BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=====***=====
Cồ Thị Thùy Vân
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội - 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=====***=====
Cồ Thị Thùy Vân
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số:
62420201
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Lê Mai Hương
2. PGS.TS. Trần Liên Hà
Hà Nội - 2015
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi; các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình của tác giả nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015.
TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn
Nghiên cứu sinh
Giáo viên HD 1
PGS.TS. Lê Mai Hƣơng
Cồ Thị Thuỳ Vân
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Mai Hương, Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và PGS.TS. Trần Liên Hà, Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để tôi hoàn thành Luận án này;
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu cũng như giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường; Đồng thời xin được gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ, cộng tác của các cán bộ phòng Nghiên cứu – Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp; các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam;
Tôi xin cảm ơn GS.TSKH. Trịnh Tam Kiệt đã cho tôi những lời khuyên và
chỉ dẫn cho tôi rất nhiều kiến thức về nấm lớn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập được giao.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Cồ Thị Thùy Vân
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
MỤC LỤC
TRANG
1 MỞ ĐẦU
5 Chƣơng 1: TỔNG QUAN
5 1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu
1.1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu 5
10 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng
15 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu
16 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta
17 1.2. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.
1.2.1. Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. 17
1.2.2. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học 18
18 1.2.3. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm Đầu khỉ
1.2.4. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H. erinaceus 19
1.2.4.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ 19
20 1.2.4.2. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ
1.2.5. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước 25
1.2.6. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả 30 thể và hệ sợi nấm dược liệu
1.2.6.1. Phương pháp tách chiết trong cồn 30
1.2.6.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng 30
31 1.2.6.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm
32 1.2.6.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm
34 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
34 2.1. Vật liệu
36 2.2. Các loại môi trƣờng
39 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
39 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ
i
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2.3.1.1. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 39
2.3.1.2. Phân lập giống nấm Đầu khỉ 40
41 2.3.1.3. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân lập giống gốc
2.3.1.4. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 41
42 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp.
42 2.3.2.1. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung tích 200 ml)
43 2.3.2.2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung tích 2000 - 5000 ml)
44 2.3.2.3. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít)
45 2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể
46 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
2.3.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 46
47 2.3.3.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
2.3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 47
49 2.3.4. Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit amin trong nấm Đầu khỉ
49 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
49 2.3.5.1. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể nấm nấm Đầu khỉ
2.3.5.2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 50
2.3.5.3. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp 50
50 nấm
2.3.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 50
51
52
2.3.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro 2.3.5.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo 2.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm 53
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 54
ii
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55
3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus 50
51 3.1.1. Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên diện hẹp
51 3.1.1.1. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn
52 3.1.1.2. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm
57 3.1.1.3. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu
59 3.1.1.4. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ He1
3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ 61
61 3.1.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ
3.1.2.2. Xác định thời điểm phân lập 63
65 3.1.2.3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ
65 a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi giống gốc
b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi 66
68 c. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của sợi nấm
3.1.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 70
73 3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
73 3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích 200ml)
3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 73
74 3.2.1.2. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1
3.2.1.3. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến 76
iii
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
76 3.2.1.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể
77 3.2.1.5. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
3.2.1.6. Chế độ nuôi giống 77
a. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc 80
b. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ 81
82 3.2.1.7. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
85 3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích 2000ml – 5000ml)
85 3.2.2.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng
86 3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
87 3.2.2.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2
88 3.2.2.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể
89 3.2.2.5. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít
90 3.2.2.6. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít
92 3.2.2.7. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể
3.2.3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 95
95 3.2.3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể tích 120 lit
95 3.2.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng
96 3.2.3.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít
iv
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
97 3.2.3.4. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120 lít
98 3.2.3.5. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của nuôi trồng dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men)
104 3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể.
104
3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm bệnh trong môi trường nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
107
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể
111 3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
113 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong nuôi trồng
3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể 114
116 3.3.6. Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể
120 3.4. Kết quả tách chiết và thử hoạt tính sinh học của polysaccaride từ nấm Đầu khỉ H. erinaceus
3.4.1. Nghiên cứu quy trình tách chiết 120
3.4.1.1. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 120
3.4.1.2. Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH 120
122 3.4.2. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 trong từng thời điểm nuôi
124 3.4.3. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng
3.4.4. Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được 125
125 3.4.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay)
3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 126
v
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
127 3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid
128 3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm
a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1 128
a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ 129
129 a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế phẩm HT1 6 tuần
131 a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần
133 a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT, SGPT của thỏ
a5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ 134
134 b. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm HT1
c. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu 135
138 Chƣơng 4. KẾT LUẬN
141 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG PHẠM VI LUẬN ÁN
142 TÀI LIỆU THAM KHẢO
149 Phụ lục
vi
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Công thức Công thức đối chứng Công thức nuôi trồng Chứng sinh học
CT CTĐC CTNT CSH DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxide FAO PGA Tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới Potato glucose agar 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Dịch kháng sinh: 100đơn vị/ ml Penicilin, 100 g /ml Streptomycin PSF 9.
HEP HPLC sulfate, 0,25 g /ml Amphotericin B Polysaccharide tách chiết từ Hericium erinaceus Sắc ký lỏng cao áp 10. 11.
KH&CN Khoa học và Công nghệ 12.
Nonessential Amino Axit Nghiên cứu sinh Qui trình công nghệ Tiêu chuẩn Việt Nam
Khuẩn lạc cầu KLC Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế tối thiểu 50% IC50 LD50 Lethal dose 50, Liều độc cấp tính MEME Minimum Essential Medium with Eagle’s salt MTĐC Môi trường đối chứng NAA NCS QTCN TCVN TCPTN Tiêu chuẩn phòng thử nghiệm TSB YF Trypcase Soya Broth Quả thể nấm khi còn non 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.
YM Hệ sợi nấm 25.
YE SKS XPĐ Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ Sinh khối sợi Xuất phát điểm 26. 27. 28.
vii
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm Đầu khỉ 19
20 Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus
Bảng 1.3: Hàm lượng một số thành phần hóa sinh của nấm Đầu khỉ 20
21 Bảng 1.4: Một số thành phần có hoạt tính sinh học mang lại lợi ích sức khỏe của H. erinaceus
Bảng 2.1: Thành phần môi trường phân lập nấm Đầu khỉ 37
37 Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
38 Bảng 2.3: Thành phần các môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể
Bảng 2.4. Thành phần môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 38
Bảng 2.5: Thành phần môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ 38
55 Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể của các giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus khảo nghiệm trên môi trường PGA và CTNT 1
57 Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm
Bảng 3.3: Thành phần và mức độ sâu bệnh hại trên bốn giống nấm Đầu khỉ 57
59 Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1
Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin cuả nấm Đầu khỉ He1 60
62 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm đến chất lượng giống gốc 64
65 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đối với sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ
67 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ
69 Bảng 3.10: Đặc điểm của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau
70 Bảng 3.11: Đặc điểm của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết nuôi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
73 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dungtích 200 ml)
74 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trung gian cấp 1
viii
76 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8
76 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8
79 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của chế độ nuôi lắc và khuấy đến sự sinh trưởng của giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8
80 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hình thái và sinh khối hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8
81 Bảng 3.18: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy từ đến hình thái và sinh khối hệ sợi Nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8
81 Bảng 3.19: So sánh giống dịch thể trung gian cấp 1 khi nuôi ở 2 chế độ: nuôi lắc, nuôi khuấy từ
85 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml)
86 Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau
87 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến kích thước và đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trong CT12
88 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể trong CT12
89
91 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2
92 Bảng 3.26. Sự sinh của giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 ở từng thời điểm nuôi
95 Bảng 3.27: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng trong bình lên men 120lit
98 Bảng 3.28: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong nồi lên men 120 lít ở từng thời điểm nuôi
107 Bảng 3.29: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu và phương pháp khử trùng đến tỷ lệ nhiễm
110 Bảng 3.30: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu nuôi trồng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ và năng suất nấm thương phẩm
112 Bảng 3.31: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3
113 Bảng 3.32. So sánh tổng thời gian nuôi trồng và năng suất nấm Đầu khỉ khi sử dụng giống dịch thể và giống trên cơ chất hạt
114 Bảng 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3
ix
117 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.34: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Đầu khỉ trên CTNT3
119 Bảng 3.35: Hoạch toán đầu vào cho 1 tấn nguyên liệu đã xử lý để nuôi trồng nấm Đầu khỉ
119 Bảng 3.36: Bảng tổng hợp năng suất trung bình nuôi trồng nấm Đầu khỉ qua 3 lần sản xuất lặp lại
120 Bảng 3.37: Bảng tổng hợp hiệu quả kinh tế thu được khi nuôi trồng nấm đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể
Bảng 3.38. Khả năng chiết của các loại dung dịch kiềm khác nhau 120
Bảng 3.39. Độ chiết (tương ứng với độ nhớt) thay đổi theo nồng độ của NaOH 121
123 Bảng 3.40: Hàm lượng polysaccharide của các mẫu nấm thu hái tại các thời điểm khác nhau
124 Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide trong hai mẫu Đầu khỉ mới thu hái và qua bảo quản
125 Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được
Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được 125
126 Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người của hai phân đoạn polysaccharide thu được
127 Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccaride
129
129 Bảng 3.46 : Sự thay đổi trọng lượng cơ thể thỏ khi dùng HT1 trong 6 tuần (n = 8) Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
130 Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
130
131 Bảng 3.49: Sự xuất hiện sóng điện tim bệnh lý thỏ ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 1012/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
131
132
132 Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l)ở thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
133 Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
x
133 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
134 Bảng 3.56: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
134 Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 khi dùng 30 ngày liều 0,5g/kg/24 giờ
135 Bảng 3.58: Số lượng tế bào ở nhóm chuột nhắt trắng dưới tác dụng của chiếu xạ và chiếu xạ + HT1
xi
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
DANH MỤC HÌNH
TRANG
5
Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng 6 một đơn vị diện tích (1 mẫu) trong một năm
Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011 7
Hình 1.4: Một số hình ảnh mô tả các công đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống 9 nấm dạng dịch thể ở một số công ty Hàn Quốc
Hình 1.5: Liên kết β -1, 3 và β -1, 6 trong chuỗi polysaccharide 12
Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus trong tự nhiên 17
Hình 1.7: Hình thái quả thể nấm Đầu khỉ nuôi trồng nhân tạo 18
Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại trên nấm Đầu khỉ trong giai đoạn ươm sợi và ra 58 quả thể
Hình 3.2: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) 61
Hình 3.3: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) dày đặc, đảm hình chuỳ mang 4 bào 61 tử với các mụn gai trên bề mặt
Hình 3.4: Hệ sợi nấm Đầu khỉ được phân lập từ bào tử và mô nấm 62
Hình 3.5: Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm Đầu khỉ tính từ khi xuất hiện 63 mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng
Hình 3.6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết khi 64 sử dụng quả thể phân lập ở các giai đoạn phát triển khác nhau
Hình 3.7: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung thêm các nguồn các bon khác nhau 66
Hình 3.8: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung các nguồn nito khác nhau 68
Hình 3.9: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau 69
Hình 3.10: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các công 70 thức môi trường dinh dưỡng khác nhau
Hình 3.11: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 71
Hình 3.12: Qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ 72
Hình 3.13: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau 75
Hình 3.14: Sinh khối sợi nấm trong các công thức môi trường khác nhau 75
Hình 3.15: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường CT8 ở chế độ nuôi 76 lắc tạo thành dạng khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai xung quanh
Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi 77 trường CT8
Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu 78 khỉ trong môi trường CT8
xii
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 ở các chế độ nuôi 79
82
Hình 3.19: Sự phát triển của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy lắc lắc và nuôi trên máy khuấy từ khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít, thời gian nuôi 7 ngày
Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng của giống Đầu khỉ trong môi trường nuôi 82 dưỡng CT8
Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể, 84 dung tích 200ml
Hình 3.22: Môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian lần lượt là 30, 40, 50, 85 60, 70phút
87
Hình 3.23: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút và môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút
Hình 3.24: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong các công thức môi trường dinh 88 dưỡng khác nhau
Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi 89 trường CT12
Hình 3.26: Giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 sau 7 90 ngày nuôi
Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể 91 trong môi trường CT12 và mức độ tạo bọt
Hình 3.28: Tác dụng của chất phá bọt trong quá trình lên men có sục khí, chế độ 93 sục khí 0,4 - 5,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút
Hình 3.29: Đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng 94 dịch thể trung gian cấp 2
Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể, 95 dung tích 5000ml
Hình 3.31: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng 96 của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể
97
Hình 3.32: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển sang thể tích 120lit đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT16
99
Hình 3.33: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển sang bình dung tích 120 lít đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trương CT16
Hình 3.34: Đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường 100 CT16 dung tích 120lit
Hình 3.35: Sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong bình lên men dung tích 120 lít, sau 102 5 ngày nuôi cấy
xiii
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hình 3.36: Qui trình sản xuất giống nấm các cấp 103
Hình 3.37: QTCN lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít 105
Hình 3.38: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tỷ lệ nhiễm bịch nguyên 106 liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên CTNT1
Hình 3.39: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tốc độ phát triển của hệ 109 sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT1
99
Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi trồng khác nhau khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng dịch thể
Hình 3.41: Giống dạng hạt và giống dạng dịch thể phát triển trong CTNT3 112
Hình 3.42: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ 113 trên CTNT3
Hình 3.43: Quả thể nấm Đầu khỉ trên công thức CTNT 3 nuôi trồng ở các khoảng 115 nhiệt độ khác nhau
Hình 3.44: QTCN nuôi trông nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể 116
Hình 3.45: So sánh QT sử dụng giống dạng hạt và QT sử dụng giống dạng dịch 118 thể trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ
Hình 3.46: Qui trình chiết polysaccharide 121
Hình 3.47: Phổ MS của Polysaccharide thu được 122
Hình 3.48: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian của quả thể nấm Đầu khỉ He1 124
Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn 127 Polysaccharide
Hình 3.50: Thử nghiệm HT1 trên chuột 136
Hình 3.51: Kết quả thử hoạt tính in vivo chiết phẩm của nấm Đầu khỉ 136
xiv
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
MỞ ĐẦU
Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên. Nhiều loài nấm lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương… Trên thế giới có khoảng hơn 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai [16].
+ Thời gian nhân giống các cấp kéo dài; + Giống nấm nhân trên cơ chất rắn có chất lượng không ổn định, tuổi giống không
+ Phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn gặp nhiều khó khăn trong việc sản xuất
+ Nguyên liệu nhân giống đắt, chi phí nhân công, chi phí khấu hao điện năng, khấu
+ Chu kỳ phát triển của giống nấm trong môi trường dịch thể nhanh, qua đó rút
Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh đó điều kiện tự nhiên của nước ta rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm. Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến cũng như thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu. Công nghệ nhân giống và nuôi trồng nấm ở nước ta hiện nay chỉ sử dụng giống nhân trên cơ chất rắn như nhân giống trên môi trường thạch, trên mùn cưa, thóc, que sắn; đây là phương pháp truyền thống tuy được sử dụng một cách phổ biến do quá trình sản suất đơn giản nhưng lại có một số nhược điểm sau: đồng nhất trong toàn bộ chai giống hay túi giống; giống với số lượng lớn do hệ số nhân giống thấp; + Thao tác cấy chuyển giống khó tự động hóa, chịu nhiều tác động của yếu tố ngoại cảnh làm tăng nguy cơ nhiễm. Việc kiểm soát nhiễm đối với giống nấm nhân trên cơ chất rắn cũng gặp nhiều khó khăn; hao nhà xưởng cao; Hiện nay, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống trên cơ chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội như: ngắn được thời gian nhân giống các cấp và nuôi trồng nấm; + Tuổi giống nấm dạng dịch thể đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định do được kiểm soát một cách nghiêm ngặt với các phương pháp thử đơn giản, có kết quả tức thì, độ chính xác cao;
1
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Công nghệ nhân giống dạng dịch thể đáp ứng được mọi nhu cầu về giống từ qui
+ Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên
Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công
+ Sinh lực giống khỏe do giống phát triển trong môi trường dịch thể được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và được sử dụng trong đúng giai đoạn sinh trưởng mạnh nhất của hệ sợi; mô nhỏ đến lớn, với hệ số nhân giống cao; vật liệu nhân giống, điện năng, nhân công. nghiệp. Đối tượng nghiên cứu của Luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers., đây là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để hỗ trợ điều trị hiệu quả một số bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh mất trí nhớ… Với các lợi ích lớn về giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đang rất quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống, nuôi trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe cộng đồng.
Nhận định được tầm quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ mới vào sản xuất giống nấm và nấm thương phẩm, góp phần thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa ngành sản xuất nấm trong nước, qua đó tạo ra nguồn nguyên liệu có giá trị dược học cao cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm, tạo ra các sản phẩm chức năng phục vụ mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng, Nghiên cứu sinh đã lựa chọn thực hiện Luận án: “Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học”
Luận án là một phần nội dung của Đề tài thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC.06/11-15 do Bộ Khoa học và Công nghệ chủ trì: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể để sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu”; mã số KC06.01/11-15; thời gian thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014, do Nghiên cứu sinh làm chủ nhiệm và Đề tài nghị định thư cấp nhà nước: “Nghiên cứu quá trình chuyển hóa các polymer tự nhiên bởi enzyme từ nấm Việt Nam”, thời gian thực hiện 2011-2013, do PGS.TS Lê Mai Hương làm chủ nhiệm.
Mục tiêu của Luận án
- Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus; - Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus dạng dịch
- Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn
- Đưa ra được qui trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu
thể các cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít; cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể; khỉ H. erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này;
2
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Nội dung của luận án
- Xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus nhằm lựa chọn được giống nấm Đầu khỉ có chất lượng tốt, năng suất cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam, chủ động trong việc nhân giống, duy trì, bảo tồn nguồn giống ổn định cung cấp cho sản xuất;
- Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể các cấp (giống trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 ml, giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít) để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp;
- Nghiên cứu xây dựng qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống dạng dịch thể, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn;
- Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ thành phẩm, đánh
giá một số hoạt tính sinh học của hợp chất này.
Kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn như sau:
- Ý nghĩa khoa học: + Đánh giá một số đặc tính sinh học và đưa ra một số kỹ thuật tuyển chọn, phân lập, nhân giống, nuôi trồng nấm Đầu khỉ là cơ sở cho việc định hướng tuyển chọn nguồn giống nấm dược liệu mới phù hợp để triển khai sản xuất đại trà trong điều kiện môi trường sinh thái của nước ta.
+ Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ góp phần làm thay đổi phương thức nhân giống nấm, sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm theo định hướng công nghiệp, áp dụng công nghệ sinh học vào sản xuất để dần thay thế phương pháp nhân giống nấm truyền thống (nhân giống trên cơ chất rắn như mùn cưa, thóc, đậu tương, đỗ xanh, kê, que gỗ…); đây là phương pháp nhân giống mới đang được các nước có ngành sản xuất nấm phát triển quan tâm nghiên cứu, ứng dụng do phương pháp nhân giống này có rất nhiều ưu điểm so với phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn.
+ Đưa ra qui trình tách chiết polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm Đầu khỉ nhằm khẳng định giá trị dược liệu của loại nấm này, kết quả nghiên cứu của luận án là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực sản xuất các thực phẩm chức năng từ nấm dược liệu phục vụ nền y học hiện đại, nâng cao sức khỏe cộng đồng.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Kết quả của luận án phù hợp với định hướng chính sách phát triển ngành nông nghiệp công nghệ cao, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất nông nghiệp nhằm tạo ra nguồn sản phẩm hàng hoá ổn định, thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp đặc biệt là tại các vùng nông thôn;
+ Kết quả của luận án là cơ sở thúc đẩy sự phát triển nghề trồng nấm ở Việt Nam, góp phần xúc tiến quá trình tuần hoàn sinh học có ích trong nông nghiệp (tận dụng phế thải
3
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
từ nông, lâm nghiệp có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường) đồng thời tạo nên nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và có giá trị dược liệu, giá trị kinh tế cao.
Những đóng góp mới của Luận án:
Công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm không thực sự là công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt Nam hiện nay thì đây thực sự là hướng mới cần được ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm từng bước thay đổi phương thức sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm, mang lại hiệu quả kinh tế cao theo hướng sản xuất qui mô công nghiệp, dần dần đưa máy móc vào sản xuất nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích người lao động cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương phẩm một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm. Hơn nữa việc áp dụng công nghệ mới vào sản xuất sẽ tạo ra một khối lượng lớn các sản phẩm nấm phục vụ cho tiêu dùng và cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm chức năng; Vậy những đóng góp mới của luận án là:
- Đã tuyển chọn được chủng nấm Đầu khỉ có khả năng phát triển tốt trong điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam, hoàn thiện phương pháp phân lập lại chủng nấm này có cơ sở để bảo quản và sử dụng lâu dài;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô 120 lít để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng hợp, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn;
- Đưa ra được qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử
dụng giống dạng dịch thể.
- Đã tách chiết và bước đầu nghiên cứu tác dụng của polysaccharide từ nấm Đầu khỉ bao gồm: hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy invitro, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy trên thạch mềm, kiểm tra độ an toàn và khả năng bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm.
Luận án được thực hiện tại:
- Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm -Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội.
- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam
- Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp
4
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu
1.1.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm dược liệu
Hiện nay, nghề trồng nấm ăn – nấm dược liệu phát triển ở mọi Châu lục; có gần 80 nước nuôi trồng các loại nấm Mỡ, nấm Hương, nấm Sò, Mộc nhĩ … trong đó ở các nước công nghiệp phát triển như Mỹ, Đức, Pháp, Nhật Bản,… đã nuôi trồng nhiều loại nấm và lượng tiêu dùng hàng năm cũng rất lớn, qui mô sản xuất nấm đã được cơ giới hoá từ khâu sử lý nguyên liệu đến thu hái; năng suất nấm tươi trung bình đạt 45 - 50% so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu [16]. Thị trường tiêu thụ nấm ăn lớn nhất hiện nay là Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan và các nước Châu Âu. Mức tiêu thụ bình quân tính theo đầu người hàng năm ở Châu Âu, Châu Mỹ là 2 - 3kg/người/năm; Đức, Nhật Bản là khoảng 4kg/người/năm [4].
Các nước có công nghệ nuôi trồng nấm dược liệu phát triển rất chú ý tới việc nghiên cứu, chọn tạo theo nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra các giống nấm có giá trị dinh dưỡng, giá trị dược học và giá trị kinh tế cao để đưa vào sản xuất. Các thành tựu khoa học kỹ thuật trong việc chọn tạo giống nấm đã tạo ra sự đa dạng các chủng loại nấm, nhiều giống nấm có năng suất cao, phẩm chất tốt, có tính chống chịu và thích nghi cao với điều kiện môi trường [25].
Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới (tấn x 1000) [70]
Nghiên cứu và công nghệ sản xuất nấm ăn trên thế giới ngày càng phát triển mạnh và đã trở thành ngành công nghiệp thực phẩm thực thụ. Hiện nay các nước Tây Âu như Anh, Pháp, Bỉ, Hà Lan… là các nước đi đầu trong lĩnh vực nuôi trồng, chọn tạo giống nấm, trồng nấm theo phương pháp công nghiệp, cơ giới hoá từ khâu xử lý đến thu hái và chế biến sản phẩm. Các nước và các vùng lãnh thổ như Đài Loan, Indonesia, Singapore, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, nghề trồng nấm phát triển theo mô hình trang trại vừa và nhỏ. Ước tính chỉ riêng năm 2004 sản lượng nấm ăn trên thế giới đã đạt trên 10 triệu tấn nấm tươi [70].
5
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Số lượng các nước trồng nấm cũng đang phát triển với tốc độ nhanh: năm 1939 toàn thế giới chỉ có 10 nước sản xuất nấm ăn, đến năm 1995 đã có trên 100 nước; Theo phân tích tốc độ phát triển tổng sản lượng nấm trên thế giới là trên 13% [2]; Với xu thế ngày càng phát triển về qui mô sản xuất, phương thức sản xuất, nguồn nguyên liệu sản xuất, loại hình sản phẩm và chủng loại sản phẩm cũng ngày càng đa dạng.
Trung Quốc được đánh giá là một trong những nước có tổng sản lượng nấm cũng như mức độ tăng trưởng lớn nhất thế giới. Theo số liệu thống kê của hội nấm ăn Trung Quốc, tính riêng trong năm 2011 tổng sản lượng nấm của Trung Quốc là 25,71 triệu tấn, chiếm khoảng 60% tổng sản lượng nấm ăn trên thế giới, mỗi năm Trung Quốc xuất khẩu hàng triệu tấn nấm sang các nước phát triển thu về nguồn ngoại tệ hàng tỷ đô la; sản lượng suất nấm ăn – nấm dược liệu của Trung Quốc liên tục tăng mạnh, trung bình mỗi năm tăng 1,58 triệu tấn [70, 73].
Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng một đơn vị
diện tích (1 mẫu) trong một năm; đơn vị: Nhân dân tệ [73]
Hiệu quả kinh tế thu được từ việc nuôi trồng nấm so với các cây nông nghiệp chủ đạo khác cũng được phân tích đánh giá, kết quả cho thấy hiệu quả thu được từ việc canh tác nấm là cao hơn hẳn so với một số cây nông nghiệp khác;
Theo sự đánh giá của các chuyên gia Trung Quốc thì nấm ăn có giá trị sản lượng ròng là 28.500 nhân dân tệ trong một mẫu (1 hecta bằng 15 mẫu) canh tác/ năm. Giá trị sản lượng gấp 3,8 lần so với cà chua trồng trong nhà kính là 7.500 nhân dân tệ trong cùng một khu vực, gấp 29,4 lần so với bông (970 nhân dân tệ), gấp 53,8 lần so với ngô (530 nhân dân tệ), gấp 67,1 lần so với lúa mì (425 nhân dân tệ) [73].
Việt Nam bắt đầu nghiên cứu và sản xuất nấm từ những năm 1970 [11, 16]. Trải qua nhiều thăng trầm, đến nay ở một số địa phương việc sản xuất nấm đã tạo ra nhiều công ăn, việc làm, tận dụng được thời gian nông nhàn và đem lại nguồn thu đáng kể cho nông dân. Mặc dù vậy trên thực tế việc sản xuất, chế biến và tiêu thụ nấm ăn - nấm dược liệu chủ yếu mới chỉ phát triển ở quy mô nhỏ, phân tán, sản phẩm nấm tiêu thụ trên thị trường nội địa là chính, chưa tương xứng với tiềm năng và giá trị vốn có của nó. Trong những
6
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
năm đầu của thế kỷ 21 (từ 2000 - 2009), có sự quan tâm chỉ đạo và định hướng phát triển nghề trồng nấm của Bộ Nông nghiệp & PTNT, Bộ Khoa học và Công nghệ, các cơ quan nghiên cứu khoa học như Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp; Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội,… đã đi sâu nghiên cứu và phát triển mở rộng nghề trồng nấm [4]; Đến năm 2009 cả nước sản xuất được khoảng 250.000 tấn nấm các loại. Mỗi năm tổng kim ngạch xuất khẩu Mộc nhĩ và nấm Rơm là chủ yếu đạt khoảng 60 triệu USD [4]. Cho đến nay, hầu hết các tỉnh trong cả nước hiện nay đều đã bắt đầu phát triển nghề sản xuất nấm với nhiều quy mô khác nhau; Chiếm đa số là các hộ sản xuất từ 1,0 đến 6,0 tấn nguyên liệu/ hộ/ năm; Các hộ này chủ yếu sử dụng phương thức sản xuất thủ công, tận dụng các thiết bị tự chế, không đồng bộ nên năng suất nấm thấp, giá thành sản phẩm cao và việc chế biến, tiêu thụ còn hạn chế [4].
Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011
(Đơn vị: tấn) [4]
Bên cạnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học theo phương pháp lên men lỏng để nhân giống nấm ăn - nấm dược liệu ở dạng dịch thể cũng đã có một số đơn vị bước đầu quan tâm nghiên cứu thăm dò như: - Trung tâm nghiên cứu nấm ăn trường Đại học tổng hợp Hà Nội; - Khoa Sinh học - Đại học Tổng hợp Hà Nội; - Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp; Sản lượng nấm ở Việt Nam (2011): Việt Nam đang nuôi trồng trên 16 loại nấm: ở phía Nam chủ yếu là nấm Rơm, nấm Mộc nhĩ; ở phía Bắc là nấm Sò, nấm Mỡ, nấm Hương, nấm Linh chi… Theo số liệu thống kê sản lượng nấm ăn – nấm dược liệu các loại của cả nước năm 2011 đạt khoảng 250.000 tấn [4]. Trong đó theo thứ tự là:
- Thị trường tiêu thụ trong nước chủ yếu là tiêu thụ nấm tươi, nấm phơi sấy khô. Thị trường xuất khẩu chủ yếu là xuất khẩu nấm nguyên liệu dưới dạng nấm Mỡ muối, nấm Rơm muối. Kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 90 triệu USD / năm [4].
- Các vùng sản xuất nấm chủ yếu [4]:
7
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Nấm Rơm (Volvariella volvacea): trồng chủ yếu ở các tỉnh miền tây và Đông Nam bộ (Đồng Tháp, Sóc Trăng, Trà Vinh, Cần thơ, Đồng Nai…) chiếm 90% sản lượng nấm Rơm trong cả nước. + Mộc nhĩ (Auricula. spp): trồng tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bình Phước…) chiếm 70% tổng sản lượng Mộc nhĩ trong cả nước. + Nấm Mỡ (Agaricus bisporus), nấm Sò trắng (Pleurotus florida), nấm Hương (Lentinula edodes) chủ yếu trồng ở các tỉnh Miền Bắc, mỗi năm đạt khoảng 30.000 tấn. + Nấm dược liệu: Linh chi (Ganoderma lucium), nấm Vân chi (Trametes versicolor), nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr. Pers.) mới được trồng ở một số tỉnh, thành phố (Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Lâm Đồng) * Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng giống nấm dạng dịch thể trong nuôi trồng nấm. Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng đang là một trong các vấn đề được nhiều nước trên thế giới rất quan tâm. Áp dụng công nghệ lên men lỏng trên qui mô công nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm y học, thực phẩm (tận thu sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất của các loài cây thuốc, nhân sâm, nấm dược liệu…, để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh hoặc sản xuất thuốc kháng sinh…), đồng thời phương pháp này cũng được nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ nhân giống nấm ăn-nấm dược liệu nhằm rút ngắn thời gian, tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm. Giống nấm dịch thể là loại giống được nuôi dưỡng trong môi trường lỏng, đảm bảo các điều kiện tối ưu về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ thông thoáng, thời gian nuôi, khiến sợi nấm sinh trưởng mạnh trong môi trường dịch thể tầng sâu [30]. Công nghệ này cho phép thu được một lượng lớn sinh khối sợi nấm để làm giống cấp 1, giống cấp 2, đồng thời có thể trực tiếp làm giống nuôi trồng (giống cấp 3); công nghệ trên còn được áp dụng trong việc tách chiết sinh khối sợi nấm dùng để sản xuất thuốc, gia vị, đồ uống… trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm. Phương pháp lên men nuôi dưỡng tầng sâu (nhân giống dạng dịch thể) được ứng dụng để sản xuất các giống nấm ăn như: nấm Hương (Lentinula edodes), nấm Sò tím (Pleurotus ostreatus), Kim châm (Flammulina velutipes), nấm Rơm (Volvariella volvacea), Mộc nhĩ đen (Auricularia auricula), nấm Mỡ (Agaricus bisporus), Trà tân (Agrocyber aegerita), Linh chi (Ganoderma lucidum)… [59] Kỹ thuật nhân giống nấm lớn dạng dịch thể khởi nguồn từ nước Mỹ, theo báo cáo năm 1947, H. Humfeld khi tiến hành lên men tầng sâu giống nấm Mỡ đã thu được lượng sinh khối sợi nấm lớn, từ đó phát triển mạnh kỹ thuật sản xuất giống nấm ăn dạng dịch thể tại các khu vực lân cận [30]. Trong những năm gần đây, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Đức là những nước có ngành công nghiệp sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu rất phát triển; đặc biệt có những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu sử dụng công nghệ nhân giống nấm lớn thuần khiết trong môi trường dịch thể. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, công nghệ nhân giống nấm lớn trong môi trường dịch thể ngày càng được hoàn thiện và được xây dựng thành quy trình chuẩn, ứng dụng khá phổ biến ở một số nước có ngành
8
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
a. Đóng chai nguyên liệu
c. Nhân giống dạng dịch thể
b. Khử trùng nguyên liệu
d. Máy cấy giống tự động
e. Nhà nuôi sợi
f. Sợi nấm lan kín toàn bộ chai nguyên liệu
g. Nấm Sò vua
h. Nấm Kim châm
i. Nấm Sò
Hình 1.4: Một số hình ảnh mô tả các công đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống nấm dạng dịch thể ở một số công ty Hàn Quốc (Nguồn: Cồ Thị Thùy Vân, 2013)
công nghiệp nuôi trồng nấm phát triển. Hiện nay, có nhiều quy trình nhân giống nấm lớn dạng dịch thể khác nhau phụ thuộc vào quy mô sản xuất, điều kiện kinh tế xã hội và trình độ công nghệ của từng nước; Việc sử dụng phương pháp nhân giống dạng dịch thể để sản xuất giống nấm ăn và nấm dược liệu đã đạt được thành công với hơn 50 giống nấm khác nhau như: nấm Mỡ (Agaricus bisporus), nấm Sò tím (Pleurotus ostreatus), nấm Hương (Lentinula edodes), Kim châm (Flammulina velutipes), nấm Sò vua (Pleurotus eryngii), Linh chi (Ganoderma lucidum), Mộc nhĩ đen (Auricularia auricula), nấm Trân châu (Agrocyber aegerita)… Từ kết quả thử nghiệm tại các phòng thí nghiệm lớn và nhỏ cho thấy, đại đa số hệ sợi nấm các loại đều phát triển tốt trong điều kiện môi trường dịch thể tích hợp, chất lượng giống nấm đều đạt tiêu chuẩn.
9
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
* Triển vọng của giống nấm dịch thể
Nghiên cứu và sản xuất giống nấm dạng dịch thể trải qua nhiều năm không ngừng phát triển đã có được những thành tựu bước đầu; Phổ biến và ứng dụng nhân giống nấm dịch thể qui mô công nghiệp hóa để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu mang lại hiệu quả rõ rệt vì có thể giảm giá thành sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm... Giống nấm dạng dịch thể cho ưu thế rõ rệt so với giống thể rắn (giống trên gỗ, mùn cưa, hạt...), đối với các đơn vị sản xuất giống nấm, ứng dụng kết hợp “giống rắn – lỏng” trong sản xuất giống nấm ăn không những có thể phát huy thế mạnh của giống dịch thể như rút ngắn thời gian sinh trưởng, giá thành sản xuất thấp, độ thuần cao, chất lượng tốt, tỷ lệ nhiễm thấp mà còn thích hợp cho phát triển sản xuất giống nuôi trồng nấm theo quy mô công nghiệp… Tất cả những đặc điểm trên có ý nghĩa thực tế trong việc nâng cao chất lượng giống cũng như tăng tính cạnh tranh cho đơn vị, cơ quan sản xuất giống nấm. Ở Việt Nam, công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm cũng đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu, ứng dụng; Với những yêu cầu từ thực tiễn phát triển nghề trồng nấm ở nước ta hiện nay, chất lượng và số lượng giống nấm có vai trò đặc biệt quan trọng quyết định năng xuất, chất lượng nấm thương phẩm; chất lượng giống nấm cũng là một trong những nhân tố quyết định việc thành bại trong quá trình nuôi trồng của người sản xuất. Nếu sử dụng các giống nấm được nghiên cứu kiểm định kỹ, có chất lượng cao thì năng suất nuôi trồng cao, hiệu quả kinh tế cũng tăng cao; ngược lại khi sử dụng các giống nấm không rõ nguồn gốc hoặc giống không đủ tiêu chuẩn dễ dẫn đến hiệu quả sản xuất kém. Trong những năm qua Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật đã bước đầu nghiên cứu, tuyển chọn và xây dựng các quy trình công nghệ nhân giống, nuôi trồng nấm ăn- nấm dược liệu xong mới chỉ hoàn thiện được công nghệ nhân giống nấm trên cơ chất rắn. Từ năm 2009 cho đến nay, Trung tâm đã tiến hành nghiên cứu nhân giống nấm dạng dịch thể qui mô thí nghiệm (200ml đến 100lít) thử nghiệm trên một số giống: nấm mỡ, nấm Sò, nấm Linh chi, nấm Kim châm... kết quả cho thấy thời gian nuôi giống ngắn hơn so với công nghệ nhân giống truyền thống, xong tỉ lệ nhiễm bệnh vẫn còn cao (chiếm trên 30%), khả năng ra quả thể là 100%. Các nghiên cứu này mới dừng lại ở mức độ thăm dò và những kết quả bước đầu vẫn chưa được áp dụng vào việc sản xuất giống và nuôi trồng nấm ăn - nấm dược liệu.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu, sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng
Nấm dược liệu không còn là khái niệm mới mẻ đối với hầu hết mọi người, trên thực tế, nó đã tồn tại và được sử dụng từ hàng ngàn năm nay ở nhiều Quốc gia khác nhau trên thế giới nhằm tăng cường tuổi thọ và sức khỏe cộng đồng; Trên thế giới có khoảng 25 nghìn loại nấm trong đó có gần 300 chủng có giá trị dược liệu, nhưng hiện nay con người mới thực sự dùng làm thuốc chỉ mới 20 - 30 chủng nấm [16, 19, 26]. Nấm được biết đến với công dụng làm thuốc lâu đời nhất phải kể đến là Ganoderma lucidum, ở Trung Quốc có tên Ling zhi, trong tiếng Nhật là Mannentake, ở Việt Nam gọi là nấm Linh chi [11,16]. Nấm dược liệu chủ yếu được sử dụng làm thuốc theo phong tục dân gian trong các bài
10
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
thuốc đông y; Trung Quốc là nước dùng nấm làm thuốc nhiều nhất, gồm các loại như Linh chi, Phục linh, Trư linh, Lôi hoàn, Mã bột …[11, 8]; Ngoài ra, với hướng nghiên cứu dinh dưỡng thực phẩm trị liệu để phòng và hỗ trợ điều trị thì đa số các loại nấm dược liệu đều ít nhiều mang lại tác dụng khi thử nghiệm trên người và động vật.
* Các chức năng chính của polysaccharide - Là nguồn năng lượng dự trữ của tế bào và cơ thể. - Cấu tạo nên tế bào và các bộ phận của cơ thể. - Polysaccharide liên kết với protein tạo nên các phân tử glycoprotein là những bộ
(β-1,3-1,6-glucan), (β-1,4-glucan), zymosan alginate
Trong thành phần của nấm dược liệu có hàng ngàn hợp chất trong đó hầu hết là các chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe của con người, bên cạnh đó trong từng loại nấm lại có một số hợp chất đặc biệt chỉ hiện diện trong từng loài nấm [21, 23, 26, 29]. Hợp chất trong nấm được quan tâm nhiều nhất hiện nay là polysaccharide, cụ thể hơn beta-glucan (1,3/1,6); Beta-glucan đã được nghiên cứu, thử nghiệm rộng rãi và người ta đã chứng minh rằng chúng có khả năng kích thích và tăng cường hệ thống miễn dịch của con người. Bên cạnh thành phần chính có tác dụng tăng cường miễn dịch, nấm có khả năng sinh ra hàng loạt các chất có khả năng kháng u, hoạt tính chống oxy hóa, tính kháng các vi khuẩn và nấm gây bệnh cho người và động vật, hoạt tính kháng virut [19, 38, 39, 51]. * Polysaccaride: là các gluxit phức có phân tử rất lớn gồm nhiều đơn vị monosaccharide (như glucose, xylose và galactose) liên kết với nhau tạo nên. Polysaccharide không có vị ngọt như monosaccharide hay disaccharide, không tan trong nước mà chỉ tạo dung dịch keo; Đây là nhóm chất hữu cơ phổ biến và có khối lượng lớn nhất trên trái đất. Polysaccharide rất đa dạng về chủng loại. Trong cơ thể sinh vật có rất nhiều loại polysaccharide khác nhau, trong đó phổ biến nhất là tinh bột, glycogen, cellulose. Chúng được coi là các chất có hoạt tính sinh học đang thu hút được nhiều sự chú ý khai thác sử dụng. phận cấu tạo nên các thành phần khác nhau của tế bào. * β - glucan (beta – glucan): β - glucan là một polysaccharide được cấu thành từ các monosaccharide (là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D - glucose gắn với nhau qua liên kết β – glycoside; Nhóm các phân tử β - glucan được phân biệt dựa vào phân tử khối, độ hòa tan, độ nhớt và cấu trúc không gian 3 chiều. Các hợp chất này thường tồn tại dưới dạng phổ biến là cellulose của thực vật, vỏ cám của hạt ngũ cốc, thành tế bào của nấm men, nấm lớn và vi khuẩn. Một số loại β - glucan được sử dụng như chất dinh dưỡng ở người như hợp chất tạo mịn và chất xơ hòa tan, tuy nhiên lại có thể bị biến đổi trong trong quá trình đun sôi. Tùy theo liên kết của các monosaccharide trong chuỗi mà hình thành nên những hợp chất với tên gọi khác nhau như là: agar (β-1,3-1,4-glucan), fucoidan (β-1,3-glucan), (β-1,3-glucan), laminarin chrysolaminarin (β-1,3-1,6-glucan), carrageenan (β-1,3-1,4-glucan).
11
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 1.5: Liên kết β -1, 3 và β -1, 6 trong chuỗi polysaccharide
Agar, carrageenan được trích ly chủ yếu từ các loài rong biển thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta), trong khi fucoidan, laminarin, alginate lại dồi dào trong các loài thuộc ngành tảo nâu (Phaeophyta). Chrysolaminarin được trích ly từ vi tảo và zymosan hiện nay được trích ly chủ yếu từ nấm men Saccharomyces cerevisiae. Trong tự nhiên các dạng β - glucan cũng được tìm thấy trong vách tế bào của nấm, vi khuẩn, yến mạch và ngũ cốc, ... Giữa các dạng β - glucan khác nhau, bản chất cũng khác nhau. Fucoidan chứa các phân tử đường fucose, laminarin, chrysolaminarin được hợp thành chủ yếu là glucose. Alginate chứa các đường mannose và glucose. Trong khi đó carrageenan lại chứa đường dạng galactose và cũng được chia thành nhiều dạng như là kappa (k), lambda (λ), Iota (i). β- glucan là một khái niệm rất rộng tùy theo vị trí liên kết giữa các monosaccharide cũng như là tỉ lệ mà hình thành những hợp chất khác nhau vì vậy, về mặt cấu trúc cũng như là đặc tính sinh hóa học hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Nấm men và nấm lớn, đặc biệt là nấm dược liệu hấp thụ các β - glucan cho khả năng thích nghi với quá trình đề kháng. Các nghiên cứu đã cho thấy dạng hợp chất không hòa tan (1,3 - 1,6) β - glucan có hoạt tính sinh học cao hơn dạng (1,3 - 1,4) β - glucan. Sự khác nhau giữa liên kết β - glucan và cấu tạo hóa học chủ yếu là do độ hòa tan, phản ứng và hoạt tính sinh học.
- Nguồn β - glucan trong tự nhiên: một trong những nguồn phổ biến chứa β (1, 3) D - glucans được thu nhận từ thành tế báo của nấm men Sacchromyces cerevisiae. Bên cạnh đó, β (1, 3) (1, 4) - glucans cũng được chiết xuất từ vỏ cám của hạt yến mạch và lúa mạch, một ít từ lúa mạch đen và lúa mì. Các hợp chất β (1, 3) - glucan từ nấm men thường có thể hòa tan. Các chất được chiết xuất từ hạt thì bao gồm loại hòa tan và không hòa tan. Các nguồn khác bao gồm một số loại tảo biển, và một số loài nấm như Reishi, Shiitake, Maitake…
- Tính chất hóa học của β - glucan
β - glucan là chuỗi của các liên phân tử đường D - glucose tạo nên bởi liên kết loại β - glycoside. Vòng 6 D - glucose có thể gắn với phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D - glucose. Một vài hợp chất β - Glucan lại có cấu tạo lập lại của cấu trúc vòng D - glucose gắn tại một vị trí đặc biệt.
12
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Tuy nhiên, β - glucan có thể khác nhiều so với phân tử như tinh bột. Ví dụ, một phân tử β - glucan có thể chứa cấu trúc lặp lại của các đơn nguyên D - glucose gắn với nhau qua liên kết β - glycoside tại một vị trí như tinh bột, nhưng có nhánh glucose gắn vào vị trí khác trên chuỗi D - glucose. Các chuỗi phân nhỏ này có thể tạo thành nhánh của trục chính β - glucan (trong trường hợp của tinh bột, trục chính có thể là chuỗi D - glucose gắn tại vị trí 1,4) tại vị trí khác giống như vị trí 3, 6. Ngoài ra, các chuỗi này có thể gắn kết với một phân tử loại khác, chẳng hạn như protein. Ví dụ loại β - glucan có protein gắn với nó đó là Poly saccharide-K.
Hình thức phổ biến nhất của β - glucan đó là chứa các đơn nguyên D - glucose với các liên kết 1, 3 và với chuỗi D - glucose gắn vào vị trí 1, 6. Các loại này tạo thành β - glucan 1, 3 /1, 6. Một vài nhà nghiên cứu cho rằng tần suất, vị trí và chiều dài của chuỗi hơn là trục chính của các β - glucan quyết định hoạt tính đề kháng.
Một sự biến đổi khác đó là một vài hợp chất này tồn tại dưới dạng chuỗi sợi đơn, trong khi trục chính của những β (1, 3) - glucan khác tồn tại ở dạng các chuỗi sợi đôi hoặc sợi ba. Trong một vài trường hợp, các protein gắn vào trục β (1, 3) - glucan cũng có thể tạo nên hoạt tính kháng thể. Mặc dù các hợp chất này có tiềm năng để phát triển hệ thống kháng thể, tuy nhiên đó chỉ là những nghiên cứu sơ khai, và có nhiều ý kiến khác nhau về trọng lượng phân tử, hình dạng, cấu trúc và loại β (1, 3) - glucan nào sẽ tạo ra hoạt tính sinh học mạnh nhất. - Công dụng + Beta glucan và hệ thống miễn dịch Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh β - glucan có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể, hệ thống miễn dịch được tăng cường đóng vai trò quan trọng giúp con người chống lại bệnh tật. Khả năng tăng cường miễn dịch của β - glucan thông qua việc kích hoạt tế bào miễn dịch Macrophage, NK - Cells, T-Cells, B - Cell bao gồm cả Cytokines và bổ thể. Các tế bào này đóng vai trò quan trọng trong việc chống các yếu tố ngoại lai xâm nhập cơ thể như vi khuẩn, virut.., các tế bào ung thư. + β - glucan và bệnh ung thư Nhờ tác dụng kích hoạt hệ miễn dịch của cơ thể, β - glucan có vai trò khá quan trọng trong việc giúp hệ miễn dịch của cơ thể chống lại các bệnh ung thư. Các nước trên thế giới, đặc biệt ở Nhật Bản đã bắt đầu sử dụng β - glucan để hỗ trợ điều trị ung thư từ năm 1980, hàng trăm nghiên cứu ở các cơ sở nghiên cứu danh tiếng như Haward Medical School, Tulane University, Baylor Colledge of Medicine U.S. Armed Force… Mỹ, cho thấy β - glucan có tác dụng chống khối u, ức chế các khối u di căn, nhiều nghiên cứu cho thấy β - glucan có tác dụng nâng cao hiệu quả của hóa trị liệu, tăng đáng kể sự phát triển và kích hoạt các monocytes trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư. Tác dụng tích cực của β - glucan lên các tế bào ung thư thông qua cơ chế kích hoạt hệ miễn dịch, một trong những tác dụng đó là kích hoạt và làm tăng số lượng của các tế bào miễn dịch của cơ thể gọi là Macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên NK Cell. Macrophage là hàng rào miễn dịch đầu tiên bảo vệ và chống lại bất cứ yếu tố ngoại lai nào xâm nhập cơ thể, như vi khuẩn,
13
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
virus... kể cả các tế bào ung thư. NK Cell là một tế bào miễn dịch đặc hiệu có chức năng nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư. Sự hợp tác của 2 loại tế bào miễn dịch trên giúp bảo vệ toàn vẹn cho cơ thể chống lại bệnh tật. β - glucan bám vào bề mặt của Macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên NK Cell, tương tác với các phân tử này tạo ra sự kích hoạt miễn dịch, hình thành các “sát thủ tiêu diệt khối u”, các “tế bào sát thủ tiêu diệt khối u” này lưu thông trong cơ thể tích cực tìm kiếm tế bào ung thư, khi tiếp cận các các tế bào ung thư chúng sẽ tiêu diệt các tế bào này theo một cách đặc hiệu đảm bảo các tế bào lành của cơ thể nguyên vẹn và không bị phương hại.
β - glucan không chỉ kích hoạt các tế bào của hệ miễn dịch để đảm bảo cho chúng hoạt động ở mức tối ưu, mà còn làm tăng số lượng của các tế bào này. Các tế bào miễn dịch của cơ thể đa phần được sản sinh ra tế bào tủy xương, sự sản xuất ra các tế bào này đều đặn, liên tục, nhưng có giới hạn. Một lần nữa, β - glucan đến “tiếp ứng”, nó kích thích làm gia tăng các tế bào sản sinh tế bào miễn dịch ở tủy xương, làm gia tăng “đội quân tế bào miễn dịch” bảo vệ cơ thể, đi vào máu, các hạch, các tổ chức trong khắp cơ thể.
+ β - glucan phòng chống nhiễm khuẩn
Viện Alpha Technologies đã tiến hành một loạt thí nghiệm lâm sàng trên người để đánh giá tác động điều trị của β - glucan với các bệnh nhân có nguy cơ cao trong nhiễm trùng phẫu thuật, các dữ liệu từ thử nghiệm lâm sàng cho thấy sử dụng β - glucan làm giảm sử dụng kháng sinh tiêm tĩnh mạch. Các nhà khoa học kết luận β - glucan thúc đẩy thực bào giết chết các vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra các nghiên cứu cũng cho thấy β - glucan hiệp đồng làm tăng tác dụng của kháng sinh, các tác dụng này được giải thích nhờ tác dụng kích hoạt và bảo vệ hệ miễn dịch của β - glucan.
+ β - glucan chống phơi nhiễm phóng xạ
Các nghiên cứu cho thấy β - glucan nâng cao liều gây chết của động vật với bức xạ; nghiên cứu in vitro cho thấy β - glucan có thể tăng bạch cầu hạt và megakaryocyte hình thành thuộc tế bào gốc máu. β - glucan là thuốc bảo vệ cho hóa trị, xạ trị và trường hợp hạt nhân, đặc biệt β - glucan có thể sử dụng cho cả điều trị và dự phòng phơi nhiễm phóng xạ.
+ β - glucan và hệ hô hấp, tai mũi họng
Nhờ tác dụng tăng cường miễn dịch mạnh, β - glucan có thể tấn công sớm vào các tế bào ngoại lai, trong đó có các loại vi khuẩn virut.., β - glucan cải thiện đáng kể các trường hợp bệnh nhân bị các nhiễm khuẩn đường hô hấp, β - glucan làm giảm đáng kể các triệu chứng nhiễm trùng đường hô hấp như nghẹt mũi, sổ mũi, đau họng. Do vậy bổ sung β - glucan giúp cơ thể phòng ngừa, ngăn chặn các bệnh đường hô hấp thông qua tăng cường sức đề kháng tự nhiên của cơ thể.
+ β - glucan giảm nguy cơ sốc nhiễm trùng
Một trong những cơ chế về khả năng tăng cường miễn dịch của β - glucan là khả năng tăng bạch cầu để định vị và tiêu diệt các tế bào lạ bao gồm cả vi khuẩn. Nghiên cứu
14
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
trên động vật cho thấy β - glucan làm giảm sốc nhiễm trùng bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong máu.
+ β - glucan sử dụng trong chữa lành vết thương
Hoạt động thực bào đóng vai trò quan trọng trong việc chữa lành vết thương sau phẫu thuật hoặc chấn thương. Trong cả hai nghiên cứu trên động vật và trên người có dùng β - glucan làm giảm nguy cơ nhiễm trùng, giảm tỷ lệ tử vong và tăng khả năng làm lành vết thương.
+ β - glucan và bệnh mỡ máu, tiểu đường
Các loại thực phẩm có chứa β - glucan có tác dụng tăng nhu động ruột, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn, cải thiện các vấn đề về đường tiêu hóa. Nhiều nghiên cứu cho thấy β - glucan có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh và lipoprotein gan, dẫn đến hạ thấp xơ vữa động mạch, giảm nguy cơ các bệnh tim mạch nguy hiểm, nghiên cứu cũng cho thấy β - glucan có khả năng làm hạ đường huyết, giảm thiểu các nguy cơ tim mạch ở bệnh nhân tiểu đường.
Một số nấm dược liệu nghiên cứu rộng rãi nhất và được sử dụng ngày nay bao gồm: Linh Chi Ganoderma lucidum, nấm búp - nấm mặt trời Agaricus blazei, nhộng trùng thảo Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris, nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus, Maitake Grifola frondosa, nấm hương Lentinula edodes, nấm Vân chi Coriolus versicolor hay Trametes versicolor.
1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu
Hiện nay hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất có nguồn gốc thực vật ứng dụng trong phòng ngừa và điều trị một số bệnh của người và động vật tập trung vào các hướng:
- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. - Ức chế sự nhân lên của các vi khuẩn, virus gây bệnh và khả năng kháng viêm. - Các hợp chất có khả năng tham gia vào các quá trình sinh hóa hạn chế một số loại
bệnh như tiểu đường, ngộ độc hóa chất…
- Các hợp chất chống oxy hóa, hạn chế sự sản sinh các gốc tự do, hạn chế đột
biến gene.
- Hạn chế tác động tiêu cực của hội chứng mãn kinh ở phụ nữ và phòng tránh các
bệnh liên quan đến hội chứng mãn kinh.
- Nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính phòng và trị bệnh khởi đầu cho việc tổng hợp các chất mới có hoạt tính tương tự hoặc mạnh hơn hoạt tính của các hợp chất tự nhiên kết quả là các dược phẩm mới ra đời.
Ở nhật bản năm 1969 Ikekawa và các cộng sự là những tác giả đầu tiên có các công bố về hoạt tính kháng u của các thành phần cơ bản có trong nấm lớn từ họ Polyporaceae và một số họ khác chống lại ung thư thực nghiệm như sarcoma 180 trên chuột [38]. Năm 1999 các nhà khoa học Nhật Bản đã tiến hành thí nghiệm trên chuột cũng xác định là các
15
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
polysaccaride tách từ Agaricus blazei Murrili (nấm mỡ Blazil) có khả năng hoạt hoá một cách có ý nghĩa hệ thống miễn dịch, khả năng kháng ung thư và khối u, các polysaccaride này bao gồm (1-6, 1-3, β glucan, 1-6, 1-4 β Glucan, phức hợp polysaccharide-protein, RNA-protein, glucoman) [32].
Trung Quốc, Nga và Hàn Quốc đã sản xuất thành công một số loại thuốc kháng khối u có bản chất là polysaccharide được chiết xuất từ hệ sợi nấm và môi trường nuôi cấy một số loại nấm dược liệu khác nhau như là Shiitake (nấm Hương), Reishi (Linh chi), Corilous versicolor (Vân chi) [28].
Tiềm năng của việc sử dụng nguồn nguyên liệu là nấm dược liệu để làm thuốc là rất lớn; bằng chứng cho thấy chỉ riêng năm 1999, lợi nhuận từ sản xuất các chế phẩm sinh học từ nấm dược liệu trên thế giới đạt đến 18 tỷ USD xấp xỉ bằng giá trị của việc bán cafe; điều đó chứng tỏ việc đầu tư vào ngành sản xuất, canh tác, chế biến nấm ăn và nấm dược liệu là hướng đi đúng đắn mang lại hiệu quả kinh tế cao.
1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta
Từ những năm 2000 trở lại đây việc nghiên cứu về nấm lớn, đặc biệt là nấm dược liệu cũng được các nhà nghiên cứu Việt Nam quan tâm và đã có những kết quả đáng kể. Một số nhóm tác giả nghiên cứu về các chất có hoạt tính tách chiết từ nấm như:
Tác giả Nguyễn Thượng Dong và Bùi Thị Bằng (Viện dược liệu) đã có đề tài cấp Nhà nước (2005): “Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của 3 loài nấm Linh chi Ganoderma applanatum Pers. Pat., G. lobatum Schw. Atk. và G. lucidum Leyss. Fr. Karst., theo hướng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư và thuốc chống lão hóa”. Kết quả đã xác định được các đặc điểm hình thái và đặc điểm hiển vi của 3 loài nấm Linh chi Ganoderma applanatum Pers. Pat., G. lobatum Schw. Atk và G. lucidum Leyss. Fr. Karst. Giới thiệu đặc điểm hóa học, thử độc tính cấp và nghiên cứu tác dụng hồi phục tổn thương miễn dịch của 3 loài nấm Linh chi. Nghiên cứu tác dụng của 3 loài nấm Linh chi trên tế bào ung thư và tác dụng chống lão hóa của 3 loài nấm Linh chi.
Tác giả Lê Mai Hương và Cộng sự - Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên có các công trình nghiên cứu về chất có hoạt tính sinh học trong nấm ăn - nấm dược liệu, đặc biệt là các nghiên cứu về polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ, Linh chi, Vân chi [6, 7].
Tác giả Nguyễn Thị Chính (ĐH Quốc gia) đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng của nấm Linh chi, Đầu khỉ đối với sức khỏe con người; Trong dự án “Phát triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khoẻ”, (2005), tác giả đã tuyển chọn phân lập và xác định một số chủng nấm mới nấm nhập nội có giá trị dinh dưỡng cũng như tác dụng dược lý tốt đối với sức khoẻ như nấm Linh chi, nấm Đầu khỉ, nấm Đồng tiền và nấm Hương. Đánh giá tác dụng khử gốc oxy tự do chống phóng xạ trung hoà chất độc giảm đau của một số hoạt chất tách chiết từ nấm. Xác định một số thành phần của nấm như hàm lượng protein, lượng đường, độc tố vi sinh vật gây độc trên sản phẩm nấm tươi và nấm đã chế biến để bảo đảm tính an toàn khi sử dụng nấm
16
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
đối với sức khoẻ con người; Thử ảnh hưởng của các hoạt chất nêu trên đối với động vật thí nghiệm và người bệnh tại cơ sở thực nghiệm và Bệnh viện K [10].
1.2. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.
1.2.1. Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.
Nấm Đầu khỉ (hay còn gọi là nấm Hầu thủ) có tên khoa học là Hericium erinaceus, ở Trung Quốc được gọi là Shishigashida, ở Nhật Bản nó được gọi là Yamabushi-take. Nấm Đầu khỉ là loại nấm dược liệu quý chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng như các axit amin, đường, lipit, nguyên tố khoáng, vitamin và các chất có hoạt tính sinh học; Hương vị của loại nấm này rất tươi ngon, vị hơi đắng, tính ôn hoà [3, 4, 5, 6, 11, 13, 48].
Nấm Đầu khỉ được tìm thấy vào mùa thu và mùa xuân ở phía Bắc khu vực nhiệt đới; Loại nấm này mọc nhiều trên nhiều loại cây thân gỗ thuộc nhóm sồi, dẻ, các loại cây lá rộng đang sống hoặc đã mục nát, do đó có thể làm chết cây. Nấm Đầu khỉ được nuôi trồng lần đầu tiên ở Trung Quốc, sau đó được trồng ở Nhật Bản, các nước Bắc Mỹ và Châu Âu; cho đến nay nó được sử dụng khá phổ biến ở dạng bột khô trong túi lọc với nước sôi như pha trà hay được ngâm trong rượu; nó được coi là một loại thực phẩm bổ dưỡng, tăng lực và đặc biệt là một loại dược phẩm quí, có giá trị cao trong phòng chống ung thư [8, 11, 16].
Nấm Đầu khỉ không chỉ là nguồn dược liệu quí mà còn là loại thực phẩm ngon bổ dưỡng được gọi là “Kiện bảo thực phẩm”; Dược phẩm bào chế từ nấm Đầu khỉ khá phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc; Các thử nghiệm về độc tính đã được tiến hành kỹ lưỡng từ nhiều thập niên qua, kết quả cho thấy cả quả thể lẫn sinh khối sợi đều không hề có độc tính gì đối với người. Về dược lý, nấm Đầu khỉ được chứng minh có tác dụng nâng cao khả năng miễn dịch, phục hồi niêm mạc dạ dày, chữa loét thủng ruột, nâng cao năng lực đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi (điều này lý giải các sản phẩm nước uống tăng lực khá phong phú dùng cho các vận động viên thể thao ở Trung Quốc), chống oxy hóa, chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến tuần hoàn máu, chống lão hóa, ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư [8, 11].
Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus trong tự nhiên
17
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
1.2.2. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học [16]
Tên khoa học: Hericium erinaceus Tên tiếng Anh: Monkey head, Mountain hidden mushroom
Theo tác giả Trịnh Tam Kiệt (2013) [16], nấm Đầu khỉ thuộc: Ngành: Basidiomycota
Lớp: Basidiomycetes Bộ: Russulales Họ: Hericiaceae Donk
Chi: Hericium Loài: Hericium erinaceum (Bull.: Fr.) Pers.
1.2.3. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm Đầu khỉ
Quả thể nấm Đầu khỉ thường có dạng hình cầu hoặc hình ellip, đường kính quả thể 5- 10 x 5-7cm gồm các múi thịt nấm ghép lại với nhau như bộ óc khỉ, phần thịt nấm mền, xốp, có tua nấm dày đặc, rũ xuống; Quả thể nấm mọc riêng rẽ hoặc mọc thành chùm, mỗi
quả nấm tươi trưởng thành nặng trung bình 150 – 170 gam. Quả thể khi non có màu trắng đến trắng ngà, thịt màu trắng, khi già nấm ngả sang màu vàng đến vàng sậm, phần tua nấm
dài và chuyển sang màu vàng trông như bờm sư tử [8]. Các tua nấm chính là lớp bào tầng, dài từ 0,5 – 3 cm, trên bề mặt tua có các đảm màu trắng mang bào tử đảm hình cầu, giữa
bào tử có một giọt nội chất tròn.
Nấm Đầu khỉ là loại nấm ôn đới chỉ trồng được những vùng khí hậu mát mẻ, quả thể nấm Đầu khỉ có thể hình thành và phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 16 – 20oC [4, 8], nhiệt độ cao nhất có thể trồng nấm này là 19 – 27oC [8]; Trong điều kiện tự nhiên nuôi trồng tốt nhất vào mùa thu và mùa xuân. Nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ là nguồn phế phụ liệu từ nông, lâm nghiệp giầu xenllulo như: mùn cưa, rơm rạ, bông phế loại… có thể
khai thác ở nhiều vùng, nhiều địa phương trong cả nước [3, 4, 8, 9, 11, 12, 13, 14].
Hình 1.7: Hình thái quả thể nấm Đầu khỉ nuôi trồng nhân tạo
18
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
1.2.4. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H. erinaceus
1.2.4.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ
Các dẫn liệu kiểm tra về thành phần dinh dưỡng của nấm H. erinaceus cho thấy nấm này là một loại thực phẩm bổ dưỡng, có mức cung cấp nhiệt lượng vừa phải, cân đối về thành phần dinh dưỡng, giàu khoáng và vitamin. Tuy nhiên, ở mỗi điều kiện nuôi cấy hay phương pháp nuôi trồng khác nhau cũng dẫn đến việc thu được các thành phần trong nấm khác nhau. Hàm lượng khoáng trong nấm H. erinaceus cũng khá phong phú bao gồm Fe, Ca, Na, K,…; Các vitamin, đặc biệt B1, B2 có hàm lượng khá cao bao gồm có Niacin, ít vitamin A; Chưa phát hiện thấy vitamin C. Provitamin D có hàm lượng đặc biệt cao trong nấm H. erinaceus khô ở Nhật Bản, có khả năng chuyển thành vitamin D2 khi được chiếu sáng giúp cho hấp thụ và chuyển hóa Canxi, phòng bệnh loãng xương, yếu xương. Kết quả so sánh sản phẩm nấm Đầu khỉ ở Cát Lâm (Trung Quốc) và Nagano (Nhật Bản) được thể hiện qua bảng 1.1 dưới đây [8].
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm Đầu khỉ (trong 100g nấm khô) [8]
Thành phần
Chất tro Prôtêin thô Chất béo thô Chất sợi thô Chất xơ thực phẩm Glucide Năng lượng P Fe Ca Na K Mg Zn Vitamin B1 Vitamin B2 Vitamin B6 Vitamin B12 Vitamin A Niacin Provitamin D
Nấm ở Nagano, Nhật bản 9,01g 27,67 g 4,56 g - 40,15 g 18,66 g 227 Cal 10,10 mg 17,5 mg 2,9 mg 2,1 mg 43,70 mg 117,2 mg 8,0 3,83 mg 3,14 mg 0,41 mg 0,15 mg - 16,17 mg 451,4 mg
Nấm ở Cát lâm, Trung Quốc 8,87g 29,3 g 4,68 g 7,13 g - 50,02g 335 Cal 856 mg 18 mg 2 mg - - - - 0,69 mg 1,89 mg - - 0,01 mg - -
Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ trồng ở Cát Lâm -
Trung Quốc và ở Nagano - Nhật Bản được ghi lại qua bảng 1.2 sau đây:
19
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ H.erinaceus (mg trong 100g nấm khô) [8]
Axit amin
Lizin Histidin Valin Acginin Aspactat Xerin Glutamat Glixin Alanin Treonin Izolơxin Lơxin Tironin Phenilalani Tritophan Metionin Xistein Prolin
Nấm ở Cát Lâm - Trung Quốc 17,5 6,5 19,8 19,7 21,5 26,0 42,2 12,1 19,4 10,7 12,4 23,2 12,2 14,5 40,4 - - 9,5
Nấm ở Nagano - Nhật Bản 1,36 0,59 1,17 1,35 1,95 1,02 3,72 1,00 1,37 0,97 0,90 1,54 0,64 0,73 0,32 0,28 0,27 0,86
Theo phân tích của tác giả Khuất Hữu Trung và Cộng sự - Viện Di truyền Nông nghiệp
(2003) thành phần dinh dưỡng có trong 100g nấm Đầu khỉ được thể hiện ở bảng 1.3 sau:
Bảng 1.3: Hàm lượng một số thành phần hóa sinh của nấm Đầu khỉ [5]
(Đơn vị: mg, tính theo chất lượng khô tuyệt đối)
Chỉ tiêu Chỉ tiêu
Hàm lƣợng 13,64 86,36 19,94 40,33 2,89 0,715x10-3 5,755x10-3 8,661x10-3 1,075 x10-3 0,167 x10-3 0,043x10-3 1,45 3,39 TT 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 7.14 7.15 7.16 7.17 Serine Histidine Glycine Threonine Alanine Arginine Tyrosine Cystein+cystine Valine Methionine Phenylalanine Isoleucine Leucine Lysine Proline Hàm lƣợng 0,88 0,18 1,20 1,09 1,27 1,37 0,50 0,31 0,87 0,23 0,53 0,79 1,18 1,27 0,36 TT Chất khô 1 Nước 2 Protein tổng số 3 Glucid tổng số 4 Lipid 5 Nguyên tố khoáng 6 Cu 6.1 Zn 6.2 6.3 Fe 6.4 Mn Pb 6.5 Se 6.6 7 Acid amin 7.1 Aspartic acid 7.2 Glutamic acid 1.2.4.2. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ
Trong dân gian nấm Đầu khỉ được biết đến với vai trò làm thuốc hơn là vai trò thức ăn, các bệnh nhân mắc bệnh về rối loạn chức năng gan, thận khi dùng nấm Đầu khỉ tươi,
20
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
khô hoặc các sản phẩm chức năng chiết xuất từ loại nấm này có biểu hiện cải thiện bệnh rất rõ rệt bên cạnh đó loại nấm này còn giúp nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể, phục hồi niêm mạc dạ dày, chữa thủng loét ruột, nâng cao khả năng đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi, chống oxy hoá, chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến việc tuần hoàn máu, chống lão hoá, ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư.
Theo sự thống kê các kết quả của rất nhiều nhà nghiên cứu về polysaccharide tách chiết từ H.erinaceus của Han Z.H. và cộng sự (2012) thì polysaccharide tách chiết từ H. erinaceus (HEP) được coi là một loại thuốc truyền thống, thành phần hóa học và khả năng chống oxy hóa của HEP đã được điều tra. Phân tích HPLC cho thấy HEP có cấu tạo gồm: xylose (7,8%), ribose (2,7%), đường (68,4%), arabinose (11,3%), galactose (2,5%) và mannose (5,2%) [33]. HEP đã được thử nghiệm trên chuột bằng cách đưa vào thức ăn với liều lượng 300 mg/kg trong 15 ngày. Kết quả cho thấy HEP có khả năng làm giảm đáng kể lượng ure trong trong máu (BUN), creatinine trong huyết thanh và tăng nhanh khả năng thanh thải creatinin các cấp; các kết quả thử nghiệm còn cho thấy HEP có khả năng làm giảm đáng kể mức độ peroxy lipid và tăng hoạt động enzym chống oxy hóa ở động vật thực nghiệm [34, 35]. Gần đây nấm Đầu khỉ còn được chứng minh là có khả năng chống lại bệnh ung thư [8, 11, 48, 51].
Bảng 1.4: Một số thành phần có hoạt tính sinh học mang lại lợi ích sức khỏe của H. erinaceus [48] Tác dụng chính Chất có hoạt tính Polysaccharide STT 1 1.1 β - Dglucans: ví dụ β – 1,3 glucan; β – 1,
6 glucan
1.2 Α - HEP1 một dị polysaccharide với liên kết (1> 6) – D - Galactopyranosyl 1.3 HEPF3 (một dị polysaccharide, với một Chống ung thư, chống suy giảm miễn dịch, bảo vệ hệ thần kinh và chống oxy hóa. Chống ung thư và tăng cường khả năng miễn dịch. Chống ung thư và tăng cường khả năng miễn dịch. penta –saccharide lặp đi lặp lại.
2 3 Bảo vệ gan và chống oxy hóa Tác dụng có lợi sức khỏe phổ rộng
Endo-polysaccharide Các hợp chất lipid: + Hỗn hợp axit palmitic và axit stearic; + axit behenic + hỗn hợp axit tetracosanic; + 5-α-ergostan-3-một; + 5-α-stigmasten-22-3 + 5-α-stigmastan-3
4 Hợp chất phenolic: Hericenone B 5 Một số chất khác:
Tác dụng có lợi sức khỏe phổ rộng Tác dụng có lợi sức khỏe, bao gồm cả chống ung thư trên phổ rộng và tăng cường hoạt động miễn dịch.
+ 6-methyl-2,5-dihydroxymethyl-γ-pyranone; + 2-hydroxymethyl-5-α-hydroxy-ethyl-γ- pyranone; + 4-chloro-3, 5-dimethoxybenzoic–O- arabitol; + 4-chloro-3, 5-dimethoxybenzoic methyl ester; + 4-chloro-3, 5-dimethoxybenzoic;
21
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Các nghiên cứu về độc tính từ trước đến nay cho thấy quả thể và hệ sợi nấm Hericium erinaceus không hề có độc tính đối với con người. Theo một số tác giả, trong nấm Hericium erinaceus có một số thành phần diterpenoit có khả năng kháng các dòng tế bào ung thư nuôi cấy invitro, trong đó có dòng tế bào HeLa [38, 48].
a. Khả năng chống ung thư và điều hòa miễn dịch
Các polysaccharide trong nấm Đầu khỉ có khả năng hoạt hoá miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Lympho T và Lympho B. Trong quá trình điều trị các bệnh viêm gan, viêm phế quản mãn và một số bệnh tim phổi khác, các nhà khoa học Trung Quốc đã chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch của loại nấm này; Loại nấm này cũng có vai trò trong phòng chống mệt mỏi (anti-fatigues), tăng cường sinh lực đối với nam giới [48].
Các polysaccharide như ß-(1-3)-D - glucan được tách chiết từ nấm Đầu khỉ đã chứng tỏ khả năng ức chế sự hoạt động của tế bào ung thư và sự hoạt động của u bướu; Một số polyisoprenepolyol mới được tách chiết từ nấm Đầu khỉ đã được thử nghiệm trên chuột bạch với các khối u biểu bì phổi, bướu Saccôm ác tính 180 cho kết quả rất khả quan [48].
Khả năng chống ung thư và điều hòa miễn dịch đã được chứng minh bởi nhiều nghiên cứu trên động vật và người. Theo Wong và cộng sự, điều hòa miễn dịch là một trong những cơ chế hoạt động chính mang lại khả năng chống ung thư của H. erinaceus [71]. Các nghiên cứu về khả năng điều hòa miễn dịch và khả năng chống khối u của các polysaccharide chiết xuất từ dịch nuôi hệ sợi nấm H. erinaceus trên chuột cho thấy polysaccharide này có khả năng chống lại sự di căn của khối u ở phổi. Các nhà nghiên cứu cũng chỉ ra polysaccharide có khả năng làm tăng cường sự gia tăng của các tế bào T và đại thực bào [48]. Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự cho thấy các nội peritoneal chiết xuất từ quả thể H. erinaceus bằng nước nóng (50% ethanol / nước) có kết hợp với sử dụng lò vi ba có khả năng làm giảm trọng lượng khối u ung thư ruột từ 38 - 41% trong 2 tuần [42, 43, 44]. Các chất chiết xuất còn có khả năng làm tăng hoạt động của các tế bào “giết tự nhiên” (Tế bào NK) của lách, khôi phục sản xuất NO và thực bào trong đại thực bào phúc mạc và tăng cường việc sản xuất các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, và interleukin-6 từ các đại thực bào. Các chất chiết xuất cũng có vai trò trong việc làm giảm cyclooxygenase 2 và 5-lipoxy-genase dẫn đến ức chế tân mạch bên trong khối u. Hiệu lực của các chất chiết xuất chống lại Tế bào bạch cầu monocytic nhân U937 cũng đã được ghi nhận bởi Kim và cộng sự [44].
Trong quả thể khi còn non (YF), trong hệ sợi nấm (YM) và trong dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ (YE), người ta đã dùng phương pháp đặc biệt để có được các chế phẩm có tác dụng làm đổi mới tế bào lá lách, tăng cường sản sinh interleukine. Với tác dụng làm tăng thực bào các tế bào ung thư với cơ chế hoạt hoá yếu tố gây hoại tử (INF) thì cả 3 chế phẩm YF, YM, YE đều biểu hiện hoạt tính [54]. Trong nấm Đầu khỉ còn có một
22
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
số hợp chất có khả năng xúc tiến sinh tổng hợp yếu tố tăng cường thần kinh (NGF) có khả năng điều trị bệnh lú lẫn Alzheimer như: hericinone, hericinone D, hericinone E [53].
Các phân đoạn polysaccharide khác từ nấm H. erinaceus như xylan, glucoxylan, heteroxyglucan và các phức hợp protein của chúng có các đặc tính như là các yếu tố cải biến đáp ứng sinh học (BRM), đó có thể là lợi ích của chúng trong liệu pháp miễn dịch. Từ hệ sợi nấm H. erinaceus sau khi lên men chìm đã chiết bằng nước nóng (100oC), dung dịch 1% amonium oxlate (100oC) và 5% dung dịch NaOH (30oC), theo thứ tự thu được các polysaccharide là FI, FII, FIII-1 và FIII-2. Mỗi loại polysaccharide được chia nhỏ thành các phân đoạn và sử dụng các phương pháp làm sạch trên các cột sắc ký lọc gel và sắc ký ái lực, cuối cùng thu được 15 polysacchride. Trong nghiên cứu thực nghiệm kháng ung thư, có 5 loại polysaccharide (Flo-a-α, Flo-a-β, FIo-b, FIIo-1 và FIII-2b) có hoạt tính kháng ung thư rõ ràng; Ngoài ra còn có tác dụng kéo dài thời gian sống trên động vật thử nghiệm [48].
Dịch chiết từ hệ sợi và quả thể nấm H. erinaceus còn có tác dụng chống gây đột biến rất mạnh trên 5 dòng đột biến của Salmonella typhimurium TA 98; Dịch chiết cồn của hệ sợi hoặc quả thể tốt hơn là dịch chiết nước và dịch chiết từ quả thể nấm có tác dụng chống gây đột biến tốt hơn dịch chiết từ hệ sợi nấm.
b. Tác dụng giải độc gan, bổ dạ dày và hạ đường huyết.
Nấm Đầu khỉ có tác dụng bổ gan, khống chế có hiệu quả đối với viêm gan mãn do virut đạt hiệu quả tới 97 - 98%; nấm Đầu khỉ còn có tác dụng bổ ngũ tạng, giúp tiêu hoá tốt, chống viêm loét dạ dày. Trung Quốc đã chế biến thành công viên nhộng từ nấm Đầu khỉ để điều trị viêm túi mật, viêm gan cấp, mãn tính, chữa các chứng khó tiêu, khối u đường tiêu hoá và viêm loét dạ dày tá tràng cho kết quả rất khả quan.
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh H. erinaceus có những chức năng sinh lý quan trọng với con người, bao gồm khả năng điểu chỉnh hàm lượng lipít trong máu và làm giảm lượng đường glucose trong máu [34, 48]. Trong một nghiên cứu, khi dùng metanol để chiết từ quả thể nấm bám trên các cột silica gel và tách rửa bằng các gradient phân cực của chloroform/ etylacetate/ axeton/ methanol; hợp chất chính được chiết ra là D- threitol, D- arabinitol và axit palmitic. Các chiết xuất của nấm H. erinaceus được cô đặc tới loại bỏ các dung môi hòa tan và thu được phần cặn (gọi là HEM), hợp chất này được vào chế độ ăn kiêng; Hiệu quả của việc điều trị bằng HEM để nghiên cứu bệnh đái đường trên chuột được ghi nhận như sau: những con chuột bị đái đường mà không cho ăn HEM thì khát nhiều hơn những con chuột cũng bị bệnh như vậy nhưng được nuôi bằng HEM, những con chuột cho ăn HEM có tỉ lệ đường glucose trong máu thấp hơn đáng kể so với những con chuột không cho ăn HEM. Hiệu quả làm giảm lượng đường trong máu và tổng cholesterol là đáng kể trên những con chuột hàng ngày cho ăn HEM ở liều lượng 100mg/ kg tới 200mg/ kg trọng lượng cơ thể. Ngoài ra, nấm Đầu khỉ còn biểu hiện hoạt tính kháng nhiễm trùng với hoạt phổ rộng [48].
23
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
c. Khả năng bảo vệ tim và chống một số tác động của biến chứng tim mạch
Trong H. erinaceus có chứa một số chất có vai trò đáng kể trong việc phòng chống các bệnh biến chứng tim mạch do có khả năng chống rối loạn và điều hòa chuyển hóa lipid. Hiệu quả hypolipidemic của một exo-polymer sinh học được chiết xuất từ dịch nuôi hệ sợi nấm H. erinaceus đã được công bố bởi Yang và các cộng sự: khi bổ sung các exo- polymer sinh học với liều 200 mg /kg trọng lượng cơ thể vào khẩu phần ăn sẽ có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương xuống 32,9%, chỉ tiêu rối loạn cholesterol bằng 45,4%, chất béo trung tính tăng 34,3%, phospholipid 18,9%, chỉ số xơ vữa bằng 58,7%, hoạt động men gan tăng 20,2% và nó tăng mức HDL cholesterol huyết tương bằng 31,1% so với nhóm đối chứng [67]. Chất chiết của H. erinaceus trong ethanol có khả năng cải thiện quá trình chuyển hóa lipid ở chuột C57BL/6J khi cho chúng ăn chế độ nhiều chất béo, và những hiệu ứng trung gian này đã được điều chế bởi các biểu hiện của gen chuyển hóa lipid [67].
d. Khả năng bảo vệ hệ thần kinh
Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh là rất cần thiết cho việc duy trì các tổ chức tế bào thần kinh chức năng; Mori và cộng sự đã báo cáo rằng dịch chiết từ H. erinaceus bằng ethanol có khả năng phát huy yếu tố tăng trưởng thần kinh mRNA một cách tỉ lệ với nồng độ sử dụng [53]. Mori cũng chứng minh rằng dịch chiết từ H. erinaceus cũng có ích trong phòng ngừa hoặc điều trị chứng mất trí nhớ và khôi phục chức năng nhận thức; họ phát hiện ra rằng chính chế độ ăn uống có bổ sung bột H. erinaceus có khả năng ngăn chặn sự suy yếu trí nhớ ngắn hạn gây ra do β - amyloid (25-35) peptide ở chuột đực [53]. Trong một nghiên cứu lâm sàng trên hai nhóm song song, trong đó thử nghiệm trên 50 người đàn ông và phụ nữ Nhật Bản 80 tuổi bị suy giảm nhận thức nhẹ; Họ được cho uống bột H. erinaceust, kết quả cho thấy ở họ có biểu hiện tăng đáng kể chức năng nhận thức so với nhóm không sử dụng bột H. erinaceus; không có tác dụng phụ gây ảnh hưởng đến các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm [53].
Nagano và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng lâm sàng của H. erinaceus trên phụ nữ thời kỳ mãn kinh, người bị trầm cảm, người bị chứng mất ngủ cho thấy với một lượng nấm nhất định bổ sung vào khẩu phần ăn hàng ngày có thể làm giảm trầm cảm và lo âu ở những người tham gia thử nghiệm [58].
Wong và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ quả thể nấm H. erinaceus trong việc điều trị các chấn thương dây thần kinh ở người; Trong quá trình thử nghiệm trên chuột Sprague-Dawley bằng cách bổ sung qua đường uống hàng ngày, các kết quả cho thấy dịch chiết từ H. erinaceus có thể thúc đẩy sự tái sinh các tế bào thần kinh ở chuột bị tổn thương dây thần kinh do bị chấn thương cơ cấu myelin dẫn đến sự suy yếu hệ thần kinh nếu không được điều trị sẽ chuyển biến thành bệnh nặng của hệ thống thần kinh. Dịch chiết từ H. erinaceus có khả năng hỗ trợ cung cấp màng bọc myelin bao bọc sợi trục thần kinh, nuôi dưỡng và bảo vệ các tế bào thần kinh [71].
24
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Trong một nghiên cứu invitro bởi Kolotushkina và cộng sự cũng cho thấy dịch chiết từ H. erinaceus có khả năng thúc đẩy sự phát triển bình thường tế bào cerebellar và chứng minh tác dụng điều tiết quá trình tái tạo myelin [45].
e. Khả năng chống oxy hóa
Chức năng chống oxy hoá suy giảm được chứng minh là nguyên nhân gây ra một số quá trình lão hóa của cơ thể thậm chí còn là nguyên nhân gây ra một số bệnh bao gồm cả ung thư, biến chứng tim mạch, thoái hóa thần kinh và một loạt các rối loạn liên quan đến tuổi tác. Đối với các biến chứng kể trên thì thực phẩm bổ sung hay các loại thuốc tự nhiên trong đó có các hoạt chất chống oxy hóa mang lại các lợi ích đặc biệt. Chỉ số chất chống oxy hóa trong cơ thể được ví như khả năng dọn gốc tự do hoạt động; khả năng ức chế sự hoạt động của lipid peroxy của dịch chiết H. erinaceus bằng nóng đã được ghi nhận [48].
Wong và cộng sự đã phát hiện trong dịch chiết sợi nấm H. erinaceus giàu phenolic và có chứa hàm lượng sắt tiềm năng có khả năng tăng chất chống oxy hóa. Dịch chiết xuất từ quả thể tươi cũng đã xác định là có chứa mạch 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl có khả năng dọn triệt để các gốc tự do hoạt động; Họ có cũng báo cáo rằng tổng hàm lượng phenolic và khả năng hoạt động chống oxy hóa của dịch chiết xuất từ quả thể nấm Đầu khỉ sấy khô cao hơn so với dịch chiết từ quả thể nấm đông khô hoặc nấm tươi [71].
Trong một nghiên cứu gần đây của Han và cộng sự đã ghi nhận polysaccharide chiết xuất từ H. erinaceus có hoạt động chống oxy hóa quan trọng đối với bệnh thiếu máu cục bộ qua đó giảm thiệt hại do tổn thương thận gây ra trên động vật thí nghiệm [34,35].
1.2.5. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước
Nấm Đầu khỉ được nuôi trồng khá phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, có nhiều tài liệu ghi nhận các kết quả nghiên cứu về chọn tạo giống, nhân giống và nuôi trồng loại nấm này.
Từ năm 1989 tác giả Chang, S.H., Miles, PG., đã có những công bố về điều kiện
nuôi trồng một số loại nấm ăn, nấm dược liệu, trong đó có nấm Đầu khỉ [25, 28].
Tác giả Ahmed Imtiaj và cộng sự (2008) ghi nhận ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của nấm Đầu khỉ khi nghiên cứu sự mọc của nấm Đầu khỉ trên các môi trường PDA, Czapek Dox, Hoppokins, Hennerberg, Lily, môi trường cơ bản với thành phần 0,5gam MgSO4; 0,5 gam KH2PO4; 1 gam K2HPO4, có thay đổi 10 nguồn cácbon khác nhau bao gồm: Dextrin, Fructose, Maltose, Glucose, Lactose, Galactose, Sorbitol, Sucrose, Xylose, Mannose, kết quả được ghi nhận hầu hết các loại đường trên đều có ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ; trong đó các loại đường Glucose, Fructose, Maltose có ảnh hưởng không tốt hơn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ so với các loại đường khác [18].
Tác giả Burkhard Kirchhoff đã nghiên cứu nuôi trồng 15 chủng nấm Đầu khỉ trên 3 môi trường mùn cưa có bổ sung dinh dưỡng; Kết quả cho thấy một số chủng cho năng suất
25
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
cao nhất nhưng lại có chất lượng thấp. Môi trường dùng để nuôi trồng nấm Đầu khỉ cho năng suất cao nhất bao gồm 80% mùn cưa cây dẻ và bổ sung thêm 20% bột ngô [22].
Thử nghiệm môi trường nuôi trồng và nghiên cứu lựa chọn chủng H. erinaceum [22]:
Để có được cơ chất nuôi trồng thích hợp nhất nhóm tác giả đã thử nghiệm trên 3
+ Công thức 1: mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 10% cám mạch;
+ Công thức 2: mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 20% cám ngô;
công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau:
+ Công thức 3: mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 10% cám mạch với 5% cám ngô;
Độ ẩm nguyên liệu 63%; khối lượng nguyên liệu 2kg/ túi, nguyên liệu được khử
trùng ở nhiệt độ 120oC trong 2 giờ; để nguôi, cấy giống dạng hạt với tỉ lệ 2%;
Nuôi sợi ở điều kiện 25o C, thời gian nuôi 70 ngày.
Sau khi kín sợi, bịch nguyên liệu được chuyển sang phòng chăm sóc ra quả thể trong điều kiện độ ẩm không khí 95%, nhiệt độ 18oC và nồng độ CO2 không khí dưới 12o/oo. Sau 10 đến 14 ngày trong phòng nuôi quả thể nấm bắt đầu xuất hiện trên miệng túi. Thời gian thu hoạch nấm kéo dài trong 5 tuần với 2 lần thu hoạch liên tiếp.
Kết quả nghiên cứu môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ cho thấy: H. erinaceum thích hợp trồng trên nhiều loại cơ chất khác nhau, trong đó môi trường cho kết quả tốt nhất là ở công thức 2 (mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 20% cám ngô) năng suất đạt 400 gam nấm tươi/1 túi nguyên liệu, tiếp đến là ở công thức 3 (mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 10% cám mạch với 5% cám ngô) năng suất đạt 320g nấm tươi/1 túi nguyên liệu, ở công thức 1 (mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 10% cám mạch) năng suất đạt 300g nấm tươi/1 túi nguyên liệu [22].
Kết quả đánh giá chủng giống: năng suất nấm thương phẩm là một trong các chỉ tiêu để đánh giá chủng giống có thể đưa vào sản xuất phổ biến hay không, bên cạnh đó chỉ tiêu về chất lượng quả thể nấm cũng đóng vai trò rất quan trọng trong việc đánh giá chủng giống [19]; dựa trên các tiêu trí trên trong 15 chủng giống nghiên cứu nhóm tác giả đã tìm ra một số chủng năng suất cao (He 1 nguồn gốc từ Bỉ và He 2 nguồn gốc từ Đức, năng suất đạt 31-32%) và một số chủng cho chất lượng tốt (He 6 nguồn gốc Hà Lan và He 13 nguồn gốc từ Nhật, năng suất đạt 18 – 20%); trong đó chủng Đầu khỉ có nguồn gốc từ Bỉ có một số đặc điểm mong muốn với sự phát triển sợi nhanh, năng suất cao, chất lượng tốt, hình dạng quả thể đẹp và kháng sâu bệnh cao [22].
* Nuôi cấy giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ [22]: để sản xuất giống dạng dịch thể thu sinh khối sợi nhóm tác giả đã thử nghiệm 3 công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau:
+ Công thức dung dịch thứ nhất gồm 15 g rỉ đường mía/lít nước;
+ Công thức 2 cho 20 g biomalt/lít nước;
+ Công thức 3 gồm: 30 g malt (lấy dịch chiết)/lít, 5 g pepton/lít nước;
26
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Môi trường dinh dưỡng được đưa vào bình 150ml, mỗi bình đổ 75ml môi trường;
khử trùng; cấy giống; nuôi sợi ở 25oC trong 6 tuần với điều kiện lắc 140 vòng/phút.
Giống dạng dung dịch tiếp tục được nhân lên trong các bình lên men 12 lít (Braun, Melsungen) sử dụng các phương pháp được mô tả bởi Song và Cho (1987). Nhóm tác giả đã đưa ra kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể để nhân giống, trong đó công thức 3 cho sinh khối sợi cao nhất: 8g/ 75 ml dịch nuôi, tiếp theo là công thức 2: 6,2 g/75ml dịch nuôi sợi, cuối cùng là môi trường 1: 3,8g/75ml dịch nuôi [22].
Kết quả sử dụng giống nấm dạng dịch thể nuôi trồng nấm Đầu khỉ: sử dụng giống nấm dạng dịch thể để cấy sang môi trường nuôi trồng nấm, kết quả ghi nhận được có sự khác biệt so với sử dụng giống nấm dạng hạt như sau: sợi phát triển lan kín toàn bộ túi nguyên liêu sau 42 ngày kể từ khi cấy giống; quả thể non bắt đầu xuất hiện sau 5 đến 7 ngày kể tử khi đưa vào phòng nuôi chăm sóc quả thể. Phụ thuộc vào từng chủng, mùa thu hoạch có thể bắt đầu từ 10 đến 28 ngày sau khi thấy quả thể non xuất hiện. Với việc sử dụng giống dạng dịch thể nhóm tác giả Burkhard Kirchhoff thu được năng suất quả thể cao hơn hẳn so với sử dụng giống hạt, và được đánh giá là phương pháp nhân giống mang lại hiệu quả cao khi sử dụng trong nuôi trồng [22].
Tác giả Hassan khi nghiên cứu nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên cơ chất mùn cưa trong
điều kiện địa phương ở Ai Cập cũng cho các kết quả tương tự [36].
Trong tư liệu của Tác giả Nguyễn Lân Dũng, Đinh Xuân Linh cũng ghi nhận một số kinh nghiệm khi nuôi trồng nấm Đầu khỉ nhân tạo ở qui mô lớn, có thể phát triển công nghiệp hóa, kể cả nuôi trồng thủ công trong các túi nylon với cơ chất là phế phụ liệu nông lâm nghiệp lẫn nuôi cấy trong các hệ thống lên men lớn [4, 8].
Các điều kiện cần lưu ý khi nuôi trồng nấm Đầu khỉ bao gồm [3, 8, 9, 11, 12, 13, 14]:
- Nhiệt độ thích hợp nhất để phát triển hệ sợi nấm là 22 – 25oC.
- Nhiệt độ thích hợp nhất để phát triển quả thể nấm là 16 – 20oC.
- pH 5
- Hàm lượng nước trong nguyên liệu cơ chất từ 60 – 65%.
- Độ ẩm tương đối của không khí từ 80 – 90%.
- Nồng độ CO2 trong không khí không vượt quá 0,1%.
- Ánh sáng không cần trong pha hệ sợi sinh trưởng, khi ra quả thể cần ánh sáng tán xạ nhẹ.
Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng có thể áp dụng 10 công thức cơ chất sau đây để
nuôi trồng nấm Đầu khỉ với các túi nylon mỏng [11].
+ Công thức 1: 79%, mùn cưa, 20% bột ngô, 10% cám gạo, 1% thạch cao, 0.05%
MgSO4, 0.1% KH2PO4, 58% nước.
+ Công thức 2: 79% vỏ hạt bông, 20% cám gạo, 1% thạch cao, 60% nước
27
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Công thức 3: 70% rơm rạ cắt nhỏ, 30% cám gạo, 1% đường, 1% thạch cao, 1%
superphosphate, đủ ẩm.
+ Công thức 4: 65% rơm rạ cắt nhỏ, 35% cám gạo, 1% thạch cao, 0.05% MgSO4, 1%
superphosphate, đủ ẩm.
+ Công thức 5: 49% rơm rạ cắt nhỏ, 49% lõi ngô nghiền, 1% thạch cao, 1%
superphosphate, đủ ẩm.
+ Công thức 6: 78% lõi ngô nghiền, 20% cám gạo, 1% đường, 1% thạch cao
+ Công thức 7: 78%, mùn cưa, 20% cám gạo, 1% thạch cao, 1% đường.
+ Công thức 8: 76%, mùn cưa, 3% bột ngô, 20% cám gạo, 1% thạch cao, 1% đường.
+ Công thức 9: 76% bã mía, 20% cám gạo, 2% bột đậu tương, 1% thạch cao, nước 60-65%
+ Công thức 10: 78% bã mía, 20% cám gạo, 1% bột đường, 1% thạch cao, nước 60-65%
Sau khi đóng bịch, khử trùng, cấy giống, xếp các bịch lên giá và duy trì nhiệt độ ổn định ở 22 – 25oC. Độ ẩm không khí chỉ cần khoảng 60 – 65%. Mỗi ngày mở cửa sổ để thông khí trong 1 – 2 giờ, tránh để thán khí vượt quá 0,1%. Mức độ ánh sáng tán xạ nên duy trì ở mức 50 – 60 lux. Khi sợi nấm mọc trắng đầy bịch cần tăng mức chiếu sáng lên đến 100 lux. Không nên xếp dầy quá, mỗi khoảng 1 m3 chỉ nên đặt không quá 20 bịch [3, 8, 9, 11, 13, 14].
Trên cơ chất hỗn hợp nền chất xơ sợi, sau 23 – 27 ngày bắt đầu thấy mầm thể quả xuất hiện (đầu tiên là thấy nhiều điểm trên bề mặt khối cơ chất nấm bện kết hệ sợi thành những mụn cục nhỏ). Khi đó nên đưa vào pha hạ nhiệt: buồng lạnh khoảng 16- 22oC và bắt đầu phun mù tạo ẩm mỗi ngày 4 – 5 lần. Mở nút cổ bịch cho thế quả mọc bung ra ngoài. Sau 30 – 35 ngày, quả thể đã đủ lớn, màu trắng đẹp, đường kính đạt trên 10 -12 cm. Sau một tuần quả thể bắt đầu chuyển sang màu vàng, các tua nấm teo tóp lại. Cần hái nấm lúc còn trắng, tua nấm chưa bị héo vàng, khi mà bào tử chưa phóng thích mạnh thành đám bụi trắng, thịt nấm còn mọng chắc. Tránh để bào tử phát tán quá mạnh, quả thể trở nên xốp. Trong thời gian chăm sóc thu hoạch cần nâng và duy trì độ ẩm cao 90 - 95%, bằng phun mù. Sau khi thu hái lần đầu, có thế chăm sóc để thu hoạch thêm 2 lần nữa [3, 8, 9, 11, 12, 13, 14].
Ở Nhật Bản hay Trung Quốc, người ta thường trồng nấm Đầu khỉ trong các chai nhựa khoảng 2 – 2.5 lít, miệng rộng và để thẳng đứng, cho nên quả thể hình thành dạng
tròn, tua ngắn, trông rất giống đầu con khỉ. Tuy nhiên kích thước thường không lớn (8 – 12 cm đường kính, theo đó trọng lượng chỉ đạt 80 – 110 gam/1 quả tươi), khi sấy khô chỉ nhỏ
như quả trứng gà, khoảng 10 gam, bán tại Bắc Kinh khá rẻ, tuy nhiên nấm tươi lại khá hiếm gặp trong siêu thị [8].
Ở Việt Nam thường nuôi trồng trên các bịch lớn nhỏ khác nhau, thu quả thể lớn hơn rõ rệt (đường kính thường đạt tới 13 – 16 cm). Do các bịch đặt nằm ngang nên nấm
28
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
hình thành thể quá khá giống điều kiện tự nhiên, thành những cụm khá lớn, tua thường
kéo dài hơn. Khi dùng các loại bịch lớn chứa nhiều cơ chất (500 – 600 g khô), dễ dàng thu hoạch được hai đợt, năng suất khá. Một số cơ sở dùng loại bịch nhỏ, chỉ thu hoạch
một lần [8].
Vì là loại nấm có giá trị dược liệu cao nên từ lâu ở Trung quốc, Nhật Bản,… đã tiến
hành nuôi cấy chìm để thu sinh khối nấm Đầu khỉ trong các hệ thống lên men (Fermentor); Các loại thuốc chữa bệnh dạ dày, ruột, các loại nước uống tăng lực… hầu hết được bào chế từ các nguồn nguyên liệu sinh khối lên men. Sản phẩm trên thị trường
Nhật Bản, Trung Quốc thường là các chế phẩm tinh chế từ nấm Đầu khỉ như: Essence of Hericium – Oral liqid, super Quaility Healthy Oral Liqid,… từng hộp 10 chai nhỏ 10 ml,
hoặc các dạng gói viên hoàn,… giá khá đắt so với nấm khô hoặc tươi, dùng như những thực phẩm cao cấp [8, 11].
Các môi trường nuôi cấy sơ cấp có thành phần đơn giản như sau:
+ Giống nuôi cấy lắc: 50 g cám gạo đun sôi, lọc lấy nước, 20 g đường, 1 g
KH2PO4, 0,5g MgSO4, nước 1000ml.
Chia dung dịch môi trường vào các bình tam giác 500 ml, mỗi bình 100 – 200 ml.
Đậy nút bông và hấp khử trùng bằng nồi hấp áp lực (Autoclave). Đợi nguội cấy giống từ ống thạch nghiêng sang. Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 24 – 26oC, pH = 4.5, nuôi lắc trong 5 – 7 ngày, sau đó chuyển sang bình 2500 – 5000 ml. Lượng giống cấy khoảng 10% [1, 13].
+ Giống nuôi cấy nồi lên men nhỏ: 2% đường, 1% bột khô dầu, 0,1% cao nấm men,
0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4, nước 1000ml.
Môi trường chiếm khoảng 70% dung tích nồi, khử trùng ở áp suất 0,12 Mpa trong
45 phút. Nồi nhân giống cấp 1 có dung tích 60 – 100 lít, cấy giống với lượng 3 – 5%, nuôi cấy ở 24 – 26oC, lượng thông khí là 1: 1 (V/V.m), áp suất trong nồi là 0,5 x 105 Pa. Sau 7 ngày nuôi cấy sẽ chuyển sang nồi nhân giống cấp 2. Đây là nồi có dung tích lớn hơn: 400 – 500 lít. Lượng cấy giống là 10%. Điều kiện nhân giống như ở nồi nhân giống cấp 1. Sau 5 ngày nuôi cấy chuyển sang nồi lên men thu nhận sinh khối [8, 11].
+ Môi trường lên men: 3% đường; 1,5% bột đậu tương; 1,5% bột ngô, 0,1%
pepton; 0,1% KH2PO4; 0,05% MgSO4; nước 1000ml.
Khử trùng ở 0,12 Mpa trong 1,5 giờ; Để nguội, cấy giống với tỷ lệ 10%, lên men trong 5 ngày. Hệ thống lên men công nghiệp có thể lên tới dung tích 2500 – 5000 m3. Khi pH giảm xuống 4,5 và lượng đường dư chỉ còn 0,2% thì kết thúc quá trình lên men. Lọc
dịch lên men và chuyển dịch lọc và sinh khối sang phân xưởng bào chế và tinh chế tinh dược liệu [8, 11].
29
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
1.2.6. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả thể và hệ sợi
nấm dược liệu
1.2.6.1. Phương pháp tách chiết trong cồn
a. Phương pháp của Mizuno (1999) [55]
+ Bước 1: sấy khô nguyên liệu
+ Bước 2: chiết trong etanol nóng để loại những chất có trọng lượng phân tử thấp
+ Bước 3: tách phần cặn sau chiết, tiếp tục chiết trong nước nóng 100oC trong 3 giờ
+ Bước 4: chiết trong kiềm NaOH 5%, nhiệt độ 80oC trong 6 giờ
+ Bước 5: bổ sung axit oxalat 1%, nhiệt độ 100oC trong 6 giờ
Sự thu nhận polysaccaride ở các bước tiếp theo được tiến hành bởi sự kết hợp các
kỹ thuật: kết tủa phân đoạn, kết tủa trong axit acetic, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực.
b. Phương pháp của Yap và Ng (2001): β – glucan từ Nấm Hương (Lentinula edodes) được tách bằng cách kết tủa trong cồn etanol và đông khô bằng nito lỏng: β - glucan từ
nấm Hương Lentinus edodes được tách thông qua sự kết tủa bằng etanol và đông khô bằng nitơ lỏng. Khi tinh chế dùng một cột phân tích cacbonhydrat, cho độ tinh khiết là
87,5%. Về mặt thương mại, phương pháp này tốn ít thời gian, hiệu quả hơn và giá thành thấp hơn so với phương pháp của Mizuno [44].
- Elaine R. Carbonero và cs, (2006) cũng đã công bố một quy trình chi tiết để chiết β - glucan từ quả thể của 2 chủng nấm sò: Pleurotus eryngii và P. ostreatus vẫn
dựa trên nguyên tắc chung như các tác giả trên [30].
1.2.6.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng
Phương pháp tách, chiết polysaccaride từ quả thể hoặc sinh khối nấm Maitake để làm thuốc hỗ trợ chống ung thư bao gồm các bước chiết với nước nóng, cô đặc dịch chiết dưới áp suất thấp, kết tủa dịch bằng một dung môi hữu cơ, thẩm tích tủa để loại chất có trọng lượng phân tử thấp và chiết tạp chất bằng dung môi hữu cơ ưa béo để loaị bỏ chúng. (Theo paten của Nhật năm 1968 - Japanese Patent Publication No 16047/1968 và năm 1984- Japanese Patent LOP Publication No 210901/1984). Tuy nhiên, phương pháp này chưa hẳn là phù hợp cho sự chuẩn bị một lượng lớn nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng vì các bước tinh chế quá phức tạp và sản
phẩm còn chứa những chất kìm hãm hoạt tính miễn dịch.
30
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Khắc phục hạn chế trong phương pháp tách chiết β - glucan theo Paten của Nhật,
người Mỹ đã đưa ra Paten số 5854404 năm 1998 (United State Patent 5854404 - Antitumor substance extracted from Grifola – issued on December 29, 1998), theo đó
một chất chống u, bướu có hoạt tính miễn dịch cao, đã được tách, chiết và phân đoạn từ sợi hoặc quả thể Grifola bằng nước nóng, có thể thu được bằng việc bổ sung etanol vào
dịch chiết sao cho nồng độ cuối cùng đạt 20 - 60% (tốt nhất là 20 - 50%) thể tích để loại các chất lơ lửng hoặc tạp chất.
1.2.6.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và
siêu âm [62].
Theo báo cáo của Sheng - Quan Huang và cộng sự (2010) [62] về kết quả tối ưu
hóa điều kiện tách chiết Polysaccharide trong nấm Linh chi Ganoderma lucidum bằng kiềm đã chỉ ra rằng quá trình tách chiết có hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm mang lại
hiệu quả chiết cao hơn hẳn so với không sử dụng vi sóng và siêu âm. Sheng - Quan Huang đã đưa ra điều kiện thí nghiệm tối ưu cho quá trình tách chiết polysaccharide từ
Ganoderma lucidum trong kiềm như sau: nhiệt độ 60,1ºC, thời gian 77,3 phút, nồng độ NaOH là 5,1% và tỷ lệ dung dịch kiềm 21,4 ml/g cơ chất rắn. Hiệu suất chiết
polysaccharide từ Ganoderma lucidum là 8,21% cao gấp 5,0 lần so với chiết trong nước nóng. Quy trình tách gồm các bước sau:
- Tiền xử lý: bột Linh chi khô (độ ẩm 13,26%) được hồi lưu hai lần với ethanol 95% nhiệt độ 70ºC trong một cốc nước nóng trong 3 giờ để bất hoạt các enzym nội sinh
và loại bỏ một số chất hòa tan, bao gồm cả đường tự do, axit amin và một số phenol. Các chất chiết xuất được ly tâm (3.000 vòng, 10 phút) theo phương pháp của Li; phần cặn
chiết G. lucidum dạng viên được hút chân không sấy khô ở 60ºC trong 24 giờ.
- Chiết trong nước nóng có sự trợ giúp của sóng siêu âm và vi sóng: phần bã G.
lucidum sau chiết ethanol khô được hòa vào nước sau đó dùng sóng siêu âm tác động để tăng hiệu quả chiết. Việc khai thác siêu âm được thực hiện trong 60 phút ở nhiệt độ
50ºC; tiếp tục xử lý mẫu trong lò vi sóng ở chế độ 350 W trong 10 phút. Phần bã kh ông hòa tan được tách ra bằng cách ly tâm (5000 vòng, 15 phút) và sấy khô chân không ở
60ºC trong 20 giờ để có được phần bột không tan (độ ẩm 12,26%) tiếp đưa vào tách trong kiềm. Phần dịch chiết được xử lý theo phương pháp của Li để có được những
polysaccharide thô hòa tan trong nước.
- Tách trong Alkaline: các dư lượng khô của G. lucidum sau chiết nước nóng tiếp tục được chiết trong dung dịch NaOH 5,1% để trích xuất các polysaccharide hòa tan trong kiềm. Phần dịch sau chiết xuất được ly tâm (3000 vòng, 10 phút) thu phần
31
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
chất lỏng. Chất lỏng sau chiết được đưa vào thiết bị bay hơi quay ở 60 oC trong 30 phút cuối cùng đông khô để có được những polysaccharide thô hòa tan trong kiềm.
1.2.6.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm [61, 69].
Bước 1: Tiền xử lý vật liệu Quả thể H. erinaceus khô được nghiền mịn, đem cân, ngâm trong nước tỷ lệ 15 -
- Chiết nước nóng: lấy hỗn hợp đã xử lý ở bước 1 gia nhiệt đến 80 – 90oC, duy
Bước 4: Chiết ethanol Đưa phần cặn sau cô quay vào chiết tiếp bằng ethanol 80 - 90% với tỷ lệ 1:2 để
Theo tác giả Yilin M. các polysaccharide từ Hericium erinaceus có thể được chiết xuất bằng cách kết hợp ba phương pháp: chiết bằng nước nóng, chiết bằng siêu âm và chiết dưới tác dụng của lò vi sóng. Phương pháp chiết bằng lò vi sóng được đánh giá là có hiệu quả chiết cao, thời gian chiết nhanh, tiết kiệm vật liệu chiết, tiết kiệm năng lượng và thân thiện với môi trường; Dưới tác động trực tiếp của bước sóng ngắn trong lò vi sóng sẽ tác động lên vật liệu chiết, do đó nhiệt độ vật liệu được tăng lên một cách nhanh chóng, độ hòa tan của chất mục tiêu trong môi trường được tăng lên, chất lượng chất chiết ổn định. Tốc độ làm nóng vật liệu bằng lò vi sóng cao, thời gian gia nhiệt vật liệu là ngắn, sau đó quá trình chiết sẽ tiếp tục được hoàn thành ở nhiệt độ thấp, do đó các thành phần chức năng của polysaccharide có thể được bảo vệ một cách hiệu quả. Phương pháp chiết bằng nước nóng và phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm là phương thức truyền thống được sử dụng để chiết hầu hết các hợp chất trong nấm lớn, các thông số vận hành được tối ưu hóa, tốc độ và năng suất khai thác được đảm bảo. Quá trình chiết polysaccharide bằng nước nóng kết hợp tác động của lò vi sóng và siêu âm sẽ mang lại hiệu quả cao hơn khi sử dụng đơn lẻ từng phương pháp; Bao gồm các bước sau: 25 theo trọng trong 4 giờ trước khi đem chiết. Bước 2: Chiết - Khai thác lò vi sóng: lấy hỗn hợp đã xử lý ở bước 1 đưa vào lò vi sóng, điều chỉnh công suất của máy phát điện lò vi sóng 600 – 800 trong 6 - 10 phút, đưa hỗn dịch ra để tách rắn - lỏng, loại bỏ các chất rắn còn lại sau khi thu dịch chiết (dịch chiết I); trì nhiệt trong vòng 2 - 8 giờ, lọc để thu hỗn hợp chất lỏng (dịch chiết II); - Khai thác siêu âm: lấy hỗn hợp đã xử lý ở bước 1 gia nhiệt đến 40°C, sử lý bằng siêu âm trong 40 - 60 phút, điều chỉnh pH = 7 5, lọc thu dịch lỏng (dịch chiết III); Bước 3: trộn 3 dịch chiết (I, II, III) thu được ở 3 cách chiết, đưa hỗn dịch vào thiết bị cô quay áp suất thấp, cho bay hơi ở nhiệt độ 50 – 60oC, thu lấy phần bột sau bay hơi. hòa tan polysaccharide kết tủa trong phần bột sau cô quay;
32
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bước 5: Ly tâm
Đem toàn bộ phần hỗn dịch chiết trong ethanol vào thiết bị làm lạnh để giảm nhiệt độ dịch chiết xuống 4oC trong 18 - 30 giờ, sau đó đưa đi ly tâm ở 2500 – 4000 vòng/phút, ly tâm trong 20 - 30 phút, thu thập polysaccharide bằng cách lấy phần cặn ở ống ly tâm.
Bước 6: Sấy khô Các polysaccharide thu nhận được đem sấy chân không ở 50 - 70°C đến khối
lượng không đổi.
Như vậy, nấm Đầu khỉ là loại nấm dược liệu rất có tiềm năng với giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, chính vì vậy nó đã được nghiên nhiều về công nghệ nhân
giống, quy trình nuôi trồng, quy trình tách chiết các chất có hoạt tính… cả ở trong nước lẫn trên thế giới. Tuy nhiên, tại Việt Nam quy trình nhân giống và nuôi trồng nấm Đầu
khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể chưa được nghiên cứu một cách chi tiết từ quy mô nhỏ đến quy mô sản xuất lớn; Chính vì thế Luận án của tôi nhắm vào các nội dung
nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ; Sản phẩm nấm thu được sẽ được sử dụng để tách chiết
polysaccharide theo phương pháp chiết nước nóng và chiết kiềm. Kết quả của Luận án nhằm góp phần khai thác hiệu quả hơn nữa các tiềm năng sử dụng nấm ăn – nấm dược
liệu nói chung và nấm Đầu khỉ nói riêng.
33
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguồn giống
Trong đó: - Giống nấm Đầu khỉ ký hiệu He1, He2 có nguồn gốc từ Trung Quốc được du nhập
- Giống nấm Đầu khỉ ký hiệu He3, He4 có nguồn gốc từ Nhật bản đã được du nhập
Bốn chủng nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.:Fr).Pers đang lưu giữ tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp, được ký hiệu He1, He2, He3, He4; vào nước ta từ những năm 2009. vào nước ta từ những năm 1998.
2.1.2. Mẫu thí nghiệm
- Nấm Đầu khỉ đã sấy khô được thu hái đúng kỹ thuật, là sản phẩm của quá trình
nuôi trồng bằng giống nấm dạng dịch thể; - Polysaccarit tổng số tách chiết từ nấm Đầu khỉ (kí hiệu HT1)
2.1.3. Các chủng vi sinh vật kiểm định:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922 ) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 ) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
- Nấm sợi: Aspergillus niger (439)
Staphylococcus aureus (ATCC12222) Fusarium oxysporum (M42)
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
2.1.4. Dòng tế bào: Các dòng tế bào ung thư người hiện được lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KH& CN Việt nam. Trong đó:
+ Dòng MCF7 (Human Breast adenocarcinoma – ung thư biểu mô vú) + Dòng Lu (Lung cancer – ung thư phổi) Có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm Bioassay trường ĐH dược Illinois-USA + Dòng HepG2 (Human Hepatocellular carcinoma– ung thư gan người) + Dòng RD (Human Rhabdosarcoma - ung thư mô liên kết) Có nguồn gốc từ Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương
- Các dòng tế bào được giữ trong Nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong các môi
trường dinh dưỡng có bổ sung huyết thanh bê tươi 7-10%.
34
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2.1.5. Động vật thí nghiệm
0,2 kg đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.
2,0 g đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.
- Thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 2,0 - Chuột nhắt trắng (CNT) trọng lượng 20,0 Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm
chuyên dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm.
2.1.6. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị
* Hóa chất
Một số hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm có nguồn gốc từ Merck - Đức, Xilong chemical – Trung Quốc và Việt Nam: Pepton, Cao nấm men, Glucose 98%, Saccarose 98%, Agar 98%, MgSO4 .7H2O (99%), KH2PO4 (99%), K2HPO4 (99%); NaOH, KOH, Na2CO3, CH3COOH loại phân tích, cồn thực phẩm 96%; Axit sulfuric 95,5% trọng lượng riêng 1,84; Phenol, 80% tính theo trọng lượng, chuẩn bị bằng cách thêm 20 gam nước cất vào 80 gam phenol tinh khiết dạng tinh thể;
Chất phá bọt sử dụng: Tween 80 (1ml/lít môi trường); antifoam (0,5 ml/lít môi trường);
soybean oil wasted powder (1 g/lít môi trường); dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
Kháng sinh: Streptomycin, Tetracyclin, Nystatin, Amphotericin B. * Nguyên liệu - Khoai tây: tươi, không nhiễm bệnh, không mọc mầm; - Giá đỗ: tươi, không bị dập nát; - Nấm Sò tươi, được thu hái trong giai đoạn trưởng thành, không quá non hay quá
- Thóc tẻ: lựa chọn loại thóc tốt, cùng chủng loại, kích thước hạt đồng đều, không
- Lõi ngô nghiền: lõi ngô khô độ ẩm đạt 12-13%, được nghiền nát, không nhiễm
- Bã mía: độ ẩm đạt 12-13%, được nghiền mịn, không nhiễm mốc, hóa chất. - Bông phế loại: lấy từ các nhà máy dệt, chứa nhiều hạt bông, đảm bảo khô tuyệt
già, hái xong sử dụng luôn hoặc được bảo quản lạnh không quá 3 ngày. chọn thóc quá dẻo tránh trường hợp sau khi luộc thóc bị nát, bết. - Mùn cưa: có thể sử dụng nhiều loại mùn cưa khác nhau, tốt nhất là mùn cưa cây cao su, mùn keo, mùn bồ đề, gỗ mít, mùn cưa các loại gỗ tạp không có tinh dầu; Không dùng mùn cưa đã bị mốc, đã bị xử lý qua hoá chất, mùn cưa các loại cây gỗ cứng như Đinh, Lim. Mùn cưa mới có thể dùng ngay, nếu dùng dần phải phơi khô đóng bao hoặc phối trộn thêm phân vô cơ ủ bảo quản dài ngày chống mốc, chống mùn hoá làm mất dinh dưỡng. Các loại gỗ không có tinh dầu, không nhiễm mốc, mốc, hóa chất. đối, không nhiễm dầu máy, hóa chất độc hại. - Bông hóa học không thấm nước. - Túi nylon chịu nhiệt, cổ nút nhựa, nắp nhựa...
35
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
* Thiết bị:
Nồi khử trùng; Box cấy vô trùng; Tủ nuôi vi sinh; Máy khuấy từ; Máy lắc; Tủ sấy; Cân phân tích; Kính hiển vi; Kính lúp soi nổi; Máy li tâm; hệ thống bình lên men thể tích 2 lít, 5 lít, 20 lít, 50 lít, 120 lít; Nồi hấp thủ công, công suất 500 bịch nguyên liệu/1mẻ hấp; Nồi hấp áp lực công xuất 1,5 – 2,5kg hơi/giờ; 500 bịch nguyên liệu/ 1 mẻ hấp. Bề ổn nhiệt Memmert (Đức); Bình cầu thủy tinh 2 cổ dung tích 2 lít; Máy li tâm; Sinh hàn đứng và sinh hàn ngang; Bình thủy tinh miệng rộng; Dụng cụ đo độ nhớt Ubelot (Nga). Máy đo OD, máy ELISA
2.2. Các loại môi trƣờng
2.2.1. Môi trường giữ giống nấm lớn
- Môi trường PGA: Khoai tây 20 gam, glucose 20 gam, agra 20 gam, nước 1000ml.
2.2.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu xây dựng QTCN phân lập giống gốc
- Sử dụng môi trường Czapeck không bổ sung đường làm môi trường đối chứng (MTĐC): khoai tây 200 gam, MgSO4 .7H2O 1 gam, KH2PO4 1 gam, K2HPO4 1 gam, agar 20 gam, nước 1000ml - Môi trường sử dụng trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ: trên nền MTĐC bổ sung lần lượt các loại đường với hàm lượng 20g/L như sau:
1. MTĐC + Glucose (20g/ L) 3. MTĐC + Saccarose (20g/ L) 5. MTĐC + Lactose (20g/ L)
2. MTĐC + Fructose (20g/ L) 4. MTĐC + Maltose (20g/ L)
- Môi trường sử dụng trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nito đến sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ: trên nền MTĐC bổ sung lần lượt các loại đạm khác nhau với hàm lượng tương ứng như sau:
1. MTĐC + Cao nấm men: 2 g/L 2. MTĐC + Pepton: 2 g/L 3. MTĐC + Bột ngô 4. MTĐC + Cám gạo 5. MTĐC + Mầm malt 6. MTĐC + Cao đậu tương 7. MTĐC + (NH4)2SO4: 1 g/L 8. MTĐC + NH4NO3 : 1 g/L 9. MTĐC + NaNO3: 1 g/L 10. MTĐC + (NH4)2HPO4:1 g/L
- Môi trường sử dụng trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn bổ sung vitamin đến sinh trưởng của hệ sợi giống gốc: trên nền MTĐC bổ sung lần lượt các loại vitamin với hàm lượng tương ứng như sau: 2. MTĐC + Thiamin: 20µg/L 3. MTĐC + Vitamin B tổng hợp: 20µg/L 4. MTĐC + Nước chiết nấm tươi: 200 g/L
- Môi trường sử dụng trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi giống gốc: dựa trên việc nghiên cứu nguồn cacbon, nito,
36
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
vitamin thích hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ, tiến hành nghiên cứu tỉ lệ C/N thích hợp với các công thức được trình bầy trong bảng 2.1 sau.
Bảng 2.1: Thành phần môi trường phân lập nấm Đầu khỉ (cho 1 lít môi trường)
Công thức CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5
200 1 1 0,5 20 0,5 0.5 10 - - - 20 6,5 200 1 1 0,5 20 1 1 20 50 - - 20 6,5 200 1 1 0,5 20 1,5 1,5 30 100 10 10 20 6,5 200 1 1 0,5 20 2 2 40 150 20 20 20 6,5 200 1 1 0,5 20 2,5 2,5 50 200 30 30 20 6,5 Thành phần Khoai tây (g) KH2PO4 (g) K2HPO4 (g) MgSO4 .7H2O (g) Glucose (g) Pepton (g) Cao nấm men (g) Thiamin (µg) Nấm tươi (g) Cám gạo (g) Cám ngô (g) Agar (g) pH
2.2.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
- Môi trường sử dụng trong nhân giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể (thể tích 200ml);
Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
Công thức
CT 6
CT 7
CT 8
CT 9
200 100 15 1
200 100 15 1
200 100 15 1
200 100 15 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0,5
1
2 2,5 20 6,5
2,5 3 30 6,5
1 1 - 6,5
1,5 2 10 6,5
Thành phần Khoai tây (g) Nấm tươi (g) Glucose (g/l) KH2PO4 (g/l) K2HPO4 (g/l) MgSO4.7H2O (g/l) (NH4)2HPO4 (g/l) Cao nấm men (g/l) Pepton (g/l) Thiamin (µg/l) pH
- Môi trường sử dụng trong nhân giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích 2000-5000ml);
37
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 2.3: Thành phần môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể
Công thức
CT 10
CT 11
CT 12
CT 13
Thành phần
15 1
15 1
15 1
15 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Glucose (g/l) KH2PO4 (g/l) K2HPO4 (g/l) MgSO4.7H2O (g/l) (NH4)2HPO4 (g/l) Thiamin (µg/l)
20
20
20
20
2 6,5
3 6,5
4 6,5
5 6,5
Pepton (g/l) pH
- Môi trường sử dụng trong nhân giống dạng dịch thể phục vụ sản xuất (thể tích 120L);
Bảng 2.4. Thành phần môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
Công thức
CT 14
CT 15
CT 16
CT 17
10 5 10 1 1 1 1 1 1 1
10 7 15 2 1 1 1 1 1 1
10 10 20 3 1 1 1 1 1 1
10 12 25 4 1 1 1 1 1 1
Thành phần Glucose (g/l) Saccarose (g/l) Bột dinh dưỡng cô đặc (g/l) B1 uống (viên) Phá bọt (g/l) MgSO4 .7H2O (g/l) KH2PO4 (g/l) K2HPO4 (g/l) NaNO3(g/l) NH4NO3(g/l)
2.2.4. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể
- Môi trường sử dụng trong thí nghiện nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất và thành phần dinh dưỡng phối trộn đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng nhiễm bệnh của nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng thu quả thể:
Bảng 2.5: Thành phần môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ (% khối lượng)
Thành phần
Công thức
Lõi ngô 40
Bã mía 40 Cám gạo 6 6 6 6 Cám ngô 8 8 8 8 Bột nhẹ 1 1 1 1 CTNT 1 CTNT 2 CTNT 3 CTNT 4 Độ ẩm Mùn cưa 85 45 45 45 Bông hạt 40 65±2%
38
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2.2.5. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của polysaccharide
- Môi trường duy trì và bảo tồn nấm men và nấm mốc: Saboraud Dextrose Broth
(SDB) 1 % peptone, 2% dextrose;
- Môi trường duy trì và bảo tồn vi khuẩn: Trypcase Soya Broth (TSB): 20 g/l cao
đậu tương, 2,5 g/l glucose; 5 gam NaCl; 2,5 g/l K2HPO4
- Môi trường thí nghiệm: + Thử nghiệm vi khuẩn: môi trường Eugon Broth (Difco, Mỹ) + Thử nghiệm nấm: môi trường Mycophil (Difco, Mỹ)
2.2.6. Môi trường nuôi cấy tế bào sử dụng trong kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào của polysaccharide
- Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium): 10% huyết thanh bê
- Môi trường MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) 7-10% huyết
- Dịch kháng sinh PSF:100đơn vị/ ml Penicilin, 100 g /ml Streptomycin sulfate,
tươi, 1% dịch kháng sinh (PSF), 1% NAA (Nonessential Amino Axit). thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh (PSF) và 1% NAA (Nonessential Amino Axit). 0,25 g /ml Amphotericin B.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ
2.3.1.1. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ
- Bốn giống nấm Đầu khỉ được lưu giữ tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật từ năm 2005 trên môi trường thuần khiết được nhân chuyển sang môi trường thóc (giống cấp 2) sau đó nuôi trồng thử nghiệm trên nguồn nguyên liệu mùn cưa và bông hạt có bổ sung phụ gia cám gạo, bột ngô; qui trình nhân giống và nuôi trồng áp dụng theo qui trình đã hoàn thiện của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp.
- Khảo nghiệm cơ bản: thí nghiệm khảo nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần; lấy mẫu ngẫu nhiên 50 bịch mỗi loại giống; định kỳ theo dõi 3 ngày 1 lần, điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 10 bịch.
Sử dụng phương pháp sàng lọc giống nấm Đầu khỉ thông qua các chỉ tiêu về hình
thái quả thể, năng suất, khả năng thích nghi với điều kiện tự nhiên, khả năng chịu bệnh.
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Các chỉ tiêu về sinh trưởng, phát triển:
+ Thời gian mọc kín bịch.
+ Thời gian xuất hiện mầm quả thể.
+ Thời gian thu hái đợt 1.
39
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Thời gian thu hái các đợt tiếp theo.
- Chỉ tiêu về mức độ nhiễm sâu bệnh.
Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) = (Số bịch bị nhiễm bệnh/ Tổng số bịch) x 100
- Các chỉ tiêu về năng suất, chất lượng nấm.
+ Kích thước quả thể nấm (cm).
+ Trọng lượng nấm tươi/ bịch nguyên liệu (gam)
+ Tỷ lệ nấm khô/ tươi (%).
Bố trí 3 lần nuôi trồng lặp lại đối với bốn chủng Đầu khỉ nghiên cứu, mỗi lần 150
bịch nguyên liệu/ 1 chủng.
2.3.1.2. Phân lập lại (thuần khiết lại) giống nấm Đầu khỉ
Dựa vào kết quả nuôi trồng khảo nghiệm chọn ra giống nấm Đầu khỉ có khả năng thích ứng tốt với điều kiện khí hậu Việt Nam, hình thức quả thể đẹp, giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao để tiến hành phân lập lại nguồn giống gốc sạch bệnh, chất lượng giống ổn định.
Chọn quả thể nấm to, chắc khoẻ, không sâu bệnh, hình thái cân đối mang đặc trưng điển hình của chủng giống ban đầu để tiến hành phân lập giống gốc. Quả thể nấm sau khi được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 độ và rửa lại bằng nước cất vô trùng, tiến hành thu bào tử nấm, mô nấm, hệ sợi nấm. Các công đoạn được tiến hành trong box cấy vô trùng; có 2 phương pháp phân lập giống gốc:
a. Phương pháp tách bào tử nấm [56]: đây là phương pháp dùng bào tử nấm cho nẩy mầm sinh hệ sợi nuôi thành giống gốc. Sau khi rửa sạch mẫu nấm, đưa mẫu vào cốc nuôi có sẵn giấy lọc đã thanh trùng để một ngày đêm, lấy mẫu nấm ra bào tử sẽ phát tán ra giấy thành dấu in bào tử màu trắng. Dùng que cấy chấm môi trường PGA dính vào bào tử rồi chuyển vào môi trường PGA. Hoặc cho bào tử rơi vào 10 ml nước cất vô trùng trong thời gian 24 giờ, dùng pipet lấy 0,1 ml dịch thể bào tử, pha trong nước cất vô trùng, nhỏ lên đĩa petri có môi trường nuôi cấy. Đĩa Petri được đánh dấu bằng các đường tròn ở mặt sau có đường kính 0.5 cm, mỗi 0,1 ml dịch thể bào tử nhỏ vào một đường tròn. Sau khi nuôi từ 12 – 24 giờ thì tiến hành đếm số lượng bào tử trong mỗi đường tròn. Từng bào tử trong mỗi đường tròn khi nảy mầm sẽ được tách riêng để cấy truyền sang môi trường mới. Kết quả thí nghiệm trong nghiên cứu này sẽ cho thấy số lượng bào tử trong mỗi 0,1ml dịch thể (từ 0 - 15 bào tử) và dễ dàng trong việc tách riêng từng bào tử.
Tiến hành phân tách từng bào tử nấm riêng biệt để nuôi cấy sang môi trường nuôi cấy nấm thuần khiết. Đem nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng tự nhiên; Theo dõi sinh trưởng của hệ sợi sinh ra từ từng bào tử ở các giai đoạn sinh trưởng của quả thể khác nhau; chọn lấy những mẫu có hệ sợi sinh trưởng khỏe, đều đặn, không nhiễm bệnh đem nuôi thuần hóa, nhân ra các cấp làm giống thí nghiệm nuôi trồng ra nấm thương phẩm.
40
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
b. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào [56]: sau khi rửa sạch mẫu nấm, tách đôi quả thể nấm bắng dao đã thanh trùng, cắt mô nấm đưa vào môi trường PGA, đem nuôi trong điều kiện thích hợp mỗi ngày kiểm tra một lần, chọn ra những ống giống bung sợi nhanh, phát triển đều, không nhiễm bệnh để cấy chuyển tiếp ra các cấp làm giống thí nghiệm nuôi trồng ra nấm thương phẩm.
Các chủng giống thuần thu được nhờ hai phương pháp phân lập trên đều phải trải qua quá trình nuôi trồng ra quả thể thử nghiệm nhiều lần, khi thấy được tính ưu việt của giống phân lập được mới đem dùng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Môi trường sử dụng cho các thí nghiệm là môi trường PGA Số mẫu cấy trong một công thức thí nghiệm là 30 mẫu, nhắc lại 3 lần Chỉ tiêu theo dõi: thời gian nẩy mầm, tỉ lệ nhiễm, đặc điểm hệ sợi trên môi trường
thuần khiết.
2.3.1.3. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân lập giống gốc
Lựa chọn quả thể nấm Đầu khỉ ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau để phân lập có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng giống nấm cũng như khả năng nẩy mầm của bào tử và mô nấm. Trong thí nghiệm này sử dụng 4 giai đoạn tuổi khác nhau dùng để phân lập giống.
+ Giai đoạn 1: Quả thể vừa nhú mầm trên bịch nguyên liệu nuôi trồng (sau 5 - 7
ngày kể từ khi rạch hoặc nới nút bông cho ra quả thể)
+ Giai đoạn 2: Quả thể nấm còn non (3 - 5 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể).
+ Giai đoạn 3: Quả thể nấm trưởng thành nhưng chưa phát sinh bào tử (7 - 9 ngày
kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng).
+ Giai đoạn 4: Quả thể nấm chuyển sang giai đoạn già, phát sinh bào tử (11 - 13
ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng)
Xử lý mẫu nấm và lấy mô nấm cấy chuyển sang môi trường PGA
Nuôi sợi ở nhiệt độ nuôi 25oC± 2oC trong điều kiện không cần ánh sáng.
Số mẫu cấy trong một thí nghiệm là 30 mẫu, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: khả năng bung sợi, tốc độ mọc sợi, đặc điểm hệ sợi trên môi trường
thuần khiết.
2.3.1.4. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nito đến sinh trưởng của hệ sợi giống gốc: tiến hành cấy mô nấm vào các công thức môi trường ĐC 1, ĐC 2 có bổ sung các nguồn cacbon, nito khác nhau, nuôi sợi ở nhiệt độ 25oC± 2oC trong điều kiện không cần ánh sáng.
41
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
- Nghiên cứu thành phần môi trường phân lập giống nấm Đầu khỉ: cấy mô nấm lên 5 công thức môi trường (bảng 2.1), nuôi sợi ở nhiệt độ 25oC± 2oC trong điều kiện không cần ánh sáng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và tốc độ phát triển của hệ sợi giống nấm Đầu khỉ trên môi trường phân lập giống gốc: cấy mô nấm Đầu khỉ vào môi trường CT 3; nuôi sợi ở các nhiệt độ khác nhau: 20 ± 2oC, 24 ± 2oC, 28 ± 2oC.
- Các chỉ tiêu theo dõi: khả năng bung sợi, tốc độ mọc sợi, đặc điểm hệ sợi.
Tốc độ mọc sợi được tính bằng cách: đo đường kính lớn nhất, nhỏ nhất của vòng
tròn lan sợi, lấy giá trị trung bình rồi chia cho tổng thời gian nuôi; đơn vị tính: mm/ngày
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp
2.3.2.1. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung tích 200 ml)
- Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: khử trùng ở chế độ nhiệt độ 115oC trong thời gian: 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút, 40 phút; lưu mẫu trong 30 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: mầu sắc môi trường sau khử trùng, tỉ lệ nhiễm sau thời gian lưu mẫu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: cấy giống vào các môi trường trình bầy ở bảng 2.2, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 ±2oC, chế độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: Sử dụng công thức môi trường CT 8; chỉnh pH môi trường ở các giá trị: 4; 5; 6; 6,5; 7; 8; khử trùng, để nguội, cấy giống, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 – 27oC, chế độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ trung gian cấp 1: sử dụng môi trường CT 8;
Giống cấy: 1 ống giống trên môi trường thạch thuần khiết nghiền nhỏ trong 100ml nước
cất vô trùng, cấy vào môi trường dạng dịch thể với các tỉ lệ: 2%, 4%, 6%, 8% theo thể tích. Nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 – 27oC, chế độ lắc 150 vòng/phút, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ trung gian cấp 1: Sử dụng CT 8, tỉ lệ giống cấy: 4% theo thể tích.
Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ 20±2oC, 24±2oC, 28±2oC, 32±2oC
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: sử dụng môi trường CT 8, tỉ lệ giống cấy: 4% theo thể tích, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC;
42
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Các chế độ nuôi:
+ Nuôi tĩnh + Nuôi trên máy khuấy từ: con khuấy kích thước 2 cm, tốc độ khuấy 150 vòng/ phút + Nuôi lắc: 150 vòng/phút
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lắc và chế độ khuấy đến sự sinh trưởng của hệ
sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1
+ Nuôi trên máy khuấy từ: sử dụng con khuấy kích thước 2 cm, tốc độ khuấy thay
đổi theo các mức: 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 vòng/ phút.
+ Nuôi lắc: nuôi giống trên máy lắc với các tốc độ lắc: 110, 120, 130, 140,150, 160,
170, 180 vòng/ phút.
- Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1: Sử dụng môi trường CT 8, tỉ lệ giống cấy 4% theo thể tích, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, chế độ nuôi lắc tốc độ 150 vòng/ phút.
Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể.
2.3.2.2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung tích 2000 - 5000 ml)
- Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: Khử trùng ở chế độ nhiệt
độ 115oC trong thời gian: 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút; lưu mẫu trong 30 ngày.
* Chỉ tiêu theo dõi: mầu sắc môi trường sau khử trùng, tỉ lệ nhiễm sau thời gian lưu mẫu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: cấy giống vào các môi trường trình bầy trong bảng 2.3, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25 – 27oC, có sục khí, thời gian nuôi 7 ngày.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể dùng để cấy chuyển đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: Sử dụng công thức môi trường CT 12;
Cấy giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể ở các thời điểm: giống sau 72 giờ nuôi (3 ngày); 96 sau giờ nuôi (4 ngày), giống sau 120 giờ nuôi (5 ngày); giống sau 144 giờ nuôi (6 ngày)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ trung gian cấp 2: sử dụng môi trường CT 12;
Cấy chuyển giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể được nuôi sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể với các tỉ lệ sau: 3%, 5%, 7%, 10% so với thể tích;
43
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ trung gian cấp 2: Sử dụng môi trường CT 12
Các chế độ sục khí: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 (đơn vị tính: lít khí/ 1 lít môi trường/ 1 phút)
- Nghiên cứu tác dụng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2: sử dụng CT 12; chất phá bọt sử dụng: Tween 80 (1ml/lít môi trường), antifoam (0,5 ml/lít môi trường); soybean oil wasted powder (1 g/lít môi trường); dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
- Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2: Sử dụng
CT 12, chất phá bọt sử dụng: dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
Cấy chuyển giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể được nuôi sau 120 giờ nuôi (5
ngày), tỉ lệ 7% so với thể tích
Chế độ sục khí: 0,5 lít khí/ 1 lít môi trường/ 1 phút
Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể.
2.3.2.3. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít)
- Nghiên cứu thành phần môi trường nuôi cấy cho nhân giống thể tích 120 lít: sử
dụng các môi trường trong bảng 2.4
Cấy giống, nuôi sợi ở nhiệt độ 24±2oC, sục khí 0,5lít khí/1 lít môi trường/1phút.
Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ mọc của sợi (được đánh giá dựa trên sinh khối sợi trong
100 ml dịch, sau 5 ngày nuôi)
- Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể, dung tích 120
lít: Sử dụng CT 16
Khử trùng ở chế độ nhiệt độ 121oC trong thời gian: 60 phút, 70 phút, 80 phút, 90
phút; Lưu mẫu trong 10 ngày
Chỉ tiêu theo dõi: mầu sắc môi trường sau khử trùng, tỉ lệ nhiễm sau thời gian lưu mẫu.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể dùng để cấy chuyển đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trong bình lên men dung tích 120 lít: Sử dụng CT 16; khử trùng ở chế độ nhiệt độ 121oC trong thời gian: 80 phút.
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể ở các thời điểm: giống sau 72 giờ nuôi (3 ngày); 96 sau giờ nuôi (4 ngày), giống sau 120 giờ nuôi (5 ngày); giống sau 144 giờ nuôi (6 ngày); 168 giờ (7 ngày).
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, có sục khí, thời gian nuôi 5 ngày.
44
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ dạng dịch thể trong bình lên men dung tích 120 lít: sử dụng CT 16;
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi
trường nhân giống dung tích 120 lít với các tỉ lệ sau: 5, 10, 15, 20% (so với thể tích)
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, có sục khí.
- Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong bình lên men
dung tích 120 lít: Sử dụng môi trường CT 16.
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi
trường nhân giống dung tích 120 lít với tỉ lệ 15% so với thể tích.
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, có sục khí.
Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể.
* Các chỉ tiêu theo dõi trong nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp
- Tốc độ mọc của sợi: được đánh giá dựa trên sinh khối sợi trong 100 ml dịch, sau 7
ngày nuôi;
- Đặc điểm của hệ sợi: soi khuẩn lạc cầu (KLC) trên kính hiển vi soi nổi để đánh giá
- Kích thước khuẩn lạc cầu: gắp khuẩn lạc cầu cho vào nước cất, để khuẩn lạc cầu
trương nở hết cỡ, đưa lên máy kính lúp có thang đo để đo.
- Mật độ khuẩn lạc cầu: đếm trực tiếp số khuẩn lạc cầu trong 10 ml dịch nuôi, trong
trường hợp số khuẩn lạc cầu quá lớn sử dụng phương pháp pha loãng sau đó đếm trực tiếp.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 mẫu/ 1 công thức.
2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể
a, Kiểm tra độ thuần khiết của dịch nuôi
Soi dịch nuôi dưới kính hiển vi, kiểm tra để xác định xem vi khuẩn có tồn tại trong
dịch nuôi hay không. Phương pháp này nhanh, có thể kịp thời biết được kết quả kiểm tra.
Cấy trực tiếp dịch nuôi vào môi trường PGA trên đĩa petri, hoặc nuôi dưỡng trong môi trường nước thịt có pepton; Sau thời gian 24 - 48 giờ kiểm tra sẽ cho biết có hay không tạp khuẩn gây nhiễm trong quá trình lên men.
b, Kiểm tra khả năng phát triển của hệ sơi
Dùng kính hiển vi, kính lúp soi nổi để quan sát mép ngoài của khuẩn lạc cầu (hệ sợi
nấm hình cầu), quan sát sự phân nhánh và đo kích thước của khuẩn lạc cầu.
45
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
c, Kiểm tra kích thước hệ sợi hình cầu (khuẩn lạc cầu)
Lấy mẫu, lọc, rửa, cho một lượng nhỏ khuẩn lạc cầu vào trong đĩa petri, thêm nước cất để khuẩn lạc cầu nở ra, căng hết cỡ; đo kích thước lớn nhỏ của khuẩn lạc cầu dưới đĩa petri trên kính lúp có thang đo.
d, Kiểm tra tốc độ sinh trưởng của hệ sợi
Tốc độ sinh trưởng và phát triển được xác định thông qua trọng lượng khô của hệ sợi nấm trên một đơn vị dịch nuôi. Lấy100 ml dịch nuôi cần kiểm tra, lọc lấy phần sợi nấm, dùng nước xịt rửa cặn bám, ly tâm, lọc lấy sợi nấm, sấy khô rồi cân.
e, Xác định mật độ khuẩn lạc cầu
Mật độ khuẩn lạc cầu trong một đơn vị thể tích dịch nuôi cũng là chỉ tiêu để đánh giá tốc độ sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường nhân giống; để xác định được mật độ khuẩn lạc cầu tiến hành rót một lượng mẫu nhất định, đếm trực tiếp số khuẩn lạc cầu trong mẫu, có thể pha loãng mẫu để đếm trong trường hợp số lượng khuẩn lạc cầu quá lớn.
f, Kiểm tra mùi khí thoát ra của dịch lên men
Kiểm tra tại lỗ thoát khí của bình lên men, thấy khí có mùi thơm dễ chịu đặc trưng của sợi nấm bay ra là dịch lên men bình thường; nếu như sau 12 tiếng lên men, ngửi thấy có mùi chua thối, điều này chứng tỏ rằng dịch nuôi dưỡng đã bị nhiễm.
g, Đo pH: dùng giấy kiềm hoặc máy đo pH.
ơ2.3.3. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể
2.3.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ [3, 8, 9, 11]
- Mùn cưa, lõi ngô nghiền nhỏ, bông hạt được làm ẩm bằng nước vôi trong pH 10 –
11, với định lượng 4kg vôi/1000 lít nước, ủ 1 - 3 ngày, đảo đều, ủ tiếp 1 - 3 ngày.
- Bã mía: tạo ẩm bằng nước vôi trong rồi dùng luôn, tránh ủ qua đêm làm chua
nguyên liệu.
Độ ẩm nguyên liệu sau ủ đạt 65 - 67%, nguyên liệu đã được xử lý tiến hành phối trộn phụ gia theo các công thức thí nghiệm, sau đó đóng túi 19 x 33 cm, mỗi bịch nguyên liệu có khối lượng 750 - 800 gam, độ nén nguyên liệu vừa phải sao cho chiều cao nguyên liệu sau khi đóng túi đạt 22 – 24 cm.
Khử trùng nguyên liệu
Cấy giống: Cấy giống nấm dạng dịch thể chất lượng tốt; các mẫu đối chứng cấy giống dạng hạt được sản xuất tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp.
Nuôi sợi: Bịch cấy giống xong được nuôi trong phòng có điều kiện tối, ở nhiệt độ
thích hợp.
46
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Thu hái: thu hái đúng độ tuổi khi nấm chưa phát tán bào tử trắng.
Sơ chế: sấy khô ở nhiệt độ 40 – 45oC trong 4 giờ để làm giảm lượng nước, sau đó
tăng dần nhiệt độ để sấy nấm đến khô kiệt, nhiệt đô sấy tối đa 65oC.
Bảo quản: Bảo quản nấm Đầu khỉ tươi ở nhiệt độ 3 - 6oC trong nhiều nhất 7 ngày;
bảo quản nấm khô trong túi nylon kín ở nơi khô thoáng, điều kiện tự nhiên.
2.3.3.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể
- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng nhiễm bệnh của nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng thu quả thể: sử dụng CTNT 1, phối trộn nguyên liệu đồng đều, tạo ẩm nguyên liệu ở các ngưỡng khác nhau: 50%±2%, 55±2%, 60±2%, 65±2%, 70±2%.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử
trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể: phối trộn các nguyên liệu theo các công thức như bảng 2.5; độ ẩm 65±2%.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh
trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng thu quả thể:
Sử dụng môi trường CTNT 3, khử trùng bằng nồi hấp áp lực áp suất 1,3 – 1,4 atm
trong 3,5 giờ.
Cấy giống: Sử dụng giống nấm dịch thể nuôi 4 - 5 ngày cấy chuyển vào bịch nguyên liệu nuôi trồng với các thể tích giống cấy: 10ml / bịch, 15ml/ bịch, 20ml/ bịch, 25ml/ bịch, 30ml/bịch, 35ml/ bịch; Mẫu đối chứng cấy giống nhân trên cơ chất hạt với định lượng 5 gam giống/ bịch; mỗi bịch nguyên liệu có khối lượng 800 gam;
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng: sử dụng CTNT 3, khử trùng, cấy giống: 25 ml giống / bịch nguyên liệu; Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ: 18 - 21oC, 22 - 25oC; 26 - 29oC, 30 – 34o C.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Đầu khỉ: sau thời gian nuôi sợi, khi sợi có xu hướng bám vào nút bông thì bắt đầu nới lỏng nút bông, để lại 1/3 lượng bông trên cổ nút để giữ ẩm và làm chỗ bám cho ra quả thể; chuyển bịch vào phòng cho ra quả thể có thể điều chỉnh nhiệt độ ở các ngưỡng: 16-18oC; 20-22oC; 24-26oC; 28-30oC.
2.3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Các thí nghiệm được bố trí 3 lần nhắc lại và được tiến hành như sau:
Mỗi công thức thí nghiệm bố trí 150 bịch nguyên liệu (800 gam/bịch). Theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu với số lượng 50 bịch/công thức thí nghiệm, lấy mẫu theo 5 điểm của đường chéo, mỗi điểm 10 bịch.
47
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Theo dõi các đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi
- Tỉ lệ nhiễm: được tính theo công thức
Tỉ lệ nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm Tổng số mẫu thí nghiệm x 100%
- Thời gian ươm sợi, ký hiệu T1 (ngày) được tính từ khi cấy giống đến khi hệ sợi
mọc kín toàn bộ bịch nguyên liệu nuôi trồng.
1
-
D: Chiều cao bịch nguyên liệu (mm)
T1: Thời gian ươm sợi (ngày)
- Thời gian hình thành mầm quả thể nấm, ký hiệu T2 (ngày): tính từ khi hệ sợi mọc kín bịch nguyên liệu đến khi thấy xuất hiện mầm quả thể ở vết rạch hay trên cổ nút bịch nguyên liệu.
- Thời gian quả thể trưởng thành, ký hiệu T3 (ngày): tính từ khi xuất hiện mầm quả
thể đến khi quả trưởng thành có thể thu hoạch.
- Tổng thời gian nuôi trồng nấm thu quả thể, ký hiệu T (ngày): T = T1 + T2 + T3
- Đặc điểm hình thái quả thể, trọng lượng trung bình.
- Đường kính quả thể nấm (mm): lấy kích thước trung bình của 10 mẫu nấm; mỗi
mẫu được đo đường kính lớn nhất, đường kính nhỏ nhất. - Hiệu suất sinh học (%) được tính theo công thức:
Hiệu suất sinh học (%) = Tổng khối lượng nấm tươi Khối lượng nguyên liệu khô x 100%
- Năng suất nấm tươi được tính như sau:
M1 – M2
Khối lượng nguyên liệu khô x 100%
Năng suất nấm (%) = Trong đó: + M1 là tổng khối lượng nấm thu được
+ M2 là khối lượng phần nấm không có giá trị sử dụng (chân nấm, cuống nấm)
Đối với nấm Đầu khỉ năng suất bằng hiệu suất sinh học do nấm Đầu khỉ không có
phần cuống và gốc nấm.
48
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2.3.4. Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit amin trong nấm Đầu khỉ
2.3.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng nước tổng số (TCVN 4846:1989)
2.3.4.2. Xác định hàm lượng Nito amin ammoniac (TCVN 3707 - 90)
2.3.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo tổng số (TCVN 6555: 2011)
2.3.4.4. Xác định hàm lượng Hydratcacbon bằng hệ thống HPLC (TCPTN – 001 HPLC)
2.3.4.5. Xác định hàm lượng phospho bằng phương pháp quang phổ (TCVN 1525:2011)
2.3.4.6. Xác định hàm lượng canxi, đồng, sắt, magie, mangan, kali và kẽm bằng phương pháp quang phổ hấp phụ (TCVN 1537: 2007)
2.3.4.7. Xác định hàm lượng vitamin B1 bằng sắc ký detectơ huỳnh quang (HPLC/FL) tiêu chuẩn JAS-SOP-57
2.3.4.8. Xác định hàm lượng vitamin C tổng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - FL) tiêu chuẩn JAS-SOP 60
2.3.4.9. Xác định hàm lượng vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - FL) tiêu chuẩn JAS-SOP 65
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
2.3.5.1. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể nấm Đầu khỉ [68, 69]
Tiến hành chiết polysaccharide trong nấm Đầu khỉ bằng nước nóng và dung môi
kiềm dựa trên cơ sở kinh nghiệm của một số các nhà khoa học [68, 69].
100 g quả thể nấm khô được nghiền nhỏ thành bột và được chiết trong thể tích 1 lít nước tại 100 C trong 8 giờ; Dịch chiết nấm được lọc qua vải, bã nấm tiếp tục được chiết như trên thêm 2 lần nữa; Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại và cô tới thể tích 100 ml, sử dụng máy cô chân không tại 70 C, thu được dịch chiết nước nóng.
Polysaccharide được kết tủa bằng việc bổ sung 3 lần thể tích cồn tuyệt đối vào dịch chiết, ủ qua đêm tại 4 C. Polysaccharide được thu bằng ly tâm dịch tủa tại 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Kết tủa được rửa bằng methanol và hòa tan lại trong nước cất.
Phần bã nấm được bổ sung 1 lít NaOH 5% và ủ tại 56 C qua đêm; Phần dịch tan trong kiềm được thu lại bằng lọc qua vải; Bã nấm tiếp tục được chiết kiềm 2 lần nữa. Dịch lọc của 3 lần chiết kiềm được gộp lại, trung hòa bằng dung dịch axit axetic 1M tới pH 6,5- 7,0; sau đó polysaccharide được kết tủa bằng cách bổ sung 3 lần thể tích cồn tuyệt đối lạnh, ủ tại 4 C qua đêm; Ly tâm dịch đã tủa tại 10.000 vòng/phút trong 10 phút; Kết tủa được rửa lại bằng methanol và được hòa lại trong nước cất.
49
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2.3.5.2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
Để phát hiện sự có mặt của các polysacharide trong dịch chiết và nghiên cứu một
Chỉ tiêu thí nghiệm: lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp cho quá trình chiết;
số điều kiện tối ưu của dung môi chiết, sử dụng phương pháp đo độ nhớt bằng kế Ubelot.
Xác định nồng độ kiềm thích hợp cho quá trình chiết.
Chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu 10g bột Đầu khỉ khô thêm 100ml nước, lắc đều rồi chiết ở 100oC trong thời gian 40 phút; Lọc lấy dịch, phần không tan cho thêm 200 ml dung dịch NaOH 2%; KOH 2%; Na2CO3 2%; Chiết kiềm ở 50oC trong 4 giờ. Dịch lọc mỗi mẫu thu được 160 ml (M1, M2 và M3 là các dịch chiết thu được bằng các dung dịch kiềm tương ứng là KOH, Na2CO3 và NaOH), được li tâm và đo độ nhớt, độ nhớt càng cao thì hiệu quả chiết càng cao.
2.3.5.3. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp
Chuẩn bị 6 mẫu, mỗi mẫu 10 g bột Đầu khỉ khô và tiến hành chiết theo điều kiện như trên với sự thay đổi nồng độ của dung dịch NaOH (2%; 3%; 3,5%; 4%; 4,5% và 5%) tương ứng với dịch chiết thu được là M4, M5, M6, M7, M8 và M9; Li tâm dịch chiết thu lấy phần dịch trong và đo độ nhớt, độ nhớt càng cao thì hiệu quả chiết càng cao.
ẫu nấm (phương ph
2.3 phenol/axit sulphuric) [57]
100 ứ ,
tiếp theo ợ
Lấy 150
500 2SO4 l dịch phản ứng cho vào giếng của phiến 96 l ; Mẫu đối chứng được chuẩn bị tương tự dùng 100
ợ
giế nước cất thay thế với mẫu thử glucose) để xác định
2.3.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996).
Chứng dương tính:
+ Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+)
+ Tetracyclin cho vi khuẩn Gr (-)
+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh pha trong dung dịch DMSO 10% với nồng độ thích hợp: Streptomycin:
4mM; Tetracyclin: 10mM; Nystatin: 4mM
50
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chứng âm tính: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử
Tiến hành thí nghiệm:
- Các chủng kiểm định được hoạt hoá và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland
rồi tiến hành thí nghiệm.
- Các phiến thí nghiệm được nuôi trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48
giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Tính kết quả: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration)
của mẫu:
Các mẫu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5- 10) thang nồng độ
để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Mẫu thô có MIC ≤ 200 g/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 g/ml là có hoạt tính.
Nồng độ ức chế 50% vi sinh vật (IC50) của mẫu có hoạt tính
Các mẫu có hoạt tính được pha loãng theo 10 thang nồng độ. Giá trị IC50 được xác định bằng chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển của vi sinh vật và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
2.3.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro
Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993), hiện đang được áp dụng tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NCI) và trường ĐH dược, ĐH tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
- Đánh thức các dòng tế bào; Hoà mẫu thí nghiệm vào dịch thể DMSO 100% (4-
10mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ.
- Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50
- Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức 60 - 70%, thay môi trường sạch để hoạt
hoá tế bào từ 18- 24 giờ, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để thực hiện thí nghiệm.
- Tế bào được xử lý Tripsin 0,1% cho tách khỏi đáy bình. Hoà dịch thể huyền phù tế bào bằng môi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha tế bào nồng độ 3x104 tế bào/ml đối với dòng KB, 4x104 tế bào/ml đối với dòng FL.
- Thêm vào các giếng đã có chất chuẩn bị sẵn ở trên 190 μl dịch thể huyền phù tế bào.
- Phiến được ủ trong tử CO2 thêm 3 ngày.
Tế bào khi ủ 3 ngày được cố định bằng dịch thể TCA lạnh (30 - 50%); Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit acetic 1% và rửa lại bằng axit acetic 1% để loại mầu thừa; để khô, hoà lại bằng dịch thể đệm Tris base 10mm.
- Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515 mm.
51
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
- Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
OD (mẫu) – OD (ngày 0)
CS% = x 100
OD (MSO) – OD (ngày 0)
Giá trị CS % sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán exel để tìm ra % trung bình + - độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lăp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: độ lệch tiêu chuẩn σ
√∑ (xi – x ) 2
σ =
n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để
tìm giá trị IC50
Giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX
Trong đó Y: nồng độ chất thử
X: Giá trị CS (%)
2.3.5.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo [37, 46]
Theo tác giả Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao & CS, (2007) [37, 46], hiện đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Tóm tắt như sau: Tế bào nuôi trong môi trường MEM bổ xung 10% FBS ở 37oC trong tủ ấm CO2 (5% CO2). Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy 1 lớp, đạt đến phase Log, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi tripsin, đếm và hòa lại vào môi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồng độ tế bào 3,33 x 103/ml. Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 5- 25 µg/ml. Thí nghiệm được tiến hành trên phiến 96 giếng, lặp lại 2 - 3 lần. Sau 10-20 ngày lấy ra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển vi ngược có gắn camera và nối ra máy tính. Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch được tính lặp lại 3 - 5 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thành khối u, kích thước khối u so với đối chứng (DMSO 1%).
52
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm
Phương pháp của Abrham W.B.; Turner A. và theo quy định của WHO và Bộ Y tế
về an toàn và hiệu lực của chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên [1, 18, 65]
a, Phương pháp nghiên cứu an toàn của HT1 trên thực nghiệm
Chọn thỏ khỏe mạnh, trọng lượng 2,0 0,2 kg; chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm 8 con.
+ Nhóm chứng: uống dung môi dùng để pha chế phẩm nghiên cứu, liều 1ml/1kg
trọng lượng cơ thể (TLCT)
+ Nhóm HT1: uống HT1 các mức liều trong thể tích 1ml/1kg TLCT
Trong thời gian thí nghiệm, theo dõi chặt chẽ tình trạng chung, cân trọng lượng cơ thể hàng tuần, kiểm tra kết quả sinh hoá, huyết học, tình trạng tim mạch, so sánh với nhóm chứng. Thời gian theo dõi trong 6 tuần.
Lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học tại 3 thời điểm: xuất phát điểm,
sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên cứu.
b, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ phóng xạ của HT1
* Phương pháp chiếu xạ: Theo phương pháp được mô tả bởi Gonchavenko E.N và
Vasin MV [31, 66] như sau:
Chuột nhắt trắng (CNT) được chiếu xạ (CX) bằng tia gamma từ nguồn Cobalt-60 trên máy tại bộ môn – khoa Phóng xạ - Viện Quân y 103 – Học viện Quân y; Liều chiếu xạ từ 5,5 Gy đến 8,5 Gy tùy theo mục đích nghiên cứu của từng nhóm.
* Các chỉ tiêu nghiên cứu tổng thể:
- Tính thời gian sống trung bình và tỷ lệ CNT sống sót sau chiếu xạ trong 30 ngày
theo công thức của R.A. Besiadovskii (1978) và của Nguyễn Xuân Phách (1995) [15];
- Tính hệ số bảo vệ theo công thức của Burnazian A.I (1975)
- Hệ số giảm liều (HSGL) được tính theo công thức:
LD50/30 nhóm nghiên cứu với HT1
HSGL = LD50/30 nhóm chứng sinh học
* Nghiên cứu một số chỉ tiêu về máu và tạo máu:
- Đếm số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu (BC), tiểu cầu (TC) máu ngoại vi trên các
máy xét nghiệm tự động.
- Trọng lượng lách, hạch lympho, tuyến ức CNT ở các ngày thứ 2, 4, 9 sau chiếu
xạ, được cân trên cân chính xác.
53
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
- Mô học của lách, hạch lympho, tuyến ức CNT được tiến hành tại khoa giải phẫu
bệnh lý – Học viện Quân y.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu:
Nhóm I: Chứng sinh học (CSH)
Nhóm II: Chiếu xạ đơn thuần
Nhóm III: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 5,5 Gy
Nhóm IV: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 6,5 Gy
Nhóm V: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 7,5 Gy
Nhóm VI: Chiếu xạ có dùng HT1 bảo vệ trước, liều xạ 8,5 Gy
Thời gian theo dõi sau chiếu xạ là 30 ngày, ghi lại số CNT sống/ CNT chết ở từng nhóm.
Tính tỷ lệ thời gian CNT sống (trung bình);
Tính tỷ lệ thời gian CNT chết (trung bình);
Xét nghiệm chỉ tiến hành với các CNT còn sống sót tại các thời điểm kể trên tại các
ngày thứ 2 và thứ 9 sau chiếu xạ;
Tính số CNT còn sống sau từng ngày cho đến ngày thứ 30;
Tại các thời điểm trên cân trọng lượng CNT, cuối kỳ autopsy tính trọng lượng các
tạng lách, hạch, tuyến ức.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học, thống kê y sinh
học bằng phần mềm Excel và phần mềm IRRISTAT 4.0.
54
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus 3.1.1. Kết quả so sánh và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên diện hẹp 3.1.1.1. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn Các đặc điểm sinh trưởng, phát triển của giống gốc có mối liên quan chặt chẽ đến đặc tính di truyền của giống. Việc nghiên cứu đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể nấm nhằm đánh giá được ưu thế tính trạng bên ngoài của giống, làm cơ sở để đánh giá tính thích nghi của giống với điều kiện khí hậu của khu vực nghiên cứu. Trong đó các chỉ tiêu về mầu sắc, hình thái quả thể, đường kính quả thể... là những chỉ tiêu có ý nghĩa quan trọng trong công tác tuyển chọn giống, là cơ sở cho việc phân loại cũng như tuyển chọn được nguồn giống cho năng suất, chất lượng cao phù hợp với điều kiện canh tác của từng vùng sinh thái khác nhau. Tiến hành nhân giống và nuôi trồng khảo nghiệm bốn chủng nấm Đầu khỉ được ký hiệu He1, He2, He3, He4 được lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp: Giống cấp 1 được nhân chuyển từ ống giống đang bảo quản lạnh sang môi trường PGA, sau khi hệ sợi mọc kín ống thạch chọn những ống giống có hệ sợi phát triển khỏe, không nhiễm bệnh để cấy chuyển sang môi trường thóc hạt (giống cấp 2). Giống cấp 2 được dùng để cấy chuyển sang cơ chất nuôi trồng nấm; Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm được tiến hành trên công thức môi trường CTNT 1 trình bày trong bảng 2.5; Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ thích hợp 22 – 25oC và cho ra quả thể điều kiện nhiệt độ 16 – 20oC theo như điều kiện nuôi trồng nấm Đầu khỉ của các tác giả Nguyễn Lân Dũng (2001), Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh (2000), Lê Xuân Thám (2004); Theo dõi đánh giá một số đặc trưng hình thái hệ sợi nấm trên môi trường thạch PGA; đặc trưng hình thái quả thể nấm khi trưởng thành. Kết quả được ghi nhận chi tiết trong bảng 3.1 dưới đây; Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể của các giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus khảo nghiệm trên môi trường PGA và CTNT 1
STT
Giống
Đặc điểm hệ sợi nấm
Đặc điểm quả thể
1
He1
2
He2
Quả thể nấm có màu trắng muốt, cân đối, gồm các múi thịt nấm ghép lại với nhau đường kính quả thể 5-10 x 5-7cm, hình dạng giống như bộ óc Khỉ. Trọng lượng trung bình đạt 150-170 g/ quả. Phần thịt nấm chắc, đặc. Quả thể nấm có màu trắng ngà, đường kính quả thể 5 - 7 x 4-7cm. Tua gai dài; quả thể rất xốp, nhẹ, trọng lượng trung bình đạt 90-100 g/quả.
3
He3
Quả thể nấm có màu vàng nhạt, đường kính quả thể 5-10 x 5-7cm. Quả thể rất xốp, nhẹ, tua nấm dài, năng suất thấp. Trọng lượng trung bình đạt 60-80g/ quả.
4
He4
Quả thể nấm có màu vàng lông gà non, gồm các múi thịt nấm ghép lại với nhau đường kính quả thể 7-10 x 4-7cm. Mỗi quả nấm tươi nặng trung bình 100-140g. Phần thịt nấm mềm, xốp, tua nấm ngắn.
Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng muốt đồng nhất, mật độ sợi dày. Khi trưởng thành hệ sợi bện kết lại tạo các mụn gai trên bề mặt môi trường nuôi cấy, khi già chuyển màu vàng rồi vàng nâu. Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng muốt đồng nhất, mật độ sợi thưa, loang lổ. Khi trưởng thành hệ sợi chuyển màu trắng ngà, sợi nấm to, thô, phân nhánh dày, khi già chuyển màu vàng nâu, sớm xuất hiện quả thể trên môi trường nuôi cấy thuần khiết. Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng, mật độ sợi phân bố không đều. Khi trưởng thành hệ sợi chuyển màu trắng đậm, xuất hiện mụn gai, hệ sợi sần sùi, xuất hiện quả thể ngay khi sợi chưa ăn kín ống thạch. Hệ sợi trên môi trường PGA khi non màu trắng muốt đồng nhất, mật độ sợi dày. Khi trưởng thành hệ sợi bện kết lại tạo các mụn gai trên bề mặt môi trường nuôi cấy, khi già chuyển màu vàng rồi vàng nâu.
55
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm và đánh giá đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể
nấm cho thấy: bốn giống Đầu khỉ nghiên cứu đều có đặc điểm hình thái hệ sợi nấm trên môi trường PGA tương tự nhau xong có sự khác biệt về mầu sắc hệ sợi, đặc biệt là có sự
chênh lệch về thời gian hình thành mầm quả thể trên môi trường thạch PGA; trong đó hai giống He2 và He3 thấy có sự xuất hiện mầm quả thể trên môi trường thuần khiết sớm hơn
so với hai giống còn lại; đây là đặc điểm không có lợi của giống do trong quá trình nhân giống các cấp nhà chọn giống không mong muốn sử dụng giống tạo quả thể trên môi trường nhân giống các cấp. Quá trình tạo mầm quả thể sẽ làm suy yếu giống, giảm khả
năng nhân giống các cấp, giảm khả năng lưu giữ giống. Trong nghiên cứu của tác giả Burkhard Kirchhoff (1996) khi nghiên cứu nuôi trồng 15 giống nấm nấm Đầu khỉ có
nguồn gốc khác nhau cũng ghi nhận sự hình thành mầm quả thể trên môi trường thạch thuần khiết của một số giống nghiên cứu và điều này cũng gây bất lợi trong quá trình nhân
giống các cấp.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm hình thái quả thể
nấm giữa 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu, trong đó sự khác biệt lớn nhất là mầu sắc quả thể, độ phân thùy của quả thể, độ dài của tua nấm, độ chắc của quả thể nấm và trọng lượng
trung bình của quả thể nấm. Đường kính trung bình của quả thể cũng có thể hiện sự khác biệt giữa bốn giống nghiên cứu nhưng không nhiều.
Như vậy kết quả ở bảng 3.1 cho thấy trong 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu thì giống Đầu khỉ ký hiệu He1 có ưu điểm vượt trội hơn so với 3 giống còn lại do có khả năng hình
thành quả thể đồng loạt, mầu sắc, hình thái quả thể đẹp, trọng lượng trung bình cao, đạt 150-170g/ quả; chất lượng đồng đều.
3.1.1.2. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm.
Để tuyển chọn được giống nấm chất lượng tốt, phù hợp với điều kiện sản xuất thì
tiêu chí về thời gian sinh trưởng và phát triển của hệ sợi, thời gian hình thành và phát triển quả thể cũng là tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng giống vì tổng thời của một chu
kỳ sinh trưởng của nấm chính là tiêu chí chi phối kế hoạch sản xuất, số thời vụ nuôi trồng trong 1 năm, khấu hao nhà xưởng, năng lượng... qua đó cũng ảnh hưởng ít nhiều tới chi phí
sản xuất.
Thời gian sinh trưởng của nấm có mối liên quan chặt chẽ với điều kiện nuôi trồng
và chế độ dinh dưỡng; Qua quá trình nuôi trồng khảo nghiệm, song song với việc đánh giá các đặc trừng về hình thái của 4 chủng giống nghiên cứu, NCS cũng ghi nhận được các số
liệu về thời gian sinh trưởng, phát triển của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu; kết quả được trình bầy ở bảng 3.2;
56
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm (đơn vị tính: ngày) Thời điểm 1 2 3 4 5 6 Giống
14 - 16 13 - 17 19 - 21 18 - 22 29 - 32 25 - 30 32 - 37 32- 37 5-7 5 -7 7 -10 8 -10 13-15 11-15 13-18 13-18 14-15 10-15 15-20 14-17 56-62 46-60 63-75 59-72 He1 He2 He3 He4 * Ghi chú
Thời điểm 1 Thời gian sợi mọc kín 50% bịch (ngày) Thời điểm 2 Thời gian sợi mọc kín 100% bịch (ngày) Thời điểm 3 Thời gian từ khi nới nút bông đến xuất hiện mầm quả thể (ngày) Thời điểm 4 Thời gian từ khi nới nút bông đến thu hái đợt 1(ngày) Thời điểm 5 Từ thu hái đợt 1 đến thu hái đợt 2 (ngày) Thời điểm 6 Tổng thời gian từ khi cấy giống đến khi kết thúc thu hái quả thể (ngày) Từ kết quả trong bảng 3.2 trên cho thấy thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu trong cùng một điều kiện nuôi trồng có sự khác biệt, trong đó He2 có tổng thời gian sinh trưởng ngắn nhất là 46 – 60 ngày, tiếp theo là He1 là 56 – 62 ngày, He4 là 59 - 72 ngày, He3 là 63 – 65 ngày. Trong nghiên cứu của tác giả Burkhard Kirchhoff (1996) cũng ghi nhận sự khác biệt về thời gian sinh trưởng của 15 giống Đầu khỉ nghiên cứu, trong đó sự chênh lên lớn nhất là 8 ngày cho tổng chu kỳ nuôi trồng. 3.1.1.3. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu. Từ thực tế sản xuất cho thấy nhiều giống nấm có các đặc điểm sinh trưởng tốt; năng suất, chất lượng cao nhưng khả năng chống chịu sâu bệnh kém thì cũng rất khó được chấp nhận để đưa vào sản xuất trên qui mô lớn; Việc điều tra đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại chính của từng giống nấm Đầu khỉ là rất cần thiết và được tiến hành song song với các chỉ tiêu đánh giá chất lượng, thời gian nuôi trồng trong suốt quá trình khảo nghiệm.
Bệnh Giống
Kết quả được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Thành phần và mức độ sâu bệnh hại trên bốn giống nấm Đầu khỉ Bệnh do côn Bệnh teo trùng quả + * + ** + ** + * Nhiễm mốc xanh + +++ +++ ++ Bệnh thối nhũn quả + +++ ++ +
He1 He2 He3 He4 Ghi chú: - Không bị bệnh + Mức độ nhẹ: dưới 5% * Mức độ nhẹ: dưới 5% ++ Mức độ trung bình: 6 – 12% ** Mức độ trung bình: 10% +++ Mức độ nặng: trên 20%
57
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Một số biểu hiện nhiễm bệnh phổ biến trong quá trình nuôi sợi và ra quả thể nấm Đầu
khỉ được thể hiện trong hình 3.1 dưới đây;
a. Nhiễm mốc xanh b. Nhiễm mốc vàng hoa cau c. Nhiễm sợi dại
d. Bệnh mốc xanh, teo quả e. Bệnh thối nhũn quả thể f. Bệnh do côn trùng
Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại trên nấm Đầu khỉ trong giai đoạn ươm sợi và ra quả thể
Qua kết quả nghiên cứu, đánh giá một số thành phần sâu bệnh hại chính trên các giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu thấy có 4 loại sâu bệnh hại phổ biến: bệnh nhiễm mốc, phát sinh chủ yếu khi nuôi sợi ở nhiệt độ cao kéo dài; Bệnh thối nhũn quả, xuất hiện khi độ ẩm không khí cao và nhiệt độ tăng đột ngột; Bệnh teo quả, xuất hiện khi trong thời gian chăm sóc ra quả thể có sự thay đổi nhiệt độ đột ngột kết hợp với độ ẩm không khí khô hanh kéo dài; Bệnh do côn trùng (ruồi, nhện), xuất hiện khi điều kiện phòng nuôi quá tối, độ thông thoáng trong phòng nuôi kém.
Kết quả khảo nghiệm cho thấy trong cùng một một điều kiện nuôi trồng thì giống He1 có khả năng chống chịu với sâu bệnh hại tốt hơn so với các giống còn lại, xong trong quá trình nuôi trồng vẫn cần đảm bảo các khâu khử trùng nguyên liệu cũng như vệ sinh khu vực chăm sóc quả thể theo đúng kỹ thuật để hạn chế tối đa sự phát sinh bệnh.
Thông qua kết quả khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ nhận thấy giống He1 so với 3 giống còn lại có các ưu điểm vượt trội hơn và rất phù hợp điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam thể hiện ở các đặc điểm sau:
+ Khả năng quả thể đồng loạt, thời điểm thu hoạch tập trung; + Hình thái quả thể cân đối, đồng đều, năng suất cao;
58
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Khả năng thích nghi với điều kiện nuôi trồng tự nhiên tốt; + Khả năng chống chịu bệnh cao;
Để khẳng định chất lượng nấm Đầu khỉ thương phẩm nuôi trồng từ giống He1, tiếp tục tiến hành phân tích một số thành phần dinh dưỡng và axit amin trong quả thể nấm thu được; Kết quả được trình bầy ở phần tiếp theo.
3.1.1.4. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ He1
Chủng nấm Đầu khỉ He1 được nuôi trồng trên nguồn cơ chất tổng hợp với thành phần chính là mùn cưa, bông hạt, lõi ngô nghiền, có bổ sung thêm các phụ gia bao gồm cám ngô, cám gạo, bột nhẹ; nuôi sợi và chăm sóc ra quả thể trong điều kiện thích hợp; thu hái quả thể đúng độ tuổi; quả thể được sấy khô ở nhiệt độ 45-60oC đến trọng lượng không đổi;
Mẫu nấm Đầu khỉ tươi vừa hái và mẫu nấm đã sấy khô được đem đi phân tích một số thành phần dinh dưỡng chính, vitamin, axit amin tại Viện công nghệ thực phẩm; Kết quả thu được ghi ở bảng 3.4 sau;
Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1
STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Nấm tƣơi
% % % % % % % mg/kg mg/100g mg/100g mg/100g 56,40 43,60 0,86 2,19 11,37 0,035 0,28 15,99 8,05 0,01 0,30 Nấm khô tuyệt đối - - 1,97 5,02 26,08 0,08 0,64 36,67 18,46 0,02 0,69 Hàm lượng nước tổng số 1 Hàm lượng vật chất khô 2 Hàm lượng Nito tổng số 3 Hàm lượng Chất béo tổng số 4 Hàm lượng Hydratcacbon 5 Hàm lượng Canxi (Ca) 6 Hàm lượng Phospho (P) 7 Hàm lượng Sắt (Fe) 8 9 Hàm lượng Vitamin C 10 Hàm lượng Vitamin A 11 Hàm lượng Vitamin B1
Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 cho thấy nấm có thành phần dinh dưỡng cân đối, với hàm lượng protein thô cao, chiếm 1,97% tổng trọng lượng khô, hàm lượng chất béo thực vật chiếm 5,02%. Trong phân tích của tác giả Mizuno, (1998) khi so sánh sản phẩm nấm Đầu khỉ ở Cát Lâm (Trung Quốc) và Nagano (Nhật Bản) cho thấy hàm lượng protein thô của hai mẫu này lần lượt là 29,3 mg/100g nấm khô và 27,67 mg/100g nấm khô; hàm lượng chất béo thô của hai mẫu lần lượt là 4,68 và 4,56 mg/100g nấm khô. Tác giả Khuất Hữu Trung, (2003) cũng đưa ra kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm Đầu khỉ, trong đó hàm lượng protein thô là 19,94 mg/100g nấm khô, hàm lượng chất béo tổng số đạt 2,89 mg/100g nấm khô. Như vậy,
59
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
hàm lượng protein và hàm lượng chất béo tổng số của quả thể nấm Đầu khỉ He1 tương đương so với kết quả của các tác giả Khuất Hữu Trung và thấp hơn so với tác giả Mizuno đã công bố trước đó.
Bên cạnh đó, trong kết quả phân tích mẫu nấm Đầu khỉ He1 cũng thể hiện rõ thành
phần một số vitamin và khoáng chất với hàm lượng cao, cân đối.
Song song với việc phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1, NCS đã phân tích cả hàm lượng các axit amim trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 để khẳng định chất lượng nấm Đầu khỉ được tuyển chọn, kết quả được trình bày trong bảng 3.5;
Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin cuả nấm Đầu khỉ He1
STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả
Hàm lượng Aspartic acid 1 Hàm lượng Threonine 2 Hàm lượng Serine 3 Hàm lượng Glutamic acid 4 Hàm lượng Proline 5 Hàm lượng Glycine 6 Hàm lượng Alanine 7 Hàm lượng Valine 8 9 Hàm lượng Lysine 10 Hàm lượng Methionine 11 Hàm lượng Isoleucine 12 Hàm lượng Leucine 13 Hàm lượng Tyrosine 14 Hàm lượng Phenylalanine 15 Hàm lượng Histidine 16 Hàm lượng Agrinine 17 Hàm lượng Cystine mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g 2,17 1,19 0,72 3,66 1,02 0,98 1,54 1,39 1,35 0,2 1,03 1,66 0,44 0,78 0,98 0,92 0,07
Kết quả phân tích cho thấy thành phần dinh dưỡng của nấm Đầu khỉ He1 có đầy đủ các axit amim với hàm lượng khá cao, trong đó đặc biệt là hàm lượng Lysine, Leucine, Isoleucine, Valine cao; Đây là những axit amin rất tốt đối với trẻ em, người cao tuổi mà cơ thể không tự tổng hợp được; Thành phần và hàm lượng các axit amim trong nấm Đầu khỉ He1 so với kết quả đã được một số tác giả công bố là tương đương nhau.
Như vậy, qua quá trình khảo nghiệm, phân tích đánh giá chất lượng 4 giống nấm Đầu khỉ He1, He2, He3, He4, kết quả cho thấy giống He1 có hình thái quả thể đẹp, trọng
60
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
lượng quả thể cao, khả năng chống chịu sâu bệnh hại tốt, thành phần dinh dưỡng cân đối; NCS lựa chọn giống He1 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ.
Phân lập giống là khâu quan trọng trong quá trình sản xuất giống nấm vì chất lượng giống gốc là một trong những yếu tố quyết định chất lượng các cấp giống tiếp theo, qua đó góp phần quyết định năng suất nấm thương phẩm, vì thế việc tiến hành phân lập, thuần hóa, sàng lọc và giám định giống trước khi đưa vào sản xuất là rất cần thiết để tạo nguồn giống có chất lượng ổn định, chủ động trong việc sản suất giống phục vụ sản xuất.
3.1.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ
Trước khi tiến hành phân lập, thuần khiết lại chủng giống nấm Đầu khỉ, tiến hành nuôi trồng khảo nghiệm các chủng giống, quan sát đặc điểm chủng nấm, đặc điểm bào tử nấm dưới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 15000 lần). Để thu được bào tử của nấm Đầu khỉ, tiến hành thu hái khi quả thể nấm đã chuyển sang giai đoạn trưởng thành 1-2 ngày; lúc này quả thể bắt đầu xốp hơn, nhẹ hơn, tua gai dài và mảnh hơn. Hái quả thể, đưa vào đĩa petri đã khử trùng, để trong box cấy vô trùng; sau khoảng 16 – 24 giờ sẽ thấy các vệt bào tử rơi xuống đĩa, để nguyên bào tử trong đĩa đậy nắp lại đem đi chụp ảnh bào tử; Kết quả được thể hiện trong hình 3.2 và 3.3 dưới đấy;
Hình 3.2: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ He1 với mật độ dày đặc (độ phóng đại 15000 lần)
Hình 3.3: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ He1dày đặc, đảm hình chuỳ mang 4 bào tử với các mụn gai trên bề mặt (độ phóng đại 15000 lần)
61
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chọn quả thể to, chắc, cân đối, không bị sâu bệnh; cắt bỏ gốc, sát trùng; tiến hành bằng 2 phương pháp phân lâp như đã mô tả; Phân lập xong nuôi chúng trong cùng một điều kiện thích hợp; Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết
Chỉ tiêu
Nuôi cấy từ bào tử 72 giờ 48/100 Nuôi cấy mô nấm 48 giờ 17/100
- Hệ sợi mọc không đều, thô sợi, sợi có xu hướng bông xù lên rồi chùn lại. - Sức sống yếu.
- Hệ sợi mọc đều, mảnh sợi, không thấy xuất hiện mô sẹo. - Hệ sợi phân nhánh đều. - Sợi nấm mọc sát mặt thạch - Sức sống khỏe, giống không bị lẫn tạp sợi lạ.
Thời gian nảy mầm Tỷ lệ nhiễm (%) Đặc điểm hệ sợi trên môi trƣờng thạch thuần khiết
a. Hệ sợi khi phân lập từ bào tử b. Hệ sợi khi phân lập từ mô nấm
Hình 3.4: Hệ sợi nấm Đầu khỉ được phân lập từ bào tử và mô nấm
Kết quả ở bảng 3.6 kết hợp với quan sát thực nghiệm cho thấy trong 2 phương pháp phân lập thì nấm Đầu khỉ phù hợp với phương pháp nuôi cấy mô quả thể vì bằng phương pháp nuôi cấy mô quả thể, hệ sợi nấm bung sợi nhanh hơn, sức sống khoẻ, tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy từ bào tử; Xong phương pháp phân lập từ mô nấm lại có nhược điểm là không bảo toàn được các đặc tính di truyền của giống gốc qua nhiều thế hệ nhân chuyển vì vậy để đảm bảo giống không bị thoái hóa, suy biến lựa chọn sử dụng kết hợp cả hai phương pháp để phân lập lại giống:
+ Trong sản xuất, để đáp ứng nhu cầu gấp rút và số lượng lớn, chất lượng giống
đồng đều thì nên sử dụng phương pháp phân lập từ mô quả thể;
+ Song song với quá trình sản xuất, để đảm bảo lưu giữ được nguồn giống trong thời gian dài mà không bị suy biến cần tiến hành phân lập giống từ bào tử để bảo quản ở điều kiện lạnh sâu trong thời gian dài.
62
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Trong khuân khổ luận án, phương pháp phân lập từ mô quả thể nấm được lựa chọn
để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm xây dựng qui trình phân lập lại giống gốc.
3.1.2.2. Xác định thời điểm phân lập
Lựa chọn đúng giai đoạn sinh trưởng của quả thể nấm để phân lập ảnh hưởng nhiều đến chất lượng giống gốc, thể hiện qua các tiêu chí như khả năng bung sợi, tốc độ mọc sợi, đặc điểm hệ sợi. Trong thí nghiệm này, sử dụng quả thể nấm ở 4 giai đoạn phát triển khác nhau nhằm tìm được chính xác thời điểm tốt nhất để phân lập giống gốc từ mô quả thể, các giai đoạn đó bao gồm:
+ Giai đoạn 1: Quả thể vừa nhú mầm trên bịch nguyên liệu nuôi trồng (sau 5 - 7
ngày kể từ khi rạch hoặc nới nút bông cho ra quả thê)
+ Giai đoạn 2: Quả thể nấm còn non (3 - 5 ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể).
+ Giai đoạn 3: Quả thể nấm trưởng thành nhưng chưa phát sinh bào tử (7 - 9 ngày
kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng).
+ Giai đoạn 4: Quả thể nấm chuyển sang giai đoạn già, phát sinh bào tử (11 - 13
ngày kể từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng)
Quả thể nấm Đầu khỉ ở các giai đoạn phát triển khác nhau được thể hiện rõ hơn qua
c. Quả thể sau 3 ngày
a. Hình thành mầm quả thể
b. Quả thể sau 2 ngày
e. Quả thể sau 7 ngày
d. Quả thể sau 5 ngày
f. Quả thể sau 9 ngày (giai đoạn trưởng thành đến tuổi thu hái)
hình 3.5 dưới đây;
Hình 3.5: Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm Đầu khỉ tính từ khi xuất hiện mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng.
63
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Sau khi lựa chọn quả thể ở các giai đoạn phát triển khác nhau, tiến hành xử lý sơ bộ quả thể nấm, lấy phần mô nấm ở các mẫu nấm cấy vào môi trường PGA, nuôi sợi ở diều kiện thích hợp; theo dõi, đánh giá sự sinh trưởng của hệ sợi.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm đến chất lượng giống gốc
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm sử dụng để phân lập đến chất lượng giống gốc.
trình bày ở bảng 3.7.
Chỉ tiêu Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Giai đoạn 4
0 0 5,10 3,70
sợi mờ,
Tốc độ mọc sợi (mm/ngày) Đặc điểm sợi Mô nấm teo dần, không thấy sợi nấm phát triển.
Mô nấm có bung tạo hệ sợi sau 3 ngày cấy nhưng sợi nấm phát triển kém, mờ nhạt không nhìn rõ hệ sợi.
- Hệ sợi dày, mượt. - Xuất hiện bào tử phấn. - Chậm xuất thể hiện quả trên bề mặt thạch.
a. Hệ sợi phân lập từ quả thể đang ở giai đoạn 1,2
b. Hệ sợi phân lập từ quả thể đang ở giai đoạn 3
c. Hệ sợi phân lập từ quả thể đang ở giai đoạn 4
- Hệ mảnh, khô sợi; - Không có bào tử phấn; - Xuất hiện quả thể sớm trên bề mặt thạch, quả thể sinh trưởng nhanh hơn hệ sợi.
Hình 3.6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết khi sử dụng quả thể phân lập ở các giai đoạn phát triển khác nhau, thời gian nuôi sợi 10 ngày
Kết quả thí nghiệm cho thấy việc lựa chọn đúng thời điểm để phân lập hệ sợi từ quả thể bằng phương pháp nuôi cấy mô có ảnh hưởng lớn đến chất lượng giống nấm; Tốc độ sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ phân lập ở 4 giai đoạn quả thể phát triển khác nhau có sự khác biệt rõ rệt, trong đó hệ sợi được phân lập từ quả thể trong giai đoạn 7- 9 ngày tuổi có tốc độ sinh trưởng cao nhất. Khả năng bung sợi của mô quả thể nấm và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm phân lập từ quả thể ở các giai đoạn khác nhau rõ rệt; Ỏ giai đoạn 1, 2 hệ sợi nấm không phát triển, mô nấm bị teo dần sau 3-4 ngày cấy; Ở giai đoạn 4 chất lượng giống kém, sớm xuất hiện quả thể ngay trên môi trường nuôi cấy thuần khiết; Ở giai đoạn
64
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
3 chất lượng giống tốt, chậm xuất hiện quả thể, thấy xuất hiện nhiều bào tử phấn trên bề mặt thạch, đây là biểu hiện của giống Đầu khỉ có chất lượng cao.
Do vậy, NCS lựa chọn quả thể ở giai đoạn trưởng thành 7-9 ngày tuổi để phân lập
lại giống gốc.
3.1.2.3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ
a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi giống gốc. Nguồn cacbon mà nấm lớn nói chung và nấm Đầu khỉ nói riêng có thể sử dụng được bao gồm rất nhiều loại như các loại đường, rượu, axít hữu cơ và các chất tan trong nước của chúng, các lipit, các hydroxit và một số chất vô cơ có cacbon.
Trong thí nghiệm này, sử dụng môi trường MTĐC (môi trường Czapek) làm môi trường nền sau đó thay đổi các loại đường khác nhau với hàm lượng 20g/l để lựa chọn loại đường phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ; Tiến hành cấy mô nấm vào các công thức môi trường, nuôi trong cùng một điều kiện, quan sát ghi lại đặc điểm hệ sợi và tốc độ phát triển của hệ sợi trong suốt quá trình nuôi; Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.8;
Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy khi không bổ sung đường vào MTĐC thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm Đầu khỉ chỉ đạt 3,0 mm/ngày; Khi bổ sung các loại đường Glucose, Fructose, Maltose, Saccarose thì tốc độ mọc của hệ sợi tăng đáng kể, tuỳ thuộc vào loại đường bổ sung mà tốc độ sinh trưởng của hệ sợi tăng ở mức độ khác nhau; Trong đó đường Glucose và Fructose cho tốc độ sinh trưởng của hệ sợi lớn nhất đạt 6,25 mm/ ngày, đồng thời đặc điểm hệ sợi tốt nhất, tiếp đến là Saccarose và Maltose. Khi bổ sung Lactose vào môi trường MTĐC thì không có lợi cho sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ, hệ sợi không phát triển được và teo dần sau 3-5 ngày nuôi.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đối với sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ
TT Đặc điểm hệ sợi Môi trƣờng Tốc độ mọc sợi (mm/ngày)
1 MTĐC 3,0
2 6,25
3 6,25
4 4,75
5 0
Sợi rất mảnh, mờ gần như không nhìn rõ, sợi nấm phát triển kém. Hệ sợi nấm trắng mượt, đậm sợi, phát triển đều, đầu sợi nấm phân nhánh như lông tơ. Hệ sợi trắng mượt, đậm sợi, phát triển đều, đầu sợi nấm phân nhánh như lông tơ. Hệ sợi trắng, nhưng mờ, đậm không đều; tốc độ phát triển trung bình. Hệ sợi không phát triển, môi trường xung quanh mô nấm chuyển mầu đen sau 3 ngày nuôi. Hệ sợi trắng đồng nhất, phát triển khá tốt. 6 4,92
MTĐC + Glucose MTĐC + Fructose MTĐC + Maltose MTĐC + Lactose MTĐC + Saccarose CV% 3,2
0,242 LSD0,05
65
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ cũng được tác giả Ahmed Imtiaj và cộng sự (2008) ghi nhận khi nghiên cứu sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các môi trường PDA, Czapek Dox, Hoppokins, Hennerberg, Lily, môi trường cơ bản với thành phần 0,5gam MgSO4; 0,5 gam KH2PO4; 1 gam K2HPO4, có thay đổi 10 nguồn cácbon khác nhau bao gồm: Dextrin, Fructose, Maltose, Glucose, Lactose, Galactose, Sorbitol, Sucrose, Xylose, Mannose; Kết quả được ghi nhận là ngoài Lactose thì các loại đường còn lại đều có ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ; Trong đó, các loại đường Glucose, Fructose, Maltose có ảnh hưởng tốt hơn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ so với các loại đường khác.
Như vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, NCS lựa chọn Glucose làm nguồn bổ sung cacbon trong nhân giống nấm Đầu khỉ vì so với Fructose thì Glucose rẻ hơn và đã được sử dụng phổ biến hơn mà hiệu quả sử dụng lại tương đương nhau.
Sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên MTĐC có bổ sung các nguồn cacbon
a. Hệ sợi phát triển trên MTĐC
b. Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung Fructose
c. Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung Glucose
d. Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung Saccarose
f. Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung Lactose
e. Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung Maltose Hình 3.7: Hệ sợi phát triển trên môi MTĐC có bổ sung thêm các nguồn cacbon khác nhau
khác nhau được thể hiện rõ hơn thông qua hình 3.7 dưới đây.
b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi
Nguồn nitơ mà nấm lớn có khả năng sử dụng rất rộng bao gồm nitơ vô cơ như muối nitrat amôn, nitơ dạng khí; nitơ hữu cơ như protein, urê... Trong thực tiễn, nguồn nitơ hữu cơ phần lớn có nguồn gốc từ protein động vật, thực vật, vi sinh vật; Nguồn đạm động vật như cao thịt bò, bột cá, bột nhộng tằm...; Nguồn đạm thực vật có các loại bánh dầu (bánh
66
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
dầu đỗ tương, bánh dầu hạt bông...), bột đậu, bột lạc, bột ngô, nước bột giấy; Nguồn đạm vi sinh vật có bột nấm men, vi khuẩn đã lên men và sản phẩm tan trong nước.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.8 cho thấy trong các nguồn nitơ sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ thì nguồn nitơ hữu cơ cho kết quả là tốc độ sinh trưởng của hệ sợi cao hơn so với nguồn nitơ vô cơ. Khi bổ sung NaNO3; (NH4)2SO4 và NH4NO3 vào nuôi cấy nấm Đầu khỉ cho tốc độ mọc của hệ sợi cao hơn khi không bổ sung nhưng hệ sợi phát triển loang lổ không đều, sợi nấm trắng đục, thô sợi; Trong khi đó bổ sung cao nấm men, pepston tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ đạt 4,8 - 5,2 mm/ngày, cao hơn hẳn so với trên MTĐC chỉ đạt 3,0 mm/ngày.
Trong thí nghiệm này sử dụng môi trường MTĐC sau đó bổ sung các nguồn nitơ khác nhau để so sánh tốc độ mọc và đặc điểm của hệ sợi nấm Đầu khỉ, từ đó tìm ra nguồn nitơ thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ.
Việc bổ sung các phụ gia nguồn gốc tự nhiên như cám gạo, bột ngô hoặc mầm malt cũng có tác động tốt đối với sự phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ; kết quả ghi nhận được khi bổ sung cám gạo, bột ngô, mầm malt có sự tăng trưởng rõ rệt, từ 5,0 – 5,25 mm/ngày. Kết quả cũng cũng cho thấy cao đậu tương không có ảnh hưởng nhiều đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ, tốc độ mọc của hệ sợi trên MTĐC bổ sung cao đậu tương tăng không đáng kể so với khi không bổ sung.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ
Nguồn nitơ Đặc điểm hệ sợi Tốc độ lan sợi (mm/ngày) T T
1 MTĐC 3,0
2 MTĐC 1 + Cao nấm men 3 MTĐC + Pepton 4 MTĐC + Bột ngô 5 MTĐC + Cám gạo 5,8 5,5 5,2 5,25
6 MTĐC + Mầm malt 5,0
MTĐC + (NH4)2HPO4
Sợi rất mảnh, mờ gần như không nhìn rõ, sợi nấm phát triển kém Hệ sợi trắng đậm, phát triển tốt Hệ sợi trắng đậm, phát triển tốt Hệ sợi trắng, mảnh sợi, phát triển trung bình Hệ sợi trắng, mảnh sợi, phát triển tốt Hệ sợi trắng ngà chứ không trắng muốt như trên các môi trường khác, sợi mịn, phát triển tốt, đậm sợi; xong kết quả giữa các mẫu nuôi cấy không đồng đều. Hệ sợi phát triển kém, khô sợi Hệ sợi trắng đục, thô sợi Hệ sợi trắng đậm, phát triển tốt Hệ sợi trắng đậm, phát triển tốt Hệ sợi trắng đục, thô sợi 3,2 3,8 4,2 4,5 4,0 2,9 0,23 CV% LSD0,05 7 MTĐC + cao đậu tương 8 MTĐC + (NH4)2SO4 9 MTĐC + NH4NO3 10 MTĐC + NaNO3 11
67
a. Hệ sợi phát triển trên MTĐC + bột ngô
b. Hệ sợi phát triển trên MTĐC + cám gạo
c. Hệ sợi phát triển trên MTĐC + mầm malt
d. Hệ sợi phát triển trên MTĐC + cao đậu tương
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.8: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung các nguồn nito khác nhau Tác giả Ahmed Imtiaj và cộng sự (2008) khi nghiên cứu sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường cơ bản với thành phần 0,5g MgSO4; 0,5 g KH2PO4; 1 g K2HPO4, có bổ 10 nguồn nitơ khác nhau, bao gồm: Alanine, Ammonium acetate, Ammonium phosphate, Arginine, Calcium nitrate, Glycine, Histidine, Methionine, Potasium nitrate, Urea kết quả cho thấy nấm Đầu khỉ thích hợp với nguồn nitơ là Alnine, và không thích hợp với Histidine; Nghiên cứu sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường Glucose pepton, môi trường bổ sung dịch chiết cao nấm men cũng cho kết quả tốt.
c. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của sợi nấm
Như vậy việc sử dụng nguồn nitơ là pepton, cao nấm men, bột ngô, cám gạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ là hợp lý và sẽ được tiếp tục nghiên cứu hàm lượng thích hợp trong thí nghiệm tiếp theo.
Có rất nhiều loại môi trường dùng để phân lập giống nấm. Trong thí nghiệm này, sử dụng môi trường với một số thành phần khác nhau bao gồm đường, nito, vitamin, khoáng thích hợp như đã nghiên cứu ở trên với các hàm lượng khác nhau để tìm ra công thức môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ. Chuẩn bị môi trường với các thành phần như đã trình bày trong bảng 2.1, khử trùng, để nguôi, cấy giống, nuôi sợi ở điều kiện nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng chiếu trực tiếp. Theo dõi sự sinh trưởng của hệ sợi nấm theo thời gian; Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái hệ sợi nấm trên các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau được trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.9; Kết quả đánh giá tốc độ mọc của hệ sợi được trình bầy trong hình 3.10.
68
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.10: Đặc điểm của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau
Đặc điểm hệ sợi giống gốc sau 7-10 ngày nuôi
Công thức môi trường CT 1 Hệ sợi có mầu trắng mờ, khô sợi, phát triển không đều trên bề mặt đĩa thạch; Xuất hiện quả thể khi sợi chưa lan kín bề mặt đĩa thạch.
CT 2
Hệ sợi mảnh, khô sợi, mọc đều, phân nhánh đều. Sợi nấm mọc sát mặt thạch.
CT 3
Hệ sợi dày, trắng đậm, sợi mượt bám sát bề mặt thạch; Hệ sợi trắng đồng nhất, phát triển đồng đều trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch; Xuất hiện mầm quả thể rất muộn khi hệ sợi đã ăn kín mặt thạch.
CT 4
Hệ sợi dày, mọc đều, sợi trắng, mọc bông trên mặt thạch. Xuất hiện quả thể muộn nhưng lại sớm xuất hiện các điểm màu nâu do nhanh bị già hóa.
CT 5
Hệ sợi dày, trắng đậm, sợi không mượt bông lên trên bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể muộn nhưng lại sớm xuất hiện các điểm màu nâu do nhanh bị già hóa.
Đặc điểm hình thái hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ He1 sinh trưởng và phát triển trên
các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau được thể hiện trong hình 3.9 dưới đây;
b. Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên CT 2
c. Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên CT 3
e. Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên CT 5
d. Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên CT 4 Hình 3.9: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau
a. Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên CT 1
69
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.10: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau.
Từ kết quả nghiên cứu, lựa chọn công thức môi trường CT 3 để tiến hành các thí
Kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực tế cho thấy ở công thức CT1 môi trường không bổ sung nước chiết nấm tươi, cám gạo, bột ngô hệ sợi sinh trưởng kém nhất, môi trường CT 3 có đầy đủ chất khoáng đồng thời có bổ sung cám ngô, cám gạo nên hệ sợi sinh trưởng tốt hơn, hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng khoẻ, tốc độ mọc nhanh đạt 8,4 mm/ngày. Công thức CT 4 và CT 5 tiếp tục lượng tăng pepton, cao nấm men, nấm tươi, cám gạo, bột ngô, vitamim không có lợi hơn cho sự tăng trưởng của hệ sợi do tỷ lệ C/N trong môi trường dinh dưỡng không hợp lý; lúc này hệ sợi phát triển tốt nhưng nhanh bị già hóa tạo thành các đốm nâu trên bề mặt thạch. nghiệm tiếp theo. 3.1.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ.
Sử dụng môi trường CT 3 để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự mọc của hệ sợi nấm Đầu khỉ; cấy giống; nuôi sợi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau để theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ.
Các chỉ tiêu theo dõi gồm: tốc độ sinh trưởng của hệ sợi, đặc điểm hình thái của hệ
sợi trên môi trường thuần khiết.
Kết quả theo dõi đặc điểm hình thái của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thạch
thuần khiết ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau được trình bầy ở bảng 3.11 dưới đây;
Bảng 3.11: Đặc điểm của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết nuôi
trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ
20 ± 2oC
24 ± 2oC
28 ± 2oC
Hệ sợi dày, trắng đậm, sợi mượt bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể rất muộn.
Hệ dày, sợi trắng đậm, sợi mượt bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể rất muộn.
Hệ sợi mảnh, trắng mờ, sợi khô bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể khi hệ sợi chưa ăn kín bề mặt thạch.
Đặc điểm hệ sợi
70
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi trên môi trường thuần khiết trong các điều kiện nhiệt
độ khác nhau được thể hiện rõ hơn ở hình 3.11 dưới đây
Hình 3.11: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Kết quả cho thấy hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 24 ± 2oC; ở điều kiện nhiệt độ này hệ sợi dày, trắng đậm, sợi mượt bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể rất muộn; tốc độ sinh trưởng đạt 8,5 mm/ ngày. Ở nhiệt 28 ± 2oC hệ sợi phát triển nhanh hơn, tốc độ sinh trưởng đạt 8,9 mm/ngày nhưng hệ sợi mảnh, trắng mờ, sợi khô, bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể khi hệ sợi chưa ăn kín bề mặt thạch. Ở nhiệt 20 ± 2oC hệ sợi phát triển chậm đạt 4,6 mm/ngày. Do đó, NCS lựa chọn điều kiện nhiệt độ 24 ± 2oC để nuôi hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trong các thí nghiệm tiếp theo.
Từ kết quả nghiên cứu các điều kiện phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ đã trình bày,
NCS xin đề xuất sơ đồ tóm tắt qui trình phân lập lại giống gốc nấm Đầu khỉ như hình 3.12 dưới đây.
71
Quả thể nấm Đầu khỉ đang trong giai đoạn phát triển 7-9 ngày tuổi, hình thái quả thể cân đối, không nhiễm bệnh
Chuẩn bị môi trường với thành phần: 200g/l khoai tây; 20g/l glucose; 1,5g/l pepton; 1,5 g/l CNM; 0,5g/l MgSO4; 1g/l KH2PO4;1g/l K2HPO4; 30µg/l thiamin; 100 g/l nấm sò tươi; 10 g/l cám gạo; 10g/l bột ngô; 20g Agar; pH 6,5. Khử trùng.
Đổ môi trường ra đĩa petri vô trùng, để nguội
Xử lý sơ bộ, đưa vào box cấy vô trùng, thu bào tử hoặc mô nấm vào đĩa môi trường đã chuẩn bị trước
Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ 24±2oC, ánh sáng mờ hoặc không có ánh sáng.
Loại bỏ những mẫu nhiễm khuẩn, nhiễm mốc, sợi phát triển yếu, chậm hơn so với những mẫu cấy cùng đợt.
Kiểm tra chất lượng giống sau 2 ngày cấy, định kỳ kiểm tra 2-3 ngày 1 lần Thời gian nuôi 12 - 14 ngày.
Giống gốc đạt tiêu chuẩn
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.12: Qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ Như vậy, qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để
phân lập lại giống gốc nấm Đầu khỉ như sau:
- Quả thể chọn để phân lập lại giống gốc đang ở giai đoạn 7-9 ngày tuổi, khi quả thể nấm trưởng thành, chưa phát sinh bào tử; Quả thể có hình thái cân đối, không bị dị tật, không nhiễm bệnh.
- Phương pháp phân lập: dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (mô nấm) để phân lập lại giống gốc với lượng lớn phục vụ sản xuất; Dùng phương pháp nuôi cấy bào tử để phân lập giống gốc phục vụ quá trình lưu giữ, bảo quản nguồn giống trong thời gian dài.
- Môi trường thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ: khoai tây: 200g/l; pepton: 1,5 g/l; CNM: 1,5 g/l; MgSO4 .7H2O: 1 g/l; KH2PO4: 2,5 g/l; thiamin: 30 µg/l; nấm sò tươi: 100 g/l; cám gạo: 10 g/l; bột ngô: 10 g/l; glucose: 20 g/l; agar: 20 g/l;. pH 6,5.
- Nhiệt độ nuôi sợi giống gốc thích hợp: 24±2oC.
72
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
- Hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trong nuôi cấy thuần khiết đạt cực đại và ổn định từ ngày 12 đến ngày 14 sau khi cấy giống; khi hệ sợi đã mọc kín bề mặt thạch cần chuyển giống vào bảo quản trong điều kiện lạnh 6 -8oCđể kéo dài thời gian sử dụng giống gốc. Giống gốc nấm Đầu khỉ đạt tiêu chuẩn để đưa vào sản xuất phải có các đặc điểm: - Hệ sợi nấm phát triển đồng đều trên bề mặt thạch, có màu trắng ngà đồng nhất; - Mật độ hệ sợi dày, phần ngọn sợi nấm phân nhánh, tơ mượt; - Hệ sợi chậm ngả màu nâu, không xuất hiện quả thể trên bề mặt thạch; - Giống không bị nhiễm bệnh, khả năng phục hồi sợi sau quá trình cấy chuyển nhanh.
3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
- Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng; - Thành phần môi trường dinh dưỡng, pH; - Tỉ lệ giống cấy chuyển; - Nhiệt độ nuôi, chế độ nuôi giống; - Thời gian nuôi giống; - Nghiên cứu xây dựng đường cong sinh trưởng của mỗi cấp giống để tìm ra thời
Để xây dựng được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể ở qui mô lớn phục vụ cho nuôi trồng cần tiến hành các bước nhân giống các cấp trung gian từ dung tích 200 ml (giống trung gian cấp 1), nhân lên dung tích 2000 – 5000ml (giống trung gian cấp 2), rồi tiếp tục nhân ở dung tích 100 - 120 lít (giống phục vụ nuôi trồng). Ở mỗi cấp giống, tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi trong môi trường dịch thể, bao gồm: điểm cấy chuyển thích hợp.
3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích 200ml)
3.2.1.1. Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng
Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng môi trường dinh dưỡng, qua đó ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng giống nấm và tỷ lệ nhiễm. Tiến hành bố trí thí nghệm như đã trình bày ở mục 2.3.2.1; Kết quả nghiên cứu được trình bầy ở bảng 3.12 sau đây:
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng
Chế độ khử trùng 115oC
Thời gian (phút) 15 20 25 30 35 40
Chỉ tiêu theo dõi Mầu sắc môi trƣờng
Tỷ lệ nhiễm khi chƣa cấy giống + 35/100 mẫu ++ 25/100 mẫu ++ 7/100 mẫu +++ 0/100 mẫu +++ 0/100 mẫu ++++ 0/100 mẫu
73
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
* Ghi chú:
(+) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng không khác biệt so với trước khử trùng.
(++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn một chút so với trước khử trùng, dịch có mùi thơm tự nhiên.
(+++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn nhiều so với trước khử trùng,dịch sau khử trùng có mầu vàng nâu mùi thơm đặc trưng.
(++++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn rất nhiều so với trước khử trùng, dịch sau khử trùng chuyển mầu nâu đỏ, có mùi thơm đặc trưng.
Kết quả cho thấy, khử trùng môi trường ở nhiệt độ 115oC trong 30 – 35 phút là thích hợp nhất vì ở điều kiện khử trùng này môi trường dinh dưỡng vừa đảm bảo vô trùng vừa không bị mất dinh dưỡng. Lựa chọn điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ 115oC trong 30 – 35 phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1
Sử dụng các môi trường có thành phần trình bày trong bảng 2.2; Tiến hành bố trí
thí nghiệm như đã trình bầy ở mục 2.3.2.1; Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.13 như sau:
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của
giống dịch thể trung gian cấp 1
Chỉ tiêu Sinh khối sợi
Kích thước KLC (mm) (g/100ml/7ngày)
Công thức
1,2 0,25 CT6
1,35 0,48 CT7
1,35 0,54 CT8
1,36 0,5 CT9
3,5 3,1 CV%
0,93 0,275 LSD0,05
Tốc độ phát triển của hệ sợi trong các công thức môi trường dinh dưỡng được xác định thông qua sinh khối sợi nấm trong 100ml dịch sau 7 ngày nuôi; kết qủa được thể hiện ở hình 3.13 sau;
74
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.13: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau
Kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực tế cho thấy ở công thức CT 6 môi trường không bổ sung dinh dưỡng hệ sợi sinh trưởng kém; Ở công thức môi trường CT 8 hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng khoẻ, lượng sinh khối tăng nhanh đạt 0,54 g/100ml/ 7 ngày nuôi. Công thức CT 9 tiếp tục bổ sung lượng pepton và cao nấm men tăng lên không có lợi cho sự tăng trưởng của hệ sợi, lượng sinh khối đạt 0,5 g/100ml/ 7 ngày nuôi giảm hơn hẳn so với công thức môi trường CT8.
Hình thái hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể được thể hiện ở hình 3.14 và 3.15
Hình 3.14: Sinh khối sợi nấm trong các công thức môi trường khác nhau
Hình 3.15: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường CT8 ở chế độ nuôi lắc tạo thành dạng khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai xung quanh
dưới đây;
Chọn môi trường CT8 với thành phần: Khoai tây: 200g/l, nấm sò tươi: 100g/l; Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO4.7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2 HPO4: 1g; Thiamin: 20 µg; Nước: 1000 ml; làm môi trường dinh dưỡng để nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể trong các thí nghiệm tiếp theo.
75
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bố trí và tiến hành thí nghiệm như đã trình bầy ở mục 2.3.2.1; Kết quả thu được
3.2.1.3. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể. trình bầy ở bảng sau: Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT 8.
Trước lên men pH 4 5 6 6,5 7 8
Sau lên men 4,5 6,2 7,5 7,6 7,5 7,5 Chỉ tiêu
0,12 0,24 0,49 0,35 0,56 0,54
Tốc độ sinh trƣởng (g/100ml/7ngày) Kích thƣớc KLC (mm) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Kết quả cho thây gống nấm Đầu khỉ có sinh khối sợi lớn nhất khi pH trước lên men ở mức 6,5 là 0,56g/100ml/7ngày nuôi, ở pH 4 và pH 8 hệ sợi phát triển kém chỉ đạt 0,12 – 0,35g/100ml/7 ngày nuôi cấy. Trong nghiên của tác giả Ahmed Imtiaj và cộng sự (2008) khi nghiên cứu sự mọc của nấm Đầu khỉ trên các môi trường nuôi cấy dạng dịch thể cũng cho kết quả tương tự; pH thích hợp đối với nấm Đầu khỉ trong nghiên cứu của tác giả này là 6,0. Như vậy, ngưỡng pH thích hợp cho hệ sợi nấm Đầu khỉ phát triển là từ 6 - 7; phát triển tối ưu ở pH 6,5; Lựa chọn pH 6,5 để chuẩn bị môi trường nhân giống trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.1.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể Bố trí thí nghiệm như đã trình bày ở mục 2.3.2.1; Sử dụng giống gốc nuôi trên môi trường thạch, nghiền mịn trong nước cất vô trùng, bổ sung cho đủ 100ml; sử dụng dịch giống này để cấy chuyển sang môi trường dịch thể với các tỷ lệ 2 %, 4%, 6%, 8% theo thể tích; Kết quả được ghi ở bảng 3.15;
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8 sau 7 ngày nuôi (dung tích 200ml)
Tỷ lệ giống 2% 4% 6% 8%
Chỉ tiêu
1,5 - 2 1,3 - 1,45 1,0 1,0
Khuẩn lạc cầu (mm) Đặc điểm hệ sợi
Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ dày đặc, kích thước các khuẩn lạc cầu nhỏ li ti. Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ thưa, kích thước các khuẩn lạc cầu khá to, đồng đều. Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ nhiều, khuẩn lạc cầu có kích thước trung bình, phát triển đồng đều đồng đều.
76
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi được thể hiện thông qua sinh khối sợi nấm trong
100ml dịch sau 7 ngày nuôi, được trình bày ở hình 3.16 dưới đây;
Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT8
Tỷ lệ giống cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới tốc độ sinh trưởng của giống nấm và đặc điểm hệ sợi trong môi trường dịch thể; Tỷ lệ giống cấy quá cao hay quá thấp đều làm giảm
tốc độ sinh trưởng của giống cũng như làm thay đổi kích thước của khuẩn lạc cầu; theo một số nghiên cứu đã được công bố thì kích thước khuẩn lạc cầu không nên quá to hay quá
nhỏ; kích thước thích hợp của khuẩn lạc cầu trong khoảng 1,2 – 1,7 mm.
Như vây, tỷ lệ giống cấy chuyển thích hợp hợp khi nhân giống Đầu khỉ trung gian
cấp 1 dạng dịch thể là 4% so với thể tích, lựa chọn tỷ lệ này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.5. Nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng của hệ sợi nấm nói chung và nấm Đầu
khỉ nói riêng, đặc biệt là trong môi trường dạng dịch thể. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ, bố trí thí nghiệm như đã trình bày trong mục 2.3.2.1;
kết quả được thể hiện ở hình 3.17 sau;
77
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8.
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất rõ rệt đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể; Ở điều kiện nhiệt độ dưới 18 oC hệ sợi phát triển rất kém, thậm chí không có hiện tượng nẩy mầm của sợi nấm gốc; Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 24±2oC; Ở điều kiện từ 28±2oC hệ sợi phát triểu kém dần và ngừng phát triển khi nhiệt độ tăng trên 32±2oC.
Từ kết quả nghiên cứu, chọn điều kiện nhiệt độ 24±2oC để tiến hành các thí nghiệm
tiếp theo
3.2.1.6. Chế độ nuôi giống
Sử dụng CT 8, cấy giống theo tỉ lệ 4% thể tích, nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ
+ Để tĩnh + Nuôi trên máy khuấy từ: sử dụng con khuấy từ kích thước 2 cm, tốc độ khuấy
+ Nuôi lắc: nuôi giống trên máy lắc với tốc độ lắc 160 vòng/ phút, liên tục trong
Chế độ nuôi giống dạng dịch thể trung gian cấp 1 có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng cũng như hình thái hệ sợi trong môi trường nuôi cấy, do chế độ nuôi đóng vai trò quyết định nồng độ oxy hòa tan trong dung dịch cũng như các tác động cơ học trực tiếp vào hệ sợi. Để nghiên cứu các chế độ nuôi giống, tiến hành thí nghiệm như sau: 24±2oC; Các chế độ nuôi giống: 160 vòng/ phút, liên tục trong suốt quá trình nuôi. suốt quá trình nuôi. Thời gian nuôi 7 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ mọc của sợi, đặc điểm của hệ sợi. Kết quả được ghi ở bảng 3.16 sau đây;
78
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.16: Ảnh hưởng của chế độ nuôi đến sự sinh trưởng của giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8
Chỉ tiêu
Đặc điểm hệ sợi
Sinh khối sợi (g/100ml/7 ngày)
Chế độ
0,42 Nuôi tĩnh
0,55 Khuấy từ
0,58 Lắc
3,4 0,392
CV% LDS0,05
a. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi tĩnh
b. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi chế độ khuấy từ
Hệ sợi nấm nổi trên bề mặt dịch nuôi, sau 5 ngày cấy giống thấy xuất hiện một lớp màng mỏng, trắng muốt, sau 10 ngày từ lớp màng sợi này xuất hiện mần quả thể nhỏ, quả thể lớn dần và có hình dạng của quả thể trưởng thành sau 15 – 17 ngày nuôi. Sau 20- 25 ngày quả thể chuyển sang giai đoạn già hóa, tàn lụi dần. Bắt đầu nhìn thấy sự phát triển của hệ sợi sau 2 ngày cấy giống; Hệ sợi nhân lên khá nhanh nhưng bị đánh tan liên tục do đó hệ sợi nhuyễn dạng huyền phù tan đều trong môi trường dịch thể; Sau 10 ngày dịch nuôi đặc sện; Hệ sợi có xu hướng ăn lan lên thành chai nuôi, sau 15 ngày hệ sợi chuyển mầu vàng, phần sợi lan trên thành bình khô héo và lụi dần. Bắt đầu nhìn thấy sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi sau 2 ngày cấy giống; trong điều kiện lắc tròn hệ sợi có xu hướng bện kết lại với nhau tạo thành khuẩn lạc cầu, các khuẩn lạc cầu lớn dần và có thể quan sát thấy rõ ràng sau 4 ngày nuôi, sau 5- 7 ngày nuôi đường kính khuẩn lạc cầu đạt từ 0,8-1,7mm; tiếp tục nuôi thì khuẩn lạc cầu cũng không tăng kích thước lên nữa mà các khuẩn lạc cầu lại trở nên xốp hơn, sau 15 ngày các khuẩn lạc cầu có xu hướng tan ra dần, tạo màng mỏng trên bề mặt dịch, chuyển sang mầu vàng và lụi dần.
c. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi chế độ trên máy lắc
Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 ở các chế độ nuôi
79
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chế độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể khác nhau có ảnh hưởng khá lớn đến sinh khôi sợi nấm đồng thời có vai trò quyết định hình thái hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể; Trong công tác nhân giống điều tối kị là để xuất hiện quả thể ngay trong quá trình nhân chuyển các cấp giống; Vì vậy không thể nuôi giống trung gian cấp 1 ở chế độ nuôi tĩnh mà phải lựa chọn một trong hai chế độ khuấy hoặc lắc để nuôi giống nhằm làm tăng lượng sinh khối sợi trong dịch nuôi; Tùy vào mục đích nhân giống mà lựa chọn chế độ nuôi dùng khuấy từ hoặc dùng bàn lắc để đạt được hiệu quả cao nhất. Để khẳng định được chế độ lắc và khuấy từ thích hợp cho nuôi giống trung gian cấp 1, tiến hành nghiên cứu tốc độ lắc và khuấy từ ở thí nghiệm tiếp theo.
a. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc
Nuôi giống trên máy lắc với các tốc độ lắc: 110, 120, 130, 140,150, 160, 170, 180
vòng/ phút; Kết quả được trình bày ở bảng 3.17sau;
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hình thái và sinh khối hệ sợi nấm Đầu khỉ
trong môi trường CT8
Chỉ tiêu Đặc điểm khuẩn lạc cầu Sinh khối sợi (g/100ml/7ngày) Kích thƣớc KLC (mm)
To, xốp, mật độ khuẩn lạc cầu ít hơn hẳn so với các thí nghiệm còn lại. 0,50 0,53 1,5 1,5 Tốc độ lắc (v/p) 110 120
0,56 1,35
130 140 0,58 1,35
150 0,60 1,35
Kích thước khuẩn lạc cầu vừa phải, đồng đều; khuẩn lạc cầu có độ xốp, có nhiều tua gai xung quanh, các tua gai có xu hướng tách ra phát triển thành khuẩn lạc cầu mới. Khuẩn lạc cầu nhỏ li ti, mật độ dầy đặc, không có tua gai. 0,60 0,54 0,50 1,35 < 1 < 1
160 170 180 CV% 3,1
LDS0,05
0,302
Khi nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể trên máy lắc với tốc độ lắc phù hợp (140 – 160 vòng/phút) sẽ thu được giống nấm chất lượng tốt với các đặc điểm: lượng sinh khối sợi lớn, hệ sợi bện kết lại với nhau tạo thành các khuẩn lạc cầu có kích thước đồng đều, kích thước khuẩn lạc cầu không quá to hoặc quá nhỏ, xung quanh khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai có xu hướng nhân lên rồi đứt gãy khỏi khuẩn lạc cầu mẹ để tạo khuẩn lạc cầu mới. Với tốc độ lắc chậm hơn sẽ hạn chế khả năng hòa tan oxi trong môi trường dịch thể do đó làm hạn chế sự phát triển của hệ sợi. Với tốc độ lắc mạnh hơn làm cho hệ sợi có xu hướng cuộn chặt lại với nhau, làm giảm khả năng tiếp xúc của hệ sợi với môi trường dinh dưỡng và oxi hòa tan, do đó cũng làm giảm khả năng sinh trưởng của giống; Hơn nữa với tốc độ lắc quá nhanh sẽ có nguy cơ làm đứt gãy hệ sợi một cách mạnh mẽ nhưng hệ sợi lại không có đủ thời gian để nhân lên, mà cứ tiếp tục cuộn lại với nhau do đó tạo thành vô số khuẩn lạc cầu có kích thước nhỏ li ti, cuộn chặt lại với nhau, không có độ xốp, do đó hệ sợi non bị ức chế sinh sản tiếp.
80
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Như vậy, chọn tốc độ lắc 140 – 160 vòng/phút để nuôi giống Đầu khỉ trong các thí
Nuôi giống trên máy khuấy từ, tốc độ khuấy được nghiên cứu ở các chế độ sau: 120,
nghiệm tiếp theo. b. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ 140, 160, 180, 200, 220 vòng/phút; Sử dụng con khuấy có kích thước 2 cm. Kết quả được ghi nhận ở bảng sau:
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy từ đến hình thái và sinh khối hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8
Chỉ tiêu Đặc điểm khuẩn lạc cầu Tốc độ lắc (v/p)
Khuẩn lạc cầu chậm xuất hiện, kính thước nhỏ, ít tua gai.
Hệ sợi không tạo khuẩn lạc cầu mà tan trong dịch nuôi do đó dịch nuôi có dạng huyền phù lơ lửng, khi nuôi kéo dài thời gian dịch nuôi đặc sệt lại như cháo.
Sinh khối sợi (g/100ml/7ngày) 0,50 0,54 0,56 0,56 0,56 0,56 0,52 0,52 4,1 0,396 Kích thƣớc KLC (mm) 1,5 1,5 1,35 1,35 1,35 1,35 < 1 < 1 100 120 140 160 170 180 200 220 CV% LDS0,05
Khi nuôi giống nấm trung gian cấp 1 dạng dịch thể với con khuấy từ kích thước 2cm; tốc độ khuấy 140-160vòng/phút cho sinh khối sợi lớn; Hệ sợi dưới tác động của con khuấy từ bị đánh tan không có khả năng cuộn lại với nhau tạo dạng khuẩn lạc cầu. Bảng 3.19. So sánh giống dịch thể trung gian cấp 1 khi nuôi ở 2 chế độ: nuôi lắc, nuôi khuấy từ
Chế độ nuôi Lắc (150v/p) Khuấy từ (150v/p)
0,54 Chỉ tiêu SKS (g/100ml/7ng) Đặc điểm hệ sợi
Hệ sợi không tạo KLC mà dịch nuôi có dạng sệt sệt như cháo. Nẩy mầm, sinh trưởng tốt sau khi cấy chuyển sang môi trường mới, trong dịch nuôi mới hệ sợi cũng có dạng huyền phù, không tạo KLC. Khả năng nảy mầm sau khi cấy chuyển sang cấp giống tiếp theo
Ƣu nhƣợc điểm của chế độ nuôi
0,60 Tạo KLC đường kính 1,3-1,5 mm. Nẩy mầm, sinh trưởng tốt sau khi cấy chuyển sang môi trường mới, trong dịch nuôi ở thể tích cao hơn hệ sợi cũng có xu hướng cuộn lại với nhau tạo dạng KLC. Ưu điểm: dễ dàng quan sát trạng thái giống và nhận biết giống nhiễm; hệ sợi phát triển nhanh sau khi cấy chuyển sang môi trường mới; một thiết bị lắc có thể nuôi được nhiều chai giống trung gian cấp 1 (tùy thuộc vào số chân lắc), dễ dàng sắp xếp khi nuôi giống với số lượng giống lớn. - Ưu điểm: hệ sợi phát triển nhanh sau khi cấy chuyển sang môi trường mới; - Nhược điểm: khó khăn trong việc quan sát trạng thái giống và phân biệt giống nhiễm; một thiết bị chỉ có thể nuôi được 1 chai giống cấp 1 nên gặp khó khăn khi nuôi giống với số lượng lớn.
81
a. Hình thái hệ sợi của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy lắc khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít
b. Hình thái hệ sợi của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy khuấy từ khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.19: Sự phát triển của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy lắc và nuôi trên máy khuấy từ khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít, thời gian nuôi 7 ngày 3.2.1.7. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
Sử dụng CT 8, cấy giống với tỉ lệ 4% thể tích; Nuôi ở điều kiện nhiệt độ 24 – 26oC; Chế độ nuôi: nuôi lắc tốc độ 150 vòng/ phút. Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong các thời điểm nuôi cấy: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ, 192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; vẽ đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.20 sau đây;
Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng của giống Đầu khỉ trong môi trường nuôi
dưỡng CT8
Nhìn vào đường cong sinh trưởng của giống nấm nấm Đầu khỉ cho thấy: + Giai đoạn thích nghi của giống ngắn, xuất phát từ thời điển cấy giống cho đến 48 giờ sau khi cấy. Trong giai đoạn này không thấy có sự thay đổi rõ về hình thái cũng như kích thước hệ sợi nấm.
82
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Như vậy, sau khi đã nghiên cứu các điều kiện nhân giống trung gian cấp 1 nấm Đầu
- pH môi trường dinh dưỡng 6,5; - Tỉ lệ giống cấy chuyển 4% theo thể tích; - Chế độ nuôi lắc 150 vòng/ phút liên tục trong suốt quá trình nuôi - Nhiệt độ nuôi giống: 24±2oC
* Tiêu chuẩn giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1
Giống không bị nhiễm bệnh, khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh sau quá trình
+ Giai đoạn tăng sinh kéo dài từ sau 24 giờ nuôi cho đến hết 144 giờ kể từ khi cấy giống; Đây là giai đoạn phát triển tối đa của giống; Hình thái hệ sợi cũng thể hiện rất rõ sinh lực giống đang trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất thể hiện như sau: hệ sợi phát triển đồng đều, các khuẩn lạc cầu tăng kích thước nhanh chóng, xung quanh khuẩn lạc cầu xuất hiện nhiều tua gai, các tua gai liên tục đứt gãy khỏi khuẩn lạc cầu ban đầu để tiếp tục nhân lên, xoắn lại với nhau để tạo thành khuẩn lạc cầu mới do đó trong giai đoạn này khuẩn lạc cầu vừa tăng sinh về kích thước lẫn số lượng. + Giai đoạn cân bằng của giống kéo dài từ 144 giờ nuôi trở đi, đây là đặc điểm khác biệt của giống nấm Đầu khỉ nói riêng và giống nấm lớn nói chung so với vi nấm; Pha cân bằng có thể kéo dài hàng chục ngày, tiếp đó hệ sợi nấm không chết đi mà chuyển sang một trạng thái mới, hệ sợi bện kết lại với nhau tạo mảng, tạo khối dày, dai, sau đó hình thành quả thể ngay trong môi trường dịch thể; Quả thể phát triển và lụi tàn dần khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt. Pha suy vọng bắt đầu diễn ra sau 30 - 35 ngày nuôi cấy. Trong công tác nhân giống, chúng tôi không quan tâm nhiều đến giai đoạn cân bằng và suy vong của giống mà chỉ nghiên cứu để nắm được đặc điểm phát triển của giống; điều quan trọng nhất trong nhân giống dạng dịch thể là tìm được giai đoạn tăng sinh của giống để khai thác sử dụng; Đối với giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 giai đoạn này kéo dài từ sau 72 đến 144 giờ nuôi cấy (3 - 6 ngày). Để sử dụng giống trung gian cấp 1 cấy chuyển sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 với dung tích lớn hơn một cách hiệu quả, NCS tiếp tục các thí nghiệm để xác định tuổi giống cấy chuyển, tỷ lệ giống cấy chuyển thích hợp ở các thí nghiệm tiếp theo. khỉ, bao gồm: - Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: 115oC trong 30-35 phút; - Thành phần môi trường dinh dưỡng: sử dụng môi trường CT8 với thành phần: Khoai tây 200g/l; nấm sò tươi: 100g/l; Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO4.7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2 HPO4: 1g; Thiamin: 20 µg; Nước: 1000 ml; Hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 phát triển đồng đều trong dịch nuôi, dịch nuôi có màu vàng nhạt, trong suốt, mật độ hệ sợi dày, không có sự phân tầng trong dịch nuôi; Hệ sợi không bị kết thành từng mảng mà phân bố đồng đều trong dịch nuôi, hệ sợi khi để tĩnh có xu hướng lắng xuống chứ không nổi trên bề mặt dịch nuôi. cấy chuyển, khả năng thích nghi với môi trường nhân giống trung gian cấp 2 cao.
NCS đề suất sơ đồ tóm tắt qui trình nhân gống trung gian cấp 1 nấm Đầu khỉ như
hình 3.21 như sau;
83
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Khoai tây gọt vỏ, thái lát mỏng 1,5 cm Nấm tươi, cắt chân, rửa sạch
Luộc trong 300 ml nước sạch/ 10- 15 phút, lọc lấy nước chiết Bổ sung 500 ml nước; Đun sôi 10 - 15 phút, lọc lấy nước chiết
Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO4.7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2HPO4: 1g; Thiamin: 20 µg
Trộn hai dịch chiết với nhau, bổ sung nước cho đủ 800 ml
Hỗn hợp dịch nuôi Hòa tan hoàn toàn trong 200ml nước
Đổ dịch vào chai 500ml, làm nút bông, hấp khử trùng ở 115oC trong 30-35 phút, để nguội.
Tỉ lệ giống đã nghiền mịn: 4% so với thể tích Cấy giống
Chuẩn bị phòng cấy, dụng cụ cấy, giống gốc
Nuôi sợi trên máy lắc 150 vòng/ phút Nhiệt độ nuôi 24± 2oC. Thời gian nuôi 3-6 ngày
Quan sát hệ sợi, đánh giá chất lượng giống dạng dịch thể.
Giống nấm dạng dịch thể trung gian cấp 1
Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể, dung tích 200ml
84
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích 2000ml – 5000ml)
3.2.2.1. Nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng
Môi trường được khử trùng ở 115oC, ở các khoảng thời gian khác nhau, kiểm tra
Chuẩn bị môi trường như đã trình bày trong mục 2.3.2.2; Chuẩn bị bình lên men 2000 -5000ml thông thường cần khử trùng toàn bộ hệ thống bình lên men 5lít trước khi đổ môi trường; Hệ thống bình lên men bao gồm: bình 5 lít, các ống dẫn, màng lọc không khí. Đổ môi trường vào bình: với bình 2000ml đổ 1500ml dịch, với bình 5000ml đổ 4500ml dịch; Vặn chặt nắp bình, buộc chặt các đầu ống dẫn, lắp màng lọc. Dùng nilon chịu nhiệt buộc phần đầu nút bông của các ống dẫn. chất lượng môi trường sau khi khử trùng và sau 30 ngày lưu mẫu.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.20.
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml) Khử trùng ở 115oC
Thời gian 30 40 50 60 - 70
+ 1/10 mẫu +++ 0/10 mẫu ++ 1/10 mẫu ++++ 0/10 mẫu
Chỉ tiêu theo dõi Mầu sắc môi trường Tỷ lệ nhiễm khi lưu mẫu * Ghi chú: (+) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng không khác biệt so với trước khử trùng (++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn một chút so với trước khử trùng, dịch có mùi thơm tự nhiên (+++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn nhiều so với trước khử trùng, dịch sau khử trùng có mùi thơm đặc trưng. (++++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn rất nhiều so với trước khử trùng, dịch sau khử trùng chuyển mầu nâu đỏ, có mùi thơm đặc trưng.
Hình 3.22:Môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian lần lượt là 30, 40, 50, 60, 70phút (tính từ trái sang phải của hình)
Hình 3.23: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút và môi trường khử trùng ở 115oC trong thời gian 70 phút (tính từ trái sang phải của hình)
85
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Kết quả cho thấy khử trùng ở nhiệt độ 115oC trong 50 phút là thích hợp nhất vì ở điều kiện khử trùng này môi trường dinh dưỡng vừa đảm bảo vô trùng mà chất lượng môi trường vẫn được bảo đảm; Lựa chọn điều kiện khử trùng ở nhiệt độ 115oC trong 50 phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
Nhằm giảm chi phí trong sản xuất mà vẫn đảm bảo được chất lượng giống, tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm được môi trường nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 với dung tích 2000 – 5000ml; Dựa trên thành phần môi trường nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 1, chúng tôi thay thế pepton Đức bằng pepton Trung Quốc với các tỉ lệ khác nhau;
Chuẩn bị các môi trường dinh dưỡng theo công thức trong bảng 2.3; khử trùng môi trường, cấy giống, nuôi giống ở nhiệt độ 24±2oC, sục khí 0,5l/1lit môi trường/1phút. Theo dõi sự sinh trưởng phát triển của giống. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.21 sau;
Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong các
môi trường dinh dưỡng khác nhau
Chỉ tiêu Sinh khối sợi
Kích thƣớc KLC (mm) (gam/100ml/7ngày) Công thức
1,3 0,45 CT 10
1,3 0,52 CT 11
1,3 0,57 CT 12
1,3 0,55 CT 13
CV% 3,9
0,412 LDS0,05
Giống nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt trên công thức CT 12 có thành phần: Glucose: 15g; Pepton TQ: 4g; MgSO4 .7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2HPO4: 1g; thiamin: 20 µg; nước cất: 1000 ml, pH 6,5; sinh khối sợi và sinh lực giống có kết quả vượt trội hơn hẳn so với các công thức còn lại. Ở các môi trường CT13 khi tiếp tục tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng thì sinh khối sợi không tăng; lựa chọn công thức CT 12 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
86
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CT10
CT11
CT13
CT12
Hình 3.24: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong các công thức môi trường dinh dưỡng khác nhau (dịch 7 ngày nuôi)
3.2.2.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2
Sử dụng môi trường CT12, khử trùng 115oC thời gian 50 phút; cấy giống với độ tuổi giống khác nhau; Bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.2; Kết quả được ghi nhận ở bảng sau:
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 đến chất lượng giống trong CT12
Chỉ tiêu Đặc điểm giống Tuổi giống
72 giờ (3 ngày) 96 giờ (4 ngày) 120 giờ (5 ngày)
Kích thƣớc KLC (mm) 1,3 1,3 1,3 1,3
Hệ sợi phát triển đồng đều, khuẩn lạc cầu tròn đều, có gai tua xung quanh; mầu sắc của khuẩn lạc cầu trắng đục đồng nhất. Sinh khối sợi (g/100ml/7ngày) 0,65 0,69 0,73 0,72 3,8 0,525 144 giờ (6 ngày) CV% LDS0,05
Sử dụng giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể trong giai đoạn phát triển mạnh mẽ nhất để cấy chuyển sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 có tác dụng làm tăng khả năng thích ứng của giống trong môi trường mới, rút ngắn thời gian của pha thích nghi, đồng thời kích thích sự tăng sinh của giống; Sử dụng giống cấy chuyển có sinh lực tốt cũng góp phần làm giảm tỷ lệ nhiễm, kéo dài thời gian của pha sinh trưởng và pha cân bằng, qua đó kéo dài thời gian sử dụng giống nấm dạng dịch thể. Qua kết quả thu được khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 1 dùng để cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 cho thấy: sử dụng giống đang ở giai đoạn từ 3 đến 6 ngày tuổi đều cho kết quả tốt, tốt nhất là sử dụng giống ở giai đoạn 5 ngày tuổi.
87
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
3.2.2.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể
Tỷ lệ giống cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới tốc độ sinh trưởng của giống nấm và đặc điểm hệ sợi trong môi trường dịch thể; Tỷ lệ giống cấy quá cao hay quá thấp đều làm giảm tốc độ sinh trưởng của giống cũng như làm thay đổi kích thước của khuẩn lạc cầu; Để xác định tỷ lệ giống trung gian cấp 1 cấy chuyển sang môi trường nhân giống trung gian cấp 2 thích hợp, bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.2; Kết quả thu được ghi nhận ở bảng 3.23, hình 3.25 và hình 3.26 sau đây.
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến kích thước và đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trong CT12
Tỷ lệ 3% 5% 7% 10% Chỉ tiêu 1,0 1,0
KLC (mm) Đặc điểm hệ sợi
1,5 - 2 Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ thưa, kích thước các KLC khá to, đồng đều. 1,3 - 1,45 Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ nhiều, KLC có kích thước trung bình, phát triển đồng đều. Hệ sợi xuất hiện sau 2 ngày cấy giống, tốc độ phát triển nhanh, mật độ dày đặc, kích thước các KLC nhỏ li ti.
Trong quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy chuyển cho thấy, với tỉ lệ giống 5-7% so với thể tích cho lượng sinh khối lớn, kích thước khuẩn lạc cầu vừa phải, đạt từ 1,0 – 1,45mm. Theo một số nghiên cứu đã được công bố thì kích thước khuẩn lạc cầu không nên quá to hay quá nhỏ, kích thước thích hợp của khuẩn lạc cầu trong khoảng 1,2 – 1,7 mm là tốt nhất.
Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT12
Như vậy lựa chọn tỷ lệ giống cấy 5% - 7% theo thể tích để tiếp tục các thí nghiệm
tiếp theo.
88
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.26: Giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 sau 7 ngày nuôi (Tính từ trái sang phải của hình: tỉ lệ giống cấy 3%, 5%, 7%, 10%)
3.2.2.5. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít
Sử dụng CT 12; cấy chuyển giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể được nuôi sau 120
Nuôi giống trung gian cấp 2 ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, Các chế độ sục khí: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 (đơn vị tính: lít khí/1 lít môi trường/ 1 phút) Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ mọc của sợi; đặc điểm của hệ sợi, kích thước khuẩn lạc cầu,
giờ nuôi (5 ngày), với tỉ lệ 7% thể tích khả năng tạo bọt. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.24 sau;
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 (cho bình lên men dung tích 5lit)
Mức độ khuấy đảo giống Thể tích khí (lít/1lit/1phút) Sinh khối sợi (g/5l/7 ngày) Kích thƣớc KLC (mm) Mức độ tạo bọt
9,62 + 0,2 1,0
10,35 + 1,2 0,3
11,7 + 1,4 0,4
++ 0,5 13,2 1,45
13,5 +++ 1,45 0,6
13,6 2,8 Sự chuyển động của giống trong bình lên men kém, giống có xu hướng chìm xuống dưới đáy bình lên men, liên kết với nhau tạo thành từng mảng lớn. Sự chuyển động của giống trong bình lên men tốt, giống chuyển động liên tục, tạo thành hệ sợi hình cầu. Mức độ chyển động của giống trong môi trường tốt nhưng tạo nhiều bọt đẩy giống ra ngoài lỗ thoát khí. ++++ 1,45
1,618 0,7 CV% LDS0,05
89
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể trong môi trường CT12 và mức độ tạo bọt; (Từ trái sang phải của ảnh: chế độ sục khí 0,3 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,4 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,5 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,6 lit khí/1l dịch nuôi/phút; 0,7 lit khí/1l dịch nuôi/phút).
Kết quả ở bảng 3.24 và hình 3.27 cho thấy thể tích khí cung cấp cho quá trình lên men có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng cũng như kích thước của khuẩn lạc cầu; Sinh khối sợi tăng khi thể tích sục khí tăng từ 0,2 lít/1lit dịch nuôi/phút đến 0,6 lít/1lit dịch nuôi/phút; Tiếp tục tăng thể tích khí lên 0,7 lít/1lit dịch nuôi/phút sinh khối sợi nấm tăng không đáng kể mà còn tạo nhiều bọt, gây cản trở cho quá trình hòa tan oxy, đồng thời đẩy giống phát triển trên thành bình nuôi, thậm chí đẩy giống tràn ra ngoài qua lỗ thoát khí; Tốc độ sục khí mạnh cũng có khả năng làm tăng tỷ lệ nhiễm do màng lọc khí bị thủng. Với lượng khí cung cấp từ 0,2 – 0,3 lít/1lit dịch nuôi/phút sinh khối sợi ít, không có sự chuyển động trong môi trường nuôi cấy, giống có xu hướng chìm dưới đáy bình, liên kết với nhau tạo thành từng mảng. Với lượng khí 0,4 - 0,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút cho kết quả tốt nhất.
Từ kết quả thu được, NCS lựa chọng chế độ sục khí 0,4 - 0,5lit khí/1lit dịch
nuôi/phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.6. Kết quả nghiên cứu tác dụng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 (cho bình lên men dung tích 2-5 lít)
Để nghiên cứu tác dụng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2, bố trí thí nghiệm như đã trình bày ở phần 2.3.2.2; Sử dụng công thức môi trường CT 12; Chế độ sục khí 0,4-0,5 lít khí/1 lít môi trường/1 phút; Các chất phá bọt sử dụng: Tween 80 (1ml/lít môi trường), Antifoam (0,5 ml/lít môi trường); Soybean oil wasted powder (1 g/lít môi trường); Dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường)
90
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 2
STT Chất phá bọt
1 Không sử dụng chất phá bọt 2 Tween 80 (1ml/lít môi trường) Mức độ tạo bọt +++ ++ Ảnh hƣởng tới giống nấm - Không
3 Antifoam (0,5 ml/lít môi trường) 4 - + Không Làm đục dịch nuôi
Soybean oil wasted powder (1 g/lít môi trường)
5 Dầu đậu tương (0,5 ml/lít môi trường) - Không
a. Bổ sung dầu đậu tương làm chất phá bọt. b. Không bổ sung chất phá bọt
Hình 3.28: Tác dụng của chất phá bọt trong quá trình lên men có sục khí, chế độ sục khí 0,4-0,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút
Do tác động của sục khí và quá trình lên men tạo ra CO2 nên hình thành bọt khí trên bề mặt dịch nuôi, tốc độ sục khí càng mạnh thì tạo bọt càng nhiều; Bọt khí làm giảm khả năng trao đổi chất qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm, bên cạnh đó nó còn làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị lên men thậm chí nếu tạo quá nhiều bọt còn gây tràn dịch làm hỏng màng lọc, gây nhiễm giống. Để đảm bảo cho việc cung cấp đủ khí cho sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi mà không tạo bọt trong quá trình lên men thì việc bổ sung chất phá bọt là yếu tố bắt buộc. Trong quá trình nghiên cứu đã lựa chọn 4 chất phá bọt để nghiên cứu: Tween 80, Antifoam, Soybean oil wasted powder và dầu đậu tương với hàm lượng sử dụng như khuyến cáo của nhà sản xuất, kết quả cho thấy các chất này đều có khả năng làm giảm bọt trong đó Tween 80 cho kết quả phá bọt thấp nhất, Soybean oil wasted powder tác dụng tốt xong khi bổ sung vào môi trường nuôi lại tạo vẩn đục gây khó khăn trong việc quan sát hình thái và sự sinh trưởng của hệ sợi nấm,
91
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
antifoam với hàm lượng 0,5 ml/lít môi trường và dầu đậu tương với hàm lương 0,5 ml/lít môi trường cho hiệu quả phá bọt triệt để; NCS lựa chọn dầu đậu tương để làm chất phá bọt trong các thí nghiệm tiếp theo vì dầu đậu tương mang lại hiệu quả phá bọt tốt, rẻ tiền, phổ biến.
3.2.2.7. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể
Xây dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường dịch thể nhằm xác định được pha sinh trưởng của giống để tiếp tục cấy chuyển sang thể tích nhân giống lớn hơn. Việc xác định giai đoạn sinh trưởng của giống có ý nghĩa quan trọng trong công tác nhân giống, nó góp phần quyết định chất lượng giống nấm đưa vào sản xuất, nuôi trồng nấm, đặc biệt là trong sản xuất lớn.
Sử dụng môi trường CT12; Bố trí thí nghiệm như đã trình bày ở phần 2.3.2.2; kết quả
được ghi nhận ở bảng 3.26 sau:
Bảng 3.26. Sự sinh của giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12
ở từng thời điểm nuôi
Thời gian (giờ) Đặc điểm khuẩn lạc cầu
Sinh khối sợi (g/100ml/) 0 0,2 Khuẩn lạc cầu nhỏ li ti, trong suốt.
Kích thƣớc khuẩn lạc cầu (mm) <1 <1 <1 Chỉ tiêu 24 48 72 0,45
1,2 96 0,63
0,75 1,2
120 144 0,75 1,3
0,77 1,5 168
Kích thước khuẩn lạc cầu tăng nhanh, xung quanh nhiều tua gai; Khuẩn lạc cầu từ mầu trắng trong chuyển dần sang mầu trắng đục, đồng nhất. Khuẩn lạc cầu tròn đều, bề mặt khuẩn lạc cầu nhẵn dần, khuẩn lạc cầu chuyển hẳn sang màu trắng đục rồi chuyển dần sang mầu hơi ngà vàng.
CV% 6,4
0,649 LDS0,05
Sinh khối sợi nấm tăng mạnh trong 3 - 6 ngày nuôi và tiếp tục tăng chậm trong thời gian tiếp theo. Trong giai đoạn 4 - 6 ngày nuôi hệ sợi thể hiện rõ nét các đặc điểm của giống đang trong giai đoạn tăng trưởng; lựa chọn giống ở giai đoạn này để nhân các cấp tiếp theo.
92
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.29: Đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng
dịch thể trung gian cấp 2
Nhìn vào đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 cho thấy: Giai đoạn thích nghi ngắn, xuất phát từ thời điển cấy giống cho đến 24 giờ sau khi cấy; Giai đoạn tăng sinh kéo dài từ 24 giờ cho đến hết 144 giờ tính từ khi cấy giống, đây là giai đoạn phát triển tối đa của giống, hình thái hệ sợi cũng thể hiện rất rõ sinh lực giống: kích thước khuẩn lạc cầu tăng nhanh, xung quanh có nhiều tua gai; khuẩn lạc cầu từ mầu trắng trong chuyển dần sang mầu trắng đục, đồng nhất; Giai đoạn cân bằng của giống kéo dài từ 144 giờ nuôi trở đi, pha cân bằng có thể kéo dài hàng chục ngày.
Như vậy, qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 lít, bao gồm các điều kiện: - Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2: Glucose: 15g; Pepton TQ: 4g; MgSO4 .7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2HPO4: 1g; thiamin: 20 µg; nước cất: 1000 ml, pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít môi trường; - Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống: 115oC/50 phút; - Tỉ lệ giống cấy chuyển: 5-7%, - Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển: 3 - 6 ngày tuổi, tốt nhất ở 5 ngày tuổi; - Nhiệt độ nuôi giống 24±2oC - Chế chế độ sục khí: 0,4 – 0,5 lít khí/lít môi trường/phút - Thời gian nuôi: 5 ngày * Tiêu chuẩn giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 đưa vào sản xuất: Hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 phát triển đồng đều trong dịch nuôi, dịch nuôi có màu vàng nhạt, trong suốt, mật độ hệ sợi dày, không có sự phân tầng trong dịch nuôi; hệ sợi không bị kết thành từng mảng mà phân bố đồng đều trong dịch nuôi, hệ sợi khi để tĩnh có xu hướng lắng xuống chứ không nổi trên bề mặt dịch nuôi. Giống không bị nhiễm bệnh, khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh sau quá trình cấy chuyển, khả năng thích nghi với môi trường nhân giống thể rắn hoặc môi trường nhân giống dạng dịch thể phục vụ nuôi trồng cao.
93
Từ đó NCS xin đề xuất sơ đồ tóm tắt qui trình công nghệ nhân giống dạng
dịch thể trung gian cấp 2 dung tích 2000 - 5000 ml như sau:
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Cân Glucose: 15g/l; Pepton TQ: 4g/l; MgSO4 .7H2O: 1g/l; KH2PO4: 1g/l; K2HPO4: 1g/l; (NH4)2HPO4: 1g/l; thiamin: 20 µg; pH 6,5
Hòa tan hoàn toàn vào nước sạch
Đổ dịch vào bình lên men, lắp ống dẫn, màng lọc khí; Khử trùng ở 115oC/50 phút, để nguội trong phòng sạch
Cấy giống, tỉ lệ 5-7% thể tích
Chuẩn bị phòng cấy, dụng cụ cấy, giống trung gian cấp 1 nuôi lắc 5 ngày liên tục.
Lắp vào hệ thống cấp khí, thể tích khí 0,4 - 0,5lit/1lit dịch nuôi/phút
Nhiệt độ nuôi 24± 2oC, thời gian nuôi 5 ngày Quan sát hệ sợi, đánh giá chất lượng giống dạng dịch thể.
Giống nấm dạng dịch thể trung gian cấp 2
Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể, dung tích 5000ml
94
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.31: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể
3.2.3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 3.2.3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể tích 120lit Để nghiên cứu thành phần môi trường thích hợp cho nhân giống nấm Đầu khỉ dung tích 120lit phục vụ nuôi trồng, chuẩn bị các môi trường dinh dưỡng theo các công thức trong bảng 2.4; Bố trí thí nghiệm như đã trình bày trong phần 2.3.2.3; Kết quả được ghi nhận ở hình dưới đây:
Giống nấm Đầu khỉ He1 sinh trưởng tốt trên công thức CT 16 và công thức CT 17, lượng sinh khối đạt 6,2 g/1000ml dịch nuôi/ 5 ngày nuôi; Để giảm chi phí sản xuất khi sản xuất giống trên qui mô lớn, NCS lựa chọn công thức CT 16 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng giống nấm đặc biệt là tỷ lệ nhiễm của giống nấm, ngay cả khi chưa tiến hành cấy giống. Để tìm được điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng thích hợp, bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.3; Kết quả nghiên cứu được ghi nhận ở bảng sau: Bảng3.27: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng trong bình lên men 120lit
Chế độ khử trùng 121oC/60ph 121oC/70ph 121oC/80ph 121oC/90ph
++ ++ +++ +++++
5/10 2/10 mẫu 0/10 mẫu 0/10 mẫu
Ghi chú:
(+) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng không khác biệt so với trước khử trùng (++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn so với trước khử trùng, dịch có mùi thơm tự nhiên (+++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn so với trước khử trùng, dịch có mùi thơm tự nhiên (++++) Độ đậm màu của dịch sau khử trùng đậm hơn nhiều so với trước khử trùng, dịch sau khử trùng có mùi cháy khét (môi trường chuyển sang mầu đen cháy)
Chỉ tiêu theo dõi Mầu sắc môi trƣờng Tỷ lệ nhiễm khi chƣa cấy giống (lưu mẫu trong 10 ngày)
95
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Kết quả cho thấy khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 80 phút là thích hợp nhất vì ở điều kiện khử trùng này môi trường dinh dưỡng vừa đảm bảo vô trùng vừa không bị mất dinh dưỡng do bị cháy đường. Lựa chọn điều kiện khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 80 phút để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít.
Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển có tác động trực tiếp tới khả năng thích nghi cũng như sự sinh trưởng và phát triển của giống trong môi trường nuôi dưỡng mới; Để nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể dùng để cấy chuyển đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trong bình lên men dung tích 120 lít, bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.3:
Sử dụng môi trường CT 16; Khử trùng ở chế độ nhiệt độ 121oC trong thời gian 80
phút, để nguội tự nhiên trong phòng kín đến nhiệt độ dưới 30oC.
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể ở các thời điểm: giống sau 72 giờ nuôi (3 ngày); 96 sau giờ nuôi (4 ngày), giống sau 120 giờ nuôi (5 ngày); giống sau 144 giờ nuôi (6 ngày); 168 giờ (7 ngày); Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, có sục khí, thời gian nuôi 5 ngày.
Kết quả nghiên cứu được trình bầy ở hình 3.32 dưới đây:
Hình 3.32: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển sang thể tích 120lit đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT16
Sử dụng giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể trong giai đoạn phát triển mạnh mẽ nhất để cấy chuyển sang môi trường nhân giống thể tích 120 lít có tác dụng làm tăng khả năng thích ứng của giống trong môi trường mới, rút ngắn thời gian của pha thích nghi, đồng thời kích thích sự tăng sinh của giống; Sử dụng giống cấy chuyển có sinh lực tốt cũng góp phần làm giảm tỷ lệ nhiễm, kéo dài thời gian của pha sinh trưởng và pha cân bằng, qua đó kéo dài thời gian sử dụng giống nấm dạng dịch thể. Qua kết quả thu được khi tiến hành nghiên cứu
96
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 dùng để cấy chuyển sang giống nuôi trồng cho thấy: sử dụng giống đang ở giai đoạn từ 4 đến 6 ngày tuổi cho kết quả tốt, lượng sinh khối sợi đạt 7,2 – 7,4 g/1000 ml dịch nuôi/5 ngày nuôi; Hệ sợi phát triển đồng đều, khuẩn lạc cầu tròn đều, có gai tua xung quanh; Mầu sắc của khuẩn lạc cầu trắng đục đồng nhất.
Từ kết quả thu được, NCS lựa chọn dùng giống trung gian cấp 2 nuôi 5 ngày để cấy
chuyển sang nồi lên men 120 lít để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3.4. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120 lít
Tỷ lệ giống cấy cũng là yếu tố có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng của giống nấm trong môi trường nuôi cấy và có ảnh hưởng ít nhiều tới thời gian giữa các pha sinh trưởng của giống do nó ảnh hưởng trực tiếp tới mật độ cá thể trong quần thể giống. Tỷ lệ giống cấy phải đảm bảo ở mức vừa đủ để các cá thể có khả năng duy trì và phát triển số lượng một cách tốt nhất.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120
lít, bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.3;
Sử dụng môi trường CT 16; Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi
trường nhân giống dung tích 120 lít với các tỉ lệ sau: 5, 10, 15, 20% so với thể tích
Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, có sục khí; Kết quả nghiên cứu được trình
bầy ở hình 3.32 sau:
Hình 3.33: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển sang bình dung tích 120 lít đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trương CT16
Kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực nghiệm cho thấy tỉ lệ giống cấy chuyển có ảnh hưởng rõ rệt tới tốc độ sinh trưởng của giống nấm và đặc điểm hệ sợi trong
97
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
môi trường dịch thể. Tỉ lệ giống cấy quá cao hay quá thấp đều làm giảm tốc độ sinh trưởng của giống cũng như làm thay đổi kích thước của khuẩn lạc cầu; Theo một số nghiên cứu đã được công bố thì kích thước khuẩn lạc cầu không nên quá to hay quá nhỏ, kích thước thích hợp của khuẩn lạc cầu trong khoảng 1,2 – 1,7 mm. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ giống cấy tăng từ 5% đến 15% thì sinh khối sợi tăng dần và đạt sinh khối lớn nhất 7,5 g/1000ml dịch nuôi/5 ngày nuôi, với tỉ lệ giống cấy là 15% so với thể tích. Tiếp tục tăng tỉ lệ giống lên 20% không có lợi cho sự phát triển của giống, thể hiện ở mật độ sợi dầy đặc nhưng nhỏ li ti, không có sự tăng kích thước của khuẩn lạc cầu, sinh khối hệ sợi có xu hướng giảm dần.
Như vậy tỉ lệ giống cấy chuyển sang bình thể tích 120lit thích hợp đối với nấm Đầu khỉ
là 15%; NCS lựa chọn tỷ lệ giống cấy chuyển là 15% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3.5. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống sử dụng trong nuôi trồng dạng dịch thể, bình dung tích 120lit
Để nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong bình lên men dung
tích 120 lít, Bố trí thí nghiệm như đã trình bầy ở phần 2.3.2.3; Sử dụng môi trường CT 16;
Cấy giống trung gian cấp 2 dạng dịch thể sau 120 giờ nuôi (5 ngày) sang môi trường nhân giống dung tích 120 lít với tỉ lệ 15% so với thể tích; Nuôi giống ở điều kiện nhiệt độ 24±2oC, có sục khí; Xác định sinh khối sợi, quan sát hình thái sợi trong suốt quá trình nuôi cấy tại các thời điểm: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ,
192 giờ, 216 giờ, 240 giờ; dựng đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể. Kết quả nghiên cứu được trình bầy ở bảng 3.28 và hình 3.34 sau:
Bảng 3.28: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong nồi lên men 120 lít ở từng thời điểm nuôi
24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h 192h 216h 240h Thời gian
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) Chỉ tiêu
SK sợi 1,0 2,3 4,7 6,5 7,5 7,7 7,8 7,8 8,0 8,0 (g/100ml/)
0 <1 1 1,2 1,3 1,5 1,7 1,7 1,7 1,5 Kích thƣớc KLC (mm)
Chưa Nhỏ Kích thước KLC tăng nhanh, KLC tròn đều, bề nhẵn dần, Đặc điểm
xuất hiện ly ti, trong xung quanh nhiều tua gai; KLC từ mầu trắng trong chuyển dần chuyển hẳn sang màu trắng đục rồi chuyển dần sang khuẩn lạc cầu
suốt sang mầu trắng đục, đồng nhất. mầu hơi ngà vàng.
CV% = 2,3; LDS0,05 = 0,239
98
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Sinh khối sợi nấm tăng mạnh trong 3 - 6 ngày đầu nuôi cấy, tăng từ 4,7 g/1000ml
dịch nuôi/3 ngày lên đến 7,7 g/1000ml dịch nuôi/6 ngày nuôi cấy; Tiếp tục tăng chậm trong thời gian tiếp theo. Trong giai đoạn 4 - 6 ngày nuôi hệ sợi thể hiện rõ nét các đặc
điểm của giống đang trong giai đoạn tăng trưởng; Do đó nên lựa chọn giống ở giai đoạn 5 – 6 ngày nuôi để cấy chuyển sang cơ chất tổng hợp dạng rắn nuôi trồng thu qủa thể nấm.
Hình 3.34: Đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường CT16
Nhìn vào đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong bình lên men 120
lít cho thấy:
+ Giai đoạn thích nghi của giống ngắn, xuất phát từ thời điển cấy giống cho đến 24
giờ sau khi cấy.
+ Giai đoạn tăng sinh kéo dài từ 24 giờ cho đến hết 144 giờ kể từ khi cấy giống, đây là giai đoạn phát triển tối đa của giống, hình thái hệ sợi cũng thể hiện rất rõ sinh lực
giống: hệ sợi phát triển đồng đều, các khuẩn lạc cầu tăng kích thước nhanh chóng, xung quanh khuẩn lạc cầu xuất hiện nhiều tua gai, các tua gai đứt gãy liên tục khỏi khuẩn lạc cầu ban đầu để tiếp tục nhân lên, xoắn lại với nhau để tạo thành khuẩn lạc cầu mới, do đó trong giai đoạn này khuẩn lạc cầu vừa tăng sinh về kích thước lẫn số lượng.
+ Giai đoạn cân bằng của giống kéo dài từ 144 giờ nuôi trở đi, pha cân bằng kéo dài hàng chục ngày, tiếp đó hệ sợi nấm không chết đi mà chuyển sang một trạng thái mới:
hệ sợi bện kết lại với nhau tạo mảng, tạo khối dày, dai nổi trên bề mặt, bám xung quanh thành nồi lên men, tạo quả thể ngay trong môi trường dịch thể, quả thể phát triển và lụi tàn
dần khi dinh dưỡng cạn kiệt.
99
b. Hệ sợi nấm Đầu khỉ phát triển
a. Nồi lên men sau quá trình lên men, cấy chuyển giống sang cơ chất nuôi trồng.
trong dịch lên men
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.35: Sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong bình lên men dung tích 120 lít, sau 5 ngày nuôi cấy
Như vậy, qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để
nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít phục vụ nuôi trồng, bao gồm:
- Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2: Glucose: 10g/l; Saccarose: 10g/l; Bột dinh dưỡng cô đặc: 20g/l; MgSO4 .7H2O: 1g/l; KH2PO4: 1g/l; K2HPO4: 1g/l; NaNO3: 1g/l; NH4NO3: 1g/l; B1: 3 viên/l; pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít môi trường;
- Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống: 121oC/80 phút;
- Tỉ lệ giống cấy chuyển: 15%,
- Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển: 4 - 6 ngày tuổi, tốt nhất ở 5 ngày tuổi;
- Nhiệt độ nuôi giống 24±2oC
- Chế chế độ sục khí: 0,4 – 0,5 lít khí/lít môi trường/phút
- Thời gian nuôi: 5 ngày
* Tiêu chuẩn giống nấm Đầu khỉ đưa vào sản xuất: Hệ sợi nấm Đầu khỉ dạng dịch thể phát triển đồng đều trong dịch nuôi, dịch nuôi có màu vàng nhạt, trong suốt, mật độ hệ sợi dày, không có sự phân tầng trong dịch nuôi; hệ sợi không bị kết thành từng mảng
100
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
mà phân bố đồng đều trong dịch nuôi, hệ sợi khi để tĩnh có xu hướng lắng xuống chứ không nổi trên bề mặt dịch nuôi. Giống không bị nhiễm bệnh, khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh sau quá trình cấy chuyển sang cơ chất tổng hợp.
* Cấu tạo nồi lên men: Sử dụng nồi lên men dung tích 120 lít, có cấu tạo phù hợp với lên men giống nấm ăn – nấm dược liệu; dưới đây là cấu tạo nồi lên men dung tích 120 lít đang được sử dụng để thực hiện các nghiên cứu trong luận án;
- Nồi được chế tạo bằng inox, gồm 2 lớp: + Lớp trong cùng chứa môi trường lên men. Lớp giữa là lớp chứa nước hoặc dầu để gia nhiệt hoặc làm lạnh. + Lớp ngoài cùng để cách nhiệt và tạo thẩm mỹ. - Khử trùng bằng điện, có thiết bị báo nhiệt, ngắt tự động và có thiết bị đặt thời gian khử trùng. - Lên men có ổn nhiệt, mô tơ khuấy có thể đặt tốc độ bằng biến tần 100 - 300 vòng/phút, có thể cài đặt thời gian lên men. - Làm lạnh bằng nước. - Có thiết bị kính ngắm và đèn soi. - Có đồng hồ báo áp suất và van an toàn lớp trong và lớp giữa.
- Bình cấp hơi khử trùng van lấy mẫu
Song song với việc chuẩn bị các điều kiện cho nhân giống dạng dịch thể dung tích bình 120 lít phải tiến hành chuẩn bị nguyên vật liệu, nhân giống gốc, nhân giống trung gian các cấp từ dung tích 200 ml đến dung tích 5000 ml; Đảm bảo các điều kiện cung cấp điện, nước, vệ sinh trong sản xuất công nghiệp.
NCS xin đề xuất sơ đồ tóm tắt qui trình sản xuất giống nấm các cấp và sơ đồ tóm tắt QTCN lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120lit như hình 3.36, 3.37 dưới đây.
101
Nhân giống sản xuất
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Nhân giống gốc, bảo quản giống sản xuất
Nhân giống trung gian cấp 1, cấp 2
Phân tích chất lượng, giám sát QTSX Lên men sản xuất
Thanh trùng, làm nguội
Vệ sinh thiết bị Xử lý dịch lên men Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường
Cấy sang cơ chất tổng hợp nuôi trồng
Hình 3.36: Qui trình sản xuất giống nấm các cấp.
Ươm sợi, chăm sóc, thu hái quả thể.
102
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
121oC trong 4 giờ
Vệ sinh, khử trùng nồi lên men
Glucose: 10g/l; Saccharose: 10g/l; Bột dinh dưỡng cô đặc: 20g/l; MgSO4 .7H2O: 1g/l; KH2PO4: 1g/l; K2HPO4: 1g/l; NaNO3: 1g/l; B1: 3 viên; Dầu đậu tương; pH 6,5
Pha môi trƣờng, khử trùng MT 121oC trong 80 phút
Để nguội, cấy giống, tỷ lệ 15% thể tích
Giống trung gian cấp 2 đạt tiêu chuẩn
- Nhiệt độ: 24±2oC - pH: 6 - 7 - Sục khí: 0,4 – 0,5lít khí/ 1lít dịch nuôi/phút. - Thời gian lên men: 5 ngày
Lên men
Lấy mẫu kiểm tra sau 24 - 36 giờ kể từ khi tra cấy giống, kiểm mùi dịch lên men, cấy chuyển sang MT PGA.
Kết thúc lên men, kiểm tra chất lƣợng giống
Giống đạt tiêu chuẩn
Cấy ra bịch nguyên liệu nuôi trồng
Hình 3.37: Qui trình lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120lit
103
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể.
Để nghiên cứu xây dựng được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể đồng thời khẳng được các ưu điểm của qui trình khi sử dụng giống dạng dịch thể so với qui trình khi sử dụng giống dạng hạt, tiến hành các thí nghiệm song song sử dụng cả giống hạt và giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ, các thí nghiệm được thực hiện trong cùng một điều kiện, với các tiêu chuẩn giống nấm đưa vào sử dụng như sau:
* Tiêu chuẩn giống dạng hạt đưa vào sử dụng: giống được nhân trên thóc, đóng trong chai thủy tinh khối lượng 300 gam/ chai; giống sử dụng đúng độ tuổi (hệ sợi mọc kín đáy chai giống nhưng chưa xuất hiện mầm quả thể ở bề mặt chai và thành chai); giống nấm phải có sinh lực khỏe thể hiện ở các đặc điểm: hệ sợi trắng muốt, màu sắc đồng nhất, khả năng phục hồi nhanh sau quá trình bảo quản, khả năng thích ứng cao với môi trường dinh dưỡng nuôi trồng. Giống nấm không bị nhiễm mốc, nhiễm khuẩn.
* Tiêu chuẩn giống dạng dịch thể đưa vào sử dụng:
- Giống dạng dịch thể được nuôi trong bình lên men 5 lít có sục khí, thời gian nuôi 4 - 6 ngày; trước khi đưa ra sử dụng được kiểm tra độ thuần khiết của giống, đảm bảo giống không nhiễm khuẩn, nhiễm mốc, sinh lực giống khỏe.
- Giống dạng dịch có màu vàng đậm của môi trường nhân giống; dịch nuôi trong, có mùi thơm đặc trưng của nấm Đầu khỉ, không phân tầng, mật độ hệ sợi dạng cầu (khuẩn lạc cầu) dày đặc, sinh khối sợi đạt 0,7 – 0,8 g/ 100 ml giống dịch thể; kích cỡ khuẩn lạc cầu đồng đều đạt từ 1,2 – 1,5mm, soi kiểm tra xung quanh bề mặt khuẩn lạc cầu thấy sợi nấm phân nhánh dày tạo thành dạng tua gai xung quanh khuẩn lạc cầu, pH dịch nuôi đạt 5,5 – 6.
Phụ gia gồm cám gạo, bột ngô, CaCO3. Xử lý nguyên liệu và chuẩn bị nguyên liệu cho nuôi trồng nấm Đầu khỉ được tiến
Nguyên liệu sử dụng nuôi trồng nấm Đầu khỉ bao gồm: mùn cưa tạp của các loại cây không chứa tinh dầu, không nhiễm hóa chất, không nhiễm mốc; bông hạt; lõi ngô nghiền; bã mía, các nguyên liệu được bảo quản và xử lý đúng qui cách trước khi đưa vào nuôi trồng nấm; hành như đã trình bày trong phần 2.3.3.1.
3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm bệnh trong môi trường nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
Độ ẩm nguyên liệu nuôi trồng là một trong các yếu tố quan trọng có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm, với độ ẩm thích hợp sẽ kích thích sự tăng trưởng, trong khi với độ ẩm cao hơn hoặc thấp hơn sẽ có ảnh hưởng tiêu cực đến tăng trưởng của hệ sợi.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển và tỉ lệ nhiễm bệnh của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng, sử dụng môi trường nuôi
104
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
trồng CTNT 1, chỉnh độ ẩm nguyên liệu ở các mức 50%, 55%, 60%, 65% và 70%; khử trùng nguyên liệu; cấy giống với tỉ lệ cấy 20 ml dịch/ túi nguyên liệu và cấy giống dạng hạt với tỉ lệ cấy: 5 – 7g giống/ bịch nguyên liệu; Nuôi sợi ở nhiệt độ 25±2oC, phòng không có ánh sáng hoặc ánh sáng tự nhiên.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu đến tỉ lệ nhiễm bệnh của hệ sợi
nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng được ghi nhận ở hình 3.38;
Hình 3.38: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tỷ lệ nhiễm bịch nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên CTNT1
Kết quả nghiên cứu cho thấy, độ ẩm của nguyên liệu có ảnh hưởng rất lớn tới tỉ lệ nhiễm trong quá trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ do ảnh hưởng tới quá trình khử trùng nguyên liệu; Ở độ ẩm nguyên liệu 50% tỉ lệ nhiễm cao, chiếm 50% (ở độ ẩm nguyên liệu 50 %) đối với cả hai mẫu cấy giống dạng hạt và cấy giống dạng dịch thể; thậm chí mẫu lưu (không cấy giống) cũng nhiễm khuẩn và nhiễm mốc sau 2 – 4 ngày lưu mẫu; Khi độ ẩm nguyên liệu tăng dần thì tỉ lệ nhiễm cũng giảm và giảm xuống thấp nhất khi độ ẩm nguyên liệu đạt 60 - 70 %; Tỉ lệ nhiễm cao khi độ ẩm nguyên liệu thấp nguyên nhân là trong nguyên liệu nuôi trồng có bổ sung cám ngô, cám gạo nên khi độ ẩm nguyên liệu quá thấp cám ngô, cám gạo sẽ không trương nở hết, không chín đều trong quá trình hấp nên dễ bị nhiễm khuẩn làm chua và mốc nguyên liệu.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy ở cùng một độ ẩm nguyên liệu nuôi trồng từ 55 - 70% thì mẫu cấy giống dạng dịch thể có tỉ lệ nhiễm thấp hơn so với mẫu cấy giống dạng hạt, nguyên nhân là do khi sử dụng giống dạng dịch thể thao tác cấy chuyển nhanh hơn, không cần sử dụng các dụng cụ cấy (que) cấy tác động vào giống nấm (làm tơi giống, kều giống sang túi nguyên liệu) như khi sử dụng giống nấm dạng hạt, do đó giảm thiểu được các yếu tố gây nhiễm trong quá trình cấy chuyển, làm giảm tỉ lệ nhiễm rõ rệt.
105
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Song song với quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu đến tỉ lệ nhiễm bệnh của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng, ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu tới sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi được cũng được ghi nhận; Kết quả được thể hiện trong hình 3.39 cho thấy, độ ẩm của nguyên liệu có ảnh hưởng rõ rệt tới sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ, có sự chênh lệch không đáng kể giữa hai mẫu thí nghiệm ở các độ ẩm nguyên liệu 50%, 55%, 60%, 70% và có sự chênh lệch đáng kể ở độ ẩm 65%.
Hình 3.39: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tốc độ phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT1.
Ở độ ẩm 50%, 55%, 60% hệ sợi phát triển kém, thậm chí ở độ ẩm 50% hệ sợi phát triển loang lổ không đều, lụi tàn dần sau 30 – 40 ngày nuôi sợi. Ở độ ẩm 65% sợi nấm phát triển tốt nhất ở cả hai mẫu thí nghiệm đạt 8,2 mm/ngày đối với mẫu cấy giống dạng hạt, đạt 9,5 mm/ngày đối với mẫu cấy giống dạng dịch thể; sở dĩ có sự chênh lệnh khá rõ rệt về tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giữa hai mẫu cấy giống dạng hạt và cấy giống dạng dịch thể ở là vì đối với mẫu cấy dạng hạt hệ sợi sẽ lan dần từ trên bề mặt túi nguyên liệu xuống đáy túi trong khi đó mẫu cấy giống dạng dịch thể hệ sợi sẽ lan ra từ tất cả bề mặt và xung quanh túi nguyên liệu – những điểm mà có sự tiếp xúc của giống dịch thể, vì thế đối với mẫu cấy giống dạng dịch thể thì tốc độ lan sợi sẽ nhanh hơn so với mẫu cấy giống dạng hạt. Khi độ ẩm nguyên liệu tăng đến 70% thì tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giảm ở cả hai mẫu thí nghiệm, trong đó mẫu cấy giống dạng dịch thể giảm mạnh hơn (đạt 5,8 mm/ngày) do độ ẩm của nguyên liệu giảm nhiều hơn khi sử dụng giống dạng dịch thể.
Từ kết quả thu được cho thấy độ ẩm nguyên liệu thích hợp nhất để nuôi trồng nấm Đâu khỉ là 65%. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số tác giả đã công bố trước đây
106
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
như Tác giả Nguyên Lân Dũng, Lê Xuân Thám, Đinh Xuân Linh đã đề cập đến độ ẩm nguyên liệu thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ là từ 60 – 65%; Các dữ liệu trong nghiên cứu của tác giả Hassan, F.R.H. khi nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu đến sự sinh trưởng của nấm nấm Đầu khỉ H. erinaceus với 3 lần lặp lại cho kết quả độ ẩm nguyên liệu thích hợp dao động từ 63,88% đến 64,62% trong mùa đầu tiên, và từ 63,96% đến 64,51% trong mùa thứ hai và dao động từ 63,39% đến 64,90% trong mùa thứ ba; Tác giả Zhanxi và Zhanhua đưa ra độ ẩm thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ là 62 - 64%; Tác giả Tác giả Burkhard Kirchhoff đưa ra độ ẩm thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ là 63%.
NCS lựa chọn độ ẩm nguyên liệu 65 % để tiếp tục tiến hành thí nghiệm nghiên cứu
thành phần môi trường tổng hợp nuôi trồng nấm Đầu khỉ tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể.
Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng nguyên liệu đến sự sinh trưởng phát triển cũng như tỉ lệ nhiễm bệnh trong quá trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ, sử dụng các công thức với các thành phần và tỉ lệ phối trộn như đã trình bày trong bảng 2.5; Tạo ẩm nguyên liệu đồng đều ở tất cả các công thức, độ ẩm đạt 65%; Đóng túi nguyên liệu khối lượng 800g/túi.
Khử trùng nguyên liệu bằng 2 phương pháp: + Nồi hấp thủ công (dung tích nồi 500 bịch/ mẻ hấp): nhiệt độ trong bịch nguyên liệu
+ Nồi hấp áp lực dạng đứng (dung tích nồi 500 bịch/ mẻ hấp): đạt áp suất 1,3 – 1,4
Cấy giống dạng dịch thể và giống dạng hạt; nuôi sợi, chăm sóc thu hái quả thể nấm
đạt 100oC, duy trì trong 6 giờ liên tục. atm duy trì trong 3 giờ. đúng độ tuổi. Các chỉ tiêu theo dõi: + Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi, đặc điểm của hệ sợi trên mỗi công thức dinh dưỡng + Tỉ lệ nhiễm của mỗi công thức với hai phương pháp khử trùng khác nhau + Năng suất nấm thương phẩm (%): được tính bằng theo công thức
Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.29;
Công thức Bảng 3.29: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu và phương pháp khử trùng đến tỷ lệ nhiễm CTNT 2 CTNT 3 CTNT 1 CTNT 4
Chế độ hấp Lò thủ công Nồi áp lực Lò thủ công Nồi áp lực Lò thủ công Nồi áp lực Lò thủ công Nồi áp lực
150 30 0 0 150 30 0 0 150 30 0 0 150 30 0 0 150 30 3 10 150 30 3 10 150 30 6 20 150 30 6 20 Tổng số bịch Số mẫu lƣu Số bịch nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%)
107
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Kết quả khi lưu mẫu trong điều kiện phòng, thời gian lưu 10 ngày cho thấy không có
sự khác biệt lớn giữa hai phương thức khử trùng mà chỉ có sự khác biệt giữa các công thức
phối trộn; Cùng khối lượng là 800 g/ bịch nguyên liệu khi khử trùng bằng lò hấp thủ công
trong thời gian 6 giờ và khử trùng bằng nồi hấp áp lực trong 3giờ thì tỷ lệ nhiễm ở công thức
CTNT 3, CTNT 4 cao hơn hẳn so với công thức CTNT 1, CTNT 2; Với công thức CTNT 3
nguyên nhân nhiễm chủ yếu là do thủng túi trong quá trình đóng nguyên liệu do lõi ngô nghiền
không mịn được như mùn cưa; kích thước nguyên liệu quá to và không đồng đều cũng là
nguyên nhân gây nhiễm vì khi khử trùng nguyên liệu chín không đều. Với công thức CTNT 4
nguyên nhân nhiễm chủ yếu do nguyên liệu bị chua, bị nhễm khuẩn vì có thể ở công thức
CTNT 4 sử dụng bã mía là nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng, hàm lượng đường còn lại
trong nguyên liệu cao, dễ bị nhiễm mốc trong thời gian bảo quản nguyên liệu và khi khử trùng
chưa đủ thời gian để diệt bào tử của các tác nhân gây nhiễm có sẵn trong nguyên liệu nên tỷ lệ
nhiễm khuẩn ở công thức này cao hơn so với các công thức còn lại.
Trong nghiên cứu của mình Tác giả Burkhard Kirchhoff đưa chế độ phù hợp để khử trùng nguyên liệu là 120oC trong 2 giờ, ngắn hơn so với thời gian khử trùng mà NCS
sử dụng là 3 giờ mà nguyên liệu của Tác giả vẫn đảm bảo; Nguyên nhân có thể do công
thức nuôi trồng mà Tác giả Burkhard Kirchhoff sử dụng trong nghiên cứu chỉ gồm mùn
cưa và cám mạch, không có các nguyên liệu khác nên chế độ khử trùng cũng khác so với
chế độ mà NCS sử dụng.
Như vậy ta có thể sử dụng cả hai phương pháp khử trùng trên để khử trùng nguyên
liệu trồng nấm nhưng để giảm tỷ lệ nhiễm khuẩn và nhiễm mốc ở công thức CTNT 3 và
CTNT 4 nên kéo dài thời gian khử trùng nguyên liệu hơn so với công thức CTNT 1, CTNT
2; có thể tăng thời gian khử trùng lên 7 – 8 giờ đối với lò hấp thủ công, tăng thời gian khử
trùng lên 3,5 – 4 giờ với nồi hấp áp lực. Đối với lõi ngô cần phơi thật khô rồi mới nghiền
để tăng độ mịn cho nguyên liệu, đối với bã mĩa cần sử dụng bã mới, hàm lượng đường
dưới 2%, phải phơi thật khô và chỉ nên dùng trong thời gian ngắn 1 – 2 tháng.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn đến tốc độ sinh
trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ được ghi ở hình 3.40;
108
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi trồng khác
nhau khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng dịch thể.
Kết quả nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên cả bốn công thức đều cho thấy tốc độ phát
triển của hệ sợi khi cấy giống dạng dịch thể phát triển nhanh hơn so với cấy giống dạng
hạt; Kết quả cũng cho thấy hệ sợi nấm phát triển tốt hơn khi sử dụng kết hợp các nguồn
nguyên liệu với nhau so với chỉ sử dụng mỗi mùn cưa, trong đó hệ sợi phát triển tốt nhất ở
công thức CTNT 2 (45% mùn cưa + 40% bông hạt + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1%
CaCO3), tiếp đó là CTNT 3 (45% mùn cưa + 40% lõi ngô + 6% cám gạo + 8% bột ngô +
1% CaCO3); trên công thức CTNT 4 (45% mùn cưa + 40% bã mía + 6% cám gạo + 8% bột
ngô + 1% CaCO3) tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ chậm hơn so với trên CTNT
2, CTNT 3 nhưng hệ sợi dày đặc, phân bố đều; trên CTNT 1 (85% mùn cưa + 6% cám gạo
+ 8% bột ngô + 1% CaCO3) hệ sợi Đầu khỉ trắng mờ, tốc độ sinh trưởng chậm.
Tiếp tục theo dõi khả năng tạo mầm quả thể, tỉ lệ quả thể trưởng thành hữu hiệu và
năng suất nấm Đầu khỉ thương phẩm ở các công thức nuôi trồng khác nhau; Kết quả ở
bảng 3.30 dưới đây.
109
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.30: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu nuôi trồng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ và năng suất nấm thương phẩm
Giống Công thức Đặc điểm hệ sợi Đặc điểm quả thể Quả thể trƣởng thành Năng suất (%)
Tạo mầm quả thể
CTNT 1
100% 87% 25,2 Hệ sợi mảnh, mờ, phát triển từ trên xuống. 100 Quả thể trắng, kích thước 5-6 x 5 - 5 cm, chắc, khối lượng trung bình – 130g/quả.
100% 30,2 Giống dạng hạt
100% 100% 29,7
100% Quả thể trắng, kích thước lớn (8 – 12 x 8 - 9 cm), quả thể chắc, khối lượng trung bình đạt 150 – 170g/quả CTNT 2 Hệ sợi đậm, màu trắng, phát triển đồng đều từ trên xuống CTNT 3 Hệ sợi đậm, màu trằng đồng nhất, phát triển từ trên xuống. CTNT 4 Hệ sợi đậm, màu 100% 100% 29,1 trắng đồng nhất CTNT 1 sợi
100% 100% 27,0
trắng, Hệ mảnh sợi, phát triển loang lổ từ từ trên xuống, dưới lên. Quả thể trắng, kích thước nhỏ (5 – 6 x 5 - 5 cm), chắc, khối lượng trung bình 100 – 130g/quả
100% 100% 34,7
Giống dạng dịch thể
100% 100% 32,5
Quả thể trắng, kích thước lớn (8 – 12 x 8 - 9 cm), quả thể chắc, khối lượng trung bình đạt 150 – 170g/quả 100% 100% 31,5
CTNT 2 Hệ sợi trắng đậm, phát triển loang lổ từ trên xuống, từ dưới lên. CTNT 3 Hệ sợi trắng đậm, phát triển loang lổ từ trên xuống, từ dưới lên. CTNT 4 Hệ sợi trắng đậm, phát triển loang lổ từ trên xuống, từ dưới lên. 6,0 CV%
1,59
2,24
3,17 LDS0,05 (Giống) LDS0,05 (CT) LDS0,05 (G * CT)
110
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Từ trước đến nay, các tác giả nghiên cứu về điều kiện nuôi trồng nấm Đầu khỉ luôn đặt trọng tâm vào việc tìm được công thức thích hợp để cho năng suất nấm cao, chất lượng nấm tốt; Có rất nhiều công thức nuôi trồng nấm Đầu khỉ đã được công bố trong đó các thành phần chủ yếu luôn là mùn cưa, bông hạt, thân cây thuộc họ thân thảo; Các nguyên liệu này được sử dụng riên từng loại hoặc được phối trộn với nhau theo tỉ lệ nhất định cùng với việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như rỉ đường, bã đậu tương, cám mạch, cám gạo, cám ngô; Theo như tác giả Nguyễn Lân Dũng thì có thể nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên 10 công thức nguyên liệu khác nhau bao gồm các nguyên liệu chính là mùn cưa, bông hạt, lõi ngô nghiền, bã mía, rơm rạ cắt nhỏ, trong đó tác giả mới chỉ nghiên cứu đơn lẻ từng loại nguyên liệu với sự thay đổi các tỉ lệ bổ sung cám gạo, bột ngô, đường khác nhau mà chưa có công thức nào sử dụng phối kết hợp các nguyên liệu. Tác giả Tác giả Burkhard Kirchhoff đã nghiên cứu nuôi trồng 15 chủng nấm Đầu khỉ trên 3 môi trường mùn cưa có bổ sung dinh dưỡng; Kết quả nghiên cứu môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ cho thấy H. erinaceum thích hợp trồng trên nhiều loại cơ chất khác nhau, trong đó môi trường cho kết quả tốt nhất là 80% mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 20% cám ngô, năng suất đạt 400 gam nấm tươi/1 túi nguyên liệu 2kg; Tiếp đến là ở công thức 85% mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 10% cám mạch với 5% cám ngô, năng suất đạt 320g nấm tươi/1 túi nguyên liệu 2kg; Ở công thức 90% mùn cưa gỗ cây dẻ trộn với 10% cám mạch năng suất đạt 300g nấm tươi/1 túi nguyên liệu 2 kg.
Kết quả ở bảng 3.30 cho thấy ở cả ba công thức nuôi trồng CTNT 2, CTNT 3, CTNT 4 đều cho năng suất nấm cao tương đương với kết quả của một số tác giả đã công bố, trong đó CTNT 2 cho năng suất cao hơn cả do ở công thức này sử dụng bông hạt kết hợp với mùn cưa mà bông hạt là nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng với hàm lượng protein, lipit thực vật khá cao, rất phù hợp để nuôi trồng nấm; nhưng nguyên liệu bông hạt khá khó mua và giá thành cũng khá cao, quá trình xử lý bông hạt trước khi đưa vào nuôi trồng khá phức tạp, tốn sức lao động và khó khăn trong việc cơ giới hóa các công đoạn nuôi trồng nấm, do đó có thể sử dụng các nguyên liệu thay thế như lõi ngô, bã mía để giảm giá thành sản xuất, giảm thiểu công lao động và phù hợp với nguồn nguyên liệu sẵn có ở từng địa phương.
Trong các thí nghiệm tiếp theo, NCS lựa chọn CTNT 3 để tiếp tục xây dựng qui
trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống dạng dịch thể cấy vào bịch nguyên liệu
nuôi trồng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ tiến hành như sau:
Phối trộn, đóng túi nguyên liệu theo CTNT 3, khối lượng 800g/bịch; Khử trùng bằng nồi hấp áp lực áp suất 1,3 – 1,4 atm trong 3,0 giờ; Để nguội trong
phòng sạch đến nhiệt độ phòng;
111
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Cấy giống: Sử dụng giống nấm dạng dịch thể đạt tiêu chuẩn cấy chuyển vào bịch nguyên liệu nuôi trồng với các thể tích giống cấy: 10ml/bịch, 15ml/bịch, 20ml/bịch, 25ml/bịch, 30ml/bịch, 35ml/ bịch;
Mẫu đối chứng: cấy giống dạng hạt đúng tiêu chuẩn, tỉ lệ giống cấy là 5 g/ bịch Chỉ tiêu theo dõi: tốc độ phát triển của hệ sợi, đặc điểm hệ sợi, thời gian sợi ăn kín túi nguyên liệu, thời điểm xuất hiện quả thể, thời điểm thu hái, năng suất nấm thương phẩm.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.31 dưới đây.
Bảng 3.31: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3.
Thể tích giống
10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 35ml ĐC (5g/bịch) Chỉ tiêu
12 6,7 8,5 15,0 17,4 17,5 17,5 Tốc độ mọc (mm/ngày)
Hệ sợi đậm, màu trắng đồng nhất. Hệ sợi trắng đậm, phát triển đều quanh bề mặt bịch nguyên liệu, xuất hiện quả thể khi hệ sợi đã ăn kín đáy bịch nguyên liệu. Đặc điểm sợi
Hệ sợi trắng mảnh, phát triển loang lổ quanh bề mặt bịch nguyên liệu, xuất hiện quả thể khi hệ sợi chưa ăn kín đáy bịch nguyên liệu
Giống dạng hạt phát triển trong CTNT3
Giống dạng dung dịch phát triển trong CTNT3
Kết quả cho thấy lượng giống cấy thích hợp nhất là 25ml dịch/ bịch nguyên liệu, nếu cấy lượng giống ít hơn sẽ làm giảm tốc độ phát triển của hệ sợi, nếu cấy lượng giống nhiều hơn cũng không làm tăng tốc độ phát triển của hệ sợi. Lựa chọn tỷ lệ giống 25ml/bịch nguyên liệu 800gam để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.41: Giống dạng hạt và giống dạng dịch thể phát triển trong CTNT3
Như vậy, đúng như nhận định của một số tác giả đã nghiên cứu sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm, so với giống trên cơ chất hạt – giống dạng rắn thì giống
112
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
dạng dịch thể có nhiều ưu điểm hơn hẳn như: rút ngắn thời gian ươm sợi sau khi cấy chuyển giống sang cơ chất nuôi trồng và tổng thời gian nuôi trồng, giảm tỷ lệ nhiễm bệnh, qua đó làm tăng năng suất thu hoạch; Quá trình nhân giống phục vụ nuôi trồng cũng được rút ngăn hơn rất nhiều (từ 20 -25 ngày xuống còn 6 - 7 ngày); giảm chi phí sản xuất do thay thế cơ chất nhân giống trên hạt thóc bằng nhân giống dạng dịch thể.
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong nuôi trồng trên cơ chất tổng hợp.
Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và đặc điểm hình thái của hệ sợi nấm Đầu khỉ chúng tôi tiến hành đóng bịch nguyên liệu theo CTNT 3. Sau khi khử trùng tiến hành cấy 25 ml giống / bịch nguyên liệu và nuôi sợi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 18 - 21oC, 22 - 25oC; 26 - 29oC, 30 – 34o C, các điều kiện khác là như nhau. Theo dõi thí nghiệm, kết quả được ghi nhận ở bảng 3.32 và hình 3.42 dưới đây.
Bảng 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3
Nhiệt độ (oC) 18 - 21 22 - 25 26 - 29 30 -34
Đặc điểm sợi Hệ trắng đậm, trưởng
sinh chậm.
Hệ sợi dày, khoẻ, trắng muốt, sinh trưởng nhanh, xuất hiện quả thể khi sợi đã lan kin bịch nguyên liệu. Hệ sợi chuyển dần sang mầu vàng, bung sợi kém, gần như không bám vào nguyên liệu.
Hệ sợi trắng, sợi sinh đậm, to trưởng nhanh, phân bố không đều, xuất hiện quả thể khi sợi chưa lan kín bịch
Hình 3.42: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT 3
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng nấm He1 sinh trưởng chậm trong khoảng nhiệt độ 18-21oC; Ở điều kiện nhiệt độ này hệ sợi nấm mượt, trắng đậm nhưng sinh trưởng chậm; Trong khoảng nhiệt độ 22-25oC hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt, hệ sợi nấm trắng mượt, dày đậm, tốc độ sinh trưởng nhanh, quả thể xuất hiện đồng đều khi sợi đã lan kín bịch nguyên liệu. Trong khoảng nhiệt độ 26-29oC hệ sợi sinh trưởng nhanh nhưng hệ
113
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
sợi có mầu trắng mờ không đồng đều, có xuất hiện những vùng sợi to thô như rễ tre, hệ sợi phân bố không đều trong bịch nguyên liệu, xuất hiện quả thể ngay khi hệ sợi mới ăn kín 3/4 diện tích bịch nguyên liệu nuôi trồng; Điều này không có lợi cho quá trình nuôi trồng vì hiệu quả sử dụng nguyên liệu không đạt 100%. Trong khoảng nhiệt độ 30 - 34oC hệ sợi chuyển dần sang mầu vàng và bị tàn lụi dần, không bám vào nguyên liệu.
Như vậy có thể kết luận khoảng nhiệt độ 22-25oC là thích hợp nhất cho hệ sợi Đầu khỉ phát triển; Kết quả này cũng gần giống với kết quả mà các Tác giả Nguyễn Lân Dũng, Đinh Xuân Linh, Lê Xuân Thám, Burkhard Kirchhoff, Hassan, F.R.H. đã công bố. NCS lựa chọn khoảng nhiệt độ này để nuôi sợi trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể
Lô bịch được nuôi sợi trong khoảng nhiệt độ thích hợp nhất (22-25oC) trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và hình thái của hệ sợi được giữ lại để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Đầu khỉ. Sau thời gian nuôi sợi, khi sợi có xu hướng bám vào nút bông thì bắt đầu nới lỏng nút bông, để lại 1/3 lượng bông trên cổ nút để giữ ẩm và làm chỗ bám cho ra quả thể; Sau đó chuyển bịch vào phòng có điều hòa nhiệt độ trong các khoảng: 16-18oC; 20- 22oC; 24-26oC; 28-30oC. Duy trì độ ẩm trong phòng nuôi ở mức 85-90%, đảm bảo độ thông thoáng, ánh sáng tự nhiên và các chế độ tưới là như nhau trong các thí nghiệm; Kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 3.33.
Bảng 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự hình thành và phát triển quả thể nấm Đầu khỉ trên CTNT3
Chỉ tiêu 16 -18 Nhiệt độ (oC) 20-22 24-26
32-35 25 - 27 22 - 25
15-20 10-12 7-10
47-55 35-39 29-35 28-30 Xuất hiện mầm quả thể sau đó bị vàng, teo dần. Thời gian xuất hiện mầm quả (ngày) (*) Thời gian thu hái (ngày) (**) Tổng thời gian nuôi trồng
Đặc điểm quả
Quả thể to, tròn, chắc, phân nhiều thùy, tua gai dài 3-5 mm, mầu trắng muốt. Quả thể nhỏ, chắc, tròn, phân nhiều thùy, tua gai ngắn 2- 3 mm, trắng ngà, có khi chuyển mầu trắng hồng Quả thể phân thuỳ, xốp, gai dài, màu vàng nhạt, xuất hiện quả thể khi sợi nấm chưa lan hết bịch nguyên liệu
62 - 95g 150 - 170g 80 - 120g 0 25,7 35 28,5 Trọng lƣợng quả trung bình Năng suất trung bình (%)
(*) Tính từ lúc cấy giống cho đến khi hình thành mầm quả thể (**) Tính từ lúc hình thành mầm quả thể đến khi quả thể trưởng thành
114
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến hình thái và màu sắc quả thể; Trong phạm vi nhiệt độ từ 20-22oC quả thể nấm phát triển tốt nhất, quả thể to, tròn, chắc, không bị phân thuỳ, màu trắng muốt, gai dài rủ xuống mượt đẹp theo phương thẳng đứng; Trong khoảng nhiệt độ 16-18oC nấm Đầu khỉ hình thành quả thể chậm, ở khoảng nhiệt độ này một số quả thể dễ bị teo dần, nhiễm mốc xanh; Trong khoảng nhiệt độ 24-26oC quả thể có màu vàng nhạt, tua gai dài, phân thuỳ nhiều, phần thịt quả xốp, trọng lượng trung bình của quả thể thấp; Khi nhiệt độ cao hơn 30oC quả thể bị teo hoặc nhiễm mốc xanh trên bề mặt quả thể, thậm chí không ra quả thể.
a, Quả thể nuôi ở nhiệt độ từ 20-22oC b, Quả thể nuôi ở nhiệt độ 24-26oC
Hình 3.43: Quả thể nấm Đầu khỉ trên công thức CTNT 3, cho ra quả thể ở các khoảng nhiệt độ khác nhau
Như vậy kết quả nghiên cứu kết hợp quan sát thực nghiệm cho thấy nhiệt độ thích hợp cho ra quả thể nấm Đầu khỉ He1 là 20 - 22oC; Ở nhiệt độ 24 – 26oC vẫn có thể trồng nấm Đầu khỉ nhưng nên đóng bịch nhỏ hơn để thu hái một lần sẽ hiệu quả hơn khi đóng bịch 800g thu hái hai lần.
Sau khi đã nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng
giống nấm dạng dịch thể bao gồm:
+ Công thức môi trường tổng hợp sử dụng trong nuôi trồng: 45% mùn cưa + 40%
lõi ngô + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO3; + Độ ẩm nguyên liệu nuôi trồng: 65 ± 2%; + Khử trùng nguyên liệu: 100oC/7 giờ hoặc 1,2 – 1,4 atm trong 3 - 3,5 giờ; + Tỷ lệ giống dạng dịch thể cấy vào bịch nguyên liệu: 25 ml dịch/ bịch nguyên liệu 800 g; + Nhiệt độ ươm sợi: 23 - 25 oC; + Nhiệt độ cho ra quả thể 20-22oC. NCS xin đề xuất quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm
dạng dịch thể tóm tắt như hình 3.44 dưới đây;
115
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Lõi ngô nghiền tạo ẩm bằng nước vôi trong; Thời gian ủ từ 24 giờ; Độ ẩm 65%; pH= 7,5 - 8 Mùn cưa tạo ẩm bằng nước vôi trong; Thời gian ủ 5 - 7 ngày; Độ ẩm 65%; pH= 7,5 - 8
Phối trộn nguyên liệu, bổ sung dinh dưỡng: 45% mùn cưa + 40% lõi ngô + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO3 chỉnh độ ẩm 65%; Đóng túi nguyên liệu, khử trùng ở 100oC/7 giờ hoặc 1,2 – 1,4 atm trong 3 - 3,5 giờ
Giống nấm đạt tiêu chuẩn, đúng độ tuổi. Cấy giống (25 ml / bịch 800g)
Ươm sợi - Nhiệt độ 22 - 25oC - Độ ẩm 65 - 70% - Không cần ánh sáng
- Nhiệt độ 20 – 22oC - Độ ẩm 85 - 95% - Ánh sáng mờ Chăm sóc cho ra quả thể, thu hái.
Nấm Đầu khỉ thương phẩm
Quả thể nấm thu hái đúng độ tuổi, được bảo quản lạnh hoặc phơi khô, bảo quản đúng qui cách.
Hình 3.44: QTCN nuôi trông nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể
3.3.6. Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể
Qua quá trình nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống dạng dịch thể các cấp và qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể, cho thấy việc nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể là rất khả thi, mang lại hiệu quả kinh tế cao do:
+ Rút ngắn được tổng thời gian cho một chu kỳ nhân giống và nuôi trồng nấm; + Tăng hệ số nhân giống + Giảm tỷ lệ nhiễm và tăng năng suất nấm thương phẩm
116
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Tiết kiệm được các chi phí về nguồn nguyên liệu sản xuất giống nấm, nhân công, điện năng, khấu hao nhà xưởng;
Dưới đây, NCS xin đưa ra một số chỉ tiêu so sánh giữa 2 qui trình nhân giống, sử dụng giống dạng rắn và giống dạng dịch thể để thấy được hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ mới vào sản suất giống và nuôi trồng nấm Đầu khỉ. Bảng 3.34: So sánh một số chỉ tiêu kỹ thuật giữa 2 qui trình nhân giống, sử dụng giống dạng rắn và giống dạng dịch thể cho nấm Đầu khỉ
Chỉ tiêu so sánh
Giống dạng rắn
Giống dạng dịch thể
Ghi chú
Tổng thời gian cho một chu kỳ nhân giống và nuôi trồng nấm
- Thời gian nhân chuyển giống gốc sang giống trung gian cấp 1 là 5 ngày; - Thời gian nhân giống trung gian cấp 1 sang giống trung gian cấp 2 là 5 ngày; - Thời gian nhân chuyển giống trung gian cấp 2 sang giống sử dụng cho nuôi trồng (dung tích 120 – 300 lít) trung bình là 5 ngày; - Thời gian nuôi sợi sau khi cấy chuyển giống dịch thể sang cơ chất nuôi trồng trung bình là 20 ngày; - Thời gian ra quả thể và thu hái nấm trung 40 ngày; Như vậy tổng thời gian cho một chu kỳ nhân giống và nuôi trồng khoảng 75 ngày.
Hệ số nhân giống
- Thời gian nhân chuyển giống gốc sang giống cấp 1 trên môi trường thạch là 12 ngày; - Thời gian nhân chuyển giống cấp 1 sang cấp 2 trên môi trường thóc là 30 ngày; - Thời gian nhân chuyển giống cấp 2 sang giống cấp 3 trên môi trường thóc (giống thương phẩm dùng trong nuôi trồng nấm là 25 ngày; - Thời gian nuôi sợi sau khi cấy chuyển giống cấp 3 trên môi trường thóc sang cơ chất nuôi trồng trung bình là 32 ngày; - Thời gian ra quả thể và thu hái nấm trung 40 ngày; Như vậy tổng thời gian cho một chu kỳ nhân giống và nuôi trồng khoảng 140 ngày. - 1 ống giống gốc cấy chuyển sang 20 ống cấp 1 trên môi trường thạch; - 1 ống giống cấp 1 cấy chuyển sang 2 chai giống cấp 2 trên môi trường thóc; - 1 chai giống cấp 2 cấy chuyển sang 25 túi giống cấp 3 trên môi trường thóc; - 1 túi giống cấp 3 cấy chuyển sang 25 túi (bịch, lọ nhựa) nuôi trồng; Như vậy hệ số nhân chuyển tính từ 1 ống giống gốc sang bịch nguyên liệu nuôi trồng là 1 – 25.000.
So với qui trình nhân giống và sử dụng giống dạng rắn để nuôi trồng nấm Đầu khỉ thì qui trình nhân giống và sử dụng giống dạng dịch thể rút ngắn được một nửa thời gian cho một chu kỳ nhân giống nuôi và trồng nấm So với qui trình nhân giống và sử dụng giống dạng rắn thì qui trình nhân giống và sử dụng giống dạng dịch thể có hệ số nhân tăng giống 15 lần.
- 1 ống giống gốc cấy chuyển sang 20 ống cấp 1 trên môi trường thạch; - 1 ống giống cấp 1 cấy chuyển 12 chai giống trung gian cấp 1 dạng dịch thể dung tích 200 ml; - 1 chai giống trung gian cấp 1 cấy chuyển sang 1 bình giống trung gian cấp 2 dung tích 5 lít; - 3 bình giống 5 lít cấy chuyển sang bình lên men dung tích 100 lít. - 1 bình lên men 120 lit cấy chuyển sang 4.800 bịch nuôi trồng (với tỷ lệ giống 25 ml/ bịch 800g). Như vậy hệ số nhân chuyển tính từ 1 ống giống gốc sang bịch nguyên liệu nuôi trồng là 1 – 384.000.
Tuổi giống và chất lượng giống đồng nhất trong toàn bộ dịch nuôi.
Tuổi giống, chất lƣợng giống
Không đồng đều trong từng chai hay túi giống trên cơ chất rắn do hệ sợi phát triển từ trên xuống, tuổi giống ở phần trên sẽ khác với phần đáy chai, túi giống.
Thấp
Cao
Khả năng công nghiệp hóa
117
Giống gốc, giống cấp 1 trên môi trường thạch
Giống câp 1 trên môi trường thạch
Giống trung gian cấp 1 dung tích 200 - 500 ml
Giống cấp 2 trên thóc
Giống trung gian cấp 2 dung tích 2 - 5 lít
Giống cấp 3 trên thóc và que sắn
Giống sử dụng để nuôi trồng, dung tích 100 lít – 300 lít
Giống nấm dạng rắn phát triển trong cơ chất tổng hợp
Giống nấm dạng dịch thể phát triển trong cơ chất tổng hợp
Quả thể nấm Đầu khỉ thương phẩm nuôi trồng trên nguồn cơ chất tổng hơpj
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.45: Sơ đồ so sánh QT sử dụng giống dạng hạt và QT sử dụng giống dạng dịch thể trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ
118
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hiệu quả kinh tế từ việc nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống cấy chuyển dạng dịch thể so với sử dụng giống nấm trên hạt được tính toán chi tiết ở các bảng 3.35, 3.36, 3.37 dưới đây. Số liệu về giá thành nguyên vật liệu, nhân công, điện nước được tính tại thời điểm năm 2013; giá thành nấm bán ra thị trường được tính tại thời điểm năm 2013 – 2014, tại Hà Nội và các tỉnh, thành phố lân cận Hà Nội.
Bảng 3.35: Hoạch toán đầu vào cho 1 tấn nguyên liệu đã xử lý để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Đơn vị tính: 1000đ)
Số lƣợng Thành tiền
Stt Nội dung chi Đvt Đơn giá
Giống hạt 0,4 0,45 0,06 0,08 0,01 Giống dịch 0,4 0,45 0,06 0,08 0,01 2 1 6,500 6,500 3 Giống hạt 800 450 390 520 30 Giống dịch 800 450 390 520 30
1 2 3 4 5 6 chịu Tấn Tân Kg Kg Kg Kg 10 10 50 500 500
Kg 4 4 20 80 80
7 8 kg 2 2 50 100 100
9 10 11 12 13 14 15 Lõi ngô nghiền Mùn cưa Bột ngô Cám gạo CaCO3 Túi nylon nhiệt Bông nút Khâu hao cổ nút, nắp đậy Giống nấm Than đốt Điện năng Lao động Khâu hao Chi khác Tổng đầu vào Chai Tấn Kw/h Công 60 0,2 100 30 60 0,2 80 20 15 5 4 130 500 250 900 1000 400 3900 500 250 9.820 300 1000 320 2600 500 250 7.840
Bảng 3.36: Bảng tổng hợp năng suất trung bình nuôi trồng nấm Đầu khỉ qua 3 lần sản xuất lặp lại.
Số lần thử nghiệm Giống Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Năng suất
29,6 32,4 30,2 Giống hạt 30,7
Năng suất nấm tƣơi/ 1 tấn nguyên liệu 33,2 33,5 33,0 Giống dịch 33,2
Từ kết quả thống kê qua 3 lần sản xuất lặp lại xác định được năng suất trung bình; sản phẩm được bán với giá thành như nhau là 55.000 VN đồng/kg nấm tươi, tính tại thời điểm năm 2013 – 2014 tại Hà Nội và các vùng lân cân; Qua đó tính được chênh lệch về hiệu quả kinh tế khi sử dụng giống nấm dạng dịch thể so với sử dụng giống nấm dạng hạt trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ như sau;
119
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.37: Bảng tổng hợp hiệu quả kinh tế thu được khi nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử
dụng giống dạng dịch thể (đơn vị: đồng)
Chỉ tiêu
QT
Giá bán 1 kg
Tổng lợi nhuận
Năng suất (kg/ tấn NL)
Lợi nhuận (kg)
Tổng phi phí sản xuất/ tấn NL 9.820.000 7.840.000
307 332
Giá thành để sản xuất 1 kg nấm 32.000 23.600
Sử dụng giống hạt Sử dụng giống dịch thể Chênh lệch 55.000 23.000 7.061.000 55.000 26.400 8.765.000 1.704.000
Như vậy, so với nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng hạt, lợi nhuận thu
được khi sử dụng giống dạng dịch thể tăng 1.704.000 trên 1 tấn nguyên liệu đưa vào sản xuất.
3.4. Kết quả tách chiết và thử hoạt tính sinh học của polysaccaride từ nấm Đầu khỉ He1
3.4.1. Nghiên cứu điều kiện tách chiết
3.4.1.1. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
Chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu 10g bột nấm Đầu khỉ khô, thêm 100ml nước, lắc đều rồi chiết ở 100oC trong thời gian 40 phút; Lọc lấy dịch chiết; phần không tan cho thêm 200ml dung dịch kiềm mỗi loại KOH, Na2CO3 và NaOH, nồng độ kiềm 2%; Chiết kiềm ở 50oC trong 4 giờ. Dịch lọc mỗi mẫu thu được 160 ml, ký hiệu M1, M2 và M3 là các dịch chiết thu được bằng các dung dịch kiềm tương ứng là KOH, Na2CO3 và NaOH, li tâm thu dịch chiết và đo hiệu quả chiết bằng nhớt kế, mẫu đối chứng là các dịch kiềm tương ứng với nồng độ 2%; Kết quả được trình bầy trong bảng 3.38.
Bảng 3.38: Khả năng chiết của các loại dung dịch kiềm khác nhau
Dung dịch đối chứng Dịch chiết Hóa chất Mẫu Mẫu
Thời gian chảy của nhớt kế (giây) 11 11,4 12 Thời gian chảy của nhớt kế (giây) 12 12,8 15 KOH 2% Na2CO3 2% NaOH 2% M1 M2 M3 M1 M2 M3
Từ bảng kết quả 3.38 cho thấy trong số 3 loại kiềm sử dụng ở cùng nồng độ % thì dung dịch NaOH có cường lực ion là mạnh nhất (0,5N), còn KOH và Na2CO3 tương ứng là 0,35 N và 0,4 N. Vì vậy, NaOH là hóa chất kiềm thích hợp nhất để chiết tách polysacharide từ nấm Đầu khỉ, sử dụng NaOH sẽ tốn lượng hóa chất ít nhất so với các loại kiềm khác khi chúng ở cùng một cường lực ion.
3.4.1.2. Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH
Để nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp trong quá trình chiết, chuẩn bị 6 mẫu, mỗi mẫu 10 g bột nấm Đầu khỉ khô và tiến hành chiết theo điều kiện như trên với sự thay đổi nồng độ của dung dịch NaOH lần lượt là 2%; 3%; 3,5%; 4%; 4,5%; và 5%; Các dịch chiết tương ứng thu được là M4, M5, M6, M7, M8 và M9; Đo hiệu quả chiết bằng nhớt kế, các số liệu thu được trình bầy trong bảng 3.39.
120
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.39: Độ chiết (tương ứng với độ nhớt) thay đổi theo nồng độ của NaOH.
STT Mẫu chiết
1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ NaOH (%) 0 2 3 3,5 4 4.5 5 Thời gian chảy của nhớt kế (giây) 13 15 30 34,2 36 36 35,8 M0 (đối chứng) M4 M5 M6 M7 M8 M9
Thông qua kết quả nghiên cứu chiết tách polysacharide và tối ưu hóa điều kiện chiết, chúng tôi kiến nghị quy trình công nghệ chiết tách polysacharide theo 3 giai đoạn như sau:
100g nấm Đầu khỉ khô
Nghiền
Chiết I
Cồn 80% tỉ lệ 10:1(v/w), 100oC, 2h
Dịch 1 Phần không tan
Loại cồn
Chiết II W 1 Nước, tỉ lệ 10:1(v/w), 100oC, 2h
Dịch 2 Phần không tan
Tủa cồn tỉ lệ 3:1 (v/v) Chiết III W 2
NaOH 4% tỉ lệ 10:1(v/w), 50oC, 90 phút (2 lần) Dịch 3 Bã Chỉnh pH = 7, tủa cồn, tỉ lệ 3:1 (v/v)
Chỉnh pH, bổ sung vi sinh W 3
Phân bón vi sinh
Hình 3.46: Sơ đồ qui trình chiết polysaccharide từ nấm Đầu khỉ
121
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Cho 100g nấm khô độ ẩm 4% đã nghiền nhỏ và 1600 ml cồn 80% vào một bình cầu 2 lít có lắp sinh hàn ngược, chiết ở nhiệt độ dưới 60oC. Sau 20 giờ lọc lấy dịch cồn, cất quay chân không không thu hồi cồn và được sản phẩm W1. Phần không tan cho thêm 1500 ml nước nóng, lắc đều rồi chiết ở 100oC trong 2 giờ, lọc lấy dịch chiết, sau đó dùng cồn tỷ lệ 3:1 (v/w), tách được W2. Phần không tan tiếp tục cho thêm NaOH 4%, tỷ lệ 10:1 (v/w), khuấy đều ở nhiệt độ 50oC, trong 90 phút, lọc lấy dịch (lặp lại 2 lần). Dịch lọc thu gom lại chỉnh về pH = 7 – 8 bằng axit axetic, để yên tĩnh trong 30 phút, tủa cồn tỉ lệ 3:1 rồi lọc lấy phần kết tủa W3. Hiệu suất tổng sản phẩm thu được khoảng 23 – 25%.
Sản phẩm polysaccharide W3 sau khi sấy phun được chụp phổ MS (Mass spectrum) tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam; Kết quả được thể hiện ở hình 3.47 dưới đây;
Hình 3.47: Phổ MS của Polysaccharide thu được
Kết quả phân tích khối phổ MS của sản phẩm W3 cho thấy sự có mặt của polysaccharide dược mô tả bởi sự xuất hiện của các pic hấp phụ trong khoảng số sóng 1000 cm-1.
3.4.2. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 trong từng thời điểm nuôi
Thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể nấm Đầu khỉ: 100g quả thể nấm khô
được nghiền nhỏ thành bột và được chiết trong thể tích 1 lít nước cất tại 100 C trong 8giờ; Dịch chiết nấm được lọc qua vải và bã nấm tiếp tục được chiết như trên thêm 2 lần nữa. Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại và cô tới thể tích 100 mL, sử dụng máy cô chân
không tại 70 C, thu được dịch chiết nước nóng. Polysaccharide được kết tủa bằng việc bổ
sung 3 lần thể tích cồn tuyệt đối vào dịch chiết, ủ qua đêm tại 4 C. Polysaccharide được thu bằng ly tâm dịch tủa tại 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Kết tủa được rửa bằng methanol và hòa tan lại trong nước cất. Phần bã nấm được bổ sung 1 L NaOH 5% và ủ tại
122
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
56 C qua đêm. Phần dịch tan trong kiềm được thu lại bằng lọc qua vải; Bã nấm tiếp tục được chiết kiềm 2 lần nữa. Dịch lọc của 3 lần chiết kiềm được gộp lại, trung hòa bằng dung dịch axit axetic 1M tới pH 6,5-7,0 và polysaccharide được kết tủa bằng bổ sung 3 lần
thể tích cồn tuyệt đối lạnh, ủ tại 4 C qua đêm. Kết tủa polysaccharide được thu bằng ly tâm dịch đã tủa tại 10.000 vòng/phút trong 10 phút; Kết tủa được rửa lại bằng methanol và được hòa lại trong nước cất.
X nấm: 100
2SO4
l dung 500
150
ứng được cho vào giếng của phiến 96 giếng, so l dịch phản Mẫu đối chứng
được chuẩn bị tương tự dùng 100 l nước cất thay thế với mẫu thử.
Tiến hành lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình
của 3 lần đo. Kết quả được trình bày trong bảng 3.40.
Bảng 3.40: Hàm lượng polysaccharide của các mẫu nấm thu hái tại các thời điểm khác nhau (g/100 g nấm khô)
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4
Mẫu 5
Mẫu 6
Mẫu 7
Mẫu Phân đoạn
4,73 4,44 4,38 4,39 4,69 3,57 3,21 Polysaccharide chiết nước nóng
2,13 3,22 3,70 4,64 4,59 4,12 4,00 Polysaccharide chiết NaOH
6,85 7,66 8,07 9,03 9,28 7,69 7,21 Polysaccharide tổng
Ghi chú: Mẫu 1: Quả thể 1 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) Mẫu 2: Quả thể 3 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) Mẫu 3: Quả thể 5 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) Mẫu 4: Quả thể 7 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) Mẫu 5: Quả thể 9 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) Mẫu 6: Quả thể 11 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) Mẫu 7: Quả thể 13 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
123
Hình 3.48: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian của quả thể nấm Đầu khỉ He1
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Kết quả tách chiết và xác định hàm lượng polysaccharide trong 7 mẫu nấm Đầu khỉ ở các độ tuổi từ 1 ngày tuổi đến 13 ngày tuổi cho thấy tổng hàm lượng polysaccharide trong 5 mẫu nấm từ 1 đến 9 ngày tuổi tăng dần, các mẫu từ 11 đến 13 tuổi giảm so với mẫu 9 ngày tuổi. Như vậy, hàm lượng polysaccacharide tổng số trong quả thể nấm tăng theo thời gian, từ khi quả thể mới hình thành cho tới khi quả thể trưởng thành; Khi quả thể bước sang giai đoạn bắt đầu phát tán bào tử thì hàm lượng polysaccharide giảm dần, đồng thời trọng lượng quả thể cũng giảm mạnh; do đó khi nuôi trồng nấm Đầu khỉ cần thu hái đúng độ tuổi, khi quả thể nấm đạt 9 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể) để sản phẩm nấm có chất lượng tốt, đảm bảo được các thành phần dinh dưỡng và dược liệu trong nấm cao.
3.4.3. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng
Việc kiểm tra chất lượng nấm Đầu khỉ khô sau thời gian bảo bảo có ý nghĩa thực tiễn lớn vì các sản phẩm nấm nói chung và nấm Đầu khỉ nói riêng rất dễ bị hút ẩm, mối mọt, thaamk chí nhiễm mốc, làm giảm chất lượng nấm; do đó muốn đưa nguyên liệu nấm vào sản xuất lớn cần xác định được chính xác chất lượng nguyên đầu vào, nếu chất lượng nguyên liệu không ổn định sau thời gian bảo quản thì cần có các biện pháp tăng cường trong công tác bảo quản nhằm giảm thiểu sự giảm chất lượng nguyên liệu hoặc rút ngắn thời gian lưu trữ nguyên liệu.
Tiến hành tách chiết và xác định hàm lượng polysaccaride của hai mẫu nấm Đầu khỉ khô vừa thu hái và mẫu đã qua thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian 6 tháng; kết quả được thể hiện trong bảng 3.41 dưới đây;
Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide trong hai mẫu Đầu khỉ mới thu hái và qua bảo quản (g/ 100g nấm khô)
Mẫu Phân đoạn
Polysaccharide chiết nước nóng Mẫu mới thu hái 5,30 Mẫu bảo quản sau 6 tháng 2,26
Polysaccharide chiết NaOH 5,03 1,21
Tổng lƣợng polysaccharide 10,33 3,47
124
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Kết quả kiểm tra cho thấy sau thời gian bảo quản 6 tháng ở nhiệt độ phòng tổng hàm lượng polysaccharide giảm còn 1/3 so với mẫu mới thu hái, chất lượng nấm Đầu khỉ giảm mạnh, mầu sắc sản phẩm sậm mầu hơn so với khi mới sấy; Như vậy sau khi thu hái và sấy nấm cần có các biện pháp bảo quản tốt nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm, thời gian bảo quản không nên kéo dài.
3.4.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học của polysaccharide thu nhận được
3.4.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay)
Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết, quá trình thử được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96- well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996). Các chủng vi sinh vật kiểm định được hoạt hoá và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
Chứng dương tính: Các phiến thí nghiệm được nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 37oC/24 giờ cho vi khuẩn
và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh sử dụng được pha trong DMSO 10% với nồng độ thích hợp:
+ Streptomycin 4mM cho vi khuẩn Gr (+) ;
+ Tetracyclin 10mM cho vi khuẩn Gr (-)
+ Nystatin 4mM cho nấm sợi và nấm men.
Chứng âm tính: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.
Kết quả thử nghiệm được trình bầy trong bảng 3.42 và 3.43 dưới đây;
Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml) Vi khuẩn Gr (+) Vi khuẩn Gr (-) STT Kết quả
Ký hiệu mẫu E. coli S. aureus Nồng độ mẫu (µg/ml)
(-) P. aeruginosa (-) B. subtillis (-) (-) Âm tính 1 Mẫu 1 400
(-) (-) (-) (-) Âm tính 2 Mẫu 2 400
Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml)
Nấm mốc STT Kết quả Ký hiệu mẫu
Nồng độ mẫu (µg/ml)
F. oxysporum (-) Nấm men S. cerevisiae (-) C. albicans (-) A. niger (-) Âm tính 1 Mẫu 1 400
(-) (-) (-) (-) Âm tính 2 Mẫu 2 400
125
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy các phân đoạn polysaccharide không
biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ở nồng độ thử 400 µg/ml.
3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay)
Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện hóa học các hợp chất tự nhiên; Theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS (1993); Kết quả được trình bầy ở bảng 3.44 dưới đây. Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người của hai phân đoạn polysaccharide thu được
Dòng tế bào Cell survival (%) Kết luận
Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu ( g/ml) Hep-G2 Lu MCF7 RD
DMSO 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0
5 Chứng (+) 0,2 0,03 1,5 0,2 0,9 0,1 0,0 0,0 Dương tính
40 Âm tính Mẫu 1 99,2 0,4 92,4 1,4 98,5 0,6 80,6 0,5
40 Âm tính Mẫu 2 98,7 1,2 95,5 0,7 97,9 1,5 98,2 0,9
Ghi chú: + Dòng Hep - G2 (Human Hepatocellular carcinoma– ung thư gan người) + Dòng Lu (Lung cancer – ung thư phổi) + Dòng MCF7 (Human Breast adenocarcinoma – ung thư biểu mô vú) + Dòng RD (Human Rhabdosarcoma - ung thư mô liên kết)
Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư gan, ung thư phổi, ung thư biểu mô vú, ung thư mô liên kết, cho thấy các phân đoạn polysaccharide không biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào khi nuôi cấy in vitro; Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với các kết quả đã được một số tác giả công bố trước đây. Theo các tác giả Kim và cộng sự, Wong và cộng sự, điều hòa miễn dịch là một trong những cơ chế hoạt động chính mang lại khả năng chống ung thư của H. erinaceus; Các polysaccharide chiết xuất từ nấm Đầu khỉ chủ yếu có khả năng hoạt hoá miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Lympho T và Lympho B giúp tăng cường miễn dịch qua đó ức chế khối u trên động vật thực nghiệm. Các nghiên cứu về khả năng điều hòa miễn dịch và khả năng chống khối u của các polysaccharide chiết xuất từ dịch nuôi hệ sợi nấm H. erinaceus đã được thực hiện trên chuột cho thấy polysaccharide này có khả năng chống lại sự di căn của khối u ở phổi.
Để chứng minh hoạt tính kháng u in vivo của polysaccharide chiết xuất từ nấm Đầu khỉ He1, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid tách chiết được; Đây là phương pháp đánh giá hoạt tính kháng u trung gian giữa in vitro và in vivo, theo tác giả Jong Bin Kim (2005) và Huiyuan Gao & CS, (2007), đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên. Kết quả được trình bầy trong phần tiếp theo đây.
126
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid
Kỹ thuật theo dõi sự hình thành khuẩn lạc là thử nghiệm sự bám dính và hình thành khuẩn lạc trên thạch mềm, đây được coi là kỹ thuật nghiêm ngặt trong kiểm tra sự biến đổi của tế bào. Theo kỹ thuật này, tế bào sau khi xử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư, được nuôi cấy cùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 10 - 20 ngày. Tiếp theo giai đoạn nuôi cấy, các khuẩn lạc hình hành có thể được nhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên mỗi giếng.
Để thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid tiến hành thí nghiệm như đã trình bầy trong phần 2.3.5.7; Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch được tính lặp lại 3 - 5 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thành khối u, kích thước khối u so với đối chứng (DMSO 1%). Kết quả được trình bày ở bảng 3.45.
Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccaride
Ký hiệu mẫu
% giảm so với đối chứng Nồng độ thử mẫu ( g/ml) Kích thƣớc trung bình của khối u Độ giảm mật độ khối u so với đối Đƣờng kính chứng (%) ( l)
22,1 0 100
Đối chứng âm (DMSO 1%) Mẫu chiết kiềm 40 21,5 2,75 0,21 26,2 0,53
Mẫu chiết nƣớc nóng 40 18,7 15,38 0,92 41,2 1,02
Chứng DMSO 1% Phân đoạn chiết nước nóng
Phân đoạn chiết kiềm Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarit
Kết quả kiểm tra cho thấy mặc dù polysacharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ He1 không có hoạt tính gây độc tế bào khi nuôi cấy invitro, nhưng khi thử hoạt tính ức chế hình
thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo thì lại cho kết quả dương tính rõ rệt. Kết quả trình bầy trong bảng 3.45 và hình 3.48 cho thấy cả hai phân đoạn polysacharide chiết bằng nước nóng và chiết kiềm đều cho kết quả làm giảm kích
127
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
thước trung bình của khối u cũng như mật độ khối u so với đối chứng; Trong đó đường
kính khối u giảm nhiều nhất là 15,38 0,92%, mật độ khối u giảm 41,2 1,02% so với đối
chứng. Kết quả này một lần nữa chứng minh xu thế sử dụng polysacharide tách chiết từ nấm ăn – nấm dược liệu nói chung, nấm Đầu khỉ nói riêng trong việc phòng chống sự hình
thành khối u là hoàn toàn khả thi và mang lại nhiều lợi ích trong công tác tăng cường sức khỏe cộng đồng.
Để chứng minh tính an toàn của nấm Đầu khỉ đối với người sử dụng cũng như khả năng bảo vệ phóng xạ của polysacharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ, chúng tôi tiếp tục thử
trên động vật thử nghiệm, kết quả được trình bày ở phần tiếp theo.
3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm polysaccharide
tổng HT1 trên động vật thực nghiệm
Những năm gần đây, các chế phẩm có nguồn gốc tự nhiên được nghiên cứu theo
định hướng bảo vệ phóng xạ ngày càng phát triển. Các chế phẩm này có tác dụng làm tăng sức đề kháng của cơ thể sinh vật chống lại các tác nhân gây độc và chống phóng xạ, làm
giảm thiểu tác động của bức xạ ion hóa, khôi phục hệ tạo máu, kích thích hệ miễn dịch cơ thể. Các chất này muốn được đưa vào hỗ trợ điều trị cho người, trước hết phải không gây
độc cho cơ thể và có tác dụng trong bảo vệ phóng xạ. Trong khuôn khổ của luận án, chúng tôi đã tách chiết được polysaccharide tổng số từ quả thể nấm Đầu khỉ, đặt tên là HT1; HT1
đã được nghiên cứu cơ bản về tính an toàn và hiệu lực bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm tại bộ môn Dược lý, Học viện Quân y - Bộ Quốc phòng. Các kết quả thử nghiệm
được trình bầy dưới đây.
a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1
Thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 2,0 0,2 kg đạt tiêu chuẩn nghiên cứu
được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm chuyên dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm.
Nhóm chứng: uống dung môi dùng để pha chế phẩm nghiên cứu, liều 1ml/1kg
trọng lượng;
Nhóm thử HT1: uống HT1 mức liều 1ml/1kg trọng lượng.
Trong thời gian thí nghiệm, theo dõi chặt chẽ tình trạng chung, trọng lượng cơ thể,
kết quả sinh hoá, huyết học, tình trạng tim mạch; So sánh với nhóm chứng. Thời gian theo dõi trong 6 tuần. Lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học tại 3 thời điểm: xuất phát điểm (XPĐ), sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên cứu.
128
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ
Bảng 3.46: Sự thay đổi trọng lượng cơ thể thỏ khi dùng HT1 trong 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
> 0,05 XPĐ
> 0,05 Tuần I
> 0,05 Tuần II
> 0,05 Tuần III
> 0,05 Tuần IV
> 0,05 Tuần V
Tuần VI
> 0,05
2,08 0,20 2,12 0,19 2,12 0,14 2,16 0,15 2,25 0,10 2,43 0,08 2,52 0,09 tăng 21,15 < 0,05 2,10 0,25 2,04 0,23 2,06 0,29 2,12 0,26 2,27 0,11 2,43 0,13 2,53 0,13 tăng 20,47 < 0,05 x SD x SD x SD x SD x SD x SD x SD So sánh VI - I ( % ) pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, trọng lượng cơ thể của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm chứng, nhóm thử, trọng lượng cơ thể thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế phẩm HT1 6 tuần
Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần ( n = 8 )
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
XPĐ > 0,05
Tuần III > 0,05
Tuần VI > 0,05 x SD x SD x SD
276,2 32,5 275,6 36,2 273,9 37 > 0,05 280,6 35 278,9 37 280 32 > 0,05 pVI - XPĐ
129
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm XPĐ, sau 3 tuần, sau 6 tuần trên các băng điện tim, đọc ở đạo trình DII, biên độ QRS của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), tại các thời điểm, sự khác biệt cũng không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
x 3,40 3,42 XPĐ > 0,05 SD 0,25 0,27
x 3,37 3,38 Tuần III > 0,05 SD 0,36 0,30
x 3,40 3,40 Tuần VI > 0,05 SD 0,27 0,25
> 0,05 > 0,05 pVI - XPĐ
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm XPĐ, sau 3 tuần, sau 6 tuần trên các băng điện tim, đọc ở đạo trình DII, biên độ QRS của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), tại các thời điểm, sự khác biệt cũng không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Bảng 3.49: Sự xuất hiện sóng điện tim bệnh lý thỏ ở đạo trình DII khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 Thời điểm
XPĐ Không Không
Tuần III Không Không
Tuần VI Không Không
Sau 6 tuần thí nghiệm, không thấy xuất hiện các sóng bệnh lý trên điện tim đồ thỏ các sóng bệnh lý trên điện tim đồ thỏ ở đạo trình DII ở cả 2 nhóm nghiên cứu tại tất cả các thời điểm nghiên cứu.
130
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Như vậy, kết quả từ bảng 3.47, 3.48, 3.49 cho thấy chế phẩm polysaccharide tách
chiết từ nấm Đầu khỉ không có tác dụng xấu đến sự hoạt động của tim thỏ thử nghiệm.
a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần
Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 1012/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
x 5,35 5,25 XPĐ > 0,05 SD 0,34 0,22
x 5,31 5,14 Tuần III > 0,05 SD 0,27 0,16
x 5,25 5,16 Tuần VI > 0,05 SD 0,34 0,19
> 0,05 > 0,05 pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, số lượng hồng cầu của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), số lượng hồng cầu thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l) ở thỏ khi dùng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
XPĐ > 0,05 x SD 115,00 7,53 118,87 8,69
Tuần III > 0,05 x SD 116,33 4,39 116,62 6,91
Tuần VI > 0,05 x SD
116,89 4,99 > 0,05 119,00 9,80 > 0,05 pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hàm lượng Hemoglobin của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hàm lượng Hemoglobin của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
131
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
x 8,20 9,22 XPĐ > 0,05 SD 1,49 3,34
x 8,32 9,08 Tuần III > 0,05 SD 1,18 0,90
x 8,45 8,51 Tuần VI > 0,05 SD 0,43 0,69
> 0,05 > 0,05 pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, số lượng bạch cầu của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), số lượng bạch cầu của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
x 411,67 397,00 XPĐ > 0,05 SD 20,66 38,93
x 413,00 402,25 Tuần III > 0,05 SD 19,70 17,20
x 415,00 405,75 Tuần VI > 0,05 SD 12,05 5,31
> 0,05 > 0,05 pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, số lượng tiểu cầu của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), số lượng tiểu cầu của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
132
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT, SGPT của thỏ
Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm
XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
74,64 67,98 x XPĐ > 0,05 SD 9,29 11,86
76,4 77,44 x Tuần III > 0,05 SD 10,49 12,71
76,91 75,3 x Tuần VI > 0,05 SD 10,65 10,49
> 0,05 > 0,05 pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hoạt độ enzym SGOT của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hoạt độ enzym SGOT của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT của thỏ khi dùng HT1 ở các
thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
89 93,76 x XPĐ > 0,05 SD 14,65 17,16
88,47 81,65 x Tuần III > 0,05 SD 9,36 18,97
90,5 95,05 x Tuần VI > 0,05 SD 14,32 15,08
> 0,05 > 0,05 pVI-I
So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hoạt độ enzym SGPT của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hoạt độ enzym SGPT của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
133
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
a5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ
Bảng 3.56: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin của thỏ khi dùng HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
Nhóm NC Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 Thời điểm
XPĐ > 0,05 x SD 100,11 6,08 102,99 14,39
x Tuần III > 0,05 SD 95,22 9,47 98,32 8,14
Tuần VI > 0,05 x SD
101,12 9,19 > 0,05 100,06 11,09 > 0,05
pVI-I So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm, hàm lượng Creatinin của nhóm thuốc thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), hàm lượng Creatinin của thỏ ở tuần thứ 6 so với tuần thứ nhất sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
b. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm HT1
Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 được xác định thông qua các chỉ tiêu: Thời gian sống trung bình (TGSTB); Tỷ lệ (%) sống sót; Hệ số bảo vệ α, β của các nhóm CNT; Kết quả được trình bày trong bảng 3.57 dưới đây.
Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 khi dùng 30 ngày liều 0,5g/kg/24 giờ
Đối chứng chiếu xạ
Nhóm NC n n α β Liều CX
10 10 10 10 TGSTB (ngày) 21,5 17,7 14,6 9,7 % sống sót 40 30 20 0 Chiếu xạ + HT1 0,5g/kg Hệ số bảo vệ % sống sót 70 70 40 20 TGSTB (ngày) 25,2 24,8 18,8 12,4 0,48 0,50 0,30 0,10 0,50 0,52 0,24 0,20 10 10 10 10 5,5 6,5 7,5 8,5
Tính hệ số giảm liều của HT1: HSGL = 7,4/5,8 = 1,27
Kết quả trong bảng 3.57 cho thấy thời gian sống trung bình và tỷ lệ phần trăm sống sót sau chiếu xạ ở tất cả các liều chiếu xạ của nhóm thử đều cao hơn nhóm chứng. Kết quả này khẳng định khả năng bảo vệ phóng xạ của polysaccaride chiết xuất từ nấm Đầu khỉ; từ kết quả thử nghiệm mở ra hướng nghiên cứu sử dụng nấm Đầu khỉ cho các bệnh nhân ung
134
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
thư trong giai đoạn chiếu xạ và sau chiếu xạ nhằm giảm thiểu tác hại của xạ trị đến cơ thể
người bệnh; Bên cạnh đó, kết quả trên còn làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm sản xuất ra các loại thuốc có tác dụng bảo vệ cơ thể trong hóa trị, xạ trị, sử dụng cho cả
điều trị và dự phòng phơi nhiễm phóng xạ.
c. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu
Dưới tác dụng của bức xạ ion hoá thì tế bào tủy xương, tế bào lách rất nhạy cảm và dễ bị tổn thương; Các tổn thương này thể hiện ở sự suy giảm số lượng tế bào hữu hình trong máu ngoại vi bao gồm cả 3 loại tế bào hồng cầu (HC), bạch cầu (BC), tiểu cầu (TC),
đều giảm mạnh; Trong đó BC giảm mạnh nhất sau đó là TC và HC. Dưới tác dụng của HT1, sự biến đổi của số lượng tế bào máu ngoại vi được trình bày ở bảng 3.58 dưới đây.
Bảng 3.58: Số lượng tế bào ở nhóm chuột nhắt trắng dưới tác dụng của
chiếu xạ và chiếu xạ + HT1
Số lƣợng HC (x 10 12/L) p Thời điểm sau chiếu xạ Nhóm CX (n=10 ) CX + HT1 (n=10)
Ngày thứ I 7,50 ± 0,70 >0,05 7,20 ± 0,80
Ngày thứ IV 7,30 ± 0,40 <0,05 6,6 ± 0,60
Ngày thứ IX 7,10 ± 0,10 <0,05 6,20 ± 0,50
Số lƣợng bạch cầu (x 10 9/L)
Nhóm CX (n=10) CX + HT1 (n=10)
Ngày thứ I 1,80 ± 0,30 >0,05 1,50 ± 0,30
Ngày thứ IV 1,3 ± 0,20 <0,05 0,60 ± 0,20
Ngày thứ IX 1,6 ± 0,40 <0,05 0,88 ± 0,30
Số lƣợng tiểu cầu (x 10 9/L)
Nhóm CX (n=10 ) CX + HT1 (n=10)
Ngày thứ I 4,90 ± 0,60 >0,05 4,30 ± 0,20
Ngày thứ IV 5,10 ± 0,70 <0,05 3,80 ± 0,30
Ngày thứ IX 4,80 ± 0,50 >0,05 4,10 ± 0,30
Số lượng các phần tử hữu hình của máu bao gồm hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu có sự
thay đổi theo chiều hướng giống nhau, giảm mạnh ở ngày thứ nhất sau chiếu xạ; Đến ngày thứ
IV, sự hồi phục ở nhóm có HT1 tốt hơn; Đến ngày thứ IX, sự hồi phục này càng tốt hơn.
135
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Hình 3.50: Thử nghiệm HT1 trên chuột
Lách nhóm chứng Lách nhóm thử
Gan nhóm chứng Gan nhóm thử
Thận nhóm chứng Thận nhóm thử Hình 3.51: Kết quả thử hoạt tính in vivo chiết phẩm của nấm Đầu khỉ
136
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Như vậy kết quả thử nghiệm in vivo tại Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y, Bộ
Quốc phòng cho thấy:
+ Polysaccharide tổng số tách chiết tử nấm Đầu khỉ an toàn ở nồng độ thử nghiệm
trên thỏ, thời gian thử nghiệm 6 tuần.
+ Polysaccharide tổng số tách chiết tử nấm Đầu khỉ được đánh giá tác dụng bảo vệ
phóng xạ trên thực nghiệm và cho kết quả dương tính rõ rệt.
137
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chƣơng 4. KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu về nấm Đầu khỉ H. erinaceus từ khâu nuôi trồng khảo nghiệm, tuyển chọn giống; Phân lập lại giống gốc; Nhân giống, sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm thương phẩm; Tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm và thử hoạt tính sinh học của polysaccharide thu được, NCS xin đưa ra một số kết luận sau:
1. Đã nuôi trồng khảo nghiệm 4 chủng nấm Đầu khỉ H. erinaceus và tuyển chọn được chủng ký hiệu He1 có chất lượng tốt, thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm thành phẩm cân đối, năng suất cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam.
2. Đã đề xuất được qui trình phân lập, thuần khiết lại giống nấm Đầu khỉ He, chủ động trong việc nhân giống, duy trì, bảo tồn nguồn giống ổn định cung cấp cho sản xuất; Các điều kiện thích hợp để phân lập lại giống gốc nấm Đầu khỉ như sau:
- Quả thể chọn để phân lập lại giống gốc đang ở giai đoạn 7-9 ngày tuổi, khi quả thể nấm trưởng thành, chưa phát sinh bào tử; Quả thể có hình thái cân đối, không bị dị tật, không nhiễm bệnh.
- Phương pháp phân lập: dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (mô nấm) để phân lập lại giống gốc với lượng lớn phục vụ sản xuất; Dùng phương pháp nuôi cấy bào tử để phân lập giống gốc phục vụ quá trình lưu giữ, bảo quản nguồn giống trong thời gian dài.
- Môi trường thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ: khoai tây: 200g/l; pepton: 1,5 g/l; CNM: 1,5 g/l; MgSO4 .7H2O: 1 g/l; KH2PO4: 2,5 g/l; thiamin: 30 µg/l; nấm sò tươi: 100 g/l; cám gạo: 10 g/l; bột ngô: 10 g/l; glucose: 20 g/l; agar: 20 g/l;. pH 6,5.
- Nhiệt độ nuôi sợi giống gốc thích hợp: 24±2oC. - Hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trong nuôi cấy thuần khiết đạt cực đại và ổn định
từ ngày 12 đến ngày 14 sau khi cấy giống.
3. Đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp: giống trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 lít, giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít; Từ đó đề xuất được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể trung gian cấp 1 dung tích 200 ml; Qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể trung gian cấp 2 dung tích 5000 ml; Qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể dung tích 120 lít sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp. Với các điều kiện nhân giống như sau:
- Nhân giống trung gian cấp 1 dung tích 200ml:
+ pH môi trường dinh dưỡng 6,5; Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: 115oC
+ Thành phần môi trường dinh dưỡng: sử dụng môi trường CT8 với thành phần: Khoai tây 200g/l; nấm sò tươi: 100g/l; Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO4.7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2 HPO4: 1g; Thiamin: 20 µg; Nước: 1000 ml; trong 30-35 phút;
138
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Tỉ lệ giống cấy chuyển 4% theo thể tích; + Chế độ nuôi lắc 150 vòng/ phút liên tục trong suốt quá trình nuôi + Nhiệt độ nuôi giống: 24±2oC
- Nhân giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 ml:
+ Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2: Glucose: 15g; Pepton: 4g; MgSO4 .7H2O: 1g; KH2PO4: 1g; K2HPO4: 1g; (NH4)2HPO4: 1g; thiamin: 20 µg; nước cất: 1000 ml, pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít môi trường;
+ Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống: 115oC/50 phút;
+ Tỉ lệ giống cấy chuyển: 5-7%,
+ Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển: 3 - 6 ngày tuổi, tốt nhất ở 5 ngày tuổi;
+ Nhiệt độ nuôi giống 24±2oC
+ Chế chế độ sục khí: 0,4 – 0,5 lít khí/lít môi trường/phút
+ Thời gian nuôi: 5 ngày
- Nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít phục vụ nuôi trồng:
+ Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2: Glucose: 10g/l; Saccarose: 10g/l; Bột dinh dưỡng cô đặc: 20g/l; MgSO4 .7H2O: 1g/l; KH2PO4: 1g/l; K2HPO4: 1g/l; NaNO3: 1g/l; NH4NO3: 1g/l; B1: 3 viên/l; pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít môi trường;
+ Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống: 121oC/80 phút;
+ Tỉ lệ giống cấy chuyển: 15%,
+ Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển: 4 - 6 ngày tuổi, tốt nhất ở 5 ngày tuổi;
+ Nhiệt độ nuôi giống 24±2oC
+ Chế chế độ sục khí: 0,4 – 0,5 lít khí/lít môi trường/phút
+ Thời gian nuôi: 5 ngày
4. Đã xác định được các điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể, từ đó đề xuất được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống dạng dịch thể. Các yếu tố thích hợp cho nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể bao gồm:
+ Công thức môi trường tổng hợp sử dụng trong nuôi trồng: 45% mùn cưa + 40%
lõi ngô + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO3; + Độ ẩm nguyên liệu nuôi trồng: 65 ± 2%;
139
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
+ Khử trùng nguyên liệu: 100oC/7 giờ hoặc 1,2 – 1,4 atm trong 3 - 3,5 giờ; + Tỷ lệ giống dạng dịch thể cấy vào bịch nguyên liệu: 25 ml dịch/ bịch nguyên liệu 800 g; + Nhiệt độ ươm sợi: 23 - 25 oC; + Nhiệt độ cho ra quả thể 20-22oC.
So sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn cho thấy so với giống trên cơ chất hạt, giống dịch thể có nhiều ưu điểm hơn hẳn như: rút ngắn tổng thời gian nhân giống các cấp và thời gian nuôi trồng nấm xuống còn một nửa, qua đó tăng hiệu suất sử dụng nhà xưởng, tăng số vụ nuôi trồng nấm trong một năm; Giảm tỷ lệ nhiễm bệnh, qua đó làm tăng năng suất thu hoạch; Giảm chi phí sản xuất do thay thế cơ chất nhân giống trên hạt thóc bằng nhân giống dạng dịch thể, giảm chi phí nhân công, điện năng, khấu hao nhà xưởng.
5. Đã đề xuất được qui trình chiết tách polysaccharide trong nước nóng và dung
môi NaOH với nồng độ thích hợp là 4%, hiệu suất chiết là 20-25%.
Các phân đoạn polisaccaride tách chiết từ nấm Đầu khỉ được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính kháng u thực nghiệm nuôi cấy invitro cho kết quả âm tính; nhưng khi kiểm tra khả năng ức chế hình thành khối u trên thạch mềm cho kết quả dương tính rõ rệt đối với dòng tế ung thư gan Hep G2.
Các phân đoạn polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ đã được thử nghiệm trên thỏ, thời gian thử nghiệm 6 tuần cho thấy chế phẩm không làm ảnh hưởng đến tốc độ tăng trọng lượng cơ thể thỏ; Không làm ảnh hưởng tới các sóng điện tim cũng như các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu); Không làm thay đổi hoạt độ enzyme SGOT, SGPT, hàm lượng creatin máu. Như vậy, polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ He1 an toàn ở nồng độ thử nghiệm đối với động vật nghiên cứu.
Kết quả kiểm tra khả năng bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm cho thấy polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ He1 có khả năng làm tăng tỷ lệ sống của chuột nhắt trắng 30% sau chiếu xạ, có tác dụng tốt đối với hệ tạo máu, phục hồi nhanh số lượng tế bào HC, BC, TC, máu ngoại vi; Polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ He1 còn có khả năng làm giảm mức độ tổn thương ở các cơ quan có chức năng miễn dịch như lách, hạch, tuyến ức.
140
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
1. Lê Mai Hương, Cồ Thị Thùy Vân, Hà Phương Thư, Nguyễn Bích Thủy, Trần Thị Hồng Hà, Trần Thị Như Hằng, Đỗ Hữu Nghị, Phạm Quốc Long, Nguyễn Xuân Phúc, (2010), “Nghiên cứu nuôi trồng một số loại Nấm ăn và Nấm dược liệu Việt Nam, thu nhận, chuyển hóa và nghiên cứu hoạt tính kháng u thực nghiệm các polysaccarit của chúng ”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học công nghệ Việt nam, tr. 75-82.
2. Nguyễn Bích Thủy, Lê Mai Hương, Trần Thị Hồng Hà, Trần Thị Như Hằng, Phạm Hồng Hải, Cồ Thị Thùy Vân, Đinh Xuân Linh, (2010), “Nghiên cứu quy trình chiết polysaccharide giàu 1,3 –β – D- glucan từ nấm Hầu thủ Hericium erinaceus Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và công nghệ, tr. 98-104.
3. Cồ Thị Thùy Vân, Nguyễn Thị Bích Thùy, Trịnh Tam Kiệt, (2010), “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers”, Tạp chí Di truyền học & ứng dụng, số 6, tr. 63-66.
4. Cồ Thị Thùy Vân, Nguyễn Thị Bích Thùy, Lê Mai Hương, Trần Liên Hà, Trịnh Tam Kiệt, (2012), “Xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống Nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus) dạng dịch thể”, Tạp chí Di truyền học & ứng dụng, số 8, tr. 81-87. 5. Cồ Thị Thùy Vân và cộng sự, “Quy trình kỹ thuật nhân giống nấm Đầu khỉ”; Công nhận Quy trình kỹ thuật mới theo quyết định số 641/QĐ – TT – CTT ngày 28 tháng 12 năm 2012 của Cục trồng trọt – Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn.
6. Cồ Thị Thùy Vân và cộng sự, “Quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm Đầu khỉ”; Công nhận Quy trình kỹ thuật mới theo quyết định số 641/QĐ – TT – CTT ngày 28 tháng 12 năm 2012 của Cục trồng trọt – Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn.
7. Cồ Thị Thùy Vân và cộng sự, “Quy trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus dạng dịch thể cấp trung gian”; Công nhận Quy trình công nghệ mới cấp cơ sở theo quyết định số 80/QĐ – TT – NC ngày 25 tháng 12 năm 2013 của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp.
8. Cồ Thị Thuỳ Vân, Trịnh Tam Kiệt, Trần Liên Hà, Lê Mai Hương, (2014), “Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus sử dụng giống nấm dạng dịch thể”, Tạp chí Di truyền học & ứng dụng, số 9, tr.19-24.
9. Cồ Thị Thùy Vân và cộng sự, “Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus sử dụng giống nấm dạng dịch thể”; Công nhận Quy trình công nghệ mới cấp cơ sở theo quyết định số 40/QĐ – TT – NC ngày 26 tháng 6 năm 2014 của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp.
10. Lê Mai Hương, Cồ Thị Thuỳ Vân, Trần Thị Hồng Hà, Vũ Mạnh Hùng, (2014), “Đánh giá độ an toàn và khả năng bảo vệ phóng xạ của sản phẩm HT1 chiết xuất từ nấm đầu khỉ Hericium erinaceus”, Tạp chí Dược học, số 460 tháng 8 – 2014, tr. 32-36.
141
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế - Cộng hoà Xã hội Chủ nghĩa Việt Nam (1996): Quy định về nghiên cứu dược lý các thuốc y học cổ truyền dân tộc, quyết định 371/BYT-QĐ.
2. Cục Khuyến nông và Khuyến lâm (2003), “Khuẩn thảo học – Dùng cỏ nuôi nấm”, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
3. Đinh Xuân Linh, Thân Đức Nhã, Nguyễn Thị Sơn (2007), “Kỹ thuật trồng, chế biến nấm ăn, nấm dược liệu”, Nhà xuất bản Nông nghiêp.
4. Đinh Xuân Linh, (2011) “Thực trạng và giải pháp phát triển sản xuất nấm tại các tỉnh phía Bắc”, Hội nghị phát triển nấm các tỉnh phía Bắc, Tại Đồ Sơn – Hải Phòng, 22/9/2011.
5. Khuất Hữu Trung và cộng sự (2003), “Kết quả bước đầu trong nghiên cứu đánh giá, tuyển chọn và thử nghiệm nuôi trồng nấm Hầu thủ”, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 136-140.
6. Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Hồng Hà, Trần Như Hằng, Đỗ Hữu Nghị, (2004), “Nghiên cứu tác dụng sinh học và phân tích hóa học từ chủng nấm Hầu thủ Hericium erinacus (Bull.Ex Fr) Pers.”, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống định hướng y sinh dược học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 501-504.
7. Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Hồng Hà, Trần Như Hằng, Phan Văn Kiệm, (2005), “Chất có hoạt tính độc tế bào từ Hericium erinacus (Bull.Ex Fr) Pers.”, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống định hướng y sinh dược học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 570-573.
8. Lê Xuân Thám (2004), “Nấm trong công nghệ và chuyển hóa môi trường”, Nxb Khoa
học và kỹ thuật - Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Lê Duy Thắng (1999), “Kỹ thuật trồng nấm”, Tập 1, Nxb Nông nghiệp.
10. Nguyễn Thị Chính, (2005), “Phát triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khỏe”. Dự án cấp nhà nước, Trường ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQG Hà Nội.
11. Nguyễn Lân Dũng (2001 - 2004), “Công nghệ nuôi trồng nấm”, Tập 1, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
12. Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn, Ngô Xuân Nghiễn, Zani Federico, (2000), “Nấm ăn – Cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng”, Nhà xuất bản nông nghiệp.
13. Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Ngô Xuân Nghiễn và cộng sự (2001), “Kết quả nghiên cứu công nghệ nuôi trồng Nấm ăn và nấm dược liệu trên bã mía”, Hội thảo quốc tế sinh học, Hà Nội - Việt Nam, tr. 113-119.
142
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
14. Nguyễn Hữu Đống và cộng sự (2003), “Kết quả nghiên cứu khoa học, chuyển giao công nghệ sản xuất giống, nuôi trồng, chế biến và tiêu thụ nấm ăn, nấm dược liệu của Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp ở các địa phương trong cả nước giai đoạn 1994 - 2003”, Hội nghị Công Nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 148-164.
15. Nguyên Xuân Phách và CS (1995), “Toán thống kê và tin học ứng dụng trong y - sinh -dược”, Nxb Quân đội Nhân dân.
16. Trịnh Tam Kiệt (2013), “Nấm lớn ở Việt Nam”, Tập 3, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
17. Abrham W.B. (1978), “Techniques of animal and clinical toxicology”. Med. Pub. Chicago, pp. 55 - 68.
18. Ahmed Imtiaj, Chandana Jayasinghe, Geo Woo Lee, (2008), “Vegetative Growth of Four of Hericium erinacus Collected from Diferent Habitats”, Mycobilogy, the Korean Society of Mycology
19. Ahn, D.K., (1992), “Medinal fungi in Korea”, Kor. J. Mycol. 20, pp. 154–165.
20. Arora, D., (1986), “Mushrooms Demystified”, Ten Speed Press, Berkeley, Calif.
21. Buswell, J. A. & Chang, S.T., (1993), “Edible mushroom: Attributes and Applications”, In Genetics and Breeding of Edible mushroom. Gorden and Breach Science publishers, pp. 297-324.
22. Burkhard Kirchhoff, (1996), Biotechnologycal Invetigation of Hericium erinacus (Bull.: Fr.) Pers Bag – Log cultivation to Increase Yield.
23. Chang, S.T. & Miles, P.G., (1993), “Edible mushroom and their cultivation”. Delhi: CBS publishers.
24. Chang, S.T. (1993), “Mushroom biology: The impact on mushroom production and mushroom products”, In mushroom biology and mushroom products (Chang, Buswell and Chiu ads.), the Chinees press, pp. 3.
25. Chang, S.T. (1993), “Mushroom and Mushroom biology”, In Genetics and Breeding of edible mushroom, (Chang, Buswell and Miles). Gorden and Breach Science publishers, pp. 1-13.
26. Chang, S.T. (1999), “Global impact of edible and medicinal mushroom on human welfare in the 21st century: nongreen revolution”. International journal of medicinal mushroom 1, pp. 1-7.
27. Chang, H.Y., Roh, M.G., (1999). “Physiological characteristics of Hericium erinaceus in sawdust media”. Kor. J. Mycol, pp. 252–255.
143
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
28. Chang, S.H., Miles, P.G., (1989). “Edible Mushroom and Their Cultivation”. CRC Press, pp. 307–312.
29. Crisan, E.V. and Sands, A., (1978), “Nutritional value” In The Biology and Cultivation of Edible Mushroom (Chang & Hayes eds.), Academic press, pp. 137-165.
30. Elaine R. Carbonero và cs, (2006), Bằng sáng chế số hiệu US3286399 A
31. Gonchavenko E.N, Deyev L.I., Kudryashov Yu.B. (1997), “The application of preparation of natural origin under condition of radioactive pollution and in experiment. Radiat Biol. 37, pp. 676-682
32. Grigansky, A.Ph, Solomko, E.F. & B. Kirchhoff (1999) “Mycelial growth of medicinal mushroom Hericium erinacus (Bull.: Fr.) Pers. In pure culture. International journal of medicinal mushroom, pp. 81-87.
33. Han Gyu Ko, Hyuk Gu Park, Sang Ho Park, Chang Won Choi, Seong Hwan Kim, Won Mok Park, (2005), “Comparative study of mycelial growth and basidiomata formation in seven different species of the edible mushroom genus Hericium”, Bioresource Technology 96, pp. 1439–1444.
34. Han ZH, Ye JM, Wang GF (2012), “Evaluation of in vitro antioxidant activity of Hericium erinaceus polysaccharides”. Int J Biol Macromol.
35. Han ZH, Ye JM, Wang GF., (2013), “Evaluation of in vivo antioxidant activity of Hericium erinaceus polysaccharides”. Int J Biol Macromol; 52, pp. 66–71.
36. Hassan, F.R.H., (2007), “Cultivation of the Monkey Head Mushroom (Hericium erinaceus) in Egypt”. Journal of Applied Sciences Research, 3(10), pp. 1229-1233.
37. Huiyuan Gao, Bailing Hou, Masonori Kuroyanagi, Lijun wu., (2007), Asian J. of Trad. Medi.,2 (3), pp. 104-109.
38. Ikekawa, T., Uehara, N., Maeda, Y., Nakamishi, M. & Fukuoka, F. (1969), “Anti - tumour activity of aqueous extracts of some edible mushroom”, Cancer reseach, 92, pp. 734-735.
39. Ikekawa, T., (2009). “Bunashimeji, Hypsizygus marmoreus: antitumor activity of extracts and polysaccharides”. Food Reviews International 11.
40. Kawagishi, H., Shimada, A., Shirai, R., Okamoto, K., Ojima, F., Sakamoto, H., Ishiguro, Y., Furukawa, S., (1994), “Erinacines A, B and C, strong stimulators of nerve growth factor (NGF) - synthesis, from the mycelia of Hericium erinaceum”. Tetrahedron Lett. 35, pp. 1569–1572.
41. Kawagishi, H., Shimada, A., Hosokawa, S., Mori, H., Sakamoto, H., Ishiguro, Y., Sakemi, S., Bordner, J., Kojima, N., Furukawa, S., (1996). “Erinacines E, F and G, stimulators of nerve growth factor (NGF) - synthesis, from the mycelia of Hericium erinaceum”. Tetrahedron Lett. 37, pp. 7399–7402.
144
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
42. Kim, D.M., Pyun, C.W., Ko, H.G., Park, W.M., (2000), “Isolation of antimicrobial substances from Hericium erinaceum”. Mycobiology 28, pp. 33–38.
43. Kim SP, Kang MY, Kim JH, Nam SH, Friedman M., (2011), “Composition and mechanism of antitumor effects of Hericium erinaceus mushroom extracts in tumor- bearing mice”. J Agric Food Chem; 59:986, pp. 1–9.
44. Kim SP, Kang MY, Choi YH, Kim JH, Nam SH, Friedman M., (2011), “Mechanism of Hericium erinaceus (Yamabushitake) mushroom-induced apoptosis of U937 human monocytic leukemia cells”. Food Funct; 2:3, pp. 48–56.
45. Kolotushkina EV, Moldavan MG, Voronin KY, Skibo GG., (2003). “The influence of Hericium erinaceus extract on myelination process in vitro”. Fiziol Zh; 49, pp. 38–45.
46. Jong Bin Kim, (2005), Seminar in Cancer Biology 15, pp. 365-377.
47. Lu, L., Li, J., Cang, Y., (2002). “PCR-based sensitive detection of medicinal fungi Hericium species from ribosomal internal transcribed spacer (ITS) sequence”. Biol. Pharm. Bull. 25, pp. 975–980.
48. Md Asaduzzaman Khan, Mousumi Tania, Rui Liu và Mohammad Mijanur Rahman (2009), “Hericium erinaceus: an edible mushroom with medicinal values” Microbiol technology.
49. Miles, P.G., (1993), “Biologycal background for mushoom breeding”, In Genetics and Breeding of Edible Mushroom, Gorden and Breach Science publishers.
50. Miles, P.G. and Chang, S.T., (1986), “Application of Biotechnology in strain selection and development of Edible Mushroom”, Asean food Journal.
51. Mohri, K., Toyomasu, T., Nanba, H., (1987), “Antitumour activity of fruit body of Edible Mushroom orally of fruit body of edible mushroom orally administered to mice”, Mush.J. Tropics, pp. 121-126.
52. Mori K, Kikuchi H, Obara Y, Iwashita M, Azumi Y, Kinugasa S, et al., (2010), “Inhibitory effect of hericenone B from Hericium erinaceus on collagen-induced platelet aggregation”. Phytomedicine; 17:108, pp. 2–5.
53. Mori K, Obara Y, Moriya T, Inatomi S, Nakahata N., (2011), “Effects of Hericium erinaceus on amyloid β (25–35) peptide-induced learning and memory deficits in mice”. Biomed Res; 32, pp. 67–72.
54. Mori K, Inatomi S, Ouchi K, Azumi Y, Tuchida T., (2009), “Improving effects of the mushroom Yamabushitake (Hericium erinaceus) on mild cognitive impairment: a double- blind placebo-controlled clinical trial”. Phytother Res; 23, pp. 367–72.
55. Mizuno, T., Wasa, T., Ito, H., Suzuki, C., Ukai, N., (1992), “Antitumoractive polysaccharides isolated from the fruiting body of Hericium erinaceum, an edible and medicinal mushroom called yamabushitake or houtou”. Biosci. Biotech. Biochem. 56, pp. 347–348.
145
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
56. Murakami S., (1993), “Genetics and Breeding of spore deficunt strain in Agrocybe cylindracea and Lentinus edodes”, In mushroom Biology and Mushroom products (Chang, Buswell and Chiu eds.), The Chinaes university, pp. 63-69.
57. Michel Duubois, K.A. Gilles, J.K.Hamilton, P.A. Reber and Fred Smith, “Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”.
58. Nagano M, Shimizu K, Kondo R, Hayashi C, Sato D, Kitagawa K, et al., (2010), “Reduction of depression and anxiety by 4 weeks Hericium erinaceus intake”. Biomed Res; 31:23, pp. 1–7.
59. Nicolini, L., Hunolstein, Von C. & Carilli, A., (1987), “Soilid state fermentation of orange peel and grape stalks by Pleurotus ostreatus, Agrocybe aegerita and Armillariella mella”, Applied Microbiology and Biotechnology 26.
60. Park, Y.S., Lee, H.S., Won, M.H., Lee, J.H., Lee, S.Y., Lee, H.Y., (2002), “Effect of an exo-polysaccharide from the culture broth of Hericium erinaceus on enhancement of growth and differentiation of rat adrenal nerve cells”. Cytotechnology 39, pp. 155–162.
61. Park, H.K., Ko, H.G., Kim, S.H., Park, W.M., 2004. “Molecular identification of Asian isolates of medicinal mushroom Hericium erinaceum by phylogenetic analysis of nuclear ITS rDNA”. J. Microbiol. Biotechnology. 14, pp. 816–821.
62. Sheng - Quan Huang, Jin-Wei Li, Zhou Wang, Hua - Xin Pan, Jiang - Xu Chen and Zheng - Xiang Ning (2010), “Optimization of Alkaline Extraction of Polysaccharides from Ganoderma lucidum and Their Effect on Immune Function in Mice”, Molecules.
63. Suzuki, C., Mizuno, T., 1997. “Cultivation of Yamabushitake Hericium erinaceum”. Food Rev. Int. 13, pp. 419–421.
64. Stadler, M., Mayer, A., Anke, H., Sterner, O., 1994. “Fatty acids and other compounds with nematicidal activity from cultures of basidiomycetes”. Planta Med. 60 (2), pp. 128–132
65. Turner A. (1965), “Screening methods in pharmacology”, Academic Press, NewYork and London, pp. 60 - 68.
66. Vasin M.V., Antipow V.V., Chemov G.A (1996), Investigation of radioprotective effect of indraline on hematopoietic system in different species of animal. Radiat. Biol. 36, pp. 168-189.
67. Yang BK, Park JB, Song CH., (2003), Hypolipidemic effect of an Exobiopolymer produced from a submerged mycelial culture of Hericium erinaceus. Biosci Biotechnol Biochem; 67: 129, pp. 2–8.
68. Young Shik Park, Hyun Soo Lee, Moo Ho Won, Jin Ha Lee, Shin Young Lee and Hyeon Yong Lee1, (2002), “Effect of an exo-polysaccharide from the culture broth of Hericium erinaceus on enhancement of growth and differentiation of rat adrenal nerve cells”.
146
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
69. Yilin W., (2010), “Method for extracting Hericium erinaceus polysaccharide”, CN 103044563 A
70. Wang Zhiqiang. (2009), “Rare mushroom cultivation”, Edible and Medicinal mushroom workshop, Shanghai, China, pp. 53-69.
71. Wong KH, Naidu M, David P, Abdulla MA, Abdullah N, Kuppusamy UR, et al., (2011), “Peripheral nerve regeneration following crush injury to rat peroneal nerve by aqueous extract of medicinal mushroom Hericium erinaceus (Bull.: Fr) Pers. (Aphyllophoromycetideae)”. Evid Based Complement Alternat Med; 580752.
72. Wasser, S.P., Weis, A.L., (1999), Therapeutic effects of substances occurring in higher basidiomycetes mushroom: a modern perspective. Crit. Rev. Immunol. 19 (1), pp. 65–96.
73. Zhang Weirui (2013), Development Trend of China’s Edible Fungi Industry.
147
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
PHỤ LỤC
1. Phụ lục hình 2. Quyết định số 193/QĐ-TT-CTT ngày 9/5/2011 của Cục trưởng cục Trồng trọt - Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, về việc công nhận giống cây trồng nông nghiệp mới. 3. Quy trình kỹ thuật nhân giống nấm Đầu khỉ; Quyết định công nhận Quy trình kỹ thuật mới theo quyết định số 641/QĐ – TT – CTT ngày 28 tháng 12 năm 2012 của Cục trồng trọt – Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn. 4. Quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm Đầu khỉ; Quyết định công nhận Quy trình kỹ thuật mới theo quyết định số 641/QĐ – TT – CTT ngày 28 tháng 12 năm 2012 của Cục trồng trọt – Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn. 5. “Quy trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus dạng dịch thể cấp trung gian”; Công nhận Quy trình công nghệ mới cấp cơ sở theo quyết định số 80/QĐ – TT – NC ngày 25 tháng 12 năm 2013 của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp. 6. “Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus sử dụng giống nấm dạng dịch thể”; Công nhận Quy trình công nghệ mới cấp cơ sở theo quyết định số 40/QĐ – TT – NC ngày 26 tháng 6 năm 2014 của Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp. 7. Phiếu kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng, vitamim, axit amim của nấm Đầu khỉ He1 8. Phiếu kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết từ nấm Đầu khỉ He1 9. Phiếu kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết từ nấm Đầu khỉ He1 10. Bản xử lý số liệu trên phần mềm IRRISTAT 4.0.
148
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH
Hình: Đồ thị dùng glucose với các nồng độ xác định để phản ứng tạo mầu với hỗn hợp dịch nhuộm (phenol và axit sulphuric)
Serial Unknown
Kết quả đo OD 490 nm, 7 mẫu nấm trên máy ELISA 2.00.17 Software Version Plate 1 Plate Number 12/7/2012 Date 12:21:17 AM Time Reader Type: ELx800 Reader Number: Reading Type Reader
Procedure Details
Chiết nước nóng, đo lặp lai 3 lần
Chiết NaOH 5%, đo lặp lại 3 lần
Mẫu
1
4
5
7
6
8
9
10
11
12
3
2
H2O
A
0.073
0.04
0.038
0.039
0.057
0.038
0.038
0.05
0.04
490
0.064
0.066
1
B
1.21
0.63
0.444
0.649
0.077
0.04
0.039
0.041
0.045
490
1.251
1.121
2
C
1.175
0.771
0.825
0.911
0.041
0.039
0.039
0.041
0.04
490
0.941
1.258
3
D
1.021
0.821
0.911
1.115
0.045
0.05
0.044
0.041
0.063
490
1.1
1.211
4
E
1.083
1.273
1.157
1.089
0.047
0.042
0.043
0.045
0.04
490
1.011
1.191
5
F
1.121
1.015
1.192
1.279
0.045
0.047
0.045
0.042
0.042
490
1.011
1.211
6
G
0.815
0.769
1.341
1.037
0.04
0.044
0.043
0.04
0.047
490
0.971
0.968
7
H
0.866
0.971
1.048
1.041
0.04
0.04
0.074
0.041
0.064
490
0.853
0.781
96 WELL PLATE Absorbance Endpoint Full Plate Wavelengths: 490 Read Speed: Normal Plate Type Read Results
149
