Luận văn thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano chitosan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN (cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là ñề tài nghiên cứu của tôi. Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kì công trình TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN

nào khác. Mọi sự giúp ñỡ và các thông tin trích dẫn ñã ñược nêu rõ nguồn

gốc.

Người thực hiện

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN

Töôûng Ngoïc Thuïc Uyeân

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

-PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người hướng dẫn khoa học trực tiếp, ñã

tận tình hướng dẫn phương pháp nghiên cứu và ñóng góp nhiều ý kiến quý

báu, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận

văn.

-Lãnh ñạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo

Phòng Sau ñại học, Khoa Khoa học tự nhiên -Công nghệ, Khoa Nông Lâm

nghiệp.

- Các Thầy Cô giáo ñã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức

quý báu trong quá trình học tập.

- Ban Giám hiệu Trường THPT chuyên Nguyễn Du.

- Các bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi

trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Trân trọng cảm ơn.

Người thực hiện

Tưởng Ngọc Thục Uyên

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………………….. i

LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………….. ii

MỤC LỤC .................................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................... v

DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………… vi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ......................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. x

PHẦN 1: MỞ ĐẦU ................................................................................... 1

1.1.Tính cấp thiết ..................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu ñề tài ................................................................................... 2

1.3.Ý nghĩa khoa học ................................................................................ 3

1.4.Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................ 3

1.5.Giới hạn ñề tài .................................................................................... 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU........................................................................4

2.1. Tổng quan về chitosan ………………………………………………. 4

2.2. Tổng quan về nano chitosan ............................................................ 6

2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan ................................. 6

2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học .......... 14

2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư...................................................................16

2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) .......... 17

2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa ................................................................... 17

2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing) ........................... 18

2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng ......................................................... 19

2.3.6. Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc .............................................. 19

2.3.7. Hoạt tính kháng khuẩn ……………………………………….. 21

2.3.8. Hoạt tính chống ñông máu của dẫn xuất sulfated chitosan ......... 27

2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin ................................................... 28

2.4. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus .............. 31

2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli .............................................................. 31

2.4.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus .................................................. 36

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 40

3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 40

3.1.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan ................................. 40

3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt

nano chitosan .......................................................................................... 40

3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 40

3.2.1. Hóa chất ........................................................................................ 40

3.2.2. Địa ñiểm nghiên cứu ..................................................................... 41

3.2.3. Thời gian thực hiện ....................................................................... 41

3.2.4. Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan ........... 41

3.2.5. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano

Chitosan ....................................................................................................................43

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 50

4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan ................................... 50

4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến kích thước

hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan .................................... 50

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS:TPP (w/w) ñến kích thước và

ñiện thế hạt nano chitosan ...................................................................... 56

4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .62

4..2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn .................................................................................. 62

4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn .................................................................................. 64

4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.............................................. 69

4.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả

năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan ............................................. 73

4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng

khuẩn của hạt nano chitosan .................................................................. 76

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 79

5.1. Kết luận ............................................................................................ 79

5.2 Kiến nghị ............................................................................................ 79

Chữ ciết tắt Nghĩa của các chữ viết tắt

Sắc kí lỏng cao áp HPLC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT Số thứ tự 1

MIC Nồng ñộ ức chế tối thiểu 2

DNA Deoxyribo nucleic acid 3

pDNA Plasmide deoxyribo nucleic acid 4

DEMC Diethylmethylchitosan 5

TPP Tri polyphosphate 6

PMAA Polymethacrylic axit 7

CS Chitosan 8

CMC Cacboxymethyl cellulose 9

CNP Chitosan nanoparticles 10

TEM Kính hiển vi ñiện tử truyền quang 11

SEM Kính hiển vi ñiện tử quyét 12

kDa Kilo Dalton 13

E.coli Escherichia coli 14

S.aureus Staphylococcus aureus 15

LMWC Khối lượng phân tử thấp 16

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế

và khả năng hấp phụ BSA 8

2.2. Tính chất vật lý của chitosan oligomer/CMC nanoparticles

hấp phụ với pDNA 11

2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng

dụng trong sinh y học 15

2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 24

2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn 25

2.6. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh

Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27

4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến tính

chất hạt nano chitosan 50

4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP ñến tính chất hạt nano

chitosan (Chitosan 30kDa) 56

4.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn

của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và

Staphylococcus aureus 62

4.4. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và

chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 65

4.5. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và

chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67

4.6. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng

viii

4.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 72

4.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74

4.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75

4.10. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 76

4.11. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 77

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang 4.1. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng

lượng phân tử 20 kDa 53

4.2. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng

lượng phân tử 30 kDa 54

4.3. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng

lượng phân tử 300 kDa 55

4.4. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan

với tỷ lệ CS:TPP là 3:1 57

4.5. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 4:1 58

4.6. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan

với tỷ lệ CS:TPP là 5:1 59

4.7. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 6:1 60

4.8. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 7:1 61

4.9. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

và Staphylococcus aureus 63

4.10. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan

trên vi khuẩn Escherichia coli 66

4.11. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan

trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67

4.12. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70

4.13. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 73

4.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn

của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74

4.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75

4.16. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 77

4.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 78

DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình ảnh Trang

2.1. Sơ ñồ phương pháp tạo hạt nanochitosan 7

2.2. Cơ chế tạo hạt chitosan nanoparticles với axit methacrylic 9

2.3. TEM của hạt nanoparticles CS-PMAA 10

2.4. Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp kết tủa 12

2.5. Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp sấy phun 13

2.6. Sơ ñồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha 14

2.7. Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) ñến tế

bào E.coli (Eaton,2008) 22

2.8. Cơ chế xâm nhập qua màng của chitosan mang vaccin

có kích thước nm khác nhau 29

2.9. Ảnh hưởng của các loại adjuvant lên ñáp ứng miễn dịch của

chuột với vaccin cúm H5N1 30

2.10. Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác ñến ñáp ứng miễn

dịch của chuột với vaccin H5N1 và hiệu giá kháng thể (HIU) 31

4.1. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân

tử là 20 kDa 53

4.2. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân

tử là 30 kDa 54

4.3. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân

tử là 300 kDa 55

4.4. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 3:1 57

4.5. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 4:1 58

xii

4.6. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 5:1 59

4.7. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP làà 6:1 60

4.8. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 7:1 61

xiii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN (cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2) TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1.Tính cấp thiết

Khoa học và công nghệ nano là một lĩnh vực mới trong những năm gần

ñây nhưng ñã và ñang phát triển nhanh chóng vì sự hiệu quả và những ứng

dụng rộng rãi của nó trong nhiều ngành như sinh y học, ñiện tử, vật lí, hóa

học. Vật liệu nano với kích thước nanomet siêu nhỏ ñã thể hiện nhiều tính

chất mới lạ do hiệu ứng kích thước. Hiện nay nhiều nước trên thế giới ñang

xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn ñể ñầu tư phát triển.

Việt Nam là nước ñang phát triển, vệ sinh an toàn thực phẩm ở mức rất

thấp và chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như: môi trường ô nhiễm dẫn ñến ô

nhiễm vào nông sản và vật nuôi, quy trình sản xuất và chế biến thực phẩm

còn nhỏ lẻ, không ñáp ứng ñiều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, hủ tục lạc

hậu trong ăn uống hoặc vì lợi nhuận mà sử dụng phụ gia, bảo quản ngoài

danh mục bộ y tế, kiểm soát thực phẩm qua biên giới và trên thị trường chưa

chặt chẽ...ñang gióng lên hồi chuông báo ñộng hơn bao giờ hết. Các thuốc

kích thích ở vật nuôi, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, melanin trong sữa và

nước mắm, 3-MCPD trong nước tương, urea, chlor, cloramphenicol, dipterex

trong thủy hải sản... , ñặc biệt thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn ñã gây ra

nhiều vụ ngộ ñộc tập thể, nguy hại cho sức khỏe của con người. Khái niệm

thực phẩm sạch ở Việt Nam vẫn là xa xỉ ñối với người dân, nhất là dân nghèo.

Để chống lại sự nhiễm khuẩn, hiện nay việc sử dụng chất kháng sinh là

giải pháp phổ biến ñể ñẩy lùi các bệnh dịch do vi khuẩn gây ra. Tuy nhiên

việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng có những mặt trái là: do chất kháng sinh

tính chọn lọc thấp nên dễ dẫn ñến hiện tượng các vi khuẩn có lợi cũng bị tiêu

diệt, gây ra trạng thái mất cân bằng khu hệ vi sinh vật, ñặc biệt việc sử dụng

rộng rãi các loại thuốc kháng sinh dễ dẫn ñến nguy cơ kháng thuốc của vi

khuẩn và xa hơn nữa là gia tăng tính nguy hiểm của các triệu chứng lâm sàng

tạo bởi các loài vi khuẩn. Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết ñặc ra hiện nay là

phải tìm một chất có khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mà không gây

ra hiện tượng nhờn thuốc, không phá vỡ trạng thái cân bằng khu hệ vi sinh

vật, không tác dụng phụ, không ñộc hại, không gây ô nhiễm môi trường.

Chitosan là một polisaccharide tự nhiên, là dẫn xuất từ quá trình khử

acetyl của chitin. Chitin là thành phần cấu trúc chính vỏ tôm, cua, là một

polimer sinh học có nhiều trong tự nhiên, ñặc biệt ở Việt Nam có bờ biển dài,

nhiều sông suối. Chitosan không ñộc, có khả năng tự phân hủy sinh học cao,

là chất ăn ñược. Chitosan mang ñiện tích dương, có ái lực cao với các axit

mang ñiện tích âm, tương tác với các thành phần polianion của vách tế bào vi

sinh vật, kết hợp DNA, gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn. Do ñó,

chitosan có tính kháng khuẩn, kháng nấm rộng, làm con người trẻ lâu, hoạt

hóa tế bào cơ thể, gia tăng khả năng miễn dịch, giải ñộc , bảo vệ gan trong cơ

thể. Đặc biệt hạt nano chitosan có kích thước nano, có nhiều ưu ñiểm như diện tích tiếp xúc và ñiện tích dương lớn hơn chitosan, do ñó có tiềm năng tăng cường hoạt tính sinh học, trong ñó có hoạt tính kháng khuẩn. Vì vậy,

việc nghiên cứu tạo hạt nano nhằm tăng cường tính kháng khuẩn của chitosan

ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là vấn ñề cấp thiết hiện nay. Ở Việt Nam,

Nguyễn Anh Dũng ñã sử dụng chế phẩm chitosan ñể ức chế sinh trưởng của

vi khuẩn Escherichia coli, nghiên cứu tạo hạt nano chitosan làm tá chất miễn

dịch cho vaccin cúm A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên ñộng vật.

Xuất phát từ ñó tôi ñã chọn ñề tài: “Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các

ñiều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano

chitosan”

1.2. Mục tiêu ñề tài

1.2.1. Xây dựng quy trình tạo hạt nano chitosan bằng tripolyphosphate (TPP).

1.2.2. Xác ñịnh các ñiều kiện tối ưu ñể nâng cao hiệu quả kháng khuẩn của

hạt nano chitosan.

1.3.Ý nghĩa khoa học

Tạo hạt nano chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn là hoàn

toàn mới tại Việt Nam.

1.4.Ý nghĩa thực tiễn

Thành công của ñề tài sẽ ñẩy nhanh việc sử dụng vật liệu nano chitosan

trong bảo quản, phòng chống nhiễm khuẩn ở thực phẩm ở Việt Nam. Đây là

vật liệu an toàn cho sức khỏe con người và phổ biến, giá thành hạ phù hợp với

ñiều kiện kinh tế của nhân dân.

1.5.Giới hạn ñề tài

Do thời gian có hạn, thiết bị, hóa chất hạn chế nên tôi chỉ tiến hành

nghiên cứu quy trình tạo hạt nano chitosan, bước ñầu thử nghiệm trên hai loại

vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus.

PHẦN 2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Tổng quan về chitosan

Chitin là thành phần cấu trúc nên vỏ côn trùng, tôm, cua, vách tế bào

nấm. Chitin có cấu tạo tương tự như cellulose, nhưng có khác biệt là ñơn vị

cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các ñơn vị này nối với nhau

bằng liên kết β-1,4-glycoside.

Công thức cấu tạo của chitin và chitosan

Tính chất, hoạt tính sinh học của chitin, chitosan phụ thuộc rất nhiều

vào khối lượng phân tử (Mw) và mức ñộ deacetyl hóa (DD: degree of

deacetylation).

Mức ñộ deacetyl hóa dùng ñể chỉ % số nhóm acetyl trong phân tử

chitin, chitosan bị khử. Mức ñộ deacetyl hóa tỷ lệ thuận với mật ñộ của nhóm + trong phân tử do ñó ảnh hưởng ñến tính chất ña ñiện phân và ñộ tan của NH3

chitin, chitosan. Chitin có mức ñộ deacetyl hóa trung bình nằm trong khoảng

10-15%. Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một phần (partially deacetyl chitin)

có mức ñộ deacetyl hóa từ 30-40%. Trong khi ñó chitosan phải có mức ñộ

deacetyl hóa > 50%, với mức ñộ deacetyl hóa này chitosan mới dễ tan trong

một số acid hữu cơ loãng như acetic, lactic. Mức ñộ deacetyl hóa ñược xác

ñịnh bằng nhiều phương pháp khác nhau như: IR spectrophotometry, sắc ký lọc gel, UV spectrophotometry, 1H NMR, 13C- NMR, phương pháp chuẩn ñộ

và HPLC theo Kumar (2000) [21].

Khối lượng phân tử của chitin, chitosan có thể xác ñịnh bằng HPLC.

Tuy nhiên phương pháp ñơn giản nhất, nhanh là ño ñộ nhớt, dựa vào các hằng

số α và K trong phương trình Mark – Houwink:

[η] = K.Mα = 1.81 x 10-3 M0.93.

Trong ñó: η là ñộ nhớt biểu kiến của chitin (intrisic viscosity) ; M: là

khối lượng phân tử.

Khối lượng phân tử trung bình của chitin biến ñộng từ 1.0 – 2.5 x106,

khối lượng phân tử của chitin sẽ giảm xuống khi mức ñộ deacetyl hóa tăng

lên.

Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y

dược, thực phẩm… nhờ vào những ñặc tính sau (Rinaudo, 2006)

- Tính chất ña ñiện ly mang ñiện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho

phép gắn kết với các thành phần sinh học mang ñiện tích âm.

- Có thể tái sinh theo các con ñường sinh học trên trái ñất.

- Có khả năng phân hủy sinh học bằng enzyme trong cơ thể.

- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào ñộng thực

vật.

- Có khả năng kích thích quá trình làm lành vết thương và ñông máu.

- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các receptor trên màng

- Giảm chlolesterol do liên kết có chọn lọc với các acid béo

- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thủy phân ñều là các chất chuyển

hoá tự nhiên.

- Không gây ñáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan ñộng vật.

- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hòa miễn dịch.

- Có thể sử dụng dưới nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt,

màng, tấm xốp (scaffolds), bông, sợi và gel [43].

2.2. Tổng quan về nano chitosan

2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan

Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet.

Chitosan nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng ñi qua màng tế

bào, diện tích và ñiện tích bề mặt cực lớn nên ñược ứng dụng nhiều trong sinh

y học mang thuốc, vaccine, trong công nghệ sinh học làm vector chuyển gen.

Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan. Theo Sulnin (2004)

5 phương pháp chủ yếu ñể tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch

nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt (coacervation)

trong NaOH-methanol, phương pháp sấy phun (dry spraying), phương pháp

tạo gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây

(sieving method). Trong ñó phổ biến nhất là phương pháp tạo hạt gel trong

tripolyphosphate[43].

2.2.1.1. Phương pháp tạo chitosan nanoparticles bằng liên kết cộng hóa trị

Ohya ñã nghiên cứu tạo nano chitosan ñể nhốt thuốc chống ung thư 5-

FU bằng cách cho dung dịch chitosan khâu mạch cộng hóa trị với

glutaraldehyde. Nhóm kép - CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –

NH2 của chitosan ñể khâu mạch (cross-linking) tạo nano chitosan. Phương

pháp này có ưu ñiểm là kích thước và tính chất hạt nano chitosan rất ổn ñịnh

[11].

2. 2.2.1.Phương pháp tạo gel ion

Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan ñiện tích

dương và TPP, polyacrylic acid, polyaspartic acid, plasmid DNA (pDNA)

mang ñiện tích âm.

Để tạo nano chitosan –TPP: Dung dịch chitosan ñược hỗn hợp với dung

dịch TPP và hỗn hợp ñược khuấy từ trong 10-60 phút sẽ thu ñược nano

chitosan. Có thể ly tâm 15.000 vòng /phút trong 1 giờ ñể thu ñược hạt nano

chitosan.

Hình 2.1. Sơ ñồ phương pháp tạo hạt nano chitosan

Quan Gan (2005) nghiên cứu tạo hạt nanon chitosan trong TPP với

nồng ñộ chitosan khác nhau, khối lượng phân tử chitosan khác nhau và tỷ lệ

chitosan/TPP khác nhau. Kết quả cho thấy khối lượng phân tử và nồng ñộ

chitosan càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan càng lớn [41].

Theo Quan Gan thì tỷ lệ chitosan/TPP càng lớn thì kích thước hạt nano

chitosan càng lớn. pH cũng có ảnh hưởng nhất ñịnh ñến kích thước hạt nano

chitosan, pH thích hợp nhất ñể tạo hạt nano chitosan là 5.5.

Quan Gan (2007) nghiên cứu tạo nano chitosan làm chất mang protein,

thuốc bằng phương pháp tạo hạt nano trong TPP. Kích thước hạt nano

chitosan cũng như ñiện tích của hạt nano chitosan phụ thuộc vào nồng ñộ và

khối lượng phân tử của chitosan. Nồng ñộ càng thấp thí kích thước hạt càng

nhỏ và ñiện tích càng dương lớn[42].

Bảng 2.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế và khả

năng hấp phụ BSA

Kích thước hạt Điện thế

(nm) (mV) Nồng ñộ

Không Phương phương Không Phương Phương chitosan

có pháp hợp pháp ủ có pháp hợp pháp ủ (mg/ml)

BSA nhất với với BSA nhất với với

BSA BSA BSA BSA

3,0 222,6 338,4 691,4 + 46,3 + 46,3 + 43,2

2,5 210,5 344,5 623,7 + 47,9 + 48,3 + 46,3

2,0 191,1 292,5 540,5 + 52,0 + 50,6 + 48,8

1,5 182,7 236,1 401,2 + 53,3 + 53,2 + 52,6

1.0 175,6 203,7 136,7 + 55,7 + 54,1 + 53,2

Điều kiện chuẩn bị hạt: Nồng ñộ BSA = 1,0mg/ml, tỷ lệ chitosan/TPP = 3:1, T=20 ± 10C, pH 5,5

Bao (2008) cũng nghiên cứu tạo nano chitosan –TPP. Nồng ñộ chitosan

sử dụng là 0.5-2 mg/ml. Kích thước hạt nano chitosan nằm trong khoảng 100-

300 nm[16].

Marcia (2008), nghiên cứu tạo nano chitosan sử dụng polymethacrylic

acid (PMAA) . Cơ chế của quá trình tạo hạt nano chitosan tương tự như với

TPP, theo sơ ñồ sau:

Chitosan nanoparticl

Hình 2.2. Cơ chế tạo hạt nano chitosan với acid methacrylic .

CS: Chitosan. PMAA (polymethacrylic acid).

Marcia cũng nghiên cứu ảnh hưởng của pH và tỷ lệ chitosan ñến kích

thước hạt nano chitosan. Kết quả nhận thấy pH trong khoảng từ 3-6 ít ảnh

hưởng ñến kích thước hạt nano CS-PMAA. Tuy nhiên, khi pH tăng >6 có sự

gia tăng ñột biến kích thước hạt nano CS-PMAA. Khác với phương pháp tạo

hạt nano chitosan –TPP, tỷ lệ CS càng cao thì kích thước hạt càng nhỏ trong

khoảng pH<6 và ngược lại. Kết quả này ñược minh chứng rõ ràng bằng hình

chụp TEM của hạt nano CS-PMAA. Kích thước hạt nano CS-PMAA biến

ñộng từ khoảng 20 nm – 140 nm ở pH <6 [31].

Hình 2.3. TEM của hạt nano CS-PMAA; a) CS 0.2%; b) CS 0.5%.

Nano chitosan cũng có thể thực hiện bằng cách tạo phức hợp

chitosan/pDNA nhờ khả năng tạo gel ion giữa DNA mang ñiện tích âm và

chitosan mang ñiện tích dương. Phương pháp này thường ñược ứng dụng

trong kỹ thuật chuyển gen, liệu pháp gen. Russell Mumper (2001) ñã công bố

sử dụng chitosan, chitosan oligomer phối hợp với carboxymethyl cellulose

(CMC) với tỷ lệ khác nhau có hấp phụ trên bề mặt pDNA ñể tạo nanoparticles

ứng dụng trong chuyển gen. Các thông số vật lý của chitosan oligomer/nano

CMC phủ pDNA cũng ñược xác ñịnh (bảng 2.2).

Yongli Zheng (2007) cũng nghiên cứu tạo nano bằng cách tạo phức hợp

giữa chitosan và polyaspartic dựa trên nguyên lý tạo gel ion. Kích thước hạt

nano chitosan ñạt từ 85-300 nm, sử dụng ñể thải chậm 5-FU trong ñiều trị ung

thư.

Zheng sử dụng chitosan (45 kDa và 230 kDa) và trimethylchitosan có

nồng ñộ 1mg/ml ở pH=5.6 sau ñó nhỏ vào dung dịch ñệm phosphate chứa 10

microgam pDNA (plasmide DNA). Kích thước hạt nano chitosan nhỏ hơn

200 nm [54].

Bảng 2.2.Tính chất vật lý của chitosan oligomer/nano CMC hấp phụ với

pDNA.

pDNA Kích thước Điện tích Hiệu suất hấp Tỷ lệ

nanoparticles phụ DNA chitosan/CMC (µg/ml) (mV)

(%) (w/w) (nm)

99.5 27 4:1 50 182 ± 3

99.9 21 100 300 ± 9

100.0 12 200 915 ± 171

96.1 -7 300 299 ±53

99.1 -25 400 178 ± 15

99.9 20 3:1 50 275 ± 11

100.0 16 100 949 ± 155

99.9 -2 200 225 ± 31

85.7 -24 300 134 ±12

99.1 -29 400 162 ± 8

2.2.1.3. Phương pháp tạo giọt coasecva (phương pháp kết tủa)

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong

dung dịch có pH kiềm tính. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva

ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có

thể là NaOH, NaOH-methanol hoặc ethandiamine. Dung dịch chitosan sẽ

ñược một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm ñể tạo hạt nano chitosan như

hình 2.4.

Hình 2.4. Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp kết tủa

Phương pháp này có thể ñược cải tiến hơn bằng cách nhỏ dung dịch

sodium sulfate vào dung dịch chitosan (pH acid) trong ñiều kiện khuấy nhẹ và

tác ñộng của sóng siêu âm (ultrasonic). Hạt nano chitosan thu bằng cách ly

tâm, sau ñó tiếp tục bước làm cho cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với

glutaraldehyde.

2.2.1.4. Phương pháp sấy phun (spray-drying)

Sấy phun là kỹ thuật thường ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm ñể

tạo bột, tạo hạt thực phẩm như sữa, tạo bột thuốc với tá dược. Kỹ thuật này

dựa trên nguyên tắc dung dịch huyền phù (suspension) ñược làm khô khi

ñược phun trong dòng không khí nóng.

Chitosan ñược hòa tan thành dung dịch, dược phẩm ñược hòa tan vào

dung dịch chitosan, sau ñó bổ sung hoạt chất khâu mạch (cross-liking agent)

và ñược phun vào dòng không khí nóng .

Hình 2.5. Sơ ñộ tạo hạt bằng phương pháp sấy phun

2.2.1.5. Phương pháp tạo mixel ngược pha (reverse micella )

Trong phương pháp này, các chất hoạt ñộng bề mặt (surfactant) ñược hóa

tan trong dung môi hữu cơ ñể tạo hệ mixel ngược pha. Sau ñó dung dịch

chitosan ñược thêm vào và ñược vortex ñể tránh bị ñục. Tiếp theo, dung dịch

chất khâu mạch ñược thêm vào. Quá trình khâu mạch ñược thực hiện qua ñêm

và khuấy ñều. Sau ñó cho bay hơi dung môi hữu cơ và chất hoạt ñộng bề mặt

cũng ñược kết tủa bằng muối, cuối cùng hỗn hợp ñược ly tâm và thu ñược hạt

nano chitosan như trong sơ ñồ 2.5.

Hình 2.6. Sơ ñồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha

Ngoài ra nano chitosan còn có thể ñược chuẩn bị khi phối hợp với

polyethylene glycon (PEG). Hoặc phủ bên ngoài một lớp alginate ñể tăng

hiệu quả của nano chitosan mang vaccin viêm gan B qua ñường uống. Kích

thước hạt nano chitosan nằm trong khoảng 100 nm.

2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học

Nhờ những ñặc tính ưu việt của chitin, chitosan là sản phẩm tự nhiên,

không ñộc, phân hủy sinh học, tương hợp sinh học cùng với các hoạt tính sinh

học của chúng như hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kích thích hoạt ñộng

của hệ thống miễn dịch dẫn ñến chitin, chitosan ñược ứng dụng rộng rãi trong

y dược học.

Đã có rất nhiều thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể xác nhận tính an toàn

của chitosan như: thử nghiệm khả năng gây ñột biến; khả năng gây ñộc cấp

tính, bán cấp tính và mãn tính; khả năng gây sốt, làm tan máu và gây dị ứng.

Bảng 2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng dụng trong

sinh y học (Rinaudo, 2006) [43].

Các ứng dụng trong sinh y học Tính chất của chitosan

Chỉ khâu trong phẫu thuật Tương hợp sinh học, phân hủy sinh

học

Cấy ghép trong nha khoa Tương hợp sinh học, phân hủy sinh

học

Da nhân tạo Kích thích tái sinh da mới

Tái tạo xương Khả năng tạo màng film

Kính áp tròng Tạo màng ưa nước trong suốt

(hydrogels)

Vật liệu ly giải chậm thuốc Không ñộc, tương hợp sinh học

Bao nang thuốc Kháng khuẩn, kháng nấm, phân hủy

sinh học

Số liệu ghi nhận trên thỏ, gà mái và gà giò khi ñược cho ăn chitosan với

liều lượng 0,7- 0,8g/kg khối lượng cơ thể/ngày trong 239 ngày là không có

triệu chứng bất thường nào. Khả năng tiêu hoá chitosan ở thỏ là 28- 38% còn

ở gà mái, gà giò là tiêu hóa hoàn toàn. Khi tiêm chitosan và các phân ñoạn

chitosan vào thỏ với liều lượng 4,5mg/kg khối lượng cơ thể/ ngày trong 7-11

ngày, không phát hiện ñược biểu hiện bất thường nào. Trong nghiên cứu kéo

dài 12 tuần trên người, không có triệu chứng lâm sàng nào ñược ghi nhận ở

những người uống chitosan trong so với những người uống thuốc giả. Chỉ có

2,6 – 5,4% ñối tượng có triệu chứng buồn nôn và táo bón tuy nhiên rất nhẹ và

tạm thời. Với tất cả các bằng chứng trên, việc ứng dụng các thuộc tính quý giá

của chitosan trong lĩnh vực y sinh là hoàn toàn hợp lý.

2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư

Chitosan oligomer kích thích ñại thực bào và cho hoạt tính chống ung

thư và ñược sử dụng trong công thức thực phẩm chức năng (Jeon, Shahidi, &

Kim, 2000),[15]. Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) 20 kDa ngăn

cản sự tiến triển của bệnh tiểu ñường và biểu hiện cấu trúc tương tự

lipopolysaccharid cao hơn chitosan Mw 140 kDa. Tác ñộng cầm máu và hoạt

tính chống ung thư (Malette & Quigley, 1984),[30]. Hoạt ñộng sinh lý mạnh

nhất ñược biểu hiện bởi oligosaccharide có ñộ dài chuỗi lớn hơn

pentasaccharide. Hexa-N-acetylchitohexaose [(GlcNAc)]6 có nhiều hứa hẹn

tăng cường hoạt ñộng của hệ thống miễn dịch và hoạt tính chống ung thư.

Hạt nano chitosan cũng ñang ñược nghiên cứu ñể chống ung thư hiệu

quả hơn. Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine ñể

ức chế khối u trên chuột. Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicine ñộc lập thì khối u ở chuột vẫn tăng lên 900 mm3 sau 50 ngày và chết, trong khi ñó ở thí

nghiệm ly giải chậm doxorubicine trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170 mm3 và chuột vẫn sống khi 90 ngày thí nghiệm [33].

L. Qi et al. (2004) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt

nanochitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và

hoạt tính cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S180 và

hepatoma H22. Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung

thư với liều uống 2.5 mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59%

và liều 0.5mg/kg là 43-53%, trong khi ñó chitosan chỉ là 30% [25].

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì

hiệu quả kháng ung thư càng cao. Kích thước hạt nano khoảng 350 nm. Hiệu

quả chống ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung

thư phổi ở chuột A549 ñồng thời làm giảm ñộc tính của thuốc chống ung thư.

2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity)

Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng giảm cholesterol và mỡ

trong máu của chitosan. Omrod (1998) thí nghiệm trên mô hình chuột quá dư

thừa cholesterol trong máu do thiếu apolipoprotein E ñược tiến hành trong 20

ngày. Mỗi ngày chuột thí nghiệm ñược ăn 5% chitosan trong khẩu phần thức

ăn còn lô ñối chứng thì không ñược cho ăn chitosan. Hàm lượng cholesterol

trong máu giảm ñáng kể sau 20 tuần, chỉ còn 64% so với lô ñối chứng. Ngoài

ra, khả năng ức chế xơ vữa ñộng mạch của chuột ñược ăn chitosan ở ñộng

mạch chủ là 42% và cung ñộng mạch chủ là 50%. Chuột ñược ăn chitosan

cũng lớn nhanh hơn rõ rệt [40] .Thí nghiệm này cũng mở ra khả năng ức chế

sự phát triển chứng xơ vữa ñộng mạch trong ñiều trị bệnh cho người quá dư

thừa hàm lương cholesterol trong máu.

Do lợi ích giảm nồng ñộ cholesterol trong huyết tương, ñóng vai trò

quan trọng trong sự giảm bớt và ñiều trị các bệnh tim mạch, chitosan ñã trở

thành một thành phần ăn kiêng hữu ích. Hoạt ñộng giảm cholesterol trong

máu của chitosan ñược giải thích là nhờ vào giảm hấp thụ cholesterol và sự

can thiệp và hấp thu acid mật, một cơ chế tương tự với chế ñộ ăn kiêng các

thành phần sợi. Hoạt ñộng giảm cholesterol của chitosan qua ñường uống

ñược báo cáo nhiều (Sugano, Watanabe, Kishi, Izumi, & Ohtakara, 1988)[46]

trong khi chitin, mặc dù biểu hiện sự tiết triglycerides trong phân cao hơn,

nhưng không biểu thị hoạt tính giảm cholesterol.

2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa

Xu hướng hiện nay sử dụng các phân tử chống oxi hóa có nguồn gốc tự

nhiên ngày càng tăng. Chúng thuộc lớp chitosan và một số dẫn xuất của

chúng, an toàn và không ñộc hại cung cấp sự bảo vệ từ các gốc tự do, vì vậy

làm chậm sự tiến triển của nhiều bệnh mãn tính. Được biết, tác ñộng chống

oxi hóa của chitosan khác nhau tùy vào trọng lượng phân tử và ñộ nhớt của

chúng (Kamil, Jeon, & Shahidi, 2002) [17]. Xử lý mẫu cá trích với chitosan,

tuy nhiên, cho thấy giá trị peroxide trong aldehyde dễ bay hơi thấp hơn mẫu

không xử lý. Chitosan ñộ nhớt thấp cho thấy có hiệu lực chống oxi hóa mạnh

nhất. Oligochitosan (Mw 1.3 và 3.5 kDa) ngăn chặn oxy hóa trong chuột .

Kanatt (2008) cũng sử dụng dẫn suất chitosan gắn glucose bằng phản

ứng Maillard trong bảo quản thực phẩm. Kết quả cho thấy phức hợp chitosan-

glucose (GCC: glucose chitosan complex) vừa có hoạt tính kháng khuẩn lại

vừa có hoạt tính chống oxy hóa và ñây là một phức hợp hứa hẹn làm chất bảo

quản thực phẩm [18].

2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing)

Chữa các vết thương là một quá trình thúc ñẩy nhanh chóng sự phục

hồi da và làm nhanh sự lành vết thương. Một màng chitosan có cấu trúc xốp

ñược thiết kế cho màng phủ chữa vết bỏng, vết thương. Màng chitosan có tác

dụng kiểm soát mất nước do bay hơi, ñảm bảo trao ñổi oxy cho da hô hấp và

thúc ñẩy khả năng thoát chất lỏng. Ngoài ra nhờ hoạt tính kháng khuẩn tự

nhiên của chitosan nên màng phủ chitosan có hiệu quả hạn chế sự xâm nhiễm

các vi sinh vật ngoại lai. Vết thương ñược bao phủ bởi màng chitosan có tác

dụng cầm máu và làm lành vết thương nhanh chóng. Thí nghiệm về mô bệnh

học ñã xác nhận sự tăng tỷ lệ phủ ñầy biểu mô cũng như tổ chức collagen

dưới lớp biểu bì. Vết thương chữa chitosan giảm sẹo do ức chế các sự hình

thành sợi trong vết thương và nó ñược cầm máu và hình thành lớp film bao

phủ bảo vệ. Là một cơ chất cho lysozyme, sản phẩm phân hủy chitosan ñược

hấp thu bên trong tế bào có tác dụng làm tăng hoạt tính ñại thực bào

macrophage.

Phức hợp Chitosan-alginate dạng màng cũng cho thấy khả năng lành

vết thương rất tốt. Hai dạng màng chitosan: Chit-LA và Chit –A A cho hiệu

quả tốt trong ñiều trị vết thương. Kết quả cho thấy vết thương lành hoàn toàn

và không hình thành sẹo. Màng phối hợp giữa chitosan và cellulose cũng là

một vật liệu chữa vết thương hiệu quả với ñặc tính kháng khuẩn cao. Chúng

có thể bảo vệ vết thương nhờ khả năng khử nước và chống nhiễm trùng .

2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng

Trong giải phẫu cấy ghép răng, quá trình phục hồi xương sử dụng vật

liệu ghép vào xương ñã trở nên cần thiết. Đối với thiết kế tái sinh tế bào

xương, một loạt các polymer chống ñỡ như chất nền collagen loại-1, chất nền

xốp poly-(lactide/gylcolide)/ hydroxyapatite 3-D polymer, chitosan ñã ñược

tổng hợp. Các kết quả cho thấy sự tạo ra xương nhân tạo sử dụng kỹ thuật mô

hình mô là một triển vọng ñể phục hồi mô xương. Lee (2002) kết quả một thử

nghiệm sơ lược in vitro ñề nghị rằng chitosan có tiềm năng biệt hóa tế bào

gốc tủy xương và thuận lợi hình thành xương[24]. Chitosan-tricalcium

phosphat xốp cũng hứa hẹn là một vật liệu chống ñỡ rất tốt cho cấy ghép vào

các vị trí phục hồi xương in vivo.

2.3.6. Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc

Hojo (2000) công bố gắn pentapeptide Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg có hoạt tính

kháng tế bào ung thư lên chitosan ñã hạn chế khả năng bị phân hủy bởi

enzyme tế bào thông qua cầu trung gian carbodiimide. Nghiên cứu tạo phức

hợp chitosan-(Gly)-Ala-Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr-Ac, cho thấy hoạt tính ức chế rõ

rệt trong thử nghiệm trên tế bào khối u phổi ác tính di căn B16-BL6 ở chuột.

Kết quả này cao hơn so với pentapeptide nguyên thủy YIGSR. Hoạt tính

chống khối u ñược tăng cường là nhờ phức hợp chitosan –petapeptide ñã bảo

vệ chống lại sự thủy phân của enzyme in vivo.

Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan ñể cố ñịnh thuốc

cyclosporin A ñể uống, kích thước hạt nano là 150nm. Kết quả cho thấy hiệu

suất mang thuốc là 94%, nồng ñộ cyclosporin A trong máu là 2760 ng/ml cao

gấp 2.5 lần so với sodium glycolate nanoparticles. Hoạt tính của cyclosporin

A cố ñịnh trong hạt nano chitosan tăng 72%, gelatin nanochitosan chỉ tăng

18%, riêng sodium glycholate lại giảm tới 36% so với ñối chứng [10].

Xinge Zhang (2008) công bố nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu

insulin qua niêm mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-hạt nano chitosan,

kích thước hạt nano là 150-300 nm. Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc

mũi thỏ ở mẫu PEG-hạt nano chitosan cao hơn so với PEG-chitosan là 30-

40%. Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bề mặt càng lớn và ñiện tích

dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnh hưởng ñến khả năng hấp thu

insulin vào máu qua niêm mạc mũi [52].

Shedaghi (2008) nghiên cứu chế tạo trimethyl hạt nano chitosan ñể làm

vật liệu ly giải chậm insulin. Kết quả cho thấy ñộng học ly giải của insulin

nhốt trong trimethyl hạt nano chitosan ổn ñịnh và kéo dài hơn [45].

Shadeghi (2008) nghiên cứu hấp phụ insulin trên vật liệu nano

chitosan, diethylmethyl nano chitosan nanoparticles (DEMC) và

trimethylchitosan nanoparticles (TMC). Kết quả về ñộng học ly giải chậm

insulin khá ổn ñịnh cho cả ba vật liệu nanoparticle [45].

2.3.7. Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó ñã nhận

ñược sự quan tâm ñáng kể trong những năm gần ñây. Cơ chế kháng khuẩn

của chitosan là nhờ một số cơ chế sau:

- Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần

polyanion vách tế bào (lipopolysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết

quả là sự rò rỉ thành phần nội bào do các thay ñổi trong tính thấm của hàng

rào (barrier); ngăn cản chất dinh dưỡng ñi vào tế bào; ngăn cản sự nhập vào tế

bào (ñặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp LMWC ).

- Chitoan có khả năng kết hợp với DNA và nhờ vậy chitosan có khả

năng ức chế tổng hợp RNA và protein.

- Chitosan có khả năng gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và

dẫn ñến giết chết tế bào.

Cơ chế tác ñộng của chitosan và chitosan oligomer ñối với E. coli và S.

aureus ñược Eaton (2008) nghiên cứu bằng kính hiển vi AFM (atomic force

microscope) như hình chụp dưới ñây. Kết quả thấy rằng sau 24h xử lý, tế bào

bị phá vỡ màng và thẩm thấu dịch tế bào ra ngoài môi trường [7].

Hình 2.7. Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) ñến tế bào

E.coli (Eaton, 2008)

Tharanathan(2004)[Chitosan cho thấy một phổ kháng khuẩn rộng

kháng lại cả nấm và vi khuẩn Gram dương và Gram âm [9].

Hong Kyoon No (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng

phân tử khác nhau của chitosan, chitosan oligomer ñến khả năng kháng khuẩn

trên 7 loại vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm. Kết quả thấy rằng

chitosan có khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan

oligomer có khối lượng phân tử thấp hơn. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương. Chỉ số MIC của

chitosan biến ñộng trong khoảng 0.05-0.1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử

và loại vi khuẩn. Hong Kyoon No cũng khẳng ñịnh rằng hoạt tính kháng

khuẩn của chitosan thể hiện tốt hơn ở môi trường pH thấp [12].

Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cứu khả năng kháng E.coli của

chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn với

salicylic aldehyde ñã làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần. MIC

của chitosan ñối với E. coli khoảng 250 ppm, oligoglucosamine khoảng 80-

100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) chỉ còn 30-40 ppm [3].

Muối ammonium bậc bốn của chitosan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

rất cao. Ví dụ: diethylmethylchitosan cloride thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

cao hơn chitosan. Hydroxypropyl chitosan ghép với acid maleic natri ức chế

hơn 99% vi khuẩn Staphylococcus aureus và E. coli trong 30 phút tiếp xúc

với nồng ñộ 100 ng/ml.

Avadi (2004) nghiên cứu chế tạo dẫn suất diethylmethylchitosan

(DEMC) ñể tăng khả năng hòa tan trong dung môi, nước và tăng tính kháng

khuẩn gấp hai lần so với chitosan không cải biến (bảng 2.5) [6].

Nguyen Anh Dzung, Phạm Quang Anh, Pham Anh Hong (2007)

nghiên cứu cải biến chitosan bằng cách gắn tạo nhánh chitosan với gốc ñường

glucose, glucosamine, trimethyl chitosan ñể tăng hoạt tính kháng khuẩn. Kết

quả ghi nhận trong bảng 2.6 [38].

Bảng 2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC

Môi trường Kiểm chứng (mẫu Chitosan DEMC

trắng)

MIC MBC MIC MBC MIC MBC

Nước cất - - - - 500 500

AcOH 0,25% khối 2500 2500 250 250 125 125

lượng

AcOH 0,5% khối 2500 2500 225 225 110 110

lượng

AcOH 0,75% khối 1250 1250 158 158 87,5 87,5

lượng

AcOH 1,00% khối 1250 1250 125 125 62,5 62,5

lượng

Bảng 2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn

MIC (ppm)

aeruginosa

MSSA MRSA E. faecalis E. coli Các dẫn suất

Chitosan 200 560 400 200 200

Oligosaccharide 200 600 480 200 200

Glucose chitosan 80 80 80 40 40

Glucose 100 180 140 100 100 oligosaccharide

Glucosamine 40 40 40 30 30 chitosan

Glucosamine 50 60 50 40 40 oligosaccharide

Trimethyl 10 20 20 5 10 chitosan

Trimethyl 100 140 120 100 120 oligosaccharide

Carboxymethyl 40 60 40 40 40 chitosan

Sun (2006) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của CMC (Carboxy methyl

chitosan) và QC (Quarterinized chitosan). Kết quả cho thấy chỉ số MIC của

CMC là 500ppm với E.coli và 1500 ppm với S. aureus; chỉ số MIC của QC là

125ppm với E.coli và 250ppm với S. aureus [47].

Tikhonov (2006) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

của chitosan khối lượng phân tử thấp (4,7 kDa) và chitosan cải biến. Kết quả

cho thấy chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn thấp. Ở

nồng ñộ 1% chitosan (4.7 kDa) tỷ lệ chết của E.coli chỉ là 91.6% [49].

Vật liệu hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và ñiện tích dương lớn

hơn chitosan thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so

với chitosan. Qi et al. (2005) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan ñể tăng

hoạt tính kháng khuẩn. Hạt nano chitosan ñược chuẩn bị bằng phương pháp

tạo gel trong tripolyphosphate (TPP), kích thước hạt khoảng 30-50nm. Các

thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên 4 loại vi khuẩn

E.coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan. MIC (nồng ñộ tối thiểu ức chế) của

hạt nano chitosan là 1/8-1/32 microgam/ml so với chitosan là 8-16

microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 1-4 microgam/ml [41].

Bảng 2.6. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh

Doxycycline và Chitosan nanoparticles

Vi khuẩn Doxycyline CNP CNP-Cu

MIC MBC MIC MBC MIC MBC

E. coli K88 1 8 1/8 4 1/16 2

E. coli ATCC 25922 2 16 1/16 2 1/16 2

S. choleraesuis ATCC 4 32 1/8 4 1/16 2

50020

S. typhinurium ATCC 4 64 ¼ 8 1/8 4

50013

8 1/8 4 S. aureus ATCC 2593 ¼ 8 ¼

CNP: chitosan nanoparticles, CNP-Cu: chitosan nanoparticles hấp thụ Cu

2.3.8. Hoạt tính chống ñông máu của dẫn xuất sulfated chitosan

Hiện tượng ñông máu liên quan ñến sự hoạt ñộng liên tiếp của một loạt

các enzyme serine proteinases, nhất là thrombin xúc tác sự chuyển ñổi

fibrinogen thành fibrin không tan. Khả năng của sulfated glycosaminoglycans

can thiệp vào quá trình ñông máu ñã ñược thử nghiệm lâm sàng rộng rãi và có

ý nghĩa thiết thực. Heparin, như là một tác nhân chống thrombin hiệu quả, ñã

sử dụng lâm sàng trong thời gian dài. Theo Doczi và Wolfrom (1953) công bố

so với heparin, chitosan sulfate có tiềm năng kháng ñông cao bằng khoảng

45% nhờ có cấu trúc hóa học tương tự heparin.

Sulfat hóa ñã ñược thực hiện bằng cách sử dụng axit chlorosulfonic

trong N, N-dimethylformamide ở nhiệt ñộ phòng ñể tránh phân hủy chitosan.

Không giống heparin, sulfated chitosan không thấy thể hiện hoạt tính chống

ñông máu, gây chảy máu quá mức ở bệnh nhân. Một mức ñộ sulfate hóa cao

hơn ñược thể hiện là có lợi cho sự kháng ñông, với sự ñánh giá thời gian

thrombin. Sự sắp xếp của nhóm sulfate ñược cho thấy có ảnh hưởng lớn quá

trình kháng ñông, ví dụ, nhóm C-6 sulfate ñã là một chìa khóa cần thiết, vì sự

desulfation của nó dẫn ñến mất hoạt tính. Sự thay ñổi hóa học của chitosan

sulfate cũng ñược quan tâm nghiên cứu bởi vì nó sẽ làm gia tăng sự giống

nhau về cấu trúc của chitosan sulfate và cấu trúc của heparin. Hoạt tính kháng

ñông của polysaccharides sulfate nói chung là kết quả từ sự tương tác giữa

các nhóm sulfate tích ñiện âm với chuỗi peptid tích ñiện dương. Nhóm

N-acetyl cũng cho thấy sự cải thiện hoạt tính kháng ñông.

2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin

Nhờ ñặc tính không ñộc, không gây phản ứng phụ, có khả năng kích

thích hệ thống miễn dịch của tế bào mà chitosan và ñặc biệt là hạt nano

chitosan ñược tập trung nghiên cứu làm tá chất cho vaccine. Maletter (1984)

[30] ñã chứng minh khả năng tăng cường hoạt ñộng của hệ thống miễn dịch

của một số dẫn suất chitin trong invivo. Maletter chỉ ra rằng chitin có mức ñộ

deacetyl hóa 70% kích thích miễn dịch trung gian tế bào và tăng cường hình

thành kháng thể ñặc hiệu trong thí nghiệm trên chuột và heo Guinea. Shibata

(1996) cũng công bố chứng minh các hạt chitin và chitosan có khả năng cảm

ứng tăng tổng hợp interferon gamma và ñại thực bào. Các tác giả cũng khẳng

ñịnh khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể phụ thuộc rất nhiều

vào mức ñộ deacetyl hóa, khối lượng phân tử và nhóm thế trên chitin,

chitosan.

Illum (2001) nghiên cứu cho thấy chitosan như là một tá chất mới cho

vaccin. Kết quả ñáp ứng miễn dịch ở lô thí nghiệm kháng nguyên cúm là rất thấp, chỉ số IgG chỉ là 102 trong khi ở tá chất chitosan là 103 ở lần chủng thứ

nhất. Ở lần nhắc hai, ñối chứng antigen là 102 và tá chất chitosan là 105

[13].Van der Lubben (2001) nghiên cứu sử dụng chitosan làm tá chất cho

vaccin qua niêm mạc mũi.

Hình 2.8. Cơ chế xâm nhập qua màng của chitosan mang vaccin có kích thước nm khác nhau (Van der Lubben ,2001)

Nhờ có kích thước nanomet và tích ñiện tích dương nên chitosan dễ dàng

ñi qua tế bào biểu mô vào trong tế bào và thải chậm vaccine ñể kích thích

miễn dịch. Do có khả năng thải chậm (slow release) nên ñáp ứng miễn dịch sẽ

kéo dài và ổn ñịnh hơn [53].

Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan ñể mang vaccin

tetanus qua niêm mạc mũi. Kích thước hạt nano là 350 nm, ñiện tích là +

40mV, có hiệu suất mang vaccin tetanus là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí

nghiệm sử dụng hạt nano chitosan cao gấp 5 lần so với sử dụng kháng

nguyên tetanus tự do sau 2 tuần, tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24

tuần. Kháng thể ñặc hiệu ở thí nghiệm sử dụng hạt nano chitosan cao hơn so

với ñối chứng gấp 2.5 lần và tăng lên theo thời gian từ 2-24 tuần [6].

Zaharoff (2007) công bố nghiên cứu cho thấy dung dịch chitosan tăng

cường ñáp ứng miễn dịch trung gian tế bào và miễn dịch dịch thể. Chitosan

làm tăng kháng thể ñặc hiệu kháng nguyên lên 4 lần so với ñối chứng và CD4

ñặc hiệu kháng nguyên lên 6 lần. So sánh với các tá chất (adjuvant) truyền

thống như Freund và hydroxyt nhôm thì chitosan làm tá chất tương ñương với

tá chất Freund và tốt hơn nhiều so với hydroxyt nhôm. Chitosan làm tăng số

lượng tế bào lympho trong hạch lympho lên 67% ở ngày thứ 14 sau tiêm. Đồng thời chitosan cũng làm tăng số lượng tế bào NK 1.1+ và CD 11b+ trong

hạch lympho. Trong mô hình thí nghiệm của Zaharoff chứng minh antigen

trong PBS chỉ tồn tại trong mô bào 3 giờ sau tiêm, trong khi ñó antigen hấp

phụ trên chitosan có thể duy trì tới hơn 7 ngày. Trong thời gian 7 ngày lượng

antigen ñược phóng thích khoảng 60%.

Le Van Hiep, Nguyen Anh Dung, Vo Thi Phuong Khanh (2008) nghiên

cứu sử dụng chitosan oligomer (dp=8-16) làm tá chất cho vaccin cúm A

H5N1. Kết quả cho thấy chitosan oligomer ñã kích thích ñáp ứng miễn dịch

sớm và tăng cường kháng thể ñặc hiệu cúm cúm A H5N1.

Hình 2.9. Ảnh hưởng của các loại adjuvant lên ñáp ứng miễn dịch của

chuột với vaccin cúm H5N1

Hình 2.10. Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác ñến ñáp ứng

miễn dịch của chuột với vaccin H5N1(a) và hiệu giá kháng thể (HIU) (b).

Nhóm 1: Đối chứng (kháng nguyên cúm A H5N1)

Nhóm 2: Hydroxyt nhôm + kháng nguyên cúm A H5N1.

Nhóm 3: Chitosan oligomer (1mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1.

Nhóm 4: Chitosan oligomer (2mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1.

Nhóm 5: Freund + kháng nguyên cúm A H5N1 [23].

2.3. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus

2.3.1 Vi khuẩn Escherichia coli

2.3.1.1. Giới thiệu chung

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli còn có tên là Bacterium colicommure,

Bacillus colicommunis ñược phân lập vào năm 1885 bởi Eschirich từ phân

của những trẻ em bị viêm ñường ruột, sống bình thường trong ruột người và

loài vật, nhiều nhất ở ruột già (vùng hồi manh tràng). Người ta nhận thấy rằng

Escherichia coli phát tán rất rộng lớn ở trong ruột của trẻ em, người lớn và

những ñộng vật có vú khác. Vi khuẩn thường theo phân ra ngoài thiên nhiên,

do ñó ta thường thấy trong nước, ñất, không khí. Vi khuẩn Escherichia coli

thường sống hội sinh với nhau, là những sinh vật có khả năng tiềm tàng gây

ra các bệnh về ñường ruột. Sự phân biệt giữa các ñộc tố của vi rút và các ñộc

tố vi khuẩn Escherichia coli ñược xác ñịnh bằng cách sử dụng phương pháp

phân loại huyết thanh. Phương pháp này lần ñầu tiên ñược ứng dụng ñể

nghiên cứu về dịch bệnh ñường ruột ở trẻ em và sau ñó ñược Kaufmann phát

triển thành một hệ thống huyết thanh là nền tảng cho việc nghiên cứu ngày

nay. Trong cuối những năm 1940, nhiều giống vi khuẩn Escherichia coli liên

quan ñến bệnh tiêu chảy ñã ñược nhận biết dựa trên cơ sở kháng nguyên O

soma của chúng, và sự phân chia các giống thành những loài vi khuẩn có khả

năng gây bệnh và sống hội sinh ñược hình thành .

Vai trò của vi khuẩn Escherichia coli nguyên nhân gây ra bệnh tiêu

chảy ngày càng ñược thừa nhận trên 25 năm qua. Những sự ảnh hưởng của

thú y này ñược mô tả một cách toàn diện gần ñây. Sự vận chuyển của vi

khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy qua ñường ñộng vật ñược xem là

chủ yếu. Nó là mối ñe doạ ñến sức khoẻ của con người do sự nhiễm bẩn của

thực phẩm hoặc là bằng cách tiếp xúc trực tiếp. Ngoài những bệnh về tiêu

chảy, các chủng vi khuẩn Escherichia coli còn thường gây ra các bệnh lây

nhiễm qua ñường nước tiểu và các bệnh về ruột thừa.

2.3.1.2. Đặc ñiểm vi sinh học

Năm 1885 Escherich phát hiện ra giống Esherichia. Theo phân loại của

Eving năm 1986, giống này thuộc bộ Escherichiae, họ Enterobacteriaceae,

loài ñiển hình là Escherichia coli. Giống Escherichia là một phần của bộ

Escherichiae,thuộc gia ñình vi khuẩn Entero – bacteriaceae và bao gồm có 5

loài. Các loài gồm là E.hermanii, E.fergusonii và E.vulneris tất cả những loài

này ñược tách ra từ các nguồn gốc khác nhau của cơ thể bao gồm cả ruột và

ruột thừa, loài E.blattae là loài chỉ ñược tách ra từ con gián. E.coli là loài lớn

nhất của giống này.

2.3.1.2.1.Hình thái

Vi khuẩn Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hình que. Kích thước

dài hay ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy, thường vào khoảng 1 ÷ 1,5 ìm ×

2 ÷6 ìm. Một số vi khuẩn di ñộng ñược nhờ tiên mao (lông roi ), một số lại

bất ñộng, một số có nang. Vi khuẩn không sinh bào tử.

2.3.1.2.2. Điều kiện nuôi cấy

Vi khuẩn Escherichia coli thuộc loại kị khí không bắt buộc. Nhiệt ñộ thích hợp nhất ñể phát triển là 37oC. Tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 15

÷40oC . Có nhiều nhóm vi khuẩn Escherichia coli có thể chịu ñược ở nhiệt ñộ cao 55oC khoảng 60 phút và thậm chí ñến 60oC khoảng 15 phút. pH phát

triển tối ưu của E.coli là 4,4.

Trong môi trường lỏng, sau 4-5h Escherichia coli làm ñục nhẹ môi trường,

càng ñể lâu ñục càng nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên bề mặt

môi trường. Để lâu vi khuẩn lắng xuống ñáy. Trên môi trường thạch thường

sau 18-24h tạo khuẩn lạc trơn, bờ ñều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ,

ñường kính 2-3 mm. Trên môi trường phân lập, vi khuẩn thường làm thay ñổi

màu của môi trường vì lên men ñường lactose. Khuẩn lạc có màu vàng trên

môi trường Istrati và màu ñỏ trên môi trường SS.

2.3.1.2.3. Đặc ñiểm trao ñổi chất

Escherichia coli sống ở ruột già của người và của ñộng vật, theo phân

người và gia súc ra thiên nhiên.

E.coli lên men ñược nhiều loại ñường glucose, lactose, sinh ra sản

phẩm của acid và hơi (ngoại trừ một số chủng EIEC không lên men ñường

lactose và không sinh hơi), có khả năng khử nitrate thành nitrite.

E.coli có enzyme trytophanase. Nếu trong môi trường có trytophan,

chúng sẽ phân giải trytophan thành indol.

Một số hoá chất ngăn chặn ñược sự phát triển của E.coli như Chlorine

và các dẫn xuất, muối mật, Brillant green, Sodium deoxycholate, Sodium

tetrathionate, Selenite …

2.3.1.2.4.Kháng nguyên

E.coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H. Dựa vào

công thức kháng nguyên O, K và H người ta phân biệt E.coli ñược chia thành

rất nhiều tuýp huyết thanh khác nhau.

Kháng nguyên O là kháng nguyên của thành tế bào. Cấu tạo bởi

lipopolysaccharit. Đặc tính của kháng nguyên O là :

- Chịu ñược nhiệt, không bị huỷ khi ñun nóng 100oC trong hai giờ.

- Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.

- Bị hủy bởi focmol 5%.

- Rất ñộc, chỉ cần 1/20mg ñủ giết chết chuột sau 24 giờ.

Kháng nguyên H ( kháng nguyên tiêu hao). Chúng ñược cấu tạo bởi

protein,có các tính chất sau :

- Không chịu nhiệt.

- Bị hủy bởi cồn 50%.

- Bị hủy bởi các protease.

- Không bị hủy bởi focmol 5%.

Kháng nguyên K ( kháng nguyên màng tế bào). Loại này chỉ có ở một

số vi khuẩn ñường ruột. Được cấu tạo bởi polysaccharit hoặc là protein.

Căn cứ vào kháng nguyên O, K, H người ta chia Escherichia coli thành

nhiều nhóm khác nhau:

- EPEC ( Enteropathogenic E.coli ) : gây bệnh ñường ruột, gây tiêu

chảy ở trẻ em vào mùa hè, gây dịch ở nhà trẻ, EPEC bám dính vào bề mặt tế

bào ruột, huỷ hoại tổ chức tại chổ.

- ETEC ( Enterotoxigenic E.coli ) : sinh ñộc tố ruột, gây tiêu chảy ở trẻ

em và người du lịch, có hai loại ñộc tố chính : không chịu nhiệt (LT) và chịu

nhiệt (ST).

- EIEC ( Enteroinvasive E.coli ) : E.coli xâm nhập ruột, thường gây ra

các vụ dịch do thực phẩm, giống như Shigella

- EHEC ( Enterohaemorrhagic E.coli ) : E.coli gây xuất huyết ñường

ruột, là bệnh viêm ñại tràng xuất huyết lây lan qua ñường ăn uống, gây hội

chứng tan máu, urê huyết cao, choáng (HUS), thường do E.coli O157:H7 gây

ra.

- EAggEC ( Enteroaggregative E.coli ) : E.coli bám dính ñường ruột

giống như nhóm EPEC.

Đây là những chủng vi khuẩn có liên quan ñến bệnh tiêu chảy ở người.

Những vi khuẩn này thường có trong những ñộng vật dùng ñể sản xuất thực

phẩm.

2.3.1.2.5.Khả năng gây bệnh

Khả năng gây bệnh rất ña dạng. Ở phụ nữ 90% trường hợp nhiễm

khuẩn ñường tiểu lần ñầu là do E.coli, khi ñó sẽ dẫn tới tiểu lắt nhắt, tiểu ñau,

tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Trong trường hợp cơ thể yếu, sức ñề kháng giảm

E.coli sẽ vào máu gây nhiễm khuẩn máu. E.coli có thể gây viêm màng não

(khoảng 40% viêm màng não ở trẻ sơ sinh). Phần lớn các vụ tiêu chảy là do

E.coli gây ra. Những biểu hiện lâm sàng do nhiễm khẩn E.coli tùy thuộc vào

vị trí mà vi khuẩn xâm nhập, thường thấy nhất là :

Nhiễm khuẩn ñường tiểu :

Khoảng 90% trường hợp nhiễm khuẩn ñường tiểu lần ñầu ở phụ nữ là do

E.coli, với các triệu chứng : tiểu lắt nhắt, tiểu ñau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Có

thể ñưa tới nhiễm khuẩn bọng ñái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn

huyết.

Nhiễm khuẩn huyết :

Khi sức ñề kháng của cơ thể giảm , vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn

máu. Gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn ñường tiểu .

Viêm màng não

E.coli và Streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng ñầu gây

viêm màng não ở trẻ em . Vi khuẩn E.coli chiếm khoảng 40% trường hợp gây

viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong ñó 75% E.coli có kháng nguyên K1.

Nguyên nhân tại sao ñộc tính của vi khuẩn lại liên hệ với kháng nguyên K1

thì chưa rõ.

Tiêu chảy

Trước ñây E.coli ñược xem là những vi khuẩn thường trú ở trong ruột

người và ñộng vật, gây tiêu chảy nhưng ít ñược ñề cập ñến. Nhưng cùng với

những tiến bộ của kỹ thuật xét nghiệm, càng ngày người ta càng phát hiện ra

nhiều chủng E.coli gây tiêu chảy. Ngày nay, E.coli ñược xem là một trong

những nguyên nhân hàng ñầu gây tiêu chảy ñặc biệt là ở trẻ em. Bệnh gặp

khắp nơi trên thế giới ở các nước phát triển lẫn ñang phát triển.

2.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.3.2.1. Giới thiệu chung

Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây bệnh thường hay gặp nhất,

nó có vai trò và ý nghĩa ñối với y học, khoảng 30% người khỏe mạnh mang vi

khuẩn này ở trên da và trên niêm mạc, khi có những tổn thương ở da và niêm

mạc hoặc những rối loạn về chức năng thí các nhiễm trùng do Staphylococcus

aureus dễ dàng xuất hiện. Staphyloccocus aureus cũng gây nên các nhiễm

trùng ở loài gia súc nhất là trong những cơ sở chăn nuôi tập trung có mật ñộ

ñàn gia súc lớn gây thiệt hại ñáng kể về kinh tế. Những nhiễm trùng do

Staphylococcus aureus có thể gây nên nhiều biểu hiện khác nhau, như các

nhiễm trùng của da, của các tổ chức dưới da hoặc trong các cơ quan nội tạng,

gây mưng mủ ñiển hình, một số trường hợp chuyển sang chứng huyết nhiễm

trùng, chứng bại huyết. Staphylococcus aureus còn có khả năng hình thành

ñộc tố trong thực phẩm, do ñó nó có thể gây nên chứng nhiễm ñộc.

2.3.2.2. Đặc ñiểm vi sinh học

2.3.2.2.1. Đặc ñiểm hình thái

Staphylococcus aureus là một trong ba loại thuộc giống tụ cầu khuẩn,

ñường kính 0.7-1µm, không di ñộng, không sinh nha bào và thường không có

vỏ, không có lông. Khi nhuộm phương pháp Gram thì vi khuẩn bắt màu Gram

dương.

2.3.2.2.2. Đặc ñiểm nuôi cấy

Staphylococcus aureus sống hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, nhiệt ñộ thích hợp 32-370C, pH thích hợp từ 5.5-7.6. Dễ mọc trên các môi trường nuôi

cấy thông thường, sinh sắc tố trên môi trường nuôi cấy. Chịu ñược nồng ñộ

muối 12% và nồng ñộ ñường 50%.

Môi trường nước thịt (bổ sung NaCl 0.5%) hay môi trường nước mắm

( ñộ ñạm cao) và pepton : sau khi cấy 5-6h, vi khuẩn ñã làm ñục môi trường,

sau 24h môi trường ñục rõ ràng hơn, lắng cặn nhiều, không có màng.

Môi trường thạch thường : sau khi nuôi cấy khỏang 24h, vi khuẩn hình

thành khuẩn lạc tương ñối to dạng S (Smouth), mặt khuẩn lạc hơi ướt, bờ ñều

nhẵn, khuẩn lạc Staphyloccocus aureus có màu vàng thẫm.

Môi trường thạch màu: vi khuẩn mọc rất mạnh sau khi cấy 24h, vi

khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S.

2.3.2.2.3. Đặc tính sinh hóa

Staphylococcus aureus có khả năng chuyển hóa ñường glucose,

lactose, saccarose, mannit, levulose và phản ứng coagulase dương tính, phản

ứng catalase dương tính.

Sức ñề kháng Staphylococcus aureus có sức ñề kháng kém ñối với nhiệt ñộ và hóa chất : ở 700C chết trong 1h, 800C chết trong 10-30 phút, 1000C chết

trong vài phút.

Acid phenic 3-5% diệt vi khuẩn trong 3-5 phút. Focmol 1% diệt vi

khuẩn trong 1h. Ở nơi khô hanh và ñóng băng vi khuẩn có sức ñề kháng tốt.

Ở nơi khô ráo vi khuẩn sống ñược trên 200 ngày.

2.3.2.2.4.Cấu tạo kháng nguyên

Dựa vào phương pháp miễn dịch người ta phân tích ñược các loại

kháng nguyên:

- Một kháng nguyên polysaccarid ở vách là một phức hợp mucopeptid-

acid teichoic. Kháng nguyên này khi gặp kháng thể tương ứng sẽ gây nên

phản ứng ngưng kết.

- Một kháng nguyên protein hay protein A là thành phần ở vách và ở

phía ngoài

2.3.2.2.5.Độc tố

Độc tố dung huyết (Haemolyzin) có 4 loại chính: - Dung huyết tố anpha: gây dung giải hồng cầu thỏ ở 370C. Dung huyết

tố này cũng gây hoại tử da và gây chết. Đây là một ngoại ñộc tố, bản chất là

protein, bền với nhiệt ñộ. Là một kháng nguyên hoàn toàn, gây hình thành

kháng thể kết tủa và kháng thể trung hòa dưới tác dụng focmol và nhiệt ñộ nó

biến thành giải ñộc tố có thể là vaccine. - Dung huyết tố beta: gây dung giải hồng cầu cừu ở 40C, dung huyết tố

này kém ñộc hơn dung huyết tố anpha.

- Dung huyết tố denta: gây dung giải hồng cầu người, thỏ, cừu, ngựa và

gây hoại tử da.

- Dung huyết tố gamma: khác với các loại trên, loại này không tác ñộng

lên hồng cầu ngựa.

Trong các loại dung huyết tố trên thì dung huyết tố anpha là ñặc ñiểm cần

thiết của các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh.

Nhân tố diệt bạch cầu (Leucocidin): Dưới tác ñộng của nhân tố này,

bạch cầu mất tính di ñộng, mất hạt và nhân bị phá hủy, nó giữ vai trò quan

trọng trong cơ chế sinh bệnh của tụ cầu.

Độc tố ruột (Enterotoxin)

Gây bệnh ñường tiêu hóa : nhiễm ñộc do thức ăn, viêm ruột cấp. Độc

tố ruột có 4 loại : trong ñó có 2 loại ñã biết.

- Độc tố ruột A : tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm

ñộc thức ăn.

- Độc tố ruột B : tạo ra do một chủng phân lập trong các bệnh nhân

viêm ruột.

Độc tố ruột là những ngoại ñộc tố, ñộc tố bền với nhiệt (phá hủy ñộc tố ở 1200C trong 20 phút), cồn, acid và không bị phá hủy bởi dịch vị.

2.3.2.2.6.Tính gây bệnh

Staphylococcus aureus kí sinh trên da, niêm mạc của người và gia súc. Khi

sức ñề kháng của cơ thể kém, hoặc tổ chức bị tổn thương thì vi khuẩn xâm

nhập và gây bệnh. Vi khuẩn có thể gây những ổ mủ ở ngoài da-niêm mạc.

Một số trường hợp vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, huyết nhiễm

mủ. Ngoài ra, ở người còn thấy ñộc tố ruột do vi khuẩn tiết ra gây nên nhiễm

ñộc thức ăn và viêm ruột cấp tính.

Về mức ñộ cảm nhiễm: ở gia súc, ngựa cảm nhiễm nhất rồi ñến chó,

bò, lợn, cừu. Gà, vịt ít cảm nhiễm, người dễ cảm nhiễm với tụ cầu.

PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung nghiên cứu

3.1.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến kích

thước hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo

gel với TPP.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ chitosan và TPP ñến kích thước hạt,

ñiện tích và tính ổn ñịnh của hạt nano chitosan

3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano

chitosan

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ hạt nano chitosan ñến khả năng

kháng khuẩn.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan ñến

khả năng kháng khuẩn.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP hạt nano chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng

khuẩn của hạt nano chitosan.

3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Hóa chất

- Chitosan trọng lượng phân tử khác nhau: 20 kDa (DD 85%), 30 kDa (DD

85%), 300 kDa (DD 80%) sản phẩm của Keumho Chemical Products Co.,

Ltd, Hàn Quốc.

- TPP (Tripolyphosphate) : Na5P3O1 (M = 367,86 g/mol) K28313999122

Merck (Đức).

- NaOH là hóa chất tinh khiết.

- Acid acetic: CH3COOH (M= 60,05 g/mol) 99,8 %, K3823463 750 Merck

(Đức)

- Nước khử ion.

- Vi khuẩn Escherichia coli và vi khuẩn Staphylococcus aureus từ Viện vệ

sinh dịch tể Tây Nguyên.

+ Máy móc và thiết bị: máy li tâm, máy khấy, kính hiển vi ñiện tử

truyền quang (Transmission electronic microscope, TEM) JEOL, JEM 1400,

Nhật Bản.

3.2.2. Địa ñiểm nghiên cứu

-Phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học

Tây Nguyên, Thành phố Buôn Ma Thuột.

-Chụp ảnh TEM Tại Trường Đại học Bách Khoa, Thành phố Hồ Chí

Minh

3.2.3. Thời gian thực hiện

Từ tháng 10/2009 ñến tháng 6/2010.

3.2.4. Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan

3.2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến kích

thước hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan bằng phương pháp

tạo gel với TPP.

-Nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến

kích thước hạt nano chitosan và ñiện thế hạt. Khối lượng phân tử chitosan là

20 kDa , 30 kDa và 300 kDa .

- Chitosan có các khối lượng phân tử khác nhau 20kDa, 30 kDa và 300

kDa ñược pha với nồng ñộ 0,2% (w/v) trong dung dịch acid acetic 0.35%, sau

khi hòa tan chitosan, dung dịch ñược ñiều chỉnh pH ñến 5.5 bằng NaOH 1M.

- TPP ñược pha với nồng ñộ 0,5% (w/v) trong nước khử ion.

- Hạt nano ñược tạo bằng cách nhỏ dung dịch TPP vào dung dich chitosan

với tỷ lệ Chitosan: TPP là 5:1 (w/w) trong ñiều kiện khuấy từ 900 rpm, thời

gian phản ứng là 60 phút ở nhiệt ñộ phòng. Sau ñó lấy dung dịch hạt nano

chitosan ly tâm với tốc ñộ 12.000 vòng/phút trong 60 phút thu cặn. Rửa cặn lặp lại hai lần bằng nước khử ion rồi ñông khô. Mẫu ñược bảo quản ở 50C

trong tủ lạnh.

+ Các chỉ tiêu theo dõi

- Kích thước trung bình hạt nano chitosan (nm).

- Phân bố kích thước hạt (nm).

- Điện thế hạt nano chitosan (mV).

+Phương pháp ño:

Hạt nano chitosan ñược chụp và xác ñịnh kích thước, phân bố kích thước

bằng kính hiển vi ñiện tử truyền quang (Transmission electronic microscope,

TEM) JEOL, JEM 1400, Nhật Bản. Phân bố kích thước hạt nano chitosan

ñược xác ñịnh bằng cách ño kích thước ngẫu nhiên của 50 hạt nano chitosan.

3.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ chitosan và TPP ñến kích thước

hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan.

- Nội dung này nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan: TPP ñến kích

thước và ñiện thế hạt nano chitosan, với mục ñích tìm ra tỷ lệ thích hợp nhất

và hoàn thiện qui trình tối ưu tạo hạt nano chitosan trong ñiều kiện Việt Nam.

-Dung dịch chitosan nồng ñộ 0,2% (w/v) với Mw là 30 kDa ñược pha

trong acid acetic 0.35% (w/v). Sau khi hòa tan, ñiều chỉnh pH của dung dich

chitosan 0,2% ñến 5.5 bằng NaOH 1M.

-TPP nồng ñộ 0,5 % (w/v) ñược pha trong nước khử ion.

-Nhỏ giọt TPP vào dung dịch CS trong ñiều kiện khuấy từ tốc ñộ 900 vòng/phút ở nhiệt ñộ phòng 300C trong 60 phút. Tỷ lệ khối lượng

chitosan/TPP là 3:1; 4:1; 5:1; 6:1 và 7:1. Sau ñó lấy dung dịch hạt nano

chitosan ly tâm với tốc ñộ 12.000 vòng/phút trong 60 phút thu cặn. Rửa cặn lặp lại hai lần bằng nước khử ion rồi ñông khô. Mẫu ñược bảo quản ở 50C

trong tủ lạnh.

+ Các chỉ tiêu theo dõi

- Kích thước trung bình hạt nano chitosan (nm).

- Phân bố kích thước hạt (nm).

- Điện thế hạt nano chitosan (mV).

+Phương pháp ño với thiết bị, kỹ thuật như nội dung 3.2.4.1

3.2.5. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan

3.2.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả năng

kháng khuẩn

-Nội dung nghiên cứu nhằm tìm ra nồng ñộ tối ưu của chitosan trong

kháng khuẩn.

- Sử dụng chitosan 300kDa cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất (Nguyen

Anh Dzung, 2003) [34] làm thí nghiệm. Chitosan hòa tan trong acid acetic ñể

ñược dung dịch chitosan 0,2%.

- Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn E.coli và S. aureus.

- Thiết kế thí nghiệm gồm 7 công thức:

+ Công thức 1: Bổ sung dung dịch chitosan vào môi trường ñể có nồng

ñộ 20ppm.

+ Công thức 2: Bổ sung dung dịch chitosan vào môi trường ñể có nồng

ñộ 40ppm.

+ Công thức 3: Bổ sung dung dịch chitosan vào môi trường ñể có nồng

ñộ 60ppm.

+ Công thức 4: Bổ sung dung dịch chitosan vào môi trường ñể có nồng

ñộ 80ppm.

+ Công thức 5: Bổ sung dung dịch chitosan vào môi trường ñể có nồng

ñộ 100ppm.

+ Công thức 6: Bổ sung dung dịch chitosan vào môi trường ñể có nồng

ñộ 200ppm.

+ Công thức 7: Đối chứng là môi trường không có chitosan ( 0ppm).

- Lấy 50ml dung dịch ở mỗi công thức và ñối chứng cho vào 1ml dung

dịch vi khuẩn, ñể 24 giờ ở nhiệt ñộ phòng.

- Sau ñó ñếm mật ñộ vi khuẩn trong 1ml dung dịch pha loãng bằng

cách trải ra trên môi trường thạch Nutrient Broth.

+ Pha loãng dung dịch: lấy 9ml nước cất cho vào các ống nghiệm, lấy

1ml dung dịch ở mỗi công thức và ñối chứng sau khi hấp phụ vi khuẩn cho

vào ống nghiệm 1, lắc ñều. Sau ñó hút 1ml dung dịch từ ống 1 cho vào ống 2

rồi lắc ñều và tiếp tục như vậy sang các ống tiếp theo cho ñến nồng ñộ cần

pha. Hút 0,1 ml dịch các ống có nồng ñộ cần ñếm trải trên ñĩa thạch, nuôi

trong tủ ấm sau 24 giờ.

- Đếm mật ñộ vi khuẩn ñược áp dụng theo công thức:

A ( CFU / ml ) =

n1Vf1 + ... niVfi

Trong ñó:

A: là số tế bào ( ñơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong một g hay

1ml mẫu

N: là tổng số khuẩn lạc ñếm ñược trên tất cả các ñĩa petri ñã chọn

ni: là số ñĩa ñược giữ lại ở ñộ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi ñĩa

fi: ñộ pha loãng tương ứng

- Phương pháp xác ñịnh tỉ lệ chết của vi khuẩn:

B - K

I (%) = . 100%

Trong ñó:

I (%) : tỉ lệ vi khuẩn chết

B: Mật ñộ vi khuẩn trong môi trường ( 0ppm)

K: Mật ñộ vi khuẩn ở nồng ñộ k

-Tất cả các vật liệu và dụng cụ thí nghiệm ñều ñược vô trùng.

-Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

+ Chỉ tiêu theo dõi

- Mật ñộ vi khuẩn trong mỗi công thức.

-Tỉ lệ vi khuẩn bị chết.

3.2.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả năng

kháng khuẩn

- Nội dung nghiên cứu nhằm tìm ra nồng ñộ tối ưu của hạt nano

chitosan trong kháng khuẩn.

Sử dung hạt nano chitosan từ 300kDa, ( CS:TPP = 6:1), tốc ñộ khuấy

900 vòng/ phút trong 60 phút ở nhiệt ñộ 30o C làm thí nghiệm.

- Thiết kế thí nghiệm: mỗi tỉ lệ gồm 4 công thức và ñối chứng:

+ Công thức 1: Đưa hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

20ppm.

+ Công thức 2: Đưa hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

40ppm.

+ Công thức 3: Đưa hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

60ppm.

+ Công thức 4: Đưa hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

80ppm

+ Đối chứng: Môi trường Nutrient Broth (nồng ñộ 0ppm), chitosan bổ sung

vào môi trường với nồng ñộ 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80ppm,100ppm,

200ppm.

-Thử nghiệm trên ñối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.

-Thực hiện tương tự như thí nghiệm trên.

+ Chỉ tiêu theo dõi

- Mật ñộ vi khuẩn trong mỗi công thức .

- Tính tỉ lệ chết của vi khuẩn.

-Tìm nồng ñộ kháng khuẩn tối ưu của hạt nano chitosan

3.2.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.

- Nội dung nhằm tìm ra khối lượng chitosan tốt nhất cho tính kháng khuẩn

của hạt nano chitosan

- Hạt nano chitosan ñược tạo từ chitosan có khối lượng phân tử 20kDa,

30kDa, 300kDa với tỉ lệ CS:TPP= 6:1, tốc ñộ khuấy 900 vòng/ phút trong 60 phút ở nhiệt ñộ 30o C làm thí nghiệm.

- Thiết kế thí nghiệm:

+ Mỗi loại hạt nano chitosan có khối lượng 20kDa, 30kDa,300kDa thực

hiện gồm 4 công thức:

- Công thức 1:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

20ppm.

- Công thức 2:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

40ppm

- Công thức 3:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

60ppm.

- Công thức 4:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

80ppm.

+ Môi trường Nutrient Broth.

- Thử nghiêm trên ñối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.

- Cách làm tương tự như thí nghiệm trên.

- Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

+ Chỉ tiêu theo dõi

- Tính mật ñộ vi khuẩn ở từng nhóm công thức.

- Tính tỉ lệ chết ở mỗi công thức.

- Tìm ra khối lượng tối ưu cho tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan.

3.2.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả

năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.

- Nội dung nhằm tìm ra tỉ lệ CS : TPP tốt nhất cho tính kháng khuẩn của

hạt nano chitosan.

- Sử dụng chitosan có khối lượng MIC của thí nghiệm trên là 300kDa tạo

ba loại hạt nano chitosan với tỉ lệ CS:TPP là 4:1; 5:1 và 6:1.

- Thiết kế thí nghiệm:

+ Mỗi loại hạt nano chitosan trên thực hiện gồm 4 công thức:

- Công thức 1: Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

20ppm.

- Công thức 2:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

40ppm

- Công thức 3:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

60ppm.

- Công thức 4:Bổ sung hạt nano chitosan vào môi trường ñược nồng ñộ

80ppm.

+ Môi trường Nutrient Broth

- Thử nghiêm trên ñối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.

- Cách làm tương tự như thí nghiệm trên.

- Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

+ Chỉ tiêu theo dõi

- Tính mật ñộ vi khuẩn ở từng công thức.

- Tính tỉ lệ chết ở mỗi công thức.

- Tìm ra tỉ lệ CS:TPP tối ưu cho khả năng kháng khuẩn của hạt nano

chitosan.

3.2.5.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng

khuẩn của hạt nano chitosan.

- Nội dung này nhằm tìm ra pH môi trường tối ưu cho tính kháng khuẩn

của hạt nano chitosan.

- Sử dụng MIC của các thí nghiệm trên là hạt nano chitosan có khối lượng

phân tử 300KDa , tỉ lệ CS:TPP là 6:1, tốc ñộ khuấy 900 vòng/ phút ở nhiệt ñộ phòng 30o C trong 60 phút, nồng ñộ 60ppm. Các yếu tố thí nghiệm là pH môi

trường thay ñổi từ 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0.

- Thiết kế thí nghiệm: gồm 6 công thức và môi trường Nutrient Broth.

+ Công thức 1: pH môi trường là 4.5

+ Công thức 2: pH môi trường là 5,0

+ Công thức 3: pH môi trường là 5,5

+ Công thức 4: pH môi trường là 6,0

+ Công thức 5: pH môi trường là 6,5

+ Công thức 6: pH môi trường là 7,0

- Thử nghiệm trên ñối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.

- Các bước tiến hành như sau:

+ Hạt nano chitosan ñưa vào môi trường Nutrient Broth có nồng ñộ

60ppm. Cho vào các bình tam giác: mỗi bình 50ml dung dịch trên rồi chuẩn

ñộ pH ở 6 công thức trên.

+ Bình 7 là 50ml môi trường Nutrient Broth

+ Đưa 1ml vi khuẩn vào mỗi bình, ủ 24 giờ ở nhiệt ñộ phòng.

+ Đếm mật ñộ vi khuẩn sau 24 giờ trong 1ml dung dịch pha loãng: cách

làm như thí nghiệm trên.

+ Tính tỉ lệ vi khuẩn chết.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần, các thao tác và dụng cụ ñều vô trùng.

+Chỉ tiêu theo dõi

- Đếm mật ñộ vi khuẩn ở mỗi công thức

-Tính tỉ lệ chết ở mỗi công thức ñể tìm ra pH môi trường tối ưu cho tính

kháng khuẩn của hạt nano chitosan.

3.3. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu ñược thu thập và xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC và

phân hạng theo trắc nghiệm LSD 0.05 và 0.01.

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo

gel ion trong TPP

4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến kích thước hạt,

ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan

Ba khối lượng phân tử của chitosan ñược sử dụng cho thí nghiệm là 20,

30 và 300kDa. Sau khi tạo hạt gel ion trong dung dịch TPP có nồng ñộ 0,2%,

pH cho phản ứng tạo hạt là 5.5, khuấy với tốc ñộ 900 rpm ở nhiệt ñộ phòng

trong thời gian 60 phút, hạt nano chitosan ñược thu nhận bằng phương pháp li

tâm với tốc ñộ 13.000 rpm. Hạt ñược chụp bằng kính hiển vi truyền quang

TEM và ño kích thước của 50 hạt lấy phân bố kích thước và giá trị trung bình.

Kết quả ñuợc ghi nhận trong bảng 4.1.

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử và mức ñộ deacetyl hóa của

chitosan ñến tính chất hạt nano chitosan

30 kDa DD 85% 300 kDa DD 80%

Mw chitosan Mức ñộ deacetyl hóa (DD%) 20 kDa DD 85%

Phân bố kích thước hạt 33,33 – 142,86 54,42 – 112,24 73,82-138,15 (nm)

82,83 106,77 Kích thước hạt trung bình (nm)

Điện thế (+ mV) 80,90 48 46 42

Kết quả bảng 4.1 cho thấy khối lượng phân tử càng lớn thì kích thước

hạt càng lớn. Phân bố kích thước hạt nano chitosan ở khối lượng phân tử

20kDa từ 33,33 ñến 142,86nm, kích thước trung bình là 80,90nm. Khi khối

lượng phân tử của chitosan tăng lên 30kDa thì phân bố hạt nano biến thiên từ

54,42 ñến 112,24nm, kích thước hạt trung bình không có sư khác biệt lớn so

với khối lượng phân tử 30kDa là 82,83nm. Kích thước hạt trung bình tăng lên

106,77 nm ở khối lượng phân tử 300 kDa. Điện tích của hạt nano chitosan

chịu ảnh hưởng khá lớn bởi khối lượng phân tử. Khối lượng phân tử càng nhỏ

thì kích thước hạt càng nhỏ, diện tích bề mặt càng lớn và ñiện tích hạt càng

lớn.

Nghiên cứu của Gupta (2007) tạo microspheres bằng phương pháp

cross-linked với glutaraldehyde có kích thước rất lớn, biến thiên từ 18-60

micromet [32]. Nghiên cứu của Gan (2005) tạo hạt nano chitosan cũng bằng

phương pháp tạo gel ion với TPP cho kích thước hạt cũng khá lớn từ 150nm

ñến 280nm, ñiện thế hạt nano chitosan là + 30mV ñến +48mV. So sánh với

nghiên cứu của hai tác giả chứng tỏ chúng tôi ñã thành công trong nghiên cứu

tạo hạt nano chitosan, hạt có kích thước nhỏ hơn 2-3 lần và ñiện thế hạt cao

và ổn ñịnh +48mV [41].

Điện tích của hạt nano chitosan chịu ảnh hưởng khá lớn bởi khối lượng

phân tử và mức ñộ deacetyl hóa (DD%). Mức ñộ deacetyl hóa càng lớn, kích

hạt càng nhỏ thì ñiện tích hạt càng lớn. Điều này có thể giải thích mức ñộ + tự do càng lớn do ñó làm tăng ñiện deacetyl hóa càng cao thì số nhóm NH3

tích hạt. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Maclaughlin (1998) công

bố nghiên cứu sử dụng chitosan, chitosan oligomer làm vector chuyển gen

trong in vivo. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan, các thông số

như kích thước hạt nanoparticle, ñộ tích ñiện dương, ñộ ổn ñịnh ñều có ảnh

hưởng ñến hiệu suất chuyển gen. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của

chitosan ñến kích thước hạt nanoparticles của chitosan/DNA rất rõ rệt. Khối

lượng phân tử càng nhỏ thì kích thước hạt càng bé. Kết quả cho thấy chitosan

có khối lượng 540kDa có kích thước 480nm, chitosan 102kDa có kích thước

240nm và chitosan 49kDa có kích thước khoảng 140nm. Kết quả cũng cho

thấy ở khối lượng phân tử nhỏ từ 49kDa, 32kDa, 24kDa và 7kDa gần như

không ảnh hưởng ñến kích thước hạt nano chitosan. Ảnh hưởng của khối

lượng phân tử và mức ñộ deacetyl hóa của chitosan ñến kích thước và ñiện

tích hạt nanoparticles cũng cho kết quả không rõ ràng ở khối lượng phân tử từ

213kDa ñến 98kDa và 49kDa.

Lifeng Qi và cộng sự (2004) cũng nghiên cứu tạo hạt nano chitosan với

TPP [25]. Khối lượng phân tử chitosan là 220kDa, kích thước hạt trung bình

là 48nm, ñiện thế hạt là 51mV. Q. Gan et al. (2005) cũng nghiên cứu tạo hạt

nano chitosan - TPP với 3 khối lượng phân tử là cao, thấp và trung bình. Kết

quả cũng chứng minh rằng khối lượng phân tử càng nhỏ thì kích thước hạt

càng nhỏ và ñiện thế hạt càng lớn. Kích thước hạt nano chitosan biến thiên từ

130nm ñến 260nm [41].

Qua kết quả ảnh TEM cho thấy hạt nano chitosan ñã ñược tổng hợp

thành công, các nghiệm thức ñều có khả năng tổng hợp ñược hạt nano

chitosan trong ñó tốt nhất là nghiệm thức khi tổng hợp hạt nano chitosan bằng

chitosan có khối lượng phân tử là 30 kDa, hạt nano ñược tạo ra có kích thước

nhỏ và khoảng phân bố kích thước tương ñối có sự khác biệt và tập trung

phân bố chủ yếu ở kích thước 64,63 – 78,23 nm (> 70%). Trong khi ñó, hai

nghiệm thức còn lại hạt nano có sự phân tán rải rác không tập trung ñặc biệt

khi khối lượng phân tử của chitosan càng lớn thì ñường kính hạt nano và sự

kém ñồng nhất trong kết quả thu ñược càng cao. Kết quả nghiên cứu này cũng

trùng với kết quả của Z. Tang et al (2006) công bố thu ñược khi tổng hợp hạt

nano chitosan ñể cố ñịnh enzyme protease. Kích thước hạt nano chitosan tăng

khi khối lượng phân tử chitosan tham gia phản ứng tăng. Hai nghiệm thức 20

kDa và 30 kDa có sự khác biệt về khối lượng phân tử không nhiều nên có thể

chưa có sự khác biệt lớn như so với nghiệm thức tổng hợp bằng chitosan có

khối lượng phân tử 300 kDa.

Hình 4.1. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với khối lượng phân

Series2

tử là 20 kDa.

% ộ ñ t ậ m

2.3 8

1 4.2 9

2 6.1 9

3 8.1 0

5 0.0 0

6 1.9 0

7 3.8 1

8 5.7 1

9 7.6 2

1 0 9.5 2

1 2 1.4 3

1 3 3.3 3

1 4 5.2 4

k ích thước hạt (nm )

Đồ thị 4.1. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với khối

lượng phân tử 20 kDa

Hình 4.2. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với khối lượng phân

Series2

tử là 30 kDa

% ộ ñ ật m

0 4 3.

1 0 7. 1

1 6 0. 3

2 2 4. 4

2 8 7. 5

3 4 1. 7

3 0 5. 8

4 6 8. 9

4 2 2. 1 1

5 8 5. 2 1

6 4 9. 3 1

6 0 3. 5 1

7 6 6. 6 1

7 2 0. 8 1

8 8 3. 9 1

k ích thước hạt (nm )

Đồ thị 4.2. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với khối

lượng phân tử 30 kDa

Hình 4.3. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với khối lượng phân

18.00

16.00

14.00

tử là 300 kDa

)

12.00

%

(

10.00

ộ ñ

Series1

8.00

t ậ M

6.00

4.00

2.00

0.00 2.38

9.52

16.67

23.81

30.95

38.10

45.24

52.38

59.52

66.67

73.81

80.95

88.10

95.24

102.38

109.52

116.67

123.81

130.95

138.10

kích thước hạt (nm)

Đồ thị 4.3. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với khối

lượng phân tử 300 kDa

4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS:TPP (w/w) ñến kích thước, ñiện

tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan

Phản ứng tạo hạt nano chitosan là do liên kết ion giữa polycation 3-. Vì vật tỷ lệ giữa chitosan và TPP có +) của chitosan và polyanion PO4 (NH3

ảnh hưởng ñến kích thước của hạt và ñộ tích ñiện của hạt nano chitosan.

Trong thí nghiệm này sử dụng 5 tỷ lệ chitosan và TPP khác nhau. Các ñiều

kiện khác như pH, tốc ñộ khuấy, thời gian tạo hạt tuơng tự như thí nghiệm 1.

Kết quả về phân bố kích thước và kích thước trung bình của hạt nano chitosan

ñược ghi nhận trong bảng 4.2.

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP ñến tính chất hạt nano

chitosan (Chitosan 30kDa)

Tỷ lệ Chitosan: TPP Chỉ tiêu theo

dõi 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1

65-162 51 – 141 55 – 112 30 – 80 Phân bố kích thước (nm)

80.99 97.55 75.30 52.50 Kích thước trung bình (nm)

Điện thế (+ mV) 41 43 45 47 35 - 85 57.10 47

Qua kết quả ở bảng 4.2 và ñồ thị của thí nghiệm này cho thấy hạt nano

chitosan ñược tổng hợp ở nghiệm thức CS:TPP với tỷ lệ 6:1 cho kết quả tốt

nhất. Hạt nano có ñường kính hạt nhỏ nhất 40 – 50 nm chiếm 50 % sự dao

ñộng về kích thước hạt rất nhỏ không có sự khác biệt nhiều so với các hạt

nano ở các nghiệm thức khác.

Về ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan:TPP không rõ rệt, không theo qui luật

nhất ñịnh, tỷ lệ 6:1 là tối ưu nhất. Tỷ lệ nhỏ hơn hoặc lớn hơn tỷ lệ này ñều

làm kích thước hạt tăng lên và phân bố không tập trung. Kết quả này dường

như có sự khác biệt với nghiên cứu của Q. Gan et al. (2005),theo nghiên cứu

này tỷ lệ chitosan:TPP càng lớn thì kích thước hạt càng lớn. Tuy nhiên,

nghiên cứu này tạo hạt có kích thước khá lớn từ 150-260nm [41].

Hình 4.4. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ

40.00

35.00

30.00

CS: TPP là 3:1

)

25.00

%

(

20.00

Series2

15.00

ộ ñ t ậ m

10.00

5.00

0.00

86.21

93.10

72.41

79.31

58.62

65.52

10 0.0 0

106.9 0

11 3.7 9

120.6 9

12 7.5 9

134.4 8

14 1.3 8

14 8.2 8

15 5.1 7

16 2.0 7

kích thước hạt nano (nm)

Đồ thị 4.4. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 3:1

Hình 4.5. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ

25.00

20.00

CS: TPP là 4:1

)

%

15.00

(

Series2

10.00

ộ ñ t ậ m

5.00

0.00

93.10

79.31

86.21

65.52

72.41

51.72

58.62

37.93

44.83

100.0 0

10 6.9 0

113.7 9

12 0.6 9

12 7.5 9

13 4.4 8

14 1.3 8

kích thước hạt nano (nm)

Đồ thị 4.5. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 4:1

Hình 4.6. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là

8 7

5:1

)

%

(

Series1

ộ ñ

5 4

t ậ m

2 1

51.02

57.82

64.63

71.43

78.23

85.03

91.84

98.64

105.44

112.24

119.05

125.85

kích thước hạt (nm)

Đồ thị 4.6. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 5:1

Hình 4.7. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ

CS: TPP là 6:1

)

%

(

Series2

o d

t a m

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

100

110 120 kich thuoc

Đồ thị 4.7. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 6:1

Hình 4.8. Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ

18.00

16.00

14.00

CS: TPP là 7:1

)

12.00

%

(

10.00

Series2

ộ ñ

8.00

t ậ m

6.00

4.00

2.00

0.00

7 7 . 0 3

5 8 . 3 3

2 9 . 6 3

0 0 . 0 4

8 0 . 3 4

5 1 . 6 4

3 2 . 9 4

1 3 . 2 5

8 3 . 5 5

6 4 . 8 5

4 5 . 1 6

2 6 . 4 6

9 6 . 7 6

7 7 . 0 7

5 8 . 3 7

2 9 . 6 7

0 0 . 0 8

8 0 . 3 8

5 1 . 6 8

3 2 . 9 8

1 3 . 2 9

kích thước hạt nano (nm)

Đồ thị 4.8. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 7:1

4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan

4..2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả năng kháng

khuẩn

Để khảo sát tính kháng khuẩn của chitosan, chitosan có khối lượng phân tử

300kDa, hòa tan trong acid acetic ñược nồng ñộ 0,2%. Sau ñó ñưa vào môi trường

Nutrient Broth ñể ñược các nồng ñộ chitosan là 20ppm, 40ppm, 60ppm,

80ppm, 100ppm, 200ppm. Khảo sát khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn

Escherichia coli và Staphylococcus aureus ghi ñược kết quả ở bảng số liệu

4.3.

Bảng.4.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn của

chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus

60pm 80ppm

100ppm 200ppm

Nồng ñộ 20ppm 40ppm Vi khuẩn

0ppm

Mật ñộ

2,36.109

1,91.109 1,58.109 1,44.109

1,34. 109

9,3.108

(CFU/ml)

1,17.1010

E.coli

83,57bc

86,36abc

87,55ab

88,55ab

92,02a

79,65c

3,00.109

2,35.109

2,10.109 1,84.109

1,49.109

1,07. 109

(CFU/ml)

1,07.1010

Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ

Tỉ lệ chết

S.aureus

72,31c

76,52bc

80,24abc

82,88abc

86,09ab

90,09a

( %)

100

)

%

E.coli

S.aureus

( t ế h c ệ l ỉ

T

100

200

Nồng ñộ chitosan (ppm)

Đồ thị 4.9. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn

Escherichia coli và Staphylococcus aureus

Kết quả bảng 4.3 cho thấy nồng ñộ kháng khuẩn cao nhất của chitosan là

200ppm. Ở nồng ñộ này vi khuẩn Escherichia coli có tỉ lệ chết là 92% và tỷ lệ chết

của vi khuẩn Staphylococcus aureus là 90%. Tính kháng khuẩn của chitosan trên vi

khuẩn Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm cao hơn trên vi khuẩn Staphylococcus

là vi khuẩn Gram dương. Kết quả này tương ñồng với kết quả của Nguyen Anh

Dzung, Vo Thi Phuong Khanh (2003), ñã sử dụng chitosan với nồng ñộ 200 - 300

ppm và chitosan là 80-100 ppm ñể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Escherichia

coli [34]. Theo nghiên cứu của Hirano (1988) thì liều ức chế Escherichia coli của

chitosan cũng là từ 200 - 240 ppm [11].

Chitosan là polysaccharide tự nhiên, không ñộc nhưng có hoạt tính kháng

+), chitosan có khả năng tương

khuẩn cao. Điều này có thể giải thích theo quan ñiểm của Rinaudo (2006) như sau:

- Chitosan là một polycationic (poly NH3

tác với thành phần polyanion vách tế bào (lipopolysaccharides và protein) của

vi sinh vật, kết quả làm rò rỉ thành phần nội bào do các thay ñổi trong tính

thấm của hàng rào (barrier); ngăn cản chất dinh dưỡng ñi vào tế bào; ngăn cản

sự nhập vào tế bào (ñặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp LMWC).

- Chitosan có khả năng kết hợp với DNA và nhờ vậy chitosan có khả

năng ức chế tổng hợp RNA và protein.

- Chitosan có khả năng gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và

dẫn ñến giết chết tế bào [43].

Chitosan có phổ kháng khuẩn rộng, kháng lại cả vi khuẩn Gram-dương,

Gram âm và nấm (Tharanathan, 2004) [9].

Vì vậy, trong những thí nghiệm sau chitosan ñược sử dụng làm ñối chứng so sánh

cho hạt nano chitosan.

4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả năng

kháng khuẩn

4.2.2.1. Ảnh hưởng nồng ñộ hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Hạt nano chitosan sử dụng trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của

nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn sử dụng chitosan 300kDa, tỷ lệ CS:TPP là

6:1 và sử dụng chitosan làm ñối chứng. Nồng ñộ hạt nano chitosan sử dụng là

20, 40, 60 và 80ppm; nồng ñộ chitosan sử dụng ñối chứng là 20, 40, 60, 80,

100 và 200ppm. Kết quả ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan và chitosan

ñến khả năng kháng khuẩn E. coli ñược ghi nhận trong bảng 4.4.

Kết quả bảng 4.4 cho thấy khả năng kháng khuẩn của nano chitosan cao

hơn nhiều so với oligomer chitosan. Ở nồng ñộ 200ppm thì oligomer chitosan

diệt khoảng 92% vi khuẩn, nhưng nano chitosan chỉ với nồng ñộ 20ppm ñã

diệt khoảng 99,8%. Đặc biệt ở nồng ñộ 60ppm và 80ppm ñã ức chế gần hoàn

toàn vi khuẩn E.coli, tỷ lệ vi khuẩn chết là 99,999%. Qua xử lí thống kê về

khả năng diệt khuẩn của nano chitosan ở nồng ñộ từ 20ppm ñến 80ppm không

có khác biệt có ý nghĩa thống kê. Như vậy, ở nồng ñộ 20ppm nano chitosan

ñã ức chế gần như hoàn toàn vi khuẩn E. coli.

Riêng chitosan chưa cải biến thì sự gia tăng nồng ñộ chitosan từ 20 ñến

200ppm làm gia tăng rõ rệt khả năng kháng khuẩn E. coli. Sự khác biệt này

có ý nghĩa thống kê và nồng ñộ ức chế mạnh nhất trong thí nghiệm là

200ppm. Một số nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chitosan cũng cho

kết quả tương tự. Nghiên cứu của Hirano (1996) cho thấy chitosan kháng vi

khuẩn trong khoảng nồng ñộ từ 200-400ppm [11].

Hong Kyoon No (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng

phân tử khác nhau của chitosan, chitosan ñến khả năng kháng khuẩn trên 7

loại vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm. Kết quả thấy rằng chitosan

có khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan có khối

lượng phân tử thấp hơn. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan mạnh hơn ở vi

khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương. Chỉ số MIC của chitosan biến

ñộng trong khoảng 0.05-0.1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi

khuẩn [12].

Bảng 4.4. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên

vi khuẩn Escherichia coli

20ppm 40ppm

60pm

80ppm 100ppm 200ppm

0ppm

2,39.07

1,11.107 1,04.106

1,08.106

Vật liệu Nồng ñộ

Nano - -

chitosan

99,79

99,89

99,99

1,17.1010

2,36.109 1,91.109 1,58. 109

1,44.109

1,34.109 9,3.108

Chitosan

Oligomer

- -

86,36abc

83,57bc

87,56ab

88,55ab

92,02a

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

79,65c

100

)

%

Nano chitosan

Chitosan

( t ế h c ệ l

ỷ T

100

200

Nồng ñộ (ppm)

Đồ thị 4.10. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi

khuẩn Escherichia coli

4.2.2.2. Ảnh hưởng nồng ñộ nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococus

aureus

Vi khuẩn S. aureus là vi khuẩn gram dương, vì vậy ñược sử dụng làm

ñại diện nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano chitosan ñối với vi khuẩn gram

dương, so sánh với vi khuẩn gram âm. Ngoài ra, S. aureus là ñối tượng vi

khuẩn gây ngộ ñộc thực phẩm khá phổ biến hiện nay. Hạt nano chitosan sử

dụng trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng

kháng khuẩn ñược chuẩn bị từ chitosan 300kDa, tỷ lệ CS:TPP là 6:1. Nồng ñộ

hạt nano chitosan sử dụng là 20, 40, 60 và 80ppm; nồng ñộ chitosan sử dụng

ñối chứng là 20, 40, 60, 80, 100 và 200ppm. Kết quả ảnh hưởng của nồng ñộ

nano chitosan và chitosan ñến khả năng kháng khuẩn S. aureus ñược ghi nhận

trong bảng 4.5.

Bảng 4.5. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và

chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

100pm

200ppm

0ppm

Vật liệu Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm

3,26.107 2,74.107 1,54.107 1,68. 107

(CFU/ml)

Mật ñộ

Nano

chitosan

99,73

99,74

99,85

1,07.1010

Tỉ lệ chết ( %)

99,85

3,00.109 2,35.109 2,10.109 1,84.109

1,49.109

1,07. 109

Oligomer

(CFU/ml)

Mật ñộ

chitosan

80,24abc

82,88abc

76,52bc

72,31c

86,09ab

90,09a

100

Tỉ lệ chết ( %)

)

%

Nano chtosan

Chitosan

( t ế h c ệ l ỷ T

100

200

Nồng ñộ (ppm)

Đồ thị 4.11. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi

khuẩn Staphylococcus aureus

Kết quả bảng 4.5 cho thấy cũng tương tự như trên vi khuẩn E.coli, khả

năng diệt khuẩn của nano chitosan trên S.aureus cao hơn nhiều so với

chitosan. Ở nồng ñộ 200ppm thì khả năng diệt của chitosan là 90%, nano

chitosan chỉ với nồng ñộ 20ppm ñã diệt khoảng 99,73%, ñặc biệt ở nồng ñộ

60ppm và 80ppm ñã diệt khoảng 99,85%. Qua xử lí thống kê, khả năng diệt

khuẩn của nano chitosan ở nồng ñộ từ 20ppm ñến 80ppm ñều rất có ý nghĩa,

ngay ở nồng ñộ 20ppm ñã ức chế 99,73% vi khuẩn.

Nguyen Anh Dzung (2007) nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của

chitosan và chitosan cải biến trên S. aureus cho thấy nồng ñộ ức chế của

chitosan là 200ppm ñối với vi khuẩn S. aureus nhạy cảm methionin (MSSA)

và 600ppm với S. aureus kháng methionin (MRSA). Sau khi cải biến gắn

glucosamine và tạo dẫn suất chitosan tứ cực (aquaterinized chitosan) vào

chitosan ñể tăng ñiện tích dương ñã làm tăng tính kháng khuẩn, chỉ số MIC

chỉ còn 40ppm và 20ppm [37].

Gần ñây cũng có một số nghiên cứu cải biến chitosan ñể tăng tính

kháng khuẩn. Sun (2006), nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của CMC

(Carboxymethyl chitosan) và QC (Quarterinized chitosan). Kết quả cho thấy

chỉ số MIC của CMC là 500ppm với E.coli và 1500 ppm với S. aureus; chỉ số

MIC của QC là 125ppm với E.coli và 250ppm với S. aureus [47]. Tikhonov

(2006) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của chitosan

khối lượng phân tử thấp (4,7 kDa) và chitosan cải biến. Kết quả cho thấy

chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn thấp. Ở nồng ñộ

1% chitosan (4.7 kDa) tỷ lệ chết của E.coli chỉ là 91.6% [46].

Vật liệu hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và ñiện tích dương lớn

hơn chitosan thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so

với chitosan. Qi và cộng sự (2004) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan ñể

tăng hoạt tính kháng khuẩn. Hạt nano chitosan ñược chuẩn bị bằng phương

pháp tạo gel trong tripolyphosphate (TPP), kích thước hạt khoảng 30-50nm.

Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên 4 loại vi

khuẩn E.coli, S. typhimurium, S. choleraesuis và S. aureus cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan. MIC (nồng ñộ tối thiểu ức

chế) của hạt nano chitosan là 1/8-1/32 microgam/ml so với chitosan là 8-16

microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 1-4 microgam/ml [25].

Nếu như khả năng kháng khuẩn của chitosan có sự khác nhau ở từng

ñối tượng thì khả năng kháng khuẩn của nano chitosan là tuyệt ñối ở cả vi

khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Sở dĩ nano chitosan có khả năng

kháng khuẩn cao hơn là do: Vật liệu hạt nano chitosan nhờ có diện tích tiếp

xúc và ñiện tích dương lớn hơn chitosan thông thường, ñồng thời với kích

thước nanomet nên khả năng bám vào màng tế bào cao hơn, dễ dàng ñi qua

màng vào trong tế bào vi khuẩn nên hiệu quả diệt khuẩn kéo dài, ổn ñịnh và

cao hơn.

4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.

Trong nghiên cứu này tôi sử dụng 3 loại hạt nano chitosan có khối lượng

phân tử 20kDa, 30kDa, 300kDa, ñều ñược tạo từ tỉ lệ CS:TPP là 6:1, tốc ñộ khuấy từ 900 vòng/ phút, nhiệt ñộ phòng 30oC, trong thời gian 60 phút. Sau

ñó cho tác dụng trên vi khuẩn E.coli và S.aureus trong 24 giờ, kết quả ghi

nhận ở bảng 4.6.

Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy khối lượng phân tử càng lớn thì khả năng

kháng khuẩn càng cao. Nano chitosan ở nồng ñộ 60ppm có khối lượng phân

tử 20kDa cho tỉ lệ chết của vi khuẩn E.coli là 98,66%, khối lượng phân tử

30kDa là 99,08%, khối lượng phân tử 300 kDa là 99,99%. Hạt nano chitosan

ở khối lượng 300kDa có khả năng kháng khuẩn cao nhất. Điều này trùng với

nghiên cứu của Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh ( 2003) ở

chitosan[34].

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Nồng ñộ

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

0ppm

Khối lượng phân tử

2,94.108

2,37.108

1,57.108

20 kDa

97,43

97,95

98,66

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

1,60.108 98,62

2,68.108

2,12.108

1,07.108

30kDa

1,17.1010

97,71

98,18

99,08

1,11.108 99,04

1,10. 107

1,11.106

1,20. 106

2,58. 107

300kDa

99,79

99,90

99,99

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

100.5

100

99.5

)

%

Khối lượng 20kDa

98.5

Khối lượng 30kDa

Khối lượng 300kDa

( t ế h c ệ l ỉ

97.5

T

96.5

Nồng ñộ nano chitosan (ppm)

Đồ thị 4.12. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Bảng 4.7 cho thấy khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi

khuẩn S. aureus chịu ảnh hưởng lớn của khối lượng phân tử. Ở nồng ñộ

20ppm, nanochitosan có khối lượng phân tử 20kDa có tỷ lệ vi khuẩn chết là

90,89% tăng lên 96,85% ở 30kDa và 98,94% ở khối lượng phân tử 300kDa.

Theo xử lí thống kê thì hạt nano chitosan có khối lượng phân tử 300kDa cho

hạt nano chitosan có khả năng kháng khuẩn cao nhất, thấp nhất là hạt nano

chitosan có khối lượng phân tử 20kDa. Ở cùng nồng ñộ là 60ppmo thì nano

chitosan 20kDa cho tỉ lệ chết là 97,68%, còn nano chitosan 30kDa là 98,16%

và nano chitosan 300kDa là 99,84%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của

Hong Kyoon No (2002) và Fernades (2008) trên vi khuẩn S. aureus thì khối

lượng phân tử càng lớn thì khả năng kháng khuẩn của chitosan càng cao.

Hong Kyoon No (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng phân

tử khác nhau của chitosan, chitosan oligomer ñến khả năng kháng khuẩn trên

7 loại vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm. Kết quả thấy rằng

chitosan có khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan

oligomer có khối lượng phân tử thấp hơn. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương. Chỉ số MIC của

chitosan biến ñộng trong khoảng 0.05-0.1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử

và loại vi khuẩn [12].

Fernandes (2008) cũng nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử

của chitosan (625kDa, 590kDa và 107kDa) và chitosan oligomer (1kDa,

3kDa và 5kDa) ñến khả năng kháng khuẩn E. coli và S. aureus. Kết quả cho

thấy với E. coli thì khối lượng phân tử càng nhỏ, hoạt tính kháng khuẩn càng

cao. Ngược lại, với S. aureus thì khối lượng phân tử càng lớn kháng khuẩn

càng mạnh [8].

Tikhonov (2006) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

của chitosan khối lượng phân tử thấp (4,7 kDa) và chitosan cải biến. Kết quả

cho thấy chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn thấp, ở

nồng ñộ 1% chitosan (4.7 kDa) tỷ lệ chết của E.coli chỉ là 91.6% [49].

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng khuẩn

của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm

9,85.108

2,873. 108

2,503.108

2,49.108

Khối lượng

20 KDa

90,89d 97,36c 97,68bc 97,69bc

3,39.108 2,51.108 1,97.108 1,98. 108 1,08.1010 30Kda

96,85c 97,67b 98,16bc 98,16bc

1,14.108 2,664.107 1,56.107 1,63.107 300KDa

98,94ab 99,75a 99,84a Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) 99,84a

102

100

)

%

Khối lượng 20kDa

Khối lượng 30kDa

Khối lượng 300kDa

( t ế h c ệ l ỉ

T

Nồng ñộ nnano chitosan (ppm)

Đồ thị 4.13. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả

năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.

Hạt nano chitosan tạo thành nhờ phản ứng tạo gel ion giữa chitosan

(polycation) và polyanion của TPP. Vì vậy tỷ lệ CS:TPP sẽ ảnh hưởng ñến

khả năng tạo hạt và ñiện tích dương của hạt nano. Về nguyên tắc, tỷ lệ

CS:TPP tăng thì ñiện tích polycation của hạt sẽ tăng. Trong nghiên cứu này

sử dụng ba loại hạt nano chitosan có tỉ lệ CS:TPP là 4:1, 5:1 và 6:1 có khối lượng phân tử 300kDa, tốc ñộ khuấy 900 vòng/ phút, nhiệt ñộ phòng 30oC

trong 60 phút. Sau thời gian tác dụng trên vi khuẩn E.coli và S.aureus là 24

giờ, kết quả ñược ghi nhận ở 2 bảng 4.8 và 4.9.

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60pm 80ppm 0ppm

2,81.108

1,75.108

1,78. 108

Tỉ lệ CS:TPP

4:1

98,12

98,49

98,45

2,89.108 97,50 2,44.108

1,36.108

1,12.108

1,14.108

5:1 1,17.1010

97,89

98,82

99,03

99,01

2,39.107

1,11.107

1,04.106

1,08.106

6:1

99,79

99,89

99,99

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

100.5

100

99.5

)

%

CS:TPP = 4:1

98.5

CS:TPP = 5:1

CS:TPP = 6:1

( t ế h c ề l ỉ

T

97.5

96.5

Nồng ñộ nano chitosan (ppm)

Đồ thị 4.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn

của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60pm 80ppm 0ppm

2,27. 108

2,02.108

2,01.108

Tỷ lệ CS: TPP

4:1

97,82

98,14

98,11

1,61. 108

1,07.108

1,07.1010

5:1

98,50

99,00

98,99

1,54. 107

1,50. 107

2,74. 107

6:1

99,74

99,84

99,85

2,74. 108 97,44 1,99. 108 98,14 3,26. 107 99,73

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

100.5

100

99.5

)

%

CS:TPP = 4:1

98.5

CS:TPP = 5:1

CS:TPP = 6:1

( t ế h c ệ l ỉ

T

97.5

96.5

Nồng ñộ nano chitosan (ppm)

Đồ thị 4.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn

của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

Kết quả bảng 4.8 và 4.9 cho thấy khả năng kháng khuẩn của nano chitosan

phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ CS:TPP. Hạt nano chitosan tạo ñược theo tỷ lệ

CS:TPP là 6:1 cho khả năng kháng khuẩn cao nhất. Ở nồng ñộ tối ưu 60ppm,

trên vi khuẩn E.coli thì tỉ lệ 4:1 có tỉ lệ chết là 98,49%; ở tỉ lệ 5:1 là 99,03%;

ở tỉ lệ 6:1 tăng lên là 99,99% (vi khuẩn E. coli gần như bị tiêu diệt hoàn toàn).

Ở vi khuẩn S. aureus thì tỉ lệ 4:1 có tỉ lệ chết 98,14%; ở tỉ lệ 5:1 là 99%; ở tỉ

lệ 6:1 tăng lên là 99,84%.

Trong nghiên cứu tạo hạt nano chitosan thì hạt nano chitosan ở nghiệm

thức CS:TPP với tỉ lệ 6:1 cho kết quả hạt tốt nhất, kích thước hạt nhỏ và ñồng

ñều nhất và ñiện tích hạt cũng lớn nhất. Đây là hai nguyên nhân chủ yếu làm

tăng tính kháng khuẩn của nano chitosan ở tỷ lệ CS:TPP 6:1.

4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng

khuẩn của hạt nano chitosan

Trong nghiên cứu này sử dụng trị số tối ưu của các thí nghiệm trên là

hạt nano chitosan có khối lượng phân tử 300 kDa, tỉ lệ CS:TPP là 6:1, tốc ñộ khuấy 900 vòng/ phút ở nhiệt ñộ phòng 30o C trong 60 phút, nồng ñộ 60ppm.

Các yếu tố thí nghiệm là pH môi trường thay ñổi từ 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 và

7,0. Sau thời gian ủ 24h, kết quả ñược ghi nhận ở bảng 4.10.

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Độ pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

1,61.106 1,58.106 1,00.108 1,29.108 1,41.108 2,29.108 Môi trường 1,17.1010

99,99 99,98 99,14 98,90 98,79 98,04

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

100.5

100

99.5

%)

Series2

98.5

( t ế h c ệ l Tỉ

97.5

4.5

5.5

6.5

pH môi trường

Đồ thị 4.16. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli

Bảng 4.11. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

Độ pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 Môi trường

1,40.107 1,48.107 1,07.108 1,37.108 1,73.108 1,08.1010 2,20.108

99,86 99,86 99,00 98,74 98,38 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) 97,95

100.5

100

99.5

)

%

98.5

Series2

( t ế h c ệ l ỉ

T

97.5

96.5

4.5

5.5

6.5

pH môi trường

Đồ thị 4.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

Qua kết quả bảng 4.10; 4.11và ñồ thị 4.17; 4.18 của thí nghiệm cho

thấy khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan phụ thuộc vào ñộ pH của

môi trường, pH môi trường càng thấp thì khả năng kháng khuẩn của nano

chitosan càng cao.

Trên vi khuẩn E.coli, ở pH môi trường 4,5 và 5,0 thì nano chitosan diệt

tới khoảng 99,99% vi khuẩn, khả năng này giảm dần khi pH môi trường càng

cao, ở pH môi trường là 7,0 thì khả năng diệt khuẩn giảm xuống chỉ còn

khoảng 98%.

Trên vi khuẩn S.aureus, ở pH môi trường 4,5 và 5,0 thì nano chitosan

diệt tới 99,86% vi khuẩn, khả năng này cũng giảm dần khi pH môi trường

càng cao, ở pH môi trường là 7,0 thì khả năng diệt khuẩn chỉ còn khoảng

97,95%.

Giải thích ñiều này là do hạt nano chitosan có ñiện tích dương cao nên

ở môi trường pH càng thấp thì hoạt tính kháng khuẩn càng cao. Kết quả này

phù hợp với nghiên cứu của No (2002) [12].

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

- Qua các kết quả nghiên cứu thu ñược, chúng tôi có một số kết luận

như sau:

+ Nghiên cứu thành công qui trinh chế tạo hạt nano chitosan trong ñiều

kiện ở Việt Nam. Nồng ñộ chitosan thích hợp là 0,20% pha trong dung dich

acid acetic 0.35%, ñiều chỉnh pH của dung dịch là 5.5, nồng ñộ TPP là 0.5%,

tỷ lệ Chitosan:TPP thích hợp là 6:1, thời gian tạo hạt là 60 phút, tốc ñộ khuấy

là 900rpm, ly tâm ở tốc ñộ 12.000 rpm trong 10 phút, kích thước hạt nano

chitosan trung bình là 52.5nm, ñiện tích hạt +47 mV.

+ Các tính chất của hạt nano chitosan như kích thước hạt trung bình,

phân bố kích thước và ñiện tích hạt phụ thuộc vào các yếu tố như khối lượng

phân tử của chitosan, mức ñộ dêactyl hóa và tỷ lệ CS:TPP.

+ Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn

Escherichia coli và Staphylococus aureus cao hơn nhiều lần so với chitosan

nguyên thủy, chưa tạo cấu trúc hạt nano. Hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano

chitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử và tỷ lệ CS: TPP. Trong nghiên

cứu này hạt nano chitosan có khối lượng phân tử 300kDa, tỷ lệ CS:TPP là 6:1

có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với cả hai ñối tượng E. coli và S. aureus.

Nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC) E, coli và S. aureas là 20ppm nhỏ hơn 10 lần

so với chitosan.

+ pH môi trường cũng ảnh hưởng ñến hoạt tính kháng khuẩn của hạt

nano chitosan, pH thích hợp là 4,5-5,5 cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

5.2. Kiến nghị

- Trong nghiên cứu này, việc thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan chỉ tiến hành trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus

aureus trong 24 giờ, ñề nghị tiếp tục nghiên cứu trong khoảng thời gian rộng

hơn 48, 60, 90h. Để mở rộng phạm vi nghiên cứu, cần thử nghiệm trên nhiều

ñối tượng vi khuẩn và nấm khác.

+ Đề nghị tiếp tục triển khai nghiên cứu thử nghiệm bảo quản một số

thực phẩm chế biến như giò chả, lạp xưởng, bún, phở, … ñể có thể ñưa một

sản phẩm bảo quản thực phẩm an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh (1999),

Nghiên cứu cố ñịnh trypsin trong gels chitosan-gHEMA ., Tạp chí Khoa

học và Công nghệ, 37(1), tr. 10-15.

2. Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Đình Huyên, Trần Tích Cảnh (1999),

Nghiên cứu chế tạo vật liệu chitosan-g-co-HEMA bằng kỹ thuật bức xạ,

Kỷ yếu Hội nghị Vật lý và Kỹ thuật Hạt nhân toàn quốc lần thứ 3, Đà lạt,

Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr. 647-651.

3. Nguyễn Anh Dũng, 2004, Nghiên cứu cố ñịnh Bacillus subtilis trong

hạt chitosan, Kỷ yếu nghiên cứu khoa học Đại học Tây Nguyên, NXB

Nông nghiệp, trang 173-178.

4. Nguyễn Văn Sức, Nguyễn Quốc Hiến 2004, Hấp phụ uranium bởi

chitin/chitosan có mức ñộ deacetyl hóa thấp, Tạp chí Hóa học, 42, số 1,

trang 1-4.

Tiếng nước ngoài

5. Amidi, M, Stefan G. Romeijn, J. Coos Verhoef, Hans E. Junginger,

Laura Bungener, Anke Huckriede, Daan J.A. Crommelin, Wim Jiskoot (2007)

N-Trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles loaded with influenza subunit

antigen for intranasal vaccination: Biological properties and

immunogenicity in a mouse model, Vaccine 25 (2007) 144–153.

6. Ana Vila et al, Avadi, 2004, Low molecular weight chitosan

nanoparticles as a new carrier nasal vaccine delivery in mice, European

journal of Pharmaceutical Sciences, 57, p. 123-131.

7. Eaton, P., Fernandes, J. C, Pereira, E. et al. (2008) Atomic force

microscope study of the antibacterial effect of chitosans on Escherichia coli

and Staphylococcus aureus. Ultramicroscopy, 1128-1134.

8. Fernandes, J. C., Tavaria, F. K., Soares, J. C. et al. (2008) Antimicrobial

effect of chitosan and chitooligosaccharides upon Staphylococcus aureus and

Escherichia coli, in food model system. Food Microbiology, 922-928.

9. Harish Prashanth, K. V., & Tharanathan, R. N. (2004). Depolymerized

products of chitosan as potent inhibitors of tumor induced angio- genesis.

Biochimica et Biophysica Acta, 1117, 22-29.

10. Hayashi, K., & Ito, M., Shabori (2002). Antidiabetic action of low

molecular weight chitosan in genetically obese diabetic KK-A mice.

Biological and Pharmaceutical Bulletin, 25, 188-192.

11. Hirano, Ohya (1996), “Chitin biotechnology applications”,

Biotechnol. Annual Review, 2, pp. 237-25

12. Hong Kyoon No, Na Young Park, Shin Ho Lee, Samuel P. Meyers

(2002), Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with

different molecular weights, International Journal of Food Microbiology

74, 65 – 72.

13. Illium, L., et al., 2001, Chitosan as a novel nasal delivery system for

vaccines, Advanced drug delivery review, 51, 81-96.

14. Ikeda, I., Sugano, M., Yoshida, K., Sasaki, E., Iwamoto, Y., & Hatano,

K. (1993). Effects of chitosan hydrolysates on lipid absorption and on

serum and liver lipid concentration in rats. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 41, 432-435.

15. Jeon, Y. J., Shahidi, R., & Kim, S. K. (2000). Preparation of chitin and

chitosan oligomers and their applications in physiological functional foods.

Food Reviews International, 16, 159-176.

16. Jing Mou Ju et al, Bao, 2008, Self-aggregated nanoparticles of

cholesterol modified glycol-chitosan conjugate: preparation and

characterization and primilinary assessment a new drug delivery carrier,

European polymer journal, 44, p.555-565.

17. Kamil, J., Jeon, Y. J., & Shahidi, F. (2002). Antioxidant activity of

chitosans of different viscosity in cooked comminuted flesh of herring

(Clupea harengus). Food Chemistry, 79, 69-77.

18. Kanatt, S., Chander, R. 2008, Chitosan glucose complex: a novel

food preservative, Food chemistry, 106, 521-528.

19. Kean, T et al., Chilarski 2005, Trimethylated chitosan as non-viral

gene delivery vectors: cytotoxicity and transfection efficiency, J.

controlled release, 103, 643-653. 20. Kevin A. Janes, Marie P. Fresneau, Ana Marazuela , Angels Fabra, Mar´ıa Jose´ Alonso,( 2001) Chitosan nanoparticles as delivery

systems for doxorubicin, Journal of Controlled Release 73 , 255–267.

21. Kumar, R.M NV, 2000, A review of chitin and chitosan applications,

Reactive & Funtion polymer, 46 (1-27).

22. Laurance D. Hall, Mansur Yalpani Derivatives of chitins, chitosans

and other polysaccharides Canadian Patents and Development Ltd.,

Ottawa, Canada.

23. Le Van Hiep, Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh 2008,

Chitosan as a hopeful adjuvant for H5N1 influenza vaccine, J. Chitin and

Chitosan, 13(10), 6-8.

24. Lee, H. W., Park, Y. S., Jung, J. S., & Shin, W. S. (2002). Chitosan oli-

gosaccharides, dp 2-8, have prebiotic effects on the Bifidobacte- rium

bifidium and Lactobacillus species. Anaerobe, 8, 319-324.

25. Lifeng Qi et al., 2004, Preparation and antibacterial activity of hạt

nano chitosan, carbohydrate research, 339, p. 2693-2700.

26. Limpanavech, P. et al, 2008, Effect of chitosan on floral production,

gene expression and anatomical changes in the Dendrobium orchid,

Scientia Horticculturae, 116, 65-72.

27. Lin, H. Y., & Chou, C. C. (2004). Antioxidative activities of water

soluble disaccharides of chitosan derivatives. Food Research International,

37, 883-889.

28. Liu, W. H. (1982), “Enzymatic oxidationn of glucose via crab chitin

immobilized glucose oxidase and catalase”, Proceedings of the second

International Conference on Chitin and Chitosan, Saporo, Japan, pp. 144-148.

29. Look-Teck Ng, Guthrie, J. T. and Liu, X. (1997), “Chemical

modification of chitosan and the application to enzyme immobilisation

system”, Conference proceedings of Rad.Tech. Asia’97, Japan, pp. 812-

815.

30. Malette, W. G., & Quigley Jr., H. J. (1984). Chitosan as hemostatics.

US Pat. 4,452,785. Chemical Abstracts, 101, 78864.

31. Márcia R. de Moura, Fauze A. Aouada, Luiz H.C. Mattoso, 2008,

Preparation of chitosan nanoparticles using methacrylic acid, Journal of

Colloid and Interface Science 321 (2008) 477–48.

32. Maryam Amadi et al, Gupta (2007), N-trimethyl chitosan (TMC)

nanoparticles loaded influenza subunit antigen for intranasal vaccination:

Biological and properties and immunogencity in a mouse model, vaccin,

25, 144-153.

33. Mitra, S., Gaur, U., 2001, Tumour targeted delivery incapsulated

dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier,

Journal of controlled release, 74, 317-323.

34. Nguyen Anh Dzung, Vo Thị Phương Khanh, Effects of

oligoglucosamine and salicyden-oligoglucosamine on the growth

inhibition of E.coli bacteria, Advances in Chitin Science, VII, 240-243,

2003.

35. Nguyen Anh Dzung, Nguyen Tien Thang, Effect of oligoglucosamine

on the growth and development of peanut (Arachis hypogea L.), Proceedings of The 6th Asia-Pacific on Chitin, Chitosan Symposium,

Singapore, ISBN: 981-05-0904-9, 2004. Journal of Biology, 27(3),50-54,

2005.

36. Nguyen Anh Dzung, Vo Thi Phuong Khanh, Nguyen Thi Bich Ngoc,

Pham Thi Anh Hong, Study on effects of chitosan, chitosan oligomer and

their devivatives on the growth inhibition of pathogenous fungi

Phytopthora capsici and application for biocontrol black pepper, Advances

in Chitin Science and Technology, ISBN: 89-5708-110-0, 505-507, 2006.

37. Nguyen Anh Dzung, 2007 Chitosan and their derivatives as

prospective biosubstances for developing sustainable eco-agriculture,

Advances in Chitin Science, Vol X, 453-459.

38. Nguyen Anh Dzung, Pham Quang Anh, Pham Anh Hong, 2007 Study

on hydrolysis of chitosan by cellulase combined with gamma irradiation,

Advancens in Chitin Science, vol. X, 96-101.

39. Olga Borges et al, 2007, Evaluation of immun response following a

short oral vaccination schedule with hepatitis B antigen encapsulated into

anginate coated hạt nano chitosan, European journal of Pharmaceutical

Sciences, 32, p. 278-290.

40. Ormrod DJ, Holmes CC, Miller TE, 1998 Dietary chitosan inhibits

hypercholesterolaemia and atherogenersis in the apolipoprotein E-deficient

mouse model of athero-sclerosis Wilke resources Inc. 138(2):329-334.

41. Quan Gan et al, 2005, Modulation surface charge, particle size and

morphological properties of chitosan –TPP nanoparticles intended for gene

delivery, Colloid and surface B: Biointerface, 44, p.65-73.

42. Quan Gan et al, 2007, Nano chitosan as a protein delivery carrier –

systematic examination of fabrication condition for efficient loading and

release, Colloid and surface B: Biointerface, 59, p. 24-34.

43. Rinaudo, M., 2006, Chitin and chitosan: properties and application,

Progress in polymer science, 31, 603-632.

44. Ro Dong Park, Kyu Jong Jo, You Young Jo (2002), Effects of chitin

and chitosan derivatives on the control of pathogenic fungi, Advances in

Chitin Science, 255-259.

45. Sedaghi et al, 2008, Preparation and characterization and antibacterial

activities of chitosan, trimethyl chitosan (TMC) and N-diethylmethyl

chitosan (DEMC) nanoparticles loaded with insulin using iontropic

gelation and polyelectrolyte complexation methods, international journal

pharmaceutics, (eccepted).

46. Sugano, M., Watanabe, S., Kishi, A., Izumi, M., & Ohtakara, A. (1988).

Hypocholesterolemic action of chitosan with different viscosity in rats.

Lipids, 23, 187-191.

47. Sun, L., Du, Y. et al. (2006) Preparation and charecterization and

antimicrobial activity of quaterinized carboxymethyl chitosan and

application as pulp-cap, Polymer, 47, 1796-1804.

48. Sunil, A., Anihotri et al, 2004, Recent advances on chitosan based

micro and nanoparticles in drug delivery, Journal controlled release, 100,

p. 5-28.

49. Tikhonov, V., Stepnova, E. A., Babak, V. G. et al. (2006) Bactericidal

and antifungal activity of a low molecular weight chitosan Xand its N-

/2(3)-(dodec-2 enyl) succinoyl/ derivatives, Carbohydrate polymer, 64, 66-

72.

50. Tsai G.J., Wu Z.Y., Su W.H., 2000 Antibacterial activity of a

chitooligosaccharide mixture prepared by cellulase digestion of shrimp

chitosan and its application to milk preservation. J Food Prot. 2000

Jun;63(6):747-52 PMID: 10852568

51. Tsai G.J., Zhang S.L., Shieh P.L., 2004 Antimicrobial activity of a

low-molecular-weight chitosan obtained from cellulase digestion of

chitosan. Journal of Food Protection, Volume 67, Number 2, 1 February

2004, pp. 396-398(3).

52. Tsai, M L et al., Xinge Zhang .,(2008), Cavitation effects versus stretch

effects resulted in different size and polydispersity of ionnotropic gelation

chitosan sodium tripolyphosphate nanoparticles, Carbohydrate polymer, 71

(448-457).

53. Van der Lubben, J.C. Verhoef, G. Borchard, H.E. Junginger,

Chitosan for mucosal vaccination, Advanced Drug Delivery Reviews 52

(2001) 139–144.

54. Zheng, Y (2007), Nanoparticles based on the complex of chitosan

with polyaspartic acid sodium salt: preparation, characterization and the

use for 5-fluorouracil delivery, European Journal of Pharmaceutic and

Biopharmaceutics, 67, 621-631.

PHỤ LỤC

1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer 300 kDa ñến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Escherichia coli

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

100ppm

200ppm

0ppm

10-6

Nồng ñộ Độ pha loãng

10- 7

Lặp lại1

166 89

145 65

130 45

111 57

101 43

10- 6 74

10- 7 25

10- 7 94

10- 8 28

Lặp lại2

169 94

143 69

124 48

110 55

105 41

Lặp lại3

168 95

146 64

126 51

109 48

106 45

1,91.109

1,58.109

1,44.109

1,34.109

9,30108

1,17.1010

83,57

86,36

87,55

88,55

92,02

2,36.109 79,65

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Nồng ñộ Chỉ số

0ppm Lặp lại 1 1,10.1010 Lặp lại 2 1,17.1010 Lặp lại 3 1,22.1010

2,31.109 2,39.109 2,39.109

20ppm

Mật ñộ (CFU/ml) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

40ppm 79,57 1,92.109 80,40 1,90.109 79,00 1,90.109

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

60ppm 83,58 1,56.109 84,42 1,60.109 82,72 1,59.109

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

80ppm 86,66 1,49.109 86,88 1,39.109 85,54 1,45.109

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

100ppm 87,26 1,32.109 88,60 1,37.109 86,81 1,30.109

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

200ppm 88,71 9,5.108 88,77 9,3.108 88,18 9.108

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%) 91,88 92,37 91,81

Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 18. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: nongdooligochitosanoligomer) with values from 1 to 6 Variable 3: tilechet Grand Mean = 0.863 Grand Sum = 15.532 Total Count = 18

T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.858 5.146 2 * 0.863 5.177 3 * 0.868 5.208 ------------------------------------------------- * 1 0.797 2.390 * 2 0.836 2.507 * 3 0.864 2.591 * 4 0.876 2.627 * 5 0.886 2.657 * 6 0.920 2.761 ------------------------------------------------- A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 6.9939 0.0126 2 Factor A 5 0.027 0.005 233.7319 0.0000 -3 Error 10 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 17 0.028 ----------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.56% s_ for means group 1: 0.0020 Number of Observations: 6 y s_ for means group 2: 0.0028 Number of Observations: 3 y Error Mean Square = 0.0005000 Error Degrees of Freedom = 5 No. of observations to calculate a mean = 3 Least Significant Difference Test LSD value = 0.07362 at alpha = 0.010 A&k2S Original Order Ranked Order Mean 1 = 0.8000 C Mean 6 = 0.9200 A Mean 2 = 0.8400 BC Mean 5 = 0.8900 AB Mean 3 = 0.8600 ABC Mean 4 = 0.8800 AB Mean 4 = 0.8800 AB Mean 3 = 0.8600 ABC Mean 5 = 0.8900 AB Mean 2 = 0.8400 BC Mean 6 = 0.9200 A Mean 1 = 0.8000 C

200ppm

2.Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer 300kDa ñến khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn Staphylococus aureus 100ppm

80ppm

20ppm

60ppm

40ppm

0ppm

Nồng ñộ

Độ pha loãng

10-6

10-7

10-6

10-7

10-6

10-7

10-6

10-7

10-6

10-7

10-8

10-7

Lặp lại 1

206

118

178

101

150

133

112

Lặp lại 2

210

119

175

153

137

115

Lặp lại 3

212

120

179

103

154

138

111

2,35. 109

2,10. 109

1,84.109

1,49.109

1,07.109

1,07.1010

76,52

80,24

82,88

86,09

90,02

3,00. 109 72,31

Mật ñộ ( CFU/m) Tỉ lệ chết ( %)

Chỉ số

Lặp lại 1 1,09.1010 Lặp lại 2 1,07.1010 Lặp lại 3 1,07.1010 Nồng ñộ 0ppm

2,94.109 2,99.109 3,01.109 20ppm

40ppm 72,05 2,49.109 71,86 2,56.109 73,02 2,53.109

60ppm 76,72 2,10.109 76,07 2,10.109 76,78 2,21.109

80ppm 79,71 1,85.109 80,78 1,83.109 80,21 1,83.109

Mật ñộ (CFU/ml) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

100ppm Mật ñộ 82,71 1,53.109 82,89 1,47.109 82,21 1,49.109

(CFU/ml) Tỉ lệ chết (%)

200ppm Mật ñộ 85,70 1,09.109 86,26 1,04.109 86,33 1,07.109

(CFU/ml) Tỉ lệ chết (%) 90,18 89,81 90,28

Function: FACTOR

Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 18. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: nongdochitosanoligomer) with values from 1 to 6 Variable 3: tilechet Grand Mean = 0.814 Grand Sum = 14.643 Total Count = 18 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.815 4.892 2 * 0.812 4.874 3 * 0.813 4.877 ------------------------------------------------- * 1 0.723 2.169 * 2 0.765 2.296 * 3 0.802 2.405 * 4 0.829 2.488 * 5 0.861 2.583 * 6 0.901 2.703 -------------------------------------------------

A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E

K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 1.0843 0.3748 2 Factor A 5 0.062 0.012 818.1113 0.0000 -3 Error 10 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 17 0.063 ---------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.48% s_ for means group 1: 0.0016 Number of Observations: 6 y s_ for means group 2: 0.0023 Number of Observations: 3 y

Error Mean Square = 0.001200 Error Degrees of Freedom = 5 No. of observations to calculate a mean = 3

Least Significant Difference Test LSD value = 0.1140 at alpha = 0.010 A&k2S Original Order Ranked Order Mean 1 = 0.7200 C Mean 6 = 0.9000 A Mean 2 = 0.7700 BC Mean 5 = 0.8600 AB Mean 3 = 0.8000 ABC Mean 4 = 0.8300 ABC Mean 4 = 0.8300 ABC Mean 3 = 0.8000 ABC Mean 5 = 0.8600 AB Mean 2 = 0.7700 BC Mean 6 = 0.9000 A Mean 1 = 0.7200 C A&k0SA&k2G

3.Ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan (C:TPP = 4:1, 300kDa) ñến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Escherichia coli

20ppm 40ppm 60ppm 0ppm 80ppm

10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8 Nồng ñộ Độ pha loãng

10-5 198 120 158 84 128 63 138 60 94 28 Lặp lại 1

Lặp lại 2 200 119 155 81 132 62 137 57 95 34

Lặp lại 3 198 121 157 85 135 58 134 64 99 36

2,89.108 2,81.108 1,75. 108 1,78. 108

1,17.1010

97,50 98,12 98,49 98,45

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Nồng ñộ 0ppm 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm

Mật ñộ (CFU/ml)

1,80.106

Tỉ lệchết ( %) 97,37

Tỉ lệchết ( %) 98,00

Tỉ lệchết ( %) 98,42

Tỉ lệchết ( %) 98,36

1,76.106

97,37

98,17

98,49

1,80.106

Mật ñộ (CFU/ml) 2,89.106 2,90.106 2,90.106

97,37

Mật ñộ (CFU/ml) 2,20.106 2,14.106 2,20.106

98,19

Mật ñộ (CFU/ml) 1,73.106 1,76.106 1,75.106

98,56

98,52

Chỉ số Mật ñộ (CFU/ml) Lặp lại 1 1,10.108 Lặp lại 2 1,17.108 Lặp lại 3 1,22.108

4.Ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan (C:TPP = 5:1, 300kDa) ñến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Escherichia coli

20ppm 40ppm 60ppm 0ppm 80ppm

Nồng ñộ Độ pha loãng 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8 10-6

10-5 172 93 Lặp lại 1 115 34 91 33 99 32 94 28

Lặp lại 2 175 95 113 35 92 34 95 28 95 34

Lặp lại 3 173 98 118 37 90 31 98 27 99 36

1,36.108 1,12.108 1,14.108

1,17.1010

2,44.108 97,89 98,82 99,03 99,01 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

Nồng ñộ

Chỉ số

Tỉ lệchết ( %)

0ppm Mật ñộ (CFU/ml)

Mật ñộ (CFU/ml)

Tỉ lệchết ( %)

Tỉ lệ chết ( %)

Tỉ lệchết ( %)

Lặp lại 1

1,10.108

2,40.106

97,81

1,35.106

98,77

1,12.106

98,98

1,19.106

98,91

Lặp lại 2

1,17.108

2,45.106

97,90

1,34.106

98,85

1,14.106

99,02

1,11.106

99,05

Lặp lại 3

1,22.108

2,46.106

97,98

1,40.106

98,85

1,10.106

99,09

1,13.106

99,07

5.Ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan (C:TPP = 6:1, 300kDa) ñến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Escherichia coli

Nồng ñộ 40ppm 60ppm 0ppm 80ppm

20ppm 10-4 10-5 10-4 10-5 10-3 10-4 10-3 10-4 10-7 10-8

Độ pha loãng Lặp lại 1 178 87 105 27 89 30 97 25 94 28

Lặp lại 2 172 90 96 30 82 28 92 28 95 34

Lặp lại 3 175 89 82 28 85 31 90 26 99 36

2,39.107 1,11.107 1,04. 106 1,08.106

1,17.1010

99,79 99,89 99,99 99,99

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Nồng ñộ

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

0ppm

Tỉ lệ chết ( %)

99,78

Tỉ lệ chết ( %) 99,89

99,99

Tỉ lệ chết ( %) 99,99

99,79

99,90

99,99

Mật ñộ (CFU/ml) 2,40.105 2,38.105 2,40.105

99,80

Mật ñộ (CFU/ml) 1,20.105 1,14.105 1,10.105

99,90

Mật ñộ (CFU/ml) 1,08.104 1,00.104 1,05.104

99,99

Mật ñộ (CFU/ml) 1,10.104 1,09.104 1,05.104

99,99

Chỉ số Mật ñộ (CFU/ml) Lặp lại 1 1,10.108 Lặp lại 2 1,17.108 Lặp lại 3 1,22.108

Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 36.

Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: nongdovatile) with values from 1 to 12 Variable 3: tilechet Grand Mean = 0.989 Grand Sum = 35.610 Total Count = 36 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.989 11.863 2 * 0.989 11.872 3 * 0.990 11.876 ------------------------------------------------- * 1 0.975 2.925 * 2 0.981 2.944 * 3 0.985 2.955 * 4 0.985 2.954 * 5 0.979 2.937 * 6 0.988 2.965 * 7 0.990 2.971 * 8 0.990 2.970 * 9 0.998 2.994 * 10 0.999 2.997 * 11 1.000 3.000 * 12 1.000 3.000 ------------------------------------------------- A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 17.5845 0.0000 2 Factor A 11 0.002 0.000 1072.1991 0.0000 -3 Error 22 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------------- Total 35 0.002 ----------------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.05% s_ for means group 1: 0.0001 Number of Observations: 12 y s_ for means group 2: 0.0003 Number of Observations: 7. Ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan (C:TPP = 4:1, 300kDa) ñến khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn Staphylococcus aureus

20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm

10-6 10-5

Nồng ñộ Độ pha loãng Lặp lại 1 10-6 10-5 197 106 162 87 10-6 10-5 145 78 10-6 10-5 147 80 10-7 88 10-8 32

Lặp lại 2 196 105 165 88 146 74 142 77 86 32

Lặp lại 3 193 108 166 83 150 76 143 75 89 29

2,27. 108 2,02.108 2,01.108 2,74. 108

1,07. 1010

97,44 97,92 98,14 98,11 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Nồng ñộ

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

0ppm

Tỉ lệchết ( %) 97,44

Tỉ lệchết ( %) 97,92

Tỉ lệchết ( %) 98,14

Tỉ lệchết ( %) 98,11

97,44

97,92

98,14

98,11

Mật ñộ (CFU/ml) 2,75.106 2,75.106 2,75.106

97,44

Mật ñộ (CFU/ml) 2,26.106 2,26.106 2,26.106

97,92

Mật ñộ (CFU/ml) 2,02.106 2,02.106 2,02.106

98,14

Mật ñộ (CFU/ml) 2,06.106 2,06.106 2,06.106

98,11

Chỉ số Mật ñộ (CFU/ml) Lặp lại 1 1,09.108 Lặp lại 2 1,07.108 Lặp lại 3 1,07.108

8. Ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan (C:TPP = 5:1, 300kDa) ñến khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn Staphylococcus aureus Nồng ñộ 80ppm 0ppm 20ppm 40ppm 60ppm

Độ pha loãng 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8

Lặp lại 1 143 75 128 52 87 35 84 34 88 32

Lặp lại 2 147 72 126 50 90 30 89 32 86 32

Lặp lại 3 89 29

144 78 1,99. 108 129 49 1,61. 108 86 28 1,07.108 85 33 1,07.108

1,07. 1010

98,14 98,50 99,00 98,99 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Nồng ñộ

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

0ppm

Tỉ lề chết ( %)

Tỉ lệchết ( %) 98,18

Tỉ lệchết ( %) 98,50

Tỉ lệchết ( %) 98,99

99,01

98,14

98,50

98,98

98,97

Mật ñộ (CFU/ml) 1,98.106 1,99.106 1,01.106

98,12

Mật ñộ (CFU/ml) 1,63.106 1,60.106 1,61.106

98,49

Mật ñộ (CFU/ml) 1,10.106 1,09.106 1,03.106

99,03

Mật ñộ (CFU/ml) 1,07.106 1,10.106 1,07.106

99,00

Chỉ số Mật ñộ (CFU/ml) Lặp lại 1 1,09.108 Lặp lại 2 1,07.108 Lặp lại 3 1,07.108

9. Ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan (C:TPP = 6:1, 300kDa) ñến khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn Staphylococcus aureus Nồng ñộ 80ppm 0ppm 20ppm 40ppm 60ppm

Độ pha loãng 10-4 10-5 10-4 10-5 10-4 10-5 10-4 10-5 10-7 10-8

Lặp lại 1 228 129 194 106 119 50 112 51 88 32

Lặp lại 2 234 127 192 109 116 55 117 53 86 32

Lặp lại 3 89 29

230 130 199 107 118 52 1,54. 107 2,74. 107 3,26. 107 115 54 1,50. 107

1,07. 1010

99,73 99,74 99,84 99,85 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

20ppm

40ppm

60ppm

Tỉ lệ chết ( %) 99,70

Tỉ lệ chết ( %) 99,75

Tỉ lệchết ( %) 99,84

Tỉ lệ chết ( %) 99,86

99,69

99,74

99,84

99,85

Mật ñộ (CFU/ml) 3,24.105 3,28.105 3,09.105

99,80

Mật ñộ (CFU/ml) 2,72.105 2,73.105 2,78.105

99,74

Mật ñộ (CFU/ml) 1,53.105 1,55.105 1,54.105

99,84

80ppm Mật ñộ (CFU/ml) 1,48.105 1,54.105 1,53.105

99,85

Nồng ñộ 0ppm Chỉ số Mật ñộ (CFU/ml) Lặp lại 1 1,09.108 Lặp lại 2 1,07.108 Lặp lại 3 1,07.108

Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 36. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: nongdovatilesta) with values from 1 to 12 Variable 3: tilechet Grand Mean = 0.988 Grand Sum = 35.562 Total Count = 36 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.988 11.855 2 * 0.988 11.853 3 * 0.988 11.854 ------------------------------------------------- * 1 0.974 2.923 * 2 0.979 2.937 * 3 0.981 2.943 * 4 0.981 2.944 * 5 0.981 2.944 * 6 0.985 2.955 * 7 0.990 2.970 * 8 0.990 2.970 * 9 0.997 2.992 * 10 0.997 2.992 * 11 0.998 2.995 * 12 0.999 2.996 ------------------------------------------------- A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E

100

K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 1.2291 0.3119 2 Factor A 11 0.002 0.000 3107.7283 0.0000 -3 Error 22 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 35 0.002 ---------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.03% s_ for means group 1: 0.0001 Number of Observations: 12 y s_ for means group 2: 0.0002 Number of Observations: 3 y

10.Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan có khối lượng 300kDa ( C:TPP=6:1, pH=5,5; 900 vòng; 60 phút) trên vi khuẩn Escherichia coli Nồng ñộ 80ppm 0ppm 20ppm 40ppm 60ppm

Độ pha loãng 10-4 10-5 10-4 10-5 10-3 10-4 10-3 10-4 10-7 10-8

Lặp lại 1 186 82 85 30 92 26 98 33 96 32

Lặp lại 2 190 86 92 32 95 28 99 31 96 34

99 31 Lặp lại 3

187 85 2,58. 107 90 35 1,10. 107 96 31 1,11.106 102 34 1,20. 106

1,17.1010

99,79 99,90 99,99 99,99 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Nồng ñộ

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

0ppm

Tỉ lệ chết ( %) 99,79

Tỉ lệ chết ( %) 99,91

Tỉ lệ chết ( %) 99,99

Tỉ lệchết ( %) 99,99

99,78

99,90

99,99

99,79

Mật ñộ (CFU/ml) 1,04.105 1,12.105 1,13.105

99,90

Mật ñộ (CFU/ml) 1,07.104 1,11.104 1,15.104

99,99

Mật ñộ (CFU/ml) 1,19.104 1,18.104 1,23.104

99,99

Mật ñộ Chỉ số Mật ñộ (CFU/ml) (CFU/ml) Lặp lại 1 1,16.1010 2,43.105 Lặp lại 2 1,18.1010 2,50.105 Lặp lại 3 1,18.1010 2,47.105

101

Độ pha loãng 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8

11.Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan có khối lượng 30kDa ( C:TPP=6:1, pH=5,5; 900 vòng; 60 phút) trên vi khuẩn Escherichia coli Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm

Lặp lại 1 196 103 153 82 86 35 85 36 96 32

Lặp lại 2 193 102 156 81 84 32 88 34 96 34

99 31 Lặp lại 3

194 99 2,68.108 151 79 2,12.108 87 30 1,07.108 87 38 1,11.108

1,17.1010

97,71 98,18 99,08 99,04 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

Chỉ số

Mật ñộ (CFU/ml) 2,71.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,66

Mật ñộ (CFU/ml) 2,13.106

Tỉ lệ chết ( %) 98,16

Mật ñộ (CFU/ml) 1,10.106

Tỉ lệ chết ( %) 99,05

Mật ñộ (CFU/ml) 1,10.106

Tỉ lệ chết ( %) 99,05

Nồng ñộ

0ppm Mật ñộ (CFU/ml) 1,16.1010

Lặp lại 1

1,18.1010

2,68.106

97,72

2,15.106

98,17

1,05.106

99,11

1,10.106

99,06

Lặp lại 2

1,18.1010

2,66.106

97,77

2,09.106

98,22

1,06.106

99,10

1,13.106

99,04

Lặp lại 3

12.Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan có khối lượng 20kDa ( C:TPP=6:1, pH=5,5; 900 vòng; 60 phút) trên vi khuẩn Escherichia coli

102

Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm

Độ pha loãng 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8

Lặp lại 1 208 120 169 94 119 53 124 54 96 32

Lặp lại 2 209 121 168 91 121 57 120 58 96 34

Lặp lại 3 99 31

212 124 165 2,94.108 97 2,37.108 116 52 1,57.108 121 57 1,60.108

1,17.1010

97,43 97,95 98,66 98,62 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

Chỉ số

Nồng ñộ

0ppm Mật ñộ (CFU/ml) 1,16.108

Mật ñộ (CFU/ml) 2,98.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,43

Mật ñộ (CFU/ml) 2,39.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,93

Mật ñộ (CFU/ml) 1,56.106

Tỉ lệ chết ( %) 98,65

Tỉ lệ chết ( %) 98,61

Lặp lại 1

1,18.108

3,00.106

97,45

3,35.106

98,00

1,61.106

98,63

Lặp lại 2

1,18.108

3,05.106

97,41

3,38.106

97,93

1,52.106

98,71

Mật ñộ (CFU/ml) 1,61.106 1,61.106 1,61.106

98,63

Lặp lại 3

T A B L E O F M E A N S

1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.989 11.862 2 * 0.989 11.864

103

3 * 0.989 11.865 ------------------------------------------------- * 1 0.974 2.923 * 2 0.980 2.939 * 3 0.987 2.960 * 4 0.986 2.959 * 5 0.977 2.931 * 6 0.982 2.946 * 7 0.991 2.973 * 8 0.990 2.971 * 9 0.998 2.994 * 10 0.999 2.997 * 11 1.000 3.000 * 12 1.000 3.000 ------------------------------------------------- A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 1.7682 0.1940 2 Factor A 11 0.003 0.000 3538.4845 0.0000 -3 Error 22 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 35 0.003 ----------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.03% s_ for means group 1: 0.0001 Number of Observations: 12 y s_ for means group 2: 0.0002 Number of Observations: 3 y 13.Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan có khối lượng 300kDa ( C:TPP=6:1, pH=5,5; 900 vòng; 60 phút) trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

Nồng ñộ 20ppm 40ppm 60ppm 80ppm 0ppm

104

Mật ñộ 10-5 10-6 10-4 10-5 10-4 10-5 10-4 10-5 10-7 10-8

87 35 188 108 120 51 123 60 90 29 Lặp lại 1

90 38 190 105 118 53 119 57 87 30 Lặp lại 2

89 33 Lặp lại 3

94 32 1,14.108 187 101 117 2,664.107 55 1,56.107 122 59 1,63.107

1,08. 1010

98,94 99,75 99,84 99,84 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

Chỉ số

Mật ñộ

(CFU/ml)

Mật ñộ (CFU/ml)

Nồng ñộ

0ppm Mật ñộ (CFU/ml)

Mật ñộ (CFU/ml)

Tỉ lệ chết ( %)

Lặp lại 1

1,08.1010

1,10.106

98,98

2,69.105

1,55.105

99,84

1,66.105

Tỉ lệ chết ( %) 99,75

Tỉ lệ chết ( %) 99,84

Lặp lại 2

1,06.1010

1,16.106

98,90

2,68.105

1,55.105

99,84

1,60.105

99,74

99,84

Lặp lại 3

1,10.1010

1,14.106

98,96

2,61.105

1,56.105

99,84

1,64.105

99,76

99,85

15. Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan có khối lượng 30kDa (C:TPP=6:1, pH=5,5; 900 vòng; 60 phút) trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. Nồng ñộ 80ppm 0ppm 20ppm 40ppm 60ppm

Độ pha loãng 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8

Lặp lại 1 238 137 182 93 138 82 137 84 90 29

105

Lặp lại 2 239 134 183 96 137 81 136 78 87 30

Lặp lại 3 237 135 178 97 140 74 139 80 89 33

2,51.108 1,97.108 1,98. 108

1,08. 1010

97,67 98,16 98,16

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) 3,39.108 96,85

Nồng ñộ

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

Chỉ số

Lặp lại 1

0ppm Mật ñộ (CFU/ml) 1,08.1010

Mật ñộ (CFU/ml) 3,40.106

Tỉ lệ chết ( %) 96,85

Mật ñộ (CFU/ml) 2,50.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,68

Mật ñộ (CFU/ml) 2,00.106

Tỉ lệ chết ( %) 98,14

Mật ñộ (CFU/ml) 2,00.106

Tỉ lệ chết ( %) 98,14

Lặp lại 2

1,06.1010

3,39.106

96,80

2,53.106

97,61

1,98.106

98,13

1,94.106

98,16

Lặp lại 3

1,10.1010

3,38.106

96,92

2,50.106

97,72

1,94.106

98,23

1,99.106

98,19

14. Khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan có khối lượng 20kDa ( C:TPP=6:1, pH=5,5; 900 vòng; 60 phút) trên vi khuẩn Staphylococcus aureus Nồng ñộ 80ppm 0ppm 20ppm 40ppm 60ppm

Độ pha loãng 10-6 10-7 10-5 10-6 10-5 10-6 10-5 10-6 10-7 10-8

Lặp lại 1 79 30 200 117 181 95 172 101 90 29

106

Lặp lại 2 82 26 195 116 179 94 175 92 30 87

Lặp lại 3 33 89

80 28 9,85.108 198 113 178 99 2,50.108 2,873. 108 188 94 2,49.108

1,08. 1010

90,89 97,36 97,68 97,69

20ppm

40ppm

60ppm

80ppm

Chỉ số

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Nồng ñộ

0ppm Mật ñộ (CFU/ml) 1,08.1010

Lặp lại 1

Mật ñộ (CFU/ml) 9,90.107

Tỉ lệ chết ( %) 90,83

Mật ñộ (CFU/ml) 2,88.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,33

Mật ñộ (CFU/ml) 2,50.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,68

Mật ñộ (CFU/ml) 2,48.106

Tỉ lệ chết ( %) 97,70

Lặp lại 2

90,75

97,33

97,66

97,71

1,06.1010 1,10.1010

Lặp lại 3

9.80.107 9.80.107

91,09

2,82.106 2,82.106

97,43

2,48.106 2,51.106

97,71

2,42.106 2,56.106

97,67

Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 36. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: nongdovakhoiluong) with values from 1 to 12 Variable 3: tilechet Grand Mean = 0.977 Grand Sum = 35.187 Total Count = 36 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.977 11.728 2 * 0.977 11.725 3 * 0.978 11.734 ------------------------------------------------- * 1 0.909 2.727 * 2 0.974 2.921 * 3 0.977 2.931 * 4 0.977 2.931 * 5 0.969 2.906 * 6 0.977 2.930 * 7 0.982 2.945

* 8 0.982 2.945 * 9 0.989 2.968 * 10 0.998 2.993 * 11 0.998 2.995 * 12 0.998 2.995 -------------------------------------------------

A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E

K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 6.2715 0.0070 2 Factor A 11 0.019 0.002 6172.9265 0.0000 -3 Error 22 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 35 0.019 ---------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.05% s_ for means group 1: 0.0002 Number of Observations: 12 y s_ for means group 2: 0.0003 Number of Observations: 3 y Error Mean Square = 2.000e-005 Error Degrees of Freedom = 11 No. of observations to calculate a mean = 3 Least Significant Difference Test LSD value = 0.01134 at alpha = 0.010 A&k2S Original Order Ranked Order Mean 1 = 0.9100 D Mean 10 = 1.000 A Mean 2 = 0.9700 C Mean 11 = 1.000 A Mean 3 = 0.9800 BC Mean 12 = 1.000 A Mean 4 = 0.9800 BC Mean 9 = 0.9900 AB Mean 5 = 0.9700 C Mean 7 = 0.9800 BC Mean 6 = 0.9800 BC Mean 8 = 0.9800 BC Mean 7 = 0.9800 BC Mean 4 = 0.9800 BC Mean 8 = 0.9800 BC Mean 3 = 0.9800 BC Mean 9 = 0.9900 AB Mean 6 = 0.9800 BC Mean 10 = 1.000 A Mean 2 = 0.9700 C Mean 11 = 1.000 A Mean 5 = 0.9700 C Mean 12 = 1.000 A Mean 1 = 0.9100 D A&k0SA&k

107

108

16.Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli Độ pH

Môi trường

10-3

10-4

10-3

10-4

10-5

10-6

10-5

10-6

10-5

10-6

10-5

10-6

10-7

10-8

128 53

118 51

105 41

117

173 79

Độ pha loãng Lặp lại 1

125 48

123 55

103 37

111

168 84

Lặp lại 2

130 49

120 54

102 38

114

170 82

Lặp lại 3

Mật ñộ (CFU/ml)

1,58. 106

1,00. 108

1,29. 108

1,41. 108

2,29. 108

1,61. 106

4,5 5,0 6,5 7,0 5,5 6,0

1,17.1010

99,99

99,98

99,14

98,90

98,79

98,04

Tỉ lệ chết ( %)

Độ pH Chỉ số Lặp lại 1 Lặp lại 2 Lặp lại 3

Môi trường Mật ñộ

1,16.1010 1,64.106 1,18.1010 1,57.106 1,18.108 1,62.106 4,5

99,99 99,98 99,99

1,53.104 1,61.106 1,58.106 5,0 Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml)

109

99,98 99,98 99,98

9,9.107 1,03.108 9,7.107 5,5

99,14 99,12 99,17

1,32.108 1,27.108 1,27.108 6,0

98,86 98,92 98,92

1,48.108 1,38.108 1,38.108 6,5

98,72 98,83 98,83

2,29.108 2,29.108 2,29.108 7,0

98,02 98,05 98,05

Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Title: Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 18. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: thangpH) with values from 1 to 6

Variable 3: tilechet

Grand Mean = 0.991 Grand Sum = 17.845 Total Count = 18

T A B L E O F M E A N S

1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.991 5.947 2 * 0.991 5.949 3 * 0.992 5.949 ------------------------------------------------- * 1 1.000 2.999 * 2 1.000 2.999 * 3 0.991 2.974

110

* 4 0.989 2.967 * 5 0.988 2.964 * 6 0.980 2.941 ------------------------------------------------- A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 3.2710 0.0807 2 Factor A 5 0.001 0.000 2252.4989 0.0000 -3 Error 10 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 17 0.001 ----------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.03% s_ for means group 1: 0.0001 Number of Observations: 6 y s_ for means group 2: 0.0002 Number of Observations: 3 y 17.Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus

10-4

10-5

10-4

10-5

10-6

10-5

10-6

10-5

10-6

10-5

10-6

Độ pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

Môi trường 10-7

10-8

107 50 116 47 87

102

128

162

90 29

105 49 120 48 90

107

130

159

87 30

Độ pha loãng Lặp lại 1

104 47 115 45 89

115

127

160

89 33

Lặp lại 2

Lặp lại 3

1,08.1010

1,40.107

1,48.107

1,07. 08

1,37. 108

1,73. 108

2,20. 108

111

99,86 99,86 99,00 98,74 98,38 97,95

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Độ pH

Chỉ số

Lặp lại 2 1,06.108

Lặp lại 3 1,10.108

Môi trường

Mật ñộ

1,40.105

1,37.105

1,42.105

Lặp lại 1 1,08.108

4,5

99,86

99,87

99,86

1,52.105

1,45.105

1,48.105

5,0

99,85

99,86

1,04.106

1,09.106

1,10.106

5,5

98,97

99,00

99,03

1,31.106

1,42.106

1,31.106

6,0

98,76

98,70

98,78

1,73.106

1,74.106

1,73.106

6,5

98,36

98,41

98,39

2,20.106

2,21.106

2,20.106

7,0

97,92

97,99

97,96

Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %) Mật ñộ (CFU/ml) Tỉ lệ chết ( %)

Data file: A&k0SA&k2GPHSTAA&k0S Title: Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 18. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: pH) with values from 1 to 6 Variable 3: tilechet

112

Grand Mean = 0.990 Grand Sum = 17.814 Total Count = 18 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total ------------------------------------------------- 1 * 0.990 5.939 2 * 0.990 5.937 3 * 0.990 5.938 ------------------------------------------------- * 1 0.999 2.996 * 2 0.999 2.996 * 3 0.990 2.970 * 4 0.987 2.962 * 5 0.984 2.952 * 6 0.980 2.939 ------------------------------------------------- A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob ----------------------------------------------------------------------- 1 Replication 2 0.000 0.000 1.6183 0.2461 2 Factor A 5 0.001 0.000 2610.5096 0.0000 -3 Error 10 0.000 0.000 ----------------------------------------------------------------------- Total 17 0.001 ----------------------------------------------------------------------- Coefficient of Variation: 0.03% s_ for means group 1: 0.0001 Number of Observations: 6 y s_ for means group 2: 0.0002 Number of Observations: 3 y

113

HÌNH ẢNH ĐỀ TÀI

Hình 1. Ảnh khấy từ tạo hạt nano chitosan

114

Hình 2. Ảnh dung dịch nano chitosan với tỉ lệ CS:TPP = 3:1

Hình 3. Ảnh dung dịch nano chitosan với tỉ lệ CS:TPP = 4:1

115

Hình 4. Ảnh dung dịch nano chitosan với tỉ lệ CS:TPP = 5:1

Hình 5. Ảnh dung dịch nano chitosan với tỉ lệ CS:TPP = 6:1

116

Hình 6. Khuẩn lạc Escherichia coli trong môi trường nano chitossan ( 300kDa, CS:TPP= 6:1, 60ppm, ñộ pha loãng 10-4)

Hình 7. Khuẩn lạc Escherichia coli trong môi trường oligomer chitossan ( 300kDa, 60ppm, ñộ pha loãng 10-6)

117

Hình 8. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trong môi trường nano chitossan ( 300kDa, CS:TPP= 6:1, 60ppm, ñộ pha loãng 10-5)

Hình 9. Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trong môi trường oligomer chitossan ( 300kDa, 60ppm, ñộ pha loãng 10-7)

118

119