rất nhiều hợp chất với cấu tạo hóa học phức tạp.

Những chất này có trong hơn 2.650 loài thực vật khác nhau thuộc khoảng 550

chi và hơn 130 họ, bao gồm dương xỉ, thực vật hạt kín, cây hạt trần [20]. Nhiều

cây ăn được chứa cyanogenic glycosides với nồng độ khác nhau, sự khác biệt

chủ yếu do yếu tố di truyền, môi trường, vị trí, mùa và loại đất [6].

Ở Việt Nam, cây sắn đóng góp phần không nhỏ trong công cuộc xóa đói

giảm nghèo cho nông dân các vùng thiểu số, vùng sâu vùng xa. Sản phẩm từ sắn

được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất: chế biến bột ngọt, bánh kẹo, mì ăn

liền, bao bì, phụ gia, màng phủ thực phẩm hay thành phần của ethanol.

Cyanide có mặt trong sắn ở hai dạng cyanogenic glycoside: linamarin và

lotaustralin. Trong đó, linamarin chiếm hơn 80% và có mặt trong tất cả các bộ

phận của cây sắn, đặc biệt là rễ và lá. HCN tạo ra và tích tụ nhiều ở vỏ, đầu và

phần lõi ruột của sắn [24]. Căn cứ vào hàm lượng HCN (hydro cyanua) trong

sắn, người ta chia các giống sắn thành 2 nhóm: nhóm sắn ngọt và nhóm sắn đắng.

Trong quá trình chế biến sắn, nếu không loại được HCN thì chất này có thể gây

ngộ độc cho người và động vật. Khả năng chống chịu hàm lượng HCN của động

vật phụ thuộc vào giống, độ tuổi [7]. Để làm giảm hàm lượng HCN trong sản

phẩm sắn thường phải thông qua các phương pháp như làm khô; ủ chua để lên

men, ngâm nước củ, thân và lá non.

Độc tố trong sắn được phát hiện lần đầu vào năm 1885 bởi Peckolt, có tên

gọi là manihotoxin. Quá trình sinh tổng hợp độc tố ở sắn có sự tham gia của

enzyme hydrolytic, enzyme này phân giải các dạng cyanogenic glycoside thành

dạng cyanide tự do [8]. Như vậy, hàm lượng độc tố trong sắn có thể được giảm

bằng cách sử dụng các kĩ thuật knock-out gen hoặc RNAi tác động vào chu trình

chuyển hóa đó.

Nhằm mục đích nghiên cứu vật liệu cơ sở cho việc ứng dụng kĩ thuật trên

trên đối tượng cây sắn, chúng tôi tiến hành đề tài: Phân lập đoạn gen CYP79D1

liên quan đến sự tổng hợp Hydrogen cyanide của cây sắn (Manihot

esculenta).

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập đoạn gen mã hóa cytochrome P450 của cây sắn.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA từ lá cây sắn.

- Nhân bản đoạn gen CYP79D1 bằng kỹ thuật PCR.

- Xác định trình tự đoạn gen CYP79D1.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây sắn

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae,

còn có tên gọi khác là cây khoai mì, củ mì. Cây sắn có nguồn gốc từ vùng nhiệt

đới của châu Mỹ La tinh và được trồng cách đây khoảng 5000 năm. Nơi xuất

hiện cây sắn đầu tiên được giả thiết tại vùng đông bắc Brasil. Ngoài ra, nhiều

bằng chứng chứng minh cây sắn có nguồn gốc tại Mexico, Trung Mỹ và ven biển

phía Bắc của Nam Mỹ. Tại những di tích khảo cổ, củ sắn được tìm thấy có niên

đại 2.700 năm trước Công nguyên (Venezuela,); niên đại khoảng 2.000 năm

trước công nguyên (ở vùng ven biển Peru). Những lò nướng bánh sắn ở phía bắc

Colombia niên đại khoảng 1200 năm trước công nguyên, những hạt tinh bột sắn

ở trong phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico có tuổi khoảng 900 năm đến

200 năm trước công nguyên.

Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, sau đó, được

trồng ở Trung Quốc, Myanmar và các nước châu Á khác ở cuối thế kỷ XVIII -

đầu thế kỷ XIX.

Cây sắn vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ XVIII và được trồng trên khắp

lãnh thổ do khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng, tập trung

nhiều ở các vùng sinh thái nông nghiệp như Đồng bằng sông Hồng, Trung du và

miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Trung du, Đông

Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long [25].

Ngày nay, cây sắn được trồng từ 30˚B - 30˚N, ở 89 nước nhiệt đới thuộc

châu Mỹ (14%), châu Phi (60%) và châu Á - Thái Bình Dương (20%), trên những

vùng đất nghèo dinh dưỡng với kĩ thuật canh tác truyền thống để làm lượng thực

- thực phẩm, thức ăn gia súc. Sự phân bố vùng trồng sắn trên thế giới được thể

hiện ở hình 1.1.

Hình 1.1. Phân bố và sản lượng sắn ở các nước trên thế giới (2013) [2]

Từ năm 1961 đến nay, diện tích trồng sắn trên thế giới có xu hướng gia

tăng. Cây sắn đang được nhanh chóng chuyển đổi thành cây công nghiệp triển

vọng, làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến tinh bột, cây nhiên

liệu sinh học…

1.1.2. Đặc điểm cây sắn

Đặc điểm hình thái là một trong những chỉ tiêu đánh giá và phân loại giống.

Đặc điểm này do yếu tố di truyền của giống sắn quyết định. Lá sắn là lá đơn mọc

xen kẽ trên thân. Phiến lá xẻ thùy, có 5 - 7 thùy, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới

xanh nhạt có gân nổi rõ, cuống lá dài, có giống dài tới 30 - 40 cm, màu sắc cuống

thay đổi: xanh, vàng, đỏ, thể hiện đặc trưng riêng của giống [3].

Chùm hoa có cuống dài, thường mọc ở phía ngọn thân, số lượng hoa cái ít

hơn hoa đực và thường nở trước hoa đực nên cây thường thụ phấn chéo nhờ gió

và côn trùng. Quả sắn thuộc loại quả nang tự khai, màu nâu nhạt đến đỏ tía, hình

lục giác, chia thành ba ngăn, mỗi ngăn có một hạt. Hạt sắn hình trứng, có vân

hoặc những vết nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt [5].

Sắn thường có một thân đơn, mọc thẳng, thuộc loại thân gỗ cao trung bình

từ 2 - 3 m, đường kính thân trung bình 2 - 6 cm, giữa thân có lõi trắng và xốp.

Chiều cao cây của các giống sắn chịu ảnh hưởng bởi đặc điểm di truyền và điều

kiện ngoại cảnh. Mỗi giai đoạn sinh trưởng khác nhau chiều cao cây khác nhau

và chiều cao tăng dần theo thời gian sinh trưởng. Tốc độ gia tăng kích thước thân

ở mỗi giai đoạn sinh trưởng khác nhau không giống nhau. Tốc độ tăng trưởng

chiều cao cây tăng lên từ giai đoạn 40 - 140 ngày sau trồng và tăng mạnh nhất

vào giai đoạn 80 - 120 ngày sau trồng. Sau đó tốc độ này giảm dần và đạt tối đa

vào thời kỳ thu hoạch. Những giống sắn có chiều cao trung bình khoảng 200 -

250 cm. Giống sắn có chiều cao cây cao dễ bị đổ ngã, khó thu hoạch. Giống sắn

có chiều cao cây quá thấp ảnh hưởng tới năng suất của giống cũng như đến nguồn

cây giống cho vụ sau. Sự phân cành và chiều cao phân cành được đánh giá là yếu

tố quan trọng trong chọn tạo giống sắn. Sự phân cành ảnh hưởng tới bộ tán lá,

giống phân cành càng thấp thì độ rộng tán lá thường lớn, chiếm diện tích không

gian lớn, điều này ảnh hưởng tới việc quang hợp của cây, từ đó hạn chế việc tăng

mật độ trồng trên một đơn vị diện tích. Do cây sắn sử dụng hom để trồng, sau

khi thu hoạch thân cây được thu lại làm giống cho vụ sau, nếu chiều cao phân

cành thấp làm phần thân thu được ít, gây hạn chế nguồn giống. Màu sắc thân tùy

thuộc vào giống và từng giai đoạn phát triển của cây. Thân non có màu xanh

hoặc màu đỏ tía. Thân già màu sắc thay đổi thành màu vàng, vàng tro, xám, trắng

bạc hay xám lục. Thân có nhiều mắt sắp xếp xen kẽ nhau theo vị trí của lá, khúc

khuỷu, xù xì [5].

Rễ con là rễ ở mô phân sinh, mọc dài theo hướng ngang sau đó phát triển

theo hướng xuyên xuống sâu. Rễ cái đối với cây mọc từ hạt mọc theo hướng

thẳng đứng và từ rễ cái mọc ra nhiều rễ con. Rễ con chủ yếu làm nhiệm vụ hút

nước và dinh dưỡng để nuôi cây, khi gặp điều kiện không thuận lợi sẽ mọc đâm

sâu để hút nước và dinh dưỡng. Rễ mọc từ mắt và mô sẹo của hom, phình to ra,

tập trung được nhiều dinh dưỡng và tích lũy bột thành củ. Khi gặp điều kiện

thuận lợi tượng tầng sẽ phát triển mạnh tạo thành củ.

Củ thường phát triển theo hướng nằm ngang hoặc xiên, xuyên sâu vào đất.

Củ sắn hai đầu nhọn, chiều dài từ 25 - 200 cm, trung bình khoảng 40 - 50 cm.

Đường kính củ thay đổi trung bình từ 5 - 7 cm. Kích thước cũng như trọng lượng

củ thay đổi theo giống, điều kiện canh tác và độ màu mỡ của đất [5].

1.1.3. Hướng sử dụng sản phẩm từ sắn

Củ sắn tươi có tỉ lệ chất khô 30-40%, tinh bột 16-32%, chất protein, béo,

xơ trong 100g tương ứng là 0,8-2,5g; 0,2-0,3g; 1,1-1,7g; 0,6-0,9g; giàu vitamin

C, canxi, vitamin B và các khoáng chất, nghèo chất béo và nghèo đạm. Khoáng

chất và vitamin trong 100g củ sắn là 18,8-22,5mg Ca; 22,5-25,4mg P; 0,02mg B1;

0.02mg B2; 0,05mg PP. Trong củ sắn, hàm lượng các amino acid không được cân

đối, thừa arginin nhưng lại thiếu amino acid chứa lưu huỳnh. Thành phần dinh

dưỡng khác nhau tuỳ giống, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng.

Lá sắn có hàm lượng đạm khá cao, nhiều chất bột, chất khoáng và vitamin.

Lá sắn trong nguyên liệu khô 100% chứa đựng 24,2% đường và tinh bột, 24%

protein, 6% chất béo, 11% xơ, 6,7% chất khoáng, xanhthophylles 350ppm. Chất

đạm của lá sắn có khá đầy đủ các amino acid cần thiết, giàu lysin nhưng thiếu

methionin [1].

Sắn lát khô thường có hai loại: sắn lát khô có vỏ và sắn lát khô không vỏ.

Sắn lát khô có vỏ bao gồm: vỏ thịt, thịt sắn, lõi sắn và có thể là một phần vỏ gỗ.

Sắn lát khô không vỏ chỉ bao gồm thịt sắn và lõi sắn. Số liệu hàm lượng các chất

trong sắn lát khô không vỏ của Việt Nam bình quân đạt: 90,01% khối lượng khô,

2,48% đạm thô, 1,40% béo thô, 3,72% xơ thô, 2,04% khoáng tổng số, 78,59%

dẫn xuất không đạm, 0,15% Ca, 0,25% P. Sắn lát khô có vỏ có 90,57% khối

lượng khô, 4,56% đạm thô, 1,43% béo thô, 3,52% xơ thô, 2,22% khoáng tổng

số, 78,66% dẫn xuất không đạm, 0,27% Ca, 0,50% P [24].

Bột sắn nghiền thủ công có khoảng 87,56% vật chất khô, 3,52% đạm thô,

1,03% béo thô, 1,37% xơ thô, 1,38% khoáng tổng số, 83,89% dẫn xuất không

đạm, 0,11% Ca, 0,11% P. Tinh bột sắn có màu rất trắng. Hạt tinh bột sắn quan sát

trên kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope) có kích thước

5 - 40 nm, nhiều hình dạng, chủ yếu là hình tròn, bề mặt nhẵn, một bên mặt có chỗ

lõm hình nón và một núm nhỏ ở giữa. Tinh bột sắn có hàm lượng amylopectin và

phân tử lượng trung bình cao hơn amylose của tinh bột bắp, lúa mì, khoai tây. Gel

tinh bột có độ nhớt, độ kết dính cao và khả năng gel bị thoái hóa thấp. Thành

phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tinh bột sắn thể hiện ở bảng 1.1 [24].

Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tinh bột sắn

Giá trị dinh dưỡng Thành phần

Tỷ lệ chất khô (%) 30-40

Hàm lượng tinh bột (%) 27-36

Đường tổng số (% FW) 0,5-2,5

Đạm tổng số (%FW) 0,5-2,0

Chất xơ (%FW) 1,0

Chất béo (%FW) 0,5

Chất khoáng (%FW) 0,5-1,5

Vitamin A (mg/100gFW) 17

Vitamin C (mg/100gFW) 50

Năng lượng (KJ/100g) 607

Yếu tố hạn chế dinh dưỡng Cyanogenes

Amylose (%) 15-29

700-1100

Độ dính tối đa (BU) Nhiệt độ hồ hóa (OC) 49-73

Sắn là cây trồng có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn

gia súc và lương thực thực phẩm. Mỗi bộ phận của cây đều đem lại những giá trị

sử dụng nhất định. Từ việc đóng vai trò làm cây lương thực, sắn đang được mở

rộng sang các hướng cây nhiên liệu sinh học (sản xuất cồn sinh học, màng phủ

sinh học), tinh bột biến tính. Củ sắn được dùng để chế biến tinh bột, sắn lát khô,

các sản phẩm công nghiệp như bột ngọt, mì ăn liền, glucose, siro, bánh kẹo, mạch

nha, kỹ nghệ chất dính (hồ vải, dán gỗ), bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai,

bánh tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm hoặc

dùng để ăn tươi. Củ sắn cũng là nguồn nguyên liệu chính để làm thức ăn gia súc.

Thân sắn dùng để làm giống, nguyên liệu cho công nghiệp cellulose, làm nấm,

làm củi đun. Lá sắn non làm rau xanh giàu đạm, dùng trực tiếp để nuôi tằm, nuôi

cá. Bột lá sắn hoặc lá sắn ủ chua dùng để nuôi lợn, gà, trâu bò, dê… Hiện tại, sản

phẩm sắn ngày càng thông dụng trong buôn bán, trao đổi thương mại quốc tế [4].

1.1.4. Tình hình sản xuất - tiêu thụ sắn tại Việt Nam

Hiện nay, sắn được trồng tại trên dưới 100 quốc gia trên toàn thế giới với

các quy mô canh tác rất khác nhau. Sắn là cây trồng tiềm năng, được coi là cây

lương thực quan trọng với diện tích trồng ngày càng mở rộng nhanh chóng. Tổng

diện tích sắn toàn thế giới năm 2014 là 24,15 triệu ha, năng suất bình quân 11,30

tấn/ha, sản lượng 272,94 triệu tấn, đứng hàng thứ năm về sản lượng các cây

lương thực chính, xếp sau ngô (1.037,79 triệu tấn); lúa nước (741,48 triệu tấn);

lúa mì (729,01 triệu tấn) và khoai tây (381,68 triệu tấn).

Là cây công nghiệp xuất khẩu triển vọng, Việt Nam hiện mỗi năm thu

hoạch trên 0,5 triệu ha sắn, sản lượng khoảng 10 triệu tấn. Sắn được Bộ Công

thương đưa vào nhóm 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam

những năm gần đây, giá trị xuất khẩu sắn mỗi năm đạt từ 1,0 tỷ đến 1,5 tỷ USD.

Năng suất sắn năm 2015 đã tăng lên gấp đôi và sản lượng sắn tăng lên gấp 5 lần

so với năng suất và sản lượng sắn năm 2000 (hình 1.2) [26].

Hình 1.2. Sản lượng sắn cả nước giai đoạn 1995-2016 (Đơn vị: nghìn tấn)

Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến, tập trung nhiều tại các vùng

sinh thái nông nghiệp. Đây là một trong số những nguồn thu nhập quan trọng của

nông dân do dễ trồng, vốn đầu tư ít, khả năng thích nghi với sinh thái cao và phù

hợp với kinh tế nông hộ.

Vùng Bắc Trung bộ và Duyên hải miền Trung có sản lượng năm 2015 là

3.144.200 tấn sắn củ tươi chiếm 29,46% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh

trồng nhiều sắn của vùng này là Bình Thuận, Phú Yên, Quảng Ngãi và Thanh

Hóa.

Vùng Đông Nam bộ: sản lượng năm 2015 là 2.982.600 tấn sắn củ tươi,

chiếm 27,94% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh trồng nhiều sắn của

vùng này là Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu và Bình

Dương.

Vùng Tây Nguyên: sản lượng năm 2015 là 2.728.300 tấn sắn củ tươi,

chiếm 25,56% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh trồng nhiều sắn của vùng

này là Gia Lai (nhiều nhất cả nước), Kon Tum, Đăk Lăk và Đăk Nông.

Vùng núi và trung du phía Bắc: sản lượng năm 2015 là 1.500.600 tấn sắn

củ tươi, chiếm 14,06% tổng sản lượng sắn cả nước. Những tỉnh trồng nhiều sắn

của vùng này là Sơn La, Yên Bái và Hòa Bình [26].

Bảng 1.2. Sản lượng sắn theo vùng của Việt Nam giai đoạn 2000-2015

(Đơn vị: nghìn tấn)

Hiện nay, Việt Nam hiện có 105 nhà máy sản xuất tinh bột sắn quy mô

công nghiệp và 7 nhà máy chế biến cồn với hàng trăm doanh nghiệp thương mại

sắn. Năm 2016, sắn và các sản phẩm từ sắn là đứng vị trí thứ 8 trong các mặt

hàng sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Sản xuất tinh bột sắn với sản

lượng mỗi năm trên 2,0 triệu tấn, trong đó 70% xuất khẩu và 30% tiêu thụ trong

nước. Kim ngạch xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn đứng thứ 2 sau Thái Lan.

Giá trị xuất khẩu sản phẩm sắn từ 2012 đến 2016 đạt từ 1,0 tỷ USD đến 1,5 tỷ

USD/năm. Năm 2015 sản lượng xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn đạt 4,11

triệu tấn, trong đó 1,86 triệu tấn sắn lát; 2,25 triệu tấn tinh bột sắn và các sản

phẩm khác từ sắn. Tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu: 1,32 tỷ USD. Sản lượng

xuất khẩu và kim ngạch xuất khẩu năm 2015 tăng so với năm 2014 (3,368 triệu

tấn) và (1,136 tỷ USD). Trong năm 2016, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,7 triệu

tấn sản phẩm sắn, trị giá 998.698 nghìn USD, trong đó 88,22% khối lượng được

xuất khẩu sang Trung Quốc, trị giá 868.395 nghìn USD; tiếp sau đó là các thị

trường Hàn Quốc, Nhật Bản, Philippin, Malaysia và Đài Loan [26]. Sắn là cây

đứng thứ 4 trong các cây trồng có kim ngạch xuất khẩu chủ lực của Việt Nam

trên 1 tỷ USD. Tinh bột sắn Việt Nam đã đến được với trên 20 quốc gia trên thế

giới. Năng suất sắn của Việt Nam 18,8 tấn/ha hiện đang đứng ở xung quanh số

10 trong số các nước có năng suất cao.

Sắn Việt Nam trong thời gian qua mặc dù đã đạt được những thành tựu

trong sản xuất, chế biến, kinh doanh và xuất khẩu nhưng vẫn gặp nhiều thách

thức. Giá mua bán sắn không ổn định và lệ thuộc nhiều vào thị trường Trung

Quốc. Năng suất sắn Việt Nam thấp hơn nhiều so với tiềm năng năng suất sắn

và nhiều rủi ro trong sản xuất tiêu thụ. Năng suất sắn Việt Nam hiện tại (18,8

tấn/ha) thấp hơn Ấn Độ (35,7 tấn/ha), Campuchia (25,2 tấn/ha), Indonesia (23,4

tấn/ha), Thái Lan (22,3 tấn/ha) của vùng sắn Châu Á. Nhiều địa phương trồng

một giống sắn liên tục nhiều năm, ít phục tráng, nhân giống mới, sử dụng hom

giống kém chất lượng, trồng sắn không chọn đúng lịch thời vụ và thời điểm thu

hoạch tối ưu, bón ít phân và không cân đối. Sắn trồng trên đất dốc, đất bị xói mòn

nghèo dinh dưỡng, không chú trọng đúng mức các biện pháp thâm canh sắn. Khi

bùng phát nhiều dịch hại nguy hiểm có thể làm giảm năng suất cây trồng.

1.2. Độc tố trong sắn

Nhóm chất cyanide gồm nhiều hợp chất có cấu tạo hóa học khác nhau và

rất phức tạp. Nhiều dạng cyanide được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

Hydrogen cyanide là chất lỏng màu xanh nhạt hoặc không màu, được sử dụng

chủ yếu trong sản xuất các chất chẳng hạn adiponitrile, methyl methacrylate,

cyanuric chloride, methionine. Các cyanide khác, chẳng hạn như natri và kali

cyanide, là muối hút ẩm hoặc tinh thể được sử dụng rộng rãi trong quá trình chiết

xuất quặng để thu hồi vàng…Tuy nhiên, anion CN- trong các hợp chất cyanide

là một trong số các tác nhân gây ô nhiễm cho môi trường [9]. Cyanogenic

glycosides có trong hơn 2.650 loài thực vật khác nhau thuộc khoảng 550 chi và

hơn 130 họ, bao gồm dương xỉ, thực vật hạt kín, cây hạt trần [20]. Có khoảng 25

loại cyanogenic glycosides được biết đến, khi phân giải chúng thu được sản phẩm

chứa cyanide.

Cyanogenic glycosides trong sắn được phân giải nhờ enzyme tiêu hóa hoặc

clohdric acid trong dịch vị dạ dày, tạo thành cyan hydric acid có khả năng gây

ngộ độc cho con người và động vật. Độc tính của sắn chủ yếu là do cyan hydric

acid tạo ra, tương tự như chất say của một số loại họ Đậu và tích tụ nhiều ở vỏ

sắn, đầu sắn, phần lõi ruột [24].

Độc tố trong sắn được phát hiện lần đầu vào năm 1885 bởi Peckolt, ở dạng

glycoside, tên gọi là manihotoxin. Cyanide có mặt trong sắn ở hai dạng

cyanogenic glycoside: linamarin và lotaustralin. Trong đó, linamarin chiếm hơn

80%, có mặt trong tất cả các bộ phận của cây sắn, đặc biệt là rễ và lá [16].

Quá trình sinh tổng hợp dạng cyanide tự do có sự tham gia của enzyme

hydrolytic, phân giải các dạng cyanogenic glycosides tạo thành dạng cyanide tự

do [8]. Chúng bị thuỷ phân trong nước thành acid cyanhydric, aceton và glucose.

Liên kết β trong phân tử linamarin chỉ bị phá vỡ dưới tác động của nhiệt độ cao,

áp suất cao và sự có mặt của các acid khoáng, khi đó, enzyme linamarase nội

sinh sẽ dễ dàng cắt liên kết β. Điều kiện tối ưu để enzyme hoạt động là 25°C với

pH 5,5 - 6 [16].

Cyanide có trong nhiều loại thực vật. Nhiều cây ăn được chứa cyanogenic

glycosides, nồng độ có thể khác nhau do yếu tố di truyền, môi trường, vị trí, mùa

và loại đất [6]. Nồng độ chất này trong sản phẩm từ sắn được trình bày trong

bảng 1.3.

Bảng 1.3. Nồng độ cyanide trong sản phẩm thức ăn từ sắn [18]

Nồng độ Cyanide Loại sản phẩm (mg/kg hoặc mg/l)

Sắn (đắng) / vỏ rễ khô 2360

Sắn (đắng) / lá 300

Sắn (đắng) / củ 380

Sắn (ngọt) / lá 451

Sắn (ngọt) / củ 445

Căn cứ vào hàm lượng HCN trong củ sắn, người ta chia các giống sắn

thành 2 nhóm: nhóm sắn ngọt và nhóm sắn đắng. Các loại sắn khác nhau ở hàm

lượng cyanogen, thường từ 15 đến 400mg HCN/ 1kg củ tươi. Nhóm sắn ngọt

bao gồm các giống sắn có hàm lượng HCN trong củ nhỏ hơn 80 ppm trong 100

g chất tươi; theo sự phân loại khác thì sắn ngọt có hàm lượng HCN nhỏ hơn

0,01% trong chất tươi. Nhóm sắn đắng là các giống sắn có hàm lượng HCN ≥ 80

ppm trong 100 gam củ sắn tươi và theo sự phân loại khác là có hàm lượng HCN

≥ 0,01% trong củ tươi. Lá sắn có chứa hàm lượng cao độc tố HCN, trong 1kg lá

tươi các giống sắn ngọt có 80 - 100mg HCN, các giống sắn đắng có chứa 160 -

240mg HCN.

Các loài động vật khác nhau, các giống khác nhau, cá thể và độ tuổi khác

nhau có khả năng chống chịu nồng độ HCN khác nhau. Đối với con người, liều

lượng HCN 20mg/1kg thể trọng sẽ gây độc và từ 50 - 100mg gây tử vong [7].

Ở người, các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm độc cyanua cấp tính bao gồm

hô hấp nhanh, giảm huyết áp, nhịp tim nhanh, chóng mặt, nhức đầu, đau dạ dày,

nôn, tiêu chảy, rối loạn tâm thần, co giật. Tử vong do ngộ độc cyanua có thể xảy

ra khi mức độ cyanua vượt quá giới hạn giải độc của cơ thể. Liều gây tử vong

cấp tính của hydrogen cyanide ở người được báo cáo là từ 0,5 đến 3,5 mg/kg

trọng lượng cơ thể. Trẻ em có nguy cơ cao hơn vì kích thước, trọng lượng cơ thể

nhỏ. Những người thường xuyên sử dụng sắn làm thực phẩm chính có thể nhiễm

độc cyanua mãn tính và dẫn đến một số bệnh như rối loạn chức năng tuyến giáp

và rối loạn thần kinh [10]. Tuy nhiên, cyanua trong cơ thể có thể kết hợp với

hydroxycobalamin (vitamin B12a) hình thành nên cyanocobalamin (vitamin

B12). Cyanua cũng có thể được đào thải khỏi cơ thể thông qua hô hấp khi biến

đổi thành carbon dioxide (CO2) [9].

Sự có mặt của hai glycosides cyanogenic trong sắn là một yếu tố chính của

việc hạn chế sử dụng sắn làm thực phẩm. Các kỹ thuật chế biến truyền thống

được thực hiện trong sản xuất sắn nhằm loại bỏ cyanide trong sản phẩm củ, lá

như làm khô (phơi - sấy lát khô, ép viên loại nước, làm tinh bột); ủ chua để lên

men, ngâm nước củ, thân và lá non. Trong đó, sấy khô là phương pháp chế biến

phổ biến nhất ở nhiều nước nhiệt đới. Phơi nắng loại bỏ cyanua nhiều hơn so với

sấy lò do thời gian tiếp xúc giữa linamarase và glycoside dài hơn. Ngâm nước

rồi đun sôi cũng là một phương pháp phổ biến và hiệu quả để loại bỏ cyanide.

Các sản phẩm thực phẩm truyền thống của châu Phi như gari và fufu được thực

hiện theo các bước khử nước, lên men và rang. Trong quy trình sản xuất gari,

hàm lượng cyanua giảm tới 80% - 95% [19]. Phương pháp ủ chua có thể loại bỏ

70% - 90% độc tố HCN trong củ và lá sắn, đây là phương pháp dễ thực hiện,

không phụ thuộc vào thời tiết. Các phương pháp này dựa trên ba nguyên lý cơ

bản là: loại bỏ trực tiếp cyanogen glycoside bằng cách hòa tan trong nước; làm

phân giải cyanogenic glycoside thành xeton và HCN, sau đó dùng nhiệt làm bốc

hơi HCN hoặc dùng nước rửa trôi HCN; làm phá hủy hoặc ức chế enzyme

linamariase và glucosidase, các men này không hoạt động thì cyanogenic

glycoside không thể phân giải thành xeton và HCN [23].

1.3. Họ gen CYP79 và tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2

1.3.1. Đặc điểm họ gen CYP79

Việc chuyển đổi các amino acid thành aldoximes là một bước quan

trọng trong quá trình sinh tổng hợp glycoside, được xúc tác bởi enzyme P450

cytochrome.

Cytochrome P450 oxidase (thường viết tắt là CYP) là một thuật ngữ chung

chỉ một nhóm enzyme oxy hóa khử quan trọng trong sinh lý động thực vật. Họ gen

CYP ở thực vật có rất nhiều (từ CYP71 đến CYP750). Trong đó, CYP79 có các họ

phụ từ CYP79A1 đến CYP79F2. Hệ gen của cây họ Cải Arabidopsis có chứa 7

gen thuộc họ CYP79: CYP79A2, CYP79B2, CYP79B3, CYP79C1, CYP79C2,

CYP79F1, CYP79F2 [22]. CYP79A1 ở cây cao lương chuyển hóa tyrosine thành

p-hydroxylphenyl-acetaldoxime trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate.

Glucosinolates là các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ amino acid, khi thủy

phân, thường giải phóng isothiocyanates với một loạt các hoạt động sinh

học. Glucosinolates có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật khỏi các

động vật ăn và mầm bệnh.

Bảng 1.4. Họ gen CYP79 ở thực vật [27]

Kí hiệu

Tên đầy đủ

Số hiệu

CYP79A1

tyrosine N-monooxygenase

EC:1.14.14.36

K13027

CYP79A2

phenylalanine N-monooxygenase

EC:1.14.14.40

K12153

CYP79B1_2

tryptophan N-monooxygenase

EC:1.14.13.125

K11812

CYP79B3

tryptophan N-monooxygenase

EC:1.14.13.125

K11813

valine N-monooxygenase

CYP79D1_2

EC:1.14.14.38

K13401

isoleucine N-monooxygenase

CYP79D3_4

EC:1.14.14.39

K14984

tyrosine N-monooxygenase

CYP79E1_2

EC:1.14.14.36

K20785

CYP79F1

homomethionine N-monooxygenase

EC:1.14.14.42

K12154

CYP79F2

homomethionine N-monooxygenase

EC:1.14.14.42

K12155

CYP79A2 chuyển hóa phenylalanine thành phenylacetaldoxime, tiền thân

của benzyl glucosinolate. Cả CYP79B2 và CYP79B3 chuyển hóa tryptophan thành

IAOx, tiền thân của indole glucosinolate hoặc IAA. Ở E.coli, CYP79F1 được biểu

hiện và chuyển hóa chuỗi methionine thành aldoxime tương ứng [22].

CYP79 có liên quan đến sinh tổng hợp glycosides cyanogenic - hợp chất thứ

cấp phổ biến ở các loài thực vật có mạch. Sự sinh tổng hợp bắt đầu bằng việc chuyển

đổi các amino acid thơm hoặc béo thành các aldoxime tương ứng, được xúc tác bởi

N-hydroxylating cytochrome P450 monooxygenases (CYP) của họ CYP79. Quá

trình thủy phân glycosides cyanogenic được thực hiện bởi các enzyme β-

glucosidase tạo thành hydrogen cyanide, chất này được giải phóng sau các tổn

thương mô [21]. Giai đoạn đầu tiên trong sinh tổng hợp glycosides được xúc tác

bởi hai cytochromes P450 (CYP79D1 và CYP79D2). Glycosides được tổng hợp

ở đỉnh chồi và vận chuyển đến gốc. CYP79D1 và CYP79D2 được ưu tiên biểu

hiện trong tế bào thịt lá và các tế bào nằm bên cạnh lớp biểu bì [11].

Hình 1.3. Quá trình chuyển hóa HCN từ lá sắn xuống củ [13]

1.3.2. Tình hình nghiên cứu gen CYP79D1 và CYP79D2

Trong số các gen thuộc họ CYP79, cả CYP79D1 và CYP79D2 đều có trong

hệ gen của cây sắn và chịu trách nhiệm sản xuất glycosides cyanogenic. Quá

trình tổng hợp độc tố trong sắn được quy định bởi nhiều gen, bước đầu là hai gen

CYP79D1 và CYP79D2, chúng được phát hiện trong lá mầm, cánh hoa ở đầu

chồi cây sắn 2 tháng tuổi và hầu hết các mô, nhưng chủ yếu ở lớp vỏ ngoài, các

lớp tế bào trụ bì (pericycle), các mô mạch (xylem, phloem) trong cuống [11], [14].

Quá trình chuyển hóa được thể hiện bằng sơ đồ:

Do đó, có thể dùng các cấu trúc antisense ngăn chặn hoặc làm giảm quá

trình tổng hợp glycoside cyanogenic trong cây sắn [15].

Cytochrome P450s là các hemoprotein liên quan đến quá trình oxy hóa các

hợp chất khác nhau. P450 ở sinh vật nhân sơ chủ yếu là protein hòa tan. Ở sinh

vật nhân thực, P450 chủ yếu được tìm thấy trong mạng lưới nội chất

(microsome). Cytochrome P450 có trong thành phần của cây sắn, xúc tác cho

sinh tổng hợp hai dạng cyanogenic glycoside thông qua chuyển đổi L - valin và

L - isoleucine thành các dạng trung gian tương ứng là methyl propanal, methyl

butanal oxime; acetone cyanohydrin, 2 - hydroxyl - 2 - methylbutyronitrile.

Năm 1996, chuyển gen ở sắn được thực hiện nhờ vi khuẩn Agrobacterium.

Từ đó đến nay, đã có nhiều bài báo về chuyển gen ở sắn được công bố. Trong

những năm gần đây có một số báo cáo về chuyển gen mang các đặc tính nông

học như tăng cường sức chống chịu, tăng hàm lượng tinh bột, chất dinh dưỡng

vào cây sắn được công bố. Năm 2003, Siritunga và Sayre lần đầu tiên chuyển

cấu trúc CYP79D1 và CYP79D2 vào sắn để ngăn chặn sự biểu hiện của

cytochrome P450s trong quá trình tổng hợp glycoside cyanogenic. Các cây

chuyển gen có hàm lượng cyanogen ít hơn 1% so với những cây sắn bình thường

[17].

Năm 2005, hai cấu trúc sợi đối mã có tiềm năng giảm hàm lượng cyanide

được sử dụng để tạo lượng lớn các dòng sắn là AS17A (tác động đến gen

CYP79D1) và AS17B (tác động đến gen CYP79D2), thu được kết quả là giảm

80% hàm lượng trong lá mầm, trong củ, hàm lượng cũng giảm 60%. Để giảm

được nhiều hơn hàm lượng cyanide, công nghệ RNAi được thử nghiệm tác động

ngăn chặn sự biểu hiện của hai gen CYP79D1 và CYP79D2, thí nghiệm trên 180

dòng có đã được kiểm chứng ở thí nghiệm trước có khả năng giảm xuống dưới

1% so với loài hoang dại ở lá mầm. 90 dòng được trồng trong 6 tháng để hình

thành củ, hàm lượng đã giảm xuống duới 1% so với kiểu hình hoang dại. 40 dòng

được nhận thấy hàm lượng linamarin trong củ giảm còn 8% ở loài hoang dã; 6

dòng độc lập hàm lượng linamarin thấp hơn 35% loài hoang dại [11].

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Giống sắn KM94 là con lai của tổ hợp lai R1 x R90, chung nguồn gốc cha

mẹ với KU50 của Thái Lan. Giống sắn KM94 được Bộ Nông nghiệp và PTNT

công nhận giống quốc gia năm 1995, là giống sắn công nghiệp được trồng phổ

biến nhất ở Việt Nam hiện nay với quy mô trồng năm 2008 đạt 420.000 ha [12].

Đề tài nghiên cứu sử dụng hai giống sắn KM94 và sắn xanh Vĩnh Phú do

trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp, được trồng tại vườn thực

nghiệm Khoa Sinh học - Đại học Sư Phạm Thái Nguyên.

Các mẫu lá sắn non, sạch bệnh sau khi thu hái, được lau sạch với cồn và

nước cất, bảo quản trong tủ ở -85oC.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen, phòng thí

nghiệm Thiết bị chung - Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư Phạm - Đại học

Thái Nguyên.

2.2. Thiết bị và hóa chất

Ống eppendorf, pipetman, máy li tâm Eppendorf centrifuge 5430R, máy

PCR Eppendorf vapo.protect (Eppendorf, Đức).

Bể ổn nhiệt lab.companion RW 0525G (Lab Companion, Hàn Quốc).

Tủ âm 20 Panasonic MDF-U334PE (Panasonic, Nhật).

Tủ âm 85 NUAIRE -85 Ultralow Freeze (Nuaire, Mỹ).

Máy soi DNA UV.MS Major science (Major SCI, Mỹ).

Lò vi sóng Electrolux (Việt Nam).

Tủ ấm Carbolite (Carbolite, Anh).

Nồi khử trùng Tomy SS325 (Tomy, Nhật).

Box cấy ESCO class II BSC Streamline Model SC2-4A1 (Esco, Indonesia).

Bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh.

Hóa chất: các hóa chất thông dụng như: Tris, EDTA, phenol, ethanol

(100%), RNase, agarose…được mua từ các hãng nổi tiếng Sigma, Invitrogen,

Thermo Scientific…

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Hai giống sắn nghiên cứu được trồng và tiến hành thu mẫu để làm thí

nghiệm. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số

bằng kit như sau:

(1) Nghiền 30mg mô lá trong nitơ lỏng. Chuyển 300µl dung dịch chiết vào

ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung β-mercaptoethanol. Vortex trong 10 giây.

(2) Bổ sung 600μl proteinase, trộn đều và ủ ở 15-25°C trong 10 phút.

(3) Li tâm 12000 vòng/phút trong 5-10 phút. Thu dịch sang ống eppendorf

mới.

(4) Bổ sung 450 µl ethanol (96-100%) và trộn đều.

(5) Chuyển 700 μl dung dịch vào cột GeneJET RNA. Li tâm cột 12000

vòng/phút trong 1 phút. Thu cặn.

(6) Chuyển cột GeneJET RNA vào ống eppendorf 2ml mới.

(7) Bổ sung 700 μl dung dịch đệm 1 vào cột GeneJET RNA và li tâm

12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và đặt cột tinh lọc trở lại ống thu.

(8) Bổ sung 600 μl dung dịch đệm 2 vào cột GeneJET RNA và li tâm

12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và đặt cột tinh lọc trở lại ống thu.

(9) Bổ sung 250 μl dung dịch đệm 2 vào cột GeneJET RNA và li tâm

12000 vòng/phút trong 2 phút. Chuyển cột GeneJET RNA sang ống eppendorf

1,5ml mới vô trùng.

(10) Bổ sung 100 μl nước vào giữa màng lọc. Li tâm 12000 vòng/phút

trong 1 phút. Bỏ cột, sử dụng trực tiếp RNA thu được hoặc lưu trữ RNA ở -20°C

cho đến khi sử dụng.

2.3.2. Phương pháp tạo cDNA

Từ RNA tổng số của hai mẫu sắn, cDNA được tổng hợp theo các bước

(1) Bổ sung hóa chất vào ống eppendorf đã được khử trùng với tỉ lệ như sau:

Template RNA: 0,1 μg - 5 μg

Primer Oligo (dT)18: 1 μl

Nước: 12 μl (2) Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút sau đó chuyển sang đá

lạnh.

(3) Bổ sung tiếp các thành phần:

5X reaction Buffer: 4 μl

RiboLock Rnase Inhibitor: 1 μl

10 mM dNTP Mix: 2 μl

Revertaid M-MuLV RT: 1μl

Đảo đều và li tâm nhanh.

(4) Bổ sung mồi hexamer, đặt vào máy PCR theo chu trình nhiệt 25°C

trong 5 phút, 42°C trong 60 phút và 70oC trong 5 phút.

Sản phẩm được lưu giữ ở -20oC.

2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Để tách chiết được DNA tổng số, chúng tôi sử dụng lá của hai giống sắn

nghiên cứu. Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch đệm chứa CTAB là phương

pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật. Dựa trên quy

trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994), nhiều quy trình tách chiết được xây

dựng cho từng đối tượng thực vật. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình

tách chiết DNA tổng số như sau:

(1) Các lá được lựa chọn sẽ được rửa sạch bụi, xịt qua cồn ethanol 70%

sau đó để khô trong không khí và cho mẫu lá mỗi giống vào riêng túi sạch, buộc kín, ghi tên giống, giữ mẫu trong tủ âm 85oC ít nhất 2h.

(2) Nghiền 0.8 g mô lá sắn trong cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung

6ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM pH8; EDTA 5mM pH8; NaH2PO4 0.4%; sorbitol

350mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp vào các ống eppendorf 2ml, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.

(3) Loại dịch thu tủa, bổ sung đệm rửa, tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút

trong 10 phút ở 4oC. Quá trình được lặp lại từ 2 – 3 lần, loại dịch thu tủa.

(4) Bổ sung hóa chất CTAB 4% vào mỗi ống eppendorf . Ủ trong bể ổn

nhiệt 65°C, trong vòng 60’ (5-10’ đảo một lần).

(5) Bổ sung chlorofom tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ 20’.

(6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C. Thu pha trên sang ống

eppendorf 1.5 ml mới, tủa DNA bằng cồn isopropanol tỷ lệ 1:1 trong tủ âm 20°C

ít nhất 2h. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15’, 4°C, đổ dịch.

(7) Rửa tủa bằng cồn 70°: bổ sung 500µl cồn 70o, ly tâm 12000

vòng/phút trong 15’ ở 4°C, loại dịch thu tủa. Lặp lại 2 – 3 lần.

(8) Làm khô tủa ở trong box cấy và hòa tan trong 50µl nước khử ion,

bảo quản mẫu DNA ở -20oC.

(9) Điện di gel agarose 1% kiểm tra.

2.3.4. Phương pháp PCR

Đoạn gen CYP79D1 được khuyếch đại bằng cặp mồi ME. Cặp mồi được thiết

kế dựa trên trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 và trình tự như sau:

ME-F: 5’-CAAGAGATACTTCGGCAAGG-3’

ME-R: 5’-ACCATGTCTTTGGGTTCCTG-3’

Nồng độ các thành phần và chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng

1 Nước khử ion 6 µl

2 GoTaq Green Master Mix 2X 7,5 µl

3 ME – F 10pmol/µl 0,5µl

4 ME – R 10pmol/µl 0,5µl

5 cDNA khuôn 10 - 20 ng/µl 0,5µl

Tổng thể tích 15µl

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ

1 Biến tính 94 4 phút 1

2 Biến tính 94 40 giây

3 Gắn mồi 59 40 giây 35 4 Kéo dài chuỗi 72 40 giây

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc 4 ∞

Sản phẩm được lưu trữ ở 4 oC.

2.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm PCR

Điện di sản phẩm PCR khoảng 30 phút trên gel agarose 1% ở 110V trong

dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di được nhuộm với ethidium bromide

nồng độ 0,5mg/ml trong 5 phút, rửa sạch, sau đó soi dưới đèn UV có bước sóng

320 nm và chụp ảnh.

2.3.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification gồm

các bước sau:

(1) Bổ sung Binding buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích.

(2) Chuyển sang cột lọc, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại

bỏ dịch.

(3) Bổ sung 700 µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.

(4) Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn.

(5) Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1

phút, thu dịch đáy.

(6) Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong

TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản

phẩm trong tủ -20oC.

2.3.7. Phương pháp đọc trình tự

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự đoạn gen CYP79D1 được xác

định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic

Analyzer (Applied Biosytem) tại Viện Công nghệ Sinh học.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1

Mẫu sắn sau khi thu thập được tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng kit

được mô tả ở phần 2.3.1 - Chương 2.

Hình 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số

KM94: sắn KM94; XVP: sắn Xanh Vĩnh Phú

Kết quả tách chiết RNA tổng số cho thấy mẫu RNA đạt hiệu suất và độ

tinh sạch cao.

Sau khi tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA, quá trình nhân bản đoạn

gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R.

Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3. Chương 2.

Hình 3.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số

1-5: sắn KM94; 6-10: sắn Xanh Vĩnh Phú; M: Marker 1kb

Trên điện di đồ (hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có

kích thước khoảng 0,5kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý

thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.

3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1

Song song với quá trình nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số, chúng

tôi còn tiến hành nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ DNA tổng số. DNA tổng số được

tách chiết theo phương pháp được mô tả trong phần 2.3.1 - Chương 2.

Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số

1. Sắn KM94 2. Sắn xanh Vĩnh Phú

Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy ở cả 2 mẫu đều xuất hiện 1

băng sáng, rõ chứng tỏ chúng tôi đã tách được DNA tổng số của các giống sắn

với độ nguyên vẹn đảm bảo cho nhân bản đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR tiếp theo

(Hình 3.3).

Sau khi tách chiết thành công DNA tổng số, quá trình nhân bản đoạn gen

mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành

phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3 Chương 2.

Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1

M: marker 1kb; sắn KM94; 2: sắn Xanh Vĩnh Phú

Trên điện di đồ (Hình 3.4) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều

có kích thước khoảng 1 kb. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản

phẩm phụ.

3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh

Vĩnh Phú và KM94

Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất

như mồi, đệm PCR, các nucleotide...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm

phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình xác định trình tự nucleotide. Chúng

tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 mẫu sắn theo Kit GenJET DNA

Purification. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 1% để

kiểm tra chất lượng và giải trình tự gen.

Xác định trình tự nucleotide

Sau khi giải trình tự, các đoạn gen CYP79D1 được xử lý bằng chương trình

BLAST trên NCBI và phần mềm BioEdit. Các trình tự đoạn gen CYP79D1 của

giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94 được chúng tôi so sánh với trình

tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 trên GenBank.

Sau khi xác định trình tự nucleotide và phân tích bằng các phần mềm, kết

quả cho thấy đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú

được tách chiết từ RNA đều có kích thước là 669 bp, gen CYP79D1 được tách

chiết từ DNA có kích thước là 999 bp. Tiếp theo, chúng tôi so sánh trình tự gen

CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự gen

AF140613.

So sánh trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh

Vĩnh Phú với trình tự có mã số AF140613 trên Genbank

Trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 có kích thước là 1629 bp. Trình

tự gen AF140613 phân lập từ cDNA do vậy trình tự gen này chỉ gồm các đoạn

exon. Kết quả so sánh cho thấy, các đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94

và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng với gen AF140613 là 99%.

Cặp mồi mà chúng tôi thiết kế để nhân bản đoạn gen CYP79D1 nằm từ nucleotide

674 tới nucleotide 1342 của trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613. Đây là

vùng bảo thủ trong họ gen này đảm bảo cho quá trình làm câm lặng gen sau này.

Khi so sánh về trình tự nucleotide đoạn gen CYP79D1 của 2 giống Sắn

Xanh Vĩnh Phú và sắn KM94 được tách từ DNA với gen có mã số AF140613

chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G

thành nucleotide A). Tuy nhiên trong đoạn trình tự chúng tôi có 2 vùng exon và

xen kẽ là 1 vùng intron, vùng intron nằm ở vị trí từ 345 đến 675. Do vậy sự tương

đồng giữa 2 đoạn gen này với gen có mã số AF140613 chia làm 2 vùng như mô

tả hình 3.5.

Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa về trình tự đoạn gen CYP79D1

Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số với trình tự

gen CYP79D1 mã số AF140613 trên Genbank cho thấy các đoạn gen CYP79D1

của giống sắn KM-94 và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng là

99%, giữa các trình tự có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide

G thành nucleotide A) và ở vị trí nucleotide thứ 130 (từ nuceotide G thành

nuceotide A).

Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ DNA với trình tự

nucleotide được phân lập từ RNA tổng số chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau:

ở trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số không có đoạn intron như

10 20 30 40 50 60

khi phân lập từ DNA.

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 CAAGAGATACTTCGGCAAGGGAATGCCGGACGGAGGACCAGGGCCTGAAGAAATCGAGCA

KM94-RNA ............................................................ ----

------------------

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 CATTGATGCCGTTTTCACTGCCTTGAAATACTTGTATGGGTTTTGCATATCAGATTTCTT

KM94-RNA .......................................A....................

Xanh Vinh Phu-RNA .......................................A....................

KM94- DNA .......................................A....................

Xanh Vinh Phu-DNA .......................................A....................

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 GCCTTTCTTGTTGGGACTTGATCTGGATGGCCAAGAAAAATTTGTGCTTGATGCAAATAA

KM94-RNA .........A..................................................

Xanh Vinh Phu-RNA .........A..................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 GACCATAAGGGATTATCAGAACCCTTTAATTGATGAAAGGATTCAACAATGGAAGAGTGG

KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 TGAAAGGAAGGAAATGGAGGACTTGCTTGATGTTTTCATCACTCTCAAGGATTCAGACGG

KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

310 320 330 340 350 360

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 CAACCCATTGCTCACTCCTGACGAGATCAAGAATCAAATAGCTG----------------

KM94-RNA ............................................----------------

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................----------------

KM94- DNA ............................................TAAGATCACTCTCACT

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................TAAGATCACTCTCACT

370 380 390 400 410 420

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 ------------------------------------------------------------

KM94-RNA ------------------------------------------------------------

Xanh Vinh Phu-RNA ------------------------------------------------------------

KM94- DNA TCTTACAATTGCATGCTAATGATTGATTATGATGGTGAAATTTATATGGGACTCACTTTT

Xanh Vinh Phu-DNA TCTTACAATTGCATGCTAATGATTGATTATGATGGTGAAATTTATATGGGACTCACTTTT

430 440 450 460 470 480

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 ------------------------------------------------------------

KM94-RNA ------------------------------------------------------------

Xanh Vinh Phu-RNA ------------------------------------------------------------

KM94- DNA TATTTTTTTATAGTAATTAGTATTTAATTATGATAAAAAAAAATTGGGTGAGGAAACATT

Xanh Vinh Phu-DNA TATTTTTTTATAGTAATTAGTATTTAATTATGATAAAAAAAAATTGGGTGAGGAAACATT

490 500 510 520 530 540

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 ------------------------------------------------------------

KM94-RNA ------------------------------------------------------------

Xanh Vinh Phu-RNA ------------------------------------------------------------

KM94- DNA TCTAATTCATATTTTAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAACTTTTTTTGGGTATTTTGA

Xanh Vinh Phu-DNA TCTAATTCATATTTTAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAACTTTTTTTGGGTATTTTGA

550 560 570 580 590 600

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 ------------------------------------------------------------

KM94-RNA ------------------------------------------------------------

Xanh Vinh Phu-RNA ------------------------------------------------------------

KM94- DNA ATTTCCCCCACAAAATTTTTATTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGAGAAACTTTTTC

Xanh Vinh Phu-DNA ATTTCCCCCACAAAATTTTTATTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGAGAAACTTTTTC

610 620 630 640 650 660

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 ------------------------------------------------------------

KM94-RNA ------------------------------------------------------------

Xanh Vinh Phu-RNA ------------------------------------------------------------

KM94- DNA TGTGTATTTTGAATTTCTCGCACAAAATTTATATATATTTAAAAGAAATTAACATAAGTA

Xanh Vinh Phu-DNA TGTGTATTTTGAATTTCTCGCACAAAATTTATATATATTTAAAAGAAATTAACATAAGTA

670 680 690 700 710 720

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 --------------AAATTATGATAGCAACAGTAGATAACCCATCAAACGCAATCGAATG

KM94-RNA --------------..............................................

Xanh Vinh Phu-RNA --------------..............................................

KM94- DNA TATATGGTTGCAGG..............................................

Xanh Vinh Phu-DNA TATATGGTTGCAGG..............................................

730 740 750 760 770 780

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 GGCAATGGGGGAGATGCTAAATCAACCAGAAATCCTGAAGAAGGCCACAGAAGAGCTCGA

KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

790 800 810 820 830 840

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 CAGGGTGGTCGGCAAAGACAGGCTTGTTCAAGAATCCGACATCCCCAACCTTGACTATGT

KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

850 860 870 880 890 900

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 CAAAGCCTGTGCAAGAGAAGCCTTCAGGCTCCATCCAGTAGCACACTTCAATGTCCCTCA

KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

910 920 930 940 950 960

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AF140613_CYP79D1 TGTAGCCATGGAAGACACTGTCATTGGTGATTACTTTATTCCAAAGGGCAGCTGGGCAGT KM94-RNA ............................................................ Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................ KM94- DNA ............................................................ Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................ 970 980 990 ....|....|....|....|....|....|....|.... AF140613_CYP79D1 TCTCAGCCGCTATGGGCTCGGCAGGAACCCAAAGACATG KM94-RNA ....................................... Xanh Vinh Phu-RNA ....................................... KM94- DNA ....................................... Xanh Vinh Phu-DNA .......................................

Dựa trên trình tự của gen CYP79D1 và CYP79D2 của họ cytochrome P450,

chúng tôi sử dụng thuật toán Blast để xác định toàn bộ vị trí các gen CYP79D1 và

CYP79D2 trên cơ sở dữ liệu của sắn. Khi tìm kiếm gen CYP79 ở sắn trên cơ sở dữ

liệu của sắn, chúng tôi nhận thấy gen CYP79D1 nằm trên nhiễm sắc thể 13 có mã

định danh là cassava4.1_005059m nằm ở locus Manes.13G094200, CYP79D2 nằm

trên nhiễm sắc thể 12 có mã định danh là cassava4.1_005079m nằm ở locus

Manes_12G133500. Ngoài ra, chúng tôi còn tìm thấy gen CYP84A1 nằm trên nhiễm

sắc thể 4 có mã định danh là cassava4.1_024692m nằm ở locus Manes.04G084200,

gen CYP81D1 nằm trên nhiễm sắc thể 5 có mã định danh là cassava4.1_024196m

nằm ở locus Manes.05G178600, gen CYP93A2 nằm trên nhiễm sắc thể 7 có mã

định danh là cassava4.1_027206m nằm ở locus Manes.07G003300 (hình 3.6)

Hình 3.6. Vị trí phân bố của một số gen CYP trên hệ gen sắn

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

Đã tách chiết được DNA tổng số và khuếch đại thành công đoạn gen

CYP79D1 bằng kỹ thuật PCR ở các mẫu sắn xanh Vĩnh Phú và KM94.

Đã tách chiết được RNA tổng số và khuếch đại thành công đoạn gen

CYP79D1 bằng kỹ thuật PCR ở các mẫu sắn xanh Vĩnh Phú và KM94.

Đã phân lập thành công và xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen

CYP79D1 từ DNA của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94. Đoạn gen

CYP79D1 thu được có kích thước 999 bp, bao gồm 2 vùng exon và 1 vùng intron.

Đã phân lập thành công và xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen

CYP79D1 từ RNA tổng số của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94.

Đoạn gen CYP79D1 thu được có kích thước 669 bp.

2. Đề nghị

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đặt tiền đề cho việc tiếp tục nghiên cứu

ứng dụng đoạn gen này trong kỹ thuật RNAi nhằm làm giảm hàm lượng HCN

trong sắn tại Việt Nam. Đề nghị tiếp tục nghiên cứu trình tự các đoạn gen liên

quan đến quá trình tổng hợp hydrogen cyanide ở cây sắn và một số loài thực vật

có chứa chất trên.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên (2004), Tinh bột sắn và

các sản phẩm từ tinh bột sắn , Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.

2. Hoàng Kim, Trần Ngọc Ngoạn, Nguyễn Thị Trúc Mai, Võ Văn Quang,

Nguyễn Bạch Mai, Nguyễn Thị Lệ Dung, Nguyễn Phương, Hoàng Long,

Nguyễn Minh Cường, Đào Trọng Tuấn, Trần Công Khanh, Nguyễn Minh

Hiếu, Nguyễn Văn Bộ, Nguyễn Thị Cách, Nguyễn Trọng Hiển, Lê Huy Ham,

H. Ceballos and M. Ishitani. (2014a), Kết quả chọn tạo và phát triển giống

sắn mới KM419, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Hội đồng Giống

Quốc gia, Hà Nội ngày 16 tháng 11 năm 2014.

3. Hoàng Kim (2013), Cây Lương thực Việt Nam (lúa, ngô, sắn, khoai lang), Đại

học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, 279 trang.

4. Hoàng Kim, Nguyễn Đăng Mãi (2001), Sắn Việt Nam: Hiện trạng, định hướng và

giải pháp phát triển những năm đầu thế kỷ 21, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

5. Đinh Thế Lộc, Võ Nguyên Quyền, Bùi Thế Hùng, Nguyễn Thế Hùng (1997), Giáo

trình Cây lương thực, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 121- 134.

TIẾNG ANH

6. FAO/WHO (1993), Cyanogenic glycosides. In “Toxicological evaluation of

certain food additives and naturally occurring toxicants”. Geneva, World

Health Organization, 39th Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee

on Food Additives (WHO Food Additives Series 30).

7. Halstrom F, Moller KO (1945), “The content of cyanide in human organs from

cases of poisoning with cyanide taken by mouth; with a contribution

to the toxicology of cyanides”, Acta Pharmacol Toxicol (Copenh), 1(1), pp.

18-28.

8. Heuberger C (2005), Cyanide Content of Cassava and Fermented

Products with Focus on Attiéké and Attiéké Garba, Swiss Federal Institute of

Technology, Zurich, Switzerland.

9. IPCS (2004), Hydrogen cyanide and cyanides: human health aspects, Geneva,

World Health Organization, International Programme on Chemical Safety

(Concise International Chemical Assessment Document No. 61).

10. Joey Kwok (2008), Cyanide Poisoning and Cassava, Food Safety Focus (19).

11. Jorgensen K., Bak S., Busk PK., Sorensen C., Olsen CE., Puonti-Kaerlas J.,

Moller BL. (2005a), Cassava plants with a depleted cyanogenic glucoside

content in leaves and tubers: distribution of cyanogenic glucosides, their site

of synthesis and transport, and blockage of the biosynthesis by RNA

interference technology, Plant Physiol, 139, pp. 363-374.

12. Hoang Kim, Nguyen Van Bo, Hoang Long, Nguyen Trong Hien, H. Ceballos

and R. Howeler (2010), “Current situation of cassava in Vietnam”, A New

Future for Cassava in Asia: Its Use as Food, Feed and Fuel to Benefit the

Poor, Proc. 8th Regional Workshop, held in Vientiane, Lao PDR. Oct 20-24,

2008, pp. 100-112.

13. Kirsten A.N., Olsen CE., Pontoppidan K., Møller BL (2002), Leucine-

Derived Cyano Glucosides in Barley, Plant Physiol., 129 (3): 1066-1075

14. Li H.Q. (1996), Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta

Crantz), Nature Biotech., 14: 736-740.

15. Mette Dahl Andersen (1999), “Cytochromes P-450 from Cassava (Manihot

esculenta Crantz) - Catalyzing the First Steps in the Biosynthesis of the

Cyanogenic Glucosides Linamarin and Lotaustralin”, The journal of

biological chemistry, 275 (3), pp 1966 - 1975.

16. M.P.Cereda, M.C.Y.Mattos (1996), Linamarin - the toxic compound of

cassava, Journal of Venomous Animals and Toxins, 2(1).

17. Narayanan N. Narayanan, Uzoma Ihemere, Claire Ellery, Richard T. Sayre

(2011), Overexpression of Hydroxynitrile Lyase in Cassava Roots Elevates

Protein and Free Amino Acids while Reducing Residual Cyanogen Levels,

PloS one., 6(7): e21996.

18. Nartey F (1980), Toxicological aspects of cyanogenesis in tropical foods, In:

Smith RL, Bababumni ER, eds. Toxicology in the tropics. London, Taylor &

Francis, 53-73.

19. Padmaja G (1995), Cyanide detoxification in cassava for food and feed uses,

Crit Rev Food Sci Nutr; 35(4), pp. 299-339.

20. Seigler DS (1991), Cyanide and cyanogenic glycosides. In “Herbivores: their

interactions with secondary plant metabolites”. (Eds GA Rosenthal, MR

Berenbaum), pp. 35-77.

21. Takos AM, Knudsen C, Lai D, Kannangara R, Mikkelsen L, Motawia

MS, Olsen CE, Sato S, Tabata S, Jørgensen K, Møller BL, Rook F (2011),

Genomic clustering of cyanogenic glucoside biosynthetic genes aids their id

entificationin Lotus japonicus and suggests the repeated evolution of

this chemical defencepathway, Plant J., 68(2), pp. 273-86

22. Y.P.Abrol, A.Ahmad (2003), Sulphur in Plants, 147-149; Mikkelsen

MD, Halkier BA., Metabolic engineering of valine- and isoleucine-derived

glucosinolates in Arabidopsis expressing CYP79D2 from Cassava, Plant

Physiol. 2003 Feb;131(2):773-9

TÀI LIỆU THAM KHẢO KHÁC

23. Độc tố HCN trong sản phẩm sắn,

http://lib.dntu.edu.vn:8080/dspace/bitstream/DNTU_123456789/1140/2/Gia

o%20trinh%20doc%20to%20trong%20thuc%20an%20chan%20nuoi%20%

202.pdf

24. Giá trị dinh dưỡng của sắn, http://iasvn.org/chuyen-muc/Gia-tri-dinh-duong-

cua-San-4488.html, 29.10.2016.

25.https://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFn#Ngu%E1%BB%93n_g%E1

%BB%91c,_l%E1%BB%8Bch_s%E1%BB%AD

26. Tổng cục Thống kê (2017), http://www.gso.gov.vn

27. https://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko00199+K13401