Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định đồng vị kẽm trong mẫu sinh hóa bằng phương pháp khối phổ cao tần cảm ứng plasma ICP-MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------

NGUYỄN MẠNH HÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2014

XÁC ĐỊNH ĐỒNG VỊ KẼM TRONG MẪU SINH HÓA BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHỐI PHỔ CAO TẦN CẢM ỨNG PLASMA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------------------- NGUYỄN MẠNH HÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG VỊ KẼM

TRONG MẪU SINH HÓA BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHỐI PHỔ CAO TẦN CẢM ỨNG PLASMA

Chuyên ngành: Hoá phân tích Mã số: 60440118

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS TẠ THỊ THẢO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Tạ Thị Thảo

đã giao đề tài và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phạm Luận đã giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi trong quá

trình làm luận văn.

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Hóa phân tích đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành báo cáo nghiên cứu khoa học này.

Hà Nội, ngày 14 tháng 1 năm 2014

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đề tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong điều trị hiệu quả bệnh lao của trẻ em” do Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân chủ trì, phối hợp với Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ đã giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Học viên

NGUYỄN MẠNH HÀ

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

Mục lục

Mở đầu ............................................................................................................. 1

Chƣơng 1. Tổng quan .................................................................................... 3

1.1. Vai trò thiết yếu của vi lượng kẽm với sức khỏe và trong điều trị bệnh .. 2

1.2. Phương pháp phân tích và đánh giá thành phần đồng vị kẽm ................. 5

1.2.1. Phương pháp phân tích phổ khối plasma cảm ứng (ICP – MS) ............ 5

1.2.1.1. Nguyên tắc của phép đo phổ khối ICP - MS ...................................... 6

1.2.1.2. các nghiên cứu phân tích đồng vị kẽm bằng phương pháp ICP- MS . 7

1.3. Phương pháp xử lý mẫu, làm sạch mẫu sinh học .................................... 9

Chƣơng 2. Thực nghiệm ............................................................................... 10

2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm…….. ....................................... 10

2.1.1.Hóa chất .................................................................................................. 10

2.1.2. Thiết bị ................................................................................................... 11

2.1.3. Dụng cụ.................................................................................................. 12

2.2. Mẫu nghiên cứu ........................................................................................ 13

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 13

2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo ICP khi xác định

đồng vị ............................................................................................................ 13

2.3.1.1. Sơ đồ nguyên tắc của thiết bị ICP-MS .............................................. 13

2.3.1.2. các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ phổ khối .................................... 14

2.3.1.3. khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo vào các tham

số hoạt động của plasma .................................................................................. 16

2.3.1.4. nghiên cứu lựa chọn axit dung làm môi trường dung dịch mẫu đo và

khảo sát nồng độ axit tối ưu............................................................................ 17

2.3.2. phương pháp sử lý mẫu phân tích.......................................................... 18

2.3.2.1. Xử lý mẫu huyết tương ....................................................................... 18

2.3.2.2 Xử lý mẫu nước tiểu ............................................................................ 19

2.3.2.3.Xử lý mẫu phân ................................................................................... 20

2.3.3. Phương pháp thống kê sử lý số liệu phân tích ....................................... 20

2.3.3.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đồng vị ............................. 20

2.3.3.2. Khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị …………………. ................21

2.3.3.3 Đánh giá phương pháp phân tích ........................................................ 22

Chƣơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận ............................................... 25

3.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp trên thiết bị ICP-MS . 25

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các tham số tối ưu của thiết bị đo ....................... 25

3.1.1.1. Ảnh hưởng của công suất cao tần ....................................................... 25

3.1.1.2. Ảnh hưởng của lưư lượng khí mang mẫu…………..…………..…...28

3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của công suất cao tần khi cố định LV và NGF.29

3.1.1.4. Lựa chọn tham số tối ưu cho chế độ làm việc của Plasma.. ..............30

3.1.2. Ảnh hưởng của loại axit và nồng độ axit…...…..…….….…………….31

3.2. Đánh giá phương pháp phép đo ICP – MS...……………….……..…... .34

3.2.1. Đường chuẩn xác định đồng vị…... ………………..............................34

3.2.2. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượn.…....……..35

3.2.3. Đánh giá độ chính xác của phép đo xác định các đồng vị……….…….…….36

3.2.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi……………………………...……………….……37

3.2.4.1. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch cột………..……..37

3.2.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu phân. ……….... 39

3.2.4.3.Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu huyết tương.........39

3.2.4.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu nước tiểu ........... 39

3.2.5. Phân tích mẫu thực tế..............................................................................43

3.2.5.1. Phân tích đồng vị kẽm trong viên thuốc...............................................43

3.2.5.2. Phân tích đồng vị kẽm trong mẫu phân................................................43

3.2.5. Phân tích đồng vị kẽm trong mẫu huyết tương.......................................43

3.2.5. Phân tích đồng vị kẽm trong mẫu nước tiểu...........................................43

Kết luận............................................................................................................51

Tài liệu tham khảo..........................................................................................52

Phụ lục

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Khối phổ plasma ICP-MS Inductively Coupled Plasma Mass Spectrocopy cảm ứng

Limit Of Detection Giới hạn phát hiện LOD

Limit Of Quantity Giới hạn định lượng LOQ

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

Mass/Charge Khối lượng/điện tích m/z

Peripum rate Tốc độ bơm nhu động PR

RFP Radio Frequency Power Công suất cao tần

Gas Flow NGF Lưu lượng khí mang mẫu

Lent volts Thể thấu kính LV

Count per second Số đếm trong một giây CPS

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các tham số được lựa chọn tự động của máy ICP – MS

ELAN 9000 16

Bảng 3.1. Các tham số tối ưu của máy ICP – MS ELAN 9000 33

Bảng 3.2. Nồng độ dung dịch chuẩn và nồng độ tương ứng của các

đồng vị. 34

Bảng 3.3. Phương trình đường chuẩn của các đồng vị kẽm 36

Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các đồng vị 36

Bảng 3.5. Độ chính xác của phép đo ICP-MS để xác định các đồng vị

kẽm trong dung dịch chuẩn kiểm tra 37

Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch trên cột chiết pha

rắn 38

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của quá trình phá mẫu phân 40

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của quá trình phá mẫu huyết tương 41

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi của quá trình phá mẫu nước tiểu 42

Bảng 3.10. Hàm lượng kẽm trong viên thuốc (n=3) 43 Bảng 3.11Tỷ lệ 3 cặp đồng vị 67Zn/66Zn, 68Zn/66Zn,70Zn/66Zn của bốn

đối tượng nghiên cứu mẫu phân 45 Bảng 3.11Tỷ lệ 3 cặp đồng vị 67Zn/66Zn, 68Zn/66Zn,70Zn/66Zn của bốn

đối tượng nghiên cứu mẫu huyết tuơng 48 Bảng 3.11Tỷ lệ 3 cặp đồng vị 67Zn/66Zn, 68Zn/66Zn,70Zn/66Zn của bốn

đối tượng nghiên cứu mẫu huyết tuơng 50

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý các bộ phận của hệ máy ICP – MS 7

Hình 2.1: Hình ảnh máy ICP – MS (ELAN 9000- Perkin Elmer) 11

Hình 2.2: Sơ đồ nguyên tắc thiết bị phân tích ICP-MS 13

Hình 3.1. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64Zn vào RFP

(NGF = 0,7 L/ph) 25

Hình 3.2. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66Zn vào RFP

(NGF = 0,7 L/ph) 26

Hình 3.3. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67Zn vào RFP

(NGF = 0,7 L/ph) 26

Hình 3.4. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào RFP

(NGF = 0,7 L/ph) 27

Hình 3.5. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70Zn vào RFP

(NGF = 0,7 L/ph) 27

Hình 3.6. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn

vào RFP 29

Hình 3.7. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn

vào RFP 30

Hình 3.8. Ảnh hưởng trực tiếp của nền mẫu đối với phép đo đồng vị kẽm 32

Hình 3.9. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo Zn vào nồng độ

axit 33

Hình 3.10. Đường chuẩn phân tích đồng vị 64Zn 35

Hình 3.11. Đường chuẩn phân tích đồng vị 66Zn 35

Hình 3.12. Đường chuẩn phân tích đồng vị 67Zn 35

Hình 3.13. Đường chuẩn phân tích đồng vị 68Zn 35

Hình 3.14. Đường chuẩn phân tích đồng vị 70Zn 36

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

MỞ ĐẦU

Kẽm là nguyên tố vi lượng, đóng vai trò thiết yếu đối với sinh trưởng người và động vật. Kẽm tham gia vào cấu tạo các enzym và trong thành phần một số deshydrogenaz, đóng vai trò điều hòa chuyển hóa lipit và ngăn ngừa mỡ hóa gan, tham gia vào chức năng tạo máu, cần thiết cho sự biệt hóa tế bào và sự ổn định màng. Thiếu kẽm ảnh hưởng xấu đến tốc độ hấp thu các axit amin. Ngoài ra, kẽm giữ vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, kích thích sự phát triển và biệt hóa lympho bào, đẩy mạnh sự xuất tiết các cytokin (nhất là interleukin 2) để đáp ứng lại các kích thích kháng nguyên.

Do vậy, kẽm đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh ở trẻ em như tiêu chảy, sốt rét, lao phổi, nhiễm trùng… Gần 2 tỉ người ở các nước đang phát triển bị thiếu kẽm. Ở trẻ em, thiếu kẽm làm gia tăng nhiễm trùng và tiêu chảy làm khoảng 800.000 trẻ em thiệt mạng mỗi năm trên toàn cầu. Do vậy, WHO có chủ trương bổ sung kẽm cho trẻ suy dinh dưỡng nặng và tiêu chảy. Bổ sung kẽm giúp ngăn ngừa bệnh tật và giảm tử vong, đặc biệt là trẻ em sinh thiếu cân hoặc chậm phát triển.

Lượng kẽm trong cơ thể người khoảng 2 - 3g, phân phối không đồng đều nhưng nhiều nhất tại gan, thận, xương, tinh hoàn, da, tóc, móng. Đặc điểm của kẽm là không dự trữ trong cơ thể, nửa đời sống sinh học ngắn (12,5 ngày) trong các cơ quan nội tạng, nên cơ thể dễ bị thiếu kẽm nếu khẩu phần cung cấp không đủ. Do rối loạn hấp thu hoặc bài tiết quá mức cũng làm thiếu hụt kẽm như mắc các bệnh di truyền, bệnh đường ruột (tiêu chảy mãn, cắt ruột…), các bệnh khác (xơ gan do nghiện rượu, tiểu đường, thiểu năng tuyến tụy…).

1

Kẽm cũng thuộc loại nguyên tố phổ biến trong thiên nhiên, có nhiều trong ngũ cốc và đậu (tập trung phần lớn ở vỏ ngoài), có nhiều trong hàu, gan, lòng đỏ trứng gà và có khả năng sinh học cao. Song song với việc điều chỉnh lượng kẽm từ thức ăn, thiếu kẽm cần được điều trị bổ sung từ uống viên kẽm hoặc tiêm. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra bổ sung kẽm có thể cải thiện hiệu quả điều trị lao. Một phần của đề tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong điều trị hiệu quả bệnh lao của trẻ em” do Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân chủ trì, phối hợp với

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ tiến hành có nội dung đánh giá mối liên hệ giữa bệnh lao và hàm lượng kẽm nội môi ở nhóm trẻ được điều trị lao và nhóm trẻ khỏe mạnh đối chứng ghép cặp thông qua việc phân tích các đồng vị bền của kẽm để xác định mức hấp thu kẽm của cơ thể theo đường bổ sung kẽm uống hoặc tiêm.

Để phân tích các đồng vị bền, phương pháp phổ biến hiện nay là phân tích phổ khối Plasma cảm ứng (ICP-MS) nhờ ưu điểm có tính chọn lọc và độ nhạy cao trong khoảng hàm lượng siêu vết.

Mục tiêu của đề tài luận văn “Xác định đồng vị kẽm trong mẫu sinh hóa bằng phương pháp khối phổ cao tần cảm ứng plasma ICP-MS” là nhằm xây dựng qui trình phân tích các đồng vị bền của kẽm bằng phương pháp ICP-MS, trong các đối tượng sinh học gồm mẫu huyết tương, nước tiểu và phân thu thập từ các bệnh nhân nhi đang điều trị lao được uống bổ sung viên kẽm hoặc tiêm tăng cường hiệu quả điều trị lao theo phác đồ khuyến cáo của WHO đối với trẻ em Việt Nam.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn gồm:

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu phép đo ICP-MS khi xác định năm đồng vị kẽm 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn và 70Zn, bao gồm nghiên cứu tối ưu hóa các tham số hoạt động của máy ICP – MS, ảnh hưởng của môi trường dung dịch mẫu đo đến phép phân tích.

 Đánh giá các thông số đặc trưng của phương pháp phân tích như khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ, độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phép đo trên thiết bị ICP-MS.

 Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu huyết tương, nước tiểu và phân và hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích các đồng vị kẽm trên nền mẫu thực.

 Ứng dụng qui trình phân tích xây dựng được để phân tích thành phần

2

đồng vị kẽm trong mẫu thực tế.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vai trò thiết yếu của vi lƣợng kẽm với sức khỏe và trong điều trị bệnh

Kẽm là một chất khoáng vi lượng thiết yếu cho sinh vật và sức khỏe con người [36]. Cơ thể người trưởng thành có khoảng 2–3 g kẽm, chiếm khoảng 0,1 % nhu cầu hàng ngày thiếu hụt.[21]. Thiếu kẽm ảnh hưởng đến khoảng 2 tỷ người ở các nước đang phát triển và liên quan đến nguyên nhân một số bệnh [9]. Ở trẻ em, thiếu kẽm gây ra chứng chậm phát triển, phát dục trễ, dễ nhiễm trùng và tiêu chảy, gây thiệt mạng khoảng 800.000 trẻ em trên toàn thế giới mỗi năm [36]. Các enzym liên kết với kẽm trong trung tâm phản ứng có vai trò sinh hóa quan trọng như alcohol dehydrogenase ở người. Ngược lại việc tiêu thụ quá mức kẽm có thể gây ra một số triệu chứng như hôn mê, bất động cơ và thiếu đồng.

3

Kẽm đã được sử dụng theo kinh nghiệm để điều trị nhiều bệnh, kể cả tiêu chảy, trong thế kỷ thứ 19. Vào những năm 1930, kẽm đã được coi là thiết yếu đối với sự tăng trưởng của động vật và mức kẽm thấp đã được mô tả ở người trưởng thành tại Trung Quốc, nhưng hội chứng thiếu kẽm ở người mãi đến những năm 1960 mới được Prasad và cộng sự mô tả. Mức nhu cầu khuyến nghị đối với kẽm mãi đến năm 1974 mới được Viện hàn lâm Khoa học Quốc gia đưa ra. Bổ sung kẽm được Sachdev và cộng sự đánh giá là can thiệp điều trị đối với bệnh tiêu chảy vào năm 1988, và trong những năm 1990, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá việc bổ sung kẽm đối với bệnh tiêu chảy, viêm phổi, sốt rét, với tăng trưởng và phát triển của trẻ em. Theo nhu cầu dinh dưỡng khuyến nghị cho người Việt Nam cũng như khuyến nghị của FAO/WHO 2002, nhu cầu kẽm hàng ngày cho trẻ 4-6 tuổi là 3,1 - 10,3mg cho trẻ 7-9 tuổi là 3,3 - 11,3mg, cho trẻ nam 10-18 tuổi là 5,7 - 19,2mg và cho trẻ nữ 10-18 tuổi là 4,6 - 15,5mg tuỳ theo mức hấp thu tốt (giá trị sinh học kẽm tốt = 50%), mức hấp thu vừa (giá trị sinh học kẽm trung bình = 30%) và mức hấp thu kẽm kém (giá trị sinh học kẽm thấp = 15%). Theo đánh giá của tổ chức tư vấn quốc tế về kẽm, kẽm trong khẩu phần của người Việt Nam có tỷ số phytate/kẽm = 21,6, thuộc loại hấp thu trung bình. Năm 2004, Tổ chức y tế thế giới đã khuyến cáo bổ sung kẽm là bắt buộc trong phòng và điều trị tiêu chảy trẻ em. Sử dụng kẽm (10-

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

20mg/ngày) trong vòng 14 ngày cho toàn bộ trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, (10mg/ngày cho trẻ dưới 6 tháng tuổi, 20mg/ngày cho trẻ từ 6 tháng đến 5 tuổi). Tuy nhiên, chưa có khuyến cáo bắt buộc với các loại bệnh nhiễm trùng khác.

Bệnh lao ở trẻ em là một vấn đề sức khỏe chủ yếu cần quan tâm ở Việt Nam [16]. Ước tính 75% số bệnh nhân lao xảy ra ở trên 22 quốc gia [23]. Việt Nam cũng nằm trong số đó với 5,3% trường hợp bệnh nhân lao là ở trẻ dưới 15 tuổi [13,17]. Biểu hiện bệnh lao có liên quan tới suy giảm nồng độ kẽm huyết thanh ở cả người lớn và trẻ em [6,31], đồng thời nồng độ này cũng tăng lên ở những trường hợp điều trị có hiệu quả [26]. Kẽm cần thiết về nhiều mặt trong chức năng miễn dịch [21] và người ta đã thấy kẽm làm tăng quá trình sản xuất cytokine trong đại thực bào phế nang ở những bệnh nhân bị lao phổi. Hơn thế nữa, trẻ sau điều trị lao hấp thu kẽm từ khẩu phần ăn tốt hơn so với trẻ khỏe thuộc nhóm biến chứng, điều này gợi ra là nhu cầu kẽm của trẻ bị bệnh lao lớn hơn có thể do nhu cầu kẽm cao hơn của chính hệ miễn dịch. Vì thế bổ sung kẽm có thể cải thiện hiệu quả điều trị lao. Mặc dù liều bổ sung đồng thời kẽm và vitamin A đã làm rút ngắn thời gian diệt khuẩn trong đờm dãi và cải thiện vùng tổn thương thấy trên chụp X quang ở điều trị bệnh nhân lao người lớn [22,11], nhưng chưa thấy có nghiên cứu nào về khả năng kẽm làm tăng hiệu quả điều trị lao ở trẻ em trên thế giới [14].

Để bổ sung kẽm vào cơ thể, có thể sử dụng viên kẽm dạng uống dưới dạng thực phẩm chức năng, như viên kẽm gluconat 30 mg, 50 mg hoặc kẽm sunfat. Tuy kẽm rất cần thiết cho cơ thể, nhưng nếu cơ thể thừa kẽm sẽ ảnh hưởng tới sức khỏe, tổn thương tế bào gan, thiếu máu, giảm miễn dịch (người ta không dùng kẽm khi bị nhiễm trùng). Do vậy cần nghiên cứu cụ thể hiệu quả hấp thu và chuyển hóa kẽm trong cơ thể.

Huyết tương hoặc huyết thanh kẽm thường được sử dụng để đánh giá thiếu hụt kẽm trong cơ thể. Hàm lượng kẽm trong huyết tương giảm sau khi ăn, có liên quan giới tính và độ tuổi. Hàm lượng thấp nhất của kẽm trong huyết tương khoảng 700 mg/L [36]. Sau khi dùng kẽm qua đường uống, kẽm xuất hiện trong máu sau 15 phút và nồng độ đạt tối đa sau 2 - 4 giờ. Kẽm bài tiết chủ yếu qua

phân (10mg/ngày) và nước tiểu (0,5mg/ngày), qua mồ hôi (1 /1ml) và qua tóc,

móng.

4

Các nghiên cứu về hàm lượng các dạng đồng vị kẽm trong động thực vật còn rất ít, thường mới chỉ tập trung vào mẫu chuẩn [7,12] công bố 66Zn dao động

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

trong khoảng 0 - 0,4% trong não chuột và [24]. cho biết 66Zn chiếm 0,8% trong mô tế bào. Các nghiên cứu về đồng vị kẽm trong cơ thể người mới có thông tin 66Zn chiếm 0,07 - 0,46% trong máu [36] . Trong các đối tượng sinh học, bình thường tỷ lệ các đồng vị bền cũng gần giống với trong tự nhiên. Ví dụ tỷ số hàm lượng các dạng đồng vị kẽm 67Zn/66Zn trong sữa mẹ là 0,1472, trong máu là 0,1476 và trong huyết tương là 0,1475, gần với tỷ lệ các đồng vị trong tự nhiên của dung dịch chuẩn là 0,1470. Các giá trị trên tương ứng với tỷ số hàm lượng 70Zn/66Zn lần lượt là 0,0224; 0,0222; 0,0221 còn trong tự nhiên tỷ số này là 0,0222. [19] Sự thay đổi tỷ lệ hàm lượng các đồng vị có lên quan đến các phản ứng bay hơi, ngưng tụ trong quá trình tinh chế kẽm hoặc các chuyển hóa sinh học trong cơ thể sống [25]. 1.2. Phƣơng pháp phân tích và đánh giá thành phần đồng vị kẽm

Trong tự nhiên, kẽm có năm đồng vị bền gồm 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn và 70Zn với phần trăm trung bình của mỗi dạng tương ứng là 48,63%, 27,90%, 4,10%, 18,75% và 0,72%. [30]

Trong nghiên cứu về đối tượng sinh học, sự thay đổi tỷ lệ các đồng vị cho biết mức độ hấp thu và đào thải kẽm của cơ thể. Hai tỷ lệ đồng vị thường được sử dụng để đánh giá là 67Zn/66Zn và 70Zn/66Zn. Tuy nhiên, cũng có các nghiên cứu khác sử dụng các đồng vị 67Zn/64Zn hoặc 67Zn/68Zn.

Để xác định thành phần đồng vị có thể sử dụng các phương pháp phân tích như kích hoạt nơtron, các phương pháp khối phổ dùng nguồn nhiệt. Tuy nhiên, các phương pháp kích hoạt nơtron thường không đủ độ nhạy để phát hiện các đồng vị kẽm trong mẫu sinh học và tốn thời gian chiết tách là giàu mẫu. Do vậy, nhiều năm gần đây phổ biến nhất là phương pháp phân tích khối phổ plasma cảm ứng (ICP – MS) [20].

1.2.1. Phƣơng pháp phân tích phổ khối plasma cảm ứng (ICP-MS)

Các phương pháp phân tích phổ khối xác định đồng vị (kể cả đồng vị phóng xạ cũng như đồng vị bền) dựa trên tỷ số khối lượng/điện tích (m/z) của chúng.

5

Phương pháp phân tích phổ khối ra đời khi Thompson nghiên cứu sự chuyển động của các ion mang điện tích dương trong trường điện từ vào năm 1910. Vào năm 1919, Aston đã lần đầu tiên ghi được phổ khối trên giấy ảnh, cũng từ đó Dempter đã thiết kế máy đo phổ khối đầu tiên với detector điện tử [14,21].

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Phương pháp phân tích khối phổ bao gồm các quy trình: nạp mẫu, hóa hơi và nguyên tử hóa, phân mảnh hóa và ion hóa các chất cần phân tích, tạo ra các ion dương 1 của chất phân tích dạng M1+ . Phân giải và tách các ion theo giá trị m/z của chúng để tạo ra phổ khối của tất cả các chất phân tích và cuối cùng là phát hiện từng ion có giá trị m/z riêng. Các số liệu thu được sau khi tiến hành phân tích giúp chúng ta định tính cũng như định lượng được các chất cần phân tích trong mẫu [1,2].

1.2.1.1. Nguyên tắc của phép đo phổ khối ICP – MS

ICP-MS là một phương pháp phân tích các chất vô cơ dựa trên sự ghi đo phổ theo tỷ số m/z của nguyên tử các nguyên tố và đồng vị cần phân tích. ICP (Inductively Coupled Plasma) là ngọn lửa plasma tạo thành bằng dòng điện cao tần (cỡ MHz ) được cung cấp bằng một máy phát cao tần (RF). Ngọn lửa plasma có nhiệt độ cao có tác dụng chuyển các nguyên tố có trong mẫu cần phân tích thành dạng ion. MS (Mass Spectrometry) là phép ghi phổ theo tỷ số m/z.

ICP-MS được phát triển vào đầu những năm 80 của thế kỷ trước, là sự kết hợp thành công của hai thiết bị phân tích là ICP và MS. Có thể nói đây là một trong những phương pháp phân tích hiện đại nhất hiện nay và ngày càng chứng tỏ được ưu điểm vượt trội so với các phương pháp phân tích khác trong nghiên cứu xác định lượng vết và siêu vết các nguyên tố cũng như thành phần đồng vị của chúng [3]. Phương pháp phân tích phổ khối ICP-MS dựa trên nguyên tắc của sự hóa hơi, nguyên tử hóa, ion hóa các nguyên tố hóa học khi chúng được đưa vào môi trường plasma, sau đó các ion này được tách ra khỏi nhau theo tỷ số m/z của chúng bằng thiết bị phân tách khối rồi được phát hiện, khuếch đại và đếm bằng thiết bị điện tử kỹ thuật số [3]. Vì thế muốn thực hiện các công việc phân tích như trên chúng ta phải thực hiện theo trình tự sau [2].

- Trước tiên phải chuyển mẫu phân tích về dạng dung dịch đồng nhất - Dẫn dung dịch vào hệ tạo sol khí, để tạo sol khí mẫu - Dẫn thể sol khí vào ngọn lửa ICP (ICP Plasma Torch) - Trong plasma Torch ICP, các chất sẽ hóa hơi các chất mẫu, nguyên tử hóa (phân ly thành nguyên tử tự do), ion hóa các nguyên tử của nguyên tố có trong chất mẫu.

- Các quá trình xảy ra trong plasma ICP được biểu diễn như sau:

6

- Bay hơi: MnXm (l)  MnXm (r)

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

+ m X (k)

- Hóa hơi: - Phân ly: - Ion hóa: MnXm (r)  MnXm (k) MnXm (k)  M(k)0 nM (k) + E nhiệt  M(k)+

- Thu toàn bộ đám hơi ion khối m/z của chất mẫu, lọc, tách loại bỏ các phần tử không ion sau đó dẫn chùm các ion M+ số khối (m/z) vào buồng phân giải phổ để phân ly chúng thành phổ theo số khối m/z của nó.

- Dùng một loại detector phù hợp để thu nhận và phát hiện các số khối m/z

của mỗi nguyên tố và đồng vị của nó có trong mẫu.

Từ những nguyên tắc trên muốn thực hiện được phép đo phổ khối nguyên tử

ICP-MS chúng ta phải có hệ thống trang bị hay máy quang phổ ICP-MS [1].

- Ghi phổ khối để đách giá định tính và định lượng theo phổ thu được.

(5) Detector (2) Nguồn ion hóa (4) Phân giải khối (3) Hệ quang ion (1) Bộ dẫn mẫu

(6) Hệ chân không (8)

(7) Hệ điện tử Mẫu phân tích

Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý các bộ phận của hệ máy ICP – MS

1.2.1.2. Các nghiên cứu phân tích đồng vị kẽm bằng phƣơng pháp

ICP-MS

Các nghiên cứu về phân tích đồng vị kẽm nhưng chủ yếu tập trung vào đối

tượng thực vật, địa chất và môi trường được tiến hành bằng phương pháp ICP-

7

MS như [10,27,35]

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

+, 67Zn với 35Cl16O2 [19, 34]

Phép đo các đồng vị Zn trong phương pháp ICP-MS, thường được tiến hành trong nền HNO3. Với phép đo đồng vị kẽm có m/z+ là 64, 66, 67, 68 và 70 thì trong các môi trường khác nhau, ảnh hưởng mảnh ion đa nguyên tử cản trở đến phép đo có thể kể đến là : các mảnh 32S16 O 16O+ (nếu đo trong nền H2SO4), 48Ca16O+ nếu nền mẫu chứa nhiều thành phần khoáng, 31P18O2H+ (nều đo trong nền có axit photphoric. Các mảnh ion của đa nguyên tử này trùng với phép đo đồng vị 64Zn. Ngoài ra phép đo đồng vị 66Zn+ sẽ bị ảnh hưởng bởi mảnh 31P18O16OH+ [32]. Các đối tượng mẫu có hàm lượng clorua cao có thể gây ảnh hưởng do trùng khối của phép đo 70Zn với 35Cl2

Khi xác định đồng vị kẽm trong đối tượng sinh học bằng thiết bị ICP-MS

cũng cần lưu ý về việc dụng dung dịch thêm chuẩn của đồng vị giàu. Trong số 5 đồng vị kẽm, vì hàm lượng 70Zn rất nhỏ so với các đồng vị còn lại nên cần được thêm vào mẫu để phân tích được, đồng thời có thể thêm đồng vị có hàm lượng lớn 67Zn để so sánh [33]

Trong phương pháp này, hiện tượng trùng khối cần đặc biệt lưu ý đối với

các thiết bị ICP-MS không sử dụng buồng va chạm động học để loại trừ ảnh

hưởng. Ví dụ trong phân tích mẫu địa chất, môi trường, ảnh hưởng của số khối 64Ni trùng với phép đo 64Zn sẽ được hiệu chỉnh qua phép đo 62Ni. Tương tự ảnh hưởng của 132Ba2+, 134 Ba 2+ ,và 136Ba2+( ảnh hưởng tới m/z+ của phép đo các đồng vị kẽm trong khoảng 66 đến 68) do đó cần xác định đồng vị 135Ba2+và 138 Ba2+ để tính toán các ảnh hưởng của đồng vị này[12].

Vì vậy, khi nghiên cứu điều kiện tối ưu cần chọn nền mẫu đo phù hợp để

loại trừ ảnh hưởng của mảnh ion đa nguyên tử hoặc dùng cột chiết pha rắn để

tách loại ảnh hưởng của các chất đi kèm, đặc biệt đối với nền mẫu chứa nhiều

chất béo, protein.

1.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu, làm sạch mẫu sinh học

8

Xử lý mẫu là quá trình hòa tan và phá hủy cấu trúc của chất mẫu ban đầu, giải phóng và chuyển các chất cần xác định về dạng đồng thể phù hợp với phép đo đã chọn, từ đó xác định hàm lượng các chất và đồng vị mà chúng ta mong muốn. Việc phân tích thành phần các đồng vị kẽm trong đối tượng sinh học như mẫu huyết tương, nước tiểu và phân đòi hỏi quá trình xử lý mẫu phức tạp để tách lấy được kẽm ra khỏi các yếu tố ảnh hưởng đi kèm.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Huyết tương trong máu cần tách khỏi tế bào và tiểu huyết cầu máu bằng phương pháp ly tâm, làm khô và tro hóa ở 4800C sau đó hòa tan tro bằng HCl 6M. Mẫu phân sau khi làm khô được nghiền nhỏ, tro hóa và hòa tan như mẫu huyết tương [33]. Sự có mặt của chất khoáng trong nền mẫu cũng gây ảnh hưởng rất lớn đến phép đo và cần loại trừ.

Mẫu thực vật sau khi được phân hủy bằng HNO3 và H2O2 trong lò vi sóng được tách lấy kẽm ra khỏi nền mẫu bằng cột chiết pha rắn chứa nhựa Chelex- 100 sau đó đo tỷ số đồng vị (64Zn + 66Zn)/68Zn bằng phương pháp ICP-MS [28]

Trong một nghiên cứu khác [31] mẫu phân sau khi đã tro hóa ở 5000 C trong

10h được hòa tan trong HNO3 đặc và H2O2 đặc đến khi mất màu hoàn toàn.

Việc tách và làm giàu ion kẽm hoặc các ion kim loại chuyển tiếp khác có thể thực hiện được bằng cách sử dụng nhựa trao đổi anion bazơ mạnh AG MP-1 có hệ số phân bố cao [10].

9

Trong một nghiên cứu khác của [5], mẫu huyết tương được chuyển vào ống ly tâm 10 ml , thêm 2 giọt axit thiglycolic, trộn đều. Thêm tiếp 3,0 ml HCl (2M) và 0,8 ml axit tricloroaxetic (40%), khuấy đều dung dịch trong 1 phút và ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút. Để làm giàu Zn2+ và tách loại các ion cản trở trong các mẫu sinh học, nghiên cứu của, Zn2+ được hấp thụ dưới dạng phức với 5-(2- benzothiazolylazo)-8-hydroxyquinoline (BTAHQ) trên nhựa trao đổi anion dạng gel (Sephadex DEAE A-25).

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Hoá chất, thiết bị và dụng cụ thí nhiệm 2.1.1. Hoá chất

- Dung dịch chuẩn gốc : Zn2+ 1000 ppm trong HNO3 0,5M của hãng Merck. - Dung dịch chuẩn để xác định đồng vị : Từ nồng độ dung dịch chuẩn tổng đồng vị của kẽm, dựa trên phần trăm tồn tại các đồng vị trong tự nhiên lần lượt là 64Zn 48,63% ; 66Zn 27,90% ; 67Zn 4,10% ; 68Zn 18,75% ; 70Zn 0,72% sẽ tính được nồng độ mỗi đồng vị trong dung dịch chuẩn làm việc có chứa tổng nồng độ kẽm lần lượt là 10ppb ; 100ppb ; 200ppb ; 400ppb.

- Dung dịch chuẩn làm việc Zn2+ được pha loãng hàng ngày từ dung dịch

chuẩn gốc bằng axit HNO3 2%.

- Nước deion, độ dẫn điện 18,2 - Dung dịch chuẩn pH = 4, pH = 7 - Nhựa trao đổi ion AG1-X8 (Bio-Rad Cat. No. 140-1441, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) - Nhựa Chelex 100 (Cat. No. 142-2832, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) - Amoni axetat 8M (Fisher, HPLC Grade, A639-500) - Amoni axetat 1M (Fisher, HPLC Grade, A639-500) - Các dung dịch để điều chỉnh pH: NaOH 3M, NaOH 10M, HCl 2M. - Axit HNO3 đặc, suprapure Merk. - Các dung dịch axit loãng HNO3 2,5M, HNO3 2M, HNO3 1% (OPTIMA, Fisher) - Amoni hidroxit 2M Merck - Các dung dịch axit loãng HCl 0,005M, HCl 0,5M, HCl 2,5M (OPTIMA, Fisher)

2.1.2. Thiết bị

- Máy khối phổ cao tần cảm ứng ICP – MS (Elan 9000 – Perkin Elmer), không có buồng va chạm. - Thiết bị: máy đo ICP-MS (ELAN 9000) (hình 7), máy định vị GARMIN

10

GPS 72 và các thiết bị phụ .

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình 2.1: Hình ảnh máy ICP – MS (ELAN 9000- Perkin Elmer) - Máy li tâm 800B (rotor cho các ống 50mL), hãng Hàn Quốc, tốc độ tối đa 4000 vòng/phút. - Cân phân tích OHAUS của mỹ có độ chính xác 0,01mg - Máy đo pH, độ chính xác đến 0,01 đơn vị pH,của hãng HANNA. - Máy lắc Vortex, tốc độ lắc 3000 vòng/phút - Tủ hood chống acid. - Bếp điện có điều chỉnh nhiệt độ đến 5000C. - Lò vi sóng phá mẫu, model Mars5, 7 vị trí phá mẫu

2.1.3. Dụng cụ

- Đồ bảo hộ lao động: áo blouse, kính bảo hộ, găng tay nitrile - Pipet dùng 1 lần, dung tích 15ml - Ống tuýp nhựa 50mL. Nắp da cam có lỗ cho các ống tuýp nhựa 50mL (chứa dung dịch Radiac hoặc axit rửa) - ống tuýp nhựa 15mL có nút - Ống Cyro 3,5mL chứa dung dịch gốc của AAS và ICP-MS - Bình Teflon (đã được rửa axit) dung tích 50mL hoặc 100mL - Khay đựng Pyrex và 4 cốc để bay hơi - Cột sắc kí, chứa nhựa trao đổi ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+ với nắp đáy Bio- rad Poly-Prep (Cat. No. 731-1550, phòng thí nghiệm Bio-rad, Hercules, CA) - Giá đựng ống tuýp, bình chứa dung môi (Poly-Prep Column Stack Cap, Cat. No. 731-1555, phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA)

11

- Micro pipet dung tích 1000 l và 500 l

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

- Đầu típ cho micro pipet 1000 l và 500 l

- Pipetmen và đầu típ - Parafilm - Giấy bọc bảo quản thực phẩm

2.2. Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu trong luận văn cũng là các mẫu nghiên cứu của đề tài đề tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong điều trị hiệu quả bệnh lao của trẻ em” do Viện Khoa học và kỹ thuật hạt nhân chủ trì, phối hợp với Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Hoa Kỳ tiến hành có nội dung đánh giá mối liên hệ giữa bệnh lao và hàm lượng kẽm nội môi ở nhóm trẻ được điều trị lao và nhóm trẻ khỏe mạnh đối chứng ghép cặp thông qua việc phân tích các đồng vị bền của kẽm để xác định mức hấp thu kẽm của cơ thể theo đường bổ sung kẽm uống hoặc tiêm.

12

Các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân được lấy từ trẻ em (9 đến 13 tuổi) bị bệnh lao tại Bệnh viện Phổi Trung ương được điều trị bằng bổ sung viên kẽm 7 mg/viên/ ngày và mẫu đối chứng. Bệnh nhân sau khi uống thuốc 15 phút thì tiến hành lấy mẫu và lấy tất cả các mẫu nước tiểu và phân của bệnh nhân thải ra trong một ngày. Mẫu máu được lấy 1 lần/ngày. Mẫu thu thập xong thì bảo quản ngay trong tủ lạnh sâu – 400C. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến tín hiệu đo ICP-MS khi xác định đồng vị 2.3.1.1. Sơ đồ nguyên tắc của thiết bị ICP-MS Hệ thống phân tích ICP-MS có sơ đồ nguyên tắc theo như hình vẽ 2.2.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình 2.2: Sơ đồ nguyên tắc thiết bị phân tích ICP-MS

1. Hệ bơm dẫn mẫu vào buồng tạo sol 8. Detector

khí

2. Bộ tạo sol khí mẫu 9. Hệ điện tử

3. Đèn nguyên tử hóa mẫu 10. Bơm chân không

4. Bộ khử đầu ngọn lửa ICP 11. Bơm chân không loại top

phân tử

5. Hệ thấu kính ion 12. Hệ buồng chân không của

máy

6. Hệ phân giải phổ khối 13. Bộ phận cấp khí Ar

7. Trường tứ cực và bộ lọc ion

2.3.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến cƣờng độ khối phổ

ICP- MS là thiết bị phức tạp có độ nhạy cao, bởi vậy kết quả đo chịu nhiều ảnh hưởng của khá nhiều yếu tố. Có thể chia các yếu tố ảnh hưởng thành 6 nhóm như sau:

 Nhóm thứ 1: Là các thông số của máy đo phổ, như độ sâu của plasma

13

(SDe), thế của hệ thấu kính ion VTK, điều kiện chọn, lọc, hội tụ chùm ion, điều kiện tạo chân không, điều kiện thế quét và phân giải phổ chọn để đo, điều kiện làm việc của detector EMD, v.v..Các yếu tố này sẽ được khảo sát đơn biến.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

 Nhóm thứ 2: Các điều kiện tạo thể sol khí mẫu, điều kiện hoá hơi, nguyên tử hoá chất mẫu và sự ion hoá nguyên tố phân tích tạo ra ion Me+, phần tử sinh phổ. Nhóm này là các yếu tố sau đây:

+ Công suất làm việc của máy phát cao tần HF, cung cấp năng lượng cho plasma ICP, để hoá hơi, nguyên tử hoá và ion hoá các nguyên tử của nguyên tố phân tích.

+ Chiều sâu của plasma SDe (SDe: điểm thu dòng ion khối phổ), + Tốc độ dẫn mẫu vào buồng aerosol hoá, tạo thể sol khí. + Loại kỹ thuật dùng để tạo sol khí mẫu (aerosol hoá mẫu). + Các điều kiện và cách khử phần đầu ngọn lửa ICP. Các điều kiện tối ưu phần này có thể khảo sát tự động theo chương trình

của máy hoặc khảo sát đơn biến.

 Nhóm thứ 3: Là chọn số khối m/Z của nguyên tố phân tích để phát hiện và đo định lượng nó. Đây là một yếu tố rất quan trọng, nếu chọn không đúng và không phù hợp, có thể dẫn đến sự chen lấn của số khối của đồng vị khác, hay ion khối hai nguyên tử, gây ra sai số lớn. Việc chọn số khối của nguyên tố phân tích phải:

+ Độc lập, không trùng, không bị chen lấn bởi khối của nguyên tố khác, + Pic phổ của chất phân tích phải nhạy và rõ ràng, + Nền 2 bên phải không lớn, + Cường độ của pic MS phải tuân theo đúng công thức tính cường độ. Chỉ khi pic khối phổ m/Z của nguyên tố phân tích thoả mãn đầy đủ các điều kiện này mới được chọn để xác định một nguyên tố (cả định tính và định lượng).

Riêng với kẽm sẽ sử dụng cả 5 đồng vị để phân tích nên cần khảo sát các

yếu tố ảnh hưởng tới hiện tượng trùng khối do nền mẫu gây ra.

 Nhóm thứ 4: Là các yếu tố vật lý, đặc biệt là độ nhớt của dung dịch

mẫu (tỷ trọng). Quyết định độ nhớt của dung dịch mẫu là thành phần chất nền của mẫu phân tích, nồng độ axit và loại axit của dung dịch mẫu dẫn vào buồng tạo sol khí để đo phổ.

Các axit lựa chọn để khảo sát là các axit thường sử dụng để xử lý mẫu và

các phi kim có mặt trong nền mẫu sau khi xử lý bằng axit.

14

 Nhóm thứ 5: Là các yếu tố hoá học. Có thể là:

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

+ Nồng độ và loại axit trong dung dịch mẫu đo phổ không dồng nhất, + Thành phần hoá học của mẫu phân tích, + Trạng thái, cấu trúc và dạng (loại) liên kết hóa học của chất phân tích, + Chất nền của mẫu và nồng độ của nó, + Yếu tố ảnh hưởng của một số cation và anion khác có trong mẫu phân

tích (nguyên tố thứ ba),

+ Kỹ thuật chuẩn bị và xử lý mẫu phân tích

 Nhóm thứ 6: Là kiến thức và trình độ tay nghề của nguời làm phân

tích. Trong phạm vi luận văn, chúng tôi tập trung khảo sát ảnh hưởng của 3 yếu tố sau: - Thế thấu kính ion - thuộc nhóm ảnh hưởng 1 - Công suất RF- thuộc nhóm ảnh hưởng 2 - Lưu lượng khí mang - thuộc nhóm ảnh hưởng 2

Với nhóm ảnh hưởng số 3; 4; 5 và 6, do đối tượng mẫu phân tích là mẫu huyết tương, nước tiểu và phân nên chỉ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của môi trường mẫu đo và nồng độ axit, một số ảnh hưởng trùng khối và sử dụng số khối mặc định cho 5 đồng vị kẽm để phân tích.

2.3.1.3. Khảo sát sự phụ thuộc cƣờng độ tín hiệu của phép đo vào các tham số hoạt động của Plasma.

15

Máy khối phổ plasma cảm ứng là một thiết bị hiện đại, phức tạp, có nhiều tham số hoạt động ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy và độ chọn lọc khi phân tích tổng hàm lượng cũng như thành phần đồng vị của nguyên tố. Các tham số thuộc về hệ thấu kính ion, hệ tứ cực, detector và các tham số thuộc về chế độ làm việc của plasma như công suất cao tần (radio frequency power-RFP), lưu lượng khí mang (carrier gas flow rate -CGFR), độ sâu mẫu (Sample depth -SDe), tốc độ bơm dẫn mẫu (peripump rate-PR)… cần đươ ̣c tối ưu để phép đo có độ nhạy cao , đồng thời sự hình thành các mảnh oxit và hidroxit thấp nhất, nhỏ hơn 1% và sự hình thành các ion đa nguyên tử nhỏ hơn 3%. Các yếu tố ảnh hưởng không lớn có thể tối ưu hóa một cách tự động hoặc có thể thay đổi theo phương pháp biến thiên từng yếu tố sao cho phù hợp với từng đối tượng mẫu khác nhau và chọn điều kiện đo sao cho đạt độ nhạy tốt và độ ổn định với phép đo cả 5 đồng vị kẽm.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Để khảo sát, tìm các tham số hoạt động plasma tối ưu khi xác định 5 đồng vị của Zn với điều kiện PR là 0,1 v/s còn các tham số còn lại RFP, CGFR, SDe lần lượt thay đổi. RFP thay đổi trong khoảng (900 đến 1500 W), CGFR thay đổi trong khoảng (1,0 đến 1,30 L/ph), SDe thay đổi trong khoảng (4,5 đến 8,5 mm), các tham số còn lại của máy ICP-MS như trình bày ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các tham số được lựa chọn tự động của máy ICP – MS ELAN 9000

Các tham số

Điều kiện phân tích năm đồng vị kẽm 1,0 -1,2. 10-5 Torr

Áp suất chân không (khi đo mẫu)

2,0 – 3,0. 10-6 Torr

Áp suất chân không (khi để máy Standby)

Tốc độ bơm rửa (RP) 48 vòng/phút

Tốc độ bơm mẫu (RP) 26 vòng/phút

Số lần quét khối 10 lần

Thời gian đo cho 1 lần 5,8 giây

Số lần đo lặp 3 lần

2.3.1.4. Nghiên cứu lựa chọn axit dùng làm môi trƣờng dung dịch mẫu đo và khảo sát nồng độ axit tối ƣu. Dung dịch mẫu đo thường có môi trường axit. Nhưng cần lựa chọn loại axit nào phù hợp nhất dùng làm môi trường trong dung dịch mẫu đo để hạn chế ảnh hưởng trùng khối của các mảnh khối đa nguyên tử. Các khảo sát và lựa chọn nồng độ axit tối ưu được tiến hành bằng cách xác định đồng vị trong dung dịch chuẩn khi máy hoạt động với các tham số plasma tối ưu và nồng độ axit của dung dịch mẫu thay đổi.

2.3.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu phân tích

Các qui trình xử lý mẫu được tham khảo từ các tài liệu, đã được nghiên cứu tối ưu và tiến hành tại Viện nghiên cứu sức khỏe trẻ em Oakland- Mỹ. Do vậy, trong luận văn này chỉ đánh giá hiệu suất thu hồi khi thêm lượng biết trước các đồng vị kẽm vào các mẫu trắng phương pháp.

16

2.3.2.1. Xử lý mẫu huyết tƣơng

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Cân khoảng từ 1,5-2,5g mẫu huyết tương trên cân phân tích và chuyển vào các bình Teflon của lò vi sóng. Thêm 4,0 ml HNO3 đặc. Đóng nắp bìnhvà đưa vào lò vi sóng. Vận hành chương trình phá mẫu, (khoảng 40 phút) với thông số 600W, tăng tới 115 độ C trong 10 phút, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút. Sau khi hoàn tất phá mẫu, để mẫu nguội trong 10 phút. Lấy mẫu ra khỏi lò vi sóng, chuyển mẫu vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất đến vạch mức. Đậy chặt nắp và lắc đều.

Làm sạch mẫu trƣớc khi phân tích bằng ICP-MS - Lấy 10,00 ml mẫu sau khi đã định mức, cho vào cốc Teflon dung tích 50 mL, đun cho bay hơi (không đun sôi) toàn bộ mẫu đến khô (khoảng 2-3 giờ) trong tủ hút, ở nhiệt độ 1500C), cẩn thận không làm cháy mẫu. Để nguội và thêm vào 10mL HCl 2,5M, khuấy đều và chuyển mẫu vào ống tuýp dung tích 15 ml để tiếp tục làm sạch Zn.

Chuẩn bị cột chiết pha rắn: Xếp các cột sắc kí đã rửa sạch bằng axit lên giá. Tẩm ướt bông thủy tinh với nước loại ion để đảm bảo cột không bị tắc. Chuyển 1,0 ml nhựa AG1-X8 (cân bằng trước trong dung dịch HCl 0,005M) vào mỗi cột, thêm 10mL HCl 0,005M, sau đó bằng 10mL HCl 0,5M, tiếp theo là 5mL HCl 2,5M, cuối cùng bằng 1ml HCl 0,5M. Chuyển toàn bộ mẫu trong ống vào cột chiết pha rắn. Rửa cột bằng 5mL HCl 2,5M, sau đó bằng 1mL HCl 0,5M. Loại bỏ dung dịch chảy qua khỏi cột vào thùng chứa chất thải axit.

- Cuối cùng rửa giải Zn2+ ra khỏi cột bằng 10mL HCl 0,005M vào ống tuýp

nhựa Falcon.

- Cho bay hơi phân đoạn rửa giải Zn2+ tới khô trong cốc Teflon đặt trong tủ hút (cẩn thận không đun sôi dễ làm cháy mẫu), khoảng 2h ở 150 độ C cho đến khi được chất rắn màu vàng nhạt.

- Thêm 2mL HNO3 1% vào cặn rắn và chuyển tất cả vào ống cyro 2,5mL, chờ phân tích bằng ICP-MS. Cứ 10 mẫu cần phân tích mẫu chuẩn và mẫu trắng.

Công thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu huyết tương như sau:

17

Trong đó: Cp là nồng độ mẫu thực phân tích trên ICP – MS (ppb)

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

V1 thể tích mẫu đo ICP-MS (lít) ap khối lượng mẫu phân xử lý n: độ pha loãng trong quá trình xử lý mẫu (n = 10) Chú ý: Nếu nồng độ Zn trong dung dịch mẫu lớn khi phân tích bằng ICP-MS

cần phải pha loãng mẫu 10 lần mẫu bằng cách thêm vào mỗi ống tuýp 200 l dung dịch mẫu gốc trong 3,8 ml HNO3 1% thành 4,00 ml dung dịch mẫu. 2.3.2.2. Xử lý mẫu nƣớc tiểu

Tiến hành giã đông hoàn toàn các mẫu nước tiểu thuộc cùng 1 đối tượng (16 mẫu trên 1 đối tượng). Sau khi giã đông xong tiến hành lắc xoáy kĩ. Chuyển 45mL nước tiểu vào 3 ống nghiệm dung tích 15mL. Li tâm mẫu bằng máy li tâm ở 2000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó chuyển từng mẫu nước tiểu trong 3 ống

nghiệm 15mL vào chung 1 ống nghiệm 50mL. Thêm 70 L dung dịch amoni

axetat 8M, lắc đều. Điều chỉnh pH đến 5,3 ± 0,1 bằng dung dịch NaOH (3M hoặc 10M).

Tinh chế kẽm trong nƣớc tiểu: - Chuẩn bị nhựa Chelex:

+ Tiến hành cân bằng trước nhựa Chelex100 trong HNO3 2M trong 24h + Lắp cột sắc kí đã rửa bằng axít lên giá. Làm ẩm bông thủy tinh bằng nước loại ion để đảm bảo cột không bị tắc. Chuyển 2,0 mL nhựa Chelex vào mỗi cột, thêm 15mL nước đề ion, đậy nắp cột lại.

- Trong tủ hút, thêm 7mL NH4OH 2M, bọc đầu cột bằng màng parafilm rồi lộn ngược cột, lắc đều và mở để NH4OH chảy qua cột (tránh tạo bọt trong cột). Rửa lại cột với ít nhất 30mL nước deion.

- Chuyển toàn bộ mẫu nước tiểu lên cột, cho cột chảy với tốc độ 2 ml/phút, thêm 10mL dung dịch amoni axetat 1M bằng pipet 5mL để loại Na+ , Ca2+, Mg2+ và K+.

- Rửa giải kẽm ra khỏi cột bằng 15mL HNO3 2,5M vào các ống nghiệm nhựa 15mL. Chuyển các mẫu sang cốc Teflon 50 hoặc 100mL đã rửa bằng axít, làm bay hơi đến khô ở 150 độ C, trong tủ hút khoảng 2 tiếng, có đậy đĩa Pyrex. Khi mẫu đã khô, thêm 10mL dung dịch HCl 2,5N (2 lần mỗi lần 5mL) để chuyển qua cột sắc kí trao đổi anion.

- Nếu không tiếp tục chạy sắc kí tiếp ngay, chuyển mẫu vào bình nón 15mL

18

có nắp.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

- Chuẩn bị cột sắc ký trao đổi ion AG1X-8

- Lắp các cột sắc kĩ đã rửa axit lên giá, tẩm ướt bông thủy tinh với nước loại ion để đảm bảo cột không bị tắc. Chuyển 1,0ml nhựa AG1-X8 (đã được cho cân bằng trước sử dụng HCl 0,005M) lên từng cột. Cân bằng nhựa với 10ml HCl 0,005M, sau đó bằng 10ml HCl 0,5M và 5ml HCl 2,5M.

- Chuyển mẫu (đã qua cột Chelex trong môi trường HCl 2,5M) vào cột và cho chảy qua cột hoàn toàn. Rửa cột với 5ml HCl 2,5M, sau đó với 1ml HCl 0,5M. Loại bỏ nước rửa.

- Cuối cùng rửa giải Zn2+ ra khỏi cột với 10ml HCl 0,005M vào ống nhựa

15ml.

- Cho bay hơi hết dung môi trong bình Teflon, (cẩn thận không để mẫu bị cháy) trong tủ hút, ở 150 độ C trong khoảng 2 tiếng cho tới khi còn lại chất rắn màu vàng nhạt. Chú ý không được để sôi mẫu.

- Sau khi mẫu đã cạn thêm 2ml HNO3 1%. Chuyển toàn bộ mẫu vào ống

tuýp cyro 3,5ml để phân tích ICP-MS.

- Công thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu nước tiểu như sau:

Trong đó: Nồng độ mẫu đo trên máy ICP – MS (ppb)

Thể tích mẫu nước tiểu ban đầu (ml)

Thể tích mẫu sau xử lý đo trên ICP-MS (lít)

n: Độ pha loãng trong cả quá trình phá mẫu với n = 10

2.3.2.3.Xử lý mẫu phân

19

Mẫu phân sau khi đã đông khô được nghiền mịn trong các bình xay bằng nhựa với máy xay Osterizer. Các mẫu thu thập trong cùng một ngày có thể trộn chung và nghiền cùng nhau, đảm bảo rằng các mẫu được trộn đều trong máy xay trước khi chuyển mẫu ra giấy nến và chuyển vào trong bình. Phải đảm bảo tất cả các mẫu trong hộp chứa được chuyển hết vào trong bình xay. Mẫu sau khi nghiền được chuyển ra giấy nến, sau đó chuyển vào các bình Nalgen mới (đã được cân từ trước), tiến hành phá mẫu sử dụng lò vi sóng. Cân mỗi mẫu (từ 0,1 – 0,2g) và chuyển vào các bình Teflon, thêm 4,0 ml HNO3 đặc. Đóng nắp ống và đưa vào lò vi sóng. Tiến hành phá mẫu khoảng 40

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

phút với thông số 600W, 25% công suất lớn nhất, tăng nhiệt độ tới 115 độ C trong 10 phút, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút. Sau khi hoàn tất phá mẫu, để mẫu nguội trong 10 phút. Lấy mẫu ra khỏi lò vi song, định mức bằng nước deion đến 50 ml. Đậy chặt nắp và lắc đều. Mỗi lần phá đều tiến hành mẫu blank (mẫu trắng chỉ gồm axit và nước deion)

Cho bay hơi 10ml dung dịch mẫu vừa phá trên bếp gia nhiệt tới khô khô (trong tủ hút, ở nhiệt độ 150 độ C, khoảng 2h) trong bình Teflon 50 mL đã được rửa acid, cẩn thận không làm cháy mẫu, đậy mẫu bằng đĩa Pyrex. bay hơi hết tới khô. Để nguội và thêm vào mẫu 10mL HCl 2,5M.

Mẫu phân tích chứa Zn2+ được làm sạch khỏi nền mẫu đi kèm bằng cột sắc ký

chứa nhựa AG1-X8 như mẫu nước tiểu vá huyết tương ở trên.

Công thức tính hàm lượng đồng vị kẽm trong mẫu phân như sau:

Trong đó: CF là nồng độ mẫu thực phân tích trên ICP – MS (ppb) V1 thể tích mẫu sau xử lý, phân tích trên ICP-MS (lít) aF khối lượng mẫu phân xử lý (g) n: độ pha loãng trong quá trình xử lý mẫu (n = 50)

2.3.2.4. Phân tích tổng hàm lƣợng kẽm và đồng vị kẽm bằng trong viên thuốc kẽm

Bệnh nhân nhi đang điều trị lao được uống bổ sung viên kẽm (sản xuất từ muối kẽm gluconat hoặc kẽm sunfat và phụ gia có hàm lượng dự kiến ban đầu là 10 mg Zn/viên.

Lấy 10 viên thuốc, bỏ vỏ bọc bên ngoài, cân tổng khối lượng thuốc có trong 10 viên (m1 gam). Cân khối lượng tương ứng với 1 viên thuốc (m2 gam), thêm HNO3 1 %, rung siêu âm đến khi thuốc tan hoàn toàn và định mức thành 50 ml. Tiến hành phân tích bằng hai phương pháp AAS và ICP – MS.

Trong đó: m1 là khối lượng của 10 viên thuốc (g)

20

Công thức tính tổng hàm lượng kẽm

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

m2 là khối lượng của một viên thuốc đem đi phân tích (g)

700 là hàm lượng kẽm có trong 10 viên thuốc

Công thức tính các đồng vị kẽm từ nồng độ Cx theo phương trình đường

chuẩn là:

Trong đó: Cx là nồng độ mẫu phân tích tính theo phương trình đường chuẩn m1 là lượng cân mẫu thuốc đem đi xác định 50 là thể tích định mức sau khi đã xử lý mẫu

2.3.3. Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu phân tích 2.3.3.1. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng đồng vị

Giới hạn phát hiện là nồng độ của chất phân tích tương ứng với tín hiệu đo

nhỏ nhất mà thiết bị có thể phát hiện được (định tính).

Giới hạn định lượng là nồng độ của chất phân tích tương ứng với tín hiệu

đo nhỏ nhất mà thiết bị có thể xác định được (định lượng).

Đối với thiết bị quang phổ plasma ICP – MS [3], giới hạn phát hiện và giới

hạn định lượng của đồng vị được tính theo các công thức sau:

;

Trong đó: LOD là giới hạn phát hiện đồng vị (Limit of Detection)

LOQ là giới hạn định lượng đồng vị (Limit of Quantification)

là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng

b là hệ số góc của đường chuẩn xác định đồng vị.

Đo lặp mẫu trắng 10 lần, tính theo công thức sau

21

Trong đó, là tín hiệu mẫu trắng đo được lần thứ i;

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

là giá trị trung bình tín hiệu mẫu trắng của n lần đo lặp;

n là số lần đo lặp mẫu trắng

2.3.3.2. Khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị

Trong phép đo ICP – MS [15], việc định lượng một đồng vị dựa vào

phương trình cơ bản

Trong đó: là cường độ tín hiệu của vạch phổ.

K là hằng số thực nghiệm.

C là nồng độ của đồng vị

b là hằng số .

Trong khoảng nồng độ nào đó b có giá trị bằng 1, mối quan hệ giữa và

C là tuyến tính:

Khoảng nồng độ bắt đầu từ giới hạn định lượng (LOQ) đến giới hạn tuyến tính (Limit Of Linearity – LOL) được gọi là khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị cần phân tích. Khoảng tuyến tính của mỗi đồng vị có tỷ số m/z khác nhau là khác nhau.

Để xác định khoảng tuyến tính của phép đo đồng vị cần thiết lập đường chuẩn xác định đồng vị. Tuy nhiên, phương pháp ICP –MS tín hiệu của phép đo có thể thay đổi trong khoảng giá trị rất lớn nên khoảng tuyến tính của phép đo rất rộng (từ vài ppt cho đến vài chục hay vài trăm ppm). Do đó, đối với phép đo quang phổ plasma ICP – MS không cần chú ý nhiều đến giới hạn tuyến tính.

22

Thiết lập đường chuẩn xác định đồng vị bằng dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng phù hợp, nồng dộ thấp nhất của đồng vị trong dung dịch chuẩn không nhỏ hơn giới hạn định lượng của đồng vị đó. Phải đảm bảo độ chính xác của phép đo ở mọi khoảng nồng độ của đường chuẩn, mỗi phép đo được thực hiện lặp lại 3 lần. Sau đó sử dụng đường chuẩn được thiết lập để xác định nồng độ của đồng vị trong dung dịch chuẩn kiểm tra. Đánh giá độ chính xác của phép đo qua kết quả tính toán độ chệch và độ lệch chuẩn tương đối của nồng độ đồng vị vừa xác định.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

2.3.3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

Từ kết quả nghiên cứu thu được, tiến hành xây dựng phương pháp phân tích đồng vị kẽm trong các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân sau đó đánh giá phương pháp qua thông số như độ chính xác và độ thu hồi.

*Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp phân tích

Độ chính xác của phương pháp phân tích bao gồm độ đúng và độ chụm [4] - Đánh giá độ đúng của phép phân tích qua độ lệch chuẩn (B) giữa giá trị kết quả

phân tích SRM và giá trị đã được chứng nhận. Độ chệch kết quả phân tích được

- Đánh giá độ chụm của phép phân tích qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD), được

tính như sau:

Trong đó: B là độ chệch

RSD là độ lệch chuẩn tương đối (%)

là lượng đồng vị xác định được (giá trị trung bình)

là lượng đồng vị được chứng nhận (giá trị trung bình)

SD là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức sau:

Trong đó: là lượng đồng vị xác định được lần thứ i

N là số lần thí nghiệm

23

* Đánh giá hiệu suất thu hồi

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Thêm một lượng nhất định đồng vị cần xác định vào mẫu phân tích, tiến hành xử lý mẫu qua tất cả các bước theo quy trình phân tích, so sánh kết quả phân tích hàm lượng đồng vị trong mẫu sau khi được thêm vào đồng vị và kết quả phân tích hàm lượng đồng vị trong mẫu ban đầu. Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau:

Trong đó, R là hiệu suất thu hồi (%);

: Lượng đồng vị thêm vào mẫu

: Lượng đồng vị có trong mẫu ban đầu

: Tổng lượng đồng vị xác định được trong mẫu sau khi

thêm dung dịch chuẩn.

24

Sau khi đã kết luận được độ chính xác của phương pháp phân tích, áp dụng quy trình phân tích để xác định đồng vị kẽm trong các mẫu huyết tương, mẫu nước tiểu và mẫu phân .

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện phân tích phù hợp trên thiết bị ICP-MS 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn các tham số tối ƣu của thiết bị đo

Phép đo các đồng vị kẽm trong mẫu sinh học và đánh giá sự biến đổi hàm lượng của các đồng vị được tiến hành với cả 5 đồng vị 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn. Vì vậy cần tìm điều kiện tối ưu có thể phân tích đồng thời 5 đồng vị này thông qua việc đánh giá sự phụ thuộc cường độ tín hiệu (CPS) của phép đo vào các tham số hoạt động plasma sao cho đạt được độ nhạy tốt và độ ổn định cao (RSD nhỏ).

3.1.1.1. Ảnh hƣởng của thế thấu kính

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của cường độ tín hiệu phép đo hay số đếm (CPS) Zn vào RFP khi xác định các đồng vị 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được trình bày từ hình 3.1 đến hình 3.5. (xem thêm trong phụ lục P1.6 đến P1.20).

Hình 3.1. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

25

Khi cố định tốc độ bơm mẫu (PR) là 26 vòng/s, lưu lượng khí mang argon (NGF) là 0,7 lit/phút và thay đổi lần lượt thế thấu kinh ion từ 3V đến 9V thì cường độ tín hiệu thu được khi đo riêng rẽ 5 đồng vị kẽm phụ thuộc vào công suất máy phát cao tần được biểu diễn trong các hình từ 3.1 đến 3.5.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình 3.2. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Hình 3.3. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

26

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình 3.4. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

Hình 3.5. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70Zn vào RFP (NGF = 0,7 L/ph)

27

Kết quả biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị kẽm vào công suất cao tần (RFP) khi lượng khí mang (NGF) là 0,7 L/ph từ hình 3.1 đến hình 3.5 cho thấy đối với phép đo các đồng vị 64Zn, 67Zn, 70Zn thì cường độ

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

tín hiệu tăng dần khi RFP tăng từ 900 đến 1400W (so với giới hạn cho phép của thiết bị đo là 1500W) do khả năng ion hóa mẫu cũng tăng, số lượng ion M+ hình thành tăng. Thế thấu kính ion càng lớn thì sự tăng tín hiệu khi công suất máy phát cao tần tăng càng nhanh, kèm theo tín hiệu kém ổn định hơn. Tuy nhiên, cường độ tín hiệu các phép đo đồng vị 66Zn, 68Zn lại ít thay đổi . Vì hàm lượng đồng vị 70Zn trong mẫu rất nhỏ nên để tăng độ nhạy của phép đo chúng tôi lựa chọn thế thấu kính ion là 9V (lớn nhất có thể của máy đo) để cường độ tín hiệu phép đo cả 5 đồng vị kẽm với các thông số khác nhau đều thu các giá trị là cao nhất.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của công suất cao tần đến tín hiệu đo khi thay đổi lưu lượng khí mang là 0,8; 0,9 và 1,0L/phút (các hình P1.6 đến P1.20) cũng cho thấy qui luật biến thiên cường độ tín hiệu phép đo của các đồng vị 64Zn, 67Zn và 70Zn tăng tuyến tính theo RFP, còn đối với các đồng vị 66Zn và 68Zn thì cường độ tín hiệu phép đo phổ thay đổi không đáng kể. Qui luật biến thiên tín hiệu này cũng không khác so với khi NGF là 0,7 L/phút.

3.1.1.2. Ảnh hƣởng của lƣu lƣợng khí mang mẫu (NGF)

Dựa theo kết quả khảo sát ảnh hưởng của công suất máy cao tần (Phần 3.1.1.1) đến cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn với các giá trị NGF khác nhau tại các vị trí thế thấu kính khác nhau đã xác định được với giá trị thế thấu kính LV = 9V cho cường độ tín hiệu phép đo là lớn nhất. Do đó trong phần này chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng khí mang NGF đến cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị Zn tại vị trí thế thấu kính LV = 9Volts nhằm mục đích tìm ra giá trị lưu lượng khí mang tối ưu nhất cho phép đo.

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo vào NGF khi xác định các đồng vị 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được trình bày ở các hình từ Hình P2.1 đến Hình P2.5.

28

Đối với hai đồng vị 66Zn và 68Zn (hình P2.1 và P2.2) khi thay đổi lưu lượng khí mang NGF từ 0,6 – 0,9 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ tăng dần lên, nhưng khi lưu lượng khí mang lớn hơn 0,9 L/ph thì cường độ tín hiệu phổ bắt đầu giảm. Trên đồ thị cho thấy tại NGF = 0,9 L/ph thì cho cường độ tín hiệu phép đo phổ đồng vị 66Zn và 68Zn đạt cực đại. Do vậy chúng tôi chọn lưu lượng khí mang NGF = 0,9 L/ph và vị trí thế thấu kính LV = 9Volts khảo sát để xác định giá trị công suất cao tần RFP tối ưu cho phép đo phổ đồng vị 66Zn và 68Zn.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Kết quả khảo sát từ hình P2.3 đến hình P2.5 của các đồng vị 64Zn, 67Zn và 70Zn cho chúng ta thấy khi thay đổi lưu lượng khi mang NGF từ 0,6 – 1,0 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn giảm dần. Với NGF = 0,6 L/ph thì cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị 64Zn, 67Zn và 70Zn cho giá trị lớn nhất. Do vậy chúng tôi chọn lưu lượng khí mang NGF = 0,6 L/ph và vị trí thế thấu kính LV = 9V để tiến hành khảo sát công suất cao tần đối với phép phân tích các đồng vị 64Zn, 67Zn và 68Zn. 3.1.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của công suất cao tần khi cố định LV và NGF

Hình 3.6. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP Để xác định công suất cao tần tối ưu cho phép đo 2 đồng vị 66Zn và 68Zn chúng tôi lựa chọn NGF = 0,9L/ph và LV = 9 Volts (là giá trị tối ưu đã được xác định theo phần 3.1.1.1 và 3.1.1.2). Kết quả khảo sát đồ thị hình P2.6 cho thấy khi công suất cao tần tăng từ 900 - 1200 cường độ tín hiệu phép đo tăng điều này có thể giả thích là do khi năng lượng tăng sự hình thành ion của phép đo tăng do đó cường độ tín hiệu phép đo tăng theo. Nhưng khi công suất tăng vượt quá 1200W cường độ tín hiệu phép đo giảm dần nguyên nhân do năng lượng cao dẫn đến sự hình thành nhiều loại ion không mong muốn làm giảm lượng ion của phép đo do vậy cường độ tín hiệu phép đo phổ giảm. Cường độ

29

Để xác định công suất cao tần tối ưu cho các phép đo phổ các đồng vị Zn, trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ vào công suất cao tần RFP cụ thể cho từng đồng vị Zn như sau:

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

tín hiệu phép đo đạt cực đại khi RFP = 1200W. Sau khi đã khảo sát các như trên, chúng tôi chọn NGF = 0,9L/ph, RFP = 1200W và LV = 9 Volts cho phép đo phổ xác định 2 đồng vị 66Zn và 68Zn.

Biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ 64Zn, 67Zn và 70Zn theo công suất cao tần RFP khi NGF = 0,6L/ph (là lưu lượng khí mang tối ưu đã khảo sát ở mục 3.1.1.2) ở hình 3.7 ta thấy, khi tăng công suất cao tần từ 900 – 1400W cường độ tín hiệu phép đo phổ Zn tăng dần. Điều này có thể giải thích khi cố định lưu lượng khí mang và thế thấu kính tăng công suất cao tần làm tăng sự hình thành ion của phép đo do đó cường độ tín hiệu phép đo tăng theo. Cường độ tín hiệu phép đo lớn nhất khi RFP = 1400W. chúng tôi chọn NGF = 0,6L/ph, RFP = 1400W và LV = 9 Volts cho phép đo phổ xác định 2 đồng vị 64Zn, 67Zn và 70Zn.

Hình 3.7. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo các đồng vị Zn vào RFP Nếu so sánh cường độ tín hiệu tại công suất cao tần lớn nhất có thể là 1400W và biểu diễn sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo phổ các đồng vị của Zn vào lưu lượng khí mang NGF thay đổi từ 0,7 – 1,0 L/phút ở thế thế thấu kính là 9V thì tất cả đều cho thấy giá trị cường độ tín hệu phép đo lớn nhất khi NFG là 1,0L/phút (hình 3.7). Do vậy, chúng tôi chọn 3 điều kiện này để phân tích các đồng vị 64Zn, 67Zn và 70Zn. Còn với hai đồng vị 66Zn và 68Zn thì chỉ cần chọn các điều kiện phân tích là NGF = 0,6L/ph, RFP = 1400W và LV = 9V (hình 3.6).

30

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

3.1.1.4.Lựa chọn tham số tối ƣu cho chế độ làm việc của Plasma

Mối tương quan giữa cường độ tín hiệu của phép đo vào các tham số như

công suất cao tần (RFP), lưu lượng khí mang mẫu (NGF) và thế thấu kính (LV)

khi hai trong ba tham số trên được ấn định (cùng với tốc độ nhu động (PR) được

ấn định từ trước) và tham số còn lại biến thiên. Thông thường khi máy đo được

vận hành ở chế độ tự động (autotune) máy đã tự động tìm ra các thông số tối ưu.

Tuy nhiên, các tham số này được tối ưu hóa cho việc đo một khoảng rộng các số

khối, còn trong quá trình đo ở khoảng số khối hẹp việc khảo sát các tham số

hoạt động của plasma vẫn có ý nghĩa cần thiết để tăng cường độ tín hiệu của

phép đo. Theo các kết quả đã khảo sát như trên ta có lựa chọn tham số hoạt động của plasma tối ưu khi xác định các đồng vị 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn bằng máy

ICP – MS elan 9000 như đã liệt kê trong bảng 2.1, trong đó các điều kiện đo khác nhau chỉ gồm: với phép đo đồng vị 66Zn, 68Zn thì tốc độ khí nelbulizer là

0,9 L/phút và công suất máy phát cao tần là 1200W trong khi với phép đo các đồng vị 64Zn 67Zn 70Zn thì hai chỉ số trên lần lượt là 0,6 L/phút và 1400 W.

3.1.2. Ảnh hƣởng của loại axit và nồng độ axit

Trong phương pháp phân tích ICP – MS, có thể dùng môi trường axit

HNO3 hay HCl vì hai loại axit này dễ dàng hóa hơi, còn các axit khác như

H2SO4, H3PO4 thường không được dung vì axit này hóa hơi rất kém. Các yếu tố

của điều kiện môi trường phân tích như nước, khí mang argon và axit có thể tạo

thành các mảnh đa nguyên tử, gây nên việc xác định một số đồng vị khi số khối

m/z của chúng trùng nhau.

Với phép đo đồng vị kẽm có M/Z+ là 64, 66, 67, 68 và 70 thì trong các môi

trường khác nhau, ảnh hưởng mảnh ion đa nguyên tử cản trở đến phép đo có thể kể đến là : các mảnh 32S16O16O+ (nếu đo trong nền H2SO4), 48Ca16O+ nếu nền mẫu chứa nhiều thành phần khoáng, 31P18O2H+ (nều đo trong nền có axit photphoric. Các mảnh ion của đa nguyên tử này trùng với phép đo đồng vị 64Zn. Ngoài ra phép đo đồng vị 66Zn+ sẽ bị ảnh hưởng bởi mảnh 31P18O16OH+ [27].

Do vậy cần khảo sát bằng thực nghiệm về ảnh hưởng trực tiếp của nền mẫu

31

đối với phép đo các đồng vị kẽm, đặc biệt và hai đồng vị 64Zn và 66Zn+.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Đồng vị

Hình 3.8. Ảnh hưởng trực tiếp của nền mẫu đối với phép đo đồng vị kẽm

Từ hình 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu vào cường độ tín hiệu của phép đo Kẽm ta thấy được ảnh hưởng của Ca2+ nền axit H2SO4, HCl ,H3PO4 và HNO3 ảnh hưởng đến hai đồng vị và 66Zn đặc biệt là 64Zn còn các đồng vị 67Zn 68Zn 70Zn hầu như không ảnh hưởng Mặt khác, hầu hết các dung dịch chuẩn

được pha trong môi trường axit HNO3. Như vậy HNO3 được chọn làm môi

trường của dung dịch mẫu đo trong tất cả các thí nghiệm.

Để nghiên cứu sự phụ thuộc độ nhạy của phép đo vào nồng độ axit HNO3 của dung dịch mẫu, chuẩn bị dung dịch mẫu Zn trong môi trường axit HNO3 từ

0,5% đến 3% (đo ở các điều kiện tối ưu của plasma đã lựa chọn). kết quả được

32

biểu diễn ở Hình 3.9.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình 3.9. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu của phép đo Zn vào nồng độ axit

Từ kết quả ở hình 3.9. Cho thấy sự ảnh hưởng của nồng độ axit HNO3 của dung dịch mẫu đến cường độ tín hiệu của phép đo kẽm là không đáng kể trong

khoảng từ 0,5% đến 3%. Nhận thấy ở nồng độ axit HNO3 2% thì tín hiệu của tất cả các đồng vị là cao hơn so với các nồng độ khác và ổn định hơn, do đó môi

trường axit của dung dịch mẫu đo được chọn là HNO3 2%. Tổng hợp các điều kiện đo tối ưu lựa chọn được từ các nghiên cứu điều kiện tối

ưu thu được ở bản 3.2.

Bảng 3.2. Các tham số tối ưu của máy ICP – MS ELAN 9000

Các tham số

66Zn 68Zn

Tốc độ khí Nebulizer Điều kiện phân tích đồng vị 64Zn 67Zn 70Zn 0,6 L/phút 0,9 L/phút

Công suất máy phát cao tần (RFP) 1200W 1400W

Thế của các thế thấu kính (LV) 9Volts

Lưu lượng khí tạo plasma

Áp suất chân không (khi đo mẫu)

Áp suất chân không ( Standby)

Tốc độ bơm rửa (RP) 15,0 L/phút 1,0 -1,2. 10-5 Torr 2,0 – 3,0.10-6 Torr 48 vòng/phút

Tốc độ bơm mẫu (RP) 26 vòng/phút

Số lần quét khối 10 lần

Thời gian đo cho 1 lần 5,8 giây

33

Số lần đo lặp 3 lần

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích các đồng vị kẽm trong mẫu sinh học 3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn xác định các đồng vị kẽm

Trong phương pháp ICP – MS, tín hiệu của phép đo (CPS) có thể thay đổi trong khoảng giá trị rất lớn nên khoảng tuyến tính của phép đo rất rộng (từ vài ppb đến vài chục hay vài trăm ppm).

Trong luận văn, chúng tôi không khảo sát giới hạn tuyến tính của phép đo mà chỉ tiến hành xây dựng đường chuẩn để phân tích các đồng vị kẽm và tìm giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) khi phân tích từng đồng vị dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng thiết bị và hệ số góc của các phương trình hồi qui của đường chuẩn.

Đường chuẩn xác định các đồng vị 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn được thiết lập với 4 điểm tương ứng với các nồng độ của dung dịch chuẩn Zn2+ 10 ppb; 100 ppb; 200 ppb; 400ppb khi phân tích 5 đồng vị. Nồng độ các đồng vị tương ứng như ở bảng 3.2. Tiến hành đo với các dung dịch chuẩn theo điều kiện tối ưu đã khảo sát. Đồ thị đường chuẩn xác định các đồng vị từ hình 3.10 đến 3.14.

Nồng độ 66Zn (ppb) Nồng độ 64Zn (ppb) Nồng độ 68Zn (ppb) Nồng độ 67Zn (ppb) Nồng độ 70Zn (ppb)

Bảng 3.2. Nồng độ dung dịch chuẩn và nồng độ tương ứng của các đồng vị. Dung dịch chuẩn Zn2+ (ppb) 10 100 200 400 1,875 18,75 37,50 75,00 3,41 34,1 68,2 136,4 4,86 48,6 97,2 194,4 2,79 27,9 55,8 111,6 1,02 10,2 20,4 40,8

34

Hình 3.10. Đường chuẩn phân tích đồng vị 64Zn

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình 3.11. Đường chuẩn phân tích đồng vị 66Zn Hình 3.13. Đường chuẩn phân tích đồng vị 68Zn

Hình 3.12. Đường chuẩn phân tích đồng vị 67Zn

Hình 3.14. Đường chuẩn phân tích đồng vị 70Zn

Từ các đồ thị đường chuẩn, dùng phương pháp bình phương tối thiểu, các

phương trình hồi qui biểu thị đường chuẩn của 5 đồng vị kẽm như bảng 3.3.

35

Các phương trình đường chuẩn đều có hệ số tương quan tuyến tính tốt. Mặc dù vậy đường chuẩn xác định ba đồng vị 67Zn, 68Zn và 70Zn vẫn bị mắc sai số hệ thống. Điều này có thể do phần trăm tồn tại của 3 đồng vị này trong tự nhiên thấp. Do vậy nếu phép phân tích hướng tới chỉ xác định 3 đồng vị này thì cần tăng khoảng nồng độ để xây dựng đường chuẩn và phải nhân hệ số hiệu chỉnh khi phân tích mẫu thực tế.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Bảng 3.3. Phương trình đường chuẩn của các đồng vị kẽm

64Zn

STT Đồng vị Phƣơng trình đƣờng chuẩn Y = a + bX R2

66Zn

y = 19,70x - 10,28 0,9999 1

67Zn

y = 6,613x - 16,42 0,9995 2

68Zn

y = 0,524x + 0,533 0,9998 3

y = 0,233x + 1,189 0,9998 4

70Zn

5 y = 2,167x + 0,286 0,9991

Trong đó: y là số đếm/giây (CPS); X là nồng độ mỗi đồng vị (ppb).

3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của thiết bị ICP- MS

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đo được xác định dựa trên tín hiệu mẫu nền là dung dịch HNO 2% khi phân tích ở điều kiện đo các đồng vị khác nhau. Tính toán LOD và LOQ theo các công thức đưa ra ở chương 2. Kết thu được ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các đồng vị

Các đồng vị LOD (ppb) LOQ (ppb)

Hệ số góc phương trình hồi qui (b) Độ lệch chuẩn mẫu nền (Sbl)

10,3 3,10 19,7 20,356

11,7 3,51 7,737 6,613

0,97 0,169 0,524 3,22

0,315 0,233 4,05 13,5

64Zn 66Zn 67Zn 68Zn 70Zn Với LOQ xác định được cần pha lại dãy dung dịch chuẩn sao cho nồng độ thấp nhất là LOQ. Với đường chuẩn để phân tích 2 đồng vị kẽm là 64Zn và 66Zn, phép đo không có sai số hệ thống nên không cần dựng lại đường chuẩn mà có thể sử dụng phương trình hồi qui tìm được. Riêng phép xác định 3 đồng vị kẽm là 67Zn, 68Zn và 70Zn vì điểm đầu của đường chuẩn rất nhỏ so với LOQ nên đường chuẩn sẽ được xây dựng lại với nồng độ thấp nhất là LOQ của phép đo.

36

2,167 0,202 0,28 0,95

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Với tính toán tỷ lệ % các đồng vị, chúng tôi xây dựng lại đường chuẩn xác định 67Zn và 68Zn với nồng độ ban đầu của dung dịch chuẩn Zn là 80 ppb còn với phép xác định 70Zn thì nồng độ thấp nhất của dung dịch kẽm là 130 ppb. 3.2.3. Đánh giá độ chính xác của phép xác định các đồng vị

Để kiểm tra tính ổn định và độ đúng của thiết bị đo, chúng tôi sử dụng hai dung dịch chuẩn Zn2+ có chứa đồng thời các đồng vị kẽm cần xác định có các nồng độ ở khoảng đầu và cuối của đường chuẩn để kiểm tra độ đúng và tính đồng nhất về độ chụm của phép đo (thông qua độ lệch chuẩn tương đối) trên thiết bị ICP-MS.

Sử dụng các điều kiện tối ưu đã chọn và dùng đường chuẩn các đồng vị đã thiết lập được để tìm lại nồng độ các đồng vị kẽm trong dung dịch chuẩn kiểm tra. Kết quả thu được ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Độ chính xác của phép đo ICP-MS để xác định các đồng vị kẽm trong dung dịch chuẩn kiểm tra

Er (%)

Đồng vị

RSD (%)

Nồng độ dung dịch chuẩn Zn2+

Nồng độ đồng vị kẽm trong dung dịch chuẩn (ppb) 48,6

Nồng độ đồng vị kẽm xác định đƣợc (ppb) 47,8

100 -1,65 0,28

64Zn

400 194 -0,34 0,07 194

100 27,9 -1,30 0,02 27,5

66Zn

400 112 + 0,73 0,01 112

100 4,10 -1,65 0,01 4,03

67Zn

400 16,4 -0,15 0,00 16,4

100 18,8 -3,96 0,02 18,0

68Zn

400 75,0 5,64 0,00 79,2

100 0,72 -0,56 0,04 0,72

70Zn

400 2,88 -0,05 0,01 2,88

37

Kết quả cho thấy các mức nồng độ khác nhau đều có độ lệch chuẩn tương đối nhỏ và không khác nhau nhiều chứng tỏ có độ chụm như nhau. Sai số hệ tương đối giữa nồng độ trong dung dịch chuẩn ban đầu và nồng độ tìm lại được là rất nhỏ, chứng tỏ phép đo đáp ứng được yêu cầu về độ chính xác khi phân tích lượng vết.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

3.2.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch mẫu và phân tích 3.2.4.1. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch trên cột chiết pha rắn

Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch trên cột chiết pha rắn

Nồng độ dung dịch Zn2+ 0 (ppb) 25 (ppb) 50 (ppb) 100 (ppb)

Nồng độ 0 12,16 24,32 48,63

0 6,98 13,95 27,90

0 1,03 2,05 4,10

64Zn 66Zn 67Zn 68Zn

70Zn

đồng vị Zn2+ trong dung dịch 0 4,69 9,38 18,75 chuẩn

0 0,18 0,36 0,72 ( )

KPH 11,87 23,71 48,08 Nồng độ

KPH 6,72 13,61 27,44

KPH 0,96 1,92 3,91

đồng vị Zn2+ xác định được KPH 4,51 9,05 18,33

( ) KPH 0,16 0,326 0,664

- 96,35 97,55 98,37

- 96,15 96,58 97,75 Hiệu suất

thu hồi - 97,57 97,52 98,87

64Zn 66Zn 67Zn 68Zn 70Zn 64Zn 66Zn 67Zn 68Zn 70Zn

(%) - 93,47 93,59 95,42

- 90,13 90,68 92,21

Tổng nồng độ 5 đồng vị

xác định theo ICP – MS KPH 24,21 48,62 98,43

( )

Tổng nồng độ kẽm xác

định theo AAS KPH 23,70 47,60 96,36

( )

Để đánh giá hiệu suất thu hồi của bước làm sạch mẫu phân tích có chứa

38

kẽm mà không qua quá trình xử lý mẫu, thí nghiệm được tiến hành bằng cách

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

thêm 1ml dung dịch chuẩn kẽm với các nồng độ 25ppb, 50ppb, 100ppb đi qua

cột chiết pha rắn đã chuẩn bị ở chương 2, tiến hành các bước tiếp theo tương tự

như xử lý mẫu và xác định lại nồng độ các đồng vị có trong dung dịch chuẩn

trước khi qua cột chiết. Kết quả thu được ở bảng 3.6.

Từ số liệu ở Bảng 3.6 cho thấy kết quả xác định hiệu suất thu hồi của quá

trình làm sạch cột đạt hiệu suất thu hồi rất tốt, chứng tỏ sự mất kẽm khi qua cột

chiết là không đáng kể. Tổng hàm lượng của 5 đồng vị kẽm xác định lại được

trong dung dịch ban đầu theo phương pháp ICP-MS cũng phù hợp với phương

pháp AAS, tuy thấp hơn nồng độ trong dung dịch ban đầu nhưng sai số phép đo

chấp nhận được.

3.2.4.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu

Mẫu phân của một đối tượng nghiên cứu bất kỳ được tiến hành xử lý theo quy trình ở chương 2. Cân 0,684 gam mẫu phân và xác định khối lượng các đồng vị kẽm trong mẫu dựa trên đường chuẩn của từng đồng vị theo phương pháp ICP-MS và tổng hàm lượng kẽm được xác định theo AAS.

Hiệu suất thu hồi của toàn bộ quá trình xử lý mẫu được xác định bằng cách thêm 1ml dung dịch chuẩn kẽm với các nồng độ (20ppm, 50ppm, 100ppm) vào cùng khối lượng của mẫu phân này sau đó tiến hành phân hủy mẫu, làm sạch mẫu trên cột chiết pha rắn và xác định hàm lượng của mỗi đồng vị. Kết quả thu được ở bảng 3.7 (sau khi đã nhân hệ số pha loãng).

Kết quả cũng cho thấy, tổng hàm lượng 5 đồng vị kẽm xác định theo phương pháp ICP-MS phù hợp với tổng khối lượng của kẽm xác định theo AAS kể cả mẫu ban đầu và mẫu sau khi thêm những lượng khác nhau chứng tỏ hiệu suất thu hồi về tổng hàm lượng kẽm và độ chính xác của phép đo tốt. Hiệu suất thu hồi khi phân tích từng dạng đồng vị kẽm cũng đạt từ 90,93% đến 98,54%, điều này chứng tỏ rằng việc phá mẫu và xử lý mẫu phân tích theo qui trình này không làm mất kẽm.

39

Tiến hành tương tự với mẫu huyết tương và nước tiểu của bệnh nhân đã được uống viên kẽm . Mẫu ban đầu cũng được xử lý theo quy trình ở chương 2, sau đó thêm các lượng Zn2+ khác nhau vào mẫu huyết tương và nước tiểu, tiến hành phân hủy mẫu và xác định lại hàm lượng của các đồng vị thêm vào. Kết quả thu được ở bảng 3.8 và 3.9 cho thấy quy trình phá mẫu cho hiệu suất thu hồi tốt, đạt trên 90%, việc mất mẫu trong quá trình xử lý là không đáng kể.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

40

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

41

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

42

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

3.2.5. Phân tích mẫu thực tế 3.2.5.1. Phân tích đồng vị Zn2+ trong viên thuốc (Viên kẽm)

Mẫu thuốc là viên kẽm được tiến hành xử lý như mục 2.3.2.4 rồi đem xác định hàm lượng của các đồng vị Zn2+ theo phương pháp ICP – MS và xác định tổng hàm lượng kẽm theo phương pháp F-AAS. Kết quả thu được ở Bảng 3.10.

Bảng 3.10. Hàm lượng kẽm trong viên thuốc (n=3)

68Zn

70Zn

64Zn

Hàm lượng các đồng vị Zn2+ 67Zn 66Zn

0,3033

Lượng mẫu thuốc cân (g) (tương ứng 1 viên thuốc)

1,914 0,284 1,352 0,049 3,793

 0,008  0,007  0,005  0,004  0,005 Khối lượng mỗi đồng vị xác định được theo ICP – MS (mg)

6,827  0,005

Hàm lượng Zn2+ xác định được theo F- AAS (mg)

3,319 1,904 0,280 1,280 0,049

Hàm lượng các đồng vị ( tính theo % đồng vị) từ kết quả đo theo F-AAS (mg)

1,77 0,52 1,47 5,32 -0,71

Sai số tương đối (%) giữa kết quả xác định đồng vị theo ICP-MS và tính từ % đồng vị theo AAS.

43

Với lượng mẫu thuốc lấy tương ứng một viên thuốc, thì tổng khối lượng kẽm trong 1 viên thuốc khoảng 6,8 gam. Sai số tương đối tính từ kết quả xác định các đồng vị theo ICP--MS và kết quả đồng vị tính từ phần trăm khối lượng tồn tại các đồng vị bền trong tự nhiên với tổng khối lượng các đồng vị xác định theo phương pháp AAS là không đáng kể (dưới 6%), chứng tỏ

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

phương pháp xác định hàm lượng các đồng vị kẽm trong mẫu thuốc có độ chính xác chấp nhận được.

3.2.5.2. Phân tích các đồng vị Zn trong mẫu phân, huyết tƣơng và nƣớc tiểu

Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung viên kẽm đến hiệu quả điều trị bệnh lao trên bệnh nhân nhi, việc xác định tỷ lệ của các cặp đồng vị 67Zn/66Zn, 68Zn/66Zn và 70Zn/66Zn rất cho quan trọng, nó sẽ cho biết mức độ hấp thu và đào thải các đồng vị kẽm có liên quan đến tiến triển trong điều trị bệnh. Với phương pháp phân tích đã xây dựng được, tiến hành xử lý mẫu phân, nước tiểu và huyết tương của bốn đối tượng ở ba độ tuổi khác nhau đã được bổ sung kẽm. Kết quả xác định tỷ lệ của các đồng vị 67Zn/66Zn, 68Zn/66Zn và 70Zn/66Zn trong mẫu phân, huyết tương và nước tiểu thu được ở bảng 3.11 đến bảng 3.13.

44

Các số liệu phân tích về tỷ lệ đồng vị sẽ được đề tài nghiên cứu “Vai trò của kẽm trong điều trị bệnh lao ở trẻ em” sử dụng để phân tích và biện luận, đánh giá hiệu quả điều trị bệnh lao.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

45

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

46

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

47

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

48

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

49

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

50

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

51

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

52

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

53

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

KẾT LUẬN

Với mục đích nghiên cứu của luận văn “Xác định đồng vị kẽm trong mẫu sinh hóa bằng phương pháp khối phổ cao tần cảm ứng plasma ICP-MS” là nhằm xây dựng qui trình phân tích các đồng vị bền của kẽm bằng phương pháp ICP-MS, trong các đối tượng sinh học gồm mẫu huyết tương, nước tiểu và phân thu thập từ các bệnh nhân nhi đang điều trị lao được uống bổ sung viên kẽm hoặc tiêm tăng cường hiệu quả điều trị lao theo phác đồ khuyến cáo của WHO đối với trẻ em Việt Nam, luận văn đã thu được các kết quả sau như sau:

- Khảo sát điều kiện tối ưu khi xác định năm đồng vị kẽm 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn và 70Zn trên máy ICP-MS. Luận văn đã xác định được điều kiện tối ưu để phân tích các đồng vị 66Zn và 68Zn là NGF = 0,6L/ph, RFP = 1400W trong khi hai thông số này khi phân tích 64Zn, 67Zn và 70Zn là NGF = 0,9L/ph, RFP = 1400W. Thế thấu kính ion đều là 9V, các điều kiện đo khác chung cho cả 5 loại đồng vị và được chọn theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

- Đã khảo sát ảnh hưởng của các nền mẫu axit khác nhau và nhận thấy nền axit HNO3 là nền mẫu tốt nhất, giảm được ảnh hưởng trùng khối của các mảnh đa nguyên tử.

- Đã đánh giá các thông số đặc trưng của phương pháp như giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ, độ chính xác của phép đo 5 đồng vị 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn và 70Zn bằng thiết bị ICP-MS. Kết quả cho thấy đồng vị 70Zn có % tồn tại trong tự nhiên thấp, độ nhạy phép đo thấp nên khó phát hiện được trong mẫu. Sai số tương đối đáp ứng được yêu cầu phân tích vết.

- Nghiên cứu đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu huyết tương, nước tiểu và phân và hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích các đồng vị kẽm trên nền mẫu thực kết quả cho thấy:

54

- Với mẫu phân, tổng hàm lượng 5 đồng vị kẽm xác định theo phương pháp ICP-MS phù hợp với tổng khối lượng của kẽm xác định theo AAS kể cả mẫu ban đầu và mẫu sau khi thêm những lượng khác nhau chứng tỏ hiệu suất thu hồi về tổng hàm lượng kẽm và độ chính xác của phép đo tốt. Hiệu suất thu hồi khi phân tích từng dạng đồng vị kẽm cũng đạt từ

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

90,93% đến 98,54%, điều này chứng tỏ rằng việc phá mẫu và xử lý mẫu phân tích theo qui trình này không làm mất kẽm.

- Tương tự với mẫu huyết tương và nước tiểu quy trình phá mẫu cho hiệu suất thu hồi tốt, đạt trên 90%, việc mất mẫu trong quá trình xử lý là không đáng kể.

Đã ứng dụng qui trình phân tích xây dựng được để phân tích thành phần đồng vị kẽm trong các mẫu thực tế trong 200 mẫu phân, mẫu huyết tương và mẫu nước tiểu của các đối tượng khác nhau phục vụ đề tài nghiên cứu “Vai trò

55

của kẽm trong điều trị bệnh lao ở trẻ em”.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Phạm Luận (2013), Phương pháp phân tích phổ nguyên tử, Nhà xuất

2. Nguyễn Đình Triệu (2001), các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý,

bản Bách khoa Hà Nội.

3. Lê Hồng Minh, (2012), nghiên cứu xác định thành phần đồng vị của một số nguyên tố có ứng dụng trong địa chất bằng ICP-MS, luận án tiến sỹ hóa học, Viện năng lượng nguyên tử Việt Nam.

4. Nguyễn Thị Kim Tại, (2013), nghiên cứu phương pháp phân tích tỷ lệ đồng vị 87Sr/86Sr và một số nguyên tố vi lượng trong cây thuốc, gạo và đất nhằm xác định nguồn gốc định cư của chúng, Luận án tiến sỹ hóa học, Viện năng lượng nguyên tử Việt Nam

Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật

5. Alaa S. Amin, (2011), Utility of solid-phase spectrophotometry to determine trace amounts of zinc in environmental and biological samples. Analytical Biochemistry 418;172–179

6. Bogden JD, Lintz DI, Joselow MM, Charles J, Salaki JS, (1977), Effect of pulmonary tuberculosis on blood concentrations of copper and zinc. Am J Clin Pathol;67:251-6

7. Büchl A, Archer C, Brown DR, Hawkesworth CJ, Leighton E, Ragnardottir KV, Vance D, (2004), Geochim Cosmochim Acta 68: A528

8. Charles Coudray, Christine Feillet-Coudray, Mathieu Rambeau, Jean Claude Tressol, Elyett Gueux, Andrzej Mazur, Yves Rayssiguier, (2006), The effect of aging on intestinal absorption and status of calcium, magnesium, zinc, and copper in rats: A stable isotope study. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 20:73–8

56

TIẾNG ANH

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

9. Chloe Nadia Marechal , Philippe Telouk, (2000), Francis Albarede Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma- source mass spectrometry. Chemical Geology 156:251–273

10. Chloe Nadia Marechal, Philippe Telouk, (1999), Francis Albarede Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma- source mass spectrometry. Chemical Geology 156:251–273

11. Ciro Texeira correia et al, (1997), “Rb – Sr and Sm – Nd geochronology of the cana Brava layered mafic-ultramafic instruction, Brazil, and consideration regarding its tectonic evolution”, Revista Brasileira de Geociencias, Vol.27, pp.163- 168

12. Christophe Cloquet, Jean Carignan, Moritz F. Lehmann, Frank Vanhaecke, (2008), Variation in the isotopic composition of zinc in the natural environment and the use of zinc isotopes in biogeosciences: a review. Anal Bioanal Chem 390:451–463

13. Dye C, Scheele S, Dolin P, Pathania V, Raviglione MC, (1999), Consensus statement. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project. Jama;282:677-86

14. Haider BA, Bhutta ZA, (2009), The effect of therapeutic zinc supplementation among young children with selected infections: a review of the evidence. Food Nutr Bull;30:S41-59

15. Hambidge, K. M. and Krebs, N. F, (2007), “Zinc deficiency: a special

16. Heymsfield SB, McManus C, Smith J, Stevens V, Nixon DW, (1982), Anthropometric measurement of muscle mass: revised equations for calculating bone-free arm muscle area. Am J Clin Nutr;36:680-90

17. Huong NT, Duong BD, Co NV, et al, (2005), Establishment and development of the National Tuberculosis Control Programme in Vietnam. Int J Tuberc Lung Dis;9:151-6

18. Karyadi E, West CE, Schultink W, et al, (2002), A double-blind, placebo-controlled study of vitamin A and zinc supplementation in

57

challenge”. J. Nutr. 137 (4): 1101.

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

19. Krlstme Y Patterson and Claude Velllon, (1992), Determination of zinc stable isotopes in biological materials using isotope dilution inductively coupled plasma mass spectrometry. Anulytlca Chunrca Acta, 258: 317-324

20. Lieve I. L. Balcaen, Karel A. C. De Schamphelaere, Colin R. Janssen, Luc Moens, Frank Vanhaecke, (2008), Development of a method for assessing the relative contribution of waterborne and dietary exposure to zinc bioaccumulation in Daphnia magnaby using isotopically enriched tracers and ICP–MS detection. Anal Bioanal Chem 390:555–569

21. Maggini S, Wintergerst ES, Beveridge S, Hornig DH, (2007), Selected vitamins and trace elements support immune function by strengthening epithelial barriers and cellular and humoral immune responses. Br J Nutr;98 Suppl 1:S29-35

22. Manary MJ, Hotz C, Krebs NF, et al. Dietary phytate reduction improves zinc absorption in Malawian children recovering from tuberculosis but not in well children. J Nutr 2000;130:2959-64

23. Mandalakas AM, Starke JR, (2005), Current Concepts of Childhood

persons with tuberculosis in Indonesia: effects on clinical response and nutritional status. Am J Clin Nutr;75:720-7

24. Marechal CN, Telouk P, Albarede F, (1999), Chem Geol 156:251–273

25. Masaharu Tanimizu, Yoshiki Sohrin, Takafumi Hirata, (2013), Heavy element stable isotope ratios : analytical approaches and applications. Anal Bioanal Chem 405:2771–2783

26. Mohan G, Kulshreshtha S, Sharma P, (2006), Zinc and copper in Indian patients of tuberculosis: impact on antitubercular therapy. Biol Trace Elem Res;111:63-9

27. Nancy F. Krebs, Leland V. Miller, Vernon L. Naake, Sian Lei, Jamie E. Westcott, Paul V. Fennessey, and K. Michael Hambidge, (1995), The use of stable isotope techniques to assess zinc metabolism. J. Nub-. Biochem.vol.6, 292-301

58

Tuberculosis. Semin Pediatr Infect Dis;17:93-104

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

28. Oto Mestek, Jana Komı´nkova, Richard Koplık, Miloslav Suchanek, (2001), Determination of zinc in plant samples by isotope dilution inductively coupled plasma mass spectrometry.Talanta, 54(5), 927-34

29. Prasad, A. S, (2003), “Zinc deficiency: Has been known of for 40 years but ignored by global health organisations”. British Medical Journal 326 (7386): 409

30. Aggett Iron, copper, and zinc absorption and turnover, (1997), the use of

31. Ray M, Kumar L, Prasad R, (1998). Plasma zinc status in Indian childhood tuberculosis: impact of antituberculosis therapy. Int J Tuberc Lung Dis;2:719-25

32. Rober Thomas, 2004, Practical guide to ICP-MS. Marcel Dekker

33. Robert E. Serfass, Joseph J. Thompson and R.S. Houk, (1986). Isotope ratio determination by inductive coupled plasma/mass spectrometry for zince bioavalability studies. Analytica Chimica Acta, 188 73-84

34. Ruth E. Wolf, Andrew S.Todd; , Steve Brinkman , Paul J. Lamothe; Kathleen S. Smith, James F. Ranville. Measurement of total Zn and Zn isotope ratios by quadrupole ICP-MS for evaluation of Zn uptake in gills of brown trout (Salmo trutta) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Talanta80 676–684.

35. Tim Arnold, Maria Schönbächler, Mark Rehkämper, Schuofei Dong, Fang-Jie Zhao, Guy J. D. Kirk, Barry J. Coles, Dominik J. Weiss, (2010). Measurement of zinc stable isotope ratios in biogeochemical matrices by double-spike MC-ICPMS and determination of the isotope ratio pool available for plants from soil. Anal Bioanal Chem 398:3115– 3125

36. Wolfgang Mareta, Harold H. Sandstead, (2006), Zinc requirements and the risks and benefits of zinc supplementation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 20. 3–18

59

stable isotopes. Eur J Pediatr 156, :S29–S34

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P1.6. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64Zn vào RFP (NGF = 0,8 L/ph)

Hình P1.7. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66Zn vào RFP (NGF = 0,8 L/ph) 60

PHỤ LỤC

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P1.8. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67Zn vào RFP (NGF = 0,8 L/ph)

Hình P1.9. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào RFP (NGF = 0,8 L/ph) 61

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P1.10. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70Zn vào RFP (NGF = 0,8 L/ph)

62

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Mạnh Hà Hình P1.11. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64Zn vào RFP (NGF = 0,9 L/ph)

Hình P1.12. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66Zn vào RFP (NGF = 0,9 L/ph)

63

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P1.13. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67Zn vào RFP (NGF = 0,9 L/ph)

Hình P1.14. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào RFP (NGF = 0,9 L/ph)

64

Nguyễn Mạnh Hà

Luận văn thạc sĩ khoa học Hình P1.15. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70Zn vào RFP (NGF = 0,9 L/ph)

Hình P1.16. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64Zn vào RFP (NGF = 1,0 L/ph)

Hình P1.17. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66Zn vào RFP (NGF = 1,0 L/ph) 65

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P1.18. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67Zn vào RFP (NGF = 1,0 L/ph)

Hình P1.19. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào RFP (NGF = 1,0 L/ph)

66

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P1.20. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70Zn vào RFP (NGF = 1,0 L/ph)

Hình P.2.1. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 66Zn vào NGF (LV= 9Volts) 67

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P.2.2. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 68Zn vào NGF (LV= 9Volts)

Hình P.2.3. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 64Zn vào NGF (LV= 9Volts) 68

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

Hình P.2.4. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 67Zn vào NGF (LV= 9Volts

Hình P.2.5. Sự phụ thuộc cường độ tín hiệu phép đo 70Zn vào NGF (LV= 9Volts)

69

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Mạnh Hà

70