ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
VŨ HOÀI SƠN
XÂY DỰNG MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum)
Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên, 4- 2016
i LỜI CAM ĐOAN
ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác.
Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016
Tác giả
Vũ Hoài Sơn
ii LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới
Tác giả
Vũ Hoài Sơn
iii MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục từ và chữ viết tắt ............................................................................. iv
Danh mục bảng.................................................................................................. v
Danh mục hình ................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
...................................................................................................... 1
...................................................................................... 2
..................................................................................... 2
...................................................... 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY
GIẢO CỔ LAM ................................................................................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm sinh thái học ............................................................................ 4
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG ............................. 4
1.2.1. Thành phần hóa học ................................................................................ 4
............................................................. 6
1.3. DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK ................................. 7
1.3.1. DNA lục lạp ............................................................................................ 7
iv 1.3.2. Mã vạch DNA (DNA barcoding) .......................................................... 10
1.3.3. Gen matK............................................................................................... 16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 22
........ 22
.................................................................................................. 22
............................................................................... 22
............................................................................. 22
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 22
.................. 22
2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ....................................................... 23
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27
...... 27
3.1.1. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Chợ Đồn, Bắc Kạn ........ 27
3.1.2. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Ngọc Đƣờng, Hà Giang 28
.............................................................................. 30
3.1.4. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Sapa, Lào Cai ........... 31
matK . 32
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây Giảo cổ lam ..................................... 32
3.2.2. Kết quả nhân gen matK bằng phản ứng PCR ....................................... 33
matK
.............................................................................. 34
matK .................................... 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 45
iv DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide
Cs: Cộ
DNA: Deoxyribonucleic acid
EDTA: Ethylenediamine tetraacetate
matK:
PCR: Polymerase chain reaction (
RNA: Ribonucleic acid
TAE: - –
v
DANH MỤC BẢNG
Trang
................... 25
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK ................................... 25
–SP. ........................................................... 37
.......................................... 39
......................................................................... 40
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của
các mẫu Giảo cổ lam. ...................................................................................... 40
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn
của các mẫu Giảo cổ lam. ............................................................................... 42
vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Đồn, Bắc Kạn. ................................................................................................. 27
H
.......................................................................... 29
............................................................. 30
............................ 32 (A, D, F:
.......................... 33
– – – CD) ........ 33
................ 34
–
........................................................................................................ 36
cổ lam .............................................................................................................. 38
Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu Giảo cổ lam
................................................................... 41
................................................................. 42
1
MỞ ĐẦU
Đối với nƣớc ta dƣợc liệu có một vị trí quan trọng. Nƣớc ta nằm trong
vùng nhiệt đới, chịu ảnh hƣởng của gió mùa. Nhiệt độ trung bình hàng năm là
250C, độ ẩm khá cao tạo điều kiện thuận lợi cho cây cối phát triển. Diện tích
rừng chiếm 2/3 diện tích đất. Hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, cả nƣớc
có khoảng 20.000 loài trong đó có trên 1.000 loài cây thuốc. Về mặt kinh tế,
nhà nƣớc đã xếp cây thuốc vào loại cây công nghiệp cao cấp cần đƣợc phát
triển nhƣ những cây công nghiệp khác. Hàng năm công ty Dƣợc liệu cấp I và
cấp II và gần đây các công ty tƣ nhân đã biết khai thác nhiều mặt hàng dƣợc
liệu để xuất khẩu nhƣ giảo cổ lam, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu
hồi, quế, tràm…
cây , có thành phần hóa học chính là
flavonoid và saponin thành phần giống nhƣ nhân sâm
song hàm lƣợng saponin có trong giảo cổ lam lại nhiều gấp 3 – 4 lần so với
nhân sâm. Saponin đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dƣợc
phẩm trong việc sản xuất các loại thuốc có giá trị, trong số đó quan trọng nhất
là điều trị ung thƣ. Dù Giảo cổ lam không thể hoàn toàn thay thế nhân sâm,
song xét về một số phƣơng diện, hiệu quả mà giảo cổ lam mang lại còn tốt
hơn cả nhân sâm. Ở Việt Nam chủ yếu nghiên cứu, phân loại dựa trên hình
thái và nghiên cứu tác dụng dƣợc liệu của cây Giảo cổ lam.
Đến nay, các mẫu
hƣớng dẫn định danh có sẵn. Tuy nhiên, trong nhiều trƣờng hợp, mẫu vật
chƣa phát triển đầy đủ các đặc tính hình thái, hoặc chúng bị hƣ hỏng các bộ
phận ngoài, hoặc mẫu vật chết đã khiến quá trình nhận diện mẫu vật trở nên
2
khó khăn thậm chí là không thể. Trong những trƣờng hợp này mã vạch DNA
đã giúp giải quyết bài toán trên vì trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ một mẫu
mô
“Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam
(Gynostemma pentaphyllum)”.
matK
(Gynostemma pentaphyllum).
lam thu
phân tích gen matK
DNA
nucleotide matK.
matK
ban đ matK
3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY
GIẢO CỔ LAM
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Ở Việt Nam, năm 1997, Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện cây thất diệp
đảm trên núi Fansipan và đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định đúng là
loại Gynostemma pentaphyllum [122].
Gynostemma
pentaphyllum, :
Giới (regnum) Plantae,
Bộ (ordo) Cucurbitales,
Họ (familia) Cucurbitaceae,
Chi (genus) Gynostemma,
Loài (species) G. pentaphyllum.
Ở Việt Nam có ba loại giảo cổ lam là: (1) Giảo cổ lam ba lá (G.
Laxum), (2) Giảo cổ lam năm lá (G. Pentaphyllum), (3) Giảo cổ lam bảy lá
(G. Pubescens) [122].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Giảo cổ lam là một loài cây thảo có thân mảnh, cây thƣờng mọc leo
nhờ tua cuốn đơn ở nách lá. Lá cây Giảo cổ lam là lá kép hình chân vịt, mỗi lá
gồm 3 hoặc 5 hoặc 7 lá chét, mỗi lá chét có một cuống riêng, cuống chung dài
3 – 4 cm. Lá mọc cách trên thân, mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dƣới lá
có màu xanh lá cây, mép lá có răng cƣa, đầu lá nhọn. Cây có hoa nhỏ, màu
trắng, hình sao, ống bao hoa rất ngắn cánh hoa rời nhau, cao 2,5 mm bao phấn
4
dính thành đĩa, có 3 vòi nhuỵ, ra hoa từ tháng 7 – 9, có quả từ tháng 9 – 10.
Quả khô, tròn, to 5 – 9 mm, có màu đen, mỗi quả có từ 2 – 3 hạt khi chín màu
đỏ, kích thƣớc hạt khoảng 4 mm.
1.1.3. Đặc điểm sinh thái học
ự phân bố, Giảo cổ lam mọc tự nhiên ở độ cao 100 m – 3200 m tại
các cánh rừng và thung lũng trên núi, những nơi ẩm thấp nhƣ bên bờ suối,
trong các bụi cây, phân bố rộng rãi ở các quốc gia nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc,
Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanka, Lào, Myanmar, Việt Nam.
năm 1997, lần đầu tiên, Phạm Thanh Kỳ cùng các cộng sự
đã phát hiện một quần thể Giảo cổ lam mọc tự nhiên trên núi Fansipan (Lào
Cai) ở độ cao 1500m, sau đó đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học
chính xác. Hiện nay, giảo cổ lam đã đƣợc tìm thấy ở các tỉnh phía Bắc nhƣ
Cao Bằng, Thái Nguyên, Yên Bái, Hà Giang, Hòa Bình, Lào Cai…
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG
1.2.1. Thành phần hóa học
Từ thân, lá của các loài thuộc chi Gynostemma đã phân lập đƣợc một số
lớp chất nhƣ tecpenoit, tecpenoid – glycosit và flavonoid. Nghiên cứu hóa học
thực vật tiến hành trên cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) tại Bắc
Kạn đã thu đƣợc 3 hợp chất phytosterol, 2 hợp chất flavonoid và thu đƣợc 5
hợp chất sạch là: stigmasterol (GyH1); β-sitosterol (GyH2), 3,3’5-trihydroxy-
4’,7 dimethoxyflavon (GyE1); sigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glycopyranosis
(GyE2) và 3,5-dihydroxy-4’,7- dimethoxyflavon-3’-O-[α-L rhamnopyranosyl (1-
6)]-O-β-D-glycopyranosit (GyM1) [28].
Giảo cổ lam có chứa hơn 100 loại Saponin cấu trúc triterpen kiểu
dammaran, trong đó có nhiều loại có cấu trúc rất giống với Saponin có trong
5
Nhân sâm và Tam thất (vì vậy có tên Ngũ diệp sâm, Sâm nam). Nhóm
dammaran trong Saponin triterpenoid tetracylic có phần aglycon gồm 4 vòng
và 1 mạch nhánh. Phần đƣờng nối vào OH ở đầu C-3 hoặc nối vào nhóm –OH
của mạch nhánh.
Hình 1.1. Cấu trúc của saponin trong Giảo cổ lam [10]
Giảo cổ lam còn chứa nhiều flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và
có tác dụng chống lão hóa mạnh. Ngoài ra còn trong Giảo cổ lam còn có các
acid amin tan trong nƣớc, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Zn,
Fe, Se. Đã có nhiều nghiên cứu thử độc tính cấp, trƣờng diễn, bán trƣờng diễn
và xác định cây không có độc.
Các hoạt chất chiết xuất từ giảo cổ lam đã đƣợc thử nghiệm trên cả
động vật lẫn trên cơ thể ngƣời và các nhà khoa học đã có đƣợc các kết quả rất
đáng kinh ngạc. Giảo cổ lam có tác dụng ức chế tăng cholesteron 71% theo
phƣơng pháp ngoại sinh và 82,08% theo phƣơng pháp nội sinh, do đó, nó có
tác dụng giảm mỡ máu rất mạnh [122].
Còn rất nhiều thành phần khác nữa mà các nhà khoa học trong và ngoài
nƣớc đã nghiên cứu, chiết xuất, ứng dụng.
6
Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn [5]. Các thử nghiệm Giảo cổ lam trên
chuột và thỏ áu (Triglicerid và
Cholesterol). Giảo cổ lam làm tăng lực 214,2%, Giảo cổ lam bảo vệ tế bào
gan mạnh trƣớc sự tấn công của các chất độc và làm tăng tiết mật.
Các nhà khoa học đã thử nghiệm trên chuột bơi và nhận thấy tác dụng
tăng lực tới 214,2%. Với tác dụng tăng lực nhƣ trên, các vận động viên của
Trung Quốc và Nhật Bản thƣờng sử dụng giảo cổ lam trƣớc các cuộc thi đấu
và họ gọi loại cây này là Doping thiên nhiên [12]. Giảo cổ lam có tác dụng
bảo vệ tế bào gan rất mạnh trƣớc sự tấn công của các chất gây độc, làm tăng
tiết mật và làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào khi chiếu xạ hoặc gây độc tế
bào bằng hóa chất… [12].
Giảo cổ lam làm tăng đáp ứng miễn dịch của tế bào khi chiếu xạ tế bào
hay gây độc bằng hóa chất Cyclophosphamid.
Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, tăng cƣờng khả năng miễn
dịch và tính kháng [35].
Giảo cổ lam có tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột nhắt trắng. Trên
chuột đái tháo đƣờng di truyền, liều uống 500mg/kg làm hạ đƣờng huyết
22%, liều 1000mg/kg làm hạ tối đa 36%. Trong liệu pháp dung nạp glucose ở
chuột nhắt trắng, liều uống 1000mg/kg đã ức chế sự tăng đƣờng huyết tới
55% (sau 30 phút) và 63% (sau 60 phút) so với nhóm đối chứng. Giảo cổ lam
gây hạ đƣờng huyết yếu trên chuột bình thƣờng nhƣng lại có tác dụng khá
mạnh trên chuột có đƣờng huyết cao. Nhƣ vậy ngoài cơ chế làm tiết insulin,
Giảo cổ lam cũng có tác dụng làm tăng nhạy cảm của mô với insulin [30].
cân tƣơng đối mạnh do giảm lƣợng mỡ dƣ thừa tích lũy ở vùng bụng, đùi
và nội tạng thông qua tăng cƣờng chuyển hóa mỡ. Tuy nhiên, Giảo cổ
7
lam lại có tác dụng tăng cơ bắp nên chỉ có tác dụng giảm cân ở những
ngƣời béo.
Giảo cổ lam có tác dụng tăng lực co cơ đến 11,112 kg, cao hơn hẳn
Quercetin và Phylamin. Tác dụng này phù hợp với mục đích sử dụng Giảo cổ
lam để tăng lực cho các vận động viên thi đấu để nâng cao thành tích.
Sau 2 tháng sử dụng Giảo cổ lam, huyết áp của các bệnh nhân đã giảm
từ 113,765 xuống 97,868. Giảo cổ lam có tác dụng giảm mỡ trong máu tới
20%. Đặc biệt, Giảo cổ lam còn có tác dụng hạ Cholesterol trong máu tới
22%, [4].
Thử nghiệm lâm sàng cho thấy 100 bệnh nhân sử dụng Giảo cổ lam sau
2 tháng đã cải thiện tình trạng bệnh. Đối với các triệu chứng cơ năng khác
nhƣ đau đầu, thiếu máu não, đau tức ngực, choáng ngất đều đƣợc cải thiện rất
tốt sau khi sử dụng Giảo cổ lam.
Làm hạ mỡ máu, nhất là hạ Cholesterol toàn phần, ngăn ngừa xơ vữa
mạch máu, chống huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng
tim mạch, não. Chống lão hóa, giảm căng thẳng, mệt mỏi, giúp tăng sức
mạnh, tăng khả năng làm việc. Tăng cƣờng sự miễn dịch, ngăn ngừa sự hình
thành khối u. Giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, tăng cƣờng máu lên não, cải thiện
tình trạng giảm trí nhớ ở ngƣời già. Tăng cƣờng chức năng giải độc gan.
Từ những tác dụng lâm sàng và công dụng dƣợc liệu của Giảo cổ lam
đã khẳng định rằng đây là cây thuốc quý. Sử dụng Giảo cổ lam không những
nâng cao sức khỏe mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh cho con ngƣời.
1.3. DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK
1.3.1. DNA lục lạp
Không giống nhƣ động vật, ngoài gen nhân và ty thể (mtDNA),
thực vật còn có một gen bổ sung là gen lục lạp (cpDNA). DNA
nhân, lục lạp và ty thể đều đƣợc sử dụng trong phân tích phát sinh loài.
8
Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng gen và mỗi phƣơng pháp đƣợc áp
dụng phù hợp. Do tính phức tạp và lặp đi lặp lại, chỉ có một số gen thuộc
, nhƣ vùng 18S, 26S, vùng ITS...đƣợc sử dụng. Vùng 18s và
vùng 5,8S thƣờng đƣợc sử dụng để xác định mức dƣới họ cho đến loài;
vùng ITS và vùng 5S Spacer thƣờng đƣợc dùng để phân tích mức loài cho
đến mức dƣới loài.
gen ty thể phù hợp cho phân biệt ở mức loài vì chúng có đặc điểm
là cấu trúc, kích thƣớc, và trật tự gen thay đổi nhanh chóng. Gen cytochrome
B và vùng control thƣờng đƣợc sử dụng ở mức loài đến mức dƣới loài.
DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (chloroplast DNA), DNA lục lạp đƣợc
phát hiện đầu tiên vào năm 1962 và đƣợc công bố trình tự đầu tiên vào năm
1986 khi nhóm nghiên cứu Nhật Bản giải trình tự DNA lục lạp của thuốc lá
và cây địa tiền. Kể từ đó, hàng triệu DNA lục lạp đã đƣợc giải trình tự, nhƣng
chủ yếu là đại diện thực vật trên cạn và các loài tảo.
DNA lục lạp là DNA sợi đôi, có chiều dài khoảng 35 – 217 kb tùy từng
loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dài khoảng 115 – 165 kb.
DNA lục lạp có dạng vòng, kép, chiều dài khoảng 30 – 60 µm, khối lƣợng
khoảng 80 – 130 triệu dalton. Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 –
10000 bản sao cpDNA. Bộ gen của lục lạp gồm khoảng 100 gen, ở các loài
thực vật trên cạn, trình tự gen gần nhƣ là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại
RNA ribosome, 30 – 31 tRNA, 21 proteins ribosome và 4 tiểu đơn vị RNA
polymerase.
Các gen thuộc cpDNA có tính bảo thủ cao và có thể đƣợc chia thành 3
nhóm nhƣ sau:
Nhóm 1: là các gen mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang hợp nhƣ
phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB) cytochrome (petA, petB) ATP synthease
(atpA, atpB), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenase (ndhA, ndhB)
9
Nhóm 2: là có gen mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5), trnA
(trnH, trnK), RNA polymerase (rpoA, ropB) và các gen tiểu phần
ribosome (rps2, rps3).
Nhóm 3 là gồm các ORF khung đọc mở (chƣa rõ chức năng) và các gen
mã hóa protein nhƣ matK, cemA.
Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật
nhƣ: 16S, rbcL, atpß, ndhF, intron trnL và matK...trải rộng từ bộ cho đến mức
loài. Vùng 16S phù hợp ở mức độ bộ, trong khi rbcL, atpß, ndhF, phù hợp ở
mức độ bộ đến mức loài. Vùng intron trnL và matK có thể áp dụng trong một
biên độ rộng từ bộ cho đến dƣới loài. Trƣớc đây chúng thƣờng đƣợc sử dụng
từ mức họ cho đến mức loài; hiện nay chúng thƣờng đƣợc sử dụng từ mức họ
đến mức phụ loài. Vùng atpß – rbcL có thể đƣợc sử dụng từ mức chi đến mức
loài nhƣng chúng cũng đƣợc sử dụng từ mức chi đến mức phụ loài.
Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ đƣợc gọi là phần bảo thủ. Phần này
chứa một trình tự các nucleotide bền vững, khó bị các tác nhân vật lý, hóa học
tác động gây đột biến, do đó đoạn nucleotide đổi trong
quá trình tiến hóa. Vì vậy các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu, sử dụng
các đoạn gen này ở các loài thực vật khác nhau cho công nghệ mã vạch DNA,
qua đó phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen đó để xét mối quan hệ họ
hàng giữa các loài trong sinh giới hiện nay.
Có 7 vùng DNA gồm atpF – atpH, gen matK, gen rbcL, gen
ropB, ropC1, spacer psbK – psbI và spacer trnH – psbA đƣợc chọn ứng cử
viên làm mã vạch DNA cho thực vật trên đất liền; trong đó, có 4 vùng là các
phần gen mã hóa (gen matK, gen rbcL, gen rpoB và gen ropC1) và ba vùng
đệm không mã hóa cho protein (atpF – atpH, trnH – psbA và psbK – psbI).
10
Qua khảo sát chọn ra đƣợc 3 vùng là rbcL (dễ sử dụng nhƣng khó khăn
phân biệt); matK (khả năng phân biệt và mã hóa cao hơn, gần với CO1,
nhƣng phổ quát thấp) và trnH – psbA (có tính phổ quát, có khả năng phân
biệt nhƣng chiều dài hay thay đổi).
1.3.2. Mã vạch DNA (DNA barcoding)
Phƣơng pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã
xây dựng đƣợc một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói
riêng tƣơng đối đầy đủ và toàn diện. Phƣơng pháp phân loại này chủ yếu dựa
vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt
là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng gặp rất nhiều
khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển
(chƣa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với
điều kiện môi trƣờng, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tƣơng đồng ở
bậc phân loại thấp nhƣ loài và dƣới loài. Từ giữa những năm 1990, với sự
phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phƣơng pháp nghiên cứu mới
trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và đƣợc gọi là phƣơng pháp phân
loại học phân tử. Phƣơng pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen
(DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy
mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu, ngƣời ta có thể lựa chọn các gen (đoạn
DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen [33].
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario,
Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) nhƣ là một cách để xác
định loài. Mã vạch đƣợc sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ
gen. Một mã vạch DNA điển hình phải đáp ứng đƣợc các yêu cầu sau:
(i) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;
11
(ii) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;
(iii) Có khả năng phân biệt đồng thời đƣợc nhiều loài [19], [21].
1.3.2.2. Ứng dụng của mã vạch DNA
thái, mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu
cũng đƣợc ứng dụng tại hải quan nhằm hỗ trợ v
cả
chó đã đƣợc các cơ quan pháp y của nhiều quốc gia sử dụng nhằm hỗ trợ công
việc của họ [37].
mã vạch DNA trong kiểm soát tác nhân gây hại trong nông nghiệp
USD mỗi năm. Sử dụng
loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chƣơng trình
kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Cho đến này, về cơ bản đã hoàn thành
mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái trên thế giới và chuyển
giao thiết bị, công nghệ cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ
có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh. Kinh
doanh sản phẩm nông nghiệp sẽ đƣợc đẩy mạnh hơn và nhờ đó rút ngắn thời
gian, đạt kết quả trong việc đối phó với sâu bệnh [26].
12
mã vạch DNA trong xác định vật chủ trung gian gây bệnh
Mã vạch DNA cũng đƣợc sử dụng để nhận diện những vật chủ trung
gian gây bệnh. Các nhà khoa học những ngƣời mà không phải là nhà phân
loại học hoặc nghiên cứu về ký sinh trùng đã đẩy nhanh quá trình nhận diện
các loài mang bệnh lây truyền giữa ngƣời và động vật. Và để hiểu biết thêm
những bệnh truyền nhiễm cũng nhƣ phƣơng pháp điều trị đạt đƣợc hiệu quả
nhanh chóng. Mã vạch DNA cho những vật chủ gây bệnh đang đƣợc xây dựng
và phổ biến. Điều này cung cấp cho các tổ chức và các cơ quan y tế cộng đồng
các công cụ và phƣơng pháp hiệu quả để ngăn cản và hạn chế sự phát triển của
ruồi và diệt côn trùng [38].
mã vạch DNA trong bảo vệ loài nguy cấp
Một thực tế đáng báo động, đa dạng sinh học trên thế giới đang liên tục
giảm sút, trong đó nhiều loài có nguy cơ tiệt chủng. Không thể kiểm soát
đƣợc săn bắn ở một số vùng Châu Phi điều đó đã làm cho loài linh trƣởng
giảm 90% . Rất khó để phân biệt có phải thịt của những loài động vật hoang
dã quý hiếm hay không. Vì vậy, mã vạch DNA có thể giúp những cơ quan có
thẩm quyền chỉ ra thịt có nguồn gốc từ những loài nguy cấp, ngăn chặn săn
bắn bất hợp pháp và giúp bảo tồn sự đa dạng sinh học [36].
mã vạch DNA trong duy trì nguồn tài nguyên thiên nhiên
Mã vạch DNA ngoài việc giúp ngăn ngừa bệnh, kiểm soát hành vi săn
bắn trái phép những loài nguy cấp mà nó còn đƣợc ứng dụng trong nông
nghiệp và khai thác lâm nghiệp. Một số quốc gia có nền kinh tế phụ thuộc vào
nguồn tài nguyên đã phải đối mặt với việc khai thác quá mức nguồn tài
nguyên nông nghiệp, biển và lâm nghiệp gây ra sự suy giảm hoặc thậm chí
tuyệt chủng của nhiều loài. Để kiểm soát khai thác, nhà chức trách cần phải
13
thiết lập hệ thống quản lý một cách hiệu quả để kiểm soát kinh doanh các
sản phẩm nông nghiệp, biển và lâm nghiệp. Có ít nhất hai dự án về mã
vạch cho cá (Fish-BOL) và cây thân gỗ (Tree-BOL) nhằm thúc đẩy công
tác quản lý và bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên [41].
mã vạch DNA trong kiểm tra chất lượng nước
Cuộc sống của chúng ta phụ thuộc vào nƣớc. Hiện tại nƣớc ngọt trở
thành nguồn tài nguyên quý giá cần đƣợc bảo vệ ở mỗi quốc gia. Nguồn
nƣớc bị ô nhiễm cần đƣợc xác định để phòng ngừa và biện pháp xử lý. Một
vài sinh vật đơn giản trong nƣớc đƣợc xem là ô nhiễm (ví dụ nhƣ ấu trùng
của muỗi). Tuy nhiên, ô nhiễm càng cao thì càng khó khăn hơn trong việc
xác định các chỉ số ô nhiễm. Vì vậy, tại thời điểm này các nhà khoa học
đang cố gắng xây dựng thƣ viện mã vạch DNA cho những “chỉ số mập
mờ”. Điều này giúp cho cán bộ quản lý môi trƣờng tiêu chuẩn hóa lại các
chỉ số trong việc đánh giá nƣớc và thiết lập quy trình đáng giá tiêu chuẩn
nƣớc tốt hơn ở mỗi quốc gia [20].
Ứng dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu
Thực vật dùng làm thuốc thảo dƣợc luôn cần đƣợc xác định ở cấp độ
loài. Vì vậy, xác định chính xác là một bƣớc quan trọng để có thể đảm bảo về
chất lƣợng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính
của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng nhƣ bảo
vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của thị trƣờng thảo
dƣợc, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dƣợc thuốc cũng trở thành vấn đề toàn
cầu. Các nguyên liệu thảo dƣợc này có thể đƣợc thay thế bằng các loại thảo
mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả
mạo. Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dƣợc thƣờng là do:
14
(2) Những vật liệu có tên tƣơng tự nhau;
(3) Việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu
khác rẻ tiền hơn.
Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dƣợc làm
thuốc theo phƣơng pháp truyền thống nhƣ sự đánh giá cảm quan và phƣơng
pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có
nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy,
phƣơng pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến
hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dƣợc sử dụng phƣơng pháp mã vạch
DNA có thể bảo vệ ngƣời dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc
giả mạo, đặc biệt trong nhiều trƣờng hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Dƣới đây trình bày một số mã vạch DNA đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng
trong các cây dƣợc liệu.
Vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn RNA, nằm
giữa các RNA cấu trúc của ribosome thƣờng đƣợc dịch mã. Cấu trúc của ITS
gồm ITS1 và ITS2. Một lợi thế của ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt
(ITS1 và ITS2) đƣợc nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá bảo thủ,
trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức độ bộ và ngành. Do
đó các locus 5.8S có thể phục vụ nhƣ là một điểm neo liên kết quan trọng để
so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhận diện. Tiện ích của vùng bảo
thủ 5.8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữ liệu, đặc biệt là khi so sánh
một chuỗi không tƣơng đồng với kho trình tự.
Các gen DNA ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại đƣợc
sắp xếp theo thứ tự. Chúng đƣợc tìm thấy ở các vị trí nhiễm sắc thể đƣợc gọi
là các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions NORs) [32].
15
Các vùng ITS có độ dài 600 đến 700 bp là các vùng tiến hóa nhanh nên
có thể thay đổi về trình tự cũng nhƣ độ dài. Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo
thủ nên đƣợc sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS.
Số bản sao các đoạn lặp lại của rDNA lên tới 30 000 trong một tế bào.
Điều này làm cho ITS trở thành đối tƣợng lý thú cho nghiên cứu tiến hóa,
phát sinh loài [33] và đa dạng di truyền [24].
matK
xác định các loại thuốc thảo dƣợc "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum
palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex
Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội
bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thƣờng đƣợc sử dụng để
xác định các nguyên liệu thảo dƣợc ở những vị trí địa lý khác nhau.
Gen matK cùng với vùng đệm trnH - psbA đã đƣợc đề xuất làm DNA
barcoding cho nhóm thực vật có hoa. Kết quả sử dụng gen matK cho phân
loại đã thu đƣợc sự tƣơng đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị
bootstrap từ 92 – 100% [24], [29].
Vùng đệm trnH – psbA nằm trong hệ gen lục lạp. Vùng này có kích
thƣớc xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài
đã đƣợc nghiên cứu). Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài là
1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0.00% - 0.08%. Trình tự
trnH-psbA cng đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau
thuộc thực vật Hạt trần, dƣơng xỉ, rêu và rêu tản (liverwort).
trnH – psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và
tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL
và matK. Vì vậy, trnH – psbA đƣợc coi nhƣ 1 trình tự hữu ích để phân biệt
các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó đƣợc dùng để phân biệt loài giả
16
mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.) Lindl. ex. Hook.f.
(Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw với tỷ lệ sai khác trong
trình tự là từ 2% đến 3,1% [34].
rpoC1 Chiều dài trung bình
520 bp. Chức năng mã hóa cho enzyme RNA polymerase β – tiểu đơn vị [14].
Gen rbcL đƣợc sử dụng nhiều để xây dựng cây phát sinh loài. Tuy
nhiên đối với mối quan hệ di truyền ở mức dƣới loài thì sự phân tích gen này
gặp nhiều hạn chế. Vì vậy, việc cần tìm một vùng DNA khác tiến hóa nhanh
hơn so với gen rbcL để xây dựng cây phát sinh loài và ở mức dƣới loài và gen
matK là một gen đầy hứa hẹn cho mục tiêu này.
Những thay đổi ở DNA lục lạp (cpDNA) đã và đang đƣợc sử dụng cho
các nghiên cứu về tiến hóa, sinh thái và phát sinh chủng loại ở thực vật.
CpDNA có mức độ bảo thủ trong việc thay thế các nucleotide. Điều này tạo
điều kiện cho sự so sánh những thay đổi ở phạm vi rộng trong phân loại thực vật.
Một số chỉ thị cpDNA nhƣ microsatellite lục lạp (Graham và cs
cs, 1998), một số vùng không mã hóa (Kajita và cs, 1998), một số phân đoạn của
chuỗi đơn lớn (trnC – trnD, trnD – trnT, psaA – trnS, petB – petD, trnH – psaA,
trnD – trnT, Magni và cs, 2005) và một số vùng đệm giữa các gen (trnL – trnF,
Kajita và cs, 1998, Pardo và cs, 2004 Plumkett và cs, 2004) đã đƣợc sử dụng
trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền và phát sinh loại ở thực vật.
1.3.3. Gen matK
Gen matK đang có
17
Gen matK mã hóa cho protein maturaseK đƣợc phát hiện lần đầu tiên
bởi Sugita và cs (1985) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự
vùng gen trnK mã hóa cho tRNALys
ORF chứa 509 codon nằm trong intron của gen trnK và dƣờng nhƣ chƣa rõ
chức năng. Đã có một số nghiên cứu sử dụng trình tự gen matK để xây dựng cây
phát sinh loài nhƣ: Polemoniaceae (Johnson và Soltis, 1994, 1995; Johnson và
cs 1996), Orchidaceae (Jarrell và Clegg, 1995), Myrtaceae (Gadek và cs 1996),
Poaceae (Liang và Hilu, 1996), Apiaceae (Plunkett và cs, 1996) và thực vật có
hoa (Hilu và cs, 1997) [23].
matK có trên Genbank cho thấy gen
matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp [23].
Gen matK đƣợc coi nhƣ là một gen
rừng
mƣa nhiệt đới. Từ đó có thể xác định chính xác loài
y học cổ truyền và có thể giúp kiểm
soát, ngăn ngừa việc vận chuyển trái phép các loài thực vật quý hiếm.
Gen matK khác nhau giữa những loài thực vật nhƣng lại gần trùng
khớp ở những cây cùng loài. Nhƣ vậy, gen matK có thể cung cấp cho các
nhà khoa học phân biệt
matK.
sống Đại học Hoàng gia London
18
Quốc gia Kruger, Nam Phi. Dựa vào những mẫu thu đƣợc từ Costa Rica có
thể sử dụng gen matK để nhận dạng 1600 loài lan. Trong quá trình thực
hiện, họ phát hiện một loài trƣớc đây đƣợc cho là lan thực ra lại là hai loài
tách biệt. Loài này sống trên những dốc khác nhau trên núi và có hoa hình
dạng khác nhau để thích nghi với những loài côn trùng thụ phấn khác nhau.
Ở Nam Phi, nhóm nghiên cứu sử dụng gen matK để nhận diện cây và bụi
cây của Công viên Quốc gia Kruger, nơi khá nổi tiếng về những loài động
vật của mình. Savolainen giải thích rằng mục tiêu lâu dài là xây dựng dữ
liệu di truyền gen matK của càng nhiều loài thực vật càng tốt, dựa trên
những thông tin họ thu thập đƣợc từ Costa Rica và Nam Phi. Các mẫu có
thể đƣợc so sánh với dữ liệu này và nhận diện đƣợc chính xác nhiều loài
khác nhau [30].
Trong nghiên cứu sử dụng các trình tự gen matK
luận về việc sử dụng gen matK
matK lục lạp khác
nhau, từ 730 – 1
trần (Pinus thunbergii, Pinus attenuata và Ginko biloba
tiến hóa từ một tổ tiên chung. Trong nghiên cứu này, các mối quan hệ trong
19
và giữa họ Fabaceae (Fabales), Rosaceae (Rosales), Moraceae (Uriticales),
Cannabeceae (Uriticales) và Uriticaceae (Uriticales). Malvaceae (Malvales)
và Brassicaceae (Brassicales) cũng đã đƣợc thảo luận. Nhìn chung, kết quả
của họ chỉ ra rằng gen matK
chi và loài, do đó trình tự gen matK
một phần của trình tự gen matK
13].
matK
(rbcL và matK) đã đƣợc sử dụng nhƣ mã vạch
matK
học cực lớn, Indonesia có nhiều loài cây đƣợc sử dụng cho mục đích y học
matK
(2) xác định mức độ loài có
sự tƣơng đồng cao nhất với trình tự đƣợc lƣu trữ trong cơ sở dữ liệu là chỉ
tiêu đáng tin cậy [15].
Tuy nhiên, gen matK
phụ có thể sẽ cần thiết để nhậ
do gen matK cung cấp.
20
Gen matK
matK
nucleotide. Sản phẩm của gen matK là protein maturase K, protein này mã
hóa 268 amino acid, chứa 2 vùng chức năng. Vùng “matK_N” gồm 173
amino acid (từ amino acid 1 đến 173), vùng “Intron_maturas2” gồm 68 amino
acid (từ amino acid 200 đến 267). Vùng này đƣợc tìm thấy trong intron nhóm
II và đƣợc gọi là vùng X [18], [23].
matK matK
a dạng di truyền họ Gừng (Zingiberaceae)
[8
gen trnL – trnF, psbA – trnH và matK
chi Tre (bambusa sCHREB.) ở Việt Nam [1
matK của loài sao hòn gai (Hopea hongayensis) ở Việt
Nam [11], xác định đoạn mã vạch DNA cho cây Trà hoa vàng Tam Đảo
(Camellia tamdaoensis): loài cây đặc hữu của Việt Nam [2].
matK matK
KF269170 [42], [43], [44], [45], [46
gen matK 47].
matK ở thực vật, tuy nhiên việc nghiên cứu về gen matK
21
matK
.
22
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
Mẫu cây
làm vật liệu nghiên cứu. Mẫu cây
Kạn (GCL – CD)
Giang (GCL – HG), mẫu cây Giảo cổ lam thu từ
– SP). –
Sử dụng các hoá chất: EDTA, Tris – HCl, Isopropanol, chloroform, Agarose, cồn 700, bộ Kit dùng cho tinh sạch DNA , các cặp mồi đặc hiệu nhân gen MatK. Ngoài ra còn một số hóa chất khác.
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên các trang thiết bị nhƣ: bộ nguồn
điện di NanoPAC – 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver
Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800,
Nhật Bản, một số thiết bị khác nhƣ lò vi sóng (Electrolux, Việt Nam), tủ sấy (Nuaire, Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic, Nhật Bản), tủ lạnh -85oC (Nuaire, Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng…
Phòng thí nghiệm Công nghệ gen – protein thuộc Bộ môn Di truyền
và Sinh học hiện đại, Khoa sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ pham – Đại học
Thái Nguyên.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp thu mẫu
Thu thập mẫu Giảo cổ lam ở các khu vực khác nhau. Tiến hành rửa bằng cồn tuyệt đối rồi để trong tủ lạnh -850C ít nhất 2 tiếng để tiến hành tách DNA tổng số.
23
rễ
2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
[6].
- Lấy 200mg lá non nghiền trong cối sứ thành bột mịn.
- Bổ sung 700 – 1000 µl dung dịch đệm rửa, đảo đều. Li tâm 15 phút,
12000 vòng/phút ở 4ºC, loại dịch thu tủa.
- Thêm 700 µl đệm chiết, mix nhẹ, ủ ở nhiệt độ 65ºC trong vòng 30 –
60 phút (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần). Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ
phòng 5 phút.
- Bổ sung thêm 700µl C : I (24 cloroform: 1 isoamyl ancohol), đảo
đều ống trong 15 phút.
- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC. Hút cẩn thận 600µl dịch
pha trên sang ống eppendorf 1,5µl mới.
- Bổ sung thêm 600µl dung dịch 25:24:1 (25 phenol: 24 cloroform: 1
isoamyl ancohol), đảo đều ống trong 15 phút.
- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC. Hút cẩn thận 500µl dịch
trong ở pha trên sang ống eppendorf 1,5µl mới.
- Thêm 500µl isopropanol, mix nhẹ, tủa DNA ở -20ºC ít nhất 2 tiếng.
- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC, loại dịch thu tủa.
- Bổ sung 500µl cồn 70 độ. Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút ở 4ºC,
loại bỏ cồn (lặp lại 2 – 3 lần).
24
- Làm khô ở nhiệt độ phòng.
- Hòa tan DNA trong 50µl nƣớc cất 2 lần đã khử trùng.
Sản phẩm DNA đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE
1X và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch
trong tủ -20oC.
2.2.2.2. Phương pháp điện di DNA
gel agarose
gel sau:
- Cân 0,8 gam agarose hòa trong 100ml TAE 1X, đun trên bếp điện
hoặc lò vi sóng cho đến khi hỗn hợp trong suốt, để nguội đến khoảng 60ºC.
- Lau sạch khuôn, cài lƣợc và đổ agarose 0,8% vào, để yên cho đến
khi thạch đông (khoảng 30 – 60 phút), tháo lƣợc.
- Đổ TAE 1X và đặt gel vào bể điện di.
- Lấy 5µl mẫu trộn với 3µl dye và tra hỗn hợp vào giếng.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 110V trong 30 phút.
- Nhuộm gel bằng Ethidium Brommide trong 1 – 2 phút.
- Rửa bản gel bằng nƣớc cất và soi gel dƣới đèn UV, chụp ảnh.
2.2.2.3. Phương pháp nhân gen matK bằng kĩ thuật PCR
Gen matK cặp mồi đặc hiệu
matK-F/matK-R. Trên cơ matK
website http://www.kew.org/barcoding/protocols.html, đặc hiệu
matK-F/matK-R nhân gen matK
2.1.
25
Bảng 2.1. PCR nhân gen matK
mồi leotide
PCR
5’ CATATAAACCAATTATCAAAC 3’ 900 matK-F
nucleotide 5’ AGTTTGATAATTGGTTTATATG 3’ matK-R
2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
PCR Masster Mix 2X 7,5 1
matK-F 0,5 2 10 pmol/l
matK-R 0,5 3 10 pmol/l
DNA 0,5 4 20 – 500 ng/ l
Nƣớc khử ion - 6 5
Tổng thể tích 15,0
Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng nhân gen matK bao gồm: Biến tính khởi động ở 940C trong 3 phút 30 giây; (biến tính ở 940C trong 50 giây; gắn mồi ở 500C trong 1 phút; tổng hợp kéo dài ở 720C trong 1 phút) x 35 chu kỳ; ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 720C trong 10 phút; bảo quản mẫu ở 40C.
Sản phẩm PCR trƣớc khi tinh sạch đƣợc bảo quản ở tủ -200C
26
2.2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phầm PCR
Sản phẩm PCR nhân gen matK Kit DNA
extraction
- Bổ sung Buding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1 : 1 về thể tích. - Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4 oC,
loại bỏ dịch.
- Bổ sung 700 µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.
- Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml, mở nắp 3 - 5 phút cho bay
hết cồn.
- Bổ sung 35µl nƣớc khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1
phút, thu dịch đáy.
Sản phẩm DNA tinh sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%
trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.
2.2.2.5. Phương pháp đoạn gen matK
Trình tự nucleotide của đoạn gen matK đƣợc xác định tại bằng máy giải
trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu.
Trình tự gen matK
bằng các chƣơng trình
27
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
LAM
3.1.1. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Chợ Đồn, Bắc Kạn
mực
Hình 3.1.
Đồn, Bắc Kạn.
28
loài cây thảo có thân mảnh. Thân phân thành các lóng và đốt rất rõ, mỗi lóng
dài 70 - 120 mm, có lóng dài 150 mm (Hình 3.1 B, H); trên mỗi lóng có mang
1 lá, mầm ngủ (mầm cành hoặc mầm hoa) và 1 tua cuốn (tua cuốn phân nhánh
1 - 2 lần). Mặt cắt ngang thân có cạnh. Cây thƣờng mọc leo nhờ tua cuốn đơn
ở nách lá (Hình 3.1 B). Lá nhỏ
chét, mỗi lá chét có một cuống riêng, cuống chung dài 3 – 4 cm. Lá mọc cách
trên thân, mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dƣới lá có màu xanh lá cây,
mép lá có răng cƣa, đầu lá nhọn. Lá chét lớn rộng khoảng 2 – 2,5 cm, dài
khoảng 3,5 – 4 cm. Lá chét nhỏ nhất rộng khoảng 1 cm, dài khoảng 1,5 cm.
(Hình 3.1 C, D, E, F). Rễ dài và mảnh, kích thƣớc từ 10 – 13cm (Hình 3.1 G).
Tuy nhiên, ở các nhánh phụ ở thân có xuất hiện lá kép chân vịt có 7 lá
chét, nhƣng với số lƣợng ít.
3.1.2. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Ngọc Đƣờng, Hà Giang
vùng Đông Bắc, với chế độ khí hậu nhiệt đới gió mùa, do nằm sâu trong lục
địa nên ảnh hƣởng của mƣa bão trong mùa hè và gió mùa Đông Bắc trong
mùa đông. Hình ảnh cây Giảo cổ lam đƣợc thể hiện ở hình 3.2
loài cây thân mảnh. Thân phân thành các lóng và đốt rất rõ, mỗi
lóng dài 85 - 130 mm, có lóng dài 180 mm; trên mỗi lóng có mang 1 lá, mầm
ngủ (mầm cành hoặc mầm hoa) và 1 tua cuốn (tua cuốn phân nhánh 1 - 2 lần).
A, B). Lá lớn, là lá kép hình chân vịt, mỗi
Mặt cắt ngang thân có cạnh.
29
mỗi lá chét có một cuống riêng, cuống chung dài 5 – 7 cm. Lá mọc cách trên
thân, mặt trên lá có màu xanh thẫm và mặt dƣới lá có màu xanh lá cây, mép lá
có răng cƣa, đầu lá nhọn. Lá chét lớn rộng khoảng 4 – 4,5 cm, dài khoảng 1
–
E, F). Rễ dài và có nhiều rễ phụ, kích thƣớc từ 19 – 21 cm (Hình 3.2 C).
Tuy nhiên, ở các nhánh phụ ở thân có xuất hiện lá kép chân vịt có 5 lá
chét, nhƣng với số lƣợng ít.
Hình 3.2. xã
.
30
3.1.3. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo
chất toàn cầu, Cao nguyên đá Đồng Văn. Hình ảnh cây Giảo cổ lam đƣợc thể
hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3.
.
31
cây thảo có thân mảnh. Thân phân thành các lóng và
đốt rất rõ, mỗi lóng dài 8 – 10 cm, có lóng dài 17 – 20 cm; trên mỗi lóng có
mang 1 lá, mầm ngủ (mầm cành hoặc mầm hoa) và 1 tua cuốn (tua cuốn
phân nhánh 1 - 2 lần). Mặt cắt ngang thân có cạnh. Cây thƣờng mọc leo
nhờ tua cuốn đơn ở nách lá (Hình 3.3 B, C). Đa số là lá lớn
cuống chung dài 6 – 7 cm. Lá mọc cách trên thân, mặt trên lá có màu xanh
thẫm và mặt dƣới lá có màu xanh lá cây, mép lá có răng cƣa, đầu lá nhọn
Lá chét lớn rộng khoảng 3 – 4 cm, dài khoảng 12 – 14 cm (Hình 3.3 E, F,
G, H, I). Lá chét nhỏ nhất rộng khoảng 1 cm, dài khoảng 1,5 cm. Rễ dài và
mảnh, kích thƣớc từ 35 – 40 cm (Hình 3.3 D).
Tuy nhiên, ở các nhánh phụ ở thân có xuất hiện lá kép chân vịt có 7
lá chét, nhƣng với số lƣợng ít.
3.1.4. Đặc điểm thực vật học của mẫu Giảo cổ lam Sapa, Lào Cai
so với mực nƣớc biển. Khí hậu trên toàn huyện Sa Pa mang sắc thái của
vùng ôn đới, với nhiệt độ trung bình 15 – 18°C. Hình ảnh cây Giảo cổ lam
đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
thảo có thân mảnh. Thân phân thành các lóng và đốt rất rõ, mỗi lóng dài 20 – 22
cm, có lóng dài 28 cm; trên mỗi lóng có mang 1 lá, mầm ngủ (mầm cành hoặc
mầm hoa) và 1 tua cuốn (tua cuốn phân nhánh 1 - 2 lần). Mặt cắt ngang thân có
cạnh. cây
riêng, cuống chung dài 4 – 5 cm. Lá mọc cách trên thân, mặt trên lá có màu xanh
32
thẫm và mặt dƣới lá có màu xanh lá cây, mép lá có răng cƣa, đầu lá nhọn. Lá
chét lớn rộng khoảng 3 – 3,5 cm, dài khoảng 8 – 9 cm (Hình 3.4 B, C, E). Lá
chét nhỏ nhất rộng khoảng 1,5 cm, dài khoảng 2,5 cm.
Hình 3.4.
(A, D, F:
matK
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây Giảo cổ lam
di trên gel
33
Hình 3.5.
(Làn 1, 2: GCL – HG; làn 3, 4: GCL – SP; làn 5, 6: GCL – CĐ)
ăng DNA còn tạp chất
đủ matK.
3.2.2. Kết quả nhân gen matK bằng phản ứng PCR
matK
matK-F/matK-
Hình 3.6.
1: GCL – HG – – CD)
34
sáng
matK-F/matK-R.
matK đƣợc tinh sạch. Sau khi tinh sạch, sản
phẩm
←1kb→
Hình 3.7. Kết quả điện di tinh sạch gen matK.
(
matK 3.2.3.
các .
rình tự đoạn matK – SP
thu
.
matK các m
matK
matK –
matK
35
matK.
nucleotid matK
36
Hình 3.8. matK các
matK
37
matK
của các mẫu Giảo cổ
lam có độ tƣơng đồng khá cao. Các vị trí nucleotide sai khác đƣợc thể hiện ở
bảng 3.1
Bảng 3.1. trí nucleotide
matK các mẫu Giảo cổ lam và KF269170.
KF269170.1 GCL - CD GCL - HG GCL - SP Vị trí
T T A T 73
T T A T 75
T T G T 76
C C C T 116
C C C T 125
C A C C 128
G T G G 145
T C T T 151
T A T T 170
G T G G 474
G A G G 516
38
suy matK
protein suy các
KF269170
Hình 3.9. matK
các
matK
các
39
các mẫu Giảo cổ lam có độ tƣơng đồng khá cao. Các vị trí amino
acid sai khác đƣợc thể hiện ở bảng 3.2
Bảng 3.2. trí amino acid sai khác các
KF269170.1
Vị trí KF269170.1 GCL - CD GCL - HG GCL - SP
Tyr Tyr Lys Tyr 25
Cys Cys Gly Cys 26
Ser Ser Ser Phe 39
Ser Ser Ser Leu 42
Thr Lys Thr Thr 43
Val Phe Val Val 49
Phe Ser Phe Phe 51
Val Glu Val Val 57
Arg Ser Arg Arg 158
matK
matK
40
matK matK
đa dạng về trình tự nucleotid và trình tự amino acid
matK su
Bảng 3.3.
gen matK
STT Mã số Năm Quốc gia Tác giả
GCL - CD 2015 Việt Nam Chu et al. 1
GCL - HG 2015 Việt Nam Chu et al. 2
GCL - SP 2015 Việt Nam Chu et al. 3
KF269170 2014 Yu et al. 4
KF269162 2014 Yu et al. 5
KF269159 2014 Yu et al. 6
KF269157 2014 Yu et al. 7
KF269156 2014 Yu et al. 8
AY968451 2014 Zhang et al. 9
matK,
về trình tự nucleotid
41
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự các nucleotide của
các mẫu Giảo cổ lam.
matK
ảo cổ lam trên cơ sở
matK đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình cây trên
hình 3.10.
Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu Giảo cổ lam
matK.
42
KF26
1,3%.
N (nhánh phụ 1, 2, 3, 4). Mẫu
GCL – CD, GCL – HG, GCL – SP
%.
matK
thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid suy diễn
của các mẫu Giảo cổ lam.
matK
95,5 %.
mẫu Giảo cổ lam trên cơ sở phân tích
trình tự amino acid suy diễn từ gen matK đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình cây
trên hình 3.11.
43
Hình 3.11. Mối quan hệ di truyển của các
matK
%.
(n ). Mẫu GCL – SP, GCL – CD, GCL – HG
Khoảng cách
%.
44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
- - - -
G.
Pentaphyllum), Giảo cổ lam 7 lá (G. Pubescens
1.2. Đoạn gen matK
matK
1.3. D chín
–
– –
matK,
ó – – –
%. khoản
2. Đ
ITS,
ropC1
cổ lam ở Việt Nam.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Việt Thanh, Nguyễn Khắc Khôi, Đinh Thị
Phòng (2012), Làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài thuộc chi tre
(bambusa sCHREB) ở Việt Nam do biến đổi hình thái trên cơ sở giải
mã trình tự gen trnL – trnF, psbA – trnH Và matK, Tạp chí Khoa học
và Công nghệ 50 (4): 463 – 473.
2. Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định đoạn mã vạch ADN
cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis): Loài cây đặc hữu
của Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 5: 123 – 130.
3. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy
Dƣơng, Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Đặng Văn Hạnh, Lã
Đình Mỡi, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2003), “Tách dòng và xác
định trình tự gen 18S rRNA của cây Bình vôi”, Tạp chí Công nghệ Sinh
học (1): 203 – 209.
4. Phạm Thanh Kỳ, Vũ Đức Cảnh, Phạm Thanh Hƣơng, Nguyễn Kim
Phƣợng (2007), “Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu của dƣợc
liệu Giảo cổ lam - Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino”,
Tạp chí dược học: 9 – 10.
5. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học.
6. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử
7. Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây
dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật
46
ADN mã vạch, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học khoa học tự nhiên –
Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
8. Lê Thị Huyền Thanh (2003), Đa dạng di truyền họ gừng (Zingiberaceae)
vùng Bảy Núi – An Giang, Luận văn thạc sĩ Khoa học Sinh học, Đại
học khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết
quả sử dụng một số chuỗi gen lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền
và xuất xứ cây lâm nghiệp”, Tạp chí Công nghệ Sinh học (5): 77 – 83.
10. Ngô Văn Thu (2011), “Bài giảng dƣợc liệu”, tập I. Trƣờng đại học Dƣợc
Hà Nội
11. Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Tạ Thi Nhung, Hà Minh Tâm, Nguyễn Văn
Thành (2013): “Trình tự gen matK của loài sao hòn gai (hopea
hongayensis) ở Việt Nam”, Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 319 – 322.
12. Viện dƣợc liệu (2010), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập1,
Tiếng Anh
13. Ayşe Gül İNCE, Mehmet KARACA, A. Naci ONUS, Mehmet BiLGEN
(2005). “Chloroplast matK gene phylogeny of some important species
of plants”. AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ DERGİSİ,
18(2): 157 – 162.
14. Baldwin B. G., Sanderson M, Porterz J., Wojciechowski M. F. et al.
(1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source
47
of evidence on angiosperm phylogeny”. Annals of the Missouri
Botanical Garden (82): 247 – 277.
15. Beivy Jonathan Kolondam (2015), “Applying matk gene for identification
of liliopsida plant species from north sulawesi through bold systems”,
International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical
Technology. 6(2): 242 – 246.
16. Chiou S. J., Y.J.H., Fang C. L., Chen H. L., Lin T. Y. (2007),
“Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with
specific primers”, Planta Medica: 1421 – 1426.
17. Chun-Feng Qiao, Q.-B.H., Zhi-Li Zhao, Zheng-Tao Wang, Luo-Shan Xu
and HongXi Xu (2009), “Sequence Analysis Based on ITS1 Region of
Nuclear Ribosomal DNA of Amomum villosum and Ten Species of
Alpinia”, Journal of Food and Drug Analysis, 17: 142 – 145.
18. Cuenoud P., S.V., Chatrou L. W., Et Al. (2002), “Molecular
phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and
plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences”, American Journal of
Botany, 89: 132 - 144.
19. Cui X, Matsuura M, Wang Q, Ma H, Lambowitz AM (2004), “A group II
intron-encoded maturase functions preferentially in cis and requires
both the reverse transcriptase and X domains to promote RNA
splicing”. J Mol Biol: 211 – 231.
20. DNA Barcoding (2015), Water quality assessment, http://dna-
barcoding.blogspot.com/2015/08/water-quality-assessment.html, ngày
05/04/2016.
21. Han Yan, Xiaobing Wang, Junfeng Niu, Yaqin Wang, and Quanhong Liu
(2014), Anti-Cancer Effect and the Underlying Mechanisms of
Gypenosides on Human Colorectal Cancer SW-480 Cells, Nukhet
48
Aykin – Burns, University of Arkansas for Medical Sciences; College
of Pharmacy, United States of America.
22. Hao D.C., Chen S.L., Xiao P.G (2010), “Sequence characteristics and
divergent evolution of the chloroplast psbA – trnH noncoding region in
gymnosperms”, Journal of applied genetics, 50: 259 – 273.
23. Hilu K. W., (1997), “The matK gene: sequence variation and
application in plant systematics”, American Journal of Botany, 84:
830 – 839 .
24. Hollingsworth ML, Clark A, Forrest LL, Richardson JR, Pennington RT, et
al. (2009), “Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven
candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of
land plants”, Molecular Ecology Resources 9: 439 – 457.
25. Jing YU, Jian-Hua XUE, Shi-Liang ZHOU (2011), “New universal matK
primers for DNA barcoding angiosperms”, Journal of Systematics and
Evolution 49 (3): 176 – 181.
26. K.F.Armstrong (2005), “DNA barcodes for biosecurity: invasive species
identification”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci: 1813–1823.
27. Li B, Zhang X, Wang M, Jiao L (2015), “Characterization and antioxidant
activities of acidic polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Markino”, Carbohydrate Polymers: 209 – 214.
28. Masahiro Nagai, Izawa K., Nagumo S., Sakurai N., and Inoue T (1981), “Two
glycosides of a novel dammarane alcohol from Gynostemma
pentaphyllum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 29 No3: 779 – 783.
49
29. Michelle M.Barthet and Khidir W.Hilu (2007), “Expression of MatK:
Funtion and evolutionary implications”, A JB 94 (8): 1402 – 1412.
30. Moran JV, Mecklenburg KL, Sass P, Belcher SM, Mahnke D, Lewin
A, Perlman P (1999), “Splicing defective mutants of the COXI gene of
yeast mitochondrial DNA: initial definition of the maturase domain of the
group II intron aI2”, Oxford Journal 22: 2057 – 2064.
31. Mort ME, Soltis DE, Soltis PS, Francisco – Ortega J, Santons – guerra A
(2001), “Phylogenetics relationships and evolution of Crassulaceae inferred
from matK sequence data”, American Journal of Botany 88: 76 - 91.
32. Mort ME, Levsen N, Randle RP, Jaarseld EV, Palmer A (2005),
“Phylogenetics and diversification of Cotyledon (Crassulaceae) inferred
from nuclear and chloroplast DNA sequences data”, American Journal
of Botany 92 (7): 1170 – 1176.
33. Paul D. N. Hebert (2003), Alina Cywinska, Shelley L. Ball and Jeremy R.
deWaard (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”,
Proceeding Of The Royal Society: 313 – 321.
34. Petersen G., Seberg O. (1996), “ITS regions highly conserved in
cultivated barleys”, Euphytica, 90: 233 – 234.
35. Qin R, Zhang J, Li C, Zhang X, Xiong A, Huang F, Yin Z, Li K, Qin
W, Chen M, Zhang S, Liang L, Zhang H, Nie H, Ye W (2012),
“Protective effects of gypenosides against fatty liver disease induced by
high fat and cholesterol diet and alcohol in rats”, Archives of
Pharmacal Research 35: 1241 – 1250.
50
36. Reuter (2010), DNA barcoding aims to protect species, food,
http://www.reuters.com/article/us-dna-idUSTRE69S57G20101029,
ngày 05/01/2016.
37. Shneer VS (2009), DNA barcoding of animal and plant species as an
approach for their molecular identification and describing of diversity,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19799325, ngày 5/4/2016.
38. Smith et al (2012), Wolbachia and DNA Barcoding Insects: Patterns, Potential,
and Problems, http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0036514, ngày
05/04/2016.
39. Tagir Kh. Samigullin, William F. Martin, Aleksey V. Troitsky, Andrey S.
Antonov (1999), “Molecular Data from the Chloroplast rpoC1 Gene Suggest
a Deep and Distinct Dichotomy of Contemporary Spermatophytes into Two
Monophyla: Gymnosperms (Including Gnetales) and Angiosperms”, Journal
Of Molecula Evolution 49: 310 – 315.
40. Vadivalagan et al, (2015), Genetic deviation in geographically close
populations of the dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae):
influence of environmental barriers in South India,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26627691, ngày 05/04/2016
41. Ward RD et al (2009), The campaign to DNA barcode all fishes, FISH-
BOL, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20735564, ngày
20/04/2016.
42. Yu et al (2014), Gynostemma laxum isolate PT5205MT01 internal
transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene,
complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269126, ngày 15/4/2016.
51
43. Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var. pentaphyllum isolate
PT5204MT03 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269157, ngày 15/04/2016.
44. Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var. pentaphyllum isolate
PT5204MT05 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269159, ngày 15/04/2016.
45. Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var. pentaphyllum isolate
PT5204MT08 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269162, ngày 15/04/2016.
46. Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var. dasycarpum isolate
PT5207MT03 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269170, ngày 15/4/2016.
47. Zhang et al (2014), Gynostemma pentaphyllum maturase K (matK) gene,
partial cds; plastid, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY968451,
ngày 15/4/2016.
