Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHÍ HỮU VIỆT

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHÍ HỮU VIỆT

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT BẮC KẠN

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp làm các nghiên cứu trong luận văn này.

Mọi kết quả thu được là trung thực, không chỉnh sửa, không sao chép từ kết

quả nghiên cứu khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu của luận văn này chưa

từng được công bố.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên!

Tác giả luận văn

i

Phí Hữu Việt

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, tôi

xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo

mọi điều kiện, giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài này.

Các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của

Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình

giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.

Cán bộ kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật – Khoa Sinh học-

Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình,

bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt

thời gian học tập.

Thái Nguyên, tháng 3 năm 2017

Tác giả luận văn

ii

Phí Hữu Việt

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii

MỤC LỤC ......................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iv

DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. vi

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt ... 3

1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ......................................... 3

1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ............................................... 4

1.2. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 5

1.2.1. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới ................................................ 5

1.2.2. Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam ................................................. 5

1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật ................. 6

1.3.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro ................................ 7

1.3.2. Quy trình nhân giống in vitro ............................................................ 9

1.4. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong

nuôi cấy mô thực vật ..................................................................................... 11

1.4.1. Auxin ............................................................................................... 12

1.4.2. Cytokinin ......................................................................................... 13

1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm 14

1.6. Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi cấy

iii

in vitro ............................................................................................................ 15

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 19

2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ................................ 19

2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................. 19

2.1.2. Hoá chất, thiết bị .............................................................................. 19

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................ 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 20

2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro.............................................. 20

2.2.2. Phương pháp đưa cây ra vườn ươm ................................................ 22

2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................ 23

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 24

3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt

Bắc Kạn ......................................................................................................... 24

3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP hoặc kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt

Bắc Kạn ......................................................................................................... 27

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ........ 27

3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn ..... 30

3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh chồi

của quýt Bắc Kạn ........................................................................................... 33

3.3.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi cây

quýt Bắc Kạn ............................................................................................ 33

3.3.2. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi quýt

Bắc Kạn ..................................................................................................... 35

3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ cây quýt Bắc Kạn .......... 38

3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra

ngoài tự nhiên ................................................................................................ 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 43

1. Kết luận ...................................................................................................... 43

2. Đề nghị....................................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 44

iv

PHỤ LỤC ......................................................................................................... 47

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid

BAP : Benzylamino purine

cs : Cộng sự

CT : Công thức

DNA : Deoxyribo nucleic acid

ĐC : Đối chứng

IAA : indol acetic acid

IAA : indole acetic acid

IBA : Indol butyric acid

Kinetin : 6-furfurylamino purine

MS : Murashige and Skoog (1962)

iv

α-NAA : α- naphthalene acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS ........................................ 19

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt

quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần nuôi cấy) .............................................. 25

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn ... 28

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn 31

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của

cây quýt Bắc Kạn .......................................................................... 34

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của

cây quýt Bắc Kạn .......................................................................... 36

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ của cây quýt Bắc Kạn ... 39

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc

v

Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần) ................................................ 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt

quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần) ............................................................. 26

Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn..... 30

Hình 3.3. Ảnh của kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn (sau

8 tuần) ................................................................................... 32

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi của

quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 35

Hình 3.5. Ảnh hường của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi của

quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 37

Hình 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành và phát triển rễ của cây

quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy) .............................................. 40

Hình 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc

vi

Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần) ................................................ 42

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là cây ăn quả được nhiều người biết

đến với vị ngọt mát, thơm đặc trưng, có chứa nhiều vitamin, chất khoáng và

các chất dinh dưỡng cần thiết khác cho con người. Các chuyên gia về dinh

dưỡng khuyên ta nên tích cực ăn quýt hàng ngày.

Cây quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai

trò tích cực trong việc phát triển kinh tế của nhiều địa phương. Do chất lượng

quả tốt nên nhu cầu tiêu thụ quýt trên thị trường ngày càng tăng với số lượng

lớn. Giá thành ổn định đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người trồng quýt,

nhiều hộ gia đình đã thoát nghèo và vươn lên làm giàu từ cây quýt.

Trồng quýt còn có vai trò phủ xanh đất trống đồi trọc, giúp tạo cảnh quan

và bảo vệ môi trường sinh thái. Với chiều cao cây từ 2,0-3,5m, lá xanh che phủ

quanh năm, thích nghi với điều kiện sống khô hạn, nên cây quýt rất phù hợp

với vùng trung du và miền núi. Do đó, có thể trồng quýt trên các đồi dốc vừa

đem lại hiệu quả kinh tế vừa phủ xanh đồi trọc chống xói mòn, bảo vệ môi

trường sinh thái. Không những thế, quýt cũng có thể trồng trong vườn nhà, cây

cao vừa phải, lá thường xanh, hoa quả màu sắc đẹp, có tinh dầu tỏa ra mùi

thơm mát, do đó nó còn được trồng để làm cảnh.

Cây quýt Bắc Kạn được trồng chủ yếu ở huyện Chợ Đồn, có vị nọt mát,

hương thơm đặc trưng, là loại quả quý cần được bảo tồn. Đồng thời, cây quýt

đã được Ủy ban Nhân dân tỉnh Bắc Kạn xác định là cây trồng thế mạnh đóng

vai trò chiến lược trong phát triển kinh tế, do đó đã có nhiều chính sách và chế

độ phát triển cây quýt. Tính đến năm 2015, diện tích quýt của toàn tỉnh Bắc

Kạn lên tới 2200 ha, tăng gấp 5 lần so với năm 2005, tổng sản lượng khoảng

10000 tấn/năm đã mang lại giá trị sản xuất trên 100 tỷ đồng cho nông dân. Tuy

1

nhiên, giá trị đó vẫn chưa xứng tầm với tiềm năng sẵn có của địa phương. Một

trong những lí do làm năng suất của cây quýt còn thấp là nhiều vườn quýt khai

thác lâu năm đã bị thoái hóa không những làm năng suất thấp mà chất lượng

quả cũng bị giảm. Do đó, để tăng năng suất và nâng cao chất lượng thì cần có

biện pháp trồng cải tạo những diện tích quýt thoái hóa. Bên cạnh đó, chiến lược

trong những năm tới, tỉnh định hướng khoảng 1000 ha quýt chăm sóc theo tiêu

chuẩn VietGap nên nhu cầu cây giống tốt là rất lớn.

Phương pháp nhân giống in vitro giúp tạo ra một số lượng lớn giống cây

trồng trong khoảng thời gian ngắn, các cây con mang đặc điểm giống nhau và

giống với dòng mẹ nên có thể tạo quần thể đồng nhất. Đặc biệt, nhân giống in

vitro còn tạo ra giống cây sạch bệnh do được nuôi cấy trong điều kiện vô trùng,

từ đó đáp ứng yêu cầu sản suất rau quả sạch ngày nay.

Từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu nhân giống cây

quýt Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật".

2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu được môi trường nhân giống quýt Bắc Kạn phù hợp trong

ống nghiệm.

Xác định được giá thể phù hợp cho việc chuyển cây từ môi trường nuôi

cấy ra vườn ươm.

3. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu khử trùng hạt quýt Bắc Kạn nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban

đầu trong ống nghiệm.

Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin lên sự phát sinh chồi

trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát

sinh chồi trong ống nghiệm của giống quýt Bắc Kạn.

Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của α-

NAA tới sự phát sinh rễ từ chồi giống quýt Bắc Kạn.

2

Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm phân loại, sinh học và thành phần dinh dưỡng của quả quýt

1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học

Cây quýt thuộc bộ cam quýt: Rutales, họ cam quýt: Rutaceae, chi:

Citrus, loài quýt: Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus suhuiensis Hort. ex

Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [111].

Cây quýt có bộ lá xanh quanh năm, lá đơn, mọc cách và có eo lá. Lá thay

nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc nào cũng xanh lá. Trong lá có

nhiều túi tiết tinh dầu nên khi vò lá có mùi thơm [3].

Quýt là cây thân gỗ, thiết diện tròn, mầu nâu thẫm, cao 2-3m, hình dạng

ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong vỏ cây có chứa

nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc lớn, trồng

cây bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc.

Quýt có rễ cọc khỏe, lan rộng, rễ phát triển ở nhiệt độ 10-37oC, khi nhiệt

độ cao hay thấp hơn, độ ẩm của đất 1% thì sự phát triển của rễ sẽ ngừng lại. Tỉ

lệ ôxi trong đất từ 1,2 - 1,5% thì rễ cũng ngừng phát triển. Cây trồng bằng chiết

cành thì không có rễ chính rõ ràng mà có nhiều rễ cạnh có thể phát triển to

nhưng không đâm sâu xuống đất như trồng bằng hạt.

Hoa thường được hình thành ở nách lá, hoa mọc thành cụm, lưỡng tính,

cánh hoa rời nhau và mẫu bốn. Trong hoa thường có đĩa mật thích nghi với việc

thụ phấn nhờ sâu bọ. Nhị hoa thường có số lượng nhiều gấp ba đến bốn lần số

cánh hoa. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hàng

năm, phần lớn sinh ra cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 sinh ra hoa,

đợt 3 tháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt.

3

Trong các lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất [3].

Quả quýt thuộc dạng quả mọng gồm vỏ, thịt và hạt. Vỏ có túi tinh dầu,

thịt quả có nhiều múi, trong múi có các tép mọng nước, mỗi quả có 9- 13 múi.

Quả quýt hình dẹp, vỏ màu vàng và mỏng, vỏ dễ bóc, múi dễ chia, trọng lượng

trung bình đạt từ 35 đến 145 gam tùy giống. Quả có vị ngọt, chua nhẹ và có

hương thơm đậm đặc trưng rất dễ để phân biệt vơi bất kì loại quả nào trong

nhóm cây ăn quả có múi. Trong mỗi quả có từ 18 đến 20 hạt tùy giống. Hạt

quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có 2 lớp màng vỏ, màng ngoài

cứng do thấm nhiều linhin, màng trong mỏng. Hạt thường chín cùng quả, nảy

mầm ở nhiệt độ từ 10oC đến 30oC, tốt nhất là 25- 30oC [3].

1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt

Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, chất khoáng cần thiết

cho sức khỏe con người, đặc biệt có chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh

tật, tăng cường sức đề kháng. Trong 100 gam múi quýt (phần ăn được) có thành

phần dinh dưỡng gồm: nước 66,5%, protein 0,6%, lipit 0,7%, gluxit 6,4%

xelulozo 0,4%, năng lượng 32kcalo, canxi 25,9mg, photpho 12,6mg, sắt 0,3mg,

caroten 0,44mg, vitamin B1 0,06mg, vitamin B2 0,02mg, vitamin PP 0,2mg,

vitamin C 41mg và một số axit hữu cơ [3], [277].

Trong quả quýt ngoài vitamin, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ.

Các chất xơ khi vào ống tiêu hóa bị trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn

bã của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp

với đường và axit tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số

chất dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức

cần thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dự

trữ ở các mô gây béo phì [266].

Qủa quýt được nhiều người ưa chuộng, là loại quả sử dụng để ăn tráng

miệng, làm nước giải khát, làm mứt. Quả quýt có vị chua tính ấm, có tác dụng

làm mát tim, khai uất, trừ đàm, tan khí kết, giải rượu. Người bị cao huyết áp,

4

bệnh mạch vành, đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm, ăn

quýt rất tốt. Vỏ quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ

dày, long đờm, trị ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vị. Y học đã

chứng minh, tinh dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế

vận động của cơ dạ dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao

huyết áp, nhồi máu cơ tim, có tác dụng tốt với các chứng bệnh đầy bụng, rối

loạn tiêu hóa, kém ăn, buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt vị đắng tính bình, vào

hai kinh can và thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị

đắng, tính bình vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng,

tan u cục, chữa đau mạng sườn, sa nang, đau vú, u cục ở vú [266], [277].

1.2. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1. Tình hình sản xuất quýt trên thế giới

Cam quýt là loại quả quan trọng, đứng trên cả nho, chuối, táo. Quýt được

trồng tập trung chủ yếu ở các nước có khí hậu cận nhiệt đới như Mêhico,

Brazin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và các nước ven Địa Trung Hải, các nước ở vĩ

tuyến 30- 350. Ngày nay, sản xuất cam quýt từ vùng nhiệt đới đã tăng lên gần

bằng các nước cận nhiệt đới. Nguyên nhân là do điều kiện tự nhiên, kĩ thuật

canh tác tiến bộ, nhiệt độ vùng ôn đới hạ thấp hơn ảnh hưởng đến sản lượng

quýt. Nguyên nhân quan trọng hơn là dân số các nước vùng nhiệt đới tăng

nhanh, điều kiện kinh tế phát triển hơn, nhu cầu tiêu thụ cam quýt tăng, kéo

theo sản xuất cũng tăng. Theo FAO (năm 2013) tổng sản lượng cam quýt trên

thế giới đạt 135,169 triệu tấn. Trong đó, năm quốc gia có sản lượng cao nhất là

Trung Quốc 32,1 triệu tấn, Brazin 19,9 triệu tấn, Mỹ 10,3 triệu tấn, Ấn Độ 9

triệu tấn, Mehico 7,18 triệu tấn [29].

1.2.2. Tình hình sản xuất quýt ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp với nhiều loại cây. Do

vậy, cây quýt ở nước ta được trồng trải dọc từ Bắc xuống miền Nam. Ở miền

Bắc, quýt được trồng nhiều ở một số tỉnh Hà Tây, Hưng Yên, Bắc Giang, Bắc

5

Kạn, Tuyên Quang, Hà Giang...Do nhu cầu tiêu thụ cao nên diện tích trồng

quýt ở các địa phương ngày càng được mở rộng, nhiều vườn quýt được trồng

lại bằng các giống cho năng suất và chất lượng cao. Theo FAO, năm 2012 tổng

sản lượng cam quýt nước ta đạt 958000 tấn, sang năm 2013 sản lượng đã tăng

lên và đạt 971000 tấn. Về năng suất trung bình trong năm 2012 đạt 119,53/ha,

sang năm 2013 chỉ số này đã tăng lên 119,77/ha. Tuy nhiên, việc sản xuất quýt

trong nước vẫn chưa đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước nên mỗi năm nước ta

vẫn phải nhập khẩu quýt từ các nước, trong đó chủ yếu là từ Trung Quốc [29].

1.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật

Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính

của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm

sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây. Theo các công trình nghiên cứu

thì chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền, tiếp

đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp xử lý nhiệt để làm sạch

bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [1].

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau:

(1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu của công

tác chọn giống.

(2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống

các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây

cảnh, cây dược liệu…

(3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc

làm sạch bệnh virus.

(4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm

tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất hạt lai.

(5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong

6

ngân hàng gen [1],[15].

1.3.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro

Ngành công nghiệp nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong

những năm gần đây do yêu cầu về chất lượng và số lượng cây giống tăng lên

nhanh chóng trên toàn thế giới nhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản

xuất lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, nông nghiệp và bảo vệ môi trường

toàn cầu. Vì nhân giống in vitro có những ưu điểm lớn mà không một loại hình

nhân giống nào có được.

Thứ nhất: Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản

xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ in vitro đảm bảo một tốc độ

nhân nhanh. Đồng thời, tạo cây con giống cây mẹ, đáp ứng yêu cầu của việc

bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

Thứ hai: Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong

1m2 diện tích có thể để được tới 18.000 cây.

Thứ ba: Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh

vì vậy đảm bảo các giống sạch bệnh.

Thứ tư: Thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000

cây dâu tây cũng chỉ nặng 15kg); việc bảo quản cây giống giữ ở nhiệt độ 40C

trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%.

Thứ năm: Sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất có thể được vận hành

trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm.

Các phương thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô

phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác

của cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống

cây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp

thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm

đồng nhất về mặt di truyền. Nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh cho sản phẩm hoàn

toàn sạch bệnh, khả năng tái tạo, phục hồi nguồn gen có nguy cơ biến mất trong

7

tự nhiên [122].

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

Theo Lê Trần Bình (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy

được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của

đỉnh sinh trưởng [1]. Nhưng trong thực tế, việc nuôi cấy các mẫu vật như vậy

rất khó thành công. Người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đích nuôi cấy là

làm sạch virus cho cây trồng. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng

được tiến hành phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, đỉnh

sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10mm.

Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng cần chú ý tới tương

quan giữa độ lớn chồi, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi

vì thông thường nếu độ lớn của chồi tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn định của chồi

cũng giảm. Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy thì khi độ lớn của chồi tăng,

hiệu quả kinh tế sẽ giảm và khi độ lớn của chồi giảm, hiệu quả kinh tế sẽ tăng.

Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một

đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều

chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ [122].

Nếu xét về nguồn gốc của các cây nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh

trưởng có 3 khả năng: Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát triển từ

chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi mới phát sinh. Tuy nhiên, trong thực

tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh.

Có 2 phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh nuôi cấy đó là:

+ Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như

khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có cả ở cây một lá mầm như

dứa sợi, mía…

+ Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm)

Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử diệp (1 lá mầm) như phong lan, dứa,

huệ. Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có

8

thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn

chỉnh. Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được

hàng triệu cá thể. Do đó, đem lại hiệu quả nuôi cấy lớn, như ở phong lan vì có

phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành (protocorm) nên nhân giống vô tính hoa lan

đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi.

Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp dụng có kết quả ở các

cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quý như cà phê, táo, lê, cây thông,

bồ đề, cam, quýt…

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây

Vì tế bào thực vật có tính toàn năng nên ngoài mô phân sinh và đỉnh

sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của cơ

thể thực vật đều có thể thực hiện cho việc nhân giống in vitro được. Các bộ

phận đó là: Đoạn thân ở các đối tượng như thuốc lá, cam, chanh…; mảnh lá

ở thuốc lá, cà chua, bắp cải… ; các bộ phận của hoa như súp lơ, lúa mì…và

nhánh củ ở tỏi, hành…

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo

Trong mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực

tiếp từ mẫu vật ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cây cũng

khá đồng đều về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy

không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển

nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Do đó nhất thiết phải sử dụng các mô

sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông

qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [8], [10], [144].

1.3.2. Quy trình nhân giống in vitro

Theo Đỗ Năng Vịnh (2005) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai

đoạn sau:

Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng

9

của cây mẹ ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ

thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy

mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn

để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy

sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị.

Tùy theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 - 6 tháng.

Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn

này được tiến hành theo các bước:

(1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy

(2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn

môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro).

Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi

trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời

gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy sẽ bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các

cơ quan hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này yêu cầu 2 - 12 tháng hoặc ít nhất

4 lần cấy các mảnh.

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết định hiệu quả của quá

trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi

mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô

tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người

ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần

và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân

nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1 - 2

tháng tùy loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển.

Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh

chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu. Ví dụ, từ một đỉnh

10

sinh trưởng của một cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên 2000

- 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma. Đối với các cây

khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi từ

cây mẹ ban đầu.

Giai đoạn 4: Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh,

nhưng thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ. Ở một số loài khác thì chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực

tiếp ra đất. Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần.

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng

thí nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng

ứng dụng của quy trình nhân giống in vitro. Đối với một số loài có thể chuyển

cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau

khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm.

Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc

đặc biệt. Vì cây được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm

với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che

cây non bằng nilon bao phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm

mát cây; giá thể cây trồng có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không

chứa đất, mùn cưa và bọt biển… Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [144].

1.4. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng

trong nuôi cấy mô thực vật

Ngoài các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một

hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất

cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan. Tuy vậy,

yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm

lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hòa sinh

trưởng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm auxin và

11

nhóm cytokinin [6], [7].

1.4.1. Auxin

Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là indol acetic

acid (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả

các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở

dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol,

IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng thể hiện hoạt

tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol

ethanol.

Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và

chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực

vật như lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng

hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [2], [7].

Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới

hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích

thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các

ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín

của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sự sinh trưởng thông

qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá

trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hoocmon khác.

Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác

nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin

là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở

của vách tế bào [2], [7].

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất

đã được sử dụng từ rất lâu trong nông nghiệp. Chỉ một thời gian ngắn sau khi

IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp

chất có giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ

12

dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh

sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự

hình thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có

vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính

auxin yếu nhưng có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt

tính của auxin [7].

Các auxin thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích

sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo

rễ… Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indol butiric

acid), IAA (3-indol acetic acid), NAA (naphthalen acetic acid), 2,4-D (2,4-

dichlorophenoxy acetic acid). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử

dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra

chồi. Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng [7].

Auxin thường được sử dụng từ 0,1-2,0mg/l, riêng IAA, do kém bền với

nhiệt độ và ánh sáng nên nồng độ sử dụng cao hơn (1,0-3,0mg/l). Chúng có

hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối

tương nuôi cấy...mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của

mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào

dẫn đến hình thành mô sẹo [16].

1.4.2. Cytokinin

Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purin. Loại cytokinin đầu tiên phát

hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ mầm ngô. Ngoài ra

còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin,

chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà người ta

thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA [7].

Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là

một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm

1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA

được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng

13

độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy [7].

Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi

và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng

tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần

của các glycoside [7].

Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,

đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein. Cytokinin điều

chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách như điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi

phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái ngủ

của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả, gây

nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá do

kích thích sự lớn lên của tế bào [144].

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,

tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi

vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi

đỉnh, tăng cường phát sinh chồi phụ. Các loại cytokinin thường được dùng là:

kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng [144].

Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin trong nuôi cấy mô dao động từ

0,1-2,0mg/l. Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt

đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi

cấy. Trong nuôi cấy, có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần

cả hai, còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin

với những tổ hợp tỷ lệ khác nhau [16].

1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống cây trồng trong ống nghiệm

Ánh sáng và nhiệt độ: Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những

phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. Tất cả các nuôi cấy đều cần ánh

sáng, trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình tái sinh và

nhân giống của chúng cũng yêu cầu có ánh sáng, tỉ lệ chiếu sáng và pha tối là

16/8. Nhiệt độ của phòng nuôi cấy được duy trì từ 25-280C nhờ các máy điều

14

hòa nhiệt độ [16].

Nguồn Cacbon: Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang

hợp, nếu có quang hợp thì cường độ cũng rất yếu do thiếu chlorophil, cường độ

CO2 và nhiều điều kiện khác...Vì vậy, phải đưa thêm những hợp chất

hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy kể cả mẫu cấy là chồi xanh

có khả năng quang hợp. Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường

sucrose với hàm lượng từ 2%-6% [166].

Than hoạt tính: được dùng để hấp thụ các chất mầu, các hợp chất phenol

các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp...trong trường hợp các chất đó có tác dụng

gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính cũng hút các chất

hữu cơ như phytohoocmon, vitamin, sắt chelat, kẽm...Hàm lượng sử dụng than

hoạt tính 0,2%-0,3%. Ngoài ra, than hoạt tính còn làm giảm hiệu quả của chất

điều hòa sinh trưởng, làm thay đổi môi trường ánh sáng, có thể kích thích sự

hình thành và phát triển của rễ. một số trường hợp than hoạt tính thúc đẩy phát

sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng, phát sinh cơ quan của các loài cây

thân gỗ [16].

Nước dừa: Nước dừa được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất

khoáng và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích

phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được sử dụng

ở nồng độ từ 5% đến 20% [4].

1.6. Một số thành tựu nhân giống cây ăn quả có múi bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro

Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

được ứng dụng khá rộng rãi, không những trong nghiên cứu mà còn được ứng

dụng trong thực tiễn. Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu được thực hiện trên

cây thân thảo, còn trên cây thân gỗ, đặc biệt là cây ăn quả còn hạn chế.

Nghiên cứu tạo chồi in vitro ở cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.),

Lê Văn Trường Huân (2007) đã chỉ ra, môi trường tạo đa chồi từ đoạn thân

mang mắt chồi bên của cây chanh dây trồng ngoài tự nhiên là môi trường MS

cơ bản có bổ sung đường sucrose 20g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l đã cho hệ

15

số nhân chồi là 6,57± 0,74 [5].

Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro trụ trên lá mầm

hoàn chỉnh của cây cam Vinh và quýt Đường Canh phục vụ công tác chuyển

gen, Phan Hữu Tôn và cs (2014) đã xác định, môi trường cho tái sinh chồi tốt

nhất đối với giống cam Vinh là MS cơ bản bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l +

vitamin B5 1,0mg/l + BAP 1,5mg/l, quýt Đường Canh là MS + sucrose 30g/l +

agar 8g/l + vitamin B5 1,0mg/l + BAP 1,0mg/l, đạt số chồi/mẫu của giống cam

Vinh là 4,7 và quýt Đường Canh là 5,5. Môi trường tốt nhất cho tạo rễ của chồi

đối với giống cam Vinh là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l +

vitamin B5 5,0mg/l + α-NAA 0,4mg/l + IAA 0,4mg/l cho tỉ lệ chồi phát sinh rễ

là 82,3%, số rễ /chồi là 3,5 và chiều dài rễ là 3,5cm, với quýt Đường Canh là

MS cơ bản có bổ sung sucrose 30g/l + agar 8g/l + vitamin B5 5,0mg/l + α-NAA

0,3mg/l + 0,4mg/l tỉ lệ chồi phát sinh rễ là 86,3%, đạt 3,5 rễ/chồi, chiều dài

chồi là 3,2cm. Giá thể tốt nhất cho ra cây in vitro ra ngoài tự nhiên là cát vàng

+ trấu hun với tỉ lệ 1:1, tỉ lệ sống sót sau 6 tuần của cam Vinh là 96,5% và của

quýt Đường Canh là 95% [13].

Nghiên cứu môi trường nhân nhanh giống quýt Cleo-Patra, Suneel

Sharma và cs (2009) đã chỉ ra, môi nhân nhanh chồi từ đoạn trên trụ lá mầm

của quýt Cleo- Patra là môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30g/l

+ agar 9g/l + BAP 1,0mg/l đã cho hệ số nhân chồi đạt 2,4 lần; số rễ tối đa được

ghi nhận khi nuôi cấy đoạn chồi trong môi trường 1/2MS cơ bản có bổ sung

IBA 10mg/l [25].

Adhikarimayum H. và cs (2011) nghiên cứu về nhân giống in vitro cây

quýt Megaloxycarpa Lush của Manipur, Ấn Độ. Tác giả đã chỉ ra, môi trường

MS cơ bản có bổ sung BAP 0,25mg/l + α-NAA 0,5mg/l là thuận lợi nhất cho

sự tạo chồi của đoạn thân mang mắt chồi bên với hệ số nhân chồi là 4,7. Tiếp

đến là môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 1,0mg/l + kinetin 0,5mg/l cho

hệ số nhân chồi là 4,4. Chồi non ra rễ tốt nhất là ở môi trường MS cơ bản

16

có bổ sung α-NAA 2,0mg/l đạt 4,4 rễ/chồi [188].

Nghiên cứu quy trình nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri

Lush), Saini H K. và cs (2010) đã chỉ ra, môi trường tối ưu cho sự phát sinh

chồi từ đoạn trên trụ lá mầm là MS cơ bản có bổ sung BAP 0,5mg/l đạt 8,6

chồi/mẫu. Môi trường kéo dài chồi tốt nhất đối với chồi chanh thô là MS cơ

bản bổ sung BAP 0,5mg/l + GA3 1,0mg/l. Chồi sau khi kéo dài, cấy chuyển

sang môi trường cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, môi trường MS cơ bản bổ

sung NAA 1,0mg/l + IBA 1,0mg/l chồi ra rễ tốt nhất và được ghi nhận với

77% chồi ra rễ [19].

Nghiên cứu nhân giống cây cam chua (Citrus aurantium L.), Mohammad H

R. Mohammad M S. và cs (2013) đã chỉ ra, đoạn trên trụ lá mầm phát sinh chồi cao

nhất ở môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 2,5mg/l + α-NAA 0,05mg/l, với tỉ lệ

phát sinh chồi là 90% và số chồi/mẫu đạt được là 4,2 chồi [22].

Nghiên cứu nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush) qua mô

sẹo, các tác giả Hawkat A S. và cs thuộc Khoa Sinh học Đại học Quaid-i-Azam

Islamabad, Pakistan (2006) đã ghi nhận, môi trường MS cơ bản có bổ sung

BAP 3,0mg/l cho các mô sẹo có nguồn gốc từ đoạn thân trên trụ lá mầm tỉ lệ

phát sinh chồi cao nhất (70%), các chồi phát sinh rễ tốt nhất ở môi trường MS

cơ bản bổ sung α-NAA 0,5mg/l với tỉ lệ chồi ra rễ là 70% [23].

Nghiên cứu nhân giống bưởi (Citrusn Grandis (L.) Osbeck), tác giả

Ibrahim M A. (2012) đã ghi nhận, môi trường tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn

thân mang chồi nách là MS cơ bản bổi sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,1mg/l với

số chồi/mẫu là 9,33, tiếp là môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 4,0mg/l +

NAA 0,1mg/l cho số chồi/mẫu là 6,66. Môi trường tái sinh chồi gián tiếp từ mô

sẹo tốt nhất là MS cơ bản bổ sung BAP 1,0mg/l + NAA 0,1mg/l cho 6,33

chồi/mẫu, môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 2,0mg/l + NAA 0,1mg/l cho

4,33 chồi/mẫu. Các chồi ra rễ tốt nhất là MS cơ bản bổ sung NAA 0,2mg/l +

17

BAP 0,1mg/l [21].

Sarker I. và cs (2015), khi nghiên cứu nhân giống cây cam quýt (Citrus

aurantifollia) đã chỉ ra, môi trường tốt nhất cho tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn

gốc thân mang nách lá mầm là MS cơ bản bổ sung BAP 1,5mg/l sau 16 ngày

nuôi cấy cho tỉ lệ mẫu phát sinh chồi là 90%, đạt 5 chồi/mẫu. Môi trường MS

cơ bản bổ sung BAP 1,5mg/l + NAA 0,5mg/l + GA3 0,5mg/l cho 100% số mẫu

phát sinh chồi, đạt 10 chồi/mẫu. Môi trường tốt nhất cho chồi ra rễ là MS cơ

bản bổ sung NAA 0,5mg/l với 100% chồi phát sinh rễ [20].

Savita và cs (2010), khi nghiên cứu nhân giống cây chanh thô (Citrus

jambhiri Lush) đã xác định, môi trường tốt nhất cho sự phát sinh chồi từ mô

sẹo có nguồn gốc từ đoạn trụ trên nách lá mầm là MS cơ bản bổ sung BAP

3,0mg/l + NAA 0,5mg/l với 72% mẫu phát sinh chồi, đạt 5,83 chồi/mẫu. tiếp là

môi trường MS cơ bản bổ sung kinetin 3,0mg/l + NAA 2,0mg/l với tỉ lệ phát

sinh chồi là 64%, đạt 4,83 chồi/mẫu. Môi trường tốt nhất cho chồi hình thành rễ

18

là MS cơ bản bổ sung NAA 0,5mg/l với tỉ lệ ra rễ là 71% [24] .

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Sử dụng hạt từ giống quýt của huyện Chợ Đồn, tỉnh Bắc Kạn. Vụ thu

hoạch tháng 12 năm 2015

2.1.2. Hoá chất, thiết bị

Hoá chất

Hóa chất pha môi trường MS cơ bản, chất điều hòa sinh trưởng, chất dùng

để khử trùng. Các loại hóa chất đều nhập từ cộng hòa Đức và Trung Quốc.

Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS

(Murashige và Skoog, 1962)

STT Thành phần Nồng độ (mg/l) STT

Thành phần Nồng độ (mg/l)

0.025

10 CoCl2.6H2O

MS 1

440.00

0.025

1 CaCl2.2H2O

11 CuSO4.5H2O

0.25

12 Na2MoO4.2H2O

MS 2

170.00

2 KH2PO4

MS 4

1900.00

27.80

3 KNO3

13 FeSO4.7H2O

370.00

37.30

4 MgSO4.7H2O

14 Na2EDTA

1650.00

5 NH4NO3

MS5

15

Glicine

2.00

MS 3

6.20

0.10

6 H3BO3

16 Thiamine HCl

7 KI

0.83

0.50

17 Pyridoxine HCl

22.30

0.50

8 MnSO4.4H2O

18 Nicotinic Acid

8.60

19 Myo- inositol

100.00

9 ZnSO4.7H2O

19

Thiết bị

Bình tam giác 250ml, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ cấy (dao cấy,

que cấy, đĩa cấy), nồi hấp, buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của

hãng Nuarie (Mĩ)....

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2016 tại Phòng Công nghệ tế bào

thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.1.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy

Sau khi xác định công thứ c môi trường cần pha, tính dung tích môi trường cần dùng cho mỗi công thức và tính thể tích các hóa chất cần sử du ̣ng trong môi trường nuôi cấy tiến hành pha môi trường. Ví dụ: pha một lít môi

trường nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng đến sự nảy mầm của hạt gồm MS

cơ bản + sucrose 30g/l + agar 9g/l. Môi trường sau khi pha được đun nóng

70oC-80oC. Độ pH môi trường nuôi cấy 5,6- 5,8. Chia đều hỗn hợp dung dịch

nuôi cấy cho các bình tam giác, mỗi bình 50ml môi trường. Sau đó nút bông và làm nắp bằng giấy, đâ ̣y kín. Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 120oC, áp suất 1-1,2atm, trong thời gian 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong để môi trường 2-3 ngày thì bắt đầu sử du ̣ng.

2.2.1.2. Phương pháp khử trùng hạt

Gồm các bước:

- Rửa hạt bằng nước máy, ngâm trong nước xà phòng loãng. Sau đó, rửa

bỏ xà phòng bằng nước máy.

- Khử trùng bằng cồn 70% trong thời gian 1-2 phút. Rửa bỏ cồn bằng

nước cất 2 lần.

- Khử trùng bằng nước Javen 60% ở các mức thời gian 10 phút, 15 phút,

20

20 phút, 25 phút, 30 phút. Rửa lại bằng nước cất 3 lần, mỗi lần 1 phút.

Hạt sau khi được khử trùng tiến hành cấy vào môi trường MS cơ bản.

Để thấy được ảnh hưởng của loại mẫu cấy đến khả năng nảy mầm sau

khử trùng, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu trên mẫu cấy như sau: (1) mẫu

hạt đã khử trùng để nguyên không bóc vỏ; (2) mẫu hạt đã khử trùng bóc vỏ giữ

nguyên phôi nhũ; (3) mẫu hạt đã khử trùng bóc vỏ và cắt 1/3 phôi nhũ phía đối

diện với phôi. Mỗi loại mẫu cấy, ở mỗi thời gian khử trùng cấy 5 bình, mỗi

bình 8 hạt. Đánh giá kết quả sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ

mẫu nhiễm (%); Tỉ lệ mẫu nảy mầm không bị nhiễm (%), màu sắc thân và lá.

2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

auxin và cytokinin tới khả năng phát sinh chồi của giống quýt Bắc Kạn

Để tìm được môi trường nhân giống phù hợp đối với giống quýt Bắc

Kạn, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả năng

nhân chồi của cây quýt Bắc Kạn. Các đoạn gốc thân mang nách lá mầm thu

được từ việc cấy hạt đã khử trùng, được cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ

sung aga 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l+ BAP (nồng độ 2,0mg/l,

2,5mg/l, 3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l) hoặc kinetin (nồng độ 2,0mg/l, 2,5mg/l,

3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l). Mỗi công thức tiến hành trên 5 bình, mỗi bình cấy 6

mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Đối chứng là môi trường

MS cơ bản, bổ sung aga 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l. Đánh giá kết

quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu theo dõi: số mẫu ra chồi, số

chồi/mẫu, màu sắc thân và lá của chồi. Kết quả của thí nghiệm này sử dụng cho

các nghiên cứu tiếp theo.

Ảnh hưởng tổ hợp giữa nhóm auxin và cytokinin đến khả năng phát

sinh chồi của quýt Bắc Kạn

Từ kết quả nồng độ BAP và kinetin tốt nhất cho sự hình thành chồi,

chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng

21

thuộc nhóm cytokinin và nhóm auxin đến sự hình thành chồi của giống quýt

Bắc Kạn. Dùng nồng độ BAP và kinetin tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với

IBA nồng độ 0,5mg/l, 1,0mg/l, 1,5mg/l, 2,0mg/l, 2,5mg/l. Đối chứng là môi

trường MS cơ bản không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Mỗi công thức

pha 5 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu, các công thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3

lần. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ

phát sinh chồi; số chồi/mẫu, chất lượng chồi.

Phương pháp nghiên cứu môi trường ra rễ (tạo cây hoàn chỉnh)

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân chồi có kích thước 1,5cm -

2,0cm, được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ gồm MS cơ bản bổ sung agar

9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA với nồng độ 0,3mg/l, 0,5mg/l,

0,7mg/l, 0,9mg/l, 1,2mg/l. Với mỗi nồng độ cấy 30 mẫu tiến hành trên 5 bình,

các cong thức bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 4

tuần, 6 tuần, 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ chồi phát sinh rễ, số rễ/mẫu, chiều

dài rễ, chất lượng rễ.

2.2.2. Phương pháp đưa cây ra vườn ươm

Các cây được cấy ở môi trường tạo rễ, khi đã có bộ rễ dài, khoẻ, lá xanh,

đẹp, chiều cao đạt 4-5cm thì đưa ra môi trường tự nhiên.

Các cây đưa ra môi trường ngoài với giá thể khác nhau để xác định giá

thể phù hợp nhất.

Cây được trồng trong bầu với 3 loại giá thể:

CT1: Đất phù sa

CT2: Đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1)

22

CT3: Trấu hun.

Hai tuần đầu để trong điều kiện nhiệt độ vá ánh sáng trong phòng thì

nghiệm (giống giai đoạn nhân giống in vitro). Sau hai tuần đưa ra vườn ươm có

mái che.

Phương pháp chăm sóc cây con

Trong 2-3 ngày đầu tưới nước sạch bằng cách phun sương 4 giờ/ lần.

Thời tiết lạnh, khô hanh phải che nilon có đục lỗ để tránh rét và tránh thoát

nước nhanh. Sau 3 ngày có thể bỏ nilon che, để khay cây ra nơi đủ ánh sáng,

thoáng khí nhưng không có gió, tránh nắng mưa trực tiếp. Tưới nước bằng bình

phun 2-3 lần/ngày. Sau 4-5 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra

vườn ươm.

Đánh giá kết quả sau khi ra cây 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần.

2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thu thập được sẽ được xử lý, tính toán trên phần mềm chương

23

trình excel theo hướng dẫn của Chu Hoàng Mậu (2008) [9].

Chương 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt quýt

Bắc Kạn

Giai đoạn khử trùng là quan trọng trong quy trình nuôi cấy mô, mục đích

của giai đoạn này là thu được nguyên liệu thực vật vô trùng đưa vào nuôi cấy in

vitro. Có nhiều phương pháp cũng như hóa chất khử trùng khác nhau, nồng độ,

thời gian khử trùng thích hợp của mỗi giống là khác nhau. Phương pháp khử

trùng thích hợp phải đảm bảo được yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ nảy mầm

cao, mầm phải mập, sinh trưởng tốt. Qua nghiên cứu về đặc tính của javen,

chúng tôi tiến hành khử trùng hạt bằng dung dịch javen 60% lắc đều trong 10

phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút và 30 phút. Hạt sau khi khử trùng chia làm 3

loại: loại 1 để nguyên, loại 2 bóc vỏ, loại 3 bóc vỏ rồi cắt 1/3 lá mầm. Các hạt

được cấy vào môi trường MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 9g/l. Kết quả,

chúng tôi thu được bảng 3.1.

Qua bảng 3.1 cho thấy, cả ba loại hạt, tỉ lệ nhiễm và tỉ lệ nảy mầm của

hạt giảm khi thời gian khử trùng tăng lên. Điều đó chứng tỏ thời gian khử trùng

có ảnh hưởng đến tỉ lệ nhiễm và khả năng nảy mầm của hạt. Khử trùng hạt

bằng javen 60% trong thời gian 20 phút có hiệu quả cao nhất, hạt không bị

nhiễm và tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm cao. Hạt bóc vỏ tỉ lệ hạt không nhiễm

nảy mầm là 94,17%, hạt bóc vỏ và hạt cắt 1/3 lá mầm tỉ lệ nảy mầm là 95,00%,

hạt không bóc vỏ tỉ lệ nảy mầm là 78,86%. Với thời gian khử trùng là 25 phút

và 30 phút các mẫu không nhiễm tuy nhiên tỉ lệ nảy mầm thấp hơn hẳn, tỉ lệ

nảy mầm của hạt bóc vỏ lần lượt là 87,5% và 80,1%, tỉ lệ nảy mầm của hạt bóc

vỏ cắt 1/3 lá mầm là 90% và 79,27%. Hạt khi cấy không bóc vỏ tỉ lệ nảy mầm

24

thấp hơn hẳn so với hạt bóc vỏ trước khi cấy.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm

của hạt quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần nuôi cấy)

Công Thời gian Tỉ lệ nhiễm Tỉ lệ hạt không Chất lượng

thức khử trùng (%) nhiễm nảy mầm

(phút) mầm(%)

Hạt bóc vỏ

CT1 10,00 97,80 ± 3,88 10 +++

CT2 7,50 97,20 ± 7,84 15 +++

CT3 0 94,17 ± 2,08 20 +++

CT4 0 87,50 ± 6,25 25 +++

CT5 0 80,10 ± 7,03 30 ++

Hạt bóc vỏ và cắt 1/3 lá mầm

CT1 12,50 98,10 ± 2,71 10 ++

CT2 7,50 98,13 ± 10,45 15 ++

CT3 0 95,00 ± 6,25 20 ++

CT4 0 90,00 ± 6,25 25 ++

CT5 0 79,27 ± 15,68 30 ++

Hạt không bóc vỏ

CT1 20,00 69,10 ± 3,79 10 ++

CT2 17,50 73,67 ± 7,12 15 ++

CT3 12,50 78,86 ± 5,15 20 ++

CT4 0 66,97 ± 5,37 25 ++

CT5 0 63,30 ± 7,84 30 ++

Ghi chú: (+): cây thấp, nhỏ, lá nhỏ màu xanh nhạt; (++): cây thấp, nhỏ,

lá màu xanh đậm; (+++): cây cao, mập, lá to màu xanh đậm

Hạt quýt được cấu tạo gồm hai lớp vỏ, lớp vỏ cứng bên ngoài và bên

trong là lớp vỏ lụa. Với thời gian khử trùng ngắn, dung dịch chất khử trùng

chưa thấm được vào phôi và phôi nhũ nên ít ảnh hưởng đến sự nảy mầm của

25

hạt. Nhưng với thời gian khử trùng dài thì dung dịch chất khử trùng thấm qua

hai lớp màng và ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt. Trong ba loại hạt

đem cấy, hạt cắt 1/3 lá mầm có tỉ lệ nảy mầm cao hơn và thời gian nảy mầm

sớm hơn, tuy nhiên chất lượng mầm lại kém hơn so với hạt chỉ bóc vỏ trước khi

cấy. Do khi cắt bớt lá mầm mang chất dinh dưỡng dự trữ của hạt, lá mầm thấm

nước nhanh hơn, quá trình hô hấp xảy ra sớm nên phôi được cung cấp chất dinh

dưỡng nhanh hơn, hạt được phá ngủ nhanh từ đó làm hạt nảy mầm nhanh hơn

so với hạt không cắt lá mầm. Tuy nhiên, khi cắt bớt lá mầm cũng đã làm giảm

chất dinh dưỡng dự trữ của hạt, nên sau khi nảy mầm một thời gian, cây được

cung cấp ít dinh dưỡng làm cây sinh trưởng chậm hơn so với cây nảy mầm từ

hạt không cắt bớt lá mầm.

20 phút

15 phút

25 phút 30 phút

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm

26

của hạt quýt Bắc Kạn (sau 6 tuần)

Vậy, khử trùng hạt bằng javen 60% trong thời gian 20 phút là tốt nhất

cho hạt quýt Bắc Kạn nảy mầm, càng kéo dài thời gian khử trùng thì tỉ lệ hạt

nảy mầm thấp dần, chất lượng mầm giảm. Sau khi khử trùng, bóc vỏ hạt rồi cấy

là tốt nhất, hạt không bị nhiễm, cây nảy mầm cao, mập, khỏe có thể dùng làm

mẫu cấy tạo đa chồi.

3.2 Ảnh hưởng riêng rẽ của BAP hoặc kinetin đến sự phát sinh chồi của

quýt Bắc Kạn

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn

BAP là chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm cytokinin, là

nhóm được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô hiện nay. Tác

động chủ yếu của BAP là kích thích sự phân chia của tế bào, thúc đẩy sự hoạt

động của chồi bên. Nồng độ sử dụng phổ biến là từ 1,0 - 3,0mg/l, ở một số

giống cây nồng độ sử dụng cao hơn. Tuy nhiên, nếu nồng độ dùng quá cao sẽ

ảnh ức chế nảy mầm thậm chí làm chết mẫu cấy.

Dựa trên nghiên cứu của một số tác giả trên các đối tượng cam quýt khác

nhau như Phan Hữu Tôn (2014), Trần Vũ Hằng (2015), Suneel S, Atam P,

Ajinath T (2009), chúng tôi tiến hành nghiên cứu thăm dò để tìm ra môi trường

tối ưu cho sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn, bằng cách sử dụng môi

trường MS + agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + BAP với các nồng

độ khác nhau (bổ sung BAP từ 2,0 đến 4,0mg/l), đối chứng là môi trường MS +

agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l không bổ sung chất kích thích

sinh trưởng. Mẫu nuôi cấy chúng tôi sử dụng là đoạn gốc thân dài 0,8-1,0cm

mang nách lá mầm của các cây nảy mầm từ hạt đã khử trùng. Theo dõi sau 4

27

tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy, chúng tôi thu được bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn

Tỉ lệ mẫu Số chồi/mẫu Công BAP Chất lượng phát sinh thức (mg/l) chồi ± % so với ĐC chồi (%)

Sau 4 tuần

1,43± 0,26 100 ĐC 0 7,78 +

CT1 2,0 25,56 101,39 1,45 ± 0,23 ++

CT2 2,5 37,78 149,65 2,14 ± 0,31 ++

CT3 3,0 44,44 157,34 2,25 ± 0,35 ++

CT4 3,5 43,33 164,33 2,35 ± 0,42 ++

CT5 4,0 34,44 146,85 2,10 ± 0,41 ++

Sau 6 tuần

ĐC 0 14,44 1,25 ± 0,13 100 +

CT1 2,0 34,44 165,60 2,07± 0,37 ++

CT3 2,5 52,22 181,60 2,27 ± 0,43 ++

CT3 3,0 67,78 236,00 2,95 ±0,52 +++

CT4 3,5 57,78 198,40 2,48 ±0,58 ++

CT5 4,0 45,56 181,60 2,27±0,41 ++

Sau 8 tuần

ĐC 0 17,78 1,44± 0,26 100 +

CT1 2,0 57,78 149,30 2,15±0,49 ++

CT2 2,5 61,29 169,44 2,44±0,50 ++

CT3 3,0 87,78 239,58 3,45±0,71 +++

CT4 3,5 65,56 184,72 2,66±0,54 +++

CT5 4,0 55,56 166,67 2,40±0,57 ++

Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn, lá bé, màu xanh nhạt; (++): chồi nhỏ, lá bé,

28

màu xanh đậm; (+++): chồi to, khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nồng độ BAP khác nhau thì khả

năng phát sinh chồi có sự khác nhau. Chứng tỏ nồng độ BAP đã ảnh hưởng đến

sự hình thành chồi của giống quýt Bắc Kạn. Nồng độ BAP tăng dần từ 2,0-

3,0mg/l tỉ lệ mẫu phát sinh chồi và số chồi/mẫu tăng dần. Tuy nhiên, nếu tiếp

tục tăng nồng độ BAP thì khả năng phát sinh chồi lại giảm. Điều này hoàn toàn

phù hợp với lí thuyết là các chất kích thích sinh trưởng chỉ có tác dụng ở nồng

độ phù hợp, nếu tăng quá cao sẽ ức chế thậm chí gây chết mẫu cấy. Ở môi

trường đối chứng, sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần tỉ lệ mẫu phát sinh chồi và số

chồi/mẫu đều rất thấp, tỉ lệ phát sinh chồi sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần lần lượt là

7,78%; 14,44%; 17,78%, số chồi/mẫu là 1,43; 1,25; 1,44. Môi trường nuôi cấy

có bổ sung BAP 3,0mg/l có hiệu quả cao nhất trong việc kích thích phát sinh

chồi. Sau 4 tuần, mặc dù số chồi/mẫu thấp hơn so với môi trường bổ sung BAP

3,5mg/l, nhưng sau 6 tuần nuôi cấy, mẫu ở môi trường bổ sung BAP 3,0mg/l đã

có tỉ lệ phát sinh chồi và số chồi/mẫu vượt trội hơn so với các môi trường bổ

sung nồng độ khác. Sau 6 tuần tỉ lệ phát sinh chồi ở môi trường có BAP

3,0mg/l là 67,78%, số chồi/mẫu là 2,95 (tăng 136% so với đối chứng). Sau 8

tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu cấy phát sinh chồi là 87,78% và số chồi/mẫu cấy là

3,45 (tăng 139% so với đối chứng), các chồi đều cao, mập, khỏe, phát triển cân

đối và số chồi/mẫu nhiều. Môi trường đối chứng mặc dù không bổ sung chất

kích thích sinh trưởng, như trong môi trường nuôi cấy có bổ sung nước dừa,

trong nước dừa có chất kích thích sinh trưởng tự nhiên nên cũng có tác dụng

kích thích sự phát sinh chồi của mẫu cấy. Tuy nhiên, chất kích thích sinh

trưởng trong nước dừa có nồng độ thấp nên tỉ lệ phát sinh chồi, số chồi/mẫu ở

môi trường đối chứng không cao.

Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của S Hawkat A li, B

Ushra M Irza thuộc Khoa Sinh học Đại học Quaid-i-Azam Islamabad, Pakistan

(2006) khi nghiên cứu nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush) [23],

29

môi trường MS cơ bản bổ sung BAP 3,0mg/l cho tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất.

Ở nghiên cứu này, nồng độ BAP tối ưu cho sự phát sinh chồi của cây quýt

Bắc Kạn cao hơn so với các nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2014) [13], Suneel S.

và cs (2009) [25]. Sự khác biệt đó là do các giống quýt khác nhau có phản ứng

khác nhau với chất kích thích sinh trưởng, do điều kiện thí nghiệm và nguồn hóa

chất sử dụng khác nhau.

Vậy, môi trường cơ bản có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước

dừa 50ml/l + BAP 3,0mg/l là tốt nhất cho sự hình thành chồi từ gốc mang nách

lá mầm của giống quýt Bắc Kạn. Do vậy, để đạt hiệu quả cao trong các nghiên

cứu tiếp theo, chúng tôi bổ sung BAP 3,0mg/l vào môi trường nuôi cấy.

BAP 3,0mg/l Đối chứng

Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn

(sau 8 tuần)

3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn

Dựa trên những đặc tính của kinetin, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh

hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn bằng cách, dùng

môi trường MS cơ bản có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l

+kinetin (nồng độ 2,0mg/l, 2,5mg/l, 3,0mg/l, 3,5mg/l, 4,0mg/l). Đối chứng là

môi trường MS cơ bản + agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l không bổ

30

sung chất kích thích sinh trưởng. Kết quả thu được ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi

của cây quýt Bắc Kạn

Chất Số chồi/mẫu Công Kinetin Tỉ lệ mẫu phát lượng thức (mg/l) sinh chồi(%) ± % so với ĐC chồi

Sau 4 tuần

ĐC 0 100 + 6,67 1,50± 0.32

CT1 2,0 96,00 + 17,78 1,44± 0,33

CT2 2,5 96,67 ++ 24,44 1,45± 0,24

CT3 3,0 101,33 ++ 34,44 1,52± 0,37

CT4 3,5 127,33 ++ 38,89 1,91± 0,46

CT5 4,0 104,67 ++ 23,33 1,57± 0,35

Sau 6 tuần

ĐC 0 100 + 13,33 1,25± 0,28

CT1 2,0 140,00 + 26,67 1,75± 0,31

CT2 2,5 145,60 ++ 37,78 1,82± 0,29

CT3 3,0 153,60 +++ 43,33 1,92± 0,38

CT4 3,5 228,00 +++ 67,78 2,85± 0,56

CT5 4,0 148,80 ++ 40,00 1,86± 0,47

Sau 8 tuần

ĐC 0 + 16,67 1,47 ± 0,27 100

CT1 2,0 131,29 + 46,67 1,93± 0,56

CT2 2,5 149,00 ++ 50,00 2,20± 0,34

CT3 3,0 161,22 ++ 62,22 2,37± 0,42

CT4 3,5 200,68 +++ 74,44 2,95± 0,61

CT5 4,0 153,74 ++ 52,22 2,26± 0,45

Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn, lá bé, màu xanh nhạt; (++): chồi nhỏ, lá bé,

31

màu xanh đậm; (+++): chồi to, khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

Qua bảng 3.3 cho thấy, nồng độ kinetin khác nhau thì tỉ lệ phát sinh chồi và

số chồi trên mẫu khác nhau, như vậy nồng độ kinetin đã ảnh hưởng đến khả năng

phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn. Ở môi trường không có kinetin tỉ lệ phát sinh

chồi thấp, sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần lần lượt là 6,67%; 13,33%; 16,67%, số

chồi/mẫu là 1,5; 1,25; 1,47. Môi trường bổ sung kinetin, tỉ lệ phát sinh chồi tăng

dần khi nồng độ kinetin tăng từ 2,0mg/l- 3,5mg/l, khi nồng kinetin tăng cao hơn,

khả năng phát sinh chồi giảm, sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn cao nhất khi bổ

sung kinetin 3,5mg/l. Sau 4 tuần, tỉ lệ phát sinh chồi là 38,89%, số chồi/mẫu là

1,91 (tăng 27% so với đối chứng), sau 6 tuần tỉ lệ pháp sinh chồi là 67,78%, số

chồi/mẫu là 2,85 (tăng 128% so với đối chứng). Sau 8 tuần tỉ lệ mẫu phát sinh

chồi là 74,44%, số chồi/mẫu là 2,95 (tăng 100% so với đối chứng).

Đối chứng Kinetin 3,5mg/l

Hình 3.3. Ảnh của kinetin đến sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn

(sau 8 tuần)

Khi so sánh môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 3,0mg/l với môi

trường nuôi cấy có bổ sung kinetin 3,5mg/l. Chúng tôi nhận thấy, sau 8 tuần

nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu ở môi trường bổ sung BAP 3,0mg/l

cao hơn so với môi trường nuôi cấy bổ sung kinetin 3,5mg/l. Điều đó cho thấy,

ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin thì BAP 3,0mg/l kích thích tới sự phát

sinh chồi từ đoạn gốc thân mang nách lá mầm của quýt Bắc Kạn là đạt hiệu quả

32

cao hơn so với kinetin.

3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP hoặc kinetin với IBA đến sự phát sinh

chồi của quýt Bắc Kạn

3.3.1. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi cây quýt

Bắc Kạn

Ở thí nghiệm trên chúng tôi đã xác định, nồng độ BAP tốt nhất cho sự

phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn là 3,0mg/l. Tuy nhiên, số chồi phát sinh từ

mỗi mẫu cấy còn thấp, để tăng số chồi trên mẫu chúng tôi tiếp tục nghiên cứu

ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và

auxin, cụ thể ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi

của quýt Bắc Kạn.

Mẫu được cấy trên môi trường có MS cơ bản, bổ sung agar 9g/l +

sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + BAP 3,0mg/l + IBA (nồng độ 0,5mg/l;

1,0mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l và 2,5mg/l). Đối chứng là môi trường MS cơ bản, bổ

sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l. Kết quả, chúng tôi thu được

ở bảng 3.4.

Qua bảng 3.4 cho thấy, môi trường có bổ sung cả BAP và IBA, tỉ lệ mẫu

phát sinh chồi và số chồi/mẫu cao hơn hẳn so với môi trường chỉ bổ sung BAP

cũng như đối chứng. Khi tăng nồng độ IBA từ 0,5mg/l đến 1,5mg/l thì tỉ lệ phát

sinh chồi và số chồi/mẫu tăng dần, khi nồng độ IBA tăng lên 2,0mg/l thì tỉ lệ

phát sinh chồi và số chồi/mẫu giảm. Môi trường bổ sung BAP 3,0mg/l+ IBA

1,5mg/l có hiệu quả cao nhất với tỉ lệ phát sinh chồi sau 4 tuần là 56,67%, số

chồi/mẫu là 2,67 (tăng 78% so với đối chứng). Sau 6 tuần nuôi cấy tỉ lệ phát

sinh chồi là 83,33%, số chồi/mẫu là 3,84 (tăng 207% so với đối chứng). Sau 8

tuần tỉ lệ phát sinh chồi là 93,33%, số chồi/mẫu cấy là 4,68 (tăng 249% so với

33

đối chứng).

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi

của cây quýt Bắc Kạn

Công BAP IBA Tỉ lệ phát Số chồi/mẫu Chất

thức (mg/l) (mg/l) sinh chồi lượng ± % so với

chồi (%) ĐC

Sau 4 tuần

ĐC 1,50±0.26 100 0 0 6,67 +

CT1 2,09±0,35 139,33 3,0 0,5 35,56 ++

CT2 2,25±0,44 150,00 3,0 1,0 53,33 ++

CT3 2,67±0,53 178,00 +++ 3,0 1,5 56,67

CT4 2,39± 0,62 159,33 3,0 2,0 42,22 ++

CT5 2,08±0,51 138,67 3,0 2,5 40,00 ++

Sau 6 tuần

ĐC 0 0 13,33 1,25±0,37 100 +

CT1 3,0 0,5 44,44 2,30±0,46 184,00 ++

CT2 3,0 1,0 66,67 2,73±0,54 281,40 +++

CT3 3,0 1,5 83,33 3,84±0,63 307,20 +++

CT4 3,0 2,0 68,89 2,56± 0,48 204,80 +++

CT5 3,0 2,5 55,56 2,52± 0,39 201,60 ++

Sau 8 tuần

ĐC 0 0 17,78 1,34±0,25 100 +

CT1 3,0 0,5 63,33 2,68± 0,47 200,00 ++

CT2 3,0 1,0 68,89 3,26± 0,62 243,28 +++

CT3 3,0 1,5 93,33 4,68± 0,58 349,25 +++

CT4 3,0 2,0 75,56 3,51± 0,46 261,94 +++

CT5 3,0 2,5 56,67 2,51±0,45 187,31 ++

Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn, lá bé, màu xanh nhạt; (++): chồi nhỏ, lá bé,

34

màu xanh đậm; (+++): chồi to, khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

Môi trường nuôi cấy có cả BAP và IBA tỉ lệ phát sinh chồi và số

chồ/mẫu cao hơn hẳn so với môi trường chỉ bổ sung BAP. Kết quả này cũng

phù hợp với khẳng định của tác giả Vũ Văn Vụ là có loại mẫu chỉ cần auxin

hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai, còn đa số các mẫu phải sử dụng phối

hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ hợp khác nhau [16].

Đối chứng BAP 3,0mg/l + IBA 1,5mg/l

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi

của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.3.2. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi quýt Bắc Kạn

Ở thí nghiệm trước chúng tôi đã xác định được môi trường nuôi cấy có

bổ sung nồng độ kinetin tối ưu cho sự phát sinh chồi của cây quýt Bắc Kạn là

3,5mg/l. Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích

sinh trưởng kinetin và IBA tới sự phát sinh chồi của quýt Bắc Kạn.

Mẫu cấy là đoạn gốc thân mang nách lá mầm được cấy trong môi trường

có bổ sung kinetin 3,5mg/l + IBA nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,5mg/l. Đối chứng

là môi trường MS cơ bản có bổ sung + agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa

35

50ml/l. Kết quả thu được bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi

của cây quýt Bắc Kạn

Số chồi/mẫu

Công thức Kinetin (mg/l) IBA (mg/l) ± Chất lượng chồi % so với ĐC

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 1,5± 0,26 1,79± 0,38 1,69± 0,45 1,91± 0,59 2,19± 0,64 1,67± 0,47 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 100 119,33 112,67 127,33 146,00 111,33 ++ ++ ++ ++ ++ + 0 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 1,25± 0,37 2,16± 0,53 2,22± 0,51 2,41± 0,49 3,26± 0,73 2,14± 0,44 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 100 172,80 177,60 192,80 260,80 171,20 ++ ++ ++ ++ +++ + 0 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Tỉ lệ phát sinh chồi (%) Sau 4 tuần 6,67 32,22 38,89 36,67 41,11 33,33 Sau 6 tuần 13,33 51,11 53,33 56,67 64,44 46,67 Sau 8 tuần 16,67 62,22 65,56 68,89 78,89 48,89 1,47± 0,26 2,68 ±0,54 2,47±0,46 2,94±0,61 3,87±0,67 2,27±0,56 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 100 182,31 168,03 200,00 263,26 154,42 ++ ++ ++ +++ +++ + 0 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn, lá bé, màu xanh nhạt; (++): chồi nhỏ, lá bé,

màu xanh đậm; (+++): chồi to, khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

Theo bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung đồng thời IBAvà kinetin tỉ

lệ phát sinh chồi cao hơn hẳn so với môi trường chỉ bổ sung kinetin cũng như đối

chứng, tỉ lệ phát sinh chồi và số chồi/mẫu tăng dần khi nồng độ IBA tăng từ 0,5

36

đến 2,0mg/l, khi nồng độ IBA tiếp tục tăng lên thì tỉ lệ phát sinh chồi và số

chồi/mẫu giảm dần. Môi trường bổ sung kinetin 3,5mg/l + IBA 2,0mg/l cho hiệu

quả cao nhất. Sau 4 tuần nuôi cấy tỉ lệ phát sinh chồi là 41,11%, số chồi/mẫu là

2,19 (tăng 46% so với đối chứng). Sau 6 tuần tỉ lệ mẫu phát sinh chồi là 64,44%,

số chồi/mẫu là 3,26 (tăng 160% so với đối chứng). Sau 8 tuần tỉ lệ phát sinh chồi

là 78,89%, số chồi/mẫu là 3,87 (tăng 163% so với đối chứng).

Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của các tác trước đó

như Mohammad H.R. Mohammad M.S. (2013) [222], Adhikarimayum H.

và cs (2011) [188] là môi trường bổ sung đồng thời các chất điều hòa sinh

trưởng nhóm auxin và cytokinin kích thích tốt hơn môi trường bổ sung riêng

rẽ chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin.

So sánh với môi trường bổ sung BAP 3,0mg/l +IBA 1,5mg/l, thì môi trường

bổ sung kinetin 3,5mg/l +IBA 2,0mg/l có tỉ lệ mẫu phát sinh chồi và số chồi/mẫu

đều thấp hơn. Do vậy, vừa tiết kiệm, vừa đem lại hiệu quả trong công tác nhân

giống cây quýt Bắc Kạn, thì môi trường tốt nhất là MS cơ bản có bổ sung + agar

9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + BAP 3,0mg/l + IBA 1,5mg/l, cho tỉ lệ

mẫu phát sinh chồi cao, số chồi/mẫu nhiều, các chồi đều mập, khỏe, lá to, màu xanh

đậm, phát triển cân đối.

Đối chứng Kinetin 3,5mg/l + IBA 2,0mg/l

Hình 3.5. Ảnh hường của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi

37

của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ cây quýt Bắc Kạn

α-NAA là chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin, có hoạt

tính sinh lí như một auxin tự nhiên, có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn

nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, đặc biệt

là kích thích tạo rễ. Thông thường, α-NAA được sử dụng bổ sung vào môi

trường nuôi cấy nồng độ từ 0,1mg/l -2,0mg/l. Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng

độ thấp. Với những tìm hiểu về đặc tính của α-NAA, chúng tối tiến hành

nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA tới sự hình thành rễ cây quýt Bắc Kạn bằng

cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy α-NAA với nồng độ khác nhau.

Các chồi khi đạt được chiều cao 1,5- 2,0cm được cấy chuyển sang môi trường

MS cơ bản có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA

0,3mg/l, 0,5mg/l, 0,7mg/l, 0,9mg/l, 1,2mg/l. Đối chứng là môi trường MS cơ bản có

bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l. Qua nghiên cứu chúng tôi thu

được bảng 3.6.

Qua bảng 3.6 cho thấy, ở môi trường nuôi cấy nồng độ α-NAA khác nhau

thì tỉ lệ chồi ra rễ và chiều dài rễ khác nhau. Chứng tỏ nồng độ α-NAA ảnh hưởng

đến sự hình thành và phát triển rễ của cây quýt Bắc Kạn trong nuôi cấy in vitro. Tỉ

lệ chồi hình thành rễ, sỗ rễ/chồi cũng như chiều dài rễ tăng đần khi nồng độ α-

NAA tăng từ 0,3-0,5mg/l, khi nồng độ α-NAA tiếp tục tăng thì tỉ lệ chồi hình

thành rễ và số rễ/chồi giảm dần. Ở môi trường bổ sung α-NAA 1,2mg/l và môi

trường không bổ sung α-NAA, các chồi đều không hình thành rễ. Môi trường có

bổ sung α-NAA 0,5mg/l cho hiệu quả cao nhất. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỉ lệ chồi ra rễ

26,67%, số rễ/chồi 1,75. Sau 6 tuần tỉ lệ chồi hình thành rễ và số rễ/chồi đều tăng

nhanh, tỉ lệ chồi hình thành rễ là 63,33% số rễ/chồi là 2,44. Sau 8 tuần nuôi cấy tỉ

lệ chồi phát sinh chồi là 90%, số rễ/chồi là 2,89.

Kết quả này cũng phù hợp với kết luận của Phan Hữu Tôn và cs (2014)

[133], khi nghiên cứu trên quýt Đường Canh (nồng độ tối ưu cho chồi ra rễ là α-

NAA 0,3mg/l) và cam Vinh (phát sinh rễ tốt nhất ở môi trường bổ sung α-NAA

0,4mg/l). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Sarker và cs

38

(2015) [20], khi nghiên cứu nhân giống cây cam quýt (Citrus aurantifollia) và

Savita và cs (2010) [24], Hawkat A.S. Ushra M.I. (2006) [23], khi nghiên cứu

nhân giống cây chanh thô (Citrus jambhiri Lush), đều khẳng đinh các chồi ra rễ tốt

nhất ở môi trường MS cơ bản bổ sung NAA 0,5mg/l.

Nồng độ α-NAA cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của rễ cây quýt Bắc

Kạn. Chiều dài trung bình của rễ tăng khi nồng độ α-NAA trong môi trường nuôi

cấy tăng từ 0,3-0,5mg/l, khi nồng độ α-NAA tiếp tục tăng thì chiều dài trung bình

của rễ cũng giảm. Chiều dài trung bình của rễ cao nhất ở môi trường bổ sung α-

NAA 0,5mg/l. Sau 8 tuần nuôi cấy, chiều dài trung bình của rễ là 2,10cm,

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ

của cây quýt Bắc Kạn

Công thức

α-NAA (mg/l)

Số rễ/chồi

Chiều dài rễ (cm)

Chất lượng rễ

Tỉ lệ chồi phát sinh rễ (%)

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

0 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2

0 0,5±0,04 0,6± 0,03 0,6±0,05 0,4±0,02 0

++ +++ +++ ++

0 13,33 26,67 16,67 10,00 0

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

0 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2

0 1,3±0,06 1,7± 0,05 1,2±0,05 0,6± 0,02 0

++ +++ +++ ++

0 26,67 63,33 46,67 23,33 0

ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

0 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2

0 1,5± 0,08 2,1±0,06 1,4±0,04 0,7±0,03 0

++ +++ +++ ++

Sau 4 tuần 0 1,25±0,23 1,75±0,34 1,40±0,27 1,33±0,22 0 Sau 6 tuần 0 1,63±0,29 2,42±0,46 1,36±0,21 1,56± 0,39 0 Sau 8 tuần 0 2,21± 0,38 2,89± 0,58 1,75± 0,19 1,50± 0,40 0

0 53,33 90,00 56,67 33,33 0

Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn, lá bé, màu xanh nhạt; (++): chồi nhỏ, lá bé,

39

màu xanh đậm; (+++): chồi to, khỏe, lá to xanh đậm, phát triển cân đối.

Như vậy, môi trường tối ưu cho sự hình thành và phát triển rễ của cây

quýt Bắc Kạn là môi trường MS cơ bản bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l +

nước dừa 50ml/l + α-NAA 0,5mg/l, với tỉ lệ chồi hình thành rễ là 90%, số

rễ/chồi là 2,89 rễ, chiều dài trung bình của rễ là 2,10cm.

Đối chứng α-NAA 0,5mg/l

Hình 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành và phát triển rễ

của cây quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc Kạn ra

ngoài tự nhiên

Đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên là khâu cuối cùng của quy trình

nhân giống in vitro và nó có vai trò quan trọng quyết định đến sự thành công

của quy trình nuôi cấy. Giá thể phù hợp phải cho tỉ lệ cây sống cao, sinh trưởng

và phát triển tốt.

Đất phù sa là được hình thành chủ yếu bởi phù sa bồi tụ của các con sông

và tạo nên các vùng đồng bằng rộng. Đất phù sa trẻ, ngoài đê (đất phù sa mới

được bồi đắp) có màu nâu, độ phì nhiêu cao, tơi xốp, nhiều mùn, nhiều khoáng

sét, giàu ion trao đổi, giữ nước tốt. Đất phù sa cổ và đất phù sa trong đê, bị đào

xới nhiều do hoạt động trồng trọt thì màu nhạt, độ phì nhiêu giảm [300].

Qua tìm hiểu về giá thể ươm cây và tham khảo công trình nghiên cứu về

40

giá thể đưa cây quýt ra ngoài môi trường tự nhiên của tác giả như Phan Hữu

Tôn (2014) [14], chăm sóc cây in vitro khi ra bầu của Lê Văn Hoàng (2007) [4]

và tìm hiểu về đặc điểm đất phù sa, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của giá

thể đến sự sinh trưởng, phát triển của cấy quýt Bắc Kạn qua các loại giá thể: đất

phù sa, trấu hun, đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1). Đất phù sa dùng làm giá thể là

loại đất phù sa trẻ, được lấy ở bãi ven sông. Cây ở các thí nghiệm đều được

chăm sóc như nhau. Kết quả thu được bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro

giống quýt Bắc Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần)

Giá thể thí nghiệm Tỉ lệ sống(%) Chất lượng cây

Đất phù sa 46,67 +

Trấu hun 56,67 ++

Đất phù sa+ trấu hun (tỉ lệ 1:1) 83,33 +++

Ghi chú: (+): Lá cây chuyển màu xanh nhạt, có nhiều lá bị rụng, không

phát triển thêm lá mới; (++): Lá màu xanh đậm, chưa xuất hiện lá mới; (+++):

Lá màu xanh đậm, phát sinh thêm lá mới.

Qua bảng 3.7 cho thấy, các loại giá thể khác nhau thì tỉ lệ cây sống, chiều

cao cây khác nhau. Chứng tỏ giá thể đã ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát

triển của cây quýt Bắc Kạn.

Giá thể tốt nhất để cho cây in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên là đất

phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1), tỉ lệ cây sống sau 6 tuần là 83,33 %, trong khi đó,

giá thể là đất phù sa tỉ lệ cây sống chỉ là 46,67% và trấu hun tỉ lệ cây sống chỉ

là 56,67%. Những cây trồng ở giá thể là đất phù sa còn sống cũng không hình

thành lá mới, lá cũ rụng nhiều, lá trên cây không còn màu xanh đậm như lúc

mới ra cây. Cây trồng ở giá thể là trấu hun, mặc dù lá không rụng, không

chuyển màu, tuy nhiên không phát sinh lá mới. Cây trồng ở giá thể là đất phù

sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1) tỉ lệ cây sống cao (83,33%), các cây đã bắt đầu hình

thành lá mới, lá cũ phát triển, phiến lá rộng màu xanh đậm. Cây mới chuyển ra

41

từ môi trường nuôi cấy nhân tạo, khả năng hấp thụ nước và chất dinh dưỡng

chưa tốt, ở giá thể đất phù sa + trấu hun có đủ độ tơi xốp, thoáng khí, nhiều

chất khoáng, khả năng giữ nước tốt, thuận lợi cho rễ hấp thụ nước, tỉ lệ cây

sống cao, cây sinh trưởng tốt.

Trấu hun Đất phù sa Đất phù sa + trấu hun

(1:1)

Hình 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến việc đưa cây in vitro giống quýt Bắc

42

Kạn ra ngoài tự nhiên (sau 6 tuần)

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Thời gian khử trùng bằng dung dịch Javen 60% tốt nhất là lắc

trong 20 phút. Với lượng thời gian này tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ nảy mầm cao,

mầm đều to khỏe.

1.2. Nồng độ BAP tốt nhất cho tái sinh chồi trực tiếp từ gốc mang nách

lá mầm của cây quýt Bắc Kạn là 3,0mg/l trên môi trường MS cơ bản bổ sung

agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l .

1.3. Nồng độ phối hợp giữa BAP và IBA tốt nhất cho sự tái sinh chồi từ

gốc mang nách lá mầm của cây quýt Bắc Kạn là BAP 3,0mg/l + IBA 1,5mg/l

trên môi trường MS cơ bản có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa

50ml/l, tỉ lệ phát sinh chồi là 93,33% và số chồi trung bình/mẫu là 4,68. Các

chồi đều to, khỏe, lá to phát triển cân đối.

1.4. Môi trường tối ưu cho sự hình thành rễ của cây quýt Bắc Kạn là MS

cơ bản có bổ sung agar 9g/l + sucrose 30g/l + nước dừa 50ml/l + α-NAA

0,5mg/l. Các rễ hình thành đều dài mập, khỏe có nhiều lông hút.

1.5. Giá thể tốt nhất cho việc chuyển cây in vitro ra ngoài là đất phù sa +

trấu hun tỉ lệ 1:1, với tỉ lệ sống của cây là 83,33%, các cây sinh trưởng tốt, phát

sinh cành mới, lá to, xanh.

2. Đề nghị

2.1. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của chất kích thích sinh

trưởng và chất phụ gia khác đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng phát triển của

chồi trong nuôi cấy in vitro cây quýt Bắc Kạn

2.2. Ứng dụng quy trình nhân giống trong chuyển gen vào giống quýt

43

Bắc Kạn, nhằm nâng cao chất lượng quả quýt Bắc Kạn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ tế bào thực

vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà nội.

2. Nguyễn Minh Chơn (2004), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực

vật, khoa Nông nghiệp - Đại học Cần Thơ.

3. Nguyễn Hữu Đống (2003), Cây ăn quả có múi (cam chanh, quýt, bưởi),

NXB Nghệ An.

4. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB

Khoa học và Kỹ thuật.

5. Lê Văn Trường Huân, Hoàng Ý Nhi (2007) , “Nghiên cứu tạo chồi in vitro ở

cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.)”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản

trong khoa học sự sống, NXB khoa học kĩ thuật (2007), tr 308-310.

6. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều

hòa sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam.

7. Nguyễn Bá Lộc (1997), Giáo trình sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục.

8. Mai Xuân Lương (2005), Giáo trình Công nghệ Sinh học thực vật, NXB

Đại học Đà Lạt.

9. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong

chọn giống cây trồng, NXB Đại học Thái Nguyên.

10. Dương Tuấn Nhựt (2011), Công nghệ tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp

11. Hoàng Thị Sản (1977), Phân loại thực vật, NXB Giáo Dục.

12. Nguyễn Đức Thành (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu và

ứng dụng, NXB Nông nghiệp.

13. Phan Hữu Tôn và cs (2014), “Nuôi cấy in vitro trụ trên lá mầm giống cam

(Citrus sinensis), quýt (Citrus reticulata)”, Tạp chí Khoa học và Phát

triển, tập 12, số 5; tr 641-649.

44

14. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật và ứng dụng , NXB

Nông nghiệp Hà Nội

15. Đỗ Năng Vịnh, Ngô Xuân Bình (2008), Giáo trình công nghệ sinh học đại

cương, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

16. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2010), Công nghệ sinh

học Tập II, NXB Giáo Dục Việt Nam.

17. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tâm (1999), Sinh lí học thực

vật NXB Giáo Dục.

II. Tài liệu tiếng Anh

18. Adhikarimayum H., Kshetrimayum G., Huidrom S., Maibam D.

(2011), “In vitro propagation of Citrus megaloxycarpa”,

Environmental and Experimental Biology, (9), pp.129-132.

19. Saini H.K., Gill M.S. and Gill M.I.S., (2010), “Direct shoot

organogenesis and plant regeneration in rough lemon (Citrus

jambhiri Lush.)”, Indian Journal of Biotechnology, 9, pp. 419-423.

20. Sarker I. và cs (2015), “Establishment of a standard protocol for in vitro

meristem culture and plant regeneration of Citrus aurantifollia”, Journal

of Pharmacy and Biological Sciences, 10(2), pp. 61-69.

21. Ibrahim M. A (2012), “In vitro plant regeneration of local pummelo

(Citrusn Grandis (L.) Osbeck.) via direct and indirect organogenesis”,

Genetics and Plant Physiology, 2 (3-4), pp . 187-191.

22. Mohammad H. R., và cs (2013), “In vitro regeneration of sour orange (Citrus

aurantium L.) via direct organogenesis”, Plant Knowledge Journal, Southern

Cross Publishing Group, 2(4), pp. 150 - 156.

23. S Hawkat A., Ushra M.B., (2006), “Micropropagation of rough lemon

(Citrus jambhiri Lush.): Effect of explant type and hormone

concentration”, ActaBot.Croat, 65(2), pp. 137-146.

45

24. Savita và cs (2010), “Effect of Explant Type and Different Plant Growth

Regulators on Callus Induction and Plantlet Regeneration in Citrus

jambhiri Lush”, Environ. We Int. J. Sci. Tech, 5, pp. 97-106.

25. Suneel S., Atam P., Ajinath T., (2009), “In vitro Propagation of Citrus

Rootstocks”, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, Not.

Bot. Hort. Agrobot. Cluj, 37 (1), pp. 84-88.

III. Tài liệu mạng

26. http://www.caythuocquy.info.vn/old/modules.php?name=News&opcase=

detailsnews&mid=975&mcid=245&pid=&menuid=)

27. http://botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=773( trung tâm dữ liệu

thực vật Việt Nam).

28. http://www.baobackan.org.vn/channel/1121/201512/quyt-bac-kan-tren-

duong-hoi-nhap-2419819/

29. http://www.faostat.fao.org

30. http://www.tailieu.tv/tai-lieu/tinh-hinh-khoang-set-trong-nhom-dat-phu-

sa-11208/

31. Ngọc Lan (2015), Quýt Bắc Kạn - sản phẩm nông nghiệp “sạch”

(https://www.backan.gov.vn/Pages/tin-tuc-su-kien-215/tin-trong-tinh-

289/xuc-tien-dau-tu-187/quyt-bac-kan-san-pham-nong-nghiep-

1888788d48aad96f.aspx)

46

PHỤ LỤC

Kêt quả xử lí số liệu thực nghiệm

1 Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi (số chồi/mẫu) của quýt

Anova: Single Factor

SUMMARY

Count

Sum Average

Variance

Groups

23

1.4375

0.2625

16

ĐC

112 2.153846 0.485671

52

CT1

139 2.438596 0.500627

57

CT2

273 3.455696 0.712756

79

CT3

157 2.661017 0.538282

59

CT4

119 2.38

0.566939

50

CT5

ANOVA

Source of Variation

SS

df MS

F

P-value

F crit

2.61E-

Between Groups

93.67249 5

18.7345

33.56828

27

2.243399

Within Groups

171.3371 307 0.558101

Total

265.0096 312

Bắc Kạn (sau 8 tuần)

2 Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi (số chồi/mẫu) của quýt

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum Average

Variance

ĐC

22

1.466667 0.266667

15

CT1

81

1.928571 0.555749

42

CT2

99

2.2

0.345455

45

CT3

133 2.375

0.420455

56

CT4

196 2.925373 0.615559

67

CT5

106 2.255319 0.455134

47

ANOVA

Source of Variation

SS

df MS

F

P-value

F crit

2.21E-

Between Groups

42.79512 5

8.559024 18.01086

15

2.24795

Within Groups

126.4071 266 0.475215

Total

169.2022 271

Bắc Kạn (sau 8 tuần)

3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến sự phát sinh chồi (số chồi/mẫu)

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average

Variance

Đc

16

22

1.38

0.25

CT1

57

153

2.68

0.47

CT2

62

202

3.26

0.62

CT3

84

393

4.68

0.58

CT4

68

239

3.51

0.46

CT5

51

128

2.51

0.45

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups

274.2511

5

54.85021

107.1264

4.41394E-67

2.241179

Within Groups

169.9886

332

0.512014

Total

444.2396

337

của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần)

4 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IBA đến sự phát sinh chồi (số

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum Average

Variance

Đc

25

1.47

0.26

17

CT1

150

2.68

0.48

56

CT2

146

2.47

0.43

59

CT3

182

2.94

0.65

62

CT4

275

3.87

0.31

71

CT5

100

2.27

0.48

44

ANOVA

df

Source of Variation

SS

MS

F

P-value

F crit

5

Between Groups

131.74

26.34799

58.0657

2.98889E-42

2.243788

Within Groups

137.4898

303

0.453762

Total

269.2298

308

chồi/mẫu) của quýt Bắc Kạn (sau 8 tuần)

5. Ảnh hưởng của NAA đến sự phát sinh rễ (số rễ/chồi) của quýt Bắc Kạn

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average

Variance

ĐC

38

0

0.00

0.00

CT1

48

106

2.21

0.38

CT2

81

234

2.89

0.58

CT3

51

89

1.75

0.19

CT4

30

45

1.50

0.40

ANOVA

df

Source of Variation

SS

MS

F

P-value

F crit

4

Between Groups

226.9454

56.73636

162.003

2.46E-67

2.408792

Within Groups

85.10294

243

0.350218

Total

312.0484

247

(sau 8 tuần)

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Average

Variance

Sum

CT1

35

1.505714

0.079378

52.7

CT2

78

163.5

2.096154

0.05544

CT3

30

1.383333

0.042816

41.5

CT4

15

0.693333

0.030667

10.4

ANOVA

P-

Source

of

Variation

SS

df

MS

F

value

F crit

Between

2.26E

2.66332

Groups

31.76971442

3

10.5899

188.7836

-51

8

Within Groups

8.638703297

154

0.056095

Total

40.40841772

157

6. Ảnh hưởng của NAA đến chiều dài của rễ (cm) (sau 8 tuần)

7. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ nảy mầm của hạt quýt Bắc Kạn

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average

Variance

293.4 97.8

3.88

3

CT1

291.6 97.2

7.84

3

CT2

282.5 94.16667 2.083333

3

CT3

262.5 87.5

6.25

3

CT4

240.3 80.1

7.03

3

CT5

ANOVA

Source

of

Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups 675.4307 4

168.8577 31.17372 1.26958E-05

3.47805

Within Groups

54.16667 10

5.416667

Total

729.5973 14

7.1. Hạt bóc vỏ (tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm)

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average

Variance

294.3

98.1

2.71

3

CT1

294.4

98.13333 10.45333

3

CT2

285

95

6.25

3

CT3

270

90

6.25

3

CT4

237.8

79.26667 15.61333

3

CT5

7.2. Hạt bóc vỏ và cắt 1/3 lá mầm (tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm)

ANOVA

Source

of

Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups 749.7467 4

187.4367 22.70492 5.28393E-05

3.47805

Within Groups

82.55333 10

8.255333

Total

832.3

14

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average

Variance

207.3

69.1

3.79

CT1

3

221

73.66667 7.123333

CT2

3

236.57 78.85667 5.148633

CT3

3

200.9

66.96667 5.373333

CT4

3

189.9

63.3

7.84

CT5

3

ANOVA

Source

of

Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups 438.215 4

109.5538 18.71095 0.00012307

3.47805

Within Groups

58.5506 10

5.85506

7.3. Hạt không bóc vỏ (tỉ lệ hạt không nhiễm nảy mầm)