Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––

ĐÀO THỊ NHÂM

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN – 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––

ĐÀO THỊ NHÂM

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiê ̣n dướ i sự

hướ ng dẫn củ a PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và

chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016

Tác giả

i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Đào Thị Nhâm

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình

nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bô ̣ môn Di truyền &

Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Ban chủ nhiê ̣m K hoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi

trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, Ths. Hồ Mạnh Tường và các cán

bô ̣ Phòng DNA ứ ng du ̣ng , Phòng thí nghiệm Trọng điểm C ông nghê ̣ gen , Viê ̣n

Công nghê ̣ S inh ho ̣c , Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam đã ta ̣o điều kiê ̣n và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiê ̣m củ a đề tài luận văn .

Tôi xin cảm ơn sự động viên , khích lệ củ a gia đình và bạn bè trong suốt

thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài luận văn .

Đề tài luâ ̣n văn th uô ̣c chương trình đào ta ̣o nghiên cứ u sinh và cao ho ̣c

của Bộ môn Di t ruyền & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Khoa Sinh học, Trườ ng Đa ̣i ho ̣c Sư

phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên .

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016

Tác giả

ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Đào Thị Nhâm

MỤC LỤC

Lời cam đoan ..................................................................................................... i

Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii

Mục lục ........................................................................................................... iii

Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................... iv

Danh mục bảng ................................................................................................. v

Danh mục hình ................................................................................................ vi

MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1

Đặt vấn đề ............................................................................................. 1

Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................. 2

Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3

1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ...................................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................ 3

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn ....................................................... 4

1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn ..................................................................... 5

1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng ............................................................... 6

1.2.1. Alkaloid ................................................................................................ 6

1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn ................................................................. 10

1.2.3. Peroxidase và gen mã hóa peroxidase ................................................. 14

1.3. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và

vincristine ở cây dừa cạn ...................................................................... 17

1.3.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật ............... 17

1.3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen .......................................... 19

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22

iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ................................................................ 22

2.1.1. Vật liệu ............................................................................................... 22

2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................. 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 24

2.2.1. Thiết kế cặp mồi nhân gen .................................................................. 27

2.2.2. Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số......................................................... 28

2.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA từ mRNA............................................. 28

2.2.4. Nhân gen CrPrx bằng kĩ thuật RT-PCR .............................................. 29

2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR .......................................... 30

2.2.6. Kỹ thuật tách dòng gen ....................................................................... 31

2.2.7. Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx ..... 34 2.2.8. Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx ............................................. 34

2.2.9. Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng ......................................... 37

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 38

3.1. Kết quả phân lập và tách dòng gen CrPrx ........................................... 38

3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA ................................... 38

3.1.2. Kết quả ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng .............................. 39

3.2. Xác định trình tự gen CrPrx ................................................................ 43

3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx ...................................... 47

3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) ....................... 48

3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 ................................ 51

3.4. Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx .............. 54

iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Chữ viết tắt ABA

Abscisic acid

Axit Absisic

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

Bp CaMV 35S

base pairs Cauliflower Mosaic Virus 35S

Cặp bazơ nitơ

promoter

Cộng sự

Catharanthus roseus peroxidase

Gen mã hóa peroidase ở

CrPrx

cây dừa cạn Cây dừa cạn

C. roseus

Catharanthus roseus (L.) G. Don.

DAT

Deacetylvindoline

4-O-acetyl

Gen DAT

DNA

tranferase Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent

Xét nghiệm ELISA

Assa(cid:13)

IPTG

Isopropyl β-D-1-

Thiogalactopyranoside

Luria Bertami

Môi trường dinh dưỡng cơ

bản nuôi cấy vi khuẩn

MCS

Vùng cắt gắn đa vị

Multi Cloning Site

NptII

Neomycin phosphotransferase gene

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

Kilo base

SDS

Sodium dodecyl sulphate

RT-PCR

Reverse transcription - Polymerase

Phản ứng chuỗi polymerase

X-gal

-phiên mã ngược

V/p

Chain Reaction 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta- Dgalacto-pyranoside

Vòng/ phút

iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx....................................... 29

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx ............. 30

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT .............. 31 Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn ................................................... 32

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR ......................................................... 32

Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid............................................................ 33

Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3 ..................... 35

Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 và gen CrPrx ............................. 35

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 .............. 36

Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự gen CrPrx và LN809932 ........ 46

v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don. ............................................. 4

Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine và vincristine .............................................................. 12

Hình 1.3: Công thức hóa học của vinblastine ........................................................................ 13

Hình 1.4: Công thức hóa học của vincristine ......................................................................... 13

Hình 2.1: Vector tách dòng pBT ............................................................................................. 23

Hình 2.2: Vector pRTRA7/3 ................................................................................................... 23

Hình 2.3: Vector pBI121 ........................................................................................................ 23

Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrPrx ........... 26

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn cDNA CrPrx............ 38

Hình 3.2: Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E. coli DH5 chứa vector tái tổ hợp

mang đoạn gen CrPrx ............................................................................................. 40

Hình 3.3: Kết quả điê ̣n di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc .......................................... 41

Hình 3.4: Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng

NcoI/NotI ................................................................................................................ 43

Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid của gen CrPrx với trình tự gen mang mã số

LN809932 ............................................................................................... 45

Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx ...................................................................... 47

Hình 3.7: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng NcoI/NotI ........... 49

Hình 3.8: Kết quả PCR các dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp

pRTRA7/3-CrPrx ................................................................................................ 50

Hình 3.9: Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa

gen CrPrx ................................................................................................................. 52

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 .......................................... 53

Hình 3.11: Kết quả điện di colony-PCR của vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx ...................... 54

Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen .................... 55

vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Nước ta là một nước nhiệt đới với những điều kiện khí hậu thuận lợi, vì

vậy nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng. Cùng với nền y

học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta đã biết sử dụng các

loài cây cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh rất có hiệu quả.

Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược thì các loại dược liệu có nguồn gốc từ

thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng.

Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi

trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con người thay đổi, thực phẩm

không an toàn… Những yếu tố này tác động đến sức khỏe của con người, làm

gia tăng nguy cơ mắc bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi. Đây là

một trong các nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng. Vì

thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu,

cải tiến các biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho

người bệnh.

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những cây

có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo

các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu. Trong các indol alkaloid

có mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine, vincristine được sử

dụng nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa

cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết được 1g vinblastine cho sản xuất dược

phẩm (Noble, 1990) [21]. Các chất này không thể tổng hợp bằng con đường

hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine và

vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen là một hướng nghiên

1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới.

Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp

của catharanthine và vindoline. Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức năng

xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine.

Các nghiên cứu cho thấy, trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn

hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine

và vincristine cao nhất.

Nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn

phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Để tăng năng

suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào

các con đường tổng hợp alkaloid và thiết kế vector phục vụ chuyển gen là rất

quan trọng.

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế

vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn

(Catharanthus roseus (L.) G. Don)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập được đoạn mã hóa cDNA của gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa

hồng tím.

Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ

cây dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid ở

cây dừa cạn.

3. Nội dung nghiên cứu

Phân lập, tách dòng gen CrPrx.

Xác định trình tự gen CrPrx được nhân lên từ cặp mồi chứa điểm cắt của

enzyme giới hạn NotI/NcoI.

Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím.

2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen gắn CrPrx.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Cây dừa cạn hay còn gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, trường

xuân, hoa thuộc họ Apocynaceae, chi Catharanthus, loài Catharanthus

roseus. [4], [37].

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) có nguồn gốc ở

Madagasca (châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn

đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia…. Cây dừa cạn được người Pháp đưa vào

trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh. Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng

nóng cây dừa cạn được trồng quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được

trồng theo mùa vì không chịu được lạnh. Cây dừa cạn dễ trồng, phát triển

nhanh chịu nắng, hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc

không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các

tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta. Cây dừa cạn ra hoa quanh năm, chủ yếu là

từ tháng 5 - 9 [5].

Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh

Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các

tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà

Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa

cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ,

cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven

biển. Trước đây cây dừa cạn còn chỉ được trồng để làm cảnh, nhưng gần đây

cây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá, rễ dùng làm thuốc [5].

Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole được

3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa

màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Ocellatus” có hoa màu trắng nhụy đỏ;

(3) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng. Trong đó, hoa màu hồng

tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [37].

Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [37].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn

Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm – 60cm, phân

nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân

hình trụ có 4 khía dọc, lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang

màu hồng tím có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Cây

dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi

nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước của lá thường biến động tùy từng vùng

phân bố dài 3cm - 6cm, rộng 2cm - 3cm. Cuống lá ngắn 3 - 5mm. Gân lá hình

lông chim lồi mặt dưới, gồm 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới. Mỗi cành

thường có 8 - 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn mặt

dưới có nhiều lông. Mùa hoa và quả vào tháng 4 - 5 và tháng 9 - 10 hàng năm [5].

Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính

nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài

3 - 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần

họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …. Mặt

trên và mặt dưới của hoa màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm, miệng ống tràng có nhiều

lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay

4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

vàng nếu hoa màu hồng tím). Nhị 5, rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen

kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Hoa có mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên.

Quả gồm hai đại dài 2cm - 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi ngả hai

bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù. Trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu

nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc [4], [2].

Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ. Rễ cái đâm thẳng xuống đất

có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển

theo chiều ngang [4], [5].

1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn

Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã

chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine,

vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine,

ajmalicine… chúng được sử dụng làm nguyên liệu điều trị bệnh ung thư [5].

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng

thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm

thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da.

Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn [4]:

Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc

lấy nước, chia uống từ 2 – 3 lần mỗi ngày. Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g

nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20

phút. Uống thay nước trà mỗi ngày.

Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 – 20g thân lá dừa cạn khô sao

vàng và sắc uống từ 2 – 3 lần trong ngày.

Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g

hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ.

Rong kinh: Lấy từ 20 – 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ),

sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 – 5 ngày.

Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với

5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

chút gạo, đắp lên vết thương bỏng.

Trị bệnh bạch cầu lympho cấp: Dùng 15g dừa cạn sắc nước uống. Y học

đã chiết được vinblastine từ lá dừa cạn và dưới dạng thuốc tiêm vinblastine

sulfate để chữa bệnh này.

Cây dừa cạn chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc dùng

thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân, lá khô/ngày) sắc uống.

Điều trị zona: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh

10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g, hạ khô

thảo 16g. Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần. Thuốc đắp: lá dừa cạn

kết hợp với lá cây hòe. Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn

thương, băng lại. Tác dụng làm giảm đau nhức.

Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất

nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh. Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ

sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g,

đinh lăng 20g. Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày.

Cây dừa cạn điều trị u xơ tuyến tiền liệt: Dừa cạn 12g, huyền sâm 12g,

xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g,

đinh lăng 16g. Sắc uống ngày 1 tháng, chia ba lần.

1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng

1.2.1. Alkaloid

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ

gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao

đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức

năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng là sản phẩm các phản ứng hóa

học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ chống lại vi sinh vật và động

vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát

triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp

6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [2], [27].

Alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh

lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid

bao gồm codein, nicotine, caffeine và morphine [2], [27].

Một số loại thực vật chứa nhiều alkaloid như là cây thuốc phiện, cây cà

độc dược, cây thuốc lá và khoai tây. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, cũng có

khi chỉ tập trung trong lá. Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây

mà tạo ra các alkaloid khác nhau. Tùy theo từng loại alkaloid mà tác dụng lên

các bộ phận khác nhau như lên hệ thần kinh, hệ cơ, mạch máu và hệ hô hấp [2].

Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu,

ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái. Vì

vậy, đối với mỗi loại dược liệu cần nghiên cứu cách trồng trọt, thu hái và bảo

quản để có hàm lượng hoạt chất cao [2].

1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid

Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base,

thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài

động vật. Ngoài ra, alkaloid còn được sử dụng rộng rãi để bào chế thuốc

(cafeine, cocaine, ephedrin...) [11].

Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và

động vật nhất là đối với hệ thần kinh. Tùy vào hàm lượng alkaloid nó có thể là

chất độc gây chết người nhưng có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [12].

Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết

tinh. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng

như khoai tây, chè, cà phê. Alkaloid là hợp chất thiên nhiên rất quan trọng về

nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có

giá trị chữa bệnh cao [12].

1.2.1.2. Phân loại alkaloid

Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung

7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử.

Khi người ta chưa biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì

chúng được gộp nhóm theo tên gọi của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu

trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện

đôi khi còn được gọi là các “phenanthrene”. Hay gọi tên dựa theo nhóm

động/thực vật từ đó chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid chiết từ

cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid [12].

Các nhóm alkaloid hiện nay, gồm có nhóm pyridine (piperine, coniine,

trigonelline, arecaidine, guvacine, pilocarpine, cytisine, nicotine, spartein,

pelletierine); nhóm pyrrolidine (hygrine, cuscohygrine, nicotine) nhóm tropan

(atropine, cocaine, ecgonine, scopolamine); nhóm quinoline (quinine,

quinidine, dihydroquinine, dihydroquinidine, strychnine, brucine, veratrine,

cefradine); nhóm isoquinoline (morphine, codeine, thebaine, papaverine,

narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine); nhóm phenethylamine

(mescaline, ephedrine, dopamine, amphetamine); nhóm indole gồm các

tryptamine (DMT, N-metyltryptamine, psilocybin, serotonine), ergoline

(alcaloid từ ngũ cốc/cỏ như ergine, ergotamine, axid lysergic v.v), beta-

cacbolin (harmin, harmaline, yohimbine, reserpine, emetine) và các alkaloid từ

chi Ba gạc (Rauwolfia) (reserpine); nhóm purine bao gồm xanthine (caffeine,

theobromine, theophylline); nhóm terpenoid gồm các alkaloid aconitin, steroid

(solanine), samandarin (muscarine, choline, neurin) [12].

1.2.1.3. Tính chất của alkaloid

Phần lớn alkaloid trong tự nhiên, công thức cấu tạo có oxy thường ở

thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codeine

(C18H21NO3), strychnine (C21H22N2O2), quinine (C20H24N2O2), reserpine

(C33H40O9N2)…. Những alkaloid trong thành phần cấu tạo không có oxy

thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniine (C8H17N), nicotine (C10H14N2),

8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

sparteine (C15H26N2) [27].

Tuy nhiên, cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể

lỏng như arecoline (C8H13NO2), pilocarpidine (C10H14N2O2) và có vài chất

không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecviren (C19H16N2), conexine (C24H40N2).

Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng

có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy bởi nhiệt độ trước khi

chảy [27].

Đa số alkaloid không mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như

capsaicin, piperine… Hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một số alkaloid

có màu vàng như berberine, palmatine, chelidonine. Các alkaloid base không

tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether,

chloroform, benzen… Muối của alkaloid dễ tan trong nước, hầu như không tan

trong các dung môi hữu cơ. Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và

muối alkaloid người ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế

alkaloid. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của

nó bằng dung dịch kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, NaOH… [27].

Qua nghiên cứu định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác

nhau của cây và theo dõi sự vận chuyển của chúng, người ta nhận thấy nơi tạo

ra alkaloid không phải là nơi tích tụ nhiều alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo ra

ở rễ sau đó vận chuyển lên phần trên của cây. Sau khi thực hiện những biến đổi

thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả và hạt. Ví dụ: L-hyoscryamine trong cây

cà độc dược (Atropa belladonna) được tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên phần trên

của cây. Khi cây 1 tuổi thân cây chứa nhiều alkaloid hơn lá, khi cây 2 tuổi thân

cây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lượng alkaloid giảm xuống, hàm lượng alkaloid ở

phần ngọn đạt được mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả chín [6].

Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố

9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và bộ phận thu hái [32].

1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn

1.2.2.1. Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn

Lá và hoa cây dừa cạn có hàm lượng vindoline, catharanthine và anhydro

vinblastine cao, trong khi ở rễ lại tích lũy hàm lượng ajmalicine, vindolinine và

serpentine cao hơn ở các vị trí khác trong cây [25].

Cây ở giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì mức độ sản sinh alkaloid khác

nhau. Hàm lượng alkaloids indole mono giảm, trong khi alkaloid bisindole tăng

với lá già và khi cây ngừng phát triển [24].

Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân

0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ quả

1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ cây dừa

cạn, người ta đặc biệt chú ý 20 nhóm alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt

tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine [22].

Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013% - 0,063%, ở bộ phận trên mặt

đất 0,0015%, ở rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không

có vinblastine. Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0,0003% - 0,0015% [23].

Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7% - 1,2%

alkaloid toàn phần. Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn ở lá. Thời

gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất cao là vào

cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [20].

1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn

Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai alkaloid

vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid

này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào ngăn

cản sự tạo thành các vi ống và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Cho nên,

chúng hạn chế hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu. Vì vậy,

vinblastin và vincristin được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị

10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ung thư [5].

Nhờ thực nghiệm trên chuột, các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác

dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và phát hiện ra

chất vincaleucoblastine và 3 ankaloid khác cũng có tác dụng chống khối u là

leurosine, leurocristine và leurosidine. Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện

ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthine, vindolinine

và vincolidin [33].

Các alkaloid được chiết xuất từ dừa cạn được dùng dưới dạng muối

sulfate. Vinblastine sulfate được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư

biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin,

ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận. Hơn nữa,

vinblastine sulfate còn được dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư

vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [30].

Vincristine sulfate là một trong những thuốc chống ung thư được dùng

rộng rãi hàng đầu, đặc biệt đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để

làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Đây là lựa chọn hàng đầu để điều

trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u

Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân.

Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp, vincristine sulfate còn được dùng cho ung thư

biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu

lympho mạn tính [30].

Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh bạch

cầu tốt hơn vinblastine và vincristine nên cây dừa cạn càng trở nên có giá trị.

Tuy nhiên, để chữa được bệnh ung thư cần sử dụng vincristine, vinblastine với

hàm lượng rất cao. Nhưng dùng các thành phần này, cần có sự hướng dẫn của

bác sỹ điều trị, nếu không dễ bị ngộ độc [9].

Vinblastine được chuyển hóa chủ yếu ở gan để thành desacetyl vinblastine.

Thuốc này được thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới

11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

dạng thuốc không biến đổi [9].

1.2.2.3. Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn

Sự khác nhau của alkaloid trong cây dừa cạn phụ thuộc vào loại terpenoid

indole alkaloid (TIA). Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển

hóa riêng biệt là quá trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan và quá

trình tryptophan cho nửa chứa tryptophan. Cấu trúc phức tạp của những

alkaloid này luôn có mặt hai nguyên tử nitơ. Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn

từ tryptophan) và nguyên tử nitơ thứ hai được tạo thành từ sự tách rời của hai

carbon tại vị trí β của vòng indole. Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ

mevalonic acid và nó là một C10-geraniol (monoterpenoid). Geraniol được tạo

thành, thông qua một chuỗi chuyển hóa sẽ chuyển thành dạng loganin và sau đó

là secologanin (một monoterpenoid glucoside) [7].

Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine và vincristine

Chất trung gian hình thành các monoterpenoid indole alkaloid là 3α (S)-

12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

strictosidine. Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng kết hợp giữa trytamine và

secologanin là strictosidine synthase. Strictosidine sau đó sẽ hình thành cấu trúc

cathenamine (alkaloid loại coryanthe). Cathenamine phải trải qua một chuỗi

các phản ứng để dẫn đến sự hình thành catharanthine (alkaloid loại iboga) và

vindoline (alkaloid loại aspidosperma). Catharanthine và vindoline là các

alkaloid monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây. 3’,4’-

Anhydrovinblastine được hình thành do từ sự ghép nối của catharanthine và

vindoline, với sự xúc tác của peroxidase. Sau đó, 3’,4’- Anhydrovinblastine

được chuyển thành vinblastine cuối cùng là vincristine [6]. Vincristine cũng có

cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm

methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline [24].

Hình 1.3: Công thức hóa học của vinblastine (C48H58N4O9)

Hình 1.4: Công thức hóa học của vincristine (C46H56N4O10)

Việc nghiên cứu sáng tỏ con đường chuyển hóa tổng hợp các alkaloid

nói chung, vinblastine và vincristine nói riêng ở cây dừa cạn, cùng sự phát hiện

13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

các enzyme xúc tác cho các quá trình tổng hợp và các gen mã hóa tổng hợp các enzyme tương ứng tạo cơ sở thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo cây dừa cạn

chuyển gen có khả năng tổng hợp các alkaloid có lợi với hàm lượng cao phục

vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư có hiệu quả.

1.2.3. Peroxidase và gen mã hóa peroxidase

Quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn có sự tham gia của nhiều nhân

tố phiên mã và các gen chức năng như DAT, ORCA3, Prx… [34].

Peroxidase là loại enzyme thực vật có khả năng sử dụng H2O2 để oxy

hóa một số chất cho quá trình chuyển hóa trung gian, đặc biệt là hợp chất

phenol. Những enzyme này được định vị trên thành tế bào hoặc trong không

bào, đây là sản phẩm của quá trình chuyển hóa trung gian. Chức năng sinh hoá

của peroxidase trong cây dừa cạn đã được phát hiện bởi những nghiên cứu về

khả năng oxy hóa các hợp chất phenol sử dụng H2O2. Phân tích các hợp chất

phenol từ không bào lá người ta đã phát hiện sự có mặt của 3 axit

caffeoylquinic và 4 flavonoid trong bào quan này. Điều thú vị là peroxidase

hoạt động trong không bào chiếm tỷ lệ lên tới hơn 90% peroxidase tổng số

trong lá [10].

Gen mã hoá enzyme peroxidase đã được phân lập từ cây dừa cạn bởi

Kumar và cs (2007) có kích thước 1357 bp, vùng mã hoá gồm 993 nucleotide, từ

nucleotide số 41 đến nucleotide số 1034. Gen Prx mã hóa một sản phẩm protein

gồm 330 amino acid với 21 amino acid của peptide tín hiệu. Khối lượng phân tử

của Prx ước tính 37,43 kDa và có giá trị pI 8,68. mRNA và Prx đã được tìm thấy

trong lá của cây dừa cạn và đã được xác định bằng phương pháp Northern blot

và Western blot [16].

Để có được một cái nhìn sâu sắc về trình tự hoàn chỉnh của CrPrx, Kumar

và cs (2007) đã thực hiện phản ứng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi PFLF1 và

PFLR1, được thiết kế bám để bảo tồn vùng 5' - UTR và vùng 3' - UTR trên DNA

của cây dừa cạn. Sản phẩm khuếch đại khi nhân bản và trình tự được tìm thấy dài

1793 bp. CrPrx bao gồm bốn exon (268 bp, 189 bp, 172 bp, 405 bp, dừng lại ở

14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

UAG) và ba intron (95 bp, 435 bp, 79 bp). Intron thứ hai trong CrPrx đã được tìm

thấy có kích thước lớn nhất và lớn hơn so với các exon, sự phát hiện cấu trúc CrPrx

đã góp phần làm rõ thêm quan điểm về nguồn gốc của peroxidases ở cây dừa cạn từ

một gen tổ tiên chung với các loài khác có ba intron và bốn exon [16].

Hình 1.5: Cấu trúc intron và exon của CrPrx [14]

Phân tích Northern Blot cho thấy biểu hiện của CrPrx khác nhau trong

các cơ quan khác nhau. Trong các mô sinh dưỡng, biểu hiện nhiều nhất trong

các mô liên nút gốc, tiếp theo là rễ, lá non và lá trưởng thành. Trong các mô

sinh sản, biểu hiện nhiều nhất trong quả, tiếp theo là nụ hoa. Sự biểu hiện

CrPrx đã không được phát hiện trong lá già và hoa [16].

Maria Manuela và cs (2008) đã phân lập được gen mã hóa enzyme

anhydrovinblastine synthase từ DNA genome, gen này được xác định thuộc

peroxidase III có mặt trong lá cây dừa cạn và đặt tên CrPrx1. CrPrx1 có 1388

nucleotide, vùng mã hóa từ nucleotide số 43 đến nucleotide số 1134, trình tự

amino acid suy diễn tương ứng gồm 363 amino acid, trong đó có đoạn peptide

tín hiệu nằm ở đầu tận cùng N điều khiển sự vận chuyển loại protein này trong

tế bào [19].

Gen Arabidopsis Prx (AtPrx12) là gen có tương đồng cao nhất với

CrPrx1. Gen AtPrx12 chứa hai intron, có vùng mã hóa gần như hoàn toàn

giống với các vùng tương ứng trong CrPrx1. Thiết kế mồi ở vị trí giả định của

intron đã khuếch đại được một intron. Intron I của CrPrx1 bao gồm 828 bp,

được lắp vào vị trí 300 của cDNA, và hai bên là các dinucleotide - GT và –

15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

AG. Intron thứ hai cũng có mặt và có khả năng cùng ở trong một vị trí tương

đương với intron II của gen AtPrx12. Tuy nhiên, để khuếch đại intron II

CrPrx1 bằng các cặp mồi oligoT không thành công. Việc khuếch đại intron II

của gen CrPrx1 rất khó khăn có thể là do kích thước lớn. Bằng phương pháp

Southern blots người ta đã xác định được số lượng bản sao gen của CrPrx1 và

kích thước của intron II. Kết quả, xuất hiện một băng duy nhất, điều đó cho

thấy rằng CrPrx1 tồn tại như một gen đơn bản sao trong cây dừa cạn, kích

thước ước tính của intron II là 3,5 – 4 kb [19].

Năm 2011, Kumar và cộng sự đã tách dòng và giải trình tự của hai gen

peroxidase III là CrPrx3 và CrPrx4 từ cDNA cây dừa cạn. Chiều dài đầy đủ của

CrPrx3 phân lập từ DNA genome là 1233 bp, mã hóa chuỗi polypeptid gồm 330

amino acid, CrPrx4 phân lập từ DNA genome dài 1055 bp, có vùng mã hóa gồm

956 nucleotide và mã hóa cho 318 amino acid. Giả định mô hình cấu trúc 3-D của CrPrx3 và CrPrx4 đã phát hiện sự hiện diện của hai Ca(+2) bằng các liên kết

ion ở hai đầu, và một nhóm heme phối hợp tại vị trí trung tâm. CrPrx3 và CrPrx4

đều có một bản sao duy nhất trong cây dừa cạn. Cả hai gen trên đều có mặt trong

một loạt các mô thực vật. Định lượng CrPrx3 và CrPrx4 bằng real-time PCR đã

xác nhận được, chúng biểu hiện tối đa trong thân tiếp theo là hoa [17].

Costa và cs (2008) nghiên cứu cấu trúc của peroxidase III isoenzyme

hiện diện trong lá của cây dừa cạn và enzyme này tham gia vào quá trình sản

xuất các alkaloid có tác dụng chống ung thư [8].

Nói chung, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về Prx ở

thực vật và số ít ở động vật. Tuy nhiên, việc nghiên cứu về gen này trên cây

dừa cạn còn hạn chế.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cây dừa cạn chỉ được tập trung vào

khảo sát hàm lượng alkaloid, phương pháp nuôi cấy và phương pháp chiết rút

để thu sản phẩm alkaloid từ cây dừa cạn . Tuy nhiên , nghiên cứu sinh học phân

16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

tử các gen liên quan đến cơ chế sinh tổng hợp các alkaloid ở dừa cạn còn ít được đề câ ̣p tớ i .

1.3. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine

ở cây dừa cạn

1.3.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

cây dừa cạn bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật

Marfori và Alejar (1993) đã nghiên cứu khả năng sản xuất alkaloid của

những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống cây dừa cạn

trắng và hồng tím. Kết quả thu được tám dòng mô sẹo bằng cách sử dụng môi

trường LS bổ sung BA 3mg/l, 2,4-D 0.5mg/l và nước dừa. Sau khi các mô được

hình thành chuyển vào môi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và

được nuôi trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng

tím và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ [18].

Pietrosiuk và cs (1999) đã tạo được hai dòng mô sẹo cây dừa cạn trắng

và xanh trên môi trường Gamborg rắn bổ sung kinetin 0,1mg/l và IAA 1mg/l.

Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây cây dừa cạn. Dòng mô

sẹo trắng đã được chọn từ những mô sẹo xanh phát triển trong pha tĩnh. Trái

ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và

mềm. Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai

dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng cho thấy, các indole alkaloid tồn tại ở dạng

vết và không có dược tính [26].

Bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), nghiên cứu của Junaid

Aslam và cs (2009) cho thấy, có sự khác nhau về hàm lượng vincristine trong

các loại mô sẹo (mô sẹo phôi và không phải mô sẹo phôi) thu được từ nuôi cấy

in vitro. Hàm lượng vincristine trong các giai đoạn của sự phát triển phôi (phôi

chín, phôi nảy mầm), các bộ phận khác nhau của cây (lá, rễ…) trồng ngoài tự

nhiên cũng có sự khác nhau. Nghiên cứu đã khẳng định, hàm lượng vincristine

cao trong mô sẹo lá và phôi nảy mầm. Lá của cây nuôi cấy trong ống nghiệm

có hàm lượng hàm lượng vincristine cao hơn lá của cây nuôi trồng ngoài tự

17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

nhiên cũng ở giai đoạn tương tự [15]. Kết quả nghiên cứu này góp phần định

hướng sản xuất vincristine trong các loại mô và các giai đoạn cụ thể để đạt hiệu

quả cao.

Zhao và cs (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận được

từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole

alkaloid ở huyền phù tế bào cây dừa cạn. Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được

catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25mg/l, 32mg/l và 22mg/l trong bình

lắc 500ml, 1000ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít. Tác giả cũng đã quan sát

thấy, có sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng

lại, ví dụ như: sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy cây dừa cạn

và điều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con đường

jasmonate [36].

Tarek Kapiel (2010) đã nghiên cứu các điều kiện để tối ưu hóa khả năng

tổng hợp alkaloid trong tế bào cây dừa cạn nuôi cấy dịch huyền phù bằng cách

bổ sung một số yếu tố kích thích vào môi trường MS. Môi trường cho sự sinh

trưởng tối ưu của mô sẹo nhận được từ trụ dưới lá mầm và lá mầm là môi

trường MS bổ sung 2,4D và BA đều với nồng độ 1mg/l (môi trường MS4).

Trong khi đó môi trường tối ưu cho mô sẹo nhận được từ lá là MS, bổ sung

NAA và BA cùng với nồng độ 1mg/l (môi trường MS6) [31]. Pan và cs (2010)

trong nghiên cứu của mình cũng đã khẳng định, chất điều hòa sinh trưởng có

ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp vinblastine, vindoline và catharanthine của

cây dừa cạn nuôi cấy [23].

Cùng hướng nghiên cứu trên, Jinwei Liu và cs (2013) nghiên cứu bổ

sung artemisinic acid vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào cây dừa cạn và

đã nhận thấy, sự tăng cường khả năng sản sinh terpenoid indole alkaloids ở tế

bào nuôi cấy. Hàm lượng của vindoline và vinblastine thu được từ môi trường

nuôi cấy có xử lý với artemisinic acid tăng sáu lần và gấp đôi tương ứng so với

hàm lượng của 2 alkaloids này trong nhóm đối chứng. Nhóm tác giả đã nghiên

18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

cứu sự biểu hiện gen của 4 enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

vinblastine trong môi trường nuôi cấy huyền phù cây dừa cạn. Bằng phương

pháp RT-PCR cho thấy, artemisinic acid có thể điều chỉnh lên phiên mã của các

gen tổng hợp decarboxylase tryptophan, geraniol 10-hydroxylase, tabersonine

16-hydroxylase và deacetoxyvindoline 4-hydroxylase [14].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào năm

2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng. Nghiên cứu của các

tác giả cho thấy, mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá dừa cạn nuôi cấy in vitro

trong môi trường MS lỏng, bổ sung NAA1mg/l + kinetin 0,5mg/l cho sinh khối

và hàm lượng alkaloid cao nhất. Hàm lượng đường sucrose 60g/l cho kết quả

nuôi cấy tốt nhất. Kết hợp giữa NAA 1mg/l + kinetin 0,5mg/l + sucrose 60g/l

đã thu nhận được hàm lượng vincristine từ mô nuôi cấy cao hơn lá cây dừa cạn

ngoài tự nhiên [3]. Bằng phương pháp sắc khí lỏng cao áp – khối nhỏ liên hợp

(LC-MS), Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011) đã xác định được 2 alkaloid

quan trọng là vinblastine và vincristine từ rễ cây dừa cạn hoa hồng đạt 65,84%

so với hàm lượng alkaloid tổng số [1].

1.3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

cây dừa cạn bằng phƣơng pháp chuyển gen

Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình thành do sự xâm nhiễm của vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật tổn thương từ lâu đã được

ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng

của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi

thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật. Nguyên nhân của sự phát triển rễ tơ

đã được xác định liên quan đến vùng TL-DNA nằm trên plasmid Ri của các

chủng Agrobacterium rhizogenes, trong đó giữ vai trò quan trọng là 4 locus gen

rolA, rolB, rolC và rolD. Các nghiên cứu về hàm lượng alkaloid, vincristine và

vinblastine ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ. Vì vậy,

19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập.

Javier và cs (1998) thu được các dòng rễ cây dừa cạn chuyển gen phát

triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5

1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng indole alkaloid

trong rễ nuôi cấy đã được xác định. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng rễ dừa

cạn chuyển gen được phân tích đều có mặt của vindoline và catharanthine, hai

tiền chất tổng hợp vinblastine và vincristine. Trong điều kiện nuôi cấy của thí

nghiệm, rễ với hình thái mỏng cho lượng sản phẩm gen rolC cao nhất. Như

vậy, các rễ nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng thấp thì có khả năng sản xuất

alkaloid cao. Ngược lại, những rễ mập là những rễ có khả năng tăng trưởng

nhanh hơn thì lại cho hàm lượng alkaloid thấp hơn [13].

Wang và cs (2012) đã phát triển phương pháp chuyển gen ở cây dừa cạn

bằng cách sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng EHA được biến nạp

vector nhị thể pCAMBIA2301 chứa gen β-glucuronidase (GUS) và gen

neomycin phosphotransferase II (NTPII). Lây nhiễm A.tumefaciens chủng EHA

tái tổ hợp nói trên vào mô sẹo, chồi và rễ, sau đó chuyển các mẫu lên môi

trường nuôi cấy bổ sung kanamycin, các tác giả đã thu được các dòng cây tái

sinh. Biểu hiện của gen GUS được xác định thông qua biểu hiện kiểu hình của

mô nuôi cấy trên môi trường bổ sung X-gal. Sự có mặt của gen GUS được xác

định bằng phản ứng dây chuyền polymerase và phân tích southern blot. Để

chứng minh hiệu quả của kĩ thuật chuyển gen thông qua gen chỉ thị GUS vào

cây dừa cạn, gen DAT mã hóa deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase đã được

chuyển vào cây dừa cạn và thu được 16 cây To chuyển gen thành công, hiệu

suất chuyển gen là 11%. Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy, có sự tăng

hàm lượng của vindoline trong cây chuyển gen. Đây là báo cáo đầu tiên tính

đến thời điểm công bố chuyển gen qua A. tumefaciens ở cây dừa cạn. Quan

trọng hơn, việc chuyển thành công gen DAT vào cây dừa cạn sử đã khẳng định

kĩ thuật chuyển gen cây dừa cạn được phát triển hoàn thiện, nâng cao tích lũy

20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

vindoline trong cây chuyển gen [35].

Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ

công bố thành công ở mức độ mô nuôi cấy và cây trong phòng thí nghiệm.

Song các kết quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên

cứu tạo cây dừa cạn chuyển gen nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và

21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

vincristine phục vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư hiệu quả.

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu

Hạt của cây dừa cạn hoa hồng tím do Phòng Công nghệ tế bào thực vật,

Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên cung cấp.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1. Hóa chất

Sử dụng các hoá chất: EDTA, SDS, tris - HCl, X-gal, agar, cồn tuyệt

đối, Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton,

glycerol, ethanol 70%, nước k hử io n. Các loại kháng sinh kanamycin,

rifamicine, carbecillin và các hóa chất thông dụng khác (X-gal, agarose,...).

Bộ Kit dùng cho phản ứng PCR, bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR

Accuprep PCR Purification (Bioneer - Hàn Quốc), bộ Kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen), bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “AccuprepTM Plasmid Mini

Extraction Kit”, Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer cung cấp.

2.1.2.2. Thiết bị

Cân điện tử Santorius ( Đức), tủ lạnh sâu, box cấy, nồi khử trùng Tomy

(Nhật Bản), bộ điện di DNA của Bio - Rad

Máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy

Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy PCR System 9700

(Appied Biosystem, Mỹ) và một số thiết bị khác tại Phòng công nghệ DNA

ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học

2.1.2.3. Chủng vi khuẩn và nguyên liệu DNA

Vector pTRA7/3, vector pBI121, vector tách dòng pBT, các chủng

khuẩn E. coliDH5α và A. tumefaciens EHA1 0 5 mang gen GUS do Phòng

22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học - cung cấp.

Hình 2.1: Vector tách dòng pBT

Hình 2.2: Vector pRTRA7/3

23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Hình 2.3: Vector pBI121

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrPrx

(A) Phân lập gen CrPrx từ mRNA và tách dòng gen CrPrx trong vector

tách dòng pBT; (B) Cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx, thu nhận gen CrPrx; (C)

Cắt mở vòng vector pRTRA7/3; (D) Gắn gen CrPrx vào vector pRTRA7/3 tạo

vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx; (E) Cắt mở vòng vector tái tổ hợp

pRTRA7/3-CrPrx, thu nhận cấu trúc gen CrPrx-Cmyc và mở vòng vector

pBI121; (F) Ghép nối cấu trúc CrPrx-Cmyc vào vector pBI121 tạo vector

chuyển gen chứa cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc; (G) Biến nạp pBI121-CrPrx vào

A.tumefaciens EHA1 0 5 và c họ n dò n g A.tumefaciens EHA1 0 5 tá i tổ

hợp ma n g cấ u trúc 35S-CrPrx-Cmyc bằng colony-PCR.

Các phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.1. Thiết kế cặp mồi nhân gen

Cặp mồi được thiết kế với mục đích nhân gen CrPrx. Các bước thao tác:

i) thu thập trình tự nucleotide từ ngân hàng gen NCBI; ii) thiết kế cặp mồi;

iii) Kiểm tra chất lượng cặp mồi bằng phản ứng PCR.

Dựa trên trình tự Prx đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã

số LN809932. Chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi nhân gen CrPrx trong cây

dừa cạn hoa hồng tím, trên cặp mồi có gắn điểm cắt của enzyme giới hạn.

Cặp mồi đặc hiệu nhân gen CrPrx có điểm cắt của enzyme giới hạn

NcoI/NotI có trình tự là:

Prx-NcoI: 5’ – CATGCCATGGTAGGCTTCCAAAACTCTCTTCT – 3’

Prx-NotI: 5’ – ATTTGCGGCCATGTAACTTATTAGCTACATTA – 3’

Trong đó: CCATGG là vị trí cắt của enzyme NcoI

GCGGCC là vị trí cắt của enzyme NotI

Đoạn gen CrPrx được nhân lên bằng cặp mồi có chứa enzyme giới hạn

có kích thước dự tính 1 kb, tương ứng với kích thước gen đã công bố tại Ngân

27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

hàng Gen quốc tế mang mã số LN809932.

2.2.2. Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số

Chuẩn bị mẫu: (1) Thu mẫu và xử lí mẫu: Quả sau khi thu về được phơi

khô 2 – 3 ngày, sau đó tách ra lấy hạt. Cho hạt vào ống falcon 50ml lắc nhiều

lần để rửa sạch hạt trước khi tiến hành vào mẫu. (2) Khử trùng hạt: Hạt dừa cạn

được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, javen 60% lắc đều trong 15 phút,

sau đó rửa sạch bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Sau khi khử trùng được

cấy vào môi trường MS cơ bản, bổ sung thêm sucrose 30g/l và agar 8g/l. Sau

khi hạt nảy mầm được 2 đến 3 lá trên cây mang đi tách chiết RNA tổng số.

Tách RNA tổng số được thực hiện theo theo các bước như sau:

Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng thành bột mịn.

Thêm 1ml Trizol Regents, đảo nhẹ 5 phút.

Bổ sung 200µl cloroform : isoamyl (24:1), đảo đều 5 phút.

Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu 500µl dịch nổi cho vào ống

eppendort 1,5ml.

Bổ sung 500µl isopropanol để ở 4oC vào ống, đảo đều 15 phút ở 25oC, để ở tủ -20oC trong vòng 30 phút. Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 4oC, thu

tủa, làm khô tủa.

Thêm 500µl cồn 70% (cồn pha trong DEPC), ly tâm 7000 vòng/phút

trong 5 phút, thu tủa. Bước này lặp lại hai lần.

Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendort trong box vô trùng. Bổ sung

50µl H2O, ủ ở nhiệt độ 55oC trong 15 phút cho tan RNA.

Bảo quản trong tủ -20oC

2.2.3. Phƣơng pháp tổng hợp cDNA từ mRNA

Phương pháp tổng hợp cDNA: Làm tan, li tâm nhanh các thành phần của

28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

kit, giữ trên đá.

Cho vào ống vô trùng có thể tích 0,5ml các thành phần sau:

5μl H2O (DEPC)

Mồi oligoT (15μg/μl) 1 μl

RNA khuôn (100ng/μl) 6 μl

Đảo nhẹ, ủ 65oC trong 5 phút sau đó lấy ra chuyển ngay vào đá lạnh

trong 5 phút.

Bổ sung vào ống thêm các thành phần sau:

5X Reaction Buffer (5X) 4 μl

Ribolock Rnase Inhibitor (40u/μl) 1 μl

dNTPs (10mM) 2 μl

RrevertAid H Minus Transcriptase (200u/μl) 1 μl

Tiến hành li tâm nhanh, chuyển mẫu sang ủ trong máy PCR theo chu trình nhiệt: 25oC trong 5 phút; 42oC trong 60 phút; kết thúc phản ứng ở 70oC

trong 5 phút.

2.2.4. Nhân gen CrPrx bằng kĩ thuật RT-PCR

Phản ứng RT- PCR được tiến hành với thành phần phản ứng đươ ̣c trình

bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx

Thể tích (l) STT Thành phần Nồng độ

1 PCR Masster Mix 2X 12,5

10 pmol/l 2 CrPrx-NcoI 1,0

10 pmol/l 3 CrPrx-NotI 1,0

200 ng/ l 4 cDNA 2,0

5 Nước khử ion - 8,5

Tổng thể tích 25,0

Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng nhân gen CrPrx đươ ̣c trình bày

29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ở bảng 2.2:

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx Nhiệt độ (oC) Thời gian Phản ứng Chu kỳ Bƣớc

1 Biến tính khởi động 94 4 phút 1

2 Biến tính 94 30 giây

3 Gắn mồi 58 30 giây 30

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Kiểm tra sản phẩm cDNA trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm

gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

2.2.5. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Sau khi nhân được gen CrPrx với số lượng lớn, bước tiếp theo cần thu

nhận gen ở dạng tinh sạch.

Đây là phương pháp thu đoạn DNA tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng

cột có chứa hạt sepharose để giữ các phân tử DNA sợi kép đã được gắn với các

hạt ion trong đệm gắn. “GeneJET Gel extraction Kit” của hãng Thermo scientific

là bộ kít tinh sạch DNA được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm sinh học

phân tử. Bộ kít gồm các thành phần chính là đệm gắn DNA (binding buffer), cột

thu nhận DNA, đệm rửa (wash buffer). Khi hỗn hợp DNA đi qua cột, các phân

tử DNA sẽ gắn vào mạng lưới còn các thành phần khác như protein, muối…sẽ bị

rửa trôi. Sau đó, để tách DNA ra khỏi cột người ta sử dụng một loại đệm có độ

ion hóa thấp, đó là đệm thôi mẫu (elution buffer).

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification

của hãng Thermo Scientific gồm các bước sau:

Bổ sung Buding Buffer vào sản phẩm PCR tỉ lệ 1 : 1. Chuyển sang cột lọc li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.

Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại

30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

bỏ dịch.

Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang ống

eppendort 1,5ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn.

Bổ sung 35µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1

phút, thu dịch đáy.

Bảo quản ở - 20oC.

2.2.6. Kỹ thuật tách dòng gen

Tách dòng phân tử được thực hiện theo Sambrook và cộng sự (2001) [29].

Sản phẩm RT- PCR nhân gen CrPrx sau khi được làm sạch được gắn trực tiếp vào vector pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Thành phần của phản ứng

gắn gen vào vector tách dòng pBT đươ ̣c trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT

Thể tích (l) STT Thành phần Nồng độ

1 T4 DNA ligase buffer 10X 1,0

5 u/l 2 T4 DNA ligase 1,0

200 ng/l 3 CrPrx 5,0

100 ng/l 4 pBT 1,0

5 Nước khử ion - 2,0

Tổng thể tích 10,0

Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ là 22oC trong 3 giờ sau đó để trong tủ

4oC trong 15 - 20 phút. Biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.

Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α

Tế bào khả biến được lấy từ tủ -800C chuyển sang môi trường -40C. Sau

30 phút biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.

Bổ sung 10µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến E.coli DH5α

và trộn nhẹ. Hỗn hợp được để trong bình đá 10 phút, sau đó ủ ở 420C (trong 1

phút 30 giây), rồi chuyển nhanh vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 300µl LB

31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

lỏng (trypton, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ.

Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn

Môi trường Thành phần

LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast Extract 5g/l, pH = 7

LB đặc LB lỏng + agar 16g/l

Cấy trải

Sử dụng que cấy đã khử trùng cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn trên môi

trường LB đặc (Tripton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung kháng sinh

carbenicilin (50mg/l), IPTG (0,1mM) và X-gal (40mg/l). Nuôi qua đêm ở 37oC

trong 16 giờ.

Chọn dòng và kiểm tra sản phẩm chọn dòng

Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng dùng tăm tre khử trùng chấm

những khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ hợp chứa gen CrPrx, hoà

ngay vào 10µl nước khử ion, dung dịch này dùng làm DNA khuôn cho phản

ứng colony - PCR. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng kĩ thuật colony-PCR với

cặp mồi đặc hiệu CrPrx-NcoI/CrPrx-NotI. Thành phần phản ứng colony - PCR

đươ ̣c thể hiê ̣n ở bảng 2.5.

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR

Thể tích (l) STT Thành phần Nồng độ

1 PCR Masster Mix 2X 7,5

10 pmol/l 2 CrPrx-NcoI 0,5

10 pmol/l 3 CrPrx-NotI 0,5

200 ng/l 4 DNA plasmid 0,5

5 Nước khử ion - 6,0

32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Tổng thể tích 15,0

Chu trình nhiệt được đặt như sau: Biến tính khởi động ở 94oC trong 4

phút; (biến tính ở 940C trong 30 giây; gắn mồi ở 58oC trong 30 giây; tổng hợp

kéo dài ở 72oC trong 30 giây) x 35 chu kỳ; ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở

72oC trong 10 phút; bảo quản mẫu ở 4oC.

Kiểm tra sản phẩm cDNA trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm

gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng

Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung

carbenicilin 50mg/l) nuôi ở 37oC trong khoảng 16 giờ.

Tách chiết plasmid

Tách chiết plasmid theo Sambrook và cs (2001) [28], tinh sạch bằng

Plasmid Miniprep Kit (Qiagen).

Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid

Ký hiệu Thành phần

Sol I Glucose 50mM; Tris HCl 25mM, pH= 8; ETDA 10mM, pH= 8

Sol II NaOH 0,2M; SDS 1%

Sol III 60ml CH3COOK 5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O

Các bước tiến hành:

Cấy chuyển một khuẩn lạc vào trong 5ml LB lỏng, nuôi qua đêm ở 37oC

(16 giờ), 200v/p.

Hút 2ml dịch môi trường nuôi cấy vào ống Eppendorf 2ml. Ly tâm

7000v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi thu cặn tế bào.

Hoà tủa tế bào bằng 100µl dung dịch Sol I bằng cách vortex. Sol I có tác

dụng ổn định tế bào, hòa tan cặn.

Bổ sung 200µl dung dịch Sol II, đảo nhanh và nhẹ để tránh đứt gãy DNA.

Sol II có SDS nên có tác dụng phá vỡ tế bào giải phóng DNA genome và

33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

DNA plasmid.

Bổ sung tiếp 150µl dung dịch Sol III để kết tủa protein, đảo nhanh và

nhẹ, trong dung dịch sẽ thấy xuất hiện kết tủa trắng. Đây là bước trung hoà,

toàn bộ protein và DNA genome (vì có kích thước lớn) sẽ bị kết tủa còn DNA

plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên vẫn hoà tan trong dung dịch.

Thêm vào ống 450µl cloroform : isoamyl (24:1), lắc nhẹ, mục đích để

hoà tan các protein có kích thước nhỏ. Ly tâm ở 12000v/p trong 15 phút, mẫu

phân thành 3 pha: pha trên là DNA plasmid, pha giữa là protein kích thước

lớn không tan (kết tủa trắng), pha cuối là chlorofom chứa protein tạp.

Dùng pipet hút dịch trong ở pha trên chuyển sang ống eppendorf

1,5ml mới. Sau đó bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 (isopropanol sẽ làm kết tủa DNA plasmid). Để ở -20oC trong 30 phút. Sau đó ly tâm 12000v/p trong 10 phút,

bỏ dịch.

Rửa tủa bằng 500µl cồn ethanol 70%. Ly tâm 12000v/p trong 5 phút,

thu tủa. Tủa được làm khô trong box cấy vô trùng. Sau đó thêm 45µl H2O. Ủ

hỗn hợp ở 37°C trong 15 phút để làm tan tủa.

Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X,

nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

2.2.7. Phƣơng pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx Các plasmid tái tổ hợp mang gen CrPrx được xác định trình tự trên trên

thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic

Analyzer. Các trình tự được xử lý bằng các phần mềm BLAST/NCBI, DNAstar

và BioEdit. So sánh trình tự gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn của Việt Nam

và trên thế giới đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.

2.2.8. Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx

Vector chuyển gen CrPrx được thực hiện gồm các bước cơ bản: (1) phát

triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrPrx; (2) gắn cấu trúc gen CrPrx vào

34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

vector chuyển gen ở thực vật pBI121.

Phát triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrPrx bao gồm cắt đồng thời

vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3 bằng enzyme giới hạn NcoI/NotI.

Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)

1 Tango Buffer 10X 6

2 NcoI 10 u/μl 2

3 NotI 10 u/μl 2,5

4 Plasmid pBT 200 ng/μl 13

5 Nước khử ion - 6,5

Tổng 30

Điều kiện phản ứng 37oC trong 5 giờ

Lấy mẫu cất vào tủ 4oC để dừng phản ứng trong 10 phút. Tiếp theo điện di

và thôi gel dựa vào kích thước của gen và vector sau đó tinh sạch và kiểm tra.

Ghép nối gen CrPrx vào vector pRTRA7/3 gồm các thành phần như sau:

Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 và gen CrPrx

STT Thành phần Nồng độ Thể tích(l)

1 Nước khử ion - 7

2 T4 ligase Buffer 10X 2

3 T4 ligase 5 u/μl 1

4 Gen CrPrx 100 ng/μl 5

5 pRTRA7/3 200 ng/μl 5

Tổng 20

Điều kiện phản ứng: 22oC trong 3 giờ

Vector tái tổ hợp pRTRA7/3 mang gen chuyển CrPrx được biến nạp vào

35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

E.coli DH5α với mục đích nhân dòng pRTRA7/3-CrPrx.

Gắn cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen ở thực vật pBI121

Dựa vào vị trí các điểm cắt trên vector tái tổ hợp chúng tôi cắt đồng thời

pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 bằng HindIII.

Dựa vào kích thước các phân đoạn DNA, lựa chọn và tinh sạch các băng

điện di theo chỉ dẫn của kít GeneJET PCR Purification để thu nhận các

thành phần cần cho phát triển vector.

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx và pBI121

STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l)

1 - 10 H2O

2 R Buffer 10X 3

3 HindIII 5 u/μl 2

4 Plasmid 200 ng/μl 15

30 Tổng

Điều kiện phản ứng: 37oC trong 5 giờ

Ghép nối cấu trúc gen CrPrx và pBI121 đã mở vòng mục đích tạo vector

chuyển gen ở thực vật pBI121 mang cấu trúc gen CrPrx. Vector chuyển gen

pBI121-CrPrx được biến nạp vào E.coli DH5α nhằm nhân được dòng mang

cấu trúc này. Chọn lọc dòng khuẩn bằng phương pháp colony - PCR.

Biến nạp cấu trúc mang gen CrPrx vào A. tumerfaciens

Biến nạp các vector tái tổ hơ ̣p vào tế bào A. tumefaciens bằng phương

pháp xung điê ̣n :

Rửa cuvette xung điện bằng cồn 100oC, rửa lại bằng nước khử ion rồi

thấm khô, khử trùng bằng tia UV.

Tế bào khả biến A. tumefaciens chủng EHA105 lấy từ tủ -84oC đặt vào

36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

trong đá 30 phút, bổ sung 1μl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và đảo nhẹ.

Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vector tái tổ hợp vào

cuvette.

Xung điện: 2,5kv, 25µF và điện trở 400, đặt vào đá. Sau 5 phút bổ sung

500μl LB lỏng và trộn nhẹ.

Sau đó, chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vector tái tổ hợp vừa được xung điện từ cuvette vào ống eppendorft 2ml, ủ ở 280c trong 2 giờ

trong tủ lắc.

Sử dụng que cấy trải đã khử trùng cấy trải 300µl vào các đĩa chọn lọc chứa

kháng sinh kanamycine 50mg/l và rifamycin 50mg/l. Ủ ở 280c từ 24 - 48 giờ.

Kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu.

2.2.9. Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng

37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Phân tích trình tự bằng các phần mềm chuyên dụng DNAstar và BioEdit .

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập và tách dòng gen CrPrx

3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA

Dựa trên trình tự Prx đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã

số LN809932, cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI có điểm cắt của enzyme

giới hạn được thiết kế để nhân gen CrPrx. Đoạn gen CrPrx nhân bằng cặp

mồi đặc hiệu có kích thước dự tính 1 kb.

RNA tổng số đươ ̣c tách chiết từ mẫu lá của cây dừa cạn được sử dụng

làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA với cặp mồi oligoT

(Random Hexamer Primer). Sản phẩm thu được dùng làm nguyên liệu cho

phản ứng RT- PCR.

Phản ứng PCR nhân đoạn mã hóa của gen CrPrx bằng cặp mồi đặc hiệu

CrPrx-NcoI/CrPrx-NotI. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra cùng marker

1 kb trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn

cDNA CrPrx

M: Thang DNA 1kb chuẩn

38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

1 - 3: Sản phẩm PCR gen CrPrx

Để tách dòng được gen này, chúng tôi tiến hành ghép nối sản phẩm PCR

tinh sạch vào vector tách dòng pBT đã cắt mở vòng. Sau đó, biến nạp vào

chủng E. coli DH5α.

3.1.2. Kết quả ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng

Quá trình ghép nối vector pBT và CrPrx được thực hiện dưới sự xúc

tác của của T4 ligase và dung dịch đệm tương ứng. T4 ligase có nguồn gốc

từ tế bào E. coli nhiễm phage T4, có khả năng ghép nối hai trình tự DNA đầu

so le và đặc biệt là hai trình tự đầu bằng. Enzyme này được sử dụng phổ biến

trong thí nghiệm dùng để ghép nối do có khả năng hình thành liên kết

phosphodiester giữa các nucleotide đứng cạnh nhau. Phản ứng ghép nối

được thực hiện ở 22°C trong 3 giờ để tổ hợp pBT- CrPrx được tạo thành với

hiệu suất cao nhất.

Ghép nối gen CrPrx vào pBT có thể xảy ra các trường hợp: (1) gen

CrPrx tự gắn lại với nhau; (2) vector tự đóng vòng; (3) gen CrPrx gắn với

vector pBT. Trong đó, phần lớn là trường hợp sản phẩm PCR gắn với vector

vì trong kỹ thuật PCR để nhân gen, chúng tôi đã sử dụng Taq – polymerase

với hoạt tính gắn thêm Adenine vào đầu 3’của sản phẩm PCR, mặt khác trên

vector pBT đã sẵn có hai đầu dính là Thymine ở đầu 5’ của mỗi sợi. Vì vậy,

khi được lai ghép với nhau, sản phẩm PCR có đầu dính Adenine dễ dàng nối

với vector có đầu dính Thymine theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên, trên

thực tế vẫn có một tỷ lệ nhất định vector tự đóng vòng do đứt gãy đầu

Thymine trong quá trình thao tác và một số gen tự lai ghép với nhau.

3.1.2.1. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coliDH5α

Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR đã

tinh sạch vào vector tách dòng pBT.

Vector tái tổ hợp pBT-CrPrx được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến

39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Tế bào E. coli DH5α dưới tác dụng

của CaCl2 thành tế bào vi khuẩn đang ở thời kỳ sinh trưởng sẽ trở lên mỏng đi,

xốp hơn và phồng lên tạo điều kiện thuận lợi cho DNA có thể chui qua các lỗ

màng tế bào vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.

Sau khi sốc nhiệt, bổ sung LB lỏng và nuôi lắc ở 37oC trong 1 giờ. Sản

phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh

chọn lọc carbenicillin, X-gal và IPTG. Cơ chất X-gal giúp cho việc chọn lọc

các dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng hơn. Trên môi trường có

kháng sinh chọn lọc carbenicillin, X-gal và IPTG phát triển hai loại khuẩn lạc

là khuẩn lạc màu xanh và màu trắng.

Hình 3.2: Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E. coli DH5 chứa vector tái tổ

hợp mang đoạn gen CrPrx

Kết quả trải đĩa ở hình 3.2 cho thấy, có rất nhiều khuẩn lạc mọc trên bề

mặt thạch. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có kích thước tương đối đồng đều.

Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid

chứa gen kháng sinh chọn lọc carbenicillin. Nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng

mới mang plasmid tái tổ hợp. Vì vậy, các khuẩn lạc màu trắng được lựa chọn

để thực hiện các bước tiếp theo của quá trình tách dòng. Nhưng ở hình 3.2, chỉ

có khuẩn lạc trắng điều đó nói lên rằng, quá trình biến nạp rất thành công. Tất

40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

cả, các khuẩn lạc có thể đều mang plasmid tái tổ hợp.

3.1.2.2. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng colony-PCR

Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa gen

CrPrx quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc khuẩn lạc bằng kĩ thuật colony-

PCR. Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng ở đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến

E.coli chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen CrPrx. kiểm tra khuẩn lạc bằng

phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Prx-NotI/Prx-NcoI. Sản phẩm

colony-PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm

TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn

cực tím. Nếu khuẩn có plasmid mang gen CrPrx thì sản phẩm PCR sẽ xuất hiện

băng có kích thước mong muốn khoảng gần 1 kb.

Hình 3.3: Kết quả điê ̣n di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc

M: Thang DNA 1kb chuẩn

1 - 6: Các dòng khuẩn lạc

Hình ảnh điện di ở hình 3.3 cho thấy, trong 6 dòng khuẩn lạc trắng kiểm

tra có 4 dòng cho kết quả dương tính với PCR, ngoại trừ dòng thứ 2 và 5 cho kết quả âm tính. Từ kết quả colony- PCR, chúng tôi lựa cho ̣n 4 dòng khuẩn lạc (1, 3, 4, 6) đem nuôi trong 5ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin ở 37oC trong 16

41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

giờ. Dùng tách plasmid phu ̣c vu ̣ cho việc xác định trình tự gen.

3.1.2.3. Kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa CrPrx trong vector tách dòng pBT

bằng enzyme cắt giới hạn

Để kết luận chính xác plasmid có chứa gen mã hóa CrPrx hay không,

chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên một dòng DNA plasmid, dùng để cắt bằng

enzyme cắt giới hạn. Vector pBT có thể cắt bằng các cặp enzyme khác nhau.

Nhưng do gen CrPrx sử dụng cặp mồi có điểm cắt của enzyme giới hạn

NcoI/NotI, nên vector pBT-CrPrx cần phải cắt bằng enzyme NcoI/NotI để gen

không bị cắt thành nhiều đoạn. Ngoài ra, tạo đầu nối giữa 2 DNA khi ghép nối

với vector trung gian tạo vector tái tổ hợp.

Mục đích của bước này là kiểm tra sự có mặt của gen CrPrx trong vector

tác dòng pBT. Ngoài ra, còn mục đích cắt và thu nhân được gen CrPrx để tạo

đầu dính tương ứng, thuận lợi cho việc gắn gen vào vector trung gian. Sản

phẩm của phản ứng cắt được thôi gel và điện di trên gel agarose 1%.

Thu nhận gen CrPrx từ vector tách dòng pBT

Vector tách dòng pBT-CrPrx được cắt bằng hai loại enzyme giới hạn là

NcoI và NotI, kết quả tạo ra hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 1 kb và

2,7 kb. Trong đó, phân đoạn DNA 1 kb chính là băng gen CrPrx cần thu nhận.

Việc sử dụng cặp enzyme cắt giới hạn như trên sẽ đảm bảo cho gen đích gắn

thuận chiều với promoter 35S trên vector tái tổ hợp.

Quan sát kết quả trên điện di (Hình 3.4 A) cho thấy, ở giếng số 2 sau khi

cắt bằng enzyme, xuất hiện hai băng tương ứng với kích thước của gen CrPrx

khoảng 1 kb và vector pBT khoảng 2,7 kb, kết quả cắt đúng với lý thuyết. Ở

giếng số 1 khi chưa cắt chỉ có 1 băng duy nhất kích thước khoảng 3,7 kb. Sau

đó, tiến hành thôi gel băng có kích thước 1 kb và điện di kiểm tra sản phẩm trên

gel agarose 1% cùng marker. Kết quả, thu được 1 băng duy nhất 1 kb đúng với

42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

kích thước của gen CrPrx (Hình 3.4 B)..

Như vậy, chúng tôi đã tạo dòng và nhân được dòng khuẩn lạc pBT-

CrPrx cần quan tâm.

Hình 3.4: Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng

NcoI/NotI

A. Sản phẩm điện di plasmid cắt bằng NcoI/NotI

(1) Plasmid pBT–CrPrx không xử lý bằng enzyme (đối chứng)

(2) Plasmid pBT–CrPrx sau khi xử lý bằng enzyme NcoI/NotI

B. Sản phẩm tinh sạch gen CrPrx sau khi thôi gel

(1) gen CrPrx tinh sạch

M: Thang DNA 1kb chuẩn

3.2. Xác định trình tự gen CrPrx

Gen CrPrx được nhân lên bằng cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI

mang điểm cắt của enzyme giới hạn NcoI/NotI. Nhưng chỉ bằng hình thức PCR

và cắt bằng enzyme giới hạn đã được thực hiện ở trên vẫn chưa thể kết luận

chắc chắn rằng đoạn gen được phân lập là gen CrPrx, có thể là đoạn gen nào

43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

khác có gần kích thước bắt cặp với mồi. Vì vậy, để có thể kết luận một cách

chính xác nhất chúng tôi tiếp tục mang đi giải trình tự và so sánh với trình tự đã

44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

công bố tại Ngân hàng Gen quốc tế mang mã số LN809932.

Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid của gen CrPrx với trình tự gen

mang mã số LN809932

Kết quả so sánh gen bằng phần mềm BioEdit cho thấy, CrPrx phân lâ ̣p từ

mRNA cây dừa cạn hoa hồng tím được PCR bằng cặp mồi có điểm cắt của

enzyme cắt giới hạn so với trình tự gen Prx của cây dừa cạn đã công bố tại

Ngân hàng gen Quốc tế mang mã số LN809932 đều có kích thước 993 bp.

Trình tự gen CrPrx so sánh với trình tự gen đã công bố có mã số

45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

LN809932 có độ tương đồng rất cao (đạt 98%).

Tuy nhiên, trình tự nucleotide CrPrx phân lâ ̣p t ừ mRNA cây hoa hồng

tím so với trình tự mang mã số LN809932 có 18 vị trí sai khác (12, 25, 33, 68,

69, 133, 143, 283, 289, 317, 334, 336, 398, 704, 756, 757, 976. 985).

Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự gen CrPrx và LN809932

STT Vị trí CrPrx LN809932

1 12 A T

2 25 T C

3 33 T G

4 68 A T

5 69 C T

6 133 A G

7 143 T G

8 283 A G

9 289 T G

10 317 C G

11 334 G A

12 336 - A

13 398 - C

14 704 C T

15 756 G A

16 757 A C

17 976 T G

18 985 T A

Như vậy, chúng tôi đã phân lập, tách dòng thành công và giải trình tự đoạn

46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

gen CrPrx phân lâ ̣p từ mẫu cây dừ a ca ̣n hoa hồng tím thu ta ̣i Thái Nguyên

3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx

Cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc-DKEL được cắt bằng enzyme giới hạn từ

vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx, sau đó gắn vào pBI121 đã cắt mở vòng và

chuyển vào E. coli DH5α. Các vector tái tổ hợp này được tách plasmid và kiểm

tra bằng cách sử dụng enzyme giới hạn HindIII.

Gen CrPrx đã phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím được đưa vào thiết

kế vector gồm các trình tự xác định chuỗi peptide tín hiệu (SP) và hai vùng

chức năng I và II.

Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx

Vector pRTRA7/3 được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi do có

chứa đoạn trình tự quan tâm là CaMV35S, Cmyc và KDEL. CaMV35S là một

promoter rất mạnh giúp cho gen biểu hiện mạnh trong cây. Cmyc và KDEL là

thành phần cần thiết để gen chuyển vào được cây. Gen CrPrx được ghép nối

vào vector pRTRA7/3 đã được cắt mở vòng chứa các đoạn trình tự cần quan

tâm. Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx phục vụ nghiên cứu thiết kế

47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

vector mang cấu trúc CrPrx.

3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc)

Vector trung gian pRTRA7/3 được dùng để cung cấp các thành phần cần

thiết cho việc biểu hiện và kiểm tra gen đích CrPrx trong tế bào thực vật như:

(1) CaMV35S là promoter mạnh phân lập từ virus khảm súp lơ, có thể khởi

động phiên mã gen chuyển ở tất cả các tế bào và mô trên cơ thể thực vật; (2) có

đuôi polyA giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA trong tế bào chất; (3) đặc biệt

pRTRA7/3 còn cung cấp trình tự xác định chuỗi peptide Cmyc kháng nguyên

để có thể dễ dàng xác định sự có mặt của sản phẩm protein đích khi dùng

kháng thể tương ứng bằng Western blot hoặc ELISA.

Dựa vào kích thước gen CrPrx đã trình bày ở phần 2.1.1 lựa chọn thôi

gel và tinh sạch. Gen CrPrx cắt bằng enzyme giới hạn NcoI/NotI được trình

bày ở phần 3.1.2.3 (hình 3.4).

Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3

Vector pRTRA7/3 là vector trung gian, trên vector này vừa có hai điểm

cắt của enzyme giới hạn là NcoI và NotI vừa có trình tự nhận biết của HindIII.

Nhưng gen CrPrx trình bày ở phần 3.1.2.3 cắt bằng cặp enzyme giới hạn

NcoI/NotI. Mục đích của bước này là đưa được gen CrPrx vào vector trung

gian pRTRA7/3. Vì vậy, pRTRA7/3 bắt buộc phải sử dụng enzyme NcoI/NotI

để tạo đầu nối giữa pRTRA7/3 và CrPrx.

Theo tính toán lý thuyết, nếu sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và NotI

cắt vector pRTRA7/3 thì thu được hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng

0,9 kb (là đoạn 2SP và antiABA không sử dụng) và 3,3 kb (kích thước của

vector pRTRA7/3). Trong đó, phân đoạn 3,3 kb chính là đoạn pRTRA7/3 đã mở

48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

vòng mang các trình tự cần thu nhận để phát triển vector tái tổ hợp.

Kết quả điện di ở hình 3.7A cho thấy, sau khi cắt mở vòng pRTRA7/3 bằng

enzyme NcoI/NotI thu được hai phân đoạn 0,9 kb và 3,3 kb đúng như lý thuyết.

Phân đoạn có kích thước 3,3 kb được thôi gel để thu nhận cấu trúc mở vòng của

pRTRA7/3. Sản phẩm được mang đi thôi gel thu nhận được một băng duy nhất

có kích thước như ước tính khoảng 3,3 kb (hình 3.7B), sản phẩm này dùng để

phục vụ phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx

Hình 3.7: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng

NcoI/NotI

A. Sản phẩm điện di plasmid cắt bằng NcoI/NotI

(1) Plasmid pRTRA7/3 không xử lý bằng enzyme (đối chứng)

(2) Plasmid pRTRA7/3 sau khi xử lý bằng enzyme NcoI/NotI

B. Sản phẩm tinh sạch vector pRTRA7/3 sau khi thôi gel

M: Thang DNA 1kb chuẩn; 1: Vector pRTRA7/3 tinh sạch

Gắn gen CrPrx vào vector mở vòng pRTRA7/3

Gen CrPrx mang đầu dính của cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI được gắn

vào vector pRTRA7/3 mở vòng nhờ phản ứng ghép nối với sự xúc tác của T4

49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ligase tạo ra vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx. Vector này được biến nạp vào

tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sản phẩm biến nạp

được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc

carbenicillin. Kiểm tra các dòng khuẩn lạc bằng phản ứng colony-PCR với cặp

mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI.

Hình 3.8: Kết quả PCR các dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp

pRTRA7/3-CrPrx

M: Thang DNA 1kb chuẩn

1 - 5: Các dòng khuẩn lạc pRTRA7/3-CrPrx

Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, trong 5 dòng khuẩn lạc có 4 dòng (2,

3, 4, 5) xuất hiện băng DNA đặc hiệu khoảng 1 kb tương ứng với kích thước

của gen CrPrx. Như vậy, 4 dòng khuẩn lạc được chọn lọc mang plasmid tái

tổ hợp mang gen CrPrx. Plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx được sử dụng

để thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx phục vụ phát triển vector chuyển gen ở

50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

thực vật.

3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121

Sau khi tạo được cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) đầy đủ các thành

phần cần thiết cho biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen, việc tiếp theo là gắn

cấu trúc này vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp được vào hệ gen

thực vật. Vector pBI121 được lựa chọn vì mang những đặc điểm như là có điểm

cắt của enzyme giới hạn phù hợp, giữa bờ trái (LB) và bờ phải (RB) có gen

kháng kanamycin hoạt động trong tế bào thực vật nhờ Nos promoter và Nos

terminator, có điểm khởi động tái bản oriV trong vi khuẩn, có gen chọn lọc

kháng kanamycin hoạt động trong vi khuẩn, có operon TrfA mang các gen vir

đảm nhiệm quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật và một số

thành phần khác.

Việc ghép nối cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen pBI121 được

thực hiện bởi các phản ứng là thu nhận cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc-

KDEL-polyA bằng enzyme giới hạn từ pRTRA7/3-CrPrx, cắt mở vòng vector

pBI121. Sau đó, ghép nối cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA

vào vector pBI121 đã mở vòng tạo vector chuyển gen ở thực vật.

Thu nhận cấu trúc vector tái tổ hợp chứa gen CrPrx và cắt mở vòng

pBI121

Cắt đồng thời pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 bằng enzym cắt giới hạn

HindIII

Gen CrPrx và các thành phần CaMV35S, Cmyc, KDEL và polyA có

kích thước là 1844 bp, ở hai đầu là điểm cắt của enzyme giới hạn HindIII. Xử

lý vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIII thu nhận được cấu trúc

mang gen CrPrx dài 1844 kb và phần còn lại của vector pRTRA7/3 dài 2156

bp. Điện di sản phẩm cắt trên agarose (hình 3.10) nhận được 3 băng DNA trong

51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

đó 2 băng có kích thước khoảng 1,8 và 2,2 kb tương ứng với kích thước tính

toán. Băng DNA trên cùng có kích thước khoảng 4 kb tương ứng với kích

thước của pRTRA7/3-CrPrx. Băng có kích thước khoảng 1,8 kb được thôi gel

và tinh sạch để thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx cho bước phát triển vector

tiếp theo.

Hình 3.9: Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIII

thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx

M: thang chuẩn DNA 1 kb

1: sản phẩm cắt bởi HindIII

2: plasmid không cắt bởi HindIII

Cắt mở vòng vector pBI121

Vùng MCS của vector pBI121 có một điểm cắt của enzyme HindIII như

vậy khi cắt mở vòng khi sản phẩm cắt tối ưu sẽ cho ra một băng vạch khoảng

12 kb. Điện di sản phẩm tinh sạch sau khi cắt mở vòng plasmid pBI121 trên gel

52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

agarose 1% thu được băng DNA có kích thước khoảng 12 kb (Hình 3.10) phù

hợp với kích thước đã tính toán. Trên gel điện di xuất hiện một băng duy nhất,

không có sản phẩm phụ hay trạng thái đứt gãy của DNA. Sản phẩm DNA được

tinh sạch đảm bảo sử dụng tốt cho phát triển vector chuyển gen.

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121

A. Kết quả điện di sản phẩm plasmid cắt bằng HindIII

(1) Plasmid pBI121 không xử lý bằng enzyme (đối chứng)

(2) Plasmid pBI121 sau khi xử lý bằng enzyme hindIII

B. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch vector pBI121 sau khi thôi gel

M: Thang DNA 1kb chuẩn

1: Vector pBI121 tinh sạch

Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx

Ghép nối cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) vào pBI121 bằng cách

sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào

plasmid pBI121 mở vòng. Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi

khuẩn khả biến E.coliDH5α bằng sốc nhiệt, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, nuôi ở 37oC trong 16 giờ. Trên môi trường nuôi cấy sau 16 giờ ở 37oC xuất hiện nhiều khuẩn lạc,

mỗi dòng khuẩn lạc này có thể mang một trong hai là plasmid tái tổ hợp

53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

pBI121-CrPrx hoặc pBI121 tự đóng vòng. Thực hiện colony-PCR một số

khuẩn lạc với cặp mồi Prx-NcoI/Prx-NotI để lựa chọn dòng khuẩn lạc mang

vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx.

Hình 3.11: Kết quả điện di colony-PCR của vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx

M: Thang DNA 1kb chuẩn

1-4: Các dòng khuẩn lạc pBI121-CrPrx

(+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm

Kết quả colony-PCR (Hình 3.11) cho thấy, dòng khuẩn lạc 4 âm tính

(không xuất hiện băng đặc hiệu) có thể do chứa plasmid pBI121 tự đóng vòng,

kháng được kanamycin nhưng không mang cấu trúc gen CrPrx. Các dòng

khuẩn lạc 1, 2, 3, dương tính với phản ứng colony-PCR (xuất hiện băng đặc

hiệu khoảng 1 kb) có thể chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx.

Những dòng khuẩn lạc dương tính này được nuôi trong LB lỏng bổ sung kháng

sinh chọn lọc (kanamycin) để tách plsamid nhân dòng vector tái tổ hợp cho quá

trình biến nạp vào A.tumefaciens phục vụ chuyển gen.

3.4. Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx

Plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx tách từ sinh khối vi khuẩn

E.coli DH5α được biến nạp vào A.tumefaciens EHA105 bằng kỹ thuật xung

điện. Sản phẩm biến nạp sau khi nuôi phục hồi trong LB lỏng được cấy trải trên

54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l và rifamycin 50mg/l nuôi ở 28oC trong 48 giờ. Sau đó, chọn 7 dòng khuẩn lạc

riêng rẽ mọc trên mặt thạch, tiến hành colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu

Prx-NcoI/Prx-NotI. Kết quả thu được ở hình 3.12.

Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen

M: Thang DNA 1kb chuẩn

1-7: các dòng khuẩn lạc A.tumefaciens EHA105 chứa vector tái tổ hợp

mang đoạn gen pBI121-CrPrx

(+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm

Sản phẩm điện di cho thấy, 7 dòng khuẩn đều dương tính, có cùng một

kích thước 1 kb với giếng đối chứng dương. Giếng đối chứng âm không có

băng xuất hiện. Chứng tỏ rằng 7 dòng A.tumefaciens đều mang vector chuyển

gen CrPrx.

Các dòng dương tính được nuôi lỏng trong LB lỏng bổ sung kháng sinh

55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

chọn lọc kanamycin và rifamycin để thu khối lượng lớn phục vụ chuyển gen.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

Phân lập được đoạn gen CrPrx có chứa enzyme giới hạn NcoI/NotI. Gen

CrPrx phân lập từ cDNA vùng mã hóa gồm 993 nucleotide.

Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx (35S-

CrPrx-Cmyc).

ĐỀ NGHỊ

56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen CrPrx vào cây thuốc lá và cây dừa cạn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn, 2011. “Nghiên cứu tách chiết Alkaloid của

rễ cây dừa cạn hoa hồng tại Bình Định”, Tạp chí KH&CN, Đại học Đà

Nẵng, 2 (43), tr. 85 – 92.

2. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1998), Bài giảng dược

liệu, Tập 2, Nhà xuất bản Đại học Dược Hà Nội, tr. 5-24.

3. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006, “Ảnh hường của chất điều hòa tăng

trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào

dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển Khoa học & Công nghệ,

ĐHQG HCM, tập 9, số 6, tr. 59 – 66.

4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y

học Hà Nội.

5. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1,

Nhà xuất bản Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh

6. Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden

E., Verpoorte R. (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on

larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua”, J Chem Ecol,

18:1955–1964.

7. Contin A., van der Heijden R., Lefeber A.W.M., Verpoorte R. (1998), “The

iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose

phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture”, FEBS

Lett, 434: 413–416.

8. Costa MM, Hilliou F, Duarte P, Pereira LG, Almeida I, Leech M,

Memelink J, Barceló AR, Sottomayor M (2008), “Molecular cloning and

characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the

metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol,

57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

146(2): 403-17.

9. Fattorusso, E., Taglialatela, O., (2008). Modern alkaloids: structure,

isolation, synthesis and biology. Wiley-VCH, Weinheim, Germany.

10. Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-

Izquierdo A., Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte P., Barceló

A.R., Sottomayor M. (2011), “Identification of phenolic compounds in

isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their

interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair”, J Exp Bot,

62(8): 2841-2854.

11. Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973), “Isolation of

saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng”, Chem

Pharm Bull Tokyo, 21(1): 98-101.

12. Guggisberg, A., Hesse, M., . Alkaloids. The University of Zurich.

13. Javier Palazn, Rosa M Cusid, Jordi Gonzalo, Mercedes Bonfill, Carmen

Morales, M Teresa Pinol (1998), “Relation Between the Amount of rolC

Gene Product and Indole Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus

Transformed Root Cultures”, Journal of Plant Physiology, 153: 712.

14. Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin

Yu (2013), “Enhancement of vindoline and vinblastine production in

suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid

elicitation”, MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology,

DOI:10.1007/s11274-013-1432.

15. Junaid Aslam, Abdul Mujib, Seikh A. Nasim, Maheshwar Prasad Sharma

(2009), “Screening of vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic

embryos derived plantlets of Catharanthus roseus L. (G) Don”, Scientia

Horticulturae, 119(3): 325-329.

16. Kumar S, Dutta A, Sinha AK, Sen J. (2007), “Cloning, characterization and

localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus”,

58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

FEBS J., 274(5): 1290-1303.

17. Kumar S, Jaggi M, Taneja J, Sinha AK, (2011), “Cloning and

characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus

roseus”, Plant Physiol Biochem, 49 (4): 404-412.

18. Marfori E.C and Alejar (1993), “Alkaloid yeild variation in callus culture

derived from different plant part of the white rosy – purple periwinke,

Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Philippine Journal of Biotechnology,

4(1): 1-8.

19. Maria Manuela R. Costa, Frederique Hilliou, Patricia Duarte, Luís Gustavo

Pereira, Iolanda Almeida, Mark Leech, Johan Memelink , Alfonso Ros

Barceló, and Mariana Sottomayor (2008), “Molecular cloning and

characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the

metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol,

146(2): 403–417.

20. Miyasaka H., Nasu M., and Yoneda K. (1999), “Salvia miltiorrhiza: Invitro

production of eryptotanshinone and feruginol. In: Biotechnology in

agricullture and forestry.7, Medicinal and Aromatic Plants II ed. By Bajaj

YPS. Springer-Verlag Berlin”, Heidelberg, 417-430.

21. Noble RL (1990), “The discovery of the vinca alkaloids - chemotherapeutic

agents against cancer” Biochem Cell Biol, 68(12): 1344-51.

22. Pahwa D. (2008), Catharanthus alkaloids, B.Pharm Punjab University

Chandigarh.

23. Pan Q, Chen Y, Wang Q, Yuan F, Xing S, Tian Y, Zhao J, Sun X, Tang K.

(2010), “Effect of plant growth regulators on the biosynthesis of vinblastine,

vindoline and catharanthine in Catharanthus roseus”, Plant Growth Regul,

60(2):133–141.

24. Pan Q, Saiman MZ, Mustafa NR, Verpoorte R, Tang K. (2016), “A simple

and rapid HPLC-DAD method for simultaneously monitoring the

59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

accumulation of alkaloids and precursors in different parts and different

developmental stages of Catharanthus roseus plants”, J Chromatogr B

Analyt Technol Biomed Life Sci, 1014: 10-6.

25. Pearce H. L., Miller M. A. (2005), “The evolution of cancer research and

drug discovery at Lilly Research Laboratories”, Adv Enzyme Regul, 45:

229–255.

26. Pietrosiuk A., Furmanowa M., Zobel A., Kuras M., Michalak A. (1999),

“Cytological changes in meristematic cells of Allium cepa L. root tips

treated with extracts from callus of Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Acta

Soc. Bot. Pol, 68: 109 – 118.

27. R. H. F Manske (1979), The alkaloid, Chemistry and physiology.

28. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (2001), Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

29. Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning: A laboratory

Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

30. Sottomayor M., Lopes Cardoso I., Pereira L. G., Ros Barcelo A. (2004),

“Peroxidase and the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in the medicinal

plant Catharanthus roseus (L.) G. Don”, Phytochem Rev, 3: 159–171.

31. Tarek Kapiel (2010). “Elicitation of alkaloids by biotic and abiotic stress

factors in Catharanthus roseus”, Egypt. J. Bot, Volume 27-29, pp. 207-224.

32. Tsay H. S., Chang W. D., Chen C. C., and Chang Y. S. (1994), “The

production of imperatorin from Angelica dahurica var. formosana by cell

suspesion culture”, J Agric Assoc China, 168: 32-48.

33. Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R.

(2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology”,

Curr Med Chem, 11: 607–628.

34. Verpoorte R., Van der Heijden R., Moreno P. R. H. (1997), Biosynthesis of

terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus cells, The Alkaloids, G.A.

60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

Cordell (Editor) Academic Press, 221–299.

35. Wang Q, Xing S, Pan Q, Yuan F, Zhao J, Tian Y, Chen Y, Wang G, Tang

K. (2012), “Development of efficient Catharanthus roseus regeneration and

transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as

explants”, BMC Biotechnology, 10: 12 – 34.

36. Zhao J, Zhu W, Hu Q. (2001), “Enhanced catharanthine production in

catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake

flasks and bioreactors”, Enzyme Microb Technol, 28(7-8):673-681.

Một số trang web

61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

37. http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Chữ viết tắt ABA

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 2.1: Vector tách dòng pBT

3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc)

KẾT LUẬN

ĐỀ NGHỊ

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Kỹ thuật gen: Chương 1 - Lịch sử hình thành kỹ thuật gen

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Tôn Thất Tùng, Đà Nẵng

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Ngô Gia Tự, Phú Yên

Đề thi giữa học kì 2 môn KHTN lớp 9 năm 2023-2024 có đáp án - Trường PTDTBT TH&THCS Xã Phu Luông

Đề thi học kì 2 môn KHTN lớp 9 năm 2023-2024 có đáp án - Trường PTDTBT TH&THCS Xã Phu Luông

Đề thi học kì 2 môn KHTN lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Trần Cao Vân, Duy Xuyên

Kế hoạch bài dạy Khoa học tự nhiên 9 - Bài 35: Khái quát về di truyền học (Bộ sách Chân trời sáng tạo)

Kế hoạch bài dạy Khoa học tự nhiên 9 - Bài 44: Di truyền học với cong người (Bộ sách Chân trời sáng tạo)

Kế hoạch bài dạy Khoa học tự nhiên 9 - Ôn tập Chủ đề 11 (Bộ sách Chân trời sáng tạo)

Kế hoạch bài dạy Khoa học tự nhiên 9 - Bài 36: Khái quát về di truyền học (Sách Kết nối tri thức)

Kế hoạch bài dạy Khoa học tự nhiên 9 - Bài 47: Di truyền học với con người (Sách Kết nối tri thức)

Đề thi giữa học kì 2 môn KHTN lớp 9 năm 2023-2024 có đáp án - Trường THCS Thanh Xương, Điện Biên

Bài giảng Cơ sở di truyền ung thư - TS.DS. Phạm Ngọc Khôi

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 - Trường THPT Minh Long, Quãng Ngãi

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 - Trường THPT Số 2 Mộ Đức, Quãng Ngãi

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Sở GD&ĐT Quãng Ngãi (Đề 2)

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Nguyễn Công Trứ, Quãng Ngãi

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Phạm Văn Đồng, Quãng Ngãi

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Số 2 Đức Phổ, Quãng Ngãi

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok