ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THỊ OANH
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƢỢNG CỦA
ZERUMBON ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CỦ GỪNG GIÓ
BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Thái Nguyên-2018
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Thắm cô
đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho em trong
suốt quá trình hoàn thành luận văn, cô đã tận tình hướng dẫn để em hoàn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại
học Khoa học - ĐHTN, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa
học trường Đại học Khoa học - ĐHTN đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong
suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo
viên Trường THPT Nguyễn Trãi - An Dương- Hải Phòng đã tạo điều kiện
thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn.
Em xin cảm sự hỗ trợ của nhóm nghiên cứu công ty TNHH Công
nghệ cao Hải Anh đã hỗ trợ cùng hoàn thành các kết quả thực nghiệm.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã dạy dỗ em nên
người!
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã
giúp đỡ em hoàn thành luận văn.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Oanh
a
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... a
MỤC LỤC ..................................................................................................... b
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... c
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... d
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... e
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................... f
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
Chương 1 TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc ................................. 2
1.1.1. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4] ........................................... 2
1.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1] ................................................ 4
1.1.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................ 5
1.2. Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC [23] ................................... 10
1.3. Đặc điểm thực vật cây gừng gió .......................................................... 14
1.4. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) ............. 14
1.5. Các đặc trưng của zerumbon .................................................................. 20
1.5.1. Phân lập và chuyển hóa zerumbon ...................................................... 20
1.5.2. Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbon ................................. 22
1.6. Mục tiêu của luận văn .......................................................................... 23
Chương 2 THỰC NGHIỆM ........................................................................ 24
2.1. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị ................................ 24
2.1.1. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 24
2.1.2. Hóa chất và dung môi ....................................................................... 24
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng
sắc kí lớp mỏng ........................................................................................... 24
2.1.4. Xác nhận cấu trúc .............................................................................. 24
2.2. Chuẩn bị mẫu zerumbon ...................................................................... 25
2.2.1. Chuẩn bị mẫu gừng gió ..................................................................... 25
b
2.2.2. Chưng cất tinh dầu gừng gió ............................................................. 25
2.2.3. Phân lập zerumbon ............................................................................ 26
2.3. Phân tích cấu trúc zerumbon bằng các phương pháp phổ.................... 27
2.3.1. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR ................................. 27
2.3.2. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ MS ................................ 27 2.3.3. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 1H-NMR ....................... 27 2.3.4. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 13C-NMR ...................... 28
2.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ 2D (HSQC, HMBC,
NOESY) ...................................................................................................... 28
2.5. Phân tích độ sạch của zerumbone bằng LC ......................................... 29
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 30
3.1. Mục tiêu của đề tài ............................................................................... 30
3.2. Kết quả chuẩn bị mẫu nghiên cứu ........................................................ 30
3.2.1. Phân tách tinh dầu ............................................................................. 30
3.2.2. Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu .......................................... 30
3.2.3. Phân tách zerumbone bằng sắc ký cột .............................................. 31
3.3. Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR .................................... 31
3.4. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ MS ................................. 33
3.5. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR ............................. 34
3.6. Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC .......... 37
3.7. Phân tích độ sạch của zerumbone bằng phương pháp LC ................... 41
KẾT LUẬN ................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 44
c
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MS Phương pháp phổ khối lượng
EI Phương pháp bắn phá bằng dòng electron
CI Phương pháp ion hóa hóa học
FAB Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh
GC Phương pháp sắc ký khí
LC Phương pháp sắc ký lỏng
IR Phương pháp phổ hồng ngoại
SKLM Sắc kí lớp mỏng
TMS Chất chuẩn
HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều biểu
hiện tương tác trực tiếp giữa H với C mà nó
liên kết trực tiếp.
1H-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
hiđro
13C-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của
cacbon
COSY Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện
tương tác của các proton gần nhau trong
không gian
DEPT Phương pháp ghi phổ
HMBC
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện tương tác xa của nguyên tử 1H với 13C
c
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sự va chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của
phân tử. .......................................................................................................... 2
Sơ đồ 1.2: Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành
các ion ........................................................................................................... 3
Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử ........................................................... 3
d
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 ) .................................... 4
Hình 1.2. Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic .......................................... 5
Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit ............................... 7
Hình 1. 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều ........................................................... 9
Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan ..................................................... 10
Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC .................................................... 11
Hình 1.7. Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.) ................................. 14
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất zerumbon ................................................... 32
Hình 3.2. Phổ MS của hợp chất zerumbone ............................................... 33 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone ....................................... 35 Hình 3.4. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone ............................... 35 Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất zerumbone ...................................... 36
Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất zerumbone ........................................... 37
Hình 3.7. Phổ HSQC giãn của hợp chất zerumbone ................................... 38
Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất zerumbone ......................................... 40
Hình 3.9. Phổ HMBC giãn của hợp chất zerumbone.................................. 40
Hình 3.10. Một số tương tác của H với C trong HMBC ............................. 41
Hình 3.11. Phổ LC và dữ liệu MS bắn phá đỉnh 2.18 ................................. 42
Hình 3.12. Đường chuẩn LC của zerumbone ............................................. 42
e
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió ....................... 15
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió .......................... 16
Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió .................. 17
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế ................ 19
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát TDZ bằng SKLM ............................................. 31
f
MỞ ĐẦU
Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ
quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có
câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng
trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ. Để
phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp
phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt
nhân, phổ khối lượng. Mỗi phương pháp cho ph p xác định một số thông
tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định
cấu trúc các hợp chất hữu cơ.
Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) là cây thuốc quen thuộc của các
dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên Việt
Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước
nhiệt đới Châu Á, được sử dụng làm các bài thuốc chữa đau bụng, bồi
dưỡng cho phụ nữ sau khi sinh nở, chống nôn, cảm gió… Gần đây, những
kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy Gừng gió có hàm lượng
zerumbon rất cao (73,2% trong tinh dầu củ). Kết quả nghiên cứu in vivo và
in vitro cho biết zerumbon không những có khả năng kháng khuẩn mà còn
có khả năng chống ung thư mạnh và đang được đưa vào thử nghiệm lâm
sàng ở giai đoạn III. Do có cấu trúc phức tạp, hoạt tính sinh học mạnh nên
được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Luận văn này tập trung vào
nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc và phương pháp định lượng
zerumbon bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.
1
Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về c c phƣơng ph p c nh cấ c
1.1.1. Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4]
Phổ khối lượng là phương pháp công cụ xác định cấu trúc khác nhiều
nhất so với các phương pháp sẽ được nói đến ở chương này. Phương pháp
phổ khối lượng không phụ thuộc vào sự hấp thụ chọn lọc các tần số cụ thể
của bức xạ điện từ mà chú trọng nhiều hơn những gì xảy ra với phân tử khi
nó bị bắn phá bởi các electron có năng lượng cao. Nếu một electron có
năng lượng khoảng 10 electronvolt ( 10 eV = 230,5 kcal/mol) va chạm với
một phân tử hữu cơ thì năng lượng được chuyển giao do kết quả của sự va
chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của phân tử.
A : B + e →. + 2e-
Phân tử electron cation gốc Hai electron
Sơ đồ 1.1: Sự va chạm để làm bật ra một trong các electron
của phân tử.
Chúng ta nói phân tử AB bị ion hóa bởi sự va chạm electron. Dạng
thu được gọi là ion phân tử mang điện tích dương và có số lẻ electron, được
gọi là cation gốc. Ion phân tử có cùng khối lượng (k m hơn một khối lượng
không đáng kể của một electron) như phân tử mà từ đó nó được tạo thành.
Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng
dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn
phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để
bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các
phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện
tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:
2
Sơ đồ 1.2: Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành
các ion
Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại là
các ion mang điện tích +2 và điện tích âm (-). Năng lượng bắn phá các
phân tử thành ion phân tử khoảng 10 eV. Nhưng với năng lượng cao thì ion
phân tử có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các
gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn
phá các phân tử ở mức năng lượng 70 eV.
Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và
năng lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Các ion dương
hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là
số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau
và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối
liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này
được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.1).
3
Hình 1.1. Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 )
Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng
phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác
định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong
những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một
chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.
1.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1]
Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho
nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất. Khi chiếu các bức xạ
hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân
tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có hai
loại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng,
dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến
dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết.
Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ
hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp
thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết
nhất định (Hình 1.2).
4
Hình 1.2. Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc
trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong
phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng
ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau
của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường
được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau.
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được
chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc
biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH,
C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 – 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là
để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ khoảng 3000 cm-1 đến 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay.
1.1.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [1]
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện
đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến
5
được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ
của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là
spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [2].
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:
Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của
hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định
nghĩa một các tổng quát như sau:
Trong đó: νchuẩn, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn
đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa
học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường
yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học ta biết được loại proton nào có
mặt trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.
6
Hình 1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit
Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân
không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi là vân phổ, mỗi
vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên
sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các
hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron
liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết
và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [3].
Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa
các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có
thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với
nhau [2].
Phổ 2D-NMR
NMR (nuclear magnetic resonance) là kỹ thuật có giá trị nhất để xác
định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Phương pháp NMR có hạn chế là chỉ áp
dụng cho các hạt nhân nguyên tử với số hiệu nguyên tử (số thứ tự Z) lẻ
7
hoặc số khối (A) lẻ vì các nguyên tử loại này có spin hạt nhân thì mới có tính chất từ như 1H, 13C, 15N, 19F, 31P… Các hạt nhân không có tính từ như 2D, 12C, 16O, 32S… không thể hiện trên phổ NMR.
Ngày nay phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là công cụ hữu
hiệu cho nhiều ngành khoa học như vật lý, hóa học, sinh học, dược học, y
học, v.v. Nó đã đạt được nhiều thành công trong phạm vi chế tạo thiết bị,
cải tiến phương pháp đo và ứng dụng. Một trong những hành động gần đây
nhất là xây dựng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-
NMR), ba chiều (3D-NMR), bốn chiều (4D-NMR). Sự phát triển của
phương pháp 2D-NMR đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích cấu
trúc các phân tử phức tạp. Trước đây nhờ nâng cao cường độ từ trường nam
châm, chế tạo các máy cộng hưởng từ hạt nhân có tần số cao từ 300 đến 1000 MHz đã làm giảm nhẹ đi một số khó khăn cho việc phân tích phổ 1H-
NMR của các phân tử phức tạp, tuy nhiên trong nhiều trường hợp vẫn chưa
giải quyết được chính xác được cấu tạo của chất, ngày nay phương pháp
phổ 2D-NMR cho ta một lượng lớn thông tin, giúp cho việc phân tích phổ
một cách dễ dàng hơn, đặc biệt phổ 3D-NMR cho ph p xác định cấu trúc
các phân tử sinh học phức tạp.
8
Hình 1. 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều
Cơ sở của phương pháp 2D-NMR dựa theo phương pháp cộng
hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier do đó được gọi là phương pháp phổ
cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier hai chiều (2D-FT-NMR).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều COSY hay HHCOSY chỉ ra
sự tương tác của các proton ở hai nguyên tử C cạnh nhau.
Khi có hai nhóm proton tương tác với nhau sẽ tạo ra hình vuông, hai
đỉnh hình vuông nằm trên đường ch o, đó là vị trí hai tín hiệu của chúng
còn hai đỉnh khác nằm phía ngoài đường ch o.
Ví dụ phổ COSY của 2-clorobutan
CH3-CH2-CH(Cl)-CH3
9
Trên phổ thấy H-1(CH3, t) tương tác với H-3(m) tín hiệu của chúng
Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan
tạo thành hình vuông, H-2 (CH3, d) tương tác với H-4 (m) tín hiệu của
chúng cũng tạo thành hình vuông và H-3 tương tác với H-4 tương tự như
vậy.
1.2. Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [23]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp
suất cao (High - Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân
tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân
tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự
phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các hợp chất
không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thường được
hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành
phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC.
10
Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích
hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích
sinh dược nói riêng.
Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC
(1) Bình chứa pha ộng: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi
vào đầu bơm cao áp cho ph p chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng
một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng
một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được
pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình
rửa giải. Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh
khiết sử dụng cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha
hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa
chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên
các pic tạp trong quá trình phân tích.
(2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ
các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện
Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời
tượng có thể có như sau:
gian lưu của peak thay đổi.
11
Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết
được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh
hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC.
Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.
(3) Bơm cao p: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá
trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar
và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút.
(4) Bộ phận iêm mẫ : Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể
tích bơm có thể thay đồi. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ
công và tiêm mẫu tự động (autosamper).
(5) Cộ sắc ký: Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng th p
không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt
nhồi cỡ 0,3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký.
(6) Đầ dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy
theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dò phù
hợp. Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát
xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên cơ sở
đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau:
- Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360nm để phát hiện UV
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để
phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là loại đầu dò thông dụng nhất.
- Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh
quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.
- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng qu t chồng phổ để
định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
12
- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…
(7)Bộ phận ghi nhận ín hiệ : Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò
phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm
trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan
đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý
các thông số liên quan đến kết quả phân tích.
(8) In dữ liệ : Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy
in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh
vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược
phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng
phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo
và sản xuất thiết bị phân tích. Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích
nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân
tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư các hệ thống HPLC
hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân
tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex
(UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang
phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ
dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn
các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích
đồng thời nhiều mẫu.
13
1.3. Đặc iểm thực vật cây gừng gió
Hình 1.7. Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.)
Gừng gió là cây thảo mộc, cao 1 – 1,3 m. Thân rễ dạng củ, phân
nhánh, lúc non màu vàng và thơm, lúc già màu trắng và đắng, có mùi thơm.
Thân khí sinh khỏe, mọc đứng, nhẵn. Lá không cuống mọc thành 2 dãy,
hình mác thuôn dài, gốc hẹp dần, đầu nhọn, dài khoảng 20 cm, rộng 5cm
mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông rải rác. Bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy.
Cụm hoa dạng trứng, đôi khi hình trụ, kích thước 6 – 14 x 4 – 5 cm, chóp
tù, mọc từ thân rễ trên một cán mập dài 20 – 30 cm phủ bởi những lá bắc
xếp lớp; m p màu lục nhạt. Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy
hẹp màu trắng; một nhị; bao phấn dài hơn trung đới, cánh môi rộng màu
vàng nhạt. Các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía
lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ kích thước 1,6 x 0,7
cm; môi dài 5 cm. M p có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu
vàng nhạt; bầu 3 ô, quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen. Mùa hoa
nở từ tháng 7 đến tháng 9 [1,3,9,22].
1.4. Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.)
Trong Gừng gió có nhiều tinh dầu, dầu b o và nhựa dầu. Trong tinh
14
dầu có 13% các monoterpen và nhiều sesquiterpen, trong đó humulen 27%,
monocyclic, sesquiterpen, xeton, zerumbon 37,5%. Các monoterpen gồm
α - pinen, camphen, limonen, cineol, và camphor. Zerumbon là thành phần
chính của tinh dầu [22].
a)Thành phần hóa học của inh dầ củ Gừng gió
Tinh dầu cây Gừng gió chủ yếu tập trung ở bộ phận củ, tinh dầu củ
Gừng gió có mùi thơm nồng [9]. Tinh dầu củ Gừng gió mọc ở Trị Thiên và
Đắc Lắc – Việt Nam có các chỉ số hóa học được dẫn ra trong bảng 1.1 [9].
Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió
Vùng Chỉ số xà phòng hóa Chỉ số axit Chỉ số este
Bình Trị Thiên 8,9790 5,8796 3,0994
Đắc Lắc 8,5392 5,8769 2,6623
Thành phần hóa học chính của củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên –
Việt Nam cũng được chỉ ra trong bảng sau [9,13].
15
Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió
TT Tên chất Hàm TT Tên chất Hàm
lượn lượng
g (%) (%)
1 Zerumbon 72,3 17 Myrcren 0,2
2 α-Humulen 4,2 18 α-Terpineol 0,2
3 Humulen-oxit I 3,8 19 (E)-nerolidol 0,1
4 Humulen-oxit II 3,3 20 α-Phelandren 0,1
5 Camphen 3,1 21 β-Pinen 0,1
6 Caryophylen oxit 1,5 22 Terpinen-4-ol 0,1
7 Campho 1,2 23 Bornyl axetat 0,1
8 1,8-cineol 0,8 24 Camphenhidrat 0,1
9 α-pinen 0,7 25 p-Cymen 0,1
10 Limonen 0,4 26 Fenchon 0,1
11 Linalol 0,4 27 Isoborneol 0,1
12 12-Norcaryophylen-2-on 0,4 28 Sabinen 0,1
13 Β-Caryophylen 0,3 29 Terpinolen 0,1
14 Bornol 0,2 30 α-Thujen 0,1
15 δ-3-Caren 0,2 31 Tricyclen 0,1
16 β-Eudesmol 0,2 Các chất chưa 4,9
nhận biết được
b) Thành phần hóa học của inh dầ hân và l Gừng gió.
Tinh dầu thân, lá và hoa Gừng gió đều có màu vàng xanh nhạt, phảng
phất mùi thơm của tinh dầu hoa bưởi [9]. Có khoảng 40 hợp chất tìm thấy
trong tinh dầu thân, lá Gừng gió (chiếm hơn 84% và 82% tinh dầu). Năm
1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học
tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, kết quả được chỉ ra trong
bảng 1.3.
16
Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió
TT Tên chất Thân Gừng Lá Gừng
gió (%) gió (%)
1 α - thujen Vết Vết
2 α – pinen 1,1 1,6
3 Camphen 0,2 Vết
4 Sabinen 0,5 Vết
5 β - pinen 5,4 5,2
0,1 Vết
6 Myrcen 7 ∆3 – caren Vết 0,9
8 P – Cymen 0,1 0,5
9 1,8 – cineol 0,3 0,6
10 Linomen 0,1 0,3
11 (Z) – β - ocimen Vết Vết
12 (E) – β - ocimen 0,6 0,6
13 Linalol 1,1 2,4
14 2-metyl-6-metylen-1,7-octadien 0,5 1,0
15 Campho 0,3 1,2
16 Trans-pinocarverol 0,7 0,3
17 Isoborneol Vết Vết
18 Borneol 0,8 0,8
19 Terpinen-4-ol 0,8 0,6
20 Myrtenal - 0,3
21 α - terpineol 0,2 0,4
22 Myrtenol 0,2 0,5
23 2 – Undecanon 0,3 0,6
24 Dihidroedulan I 0,2 0,5
17
25 Dihidroedulan II 0,3 0,8
0,1 Vết
26 Myrtenyl axetat 27 10-(axetylmetyl) ∆3-caren 0,3 0,6
28 β-Caryophylen 10,4 11,2
29 Cis-α-Bergamoten 0,7 1,4
30 α-Humulen 2,5 2,9
31 Ar-Curcumen 0,1 0,1
32 β-Chamigren 3,6 0,4
33 (E,E)-α-farnesen 2,1 0,9
34 β-Bisabolnen 1,9 0,5
35 (Z)-Nerolidol 16,8 22,3
36 Caryophylen oxit 1,1 5,5
37 β-Eudesmol 1,6 0,6
38 Ledol 0,5 0,7
39 Zerumbon 21,3 2,4
40 2-Heptadecanon 0,8 0,9
41 Trans-phytol 7,0 12,6
15,5 17,7 Các chất chưa nhận biết được
c) Thành phần hóa học của inh dầ hoa Gừng gió [9,13].
Hơn 44 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió sinh
trưởng khu vực Huế (chiếm khoảng 85% tinh dầu) và được chỉ ra trong
bảng 1.4.
18
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế
TT Tên chất Hàm TT Tên chất Hàm
lượng lượng
(%) (%)
1 α-pinen 13,2 0,3 23 β-caryophylen
2 Camphen 1,4 0,1 24 Cis-α-bergamoten
3 Sabinen 1,9 Vết 25 α-humulen
4 β-pinen 1,3 0,4 26 (Z)-β-farnesen
5 Myrcen 0,1 0,1 27 Ar-curcumen
1,9 Vết 28 β-chamigren
6 α-phelandren 7 ∆3 – caren 2,1 0,6 29 (E,E)-α-farnesen
8 p-cymen 0,2 Vết 30 β-bisabolen
9 1,8-cineol 0,2 31 Β-sesquiphelandren 0,7
10 Limonen 0,3 32 Hotrienyl este 0,4
2,2 1,3 11 (E)-β-ocimen 33 Caryophylen oxit
0,6 4,7 12 Linalol 34 β-eudesmol
3,2 1,8 13 2-metyl-6-metylen- 35 Zerumbon
1,7-octadien
14 Campho 0,2 0,1 36 Myristic axit
15 Borneol 4,4 0,1 37 Palmitic axit
16 Tecpinen-4-ol 1,8 0,1 38 Trans-phytol
17 Geraniol 0,9 0,1 39 Linoleic axit
18 Undecanon 0,3 0,1 40 Oleic axit
19 Dihidroedulan I 0,7 0,2 41 Docosan
0,5 20 Dihidroedulan I 0,1 42 Tetracosan
21 2-undecanol 0,2 Các chất khác 15,0
22 α-copaen 0,1
19
Kết quả phân tích định lượng và nhận dạng các thành phần hóa học của
tinh dầu củ, thân, lá và hoa của cây Gừng gió (Zingiber Zerumbet Sm.) cho
thấy thành phần chủ yếu của các loại tinh dầu này là các sesquitecpen và dẫn
xuất chứa oxi của chúng được xây dựng trên hai khung cacbon cơ sở là
humulan và caryophylan. Trong tinh dầu củ chúng chiếm đến 83,6%, tinh dầu
của thân và lá có thêm dẫn xuất oxi của khung farnezan chiếm một lượng khá
lớn: trong thân là 16,8%, trong lá là 22,3%.
Mối liên hệ giữa 4 loại tinh dầu này dựa trên 3 thành phần: zerumbon,
humulen và caryophylen với tinh dầu của củ thì zerumbon là chủ yếu (72,3%),
humulen và humulen oxit là 11,3%, caryophylen chiếm 1,5%. Trong khi đó,
tinh dầu của hoa thì zerumbon là 3,2%, humulen là 1,9% nhưng caryophylen
lên đến 13,2%.
Ở các vùng lãnh thổ khác nhau thì các thành phần này cũng khác nhau,
ví dụ như tinh dầu củ Gừng gió Việt Nam vùng Bình Trị Thiên zerumbon
chiếm 72,3%, humulen chiếm 4,2%. Trong khi đó, tinh dầu củ Gừng gió
Philippin thì zerumbon chiếm 35,5% và humulen là 17,3%. Trong cây Gừng
gió thì hàm lượng tinh dầu trong củ là cao nhất. Vì trong tinh dầu của củ
Gừng gió zerumbon là thành phần có hàm lượng lớn nhất nên nói đến tinh dầu
Gừng gió là nói đến zerumbon và hàm lượng của nó là tiêu chuẩn để đánh giá
tinh dầu Gừng gió.
1.5. C c ặc ƣng của ze mbon
1.5.1. Phân lập và chuyển hóa zerumbon
Zerumbon là thành phần chính được phân lập từ củ Gừng gió lần đầu
tiên vào năm 1960 [11], được Damodaran.N.P và các cộng sự xác định cấu
trúc phân tử vào năm 1965. Hiện nay zerumbon đang được ứng dụng trong
lâm sàng làm thuốc điều trị ung thư ở giai đoạn III. Do đó việc phân tích cấu
trúc và xây dựng phương pháp hóa lý hiện đại để định lượng zerumon là rất có
ý nghĩa khoa học.
20
Zerumbon còn có tên là 8-oxohumulen, tên khoa học là (E,E,E)-
2,6,9,9-tetrametylcycloundeca-2,6,10-trien-1-on, được phân lập chủ yếu từ tinh dầu. Zermbon là tinh thể hình kim, nóng chảy ở 67-68oC và có nhiệt độ sôi (10 mmHg) là 165-167oC. Ngoài ra, zerumbon đã được phân lập từ các
cây: Syringa pinnafolta; Zingiber zerumbet và một số cây thuộc chi gừng.
Zerumbon là một xeton sesquitecpen đơn vòng, trong phân tử có nhóm
cacbonyl α,β không no, có ba liên kết đôi do đó khả năng chuyển hóa zerumbon
rất lớn: chuyển hóa ở các liên kết đôi (1, 2 hay cả 3 liên kết đôi) bằng các phản
ứng khác nhau như cộng hợp, oxi hóa, đồng phân hóa... Chuyển hóa nhóm
cacbonyl bằng cách khử hóa theo các mức độ khác nhau, như khử thành ancol,
khử thành metylen bằng các phương pháp khử khác nhau, bảo toàn và không
bảo toàn liên kết đôi. Chuyển hoá mở vòng thành các dẫn xuất oxi hay dẫn xuất
khác.
Zerumbon là một tác nhân chống ung thư [21], phòng ngừa ung thư [18],
chống viêm, kháng các vi sinh vật [17] và chống virut HIV [12]. Do đó, chuyển
hóa zerumbon còn nhằm tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt hơn
zerumbon và tìm ra nhóm chức sinh học của phân tử zerumbon cũng là một
hướng chuyển hóa rất được quan tâm: Khử hóa nhóm cacbonyl thành ancol để
nghiên cứu phản ứng tổng hợp bất đối xứng của zerumbol và xác định cấu hình
tuyệt đối của nó [15]. Cộng hợp vào liên kết đôi liên hợp α,β của nhóm
cacbonyl: các nghiên cứu cho thấy khi ở nhiệt độ phòng hay ở nhiệt độ
thấp hơn các amin bậc 1 và bậc 2 cộng hợp vào liên kết đôi α,β với nhóm
cacbonyl tạo ra các dẫn xuất amin của zerumbon [17].
21
1.5.2. Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbon
Như phần trên đã trình bày hàm lượng zerumbon trong củ Gừng gió
rất cao, đặc biệt trong tinh dầu (73,2%) [13]. Nó là thành phần chính quyết
định giá trị của tinh dầu Gừng gió cũng như cặn chiết của Gừng gió. Do đó,
nghiên cứu hoạt chất sinh học trong Gừng gió trước hết là nghiên cứu hoạt
tính sinh học của zerumbon.
Hoạt tính chống ung thư là hoạt tính nổi bật của zerumbon. Điều này
được Takahashi.S đề cập đến năm 1988 [16] và về sau có nhiều nghiên cứu
khẳng định điều này. Đặc biệt năm 2005, Huang.G.C và cộng sự nghiên
cứu tác dụng ức chế khối u của zerumbon trên tế bào P-388Dl invitro, invo
ở chuột và khẳng định ở nồng độ 5 mg/kg (thể trọng chuột) thì k o dài sự
sống của chuột một cách rõ rệt [14]. Zerumbon cũng ức chế sự phát triển tế
bào ung thư máu trắng dòng HL 60 ở người, ở các nồng độ 22,29; 9,12 và
2,27 µg/ml trong 6, 12 và 18 giờ, tùy theo phương thức điều trị [25].
Ngoài nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, người ta cũng rất quan
tâm nghiên cứu hoạt tính phòng ngừa ung thư và nhóm chức sinh học của
phân tử zerumbon. Đây là một hướng nghiên cứu mới phát triển đầu thế kỉ
này. Để khảo sát hoạt tính phòng ngừa ung thư Murakami.A và cộng sự đã
khảo sát hoạt tính ức chế của zerumbon đối với tác nhân gây ung thư TPA
(12-O-tetradecanoylphorbol-13-axetat) do hoạt động của virut Epstein-Barr
tạo ra. Kết quả cho thấy zerumbon là một tác nhân ức chế mạnh tác nhân
gây ung thư TPA (IC50 = 0,14 µM) [18].
Các nghiên cứu sâu hơn vai trò của nhóm cacbonyl α, β không no
trong phân tử zerumbon của Nakamura và cộng sự cho thấy zerumbon là
một tác nhân hóa học phòng ngừa (chemopreventive agent) chống lại các
bệnh ung thư ruột già và ung thư da nhờ nhóm cacbonyl α, β không no của
nó đã kích thích các enzym giải độc phase II của tế bào biểu mô nuôi cấy
trên chuột. Còn humulen và zerumbol không có các nhóm này nên không
thể hiện một tác dụng nào. Các tác giả còn cho rằng đặc tính ái điện tử của
22
nhóm cacbonyl α, β không no làm cho khả năng phản ứng ái nhân của các
protein sunfuryl tốt hơn ở vị trí nhóm cacbonyl này, nhất là các tiol có phân
tử lượng thấp. Đó là thực chất vai trò quan trọng của nhóm cacbonyl α,β
không no trong kích thích enzym giải độc phase II [20].
1.6. Mục tiêu của luận văn
Như đã phân tích ở trên zerumbone là một hoạt chất chính được phân
lập từ cây gừng gió có hoạt tính chống ung thư mạnh, hiện nay đang được
nghiên cứu ứng dụng trong lâm sàng giai đoạn 3 cho thử nghiệm làm thuốc
điều trị nhiều loại bệnh ung thư. Luận văn này tập trung vào việc phân tích
cấu trúc của zerumbone bằng các phương pháp phổ hiện đại và phương
pháp định lượng, xác định độ sạch của zerumbone bằng phương pháp
HPLC. Góp phần vào việc xây dựng các tiêu chuẩn cơ bản cho việc xác
định cấu trúc cũng như định lượng chất này.
23
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Phƣơng ph p nghiên cứu, nguyên liệu và thiết b
2.1.1. Phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp phân lập các hợp chất hữu cơ thiên nhiên được
thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ – Hóa dược – Trường Đại học
Khoa học – Đại học Thái Nguyên. Nhằm mục đích chuẩn bị các mẫu
nghiên cứu cho phân tích cấu trúc.
2.1.2. Hóa chất và dung môi
Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được
mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ). Silicagel cho sắc ký cột là
loại 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng
sẵn Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).
2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất
bằng sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính các chất và hỗn
hợp sản phẩm. Thông thường các chất có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và
sự phát quang khác nhau. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất
của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất
đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các
chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để
tinh chế các chất.
2.2 .4. Xác nhận cấu trúc
Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, luận văn tiến
hành các phương pháp sau:
a) Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy
Gallenkamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá
học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
24
b) Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR của các chất nghiên cứu được xác định trên máy FT-IR
Spectrum Two Perkinelmer L160 tại phòng Hóa dược – Viện Hóa học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu
được đo ở dạng p viên với KBr rắn.
c) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất
nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung
môi thích hợp và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc -
Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
d) Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett phổ
LC-LTQ Orbitrap XL của hãng Thermo Scientific tại Khoa Hóa học –
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Ch ẩn b mẫ ze mbon
2.2.1. Chuẩn bị mẫu gừng gió
Gừng gió được thu hoạch vào tháng 10 năm 2017 tại Hải Dương, được
xác định tên khoa học là Zingiber zerumbet Sm. Nguyên liệu tươi được rửa
sạch, loại bỏ phần hư hỏng, lấy khối lượng gừng là 1000g đem băm nhỏ thành
các mảnh kích thước khoảng 1 mm,.
2.2.2. Chưng cất tinh dầu gừng gió
Cho 1000g củ Gừng gió tươi đã được chuẩn bị ở trên vào nồi cất
cuốn hơi nước, cho tiếp dung dịch nước muối NaCl 15% đến ngập nguyên
liệu. Sau đó đem cất lấy dịch dầu-nước, cất cho tới khi dịch dầu-nước có
phản ứng âm tính với thuốc thử Bayers, mất khoảng 5h, thu được 6 lit dịch
dầu-nước. Lấy dịch dầu-nước bão hoà bằng NaCl tiếp theo chiết 5 lần bằng
toluen mỗi lần 100 ml. Gộp các dịch chiết này lại được 500 ml, làm khô
bằng Na2SO4 khan, sau đó đem loại dung môi ở áp suất thấp thu được 6,0
gam tinh dầu, là một hỗn hợp gồm chất lỏng màu vàng sáng ở phía trên và
25
tinh thể màu trắng ở phía dưới, hỗn hợp có mùi thơm dễ chịu. Hỗn hợp tinh
dầu được làm lạnh ba lần mỗi lần 24h và được lọc thu lấy tinh thể thô. Phần
tinh thể thô là chất rắn màu trắng có khối lượng 4,5g, có khoảng chảy 60- 68oC được ký hiệu là TDZ.
2.2.3. Phân lập zerumbon
* Chuẩn bị chạy cột sắc kí
Cột được dùng có khóa kín ở dưới, dài 60 cm, đường kính 3 cm. Rửa
sạch cột bằng hỗn hợp K2Cr2O7/H2SO4đặc, rửa lại bằng nước cất rồi tráng
axeton, sấy khô. Khóa cột phải được tra mỡ silicon để bảo đảm được xoay
chuyển dễ dàng.
* Nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt
Cân 80 g silicagel (cỡ hạt 0,040-0,063 mm của hãng Merck) hòa với
200 ml n-hexan trong cốc thủy tinh dung tích 500 ml. Khuấy đều cho đến
khi không còn bọt khí trong cốc. Mở khóa cột và cho hỗn hợp silica gel
trong dung môi n-hexan lên cột, dùng quả bóp cao su gõ nhẹ lên cột nhiều
lần cho đến khi không còn bọt khí trong cột thì mới tiến hành nhồi cột.
Không để cột bị khô và sau khi nhồi xong phải để ổn định cột 12 giờ.
* Tẩm mẫu
Cân 4 g TDZ hòa tan vừa hết bằng 20 ml n-hexan trong cốc 50 ml. Sau
đó, thêm từ từ và khuấy đến khi hết 4,5 g silica gel. Loại hết dung môi thu bột
silica gel đã tẩm TDZ.
* Tiến hành sắc kí cột
Mở khóa dưới cho dung môi n-hexan ra khỏi cột đến khi bề mặt dung
môi cách bề mặt silica gel 2 mm. Cho toàn bộ mẫu đã chuẩn bị lên cột. Bề
mặt của lớp silica gel tẩm mẫu phía trên và silica gel nhồi cột phía dưới, phải
được đảm bảo tạo thành một mặt phẳng ngang so với cột để trong quá trình
rửa giải chất xuống đều và cho hiệu quả phân tách cao. Rắc một lớp mỏng
silica gel lên trên, sau đó phủ một lớp bông thủy tinh để tránh các khuếch tán
ngược.
26
Tiến hành rửa giải với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat tỉ lệ 95/5, v/v,
tốc độ rửa giải là 20 giọt trên phút. Kết quả thu được 30 phân đoạn mỗi phân
đoạn chứa 5 ml. Phân đoạn chứa zerumbon được thu từ ống số 6 đến ống 25.
Loại dung môi ở áp suất thu được zerumbon sạch 3,6g.
1.3. Phân tích cấu trúc zerumbon bằng c c phƣơng ph p phổ
2.2.1 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR
Cân 2 mg zerumbone được trộn với 100 mg KBr trong cối mã não,
trộn đều và được nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối
mã não. Hỗn hợp này được đưa vào thiết bị p viên thủy lực 50 tấn của
hãng HP, sau đó mẫu được đo lần lượt trên trên máy FT-IR Spectrum Two
Perkinelmer L160 tại phòng Hóa dược – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
IR (KBr) cm-1: 3026; 2963; 2943; 2920; 2897; 2856; 1655; 1456;
1387; 1364; 1299; 1263; 1212; 1183; 1104; 964; 907; 847; 827; 780; 696.
2.2.2 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ MS
Lấy 1 mg zerumbon hòa tan trong 1 ml dung môi axetonnitrile tạo
thành dung dịch đồng nhất. Tiếp theo, lấy xi lanh bơm mẫu hút 1µ đung
dịch trên đưa vào máy khối phổ LTQ Orbitrap XL tại Khoa hóa học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. MS (m/z): 219 [M+H]+, 241 [M+Na]+. 2.2.3 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 1H-NMR
25 mg zerumbone ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes
NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và
lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất. Mẫu được
đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại
Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam với số lần scan là 16.
27
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 1,07 (3H, s, H-14); 1,20 (3H, s,
H-15); 1,54 (3H, J=1,5 Hz, H-13); 1,79 (3H, s, H-12); 1,90 (1H, d, J=12,5
Hz, H-8b); 2,19-2.25 (2H, m, H-4b, H-5b); 2,32-2,37 (2H, m, H-4a, H-8a);
2,41-2,46 (1H, H-5a); 2,23-2,56 (1H, m, H-3); 5,86 (1H, d, J=16,0 Hz, H-
10); 5,98 (1H, d, J=16,0 Hz, H-11); 6,02-6,03 (1H, m, H-7). 2.2.4 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 13C-NMR
25 mg zerumbone ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes
NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và
lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất. Mẫu được
đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại
Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học &
13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ ppm: 204,3 (C-1); 160,7 (C-10);
Công nghệ Việt Nam, với số lần scan là 256.
148,8 (C-3); 137,9 (C-2); 136,2 (C-6); 127,1 (C-11); 125,0 (C-7); 42,4 (C-
8); 39,4 (C-4); 37,8 (C-9); 29,4 (C-14); 24,4 (C-5); 24,2 (C-15); 15,2 (C-
13); 11,7 (C-12).
2.3 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ 2D (HSQC, HMBC,
NOESY)
35 mg zerumbone ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes
NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và
28
lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất. Mẫu được
đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại
Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học &
Công nghệ Việt Nam. Thời gian đo với HSQC là 3h, HMBC là 4h và
NOESY là 6h.
2.4 Phân ích ộ sạch của zerumbone bằng LC
Phân tích định lượng để xác định độ sạch của zerumbon bằng
phương pháp LC được thực hiện trên máy LTQ Orbitrap XL tại Khoa hóa
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Cân
2,5 mg mẫu phân tích được hòa trong MeOH sau đó lọc qua màng lọc 0,25
um sau đó tiêm vào hệ thống và phân tích với chương trình đo như sau:
- Pha động: axetylnitrin (A) và H2O chứa 0,1% focmic axit (B);
- Thể tích bơm: 3uL
- Tốc độ bơm 100uL/m
- Chương trình dung môi: 0-10 phút; 90% A và 10%B
- Detector: Iontrap, chế độ đo ESI ở cả mode âm và dương
- Pha tĩnh: cột Hypersil Gold C18, 5cmx 2,1mm x 1,9 um.
29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Mục tiêu của ề tài
Như đã nghiên cứu trong phần tổng quan, gừng gió là cây thuốc quen
thuộc của các dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc Việt Nam, là loài thực
vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước nhiệt đới nhất là tại
các nước Đông Nam Á. Kết quả nghiên cứu cho thấy zerumbone là thành
phần chính có hàm lượng rất cao (73,2% trong tinh dầu củ). Do có cấu trúc
phức tạp, hoạt tính sinh học mạnh nên được nhiều nhà khoa học quan tâm
nghiên cứu. Ngày nay, việc phân tích cấu trúc các hợp chất thiên nhiên
phức tạp trở nên thuận tiện hơn nhờ các kỹ thuật phân tích phổ phát triển.
Trong nội dung của luận văn này, chúng tôi tập trung phân tích cấu trúc
hóa học zerumbone bằng sự kết hợp nhiều phương pháp phổ hiện đại như
IR, MS, NMR 1D và 2D, đồng thời nghiên cứu xác định độ sạch của hợp
chất phân lập được bằng phương pháp LC.
3.2 Kết quả chuẩn b mẫu nghiên cứu
3.2.1 Phân tách tinh dầu
Mẫu gừng gió Zingiber zerumbet Sm. được thu hoạch vào tháng 10 năm
2017 tại Hải Dương. Nguyên liệu tươi được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng và
được băm nhỏ thành các mảnh kích thước khoảng 1 mm. Tinh dầu được tách
bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước theo công bố trong tài liệu
[22, 24]. Tinh dầu chưng cất được làm lạnh cho tới khi xuất hiện tinh thể
zerumbone thô kết tinh. Phần tinh thể là chất rắn màu trắng có khối lượng 4,5g, có điểm chảy 60-68oC được ký hiệu là TDZ.
3.2.2 Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu
Để có các mẫu zerumbone cho nghiên cứu phân tích cấu trúc, đề tài
tiến hành phân lập zerumbon từ tinh dầu gừng gió. Sắc ký lớp mỏng phần
rắn TDZ với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat 95/5 chúng tôi thu được 5
30
vệt chất (bảng 3.1) trong đó vệt Rf = 0,63 (hệ n-hexan:etylaxetat 95/5) có đ-
ường kính lớn nhất, màu sắc phổ đậm nhất.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát TDZ bằng SKLM
STT Th ốc hử ce i FeCl3 5% Rf
1 0,82 Xanh đen (-)
Xanh đen 2 0,63 (-)
3 0,47 Xanh đen (-)
4 0,32 Xanh đen (-)
5 0,17 Xanh đen (-)
(-): Không hiện màu, (+): Có hiện màu
Trong 5 vệt trên có vệt thứ 2 là vệt có ∆Rf giữa các vệt trên nó và
dưới nó rất lớn. Nên vệt chất đó là hoàn toàn có thể phân lập được khi sử
dụng sắc kí cột. Hơn nữa đây cũng là vệt chất chính vì nó có sắc phổ đậm
nhất, diện tích pic lớn nhất.
3.2.3 Phân tách zerumbone bằng sắc ký cột
Zerumbone được phân tách theo công bố trong tài liệu [22,24], với
silica gel cỡ 40-63 m; cột dài 60 cm đường kính 3 cm, tỷ lệ tinh dầu trên
chất hấp phụ silica gel là 1/40, nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt với
n-hexan rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat tỉ lệ 9,5/0,5
(v/v), với tốc độ là 20 giọt/phút, thu được 30 phân đoạn với thể tích mỗi
phân đoạn là 5 ml, khảo sát các phân đoạn này bằng SKLM với hệ dung
môi (n-hexan:etyl axetat 95:5) loại dung môi, thu được chất kết tinh màu
trắng đục.
Kết tinh lại nhiều lần n-hexan thu được tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy là 67±1oC. Tan tốt trong dung môi benzen và tan nhiều
trong n-hexan.
3.3 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR
Phổ hồng ngoại IR được ứng dụng rất rộng rãi trong phân tích cấu
trúc các hợp chất hữu cơ, phổ hồng ngoại cho ta thông tin quan trọng về
31
các nhóm chức hữu cơ, các kiểu liên kết có mặt trong phân tử hợp chất hữu
cơ. Hợp chất zerumbone sau khi được tinh chế, được mang xác định phổ IR
trên máy FT-IR Spectrum Two Perkinelmer L160 tại phòng Hóa dược –
Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, kết quả
thu được ở hình 3.1:
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất ze rumbon
Phổ IR của zerumbone xuất hiện tín hiệu hấp thụ tại 3026 cm-1 là đặc
trưng hấp thụ của dao động hóa trị C-H olefin. Tín hiệu hấp thụ trong vùng 2963; 2943; 2920; 2897 và 2856 cm-1 là đặc trưng dao động của liên kết C- H bão hòa. Tín hiệu hấp thụ tại 1655 cm-1 với cường độ mạnh chân rộng là
đặc trưng hấp thụ của nhóm α,β-cacbonyl. Tín hiệu dao động biến dạng trong vùng 1456; 1387; 1364; 1299 cm-1 là của các liên kết C-H bão hòa. Tín hiệu hấp thụ trong vùng 1263; 1212; 1183 và 1104 cm-1 là dao động
biến dạng của các liên kết C-O. Như vậy, với việc phân tích phổ IR cho
thấy xuất hiện đầy đủ các tín hiệu hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức
trên khung cấu trúc của zerumbone.
32
3.4 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ MS
Phổ khối lượng MS là phương pháp hiện đại dùng để phân tích cấu
trúc các hợp chất hữu cơ nhờ bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ bằng các
bức xạ có năng lượng cao như (electron, ion, lase...) để phân tử vỡ thành
các mảnh ion, sau đó ghi lại các mảnh ion, phân tích khối lượng các mảnh
này và tìm kiếm quy tắc phân mảnh để trả lời câu hỏi về cấu trúc. Tùy vào
phương pháp ion hóa mà chúng ta sẽ thu được các dữ liệu thông tin khác
nhau về cấu trúc. Tuy nhiên phổ MS đóng góp quan trọng vào việc đưa các
thông tin về khối lượng nguyên tử, công thức phân tử và tỷ lệ các thành
phần nguyên tố, đồng vị các thành phần nguyên tố có mặt trong phân tử
hợp chất hữu cơ.
Hợp chất zerumbone được phân tích phổ khối lượng trên máy LC-
LTQ Orbitrap XL của hãng Thermo Scientific tại Khoa Hóa học – Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Phân tử Tham 01
được bắn phá theo nguyên tắc phun hơi mù điện tử ESI.
Hình 3.2. Phổ MS của hợp chất zerumbone
33
Trên phổ MS của hợp chất zerumbone tìm thấy hai tín hiệu ion giả phân tử là [M+H]+ =241,155 tương ứng với có công thức phân tử là
C15H22O phù hợp với công thức phân tử của zerumbone.
3.5 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong số các
phương pháp rất quan trọng trong phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Từ dữ liệu của phổ 1H-NMR và 13C-NMR người ta có thể xây dựng được
khung cấu trúc, đây là thông tin quan trọng quyết định đến việc chứng
minh cấu trúc của các hợp chất. Cấu trúc của zerumbone phân lập được
phân tích bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Quy trình chuẩn bị mẫu
đo phổ NMR được tiến hành theo phương pháp của Hugo E. Gottlieb [25]
và được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất
chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm
Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của đầy đủ các
nguyên tử hiđro có mặt trên phân tử zerumbone, tín hiệu cộng hưởng
doublet của 1 proton tại 5,86 ppm với hằng số tương tác J=16,0 Hz được
gán cho vị trí H-10; tín hiệu cộng hưởng doublet tại 5,98 ppm với hằng số
tương tác J=16,0 Hz được quy gán cho vị trí H-11. Tín hiệu cộng hưởng
của 1 proton tại 6,02-6,03 ppm được quy gán cho vị trí H-7. Tín hiệu cộng
hưởng của proton trường thấp tại 5,23-2,26 ppm được gán cho vị trí H-3.
Vùng trường cao xuất hiện đặc trưng cộng hưởng của 4 nhóm proton của
metyl 1,07 ppm (3H, s) được gán cho vị trí H-14; tín hiệu cộng hưởng tại
1,20 ppm (3H, s) được gán cho vị trí H-15; tín hiệu cộng hưởng tại 1,54
ppm (3H, J=1,5 Hz) được gán cho vị trí H-13); tín hiệu cộng hưởng tại 1,79
(3H, s) được gán cho vị trí H-12. Các proton tại các vị trí H-4, H-5 và H-8
được tách tín hiệu trong từ trường, trong đó tín hiệu tại 1,90 ppm (1H, d,
J=12,5 Hz) được gán cho vị trí H-8b; tín hiệu cộng hưởng tại 2,19-2.25
ppm (2H, m) được gán cho hai vị trí H-4b và H-5b; tín hiệu tại 2,32-2,37
34
(2H, m) được gán cho vị trí H-4a và H-8b; tín hiệu cộng hưởng tại 2,41-
2,46 ppm được gán cho vị trí H-5a.
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone
Trên phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện đẩy đủ tín hiệu cộng hưởng
của 15 nguyên tử cacbon, trong đó tín hiệu của 4 nhóm metyl cộng hưởng
35
tại vùng trường cao 29,4 (C-14); 24,2 (C-15); 15,2 (C-13) và 11,7 (C-12).
Tín hiệu của 3 nhóm CH2 tín hiệu cộng hưởng tại 24,4 ppm được gán cho
vị trí C-5; tín hiệu cộng hưởng tại 42,4 ppm được gán cho vị trí C-8, tín
hiệu cộng hưởng tại 39,4 ppm được gán cho vị trí C-4.
Hình 3.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất zerumbone
Ngoài ra, trên DEPT-90 tại vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu cộng
hưởng của 4 nhóm CH, tín hiệu cộng hưởng tại 160,7 ppm được gán cho
vị trí C-10; tín hiệu cộng hưởng tại 148,8 ppm được gán cho vị trí C-3; tín
hiệu cộng hưởng tại 127,1 ppm được gán cho vị trí C-11; tín hiệu cộng
hưởng tại 125,0 ppm được gán cho vị trí C-7. Hai nguyên tử cacbon bậc IV
của olefin cộng hưởng tại 137,9 pm (C-2) và 136,2 ppm (C-6). Ngoài ra
trên phổ tìm thấy tín hiệu của nhóm cacbonyl cộng hưởng tại 204,3 ppm C-
1 và một cacbon bậc IV bão hòa cộng hưởng tại 37,8 ppm C-9.
36
Hình 3.6. Phổ DEPT của hợp chất zerumbone
Kết quả phân tích phổ NMR ở trên, kết hợp với dữ liệu phân tích phổ
MS, IR so sánh với các dữ liệu công bố trên các tài liệu [12, 13, 15, 17, 22
và 24] cho ph p khẳng định cấu trúc của hợp chất phân lập được là
zerumbone.
3.6 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC
Như đã phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR, kết hợp với các dữ liệu
IR, MS và các dữ liệu đã công bố cho ph p khẳng định cấu trúc của
zerumbone. Tuy nhiên để gán chính xác các tín hiệu cộng hưởng của các
proton và cacbon trên khung cấu trúc người ta phải gán chính xác các giá
trị cộng hưởng cho của các vị trí trên khung cấu trúc. Để gán được chính
xác các vị trí này người ta cần phải sử dụng các phổ hai chiều đề có cơ sở
khoa học. Phổ HSQC thể hiện tương tác trực tiếp của hydro với cacbon mà
nó liên kết trực tiếp.
37
Hình 3.7. Phổ HSQC giãn của hợp chất zerumbone
Từ các dữ liệu phân tích HSQC như trên chúng tôi có thể gắn các vị
trí của proton và cacbon như bảng sau
Bảng 3.2. Bảng dữ liệu phổ quy gán của zerumbone
Số ên
13C-NMR
1H-NMR
khung
C
Nhóm có
Độ
Số H
J (Hz)
H
bội
C – 1
204,3
C
C – 2
137,9
C
m
2,23 - 2,56
1H
C – 3
148,8
CH
m
C – 4
39,4
2,32 - 2,37
CH2
1Ha
δC (ppm) δH (ppm)
38
2,19 - 2,25
m
1Hb
2,41 - 2,46
1Ha
C – 5
24,4
CH2
2,19 - 2,55
m
1Hb
C – 6
136,2
C
C – 7
125,0
CH
6,02- 6,03
1H
m
2,32 - 2,37
m
1Ha
C – 8
42,4
CH2
d
12,5
1,9
1Hb
C – 9
37,8
C
C – 10
160,7
CH
1H
d
16,0
5,86
C - 11
127,4
CH
1H
d
16,0
5,98
C – 12
11,7
3H
s
1,79
CH3
C – 13
15,2
3H
1,5
1,54
CH3
C – 14
29,4
3H
s
1,07
CH3
C – 15
24,2
3H
s
1,20
CH3
Các giá trị gán HSQC ở trên được kiểm tra lại bằng phổ HMBC.
Trên phổ HMBC ta sẽ chỉ tìm thấy các tương tác của proton với cacbon các
nó từ hai đến ba liên kết. Kết quả phân tích phổ HMBC như sau:
39
Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất zerumbone
Hình 3.9. Phổ HMBC giãn của hợp chất zerumbone
Từ dữ liệu phân tích HMBC ở trên chúng ta tóm tắt một số tương tác
này như sau:
40
Hình 3.10. Một số tương tác của H với C trong HMBC
Cấu trúc này tiếp tục được khẳng định bằng các tương tác trên phổ
COSY. Trên phổ COSY, tìm thấy tương tác của các proton có không gian
gần nhau.
3.7 Phân ích ộ sạch của zerumbone bằng phƣơng ph p LC
Zerumbon được xác định độ sạch bằng thiết bị LC/MS/MS: LTQ
Orbitrap XL của hãng Thermo Scientific tại phòng thí nghiệm Hóa vật liệu,
Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà
Nội, sử dụng cột tách C18 (2,1x1,9x50,5 μm), Detector DAD, bước sóng
292nm. Pha động acetonitrile và dung dịch nước ammonium acetate 10
mM với tỷ lệ 70:30. Hợp chất zerumbone được tách ra từ tột sắc ký ở thời
gian lưu tR=2,18 phút, dữ liệu bắn phát khối phổ tại tìm thấy hai tín hiệu ion giả phân tử là [M+H]+ =241,20.
So sánh với đường chuẩn đã được xây dựng tại phòng thí nghiệm, để
tính hàm lượng zerumbon có trong mẫu.
41
Hình 3.11. Phổ LC và dữ liệu MS bắn phá đỉnh 2.18
Hình 3.12. Đường chuẩn LC của zerumbone
Độ sạch của mẫu được xác định bằng xây dựng đường chuẩn. y= 268489x + 99371 với R2= 0,9987
Với x là cơ sở mg chất cân ban đầu.
y là diện tích pic tương ứng
Từ đó ta tính được độ sạch là 99,6%.
Chứng tỏ zerumbon tách được có độ sạch cao
42
KẾT LUẬN
Luận văn đã sử dụng các phương pháp phù hợp để xây dựng được
quy trình xử lý mẫu thu được zerumbone sạch từ củ gừng gió.
Luận văn đã phân tích cấu trúc của hợp chất zerumbone bằng việc
vận dụng các phương pháp phổ hiện đại là IR, MS, NMR1D và NMR2D.
Luận văn đã vận dụng phương pháp phân tích LC/MS/MS xác định
được độ sạch của hợp chất zerumbone là 99,6%.
43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục Việt nam, Hà Nội.
2. Đặng Như Tại, Trần Quốc Sơn (1998), Hóa học hữu cơ, NXB Đại học
Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
3. Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ, tập 1, NXB
Giáo dục Việt nam, Hà Nội.
4. Nguyễn Đình Triệu (2007), Các phương pháp phổ trong hóa học hữu cơ
và hóa sinh, NXB Đại học Quốc gia Hà nội, Hà Nội.
5. Lê Kim Biên (2007), Thực vật chí Việt Nam – Họ Asteraceae, Nxb
Khoa học và Kỹ thuật, tập 7, tr 371-378.
6. Đỗ Huy Bích, Những cây thuốc và vị thuốc ở Việt Nam, tr 882-883,
NXB Khoa học và Kỹ Thuật (2004).
7. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, tr 536, NXB Y học (1997).
8. Võ Văn Chi, Từ điển thực vật thông dụng, tâp II, tr 2626-7 (2004).
9. Trịnh Đình Chính, Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu một số
cây thuộc họ Gừng (zingiberaceae) ở Việt Nam, Luận án PTS Khoa học và
Hóa học, Trường ĐH Sư phạm Hà Nội I (1995).
10. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, in lần thứ mười ba,
tr 368-369, NXB Y học Hà Nội (2005).
11. Buckingham J, Dictionary of Organic compounds, New York-London-
Toronto, Chapman and Hall, 5, pp 5763 (1982).
12. Dai.J.R.., Cadellina II.J.H.., Mc mahon.J.B.., and Boyd.M.R,
“zerumbone, an HIV-inhibitory and cytotoxic sesquiterpene of Zingiber
aromaticum and Z.zerumbet”, Natl. Prod. Letl, 10, pp 115-118 (1997).
13. Dung.N.X., Chinh.T.D.., Piet A.Leclereq, “Chemical investigation of
the acrial part of Zingiber zerumbet (L.) Sm. from Vietnam”. Jour. Essent.
Oil Res. ( USA), 7 (2), pp 153-157 (1995).
44
14. Huang.G.C.., Chien.T.Y., Chen.L.G.., Wang.C.C, “antitomor activity of
zerumbone from gingiber zerumbet in P-388D1 cells in vivo and in vitro”
Planta Med, 71(3), pp 219-224 (2005).
15. Kitayama.T., Nagao.R., Masuda.T., Hill.R.K., Takatani.M., Sawada.S.,
Okamoto.T, “Chemistry of Zerumbone IV Asymmetric synthesis of
Zerumbol” Journal of molecular catalyst B: Enzymatic,17, pp 75-79
(2002).
16. Kitayama.T.., Yamamoto.K., Usumi.R., Takatani.M., Hill.R.K..,
Kawai.Y., Sawada.S., Okamoto.T, ”Chemistry of zerumbone. 2. regulation of
Ring Bond Cleavage and Unique Antibacterial Activities of Zerumbone
derivatives” Biosci. Biotechnol. Biochem, 65 (10) 2193-2199 (2001).
17. Kitayama.T., Yokoi.T.T., Kawai..Y., Hill.R.K.Morita.M., Okamoto.T.,
Fokin.vv.Sharples.B., sawada.S, ”Chemistry of the zerumbone. Part 5: Structural
transformation of the dimethylamine derivatives” Tetrahedron, 59, pp 4857-4866
(2003).
18. Murakami.A, Takahashi.M., Jiwajinda.S., Koshimizu.K., Ohigashi
Indentification of zerumbon in zingiber zerumbet Smith as Potent inhibitor
of 12-O-tetradecnoylphorbol-13=acetate induced Epstein-Bar virus
activation Biosci Biotechnol Biochem. 63 (10) 1811-2 (1999).
19. Murakami.A., Takahashi.D., Kinoshita.T., Koshimizu.K., Kim.H.W.,
Yoshihiro.A., Kakamura.Y., Jiwajido.S., Terao.J., Ohigas.H , “Zerumbone, a
southest Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation,
proinflammatory protein production, and cancer cell proliferation accompanied by
apoptosis the alpha, beta-unsatureted carbonyl group is prerequisite”
Carcinogenesis, 35 (5), pp 795-802 (2002).
20. Nakamura.Y.., Yoshida.C., Murakami.A., Ohigashi.H., Osawa.T..,
Uchida.K “Zerumbone, a tropical ginger sesquiterpene, activates phase II
drugabolizing enzymes”, FEBS letters, 13, 572 (1-3): 245-250 (2004).
45
21. Takahashi.Set al, Japanese Journal of cancer and chemotherapy, 27, pp
70 (2002).
22. Phạm Thế Chính, Khóa luận tốt nghiệp đại học 2006, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
23. Trần Tử An (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, Bộ Y tế, Nxb Y học.
24. Văn Ngọc Hướng, Đỗ Thị Thanh Thúy, Phạm Thế Chính, Phân lập và
xác định cấu trúc một số thành phần từ củ gừng gió (Zingiber zerumbet
Sm.) vùng Tam Đảo, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 2006, 52-57.
25. Hugo E. Gottlieb,* Vadim Kotlyar, and Abraham Nudelman* J. Org.
Chem. 1997, 62, 7512-7515
46
PHỤ LỤC
1. Phụ lục 1: Phổ IR của Zerumbon .............................................................. 1
2. Phụ lục 2: Phổ MS của Zerumbon .......................................................... 2
3. Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của Zerumbon ............................................. 3
4. Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR của Zerumbon ................................................. 6
5. Phụ lục 5: Phổ DEPT của Zerumbon ........................................................ 9
6.Phụ lục 6: Phổ HSQC của Zerumbon ....................................................... 11
7. Phụ lục 7: Phổ HMBC của Zerumbon ..................................................... 14
8. Phụ lục 8: Phổ COSY của Zerumbon ...................................................... 19
