Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: So sánh trình tự gen tổng hợp Isoflavone phân lập từ đậu xanh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐỖ THỊ CẨM VÂN

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN TỔNG HỢP

ISOFLAVONE PHÂN LẬP TỪ ĐẬU XANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐỖ THỊ CẨM VÂN

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN TỔNG HỢP

ISOFLAVONE PHÂN LẬP TỪ ĐẬU XANH

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi. Các số

liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được

ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin cam đoan và hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong

luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đỗ Thị Cẩm Vân

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới

PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã luôn quan tâm, hướng dẫn và chỉ bảo

tận tình cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Thị Thu Yến và các thầy cô giáo

Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như thực

hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, KS. Hồ Mạnh Tường

và các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công

nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều

kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,

đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn cùng tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đỗ Thị Cẩm Vân

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3

1.1. Cây đậu xanh .............................................................................................. 3

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh .................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây đậu xanh ..................................................... 4

1.1.3. Giá trị của cây đậu xanh .......................................................................... 8

1.2. Thành phần và hoạt tính của Isoflavone .................................................. 10

1.2.1. Thành phần của Isoflavone ................................................................... 10

1.2.2. Hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của Isoflavone .............................. 13

1.3. Gen và con đường sinh tổng hợp Isoflavone ........................................... 15

1.3.1. Con đường sinh tổng hợp Isoflavone .................................................... 15

1.3.2. Gen tổng hợp Isoflavone ....................................................................... 16

1.3.3. Gen tổng hợp Isoflavone CHI ở cây xanh ............................................ 18

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 19

2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu ................................. 19

2.1.1. Vật liệu .................................................................................................. 19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 20

iv

2.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 21

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 21

2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22

2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và mRNA tổng số ..................... 22

2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA ............................................................... 23

2.2.3. PCR khuếch đại gen CHI ...................................................................... 24

2.2.4. Tách dòng gen CHI ............................................................................... 27

2.2.5. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ............................................ 29

2.2.6. Phương pháp phân tích trình tự gen ...................................................... 29

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 30

3.1. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ DNA genome ........................ 30

3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 30

3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CHI từ cây đậu xanh ...................................... 31

3.1.3. Kết quả tách dòng gen CHI từ DNA genome ....................................... 32

3.2. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ cDNA .................................... 34

3.3. Phân tích trình tự gen CHI từ các mẫu nghiên cứu ................................. 37

3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen CHI từ DNA genome và từ cDNA .......... 37

3.3.2. Kết quả so sánh trình tự gen CHI phân lập từ mẫu đậu xanh nghiên

cứu với trình tự gen CHI đã được công bố trên Ngân hàng gen. .................... 41

3.3.3. Phân tích trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI của mẫu đậu

xanh nghiên cứu .............................................................................................. 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 48

1. Kết luận ....................................................................................................... 48

2. Đề nghị ........................................................................................................ 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Amino acid trong bột đậu xanh và tiêu chuẩn của FAO/WHO ....... 9

Bảng 2.1. Cặp mồi nhân gen CHI ................................................................... 20

Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng ................................................... 21

Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA .................................... 24

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen CHI .............................................. 25

Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen CHI .............................. 25

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen CHI vào vector pBT ...................... 27

Bảng 3.1. Tỷ số A260/A280 và hàm lượng DNA tổng số của hai giống đậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

xanh nghiên cứu .............................................................................. 31

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây đậu xanh................................................................................... 4

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Genistein và Daidzein ................................ 11

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ............................................ 16

Hình 2.1. Hình ảnh hạt của mẫu giống đậu xanh nghiên cứu ....................... 19

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose ........................... 30

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại DNA của gen

CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10 ........................... 32

Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR plasmid ....................... 34

Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của gen

CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10 ........................... 35 Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pBT-CHI bằng că ̣p enzyme

NcoI và NotI ................................................................................. 36

Hình 3.6: Đặc điểm cấu trúc gen CHI từ các mẫu đậu xanh nghiên cứu ..... 40

Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide gen CHI của đậu xanh Việt Nam với

trình tự đã công bố ........................................................................ 42

Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid từ gen CHI của đậu xanh Việt Nam

với trình tự đã công bố .................................................................. 43

Hình 3.9. So sánh (alignment) trình tự amino acid của CHI giữa các loài

thực vật khác nhau. ....................................................................... 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.10. Cây phân loại của CHI ở một số thực vật ..................................... 46

vii

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Base pair (cặp bazơ) bp

Complementary DNA cDNA

Chalcone isomerase CHI

cộng sự cs

Diethyl pyrocarbonate DEPC

Deoxyribose nucleic acid DNA

Deoxy nucleoside triphosphate dNTP

Ethylene diamine tetraacetic acid EDTA

Escherichia coli E.coli

Kilo base kb

mRNA Messenger ribonucleic acid

Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PCR

Ribonucleic acid RNA

Tris-acetate-Ethylene diamine tetraacetic acid TAE

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galacto-pyranoside X-gal

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Đậu xanh là cây đậu đỗ ngắn ngày, khả năng sinh trưởng mạnh, dễ

thích ứng với nhiều mô hình trồng trọt. Đặc biệt trong những nghiên cứu gần

đây cho thấy đậu xanh có thể trồng được nhiều vụ trong năm. Đậu xanh có thể

trồng xen, trồng gối, trồng thuần trên nhiều loại đất canh tác khác nhau. Cây

Đậu xanh ngoài giá trị kinh tế nó còn có giá trị vô cùng quan trọng khác về

mặt sinh học, đó là khả năng cố định nitơ khí quyển thành đạm cung cấp cho

cây nhờ vi khuẩn Rhirobium virgana cộng sinh ở bộ rễ.

Hạt đậu xanh là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, hạt đậu xanh

giàu hydratcacbon, protein và các loại vitamin khác. Protein đậu xanh chứa

đầy đủ các amino acid không thay thế. Với hàm lượng dinh dưỡng cao của

hạt đậu xanh nên sản phẩm chế biến từ hạt đậu xanh rất phong phú như: Bột

đậu xanh, bánh đậu xanh, đồ xôi, nấu chè làm miến, làm giá đỗ.... Ngoài việc

cung cấp dinh dưỡng, hạt đậu xanh còn được dùng trong đông y như một bài

thuốc nam: Vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, tính hàn có tác dụng giải nhiệt giải

độc. Dùng nấu ăn để tiêu phù thũng, hạ bí, giải nhiệt độc, giải các chất độc

của thuốc và kim loại, hạt đậu xanh còn dùng chữa bệnh đái tháo đường...

Trong đậu xanh còn có chứa thành phần isoflavone là dược chất có nguồn gốc

thảo mộc, có thể làm giảm sự xuất hiện của một số loại ung thư, giảm các

triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, béo phì, loãng

xương, ngăn chặn sự gia tăng choleterol trong máu. Bên cạnh đó, hoạt chất

Isoflavone giúp phụ nữ tăng cường chất lượng của da, giảm được các nếp

nhăn, giảm độ sâu của nếp nhăn mắt, làm cho da săn chắc hơn nhờ tăng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

cường kết nối collagen, đồng thời cải thiện màu sắc và giữ ẩm cho da.

2

Các công trình nghiên cứu về cây đậu xanh hiện nay chủ yếu trên

phương diện hình thái, năng suất, đánh giá sự đa dạng về kiểu gen, kiểu hình

và đa hình protein …. Một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng

kháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus, kháng mọt,… trên một số giống

đậu xanh. Tuy nhiên, những nghiên cứu về hoạt tính, tác dụng của Isoflavone

đậu xanh và về gen isoflavone ở đậu xanh vẫn còn rất hạn chế.

Xuất phát từ yêu cầu thực tế khách quan đó, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: "So sánh trình tự gen tổng hợp Isoflavone phân lập từ đậu xanh".

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được đặc điểm trình tự gen CHI phân lập từ hai mẫu

giống đậu xanh.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tách DNA tổng số, tách mRNA tổng số, nhân gen, tách dòng gen và

xác định trình tự gen của 2 mẫu giống đậu xanh nghiên cứu.

- So sánh trình tự gen CHI và trình tự amino acid suy diễn của protein

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

CHI từ 2 mẫu đậu xanh nghiên cứu với mẫu trên ngân hàng gen.

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây đậu xanh

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh

Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck] hay còn gọi là đậu nhỏ,

đậu chè, có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo.

Cây đậu xanh đươ ̣c xếp trong hê ̣ thố ng phân loại khoa học như sau:

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Fabales

Họ: Fabaceae

Phân họ: Faboideae

Chi: Vinga.

Loài: V.radiata.

Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loài thuộc hai chi phụ

là Vigna và Ceratotropic. Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu

châu Á, bao gồm 16 loài trong đó có 5 loài trồng trọt là: Đậu xanh (Vigna

radiata (L).Wiliczek), đậu gạo (Vigna umbellata (thumb)), đậu ván (Vigna

aconiti folia (Jacq)), đậu Adzukia (Vigna angularis (Wild), và Vigna

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

trilobata (L).Wildzek [3], [5].

4

Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi

ở các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương [5].

1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây đậu xanh

Đậu xanh là cây hàng năm, thuộc loại thân thảo, thân yếu có lớp lông

mịn màu nâu sáng. Thân cây gồm 7-8 đốt, phân cành muộn, chiều cao cây

trung bình 40-70 cm, đường kính trung bình 8-12 mm. Một cây đậu xanh

hoàn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt (Hình 1.1).

b a c

e d f

Nguồn [43], [44].

Hình 1.1. Cây đậu xanh

(a):thân, lá, hoa cây đậu xanh; (b):cây đậu xanh giai đoạn bắt đầu ra quả

non;(c):cây đậu xanh giai đoạn quả chắc; (d):cây đậu xanh vào thời kỳ

chín;(e):quả đậu xanh lúc chín; (f):hạt đậu xanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Rễ

5

Bộ rễ đậu xanh bao gồm rễ chính và rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu

vào đất khoảng 20-30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70-100

cm. Rễ phụ thường có 30-40 cái, dài khoảng 20-25 cm, phân bổ chủ yếu ở

tầng mặt, không sâu quá 25 cm [2]. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu

bì rễ biến đổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh

dưỡng cho cây. Ở các điểm tiếp giáp rễ chính và rễ phụ cũng như trên

chiều dài của rễ phụ thường hình thành nhiều nốt sần. Nốt sần là nơi tụ tập

vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. So với một số loại đậu đỗ khác thì số

lượng nốt sần của cây đậu xanh ít hơn, nốt sần nhỏ hơn. Thường trung bình

trên mỗi cây có khoảng 20-30 nốt sần, tập trung chủ yếu ở cổ rễ. Kích

thước của các nốt sần không giống nhau, đường kính dao động từ 4-5 mm.

Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2-3 lá thật và đạt tối đa

khi cây ra hoa rộ. Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn

các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn. Người ta nhận thấy rằng

những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động

mạnh hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng. Trung bình

mỗi vụ, một ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85-107 kg nitơ

làm cho đất tơi xốp hơn [7], [9]. Nếu bộ rễ phát triển tốt thì bộ lá xanh lâu,

cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy. Ngược lại, bộ rễ phát triển kém thì cây sẽ

chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ bị lép [3], [8].

Thân, cành

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng

40-70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu

6

sáng bao bọc. Thân có 3 dạng: đứng thẳng, đứng nghiêng, bò lan trên mặt đất.

Dạng bò lan thường chỉ gặp ở các vùng đồi núi của Ấn Độ và Mianma.

Trên thân chia 7-8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng. Độ dài của các lóng

thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác. Các lóng dài khoảng 8-10

cm, các lóng ngắn chỉ 3-4 cm. Từ các đốt mọc ra các cành, trung bình có 1-5

cành. Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển mạnh gọi là cành cấp

I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2-3 mắt, từ các mắt này mọc ra các

chùm hoa. Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùm hoa. Thời kỳ trước

khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm, sau đó mới tăng

nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc đã có quả chắc.

Đường kính trung bình của thân chỉ từ 8-12 mm và tăng trưởng tỷ lệ thuận với

tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [3].

Lá

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi

thân chính có 7-8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn.

Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên và

dưới của lá đều có lông bao phủ. Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên, các

lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn. Chỉ số diện tích lá (m2

lá/m2 đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch.

Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc

vào giống, đất trồng và thời vụ [2], [3].

Hoa

Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,

xếp xen kẽ nhau ở trên cuống. Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt

7

đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây mọc 18-20 ngày thì mầm hoa

hình thành, sau 35-40 ngày thì nở hoa. Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu

tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10-15 ngày. Mỗi chùm hoa dài từ 2-10 cm

và có từ 10-125 hoa. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu xanh

tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt [3]. Hoa đậu xanh thường nở rải rác,

các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn chậm

hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây. Trên cùng một cành, các chùm hoa

cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10-15 ngày. Trong một chùm hoa cũng

vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh 10-15 ngày. Hoa

nở được 24 giờ là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quả chín.

Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây. Công thức

hoa là: K5C5A10G1[3].

Thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm:

- Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài trong 16 ngày.

- Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp trong 30 ngày.

- Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày.

Quả và hạt

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng

dẹt với đường kính 4-6 mm, dài 8-14 cm, dài khoảng 8-10 cm, có 2 gân nổi rõ

dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màu

xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen... gặp nắng rễ bị tách

vỏ. Một cây trung bình có khoảng 20-30 quả, mỗi quả có từ 5-10 hạt. Trên vỏ

quả được bao phủ một lớp lông mịn. Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

giống và khả năng chống chịu của cây. Những giống đậu xanh chống chịu bệnh

8

khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông dày, vào thời kì chín hoàn toàn

lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [1], [2]. Các quả của những lứa

hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra lứa sau đó, nhưng quả to và hạt

mẩy hơn. Các quả của những đợt hoa ra sau thường ngắn, ít hạt, hạt không mẩy,

màu hạt cũng nhạt và bé hơn. Các quả sinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều

quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ở cành. Quả đậu xanh chín rải rác,

có khi kéo dài đến 20 ngày [9].

Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất

dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là

nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên. Hạt có hình

tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và có nhiều màu sắc khác nhau như:

màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn cách

nhau bằng những vách xốp của quả. Ruột hạt màu vàng, xanh, xanh nhạt.

Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu quan trọng để

đánh giá chất lượng của hạt. Mỗi quả có từ 8-15 hạt. Hạt của những quả trên

thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành. Hạt của các quả lứa đầu

cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau. Số lượng hạt trung bình trong một quả là

một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh. Trọng

lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20-90 gam tùy giống, thời vụ và chế

độ canh tác. Trọng lượng 1000 hạt từ 50-70 gam[9].

1.1.3. Giá trị của cây đậu xanh

Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, đứng hàng thứ ba

sau đậu tương và lạc. Về dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm

giàu đạm (khoảng 24-28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng 1,3%, glucid

60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P… cùng nhiều loại vitamin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C… Protein hạt đậu xanh chứa đầy

9

đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine,

methyonine, valine…[3], [8].

Protein đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế và tương

đối phù hợp với tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em được tổ chức Nông

lương và y tế thế giới đưa ra theo bảng 1.1.

Hàm lượng dinh dưỡng trong 100g bột đậu xanh không tách vỏ có

24,0g Protein; 1,3g dầu; 59,7g hydratcacbon; 3,5g khoáng; 124mg Ca; 326mg

P; 7,3mg Fe; 94,0mg Caroten; 0,47mg B1; 0,39mg B2 và 334kcalo.

Bảng 1.1. Amino acid trong bột đậu xanh và tiêu chuẩn của FAO/WHO

Thực phẩm tiêu chuẩn Bột Đậu Xanh FAO/WHO -2007 Amino acid (% protein) (% protein)

3,5 Isoleicine 3,6

5,9 Leucine 7,3

6,1 Lycine 6,4

2,0 Methionin + Cystine 3,5

6,7 Phenyalanin + Tyrosine 7,3

2,1 Threonine 4,2

1,8 Tryptophan 1,0

4,1 Valin 5,0

(Nguồn: FAO năm 2007)

Hạt đậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà

còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị và làm nguyên liệu cho công nghiệp chế

biến và tinh rút protein. Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại

thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

xôi đỗ và một số đồ uống...[8]. Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được

10

dùng để làm rau, muối dưa. Thân lá xanh của cây đậu xanh dùng làm thức ăn

cho chăn nuôi, còn thân lá già đem phơi khô, nghiền nhỏ làm bột dự trữ cho

gia súc...[3], [8]. Ngoài ra, đậu xanh còn có giá trị trong y học. Hạt đậu xanh

có vị ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [4].

Cây đậu xanh ngoài giá trị kinh tế nó còn có giá trị vô cùng quan trọng

khác về mặt sinh học, đó là khả năng cố định nitơ khí quyển thành đạm cung

cấp cho cây nhờ vi khuẩn Rhirobium virgana cộng sinh ở bộ rễ. Lượng đạm

cố định được phụ thuộc vào môi trường đất tương đương từ 30 - 60kg N/ha.

1.2. Thành phần và hoạt tính của Isoflavone

1.2.1. Thành phần của Isoflavone

Isoflavone có nguồn gốc phytoestrogen thực vật thuộc nhóm các hợp

chất flavonoid. Các hợp chất này được tìm thấy đầu tiên trong phân lớp đậu

thuộc họ đậu. Chúng là các hợp chất phenolic với cấu trúc tương tự cấu trúc

của estrogen ở người. Isoflavone có trong nhiều loại đậu khác nhau, trong đó

có cả ở đậu xanh.

Isoflavone tồn tại ở dạng tự do aglucon và dạng liên kết glucosid.

Isoflavone dạng tự do gồm có 3 loại genistein, daidzein và glycitein; có hoạt

tính sinh học cao hơn rất nhiều so với các Isoflavon còn lại. Genistein và

daidzein (hình 1.2) là hai hợp chất isoflavone tự nhiên đang được nghiên cứu

vì lợi ích sức khỏe đáng kể mà nó đem lại, hai hợp chất này chiếm phần lớn

trong tổng số các Isoflavone. Theo Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa

Kỳ (FDA) thì tổng hàm lượng daizdein và genistein chiếm khoảng từ 93%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

đến 98% Isoflavone tổng số.

11

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Genistein và Daidzein [45].

Genistein:

Genistein thuộc nhóm các isoflavones. Genistein có tên đầy đủ 7-

Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-one hay 4',5,7-Trihydroxyisoflavone.

Genistein đã được xác định có mặt trong nhiều loại đậu, rau quả và ngũ cốc

khác với hàm lượng khác nhau. Genistein cũng đã được chứng minh là

một phytoestrogen và có khả năng phát huy nhiều tác dụng cũng như ảnh

hưởng khác nhau khi có mặt trong cơ thể. Các tác động của hợp chất này

có thể thông quan thụ quan của hormon sinh dục nữ estrogen hoặc không

quan thụ quan này [24].

Genistein có tác động tương tự estrogen (estrogen angonist): Kích thích

sự phát triển và duy trì các đặc tính sinh dục cái (bao gồm cả các đặc điểm sinh

dục sơ cấp và thứ cấp). Genistein có khả năng hạn chế loãng xương ở phụ nữ

mãn kinh, ảnh hưởng tốt đến tim mạch và nồng độ cholesterol trong máu. Hạn

chế đáp ứng của tế bào với estrogen nhờ khả năng "khóa" các thụ quan của

hormon này.

Một số Isoflavone (bao gồm genistein) có khả năng hạn chế quá trình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

hình thành mạch máu mới (antiangiogenic), ức chế các tế bào phát triển vô giới

12

hạn có liên quan đến ung thư và có khả năng ức chế hoạt tính của một số thành

phần tham gia điều khiển quá trình phân chia và sống sót của tế bào.

Các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm cho thấy genistein và một số

isoflavone có khả năng hạn chế sự phát triển của các loại ung thư nói trên khi

cơ thể được tiếp xúc sớm với những chất này nhưng có khả năng làm tăng nguy

cơ bị bệnh khi phải thu nhận chúng trong giai đoạn bào thai (qua hệ tuần hoàn

của mẹ) hoặc ở nhưng cá thể trưởng thành nhưng có nồng độ estrogen trong

máu thấp.

Một số nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa Isoflavone với các

bệnh ung thư vú, sai lệch sự phát triển của dương vật, thiếu máu (do genistein

có khả năng ức chế enzyme topoisomerase đẫn đến phá hủy mạch kép của

DNA và gây đột biến). Trong khi đó, các nhà khoa học tại Viện nghiên cứu ung

thư Hoa Kỳ đã thử nghiệm trên động vật nhưng không tìm thấy ảnh hưởng có

hại của genistein. Nghiên cứu lâm sàng trên người đang được tiến hành [26].

Cơ chế tác động: Genistein là chất ức chế tyrosine kinase (các enzym có

khả năng xúc tác cho quá trình chuyển nhóm phốt phát từ ATP đến tyrosin).

Tyrosine kinase có liên quan đến hầu hết các tín hiệu của quá trình phát triển và

phân chia tế bào [42].

Daidzein:

Daidzein là chất rắn hầu như không tan trong nước. Daidzein có hoạt

tính estrogen và hoạt tính chống oxy hóa. Nó cũng có hoạt tính kháng nghiện

rượu, kháng các nhân tố gây ung thư, kháng xơ vữa động mạch, kháng hội

chứng loãng xương.

Daidzein được hấp thụ ở ruột sau đó được vận chuyển vào chu trình của

cơ thể bởi hệ bạch huyết, có rất ít daidzein đến được các mô. Sau đó chúng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

được phân phối tới gan dưới dạng liên kết với gluconat và sulphat nhờ Enzyme

13

UDP-glucurostyltransferaza. Dạng liên kết của daidzein với gluconat và

sulphat được bài tiết vào trong nước tiểu và vào trong ống dẫn mật. Dạng liên

kết này lại bị cắt để tạo thành daidzein được hấp thụ và chuyển hóa ở ruột già

thành dihydrodaidzein và sau đó được chuyển thành Equol và O-

desmethylangolensin.

1.2.2. Hoạt tính và tác dụng điều trị bệnh của Isoflavone

Isoflavone giúp cho sự cải thiện toàn bộ về chất lượng sống của phụ nữ

mãn kinh. Ăn các thực phẩm giàu isoflavone đã cải thiện rõ rệt những triệu

chứng của tuổi mãn kinh so với ở nhóm phụ nữ dùng chế độ dinh dưỡng

thông thường [27].

Hiệu quả của Isoflavone trên da của phụ nữ sau mãn kinh cũng đã được

nghiên cứu. Tiến hành nghiên cứu với những phụ nữ sau mãn kinh (n=30),

trước và sau khi điều trị với 100mg/ngày bằng chiết xuất đậu tương đậm đặc

giàu isoflavone trong thời gian 6 tháng. Trước và sau liệu trình điều trị, một

mẩu da ở vùng mông được lấy mẫu. Đánh giá hình thái học xác định độ dầy

của biểu mô, nếp nhăn (chỉ số nhú), sợi đàn hồi và sợi collagen của da. Số

lượng mạch máu ở các mẫu này cũng được phân tích. Tăng 9.46% độ dầy

biểu mô được quan sát thấy ở 23 bệnh nhân sau điều trị Isoflavone. Chỉ số

nhú tỉ lệ nghịch tương ứng với nếp nhăn da. Ở 25 phụ nữ (86.2%) có tăng số

lượng collagen trong da. Ở 22 phụ nữ (75.8%) có tăng sợi đàn hồi của da. Ở

21 phụ nữ có sự tăng đáng kể các mạch máu trong da. Kết quả của nghiên cứu

này chứng minh rằng bổ sung chiết xuất đậu tương đậm đặc giàu isoflavone

trong 6 tháng làm tăng đáng kể độ dầy lớp biểu mô, mạch máu, sợi đàn hồi và

sợi collagen của da [10].

Vai trò của các isoflavone trong việc ngăn chặn bệnh ung thư, đặc

biệt là các bệnh ung thư phụ thuộc vào hormone như màng trong tử cung, ở

vú, buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt thay đã được nghiên cứu rộng rãi.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả cho thấy các bệnh này rất ít phổ biến ở các nước phương Đông, nơi

14

có chế độ ăn giàu đậu tương. Sự bài tiết nước tiểu cao của equol và

enterolactone (các sản phẩm chuyển hoá của Isoflavone ở động vật có vú)

đã được tìm thấy có liên quan đến việc giảm đáng kể nguy cơ ung thư vú.

Kết quả từ 26 nghiên cứu trên động vật thực nghiệm về ung thư đã chỉ ra

tác dụng bảo vệ trong 17 nghiên cứu (chiếm 65%), gồm có giảm nguy cơ

ung thư, số khối u và không có nghiên cứu nào cho thấy đậu tương làm

tăng khối u [27].

Nhiều cơ chế chống ung thư của các Isoflavone và genistein đã được đề

xuất. Genistein ức chế hoạt động của enzyme tyrosine kinase trong sự tự

phosphoryl hoá của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF), ức chế tăng sinh tế bào,

trong khi equol có liên quan đến biểu hiện của gene estrogen. Các tác dụng

khác được đề xuất như ức chế enzyme topoisomerase DNA, ức chế chu kỳ

phát triển tế bào, ức chế sự hình thành mạch, ức chế enzyme tham gia vào các

quá trình tổng hợp estrogen [28].

Hiệu quả bảo vệ của Isoflavone chống lại ung thư tuyến tiền liệt đã

được xem xét, đặc biệt là tác dụng của equol, một sản phẩm có thể được xem

là một antiandrogen mới. Tỷ lệ tử vong do mắc ung thư tuyến tiền liệt ở Mỹ

cao hơn nhiều so với tại các nước châu Á như Nhật Bản và Trung Quốc, nơi

có chế độ ăn uống giàu đậu tương [31].

Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi James W. Anderson, với 730

tình nguyện viên để xem ảnh hưởng của việc ăn protein đậu nành với hệ

thống mạch máu qua việc đo lường chất cholesterol. Sau khi thử nghiệm và

phân tích các dữ kiện thâu thập, kết quả cho thấy là lượng cholesterol trong

máu giảm theo tỷ lệ lượng tiêu thụ protein đậu nành: nhóm ăn 25 grams một

ngày giảm 8.9 mg/dl, nhóm ăn 50 grams giảm 17.4 mg/dl, và nhóm ăn 75

grams protein đậu nành giảm 26.3 mg/dl lượng cholesterol trong máu. Tính

chung thì lượng cholesterol giảm 9.3%, lượng LDL cholesterol giảm 12.9%,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

lượng triglycerides VLDL giảm 10.5%, và lượng HDL cholesterol tăng 2.4%.

15

Bởi vì mỗi 1% lượng cholesterol giảm sẽ làm giảm mức độ nguy hiểm của

bệnh động tim và tai biến mạch máu não từ 2% đến 3%, cho nên với lượng

trung bình cholesterol giảm 9.3% độ nguy hiểm về bệnh tim mạch có thể xảy

ra sẽ giảm được 18% đến 28% [11].

Hoạt tính chống oxy hoá là một trong những cơ chế có thể góp phần

vào tác dụng bảo vệ tim mạch của đậu tương và các isoflavone có trong đậu

tương. Các Isoflavone có cấu trúc hoá học giống với estrogen, có tác dụng

chống oxy hoá yếu vì có nhóm -OH ở vòng "A", tương tự vị trí trong cấu trúc

của vitamin E, dẫn đến làm bền vững màng tế bào, bảo vệ tế bào với quá tŕnh

peroxide lipid. Ngoài ra, các isoflavone còn có nhiều nhóm -OH, giúp tăng

cường hiệu quả chống oxy hoá của chúng bằng cách cho các gốc peroxyd

nguyên tử hydro của nhóm -OH phenol. Sự khác nhau về hiệu lực giữa

genistein và daidzein là do sự có mặt của nhóm 5-hydroxyl, làm cho genistein

có tác dụng tốt hơn daidzein. Tác dụng chống oxy hoá của các isoflavone có

thể làm giảm các tác hại của gốc tự do gây ra với DNA [36], [38].

Nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng của isoflavones đậu tương đối

với điều trị suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ đã được tiến hành. Một nghiên

cứu quan sát nhằm kiểm tra mối quan hệ giữa lượng đậu nành và chức năng

nhận thức thấy rằng những người đàn ông Hawaii đã tiêu thụ đậu phụ ít nhất

hai lần một tuần trong độ tuổi trung niên có nhiều khả năng duy trì trí nhớ sau

20-25 năm sau đó hơn so với những người báo cáo tiêu thụ đậu phụ ít hơn hai

lần một tuần [37].

1.3. Gen và con đường sinh tổng hợp Isoflavone

1.3.1. Con đường sinh tổng hợp Isoflavone

Isoflavone được tổng hợp từ một nhánh của con đường trao đổi chất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

phenylpropanoid (Hình 1.3).

16

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone [32]

Phản ứng đầu tiên là một aminno acid L-phenylalanine loại bỏ đi nhóm

amin để tạo ra axit cinnamic qua các enzyme lyase phenylalaninen ammonia

(PAL). Đầu tiên, phenylalanine phản ứng với malonyl CoA để tạo thành 4

hydroxycinnamoyl CoA. Dưới sự kiểm soát xúc tác của chalcone synthase, 4-

CoA hydroxycinnamoyl ngưng tụ với ba phân tử malonyl CoA để tạo thành một

chalcone. Isomerase chalcone xúc tác đóng vòng của vòng dị vòng. Isoflavone

synthase gắn một nhóm 2-hydroxyl, sau đó được gỡ bỏ bởi một dehydratase

isoflavone để tạo thành daidzein (7,4'-dihydroxyisoflavone) và genistein (5,7,4'-

trihydroxyisoflavone) [32].

1.3.2. Gen tổng hợp Isoflavone

Hai enzyme chìa khóa quan trọng trong con đường sinh tổng hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Isoflavone là chalcone isomerase (CHI) và isoflavone synthase (IFS) [19].

17

Chalcone isomerase (CHI) là enzyme thứ hai trong con đường sản sinh

flavonoid và xúc tác chuyển đổi 1 chalcone  1 flavanone – là nguyên liệu để

tạo ra flavonoid và isoflavonoid [12]. CHI phân lập từ thực vật không thuộc

cây họ đậu không thể sử dụng isoliquiritigenin như một chất nền vì vậy CHI

được phân thành hai loại chính là loại I và loại II [21]:

Loại I: CHI có thể xúc tác cho 6-hydrox-chalcone tạo thành (2S)–

flavonoid hoặc (2S)–5- desoxidation flavonoid. CHI đã được tìm thấy trong

hầu hết các loại thực vật cả thực vật họ đậu cũng như không thuộc họ đậu có

thể kể đến như lúa mạch, Arabidopsis và lúa [6].

Loại II: CHI chủ yếu tìm thấy trong cây họ đậu có thể xúc tác cho cả 6-

hydrox-chalcone và 6-deoxidation-chalcone vào (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5-

desoxidation flavonoid [13].

Năm 1994, Heather và Ann H đã phân lập được hai gen CHI ký hiệu là

CHI1, CHI2 với kích thước lần lượt là 666 bp và 845 bp từ cDNA của cỏ linh

lăng (Medicago sativa L.) [18].

Grotewold và Peterson đã phân lập được 1 gen CHI từ cây ngô và thấy

rằng các gen mã hóa một sản phẩm ZmCHI1 24,3 kDa tương ứng. Gen CHI1

ngô này có cấu trúc intron-exon và có bốn exon [16].

Terai và cs đã nghiên cứu phân lập được gen CHI từ cDNA của cây sắn

dây Pueraria lobata với kích thước gen là 675 bp mã hóa một polypeptide

225 amino acid, trọng lượng phân tử 23,8kDa. Gen CHI (cDNA) đã được gắn

vào vector biểu hiện pET-3d và biểu thành công trong Escherichia coli [34].

Năm 2003, Norimoto Shimada và cs đã phân lập được 3 gen: CHI1,

CHI2 và CHI3 từ cDNA của cây L. japonicus và công bố trên ngân hàng

GenBank; CHI1 với mã số AB054801, chiều dài 681pb, mã hóa cho

chuỗi polypeptide 226 amino acid (24,4 kD); CHI2 mã số AB054802,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

chiều dài 666pb, mã hóa cho chuỗi polypeptide 221 amino acid (23,9 kD)

18

và CHI3 với mã số AB073787, chiều dài 678pb, mã hóa cho 225 amino

acid (24,2 kD) [30].

Gen CHI cũng được phân lập từ mRNA lá cây nho (Vitis vinifera L.)

bởi tác giả Gutha LR và cs. Kết quả nghiên cứu phân lập được gen CHI có

chiều dài 979bp, mã hóa cho 234 amino acid [17].

Gen IFS cũng đã được Misra P. và cs phân lập từ cDNA của cây

Psoralea corylifolia, một cây dược liệu quý của Ấn Độ. Gen có chiều dài

1563bp và mã hóa cho 520 amino acid [29].

Ở cây đậu tương, gen IFS đã được phân lập 2 gen đồng phân gồm IFS1

có chiều dài 1625bp và IFS2 có chiều dài 1824bp cùng mã hóa cho một sản

phẩm có 521 amino acid [20].

1.3.3. Gen tổng hợp Isoflavone CHI ở cây xanh

Trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank), gen CHI của đậu xanh đã

được công bố tại ngân hàng GenBank - NCBI với mã số NM_001317294.1.

Thông tin về gen CHI của đậu xanh trên NCBI cho thấy gen nằm trên

NST số 8. Số lượng nucleotide của gen là 1272bp, trình tự ORF của gen là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

669bp, mã hóa cho 222 amino acid.

19

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là 02 giống đậu xanh: Giống

ĐXHL10 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương

thực và Cây thực phẩm thuộc Bộ Nông nghiệp cung cấp, và giống đậu tằm

(Đậu Mốc) thu thập tại địa phương (xã Động Lâm, huyện Hạ Hòa, tỉnh Phú

Thọ) ký hiệu là ĐXĐP.

Giống đậu xanh ĐXHL10 được chọn tạo từ tổ hợp (BPI MG 50-10A x

V87-13), theo phương pháp gia phả truyền thống. ĐXHL10 là sản phẩm của

đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu chọn tạo giống và các biện pháp canh tác đậu xanh

cho các vùng trồng chính giai đoạn 2011-2013”. Giống đậu xanh ĐXHL10 có

các đặc điểm chính: thời gian sinh trưởng: 62-65 ngày, chiều cao cây 50-

64cm, lá xanh trung bình. Ra hoa và chín tập trung, tỷ lệ thu hoạch lần 1 đạt

khoảng 75-85%. Vỏ quả khi chín màu đen, dài khoảng 10-12cm. Hạt màu

xanh sáng, cấp hạt đều, đóng hạt chặt. Trọng lượng 1000 hạt 63-68g tuỳ theo

mùa vụ, hàm lượng protein 17,9%.

a b

Hình 2.1. Hình ảnh hạt của mẫu giống đậu xanh nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

a: Hạt giống ĐXHL10; b: Hạt giống ĐXĐP

20

2.1.2. Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ

Anh, Đức, Mỹ, Thụy Điển, Trung Quốc như: CTAB, EDTA, tris, ethanol,

natri clorua, đệm PCR, Taq DNA polymerase, MgCl2, dNTPs, agarose và các

hóa chất khác được mua của hãng Invitrogen.

- Các hóa chất dùng trong phân lập gen như Taq polymerase, buffer

PCR, SDS, EDTA, Tris... của Invitrogen.

- Cặp mồi nhân gen CHI được thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự

gen CHI của giống đậu xanh được công bố tại ngân hàng GenBank - NCBI

với mã số NM_001317294.1.

Bảng 2.1. Cặp mồi nhân gen CHI

Kích thước

Nhiệt độ dự kiến từ Mồi Trình tự mồi (5’-3’) gắn mồi khuôn từ

cDNA

CHI-F ATGGCAACAAAGCACCCAC 56oC

669 bp

CHI-R TCAGAGTATA ATGCCGTCCT 56oC

- Vector tách dòng pBT của Viện Công nghệ Sinh học.

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR QIAquick Gel Extraction Kit, tinh

sạch sản phẩm PCR AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer), bộ kit tách

dòng TA Cloning Kit (Invitrogen), bộ kit tách plasmid tái tổ hợp AccuPrep

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer)...

21

- Các loại hóa chất khác: agarose, cồn tuyệt đối, sorbitol, chloroform...

của Việt Nam, Trung Quốc sản xuất.

2.1.3.Thiết bị

Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng

STT Thiết bị Nguồn gốc, xuất xứ

1 Máy PCR Applied Biosystem - Mỹ

2 Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh

3 Bể ổn nhiệt Memmert - Đức

4 Máy ly tâm Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ

5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ

6 Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức

7 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu-425-400E Nuaire - Mỹ

8 Cân điện tử Precisa XB1200C - Đức

9 Máy lọc nước deion AquaMax Ultra YoungUn - Hàn Quốc

10 Máy cất nước Cascada Bio-Water - Pall Life - Mỹ/Anh

11 Máy đo quang phổ định lượng NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ

12 Máy DNA sequencing ABI Prism 3100 - Mỹ

13 Tủ lạnh -20oC Sanyo - Nhật Bản

14 Tủ lạnh -84oC Super Freezer Eco130 - Ficchetti - Ý

15 Tủ ấm IB-15G Jeiotech - Hàn Quốc

16 Bể ổn nhiệt BW-05G Jeiotech - Hàn Quốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

22

Các thí nghiệm phân lập gen, giải trình tự nucleotide đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i

Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghê ̣ gen, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và mRNA tổng số

Ngâm ủ hạt đậu xanh cho nảy mầm rồi gieo trên cát sạch, khi cây được

5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách DNA tổng số và tách mRNA tổng số.

* Phương pháp tách DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết theo theo Gawel và cs năm 1991 có cải

tiến [15] bao gồm các bước như sau:

+ Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.

+ Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, loại

bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần.

+ Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ ở 65o C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc

đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

+ Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), trộn đều 20 phút

(dung máy trộn càng tốt)

+ Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.

+ Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5 µl bỏ tủa.

+ Thêm 500 µl Isopropanol, trộn nhẹ, đặt lên đá chờ có tủa trắng.

+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô.

+ Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần).

23

+ Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.

+ Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion.

* Phương pháp tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số được tách chiết bằng cách sử dụng TRIzol reagents

(Invitrogen). Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều được khử DEPC

0,01%. Các bước tiến hành như sau:

+ Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng.

+ Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút.

+ Bổ sung 500µl Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ

phòng 5 phút.

+ Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40oC.

+ Lấy 600µl dịch nổi sang Eppendorf mới loại 1,5ml.

+ Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút.

+ Ly tâm 8000vòng/phút trong 20 phút ở 40 oC.

+ Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.

+ Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%).

+ Ly tâm 10000vòng/phút trong 10 phút. Lăp lại 2 lần.

+ Làm khô 5 phút trong box bật quạt.

+ Pha loãng RNA trong 40µl nước khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau

đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hết.

+ Mẫu mRNA thu được bảo quản trong tủ -84 oC.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA

24

Từ RNA tổng số tinh sạch, phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA

từ mRNA theo bộ kit ReverdAid First Stand cDNA Synthesis (Thermo

Scientific). Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA thể hiện ở Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 1 Mồi OligoT

6 2 RNA tổ ng số

5 3 H2O (DEPC)

Trộn nhẹ, ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá. Tiếp theo bổ sung

thêm các thành phần sau:

4 4 5X Reaction Buffer

1 5 RiboLock Rnase Inhibitor (20 U/µl)

2 6 dNTP 10 Mm

1 7 RevertAid H Minus Transcriptase (200 U/µl)

20 Tổng thể tích

Ủ 25oC trong 5 phút, 42oC trong 60 phút, ủ 70oC trong 5 phút.

Bước cuối ủ 4oC.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.3. PCR khuếch đại gen CHI

25

Sau khi tách chiết được DNA tổng số và tổng hợp cDNA, chúng tôi thực

hiện khuếch đại gen CHI bằng phản ứng PCR với cặp mồi CHI-F và CHI-R

được thiết kế dựa trên trình tự gen CHI. Thành phần phản ứng PCR nhân gen

CHI của cây đậu xanh được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen CHI

STT Thành phần Thể tích (μl)

1 PCR Master Mix 12,5 µl

2 DNA tổng số (50ng/µl); cDNA 1 µl; 1 µl

3 Mồi CHI-F (10pM/µl) 1 µl

4 Mồi CHI-R (10pM/µl) 1 µl

5 9,5 µl H2O

25 µl Tổng

Phản ứng PCR nhân gen CHI được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen CHI

Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ

3 phút 1 94 Biến tính

30 giây 90 Biến tính

30 giây 30 56 Gắn mồi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

72 Kéo dài chuỗi 90 giây

26

Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel

agarose 1,0% và được tinh sạch. Quá trình làm sạch sản phẩm PCR phục vụ

việc tạo dòng được thực hiện với bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit:

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm và soi. Cắt lấy

băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thước yêu cầu).

- Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB =

1 : 5 (quy ước 1μl tương đương 1mg mẫu).

- Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel

tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút

trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.

Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

Bước này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.

- Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB

(Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch

chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem

27

ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã

tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC.

- Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen CHI.

2.2.4. Tách dòng gen CHI

- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp

vào vector pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau:

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen CHI vào vector pBT

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 2 H2O

2 1 Buffer T4 ligase (10X)

3 Enzyme ligation (10 unit/µl) 1

4 Vector pBT 1

5 Sản phẩm PCR tinh sạch 5

Tổng 10

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α

Sau khi thực hiện phản ứng ghép nối gen quan tâm và vector pBT, tiến

hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α. Quy trình thực hiện

như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Tế bào khả biến được lấy từ tủ -80oC và được để trong đá trong 30 phút.

28

+ Lấy 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối gen cho vào ống tế bào khả

biến (50µl), để trên đá trong 10 phút.

+ Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, sau đó để ngay vào đá

trong 10 phút.

+ Bổ sung 300µl LB lỏng để nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong

1 giờ.

+ Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin, IPTG và X-

gal (Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch

nổi giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch

khuẩn lên đĩa môi trường môi trường cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ

đĩa petri ở 37oC trong 16 giờ).

+ Chọn khuẩn lạc có màu trắng đem nuôi trong môi trường LB lỏng có

bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000LB lỏng: 1carbenicillin). Nuôi ở 37oC, lắc 200

vòng/phút, trong 16 giờ.

- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR

Lấy dịch nuôi vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng kỹ thuật

PCR với cặp mồi nhân gen CHI. Sản phẩm PCR chọn dòng được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 0,8%

- Tách plasmid tái tổ hợp

Tách chiết plasmid bằng bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen

theo quy trình sau:

+ Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại

bỏ dịch nổi, thu cặn.

+ Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.

29

+ Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong

10 phút.

+ Sau đó bổ sung 500μl dung dịch Chlorofom:Isoamyl alcohol (24:1),

đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.

+ Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở

nhiệt độ -20oC trong 20 phút.

+ Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi.

+ Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm

12000 vòng/phút trong 5 phút.

+ Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở

37oC trong 1 giờ.

Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% .

- Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: plasmid được tách chiết sau đó

được phân tích bằng enzyme giới hạnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.2.5. Phương pháp xác định trình tự nucleotide

Các mẫu plasmid mang gen quan tâm có kích thước phù hợp với lý

thuyết được sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI

PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ).

2.2.6. Phương pháp phân tích trình tự gen

Sử dụng phần mềm BLAST, BioEdit, Gendoc và ClustalW2 để phân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

tích và so sánh các trình tự gen.

30

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ DNA genome

3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Vì DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân

tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành

công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi tiến

hành tách chiết DNA của 2 giống đậu xanh nghiên cứu ở giai đoạn lá non 7

ngày tuổi theo phương pháp của Gawel và cs (1991) [15].

Trong quy trình tách chiết đã sử dụng tác nhân lý, hóa học vì thế mà ít hay

nhiều ảnh hưởng tới độ nguyên vẹn của nucleic acid. Bởi vậy chúng tôi phải kiểm

tra mức độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di trong gel agarose 0,8%, kết quả thể

hiện trong hình 3.1.

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kí hiệu: M thang DNA; giếng1: ĐXĐP; giếng 2: ĐXHL10

31

Kết quả cho thấy mẫu DNA thu được có băng sáng rõ, gọn và ít bị đứt

gãy. Tiếp theo chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng của

DNA tổng số bằng phương pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu được

thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Tỷ số A260/A280 và hàm lượng DNA tổng số

của hai giống đậu xanh nghiên cứu

Tỷ số Hàm lượng DNA

Tên giống

A260/A280 (ng/µl)

ĐXĐP 2,01 2892,7

ĐXHL10 1,67 969,3

Bảng 3.1 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,67 – 2,01

chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein có

thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CHI từ cây đậu xanh

Sử dụng DNA làm khuôn để khuếch đại trình tự gen CHI bằng phản

ứng PCR với cặp mồi CHI-F và CHI-R được thiết kế dựa trên trình tự gen

CHI đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số

NM_001317294.1 (bảng 2.1). Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR trong điều

kiện nhiệt độ gắn mồi là 56oC. Sau 30 chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen

được kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với DNA Marker và được thể hiện ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

hình 3.2.

32

1 kb

0,5 kb

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại DNA

của gen CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10

M: thang DNA 1kb; giếng 1:ĐXĐP; giếng 2:ĐXHL10

Kết quả cho thấy, ở 2 mẫu nghiên cứu xuất hiện băng DNA duy nhất

sáng rõ có kích thước khoảng 1,2 kb, lớn hơn đoạn trình tự mã hóa ORF

(bảng 2.1). Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR thành công, bướ c đầu gen CHI

có thể đã đươ ̣c tổng hợp thành công từ DNA genome củ a hai giố ng đậu xanh

ĐXĐP và ĐXHL10 .

3.1.3. Kết quả tách dòng gen CHI từ DNA genome

Để phục vụ mục đích tách dòng gen CHI, băng DNA có kích thước

khoảng 1,2 kb được cắt khỏ i bản gel tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để

quá trình biến nạp, ghép nối gen đạt hiệu quả cao nhất. Quy trình tinh sạch

sản phẩm PCR được tiến hành bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Bioneer). Sản phẩm thu được thường sạch dNTP thừa và protein. Các đoạn

33

gen được phân lập từ DNA sau khi tinh sạch xong được kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng.

Tiếp theo, sản phẩm PCR nhân gen CHI sau khi tinh sạch và kiểm tra

chất lượng được gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp bằng enzyme nối

T4 ligase. Đoạn DNA của gen quan tâm sẽ được nối vào giữa trình tự MCS

(multiple cloning site) ở trên trình tự gen mã hóa enzyme β-galactosidase

(lacZ) của vector pBT. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn E.

coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau đó, cấy trải vi khuẩn E. coli

DH5α đã biến nạp trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG ở 37oC trong 16 giờ.

Sau thời gian nuôi, các khuẩn lạc mọc được trên môi trường chứng tỏ

chúng đều mang vector pBT, bao gồm khuẩn lạc xanh và trắng. Khuẩn lạc

xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên vẫn còn khả năng sinh

tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu

thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián

đoạn gen lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là

dòng khuẩn lạc có thể mang vector tái tổ hợp. Lấy ngẫu nhiên các khuẩn lạc

màu trắng để kiểm tra bằng phản ứng PCR. Để kiểm tra các dòng khuẩn lạc

trắng có mang gen quan tâm hay không, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

với cặp mồi nhân gen CHI. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.

34

Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR plasmid

M: Marker; 1, 2, 3, 4: sản phẩm PCR từ các dòng khuẩn lạc

Kết quả hình 3.3 cho thấy giếng 1, 2, 3, 4 xuất hiện các vạch ở vị trí

khoảng 1,2 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước gen quan tâm khi

PCR. Có thể kết luận ban đầu rằng các dòng khuẩn lạc tương ứng với giếng 1,

2, 3, 4 đều mang gen quan tâm. Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản

ứng PCR được nuôi trong LB lỏng và tiến hành tách chiết plasmid để phục vụ

giải trình tự.

Trình tự nucleotide của gen CHI đã tách dòng từ DNA genome thu

được có kích thước 1110 nucleotitde. Bằng chương trình phân tích BLAST

trong NCBI so vớ i trình tự gen CHI mang mã số NM_001317294.1 trên Ngân

hàng Gen cho thấy gen CHI có 4 exon và 3 intron. Như vậy, chúng tôi đã

khuếch đại, tách dòng và giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen CHI

của 2 giống Đậu Xanh nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.2. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ cDNA

35

RNA tổng số được tách chiết và tổng hợp cDNA. Tiếp theo, cDNA

được sử dụng làm khuôn và cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen CHI

của Đậu Xanh đã công bố tại Ngân hàng Gen mang mã số NM_001317294.1

để khếch đại gen CHI từ 2 mẫu nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm

PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0% (Hình 3.4).

Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của

gen CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10

M: thang DNA 1 kb; giếng 1-ĐXĐP; giếng 2- ĐXHL10.

Kết quả nhân bản gen CHI ở hình 3.4 cho thấy băng DNA đươ ̣c khuếch

đại có kích thước khoảng 0,7 kb, đú ng như tính toán lý thuyết là kích thướ c

củ a gen CHI. Như vâ ̣y bướ c đầu gen CHI đã được nhân bản thành công từ

cDNA củ a hai giố ng Đâ ̣u Xanh ĐXĐP và ĐXHL10.

Tương tự như trường hợp khuếch đại gen CHI từ DNA genome, sản

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

phẩm PCR khuếch đại gen CHI được tinh sa ̣ch và tách dòng trong vector

36

pBT. Plasmid tái tổ hơ ̣p đã đươ ̣c cắt kiểm tra bằng că ̣p enzyme giớ i ha ̣n NcoI

và NotI (Hình 3.5).

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sả n phẩm cắt vector pBT-CHI

bằng că ̣p enzyme NcoI và NotI

M: thang DNA 1 kb; giếng 1: pBT-CHI đã cắt; giếng 2: pBT-CHI chưa cắt.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Theo lý thuyết vector pBT có kích thướ c 2705 bp, gen CHI có kích thướ c 669 bp và tổ ng số nucleotide củ a vector tái tổ hơ ̣p pBT-CHI là 3374 bp. Kết quả ở hình 3.5 cho thấ y, ở giếng 2 vector pBT-CHI chưa cắ t thu đươ ̣c băng điê ̣n di DNA có kích thướ c khoảng hơn 3,0 kb, ở giếng 1 có 2 băng điê ̣n di DNA có kích thướ c khoảng 2,7 kb và 0,7 kb. Băng DNA có kích thướ c khoảng 2,7 kb là kích thướ c củ a vector tá ch dò ng pBT, cò n băng DNA có kích thướ c khoảng 0,7 kb là kích thướ c củ a gen CHI. Như

37

vâ ̣y, kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩ m cắ t vector tái tổ hơ ̣p pBT-CHI bởi că ̣p enzyme giớ i ha ̣n NcoI và NotI đú ng như tính toán lý thuyết. Do đó có thể kết luâ ̣n rằ ng, gen CHI đã đươ ̣c nhân dò ng thành công trong vector pBT ở E.coli và plasmid tái tổ hơ ̣p pBT-CHI đươ ̣c sử du ̣ng giải trình tư ̣ nucleotide củ a gen CHI.

Kết quả giải trình tự nucleotide của gen CHI thu được có đoa ̣n mã hó a củ a gen CHI có 669 nucleotide. Bằng chương trình phân tích BLAST trong NCBI cho kết quả về đô ̣ tương đồ ng 99,85% so vớ i trình tự gen CHI mang mã số NM_001317294.1 trên ngân hàng Gen. Như vâ ̣y, kết quả phân tích trên đã khẳng đi ̣nh đoạn gen phân lâ ̣p từ mRNA củ a hai giống đậu xanh nghiên

cứu là gen CHI. Gen CHI có kích thước 669 nucleotide, mã hóa cho 222 amino acid và mã kết thúc là TAG.

3.3. Phân tích trình tự gen CHI từ các mẫu nghiên cứu

3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen CHI từ DNA genome và từ cDNA

Sau khi giải trình tự nucleotide đoạn gen CHI phân lập từ DNA

genome và từ mRNA tổng số, chúng tôi tiến hành so sánh đặc điểm cấu trúc

gen CHI được phân lập từ 2 mẫu giống Đậu Xanh nghiên cứu với nhau. Kết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

quả được thể hiện tại hình 3.6

38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6: Đặc điểm cấu trúc gen CHI từ các mẫu đậu xanh nghiên cứu

41

Hình 3.6 cho thấy đặc điểm trình tự các nucleotitde của gen CHI từ

DNA genome và cDNA của 02 giống đậu xanh nghiên cứu. Gen CHI ở đậu

xanh là gen phân đoạn có 3 đoạn intron (110-191, 352-395, 818-933), 4 đoạn

exon (1-109, 192-351, 396-817, 934-1110). Trình tự nucleotide gen CHI giữa

2 mẫu nghiên cứu tương đồng 100%. Như vậy, chúng tôi khẳng định gen CHI

ở đậu xanh có sự bảo thủ giữa 2 giống nghiên cứu.

3.3.2. Kết quả so sánh trình tự gen CHI phân lập từ mẫu đậu xanh nghiên

cứu với trình tự gen CHI đã được công bố trên Ngân hàng gen.

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự ORF của gen CHI từ 2

mẫu nghiên cứu với trình tự gen CHI đã công bố với các mã số KP164975 và

NM_001317294.1. Do đặc điểm trình tự gen CHI của 2 mẫu giống đậu xanh

nghiên cứu không có sự sai khác nên chúng tôi lựa chọn 1 trình tự gen CHI đã

phân lập từ mẫu đậu xanh nghiên cứu (kí hiệu là CHIvn) để so sánh. Kết quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

so sánh được thể hiện tại hình 3.7:

42

Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide gen CHI của đậu xanh Việt Nam

với trình tự đã công bố

Hình 3.7 cho thấy trình tự nucletide mã hó a củ a gen CHI được phân lập từ mRNA của giống đậu xanh nghiên cứu có 669 nucleotide. Bằng chương trình phân tích BLAST trong NCBI cho kết quả về đô ̣ tương đồ ng 99,85% so vớ i trình tự gen CHI mang mã số NM_001317294.1 và gen mang mã số KP164975 trên Ngân hàng Gen. Hai trình tự nucletide củ a gen mã hó a CHI được công bố trên Ngân hàng Gen không có vị trí sai khác nào, độ tương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

đồng 100%. Trong khi đó trình tự nucletide mã hó a củ a gen CHI được phân lập từ mRNA của giống Đậu Xanh nghiên cứu (CHIVn) có duy nhất 01 vị trí

43

sai khác đó là vị trí số 596. Cụ thể tại vị trí 596 trên trình tự gen CHIVn là

nucleotide loại G thì ở trên trình tự của 2 gen CHI đã được công bố

(NM_001317294.1 và KP164975) đều là nucleotitde loại A. Để kiểm tra sự

sai khác trình tự nucleotide có dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid hay

không, chúng tôi tiếp tục phân tích trình tự amino acid của CHI ở đậu xanh.

3.3.3. Phân tích trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI của mẫu đậu

xanh nghiên cứu

Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI từ hai giống đậu xanh nghiên cứu với nhau và với trình tự amino acid củ a protein CHI suy diễn từ gen mang mã số NM_00131794.1 và từ gen mang mã số KP164975 được thể hiện ở hình 3.8.

Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid từ gen CHI của đậu xanh Việt Nam

với trình tự đã công bố

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết quả so sánh hình 3.8 cho thấy trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI của các giống đậu xanh nghiên cứu có sự tương đồng 100% so với trình tự amino acid suy diễn từ gen CHI đã được công bố trên Ngân hàng Gen. Sự

44

sai khác trình tự nucleotide ở vị trí 596 trên gen CHI giữa các mẫu so sánh

không làm ảnh hưởng đến trình tự amino acid.

Để phân tích đặc điểm cấu trúc liên quan đến thực hiện chức năng của

CHI, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid của CHI với CHI ở một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

số loài thực vật. Kết quả thể hiện trên hình 3.9.

45

Hình 3.9. So sánh (alignment) trình tự amino acid của CHI

giữa các loài thực vật khác nhau.

Vradiata (CHI từ đậu xanh được xác định qua nghiên cứu này và trình

tự đã công bố mã số KP164975 và NM_00131794.1); LjCHI1, LjCHI2 và

LjCHI3 (3 loại CHI từ cây đậu hoang dã - L. japonicus,AB054801,

AB054802, AB073787), Gmax (CHI từ đậu tương - Glycine max,

AF276302), Vangularis (CHI từ đậu đỏ - Vigna angularis, AP015041);

Guralensis (CHI từ cam thảo - Glycyrrhiza uralensis, EF026980); Zmays

(CHI từ cây ngô - Zea mays, AF276302), Msativa (CHI từ cỏ linh lăng -

Medicago sativa L., KF765782); Plobata (CHI từ sắn dây - Pueraria lobata,

D63577); Vvinifera (CHI từ nho, Vitis vinifera L., NM_001281104); Phần

trình tự có nền màu đen là phần amino acid giống nhau hoàn toàn giữa các

loài. Phần trình tự có nền màu xám là phần đa số các loài (60-80%) có amino

acid giống nhau. Mũi tên màu đỏ chỉ vị trí các amino acid của CHI đóng vai

trò bám với cơ chất phản ứng; mũi tên màu xanh chỉ vị trí các amino acid

hình thành liên kết hidro tham gia phản ứng của CHI.

Trên hình 3.9. cho thấy, CHI khá bảo thủ ở thực vật chỉ ra nhiều vùng

trình tự từ 5 amino acid bảo thủ như: FLGGAG (41-46); FIKFT (56-60);

IGVYLRD (62-68); FYRDIIS (92-98); ENCVA (124-128); AVLETMIG

(199-205). Theo Hui Wang và cs [21], CHI thực hiện chức năng thông một số

amino acid đặc trưng, vùng amino acid là vị trí bám với cơ chất và vùng chứa

các amino acid tham gia vào phản ứng của enzyme. Các vị trí amino acid này

của CHI ở đậu xanh có tính bảo thủ cao so với các loài (phần mũi tên chỉ các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

vị trí amino acid thực hiện chức năng của CHI).

46

Dựa trên kết quả so sánh trình tự amino acid CHI ở các loài thực vật,

chúng tôi sử dụng phần mền ClustalW2 online để xây dựng cây phân loại của

CHI ở thực vật. Kết quả thể hiện trên hình 3.10.

Hình 3.10. Cây phân loại của CHI ở một số thực vật

Trong đó: Vradiata (CHI từ đậu xanh được xác định qua nghiên cứu

này và trình tự đã công bố mã số KP164975 và NM_00131794.1); LjCHI1,

LjCHI2 và LjCHI3 (3 loại CHI từ cây đậu hoang dã - L japonicus,AB054801,

AB054802, AB073787), Gmax (CHI từ đậu tương - Glycine max,

AF276302), Vangularis (CHI từ đậu đỏ - Vigna angularis, AP015041);

Guralensis (CHI từ cam thảo - Glycyrrhiza uralensis, EF026980); Zmays

(CHI từ cây ngô - Zea mays, AF276302), Msativa (CHI từ cỏ linh lăng -

Medicago sativa L., KF765782); Plobata (CHI từ sắn dây - Pueraria lobata,

D63577); Vvinifera (CHI từ nho, Vitis vinifera L., NM_001281104);

Trên hình 3.10 cho thấy CHI từ giố ng đâ ̣u xanh và 10 mẫu phân tích được chi làm 2 nhánh chính. Nhánh chính thứ nhất bao gồm CHI của ngô, nho và CHI2 thuộc họ đậu hoang dã trong tự nhiên. Nhánh thứ 2 bao gồm

các mẫu còn lại, CHI1, CHI2 từ đậu hoãng dã; cỏ linh lăng, sắn dây, cam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

thảo, đậu đỏ và đậu xanh. Trong đó, CHI từ đậu tương và cam thảo có hệ số

47

tương đồng di truyền cao nhất (96%). CHI từ đậu xanh có hệ số tương đồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

cao nhất với CHI từ đậu đỏ (95%).

48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1. Gen mã hó a chalcone isomerase (CHI) đã đươ ̣c phân lâ ̣p thành

công từ DNA genome và từ mARN tổng số củ a giố ng đâ ̣u xanh ĐXĐP và

ĐXHL10. Kích thước gen CHI từ genome là 1110bp với 3 intron và 4 exon.

Trình tự ORF của CHI có kích thướ c là 669 nucleotide, mã hóa cho 222 amino acid.

1.2. Hê ̣ số tương đồ ng về trình tự nucleotide củ a gen CHI ở hai giố ng đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10 là 100%. Trình tự nucleotide gen CHI từ 2 mẫu

nghiên cứu so với tự gen CHI ở đậu xanh mang mã số trình

NM_001317294.1, KP164975 trên Ngân hàng Gen là 99,85% và không thấy

có sự sai khác trình tự amino acid.

1.3. Trình tự amino acid CHI có tính bảo thủ cao ở thực vật, CHI của

đậu xanh có sự tương đồng cao nhất so với đậu đỏ (95%).

2. Đề nghị

Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen CHI nhằm tạo cây đậu xanh chuyển

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

gen có hàm lượng Isoflavone cao.

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng Đậu Xanh,

Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 3-9.

2. Đường Hồng Dật (2006), Cây Đậu Xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện

pháp tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, Nxb Lao Động - Xã Hội, tr.

5-31.

3. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây Đậu Xanh, Nxb NN.

4. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb KH &

KT Hà Nội.

5. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam", Tạp chí

Sinh học, số 2, tr. 5 - 6.

6. Chu Hoàng Mâ ̣u (2008), Phương phá p phân tích di truyền hiê ̣n đại trong

chọn giống cây trồng, Nxb Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên..

7. Nxb Nông nghiệp (2001), Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp

2000.

8. Phạm Văn Thiều (1997), Cây Đậu Xanh kỹ thuật trồng và chế biến sản

phẩm, Nxb Nông nghiệp.

9. Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam(1996), Kết quả nghiên

cứu khoa học đậu đỗ 1991 - 1995, tr. 4 - 188.

II. TIẾNG ANH

10. Accorsi Neto A., Haidar M., Simoes R., Simoes M., Soares J., Baracat E.

(2009), “Effects of isoflavones on the skin of postmenopausal women:

a pilot study”, Clinics (Sao Paulo), 64(6), pp. 505-510.

11. Anderson J.W., Johnstone B.M., Cook Newell M.E.(1995)., “Meta-

analysis of effects of soy protein intake on serum lipids in humans”,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

New England Journal of Medicine, 333, pp. 276-282.12.

50

12. Dastmalchi M., Dhaubhadel S. (2015), “Soybean chalcone isomerase:

evolution of the fold, and the differential expression and localization of

the gene family”, Planta, 241(2): 507-23.

13. Dong X., Braun E.L., and Grotewold E. (2001), “Functional conservation of

plant secondary metabolic enzymes revealed by complementation of

Arabidopsis flavonoid mutants with maize genes”. Plant Physiol, 127,

pp.46-57.

14. Eduardo F., Luis G., Gilda C., Elba L., Rodrigo M.C and Ivan P. (2013),

“Soybean - Bio-Active Compounds", Agricultural and Biological

Sciences, 25(8), pp. 521-545.

15. Gawel N. J., Jarret R. L., “A wodified CTAB DNA extraction procedure

of Musa and Ipomoea”, Plant Mol Boil Rep, 9, pp. 262 – 266, 1991.

16. Grotewold E., Peterson T., (1994), “Isolation and characterization of a

maize gene encoding chalcone flavanone isomerase”, Mol Gen Genet,

24(2), pp. 1-8.

17. Gutha L.R., Casassa L.F., Harbertson J.F., Naidu R.A. (2010), “Modulation of

flavonoid biosynthetic pathway genes and anthocyanins due to virus

infection in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves”, BMC Plant Biol,

23(10), pp. 187-196.

18. Heather I.M., and Ann M.H. (1994), “Isolation of chalcone synthase and

chalcone isomerase cDNAs from alfalfa (Medicago sativa L.): highest

transcript levels occur in young roots and root tips”, Plant Molecular

Biology, 24(1), pp. 767-777.

19. Ho S.C., Chan A.S., Ho Y.P. (2007), “Effects of soy isoflavone

supplementation on cognitive function in Chinese postmenopausal

women: a double-blind, randomized, controlled trial”, Menopause,

14(3), pp. 489-499.

20. Hui W., Tangjin H., Jianzi H., Xiang L. B., and Yizhi Z. (2013), "The

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Expression of Millettia pinnata Chalcone Isomerase in Saccharomyces

51

cerevisiae Salt-Sensitive Mutants Enhances Salt-Tolerance ", Int. J.

Mol. Sci. 2013, 14, pp.8775-8786

21. Jin A.K., Seung B.H., Woo S.J , Chang Y.Y., Kyung H.M., Jea G.G., Li

M.C. (2007), “Comparison of isoflavones composition in seed, embryo,

cotyledon and seed coat of cooked-with-rice and vegetable soybean

(Glycine max (L.)) varieties”, Food Chemistry, 102(27),pp. 738-744

22. Jung W., Yu O., Lau S.M., O'Keefe D.P., Odell J., Fader G., McGonigle B.

(2000), “Identification and expression of isoflavone synthase, the key

enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes”, Nat Biotechnol,

18(2), pp. 208-212.

23. Kim H.K., Jang Y.H., Baek J.H., Lee J.H., Park M.J., and Kim J.K (2005),

“Polymorphism and Expression of Isoflavone Synthase Genes from

Soybean Cultivars”, Mol. Cells, 19(1), pp. 67-73.

24. Kimura S. (1976), Development of malignant goiter by defatted soybean

with iodine-free diet in rats, Gann, pp.763-765

25. Kumi D.J . (1998), "Influence of genistein (4',5,7-trihydroxyisoflavone) on

the growth and proliferation of testicular cell lines", Biol. Cell, 90 (4),

pp: 349-54.

26. Leopold A.S.(1976), "Phytoestrogens: Adverse effects on reproduction in

California Quail", Science, 191, pp.98-100.

27. Linlsakova P., Riecansky I., Jagla.F. (2010), “The Physiological Actions

of Isoflavone Phytoestrogens”, Physiol. Res, 59(1), pp. 651-664.

28. Messina M.J. (2003), “Emerging evidence on the role of soy in reducing

prostate cancer risk”, Nutr Rev, 61(4), pp. 117-131.

29. Misra P., Pandey A., Tewari S.K., P Nath., Trivedi P.K. (2010),

“Characterization of isoflavone synthase gene from Psoralea corylifolia:

a medicinal plant”, Plant Cell Rep, 29(7), pp. 747-55.

30. Norimoto S., Toshio A., Shusei S., Yasukazu N., Satoshi T., and Shin-ichi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Ayabe. (2003), “A Cluster of Genes Encodes the Two Types of

52

Chalcone Isomerase Involved in the Biosynthesis of General

Flavonoids and Legume-Specific 5-Deoxy(iso)flavonoids in Lotus

japonicus”, Plant Physiol, 131(3). pp. 941-951.

31. Setchell K.D., Brown N.M., Lydeking O.E. (2002), “The clinical importance

of the metabolite equol-a clue to the effectiveness of soy and its

isoflavones”, Japanese Nutrition, 132(12), pp. 3577-3584.

32. Stephen B. (2010), “The Biochemistry, Chemistry and Physiology of

the Isoflavones in Soybeans and their Food Products”, Lymphatic

research and biology, 8(1), pp. 89-98.

33. Subramanian S., Graham M.Y., Yu O., Graham T.L. (2005), “RNA

interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in

tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to

Phytophthora sojae”, Plant Physiol, 137(4), pp. 1345-1353.

34. Terai Y., Fujii I., Byun S.H., Nakajima O., Hakamatsuka T., Ebizuka Y.,

Sankawa U. (1996), “Cloning of chalcone-flavanone isomerase cDNA

from Pueraria lobata and its overexpression in Escherichia coli”, Prot

Expr Purif, 8(1), pp. 183–190.

35. Vantyghem S.A., Wilson S.M., Postenka C.O., Al-Katib W., Tuck A.B.,

Chambers AF.(2005), “Dietary genistein reduces metastasis in a

postsurgical orthotopic breast cancer model”, Cancer Res, 65(1), pp.

3396–3403.

36. Wang L.Q. (2002), “Mammalian phytoestrogens: enterodiol and

enterolactone”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1(2),

pp. 289-309.

37. White L.R., Petrovitch H., Ross G.W.(2000), “Brain aging and midlife

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

tofu consumption”, J Am Coll Nutr, 19(2), pp. 242-255.

53

38. Wiseman H., Casey K., Clarke B.D., Bowey E. (2002), “isoflaone

aglycone and gluconjugate content of high and low soy UK foods used

in nutritional studies”, J Agric Food Chem, 50 (1), pp. 1404-1410.

39. Zhao L., Brinton R.D. (2007), “WHI and WHIMS follow-up and human

studies of soy isoflavones on cognition”, Expert Rev Neurother, 7(11),

pp. 1549-1564.

Internet

40. http://www.gos.gov.vn

41. http://faostat.fao.org

42. http://tusach.thuvienkhoahoc/wiki/Isoflavone.

43. http://www.mdidea.com.

44. http://stites.google.com.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

http://www.lrc.tnu.edu.vn

45. http://www.foodnk.com.