Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin 3 phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

VŨ THỊ BÍCH HUYỀN

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN

PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC

Mã số: 9.42.01.21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1: PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết

2: PGS.TS. Phạm Thị Tâm

HÀ NỘI- NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Vũ Thị Bích Huyền, nghiên cứu sinh khóa K34 Trường Đại học Sư

phạm Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan:

1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết và PGS.TS. Phạm Thị Tâm.

2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được

công bố.

3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày tháng năm

Nghiên cứu sinh

Vũ Thị Bích Huyền

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ

trợ, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân.

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến hai thầy, cô

giáo kính mến của mình, PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết (Trường Đại học Sư phạm Hà

Nội) và PGS. TS. Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội). Thầy cô là người trực

tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình chỉ bảo, định hướng, truyền đạt kiến thức cũng như

kinh nghiệm nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô luôn luôn

động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này.

Tôi xin cảm ơn nhóm nghiên cứu đã nhiệt tình hỗ trợ tôi thực hiện đề tài của

mình bao gồm Th.S Mẫn Hồng Phước (Viện Công nghệ sinh học), Th.S Cao Thị

Thanh Hương, ThS. Nguyễn Thị Hải Yến; Th.S Huỳnh Việt Tùng, ThS. Đặng Thị

Hồng Thắm và các sinh viên Đỗ Thanh Vân, Nguyễn Đăng Quang (ĐHSPHN),

Đàm Thận Quảng, Nguyễn Mạnh Hùng, Hà Huy Tùng (Viện ĐH Mở HN).

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các cán bộ - giảng viên - sinh viên trong bộ

môn Di truyền học - Hóa Sinh, các cán bộ - giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội đã ủng hộ tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện các nội dung trong đề

tài. Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Phòng

Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành chương trình học Nghiên cứu sinh tại Trường.

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ - giảng viên - sinh viên Khoa Công nghệ sinh học

- Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn để tôi có thể

triển khai thuận lợi các nội dung của đề tài.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến gia đình và bạn

bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền

DANH MỤC VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ và nghĩa Việt

1 A Adenine

2 Ala Alanine

3 Asn Asparagine

4 Asp Aspartic acid

5 bp Base pair

6 BHI Brain Heart Infusion

7 8 CFU C Colony Forming Units Cytosine

9 DNA Deoxyribonucleic acid (axit nucleic)

10 Gln Glutamine

11 Glu 12 Gly Glutamic acid Glycine

13 G 14 His Guanine Histidine

Ile

15 16 KIA Isoleucine Kligler Iron Agar

17 KP Kanagawa phenomenon

18 Leu Leucine

19 LPS Lipopolysaccharides

20 LD50 Lethal dose (Liều gây chết trung bình)

21 LB Luria Broth

22 Met Methionine

23 NCBI

Phe PCR Pro

24 25 26 27 OMPs

28 ORF National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) Phenylalanine Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Proline Outer membrane proteins (Protein màng ngoài) Open reading frame

(Khung đọc mở)

29 PBS Phosphate buffered saline

30 RRDR

Rifampicin-resistance determining region (Vùng xác định kháng rifampicin)

31 RNA Ribonucleic acid

Serine 32 Ser

TDH-related haemolysin 33 TRH

Thermostable direct haemolysin 34 TDH

Thermolabile haemolysin 35 TLH

Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose 36 TCBS

37 Thr Threonine

38 RPS Relative percent survival

(Tỉ lệ bảo hộ)

39 T Tymine

40 Tyr Tyrosine

41 Val Valine

42 & cs Và cộng sự

42 VPGs Vibrio parahaemolyticus ghosts

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài .................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 3

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 3

4. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 4

5. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................ 4

6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................. 4

7. Tính mới, tính độc đáo của đề tài ............................................................................ 4

8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................ 5

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 6

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một

số loài cá ........................................................................................................................ 6

1.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio ........................ 6

1.1.2. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus ......................................................... 8

1.1.3. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin ................................................... 9

1.1.4. Gen rpoB và tính kháng rifampicin .................................................................. 12

1.1.5. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ...................................... 14

1.2. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển .......................................................................... 15

1.2.1. Triệu chứng .................................................................................................... 15

1.2.2. Chẩn đoán và điều trị ...................................................................................... 17

1.3. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động .................................................................... 18

1.3.1. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá ................................................................ 18

1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương ........................................................................ 21

1.3.3. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá ............................................................ 23

1.4. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng

bệnh cho cá ................................................................................................................... 25

1.4.1. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý ............................................... 25

1.4.2. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học ........................................... 26

1.4.3. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen ................................................... 32

1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá .......... 35

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 35

1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................................... 38

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 41

2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 41

2.1.1. Cá bệnh .......................................................................................................... 41

2.1.2. Cá thí nghiệm ................................................................................................. 41

2.1.3. Vi khuẩn ......................................................................................................... 41

2.1.4. Hóa chất ......................................................................................................... 41

2.1.5. Thiết bị ........................................................................................................... 42

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 43

2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính ....................................................................... 43

2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh .................. 43

2.2.3. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn ........................................................... 44

2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram .............................................................................. 44

2.2.5. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ...................... 44

2.2.6. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của

chủng vi khuẩn ......................................................................................................... 44

2.2.7. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn .................................................... 47

2.2.8. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin ..................................................... 48

2.2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin. .......... 49

2.2.10. Nhóm phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 50

2.2.10.1. Phương pháp thiết kế mồi ....................................................................... 50

2.2.10.2. Phương pháp tách DNA tổng số ............................................................. 50

2.2.10.3. Phương pháp PCR, giải trình tự gen ....................................................... 50

2.2.11. Phương pháp tin sinh ..................................................................................... 52

2.2.12. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi

khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam ................................................................. 52

2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực

trên cá mú ................................................................................................................ 53

2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 54

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 55

3.1. Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận ................. 55

3.1.1. Phân lập vi khuẩn Vibrio ................................................................................. 55

3.1.2. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập ............................. 58

3.1.3. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử ......... 62

3.1.4. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập ......... 65

3.1.5. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn

phân lập .................................................................................................................... 68

3.2. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực ................................. 78

3.2.1. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin ............................... 78

3.2.2. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực ..................... 90

3.2.3. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng

vi khuẩn dại .............................................................................................................. 90

3.2.3.1. So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn

dại ........................................................................................................................ 90

3.2.3.2. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực ................ 99

3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn

giảm độc lực ............................................................................................................... 104

3.3.1. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực ..... 104

3.3.2. Xác định tính an toàn của dòng L4650 ........................................................... 106

3.3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở

cá mú ..................................................................................................................... 107

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 112

4.1. Kết luận ............................................................................................................... 112

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 113

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................................ 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 115

Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................................... 115

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính ............................................................... 43

Hình 2.2. Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú ............................... 48

Hình 3.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS ........................ 57

Hình 3.2. Phản ứng lên men trên môi trường KIA (A) và phản ứng sinh indol với

thuốc thử Kovac (B) của các mẫu vi khuẩn ............................................ 59

Hình 3.3. Vi khuẩn VCTT 12233 (A) và HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi

bọt khi thử nghiệm với H2O2 ................................................................... 60

Hình 3.4. Vi khuẩn LBT6 gây hiện tượng tan huyết trên môi trường thạch máu (A)

và có khả năng di động trên môi trường LB bán lỏng (B) ...................... 60

Hình 3.5. Vi khuẩn N13.1.1 nuôi trên BHI agar với 5 đĩa giấy kháng sinh ............ 61

Hình 3.6. DNA tổng số của các vi khuẩn điện di trên gel agarose ......................... 62

Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi

toxR-4, toxR-7 .......................................................................................... 64

Hình 3.8. Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh của các mẫu vi khuẩn với

cặp mồi tlhF-tlhR .................................................................................... 65

Hình 3.9. Cá mú chết ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) và ở ngày thứ 9

sau gây nhiễm chủng LBT6 với hiện tượng nội tạng bị tổn thương

nghiêm trọng (B) ..................................................................................... 66

Hình 3.10. Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR của các chủng vi khuẩn

với cặp mồi toxR2, toxR4 ........................................................................ 68

Hình 3.11. So sánh hai trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi

toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) và toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB) ......... 70

Hình 3.12. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen toxR của các chủng V.

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen toxR hoàn

chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 .......................................... 71

Hình 3.13. Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh của các chủng vi khuẩn

với cặp mồi tlh1- tlh3 .............................................................................. 72

Hình 3.14. So sánh hai trình tự gen tlh của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi

tlhF - tlhR (LBT6-tlh-seqA) và tlh1-tlh3 (LBT6-tlh-seqB) ........................ 74

Hình 3.15. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen tlh của các chủng V.

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen tlh hoàn

chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 .......................................... 75

Hình 3.16. Sản phẩm PCR (~984 bp) gen rpoB của các chủng vi khuẩn với cặp mồi

1110F-CM32b ......................................................................................... 76

Hình 3.17. Tỉ lệ sống sót của cá ngựa vằn sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn

phát sinh từ chủng dại A3.3 .................................................................... 78

Hình 3.18. Cá ngựa vằn chết do nhiễm khuẩn A3.3 sau 12 giờ ............................... 79

Hình 3.19. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh

từ chủng dại A3.3 .................................................................................... 80

Hình 3.20. Cá rô phi chết do nhiễm vi khuẩn (A) A3.3; (B) A400 ......................... 80

Hình 3.21. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh

từ chủng dại LBT6 .................................................................................. 83

Hình 3.22. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm bằng các dòng vi khuẩn phát

sinh từ chủng vi khuẩn dại B3.13 ............................................................ 87

Hình 3.23. Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực ....................... 90

Hình 3.24. Sản phẩm PCR gen toxR của các dòng giảm độc lực trên gel agarose .. 91

Hình 3.25. Sản phẩm PCR gen tlh của các dòng giảm độc lực trên gel agarose .... 91

Hình 3.26. Sự tương đồng vị trí các amino acid Ser152, Gly203, Asn247 và His392

của TLH ở 3 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus LBT6, A3.3, B3.13 và

VvPla của chủng V. vulnificus ................................................................. 97

Hình 3.27. Mô hình cấu trúc 3D protein TLH của chủng vi khuẩn LBT6 (A) và

dòng L4650 (B) ....................................................................................... 98

Hình 3.28. Vị trí xoắn a 250-252 của TLH ở các dòng vi khuẩn và chủng dại khi

được xây dựng bằng phần mềm Phyre2 .................................................. 99

Hình 3.29. Sản phẩm PCR của gen rpoB ở các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus

giảm độc lực trên gel agarose 1% ......................................................... 100

Hình 3.30. Cá mú bình thường (A) và cá mú bị chết do vi khuẩn LBT6 (B) ........ 105

Hình 3.31. Đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn LBT6 và dòng L4650 .. 105

Hình 3.32. Tỉ lệ cá chết cộng dồn khi được tiêm với chủng LBT6 và dòng L4650

............................................................................................................... 106

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus .............................. 7

Bảng 1.2. Danh sách một số vắc-xin được cấp phép sử dụng cho cá ...................... 20

Bảng 2.1. Trình tự và đặc điểm của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR .......... 51

Bảng 3.1. Các vi khuẩn phân lập từ mẫu cá bị bệnh ................................................ 55

Bảng 3.2. Đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập ................................. 58

Bảng 3.3. Đặc tính kháng 5 loại kháng sinh của 11 mẫu vi khuẩn phân lập ............ 61

Bảng 3.4. Sự có mặt của các gen độc tố ở các mẫu vi khuẩn phân lập .................... 63

Bảng 3.5. Tỉ lệ sống sót của các mú khi gây nhiễm với chủng vi khuẩn phân lập .. 66

Bảng 3.6. So sánh trình tự gen toxR của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các trình tự

trên NCBI bằng công cụ BLAST ................................................................ 69

Bảng 3.7. So sánh trình tự gen tlh của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các

trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST ............................................... 73

Bảng 3.8. So sánh trình tự gen rpoB của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các

trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST ............................................... 76

Bảng 3.9. Giá trị LD50 của chủng A3.3 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin ... 81

Bảng 3.10. Giá trị LD50 của chủng LBT6 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 84

Bảng 3.11. Giá trị LD50 của chủng B3.13 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin 87

Bảng 3.12. Sự thay đổi nucleotide của gen tlh ở các dòng giảm độc lực so với các

chủng dại ................................................................................................. 92

Bảng 3.13. Những vị trí amino acid thay đổi trong đoạn trình tự gen rpoB (930 bp)

của các dòng giảm độc lực so với các chủng dại .................................. 101

Bảng 3.14. Đánh giá tính ổn định độc lực của dòng vi khuẩn L4650 ................... 104

Bảng 3.15. Đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam được tiêm vắc-xin L4650 sau

15 ngày và 60 ngày ................................................................................ 107

Bảng 3.16. Tỉ lệ cá chết và tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá được tiêm vắc-xin L4650 ở

các khoảng thời gian khác nhau ............................................................ 110

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Với lợi thế bờ biển dài (3.260 km) lại trải suốt từ Bắc đến Nam, tiềm năng

kinh tế từ biển của nước ta là rất lớn. Nghề đánh bắt và khai thác thủy hải sản có từ

ngàn đời xưa đang ngày càng khẳng định vị trí và vai trò là ngành kinh tế mũi nhọn,

đóng góp to lớn vào nền kinh tế quốc dân. Theo Tổng cục Thống kê, năm 2018

GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 3,43% toàn nền kinh tế và

23,57% toàn ngành nông nghiệp, tăng trưởng 6,46% so với năm 2017, đạt tốc độ

tăng trưởng cao nhất trong ngành nông nghiệp, đóng góp 0,22 điểm phần trăm vào

tăng trưởng chung toàn ngành nông nghiệp và cả nước [187].

Ngành nuôi trồng thủy sản nước ta liên tục tăng trưởng trong suốt 17 năm qua

cả về diện tích và sản lượng. Tổng sản lượng thủy sản nước ta năm 2018 đạt 7,76

triệu tấn, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng đạt 4,15 triệu tấn (chiếm 53,48%);

tăng 6,7% so với năm 2017 [183]. Nhiều loài cá có giá trị kinh tế được nuôi phổ

biến như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron

canadum), cá mú (Epionephelus spp)… Sản lượng cá nuôi lồng đạt 32 nghìn tấn

trên diện tích nuôi 6.000 ha [183]. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam

cũng như trên thế giới luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt

những tổn thất do bệnh dịch gây ra. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên

Hiệp Quốc (FAO), bệnh dịch gây thiệt hại cho ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu

hơn 6 tỷ USD mỗi năm, xảy ra ở hầu hết các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, ước

tính mỗi năm ngành thủy sản thiệt hại gần 1 tỷ USD do bệnh dịch gây ra [22].

Bệnh hoại tử gan thận cá phát hiện ở 14 quốc gia, trên 48 loài cá khác nhau,

trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được biết là do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra [112]. Cá bị bệnh này thường biểu hiện các triệu chứng

đặc trưng: xuất hiện các đốm đỏ, lở loét da, vẩy tróc, vây mòn cụt, nội quan xuất

huyết, đặc biệt ở gan và thận, cá bị bệnh có thể chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến

90% [112, 138]. Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận làm cá

chết hàng loạt với số lượng lớn được báo cáo hằng năm ở cá nuôi lồng thuộc các

tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa - Vũng

Tàu… [184, 185, 186].

Cho đến nay, việc kiểm soát và điều trị bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi của

người nuôi cá chủ yếu là sử dụng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn V.

parahaemolyticus [34, 61]. Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh một cách thường xuyên

và thiếu sự kiểm soát chặt chẽ trong điều trị bệnh trên cá đã dẫn tới hiện tượng

kháng thuốc ở nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [26]. Mặt khác, dư lượng kháng sinh

trong sản phẩm từ cá gây ảnh hưởng chất lượng thực phẩm cũng như sức khỏe của

người tiêu thụ [107]. Do đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh là một giải pháp hiệu quả

và mang đến sự phát bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta.

Vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt,

vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [125]. Hầu

hết các vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn cho cá đã được thương mại hóa trên thế giới là

vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn cao của loại vắc-xin này. Tuy nhiên, vắc-xin bất

hoạt được đánh giá là có thời gian bảo hộ không dài [152]. Mặc dù, đã có một vài

nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tái tổ hợp hoặc vắc-xin DNA phòng bệnh

do vi khuẩn V. parahaemolyticus ở cá đã được công bố, nhưng cho đến nay các vắc-

xin như thế được cấp phép thương mại hóa để sử dụng trên cá là chưa có. Vắc-xin

nhược độc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực đang là một hướng nghiên cứu có nhiều

triển vọng ứng dụng trong sản xuất vắc-xin thương mại cho cá nhờ khả năng cho tỉ

lệ bảo hộ cao và thời gian bảo hộ dài.

Tạo được chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc có khả năng gây đáp

ứng miễn dịch cho cá có ý nghĩa quan trọng và mang tính quyết định sự thành bại

của việc phát triển loại vắc-xin nhược độc. Vì vậy, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn

giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận là

rất cần thiết, phù hợp với xu hướng và mang đến triển vọng ứng dụng cao trong

phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế.

Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu tạo chủng vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin

phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển” được tiến hành nhằm tạo

làm cơ sở ban đầu cho việc hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoạt tử gan

thận ở cá biển.

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Mục tiêu chung

Tạo được chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả

năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin

sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi lồng có

giá trị kinh tế.

2.2. Mục tiêu cụ thể

- Tạo được vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây

bệnh hoại tử gan thận cá phân lập được bằng phương pháp xử lý với kháng sinh

rifampicin.

- Xác định được cơ sở di truyền liên quan đến những biến đổi trình tự

nucleotide trong các gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) và

gen rpoB ở các dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực.

- Đánh giá được khả năng bảo hộ của dòng vi khuẩn giảm độc lực đã tạo ra.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập và xác định các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus

gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi (cá mú, cá hồng, cá bớp) tại

vùng biển miền Bắc Việt Nam.

- Nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực từ các

chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp xử lý các chủng gây bệnh với

rifampicin và phân tích những sai khác về trình tự nucleotide của một số gen mã

hoá protein độc tố (toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB của các dòng V.

parahaemolyticus giảm độc lực so với vi khuẩn dại.

- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng V. parahaemolyticus trên

loài cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) và chọn dòng V. parahaemolyticus

làm ứng viên nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi.

4. Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số

loài cá biển.

5. Phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng

biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu

(Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) và các dòng đột biến giảm độc lực

được tạo ra.

6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

6.1. Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp thêm cơ sở dữ liệu các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh

hoại tử gan thận cho cá nuôi ở một số vùng biển miền Bắc về các đặc điểm hình

thái, hóa sinh và khả năng kháng kháng sinh, đồng thời, cung cấp cơ sở khoa học

cho các nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp chẩn đoán bệnh.

Phát hiện những đột biến trong gen độc tố và gen ropB của các dòng V.

parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực là có ý nghĩa khoa học góp phần

định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển vắc-xin sống nhược

độc sử dụng trong phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng.

Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ (RPS) của dòng V. parahaemolyticus giảm

độc lực đối với bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam (E. coioides) đã cung

cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh cho cá biển nuôi

lồng.

6.2. Ý nghĩa thực tiễn

Vi khuẩn V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng

miễn dịch sẽ là ứng viên để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá mú

chấm cam cũng như một số loài cá biển khác.

7. Tính mới, tính độc đáo của đề tài

Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu tạo vi khuẩn V.

parahaemolyticus giảm độc lực làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin nhược độc

phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển bằng phương pháp xử lý kháng sinh

rifampicin.

Lần đầu tiên kích thước đầy đủ của gen tlh ở vi khuẩn V. parahaemolyticus

được nhân bản thành công. Phát hiện được các sai khác trình tự nucleotide trong các

gen tlh và rpoB giữa các dòng giảm độc lực và chủng dại, cung cấp cơ sở di truyền

chứng minh mối liên quan giữa các đột biến trong gen độc tố tlh và gen rpoB với

tính giảm độc lực ở vi khuẩn V. paraheamolyticus.

Chọn được dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 là ứng viên tiềm

năng cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan

thận trên một số loài cá biển nuôi lồng. Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu

hiện ổn định về độc lực, tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam (Epinephelus

coioides) được tiêm liều 100 µl/con, 105 CFU/ml đạt 100%. Tỉ lệ bảo hộ (RPS)

cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15

ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm chủng.

8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền -

Hóa sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh

học, Viện Đại học Mở Hà Nội.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận

ở một số loài cá

1.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio

Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều loài thủy sản bao gồm

cả tôm, cá. Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus thuộc [56]:

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria

Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae

Chi: Vibrio

Loài: V. parahaemolyticus

V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, dạng hình dấu phẩy, kích thước

khoảng (0,5-0,8) x (1,4-2,4) µm, không sinh bào tử, có tiên mao, có khả năng di

động, kỵ khí không bắt buộc, ưa môi trường kiềm mặn và có thời gian thế hệ là 8 -

9 phút [30]. V. parahaemolyticus thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu

hết các vùng biển trên thế giới, phân lập được từ cát, bùn và nước biển, cũng như ở

thủy sản bị bệnh [150]. Trên môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-

Salts-Sucrose), khuẩn lạc của V. parahaemolyticus có mầu xanh đậm, dạng tròn đều và

bóng với kích thước từ 2 - 3 mm [101]. Vì thế, môi trường TCBS thường được dùng

để chọn lọc các loài thuộc vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, sử dụng môi trường TCBS

để chọn lọc vẫn không phân biệt được V. parahaemolyticus với Vibrio vunlnificus và

Vibrio mimicus [27]. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể được phân biệt

với nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype). Kiểu huyết thanh O4:K48; O1:K6;

O3:K6 được phát hiện phổ biến trong các mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là vi khuẩn

có kiểu huyết thanh O3:K6 [101].

Đặc điểm sinh hóa là loại chỉ tiêu rất quan trọng để định danh một loài vi

khuẩn cụ thể. Vi khuẩn V. parahaemolyticus có các đặc điểm hóa sinh đặc trưng

như: có khả năng sinh enzyme catalase, sinh enzyme oxidase, khả năng sử dụng

lysine, ornithine, arginine, khả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose,

không sinh H2S, sinh indole và có khả năng di động (Bảng 1.1) [14].

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. parahaemolyticus [14]

Các phản ứng sinh hóa

Sinh catalase Sinh oxidase Phản ứng lên men yếm khí Phản ứng lên men hiếu khí Sinh beta – galactosidase Agrinine Lysine Ornithine Sử dụng citrate Sinh H2S Sinh urease Sinh tryptophane Sinh indole Phản ứng Voges - Proskauer Sinh gelatinase Sử dụng đường Glucose

Manitol Inositol Sorbotol Rhamnose Sucrose Melibiose Amygdalin Arabinose Lactose

V. parahaemolyticus + + + + - - + - - - - - + + + + + - - - - - + - -

Ghi chú: (+) dương tính, (-) âm tính

Một trong những đặc tính sinh hóa quan trọng của vi khuẩn V. parahaemolyticus

là phản ứng KP (Kanagawa phenomenon). Đây là phản ứng làm tan huyết dạng β

(tan huyết hoàn toàn, xuất hiện vòng ly giải trong suốt quanh khuẩn lạc) cho kết quả

dương tính KP do vi khuẩn sinh độc tố haemolysin phá hủy hồng cầu trên môi

trường thạch máu [101]. V. parahaemolyticus là vi khuẩn hiếu khí tùy ý có thể sinh

trưởng ở điều kiện có hoặc không có O2 [53]. Sự phân bố của V. parahaemolyticus

trong môi trường tự nhiên có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ của môi trường

nước. Vi khuẩn này có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5℃- 43℃, tối ưu ở

37℃. Ở vùng nước có nhiệt độ trên 15℃, V. parahaemolyticus xuất hiện quanh

năm, mật độ vi khuẩn tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [163]. Độ pH

cũng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và sự vận động của V.

parahaemolyticus. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được đều phát

triển được trên môi trường NB (Nutrient Broth) với pH từ 4,8 đến 11; tuy nhiên, ở

môi trường pH 9,0 vi khuẩn V. parahaemolyticus không sản xuất ra haemolysin, pH

tối ưu là 7,8 - 8,6 [159]. Khả năng di động bằng tiên mao của vi khuẩn V.

parahaemolyticus bị hạn chế trong môi trường có tính kiềm, nhưng khả năng này

không bị ảnh hưởng trong môi trường trung tính và acid. Sự sinh trưởng của vi

khuẩn này bị ức chế khi có mặt acid acetic 0,1%; pH 5,1 [49]. V. parahaemolyticus

là vi khuẩn ưa môi trường kiềm mặn, sinh trưởng được ở nồng độ NaCl từ 0,5 -

10% và nồng độ NaCl 3% là tối ưu cho sự phát triển [30]; không mọc được môi

trường thiếu muối (0%) hoặc nồng độ muối quá cao [14, 172]. Theo Broberg và

cộng sự (2011), V. parahaemolyticus có khả năng di động bằng tiên mao với vận

tốc 60 μm/s trong môi trường độ mặn thích hợp và pH 8,0 [30].

Vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho rất nhiều động vật thủy sản: bệnh

hoại tử gan thận ở cá, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm, bệnh trên động vật có

vỏ (nghêu, trai, hàu) và gây bệnh viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) trên người khi

bệnh nhân ăn hải sản chứa vi khuẩn chưa được nấu chín. Trên mỗi vật chủ khác

nhau vi khuẩn này sẽ có cơ chế gây bệnh và những triệu chứng đặc trưng [126].

1.1.2. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus

Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được xác định hoàn chỉnh [21,

68, 76] bao gồm 2 nhiễm sắc thể dạng vòng: Nhiễm sắc thể I có kích thước lớn

khoảng 3,2 - 3,3 Mb, chứa hơn 3.000 gen; nhiễm sắc thể II có kích thước nhỏ hơn

khoảng 1,7 - 1,8 Mb, chứa hơn 1.700 gen.

Phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_14, Ahn và cộng

sự (2016) đã ghi nhận 2 nhiễm sắc thể dạng vòng có kích thước 3.241.330 bp và

1.997.247 bp với 4.274 gen mã hóa protein, 160 gen RNA; 01 plasmid (51.383 bp)

và 01 phage (96.896 bp) [21].

Kim và cộng sự (2016) khi phân tích hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus

FORC_08 đã báo cáo hệ gen với 02 nhiễm sắc thể dạng vòng nhưng không có

plasmid. Nhiễm sắc thể I có kích thước 3.266.132 bp với 2.909 ORFs, 115 gen

tRNA, 28 gen rRNA. Trong số 2.909 ORFs có 2.513 ORFs (86,39%) mã hóa

protein chức năng và 539 ORFs mã hóa cho các protein chưa xác định được. Nhiễm

sắc thể II có kích thước 1.772.036 bp chứa 1585 ORFs, 14 gen mã hóa tRNA và

rRNA. Trong số 1.585 ORFs có 1.245 ORFs mã hóa các protein chức năng và 340

ORFs mã hóa các protein giả định [68].

1.1.3. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin

Độc tố tan huyết (haemolysin) là một trong những ngoại độc tố gây bệnh chủ

yếu của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ. Haemolysin có khả năng

bám lên màng tế bào hồng cầu của vật chủ, gây thủng màng và giải phóng

haemoglobin, kết quả là tạo ra hiện tượng tan huyết (β-haemolysin). Phân tử β-

haemolysin có khả năng phân hủy sphingomyelin, một loại phospholipid màng tế

bào hồng cầu của cừu. Trong nhiều trường hợp, phạm vi tấn công của

haemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng đến các tế bào

biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào đa nhân làm tăng cường độc tố và gây

phá hủy các mô. Hầu hết các vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh phẩm đều có khả

năng gây hiện tượng tan huyết, trong khi chỉ 1 - 5% các chủng vi khuẩn phân lập

từ môi trường là có khả năng gây hiện tượng tan huyết [63]. Do vậy, haemolysin

được coi là một trong những độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để

nhận biết các chủng độc hại.

Vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể sản sinh 3 loại protein haemolysin: TDH

bền nhiệt (thermostable direct haemolysin), TRH (TDH-related haemolysin) và

TLH không bền nhiệt (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen lần lượt

tương ứng là tdh, trh và tlh [149].

Gen tdh và trh tham gia vào quá trình gây độc của vi khuẩn V.

parahaemolyticus [109, 132, 168, 178]. Haemolysin TDH tồn tại dạng bốn cấu

tử (tetramer) trong dung dịch và có hoạt tính tan huyết cao. Dạng tetramer của

TDH có một lỗ trung tâm với đường kính là 23 Å và sâu 50 Å [169]. Gen trh mã

hóa cho TRH không bền nhiệt, loại haemolysin này dễ dàng bị biến tính ở điều

kiện nhiệt độ 60℃ trong thời gian 10 phút. Các gen độc tố này được phát hiện

trong hệ gen của V. parahaemolyticus bằng kĩ thuật PCR. Tuy nhiên, sản phẩm

PCR khuếch đại gen tdh, trh đã được công bố cho đến nay là không thống nhất,

tùy thuộc cặp mồi đã được thiết kế và sử dụng. Cụ thể: sản phẩm PCR khuếch

đại từ gen tdh có kích thước 223 bp [45]; 247 - 251 bp [50, 96, 99]; 269 bp

[134]; 460 bp [141] và 668 bp [171]. Tương tự, sản phẩm PCR khuếch đại từ gen

trh cũng có kích thước rất khác nhau: 250 bp [24]; 354 bp [50]; 500 bp [33] và

623 bp [141].

Paria và cộng sự (2019) dựa trên các trình tự ở hệ gen của các chủng V.

parahaemolyticus khác nhau đã công bố xác định được kích thước 189 amino acid

tương ứng với kích thước gen trh hoàn chỉnh là 570 nucleotide, đồng thời xây dựng

được cấu trúc không gian của phân tử protein TRH [118]. Các kết quả công bố cũng

đã chỉ ra rằng, không phải bất cứ chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus nào cũng đều

mang gen tdh, trh. Theo Nishibuchi và cộng sự (1995), chỉ có 1 - 5% các chủng V.

parahaemolyticus mang các gen này [111]. Tương tự, Rojas và cộng sự (2011) cũng

nhận định trong các mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên con trai và con

hàu chỉ có 10,5% mẫu được phát hiện có gen tdh và không được phát hiện thấy gen

trh [134]. Trong mẫu V. parahaemolyticus phân lập từ hàu, Deepanjali và cộng sự

(2005) báo cáo chỉ có 3/49 (chiếm 6,1%) phát hiện có gen tdh [43]. Xie và cộng sự

(2005) phân lập được 7 chủng V. parahaemolyticus từ tôm, cá mắc bệnh và nước

biển thuộc đầm nuôi thủy sản tại Quảng Tây (Trung Quốc). Bẩy chủng vi khuẩn

phân lập này cùng 01 chủng V. parahaemolyticus VPL4-90 được cung cấp từ viện

Vi sinh học Quảng Đông (Trung Quốc) đều không phát hiện được sự có mặt của hai

gen độc tố tdh và trh [166]. Gen tdh cũng không được phát hiện trong 23 mẫu vi

khuẩn V. parahaemolyticus do Chakraborty và cộng sự (2008) phân lập được từ

mẫu cá da trơn, động vật thân mềm dạng chân đầu (cephalopod), động vật có vỏ.

Chỉ duy nhất 01 mẫu trong số đó là có chứa gen trh [33]. Trong 39 mẫu vi khuẩn V.

parahaemolyticus phân lập từ cá tại vùng Chengicherla, Hyderabad (Ấn Độ), chỉ có

5,7% và 26,6% chứa tương ứng lần lượt gen tdh và trh [109]. Tại Việt Nam,

Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012) báo cáo sự vắng mặt của hai gen độc tố trh và

tdh trong hệ gen của 05 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên thủy sản ở

Nha Trang [3].

Gen tlh mã hóa haemolysin TLH có trình tự amino acid bảo thủ đặc trưng cho

Vibrionaceae. Sản phẩm PCR khuếch đại gen này có kích thước 450 bp [70, 170],

hoặc 113 bp [52]. Phân tích trình tự genome của V. parahaemolyticus nhận thấy

khung đọc mở (open reading frame, ORF) của gen tlh dài 1254 bp, mã hóa cho trình

tự 417 amino acid [68]. Gen tlh có tiềm năng sử dụng làm chỉ thị trong chẩn đoán

bệnh Vibrio cũng như trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin điều trị bệnh thủy sản [64].

Protein TLH được phát hiện ở tất cả các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ

mẫu bệnh phẩm cũng như từ môi trường và sự biểu hiện của gen tlh sẽ được tăng

lên một cách đáng kể khi vi khuẩn nhiễm bệnh cho vật chủ [49]. TLH là loại protein

không bền nhiệt (bị bất hoạt ở 60℃ sau 10 phút), có hoạt tính phospholipase; có khả

năng làm tan huyết, phá hủy tế bào hồng cầu, tham gia vào quá trình gây độc của vi

khuẩn [158]. Cấu trúc không gian của TLH ở V. parahaemolyticus như thế nào hiện

vẫn chưa có công bố nhưng TLH (VvPlpA) của Vibrio vulnificus đã được Wan và

cộng sự (2019) báo cáo. Theo báo cáo này, TLH là một phospholipase A2, tiết ra

bởi vi khuẩn V. vulnificus và các chủng vi khuẩn Vibrio khác. VvPlpA có chứa đầu

N-terminal và C-terminal chưa rõ chức năng được đóng gói chặt với nhau, vùng gấp

SGNH có hoạt tính hydrolase điển hình với 4 vị trí xúc tác có tính bảo tồn Ser152,

Gly203, Asn247 và His392 và có thể liên kết với ion chloride nằm gần vùng xúc tác

His392. Mô hình cấu trúc 3D này là đầu tiên và duy nhất cho đến nay được xây

dựng bằng phương pháp X-ray đối với họ protein TLH của Vibrio spp. tính đến thời

điểm này [155].

Gen toxR nằm trong operon toxRS (Vp-toxRS) mã hóa cho protein điều hòa có

vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh sự tồn tại cũng như độc lực của vi khuẩn. Gen

toxR tham gia kiểm soát biểu hiện của một số gen như gen độc tố tdh, gen mã hóa

protein màng ompU [81], các gen thuộc hệ thống bài tiết loại III (T3SSs): T3SS1

trên NST số II và T3SS2 trên NST số II [59, 93]. Các protein của hai hệ thống này

có vai trò trong sự vận chuyển các tác nhân hoặc protein độc tố một cách trực tiếp

vào tế bào chất của tế bào chủ [41]. Gen toxR kìm hãm hoạt động phiên mã của các

gen thuộc hệ thống T3SS1 thông qua việc kích hoạt chất ức chế CalR [114, 180].

Trình tự gen toxR có tính bảo tồn đặc trưng loài nên được sử dụng làm gen đích để

xây dựng phương pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus trong mẫu thủy sản

bằng kỹ thuật PCR [181]. Hầu hết các nghiên cứu đều công bố sản phẩm PCR

khuếch đại gen toxR trong hệ gen của V. parahaemolyticus bằng cặp mồi F-

GTCTTCTGACGCAATCGTTG và R-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG cho sản

phẩm có kích thước 368 bp [70, 141, 182].

1.1.4. Gen rpoB và tính kháng rifampicin

Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase, enzyme lõi

RNA polymerase (RNA polymerase core enzyme) gồm 5 tiểu đơn vị: 2 chuỗi α,

1 chuỗi β, 1 chuỗi β' và 1 chuỗi ω. Hai chuỗi α có vai trò gắn kết các tiểu đơn vị.

Tiểu đơn vị β và β' là trung tâm xúc tác của enzyme RNA polymerase, trong đó

tiểu đơn vị β có vai trò liên kết DNA khuôn, trình tự RNA đang tổng hợp và các

ribonucleotide tự do. Trong quá trình phiên mã, enzyme lõi liên kết với DNA

khuôn, sau đó yếu tố σ liên kết với tiểu đơn vị β, hình thành dạng holoenzyme

nhận biết và liên kết vào trình tự khởi đầu (promoter) để bắt đầu quá trình phiên

mã [108].

Một số kháng sinh (đặc biệt là rifampicin và fidamomicin) có thể liên kết vào

enzyme RNA polymerase gây ức chế quá trình phiên mã [108]. Rifampicin có khả

năng liên kết với tiểu đơn vị β - protein được mã hóa bởi gen rpoB, gây cản trở sự

khởi đầu phiên mã của vi khuẩn [32]. Cơ chế, vị trí liên kết của kháng sinh với

enzyme RNA polymerase là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu phát triển kháng

sinh tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Sự mất tương đồng về cấu trúc của rifampicin với

tiểu đơn vị β dẫn đến rifampicin không thể liên kết được với enzyme là nguyên

nhân dẫn đến việc kháng rifampicin ở các vi khuẩn gây bệnh. Đã có nhiều nghiên

cứu phát hiện những đột biến xảy ra ở trong gen rpoB và được xem là nguyên nhân

đưa đến xuất hiện tính kháng rifampicin ở một số vi khuẩn như Mycobacterium

tuberculosis, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, V.

parahaemolyticus [54, 102, 124, 175].

Kích thước gen rpoB là 4.029 bp mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 1.342

amino acid. Vị trí nucleotide bị đột biến có thể ảnh hưởng đến mức độ kháng

rifampicin của vi khuẩn. Vùng trình tự 81 bp trên gen rpoB (từ bộ ba mã hóa 507

đến bộ ba 533, mã hóa 27 amino acid) được gọi là vùng xác định kháng rifampicin

(rifampicin-resistance determining region, RRDR) [175]. Những đột biến xuất hiện

trong vùng RRDR có liên quan đến tính kháng rifampicin của vi khuẩn. Các bộ ba

513, 516, 526, 531 của vùng này có tần suất đột biến rất cao [131, 175]. Đột biến

cũng được báo cáo xuất hiện ở bộ ba 509, 511, 512, 521, 522, 523, 528, 530, 533

[175]. Những đột biến xảy ra trên gen rpoB đặc biệt trong vùng RRDR sẽ ảnh

hưởng lớn đến cấu trúc tiểu đơn vị β của RNA polymerase. Sự thay đổi cấu trúc này

gây trở ngại cho sự nhận diện rifampicin, làm rifampicin không thể liên kết vào cấu

trúc của phân tử RNA polymerase, quá trình phiên mã tổng hợp protein của vi

khuẩn vì thế vẫn diễn ra. Những vi khuẩn này không bị diệt, sống sót và sinh sản

trên môi trường có rifampicin. Đây là hiện tượng vi khuẩn kháng rifampicin.

Những đột biến nằm ngoài vùng RRDR của gen rpoB cũng được phát hiện ở

một số chủng vi khuẩn M. tuberculosis kháng rifampicin. Cụ thể là, đột biến phát

sinh ở bộ ba 413, 435, 451, 490, 505, 535, 536, 538, 550, 572 và 645 [175]. Tuy

nhiên, vai trò của những đột biến ngoài vùng RRDR chưa được xác định rõ ràng.

Perez-Varela và cộng sự (2017) cho rằng những đột biến xảy ra trên tiểu đơn vị β

của RNA polymerase dẫn đến suy giảm khả năng di động cũng như độc lực của vi

khuẩn Acinetobacter baumannii [124]. Những chủng giảm độc lực, kháng

rifampicin của các loài vi khuẩn khác nhau có những thay đổi về sự sinh trưởng, sự

giảm độc lực và thay đổi về kiểu hình so với chủng dại [97, 102]. Đặc điểm kháng

rifampicin thường đi kèm với những biến đổi làm thay đổi cấu trúc của một số

protein [58]. Những dòng vi khuẩn kháng rifampicin xuất hiện những biến đổi ở

gen rpoB là có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của RNA polymaerase. Từ đó, gây

cản trở quá trình phiên mã của nhiều gen trong đó có các gen gây độc của vi khuẩn,

dẫn đến tính giảm độc lực của vi khuẩn.

Đối với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus, Hazen và cộng sự (2009) phát

hiện những điểm đột biến trên gen rpoB, cụ thể là ở các bộ ba 513, 526, 529,

531, 586 ở các chủng vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường chứa 100 µg/ml

rifampicin. Trong đó, 3/4 vị trí amino acid đột biến thuộc vùng RRDR và 1/4 vị trí

không thuộc vùng RRDR [54].

Peramachi và cộng sự (2018) qua phân tích về trình tự gen rpoB của các chủng

vi khuẩn đã xác định một số vị trí amino acid thuộc tiểu đơn vị β của RNA

polymerase giữ vai trò xúc tác của enzyme RNA polymerase: amino acid bảo tồn R

(Arg) và cặp amino acid YG (Tyr-Gly) có vài trò liên kết với mạch DNA khuôn

“gatekeeper/DNA template binding” YG. Khoảng cách của amino acid R và YG

được duy trì là 7 amino acid. Trong đó, 03 vị trí amino acid YG được xác định bao

gồm 555-556, 584-585 và 1281-1282 [123].

1.1.5. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Kháng nguyên O và K là hai loại kháng nguyên được phát hiện rất sớm ở V.

parahaemolyticus. Kháng nguyên lipopolysaccharides bền với nhiệt (kháng nguyên

O) và kháng nguyên nang chịu nhiệt kém (kháng nguyên K). Theo FDA (Cục quản

lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ), V. parahaemolyticus có 12 nhóm O và 65

loại K đã được xác định. Trong đó, ba kiểu kháng nguyên O4: K48; O1: K56 và O3:

K6 là phổ biến hơn [162].

Tính kháng nguyên của các protein màng khác cũng được nhiều nhà khoa học

nghiên cứu ở các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus. Các protein màng ngoài

(OMPs) của vi khuẩn Gram âm thường được nghiên cứu để phát triển vắc-xin hoặc

phát triển thuốc chống lại vi khuẩn gây bệnh. Shyne và cộng sự (2016) phát hiện 01

kháng nguyên bề mặt màng tế bào với trọng lượng phân tử 34 kDa ở trên 9 chủng

V. parahaemolyticus gây bệnh cho cá song điểm gai (Epinephelus malabaricus) và

cá mú chấm cam (E. coioides) [139]. Một số protein màng đã được xác định là

kháng nguyên và có khả năng tạo ra phản ứng miễn dịch bao gồm VPA1435,

VP0764, VPA1186, VP1061 VP2850 [78]; PsuA, PvuA [94]; OmpW, OmpV,

OmpU, OmpK [95]. Li và cộng sự (2014) đã phát hiện tám OMPs bao gồm LptD,

LamB, OmpA, OmpK, OmpU, VP0802, VP1243 và VP0966 là những kháng

nguyên của vi khuẩn V. parahaemolyticus. Bên cạnh đó, nhóm tác giả cũng khẳng

định những protein này có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cho cá. Trong số các

protein này, LptD là một loại protein có khả năng tạo phản ứng miễn dịch cao nhất

[77]. Dong và cộng sự (2014) đã xây dựng được cấu trúc phân tử của LptD với 26

nếp gấp β cùng với 6 protein khác (LptA, B, C, E, F và G) tạo thành một phức hợp

trên màng tế bào - phức hợp chịu trách nhiệm vận chuyển lipopolysaccharide qua

màng (LPS) [44]. LptD có tính bảo tồn và tương đồng với các protein trên bề mặt tế

bào của các vi khuẩn Vibrio. Đây là một loại protein kháng nguyên có tiềm năng

ứng dụng trong việc phát triển vắc-xin phòng bệnh do các loài Vibrio gây ra [176].

1.2. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển

1.2.1. Triệu chứng

V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận trên nhiều loài cá biển có giá

trị kinh tế, từ cá biển được nuôi lồng làm hải sản như cá chẽm (Lates calcarifer), cá

hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epionephelus spp)

đến một số loài cá cảnh biển như cá hề Sebae (Amphiprion sebae), đồng thời cũng

gây bệnh trên một số loài cá nước ngọt như cá ngựa vằn (Danio rerio). Vi khuẩn V.

parahaemolyticus ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14 nước

và gây bệnh trên khoảng 48 loài cá biển [6, 7, 100, 103, 112].

Bệnh hoại tử gan thận có biểu hiện đặc trưng như xuất hiện các đốm đỏ, vẩy

cá bị tróc, rụng dẫn đến vết lở loét ngày càng lan rộng và sâu, vây cá có thể bị mòn

cụt, xơ xác. Giải phẫu cá bị bệnh phát hiện xuất huyết nội tạng (đặc biệt là ở gan và

thận) và cả trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể chết hàng loạt khi ở thể cấp tính hoặc

chết rải rác khi cá ở thể thứ cấp tính [16, 112, 138]. Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở

hầu hết các nơi có nghề nuôi thủy sản nước lợ và nước mặn. Bệnh lây lan rất nhanh,

nếu không phát hiện kịp thời có khả năng gây chết rất cao. Bệnh thường xuất hiện

vào mùa nóng và đầu mùa mưa, khi môi trường thay đổi đột ngột làm cá dễ bị sốc.

Ở nhiệt độ cao, vi khuẩn sinh trưởng mạnh trong môi trường nước, xâm nhập và

gây bệnh cho cá, gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi.

Cá mú chấm cam (E. coioides) bị bệnh hoại tử gan thận xuất hiện các triệu

chứng ban đầu như cá bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá chuyển sẫm

mầu, các đốm đỏ xuất hiện trên thân. Sau đó, các đốm đỏ này phát triển thành

những vết loét rộng kèm theo biểu hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi. Cá

mú bị bệnh thường phát hiện hiện tượng gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích

dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp bệnh nặng [16]. Đối với cá giò

(Rachycentron canadum) bị bệnh có hiện tượng lở loét, xuất huyết gan, thận, vết

loét phát triển ăn sâu vào cơ, thân cá chuyển mầu đen, gan cá mầu xanh nhạt hoặc

mầu nâu, một số cá thể có các đốm trắng trong gan, dạ dày thường không có thức

ăn, có thể gây chết đến 45% ở cá giống và 90% ở cá thương phẩm [5]. Vi khuẩn V.

parahaemolyticus cũng là nguyên nhân gây xuất huyết cho cá Song giai đoạn

thương phẩm [6].

Ở Việt Nam, bệnh hoại tử gan thận được ghi nhận xuất hiện và làm cá chết

hàng loạt vào mùa hè năm 2008, 2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu (Phú

Yên), Cam Ranh (Khánh Hòa). Trong năm 2010 và đầu năm 2011, bệnh cũng xuất

hiện vào mùa hè, lúc giao mùa làm cá chết với tần suất cao tại nhiều cơ sở nuôi cá

mú trong ao và trong lồng nổi trên biển ở các tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu,

Quảng Ninh, Hải Phòng. Tháng 7 năm 2017, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông

thôn (NN&PTNT) Phú Yên thông báo có dịch bùng phát làm cá nuôi lồng tại tỉnh

này bị lở loét và chết hàng loạt, nguyên nhân là do vi khuẩn Vibrio gây ra, tại một

số thời điểm mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước tại khu vực thôn Phú Lương, An

Ninh Đông vượt giới hạn cho phép từ 1,37 - 2,42 lần; các chỉ tiêu khác đều nằm

trong giới hạn cho phép. Tính đến cuối tháng 7 năm 2017, tại vùng biển này, ước

khoảng 24.600 con cá bị chết, chiếm tỷ lệ 20% số cá nuôi, kích thước cá bị bệnh từ

0,4 - 1 kg/con [184]. Tháng 8 năm 2017, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng

Ngãi báo cáo về hiện tượng cá mú nuôi lồng chết với số lượng lớn có các triệu

chứng đặc trưng của bệnh hoại tử gan thận tại thôn Tuyết Diêm 1, xã Bình Thuận

(huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi). Qua phân tích nguyên nhân là do người dân

nhập nguồn giống từ tỉnh Khánh Hòa chưa qua kiểm dịch [185]. Cũng trong tháng 8

năm 2017, Sở NN&PTNT tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu báo cáo về tình trạng cá nuôi

trong lồng bè bị chết hàng loạt ở xã đảo Long Sơn (thành phố Vũng Tàu) với hơn

241.000 con cá (tương đương gần 90 tấn cá), chủ yếu là cá mú, cá chim, cá ria, cá

bớp của 23 hộ nuôi lồng bè trên sông Chà Và (xã Long Sơn, thành phố Vũng Tàu).

Qua phân tích cho thấy, cá có hiện tượng lột da, xuất huyết, tuột nhớt, biểu hiện lờ

đờ, bỏ ăn, nổi lên mặt nước và chết, các mẫu cá chết được phát hiện dương tính với

khuẩn Vibrio [186].

V. parahaemolyticus không chỉ gây bệnh cho cá biển nuôi lồng, nó còn có thể

gây bệnh cho cá biển cảnh. Nghiên cứu của Marudhupandi và cộng sự (2017) đã chỉ

ra rằng vi khuẩn này gây hoại tử trên vây và đuôi của cá hề Sebae (Amphiprion

sebae). Đây là một loại cá cảnh biển phân bố ở Ấn Độ Dương có giá trị kinh tế cao,

chiếm 20% giá trị kinh tế của ngành kinh doanh cá cảnh biển ở Ấn Độ [100].

1.2.2. Chẩn đoán và điều trị

Để chẩn đoán bệnh hoại tử gan thận do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra

trên cá cần dựa vào những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: xuất hiện các đốm đỏ, vẩy cá

bị tróc, rụng dẫn đến vết lở loét, vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác, xuất huyết nội

tạng (đặc biệt là ở gan và thận). Vi khuẩn V. parahaemolyticus được phát hiện trong

mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc TCBS và

phân tích đặc điểm hình thái, sinh hóa đặc trưng [27]. Về phương pháp phân tử, vi

khuẩn V. parahaemolyticus được xác định bằng phương pháp phân tích trình tự gen

16S rDNA [28], hoặc các gen độc tố đặc trưng (toxR, tlh, trh, tdh) [67, 158, 169,

178] của chủng vi khuẩn này.

Để điều trị bệnh hoại tử gan thận, sử dụng kháng sinh là phương pháp phổ

biến mà người nuôi cá sử dụng. Cá được cho ăn thức ăn trộn tetracycline,

streptomycine và oxolinic acid với liều lượng tương ứng 75 - 100 mg/kg cá, 50 - 75

mg/kg cá và 10 mg/kg cá liên tục trong 7 - 10 ngày [34]. Mặc dù, sử dụng kháng

sinh điều trị bệnh mang lại hiệu quả nhất định nhưng việc sử dụng kháng sinh

thường xuyên đã tạo ra các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc [26]. Shyne và

cộng sự (2008) báo cáo rằng trong các mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân

lập từ cá mú bệnh cho thấy hầu hết các mẫu đều kháng lại sulphadiazine và

amoxicillin, 87% kháng lại gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và

oxytetracycline [138]. Bên cạnh đó, lượng kháng sinh tồn dư trong cơ thể cá gây

ức chế hệ thống miễn dịch của cá, ảnh hưởng đến chất lượng thịt cá, từ đó gây

ảnh hưởng sức khỏe người tiêu thụ [107]. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị

bệnh cho động vật thủy sản cần được cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp.

Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi áp dụng bao

gồm sát trùng bể, ao nuôi cá và dụng cụ trong mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước

trước khi đưa vào sử dụng. Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn

thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ đề phòng các loại bệnh ký sinh

trùng và chú ý chất lượng thức ăn là những biện pháp người dân thường sử dụng để

phòng bệnh. Đây là những biện pháp phòng bệnh đơn giản, tổng hợp với mục đích

giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh và không mang tính chất phòng chống đặc hiệu cho

loại tác nhân gây bệnh xác định. Do vậy, trong một số hoàn cảnh nhất định, dịch

bệnh cho cá vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển.

Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho giống thủy hải sản bằng cách sử

dụng vắc-xin là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao, đã và

đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới. Bên cạnh đó, sử dụng

vắc-xin phòng bệnh chủ động cho động vật thủy sản sẽ hạn chế được việc sử dụng

kháng sinh cũng như hạn chế việc gia tăng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh.

Song, để sản xuất ra các loại vắc-xin đặc hiệu đem lại hiệu quả bảo hộ cao cho các

loài động vật thủy sản vẫn là một thử thách không nhỏ đối với các nhà khoa học.

1.3. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động

1.3.1. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá

Nghề nuôi cá, đặc biệt là cá biển nuôi lồng, là một ngành kinh tế mũi nhọn của

nhiều quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, ngư dân luôn phải đối mặt với dịch bệnh

bùng phát ở động vật thủy sản. Kháng sinh sử dụng để điều trị các bệnh do vi khuẩn

gây ra cho cá được đánh giá là có hiệu quả cao, nhưng cũng là tác nhân chọn lọc các

gen kháng thuốc gây ra hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh, ức chế hệ thống

miễn dịch của cá và kháng sinh có thể vẫn tồn dư trong thịt cá [107]. Vắc-xin phòng

bệnh cho cá được đánh giá là giải pháp hiệu quả và mang tính chất bền vững.

Một vắc-xin phòng bệnh cho cá cần đạt được những tiêu chuẩn như : (1) có

thể tạo được kháng thể bảo hộ cho cá, (2) sự bảo hộ của vắc-xin phải bền vững, lâu

dài, (3) có tính an toàn, (4) có tính ổn định và một số tiêu chuẩn khuyến khích khác

như, (5) có hiệu quả cho nhiều loài động vật thủy sản, (6) chi phí sản xuất thấp, (7)

dễ dàng sản xuất với số lượng lớn (8) dễ được chấp nhận cấp phép. Hiện nay, hầu

như các nghiên cứu tạo vắc-xin trên thế giới tập trung cho các loài cá đã được nuôi

công nghiệp: cá hồi coho (Oncorhynchus kisutch), cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus

mykiss), cá chẽm (Lates calcarifer), cá bơn (Scophthalmus maximus), cá da trơn

(Ictalurus punctatus), cá rô phi (Oreochromis spp.) [136].

Vắc-xin cho thủy sản gồm nhiều loại, căn cứ vào bản chất loại vắc-xin có thể

phân loại như sau [125, 136, 140]:

(1) Vắc-xin bất hoạt (inactivated vaccines): Vi khuẩn hoặc virus độc bị giết

bởi nhiệt hoặc hóa chất (formalin, phenol, kháng sinh).

(2) Vắc-xin sống nhược độc (attenuated live vaccines): Vi sinh vật sống, suy

yếu về độc lực hoặc không còn độc lực.

(3) Vắc-xin tiểu phần (sub-unit vaccines): Một phần nhỏ của vi sinh vật gây

bệnh có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch.

(4) Vắc-xin tái tổ hợp (recombinant vaccines): Protein kháng nguyên tinh

khiết được sản xuất bởi công nghệ tái tổ hợp DNA.

(5) Vắc-xin DNA (DNA vaccines): DNA tinh khiết có chứa gen của protein có

khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch được đưa vào một plasmid.

(6) Vắc-xin xóa gen bằng công nghệ gen (gene deleted live vaccines): Virus

hoặc vi khuẩn loại bỏ các gen mã hóa protein liên quan đến độc lực, đạt được các

chủng suy yếu một cách an toàn và ổn định.

Các chủng vi khuẩn bị bất hoạt có tính an toàn cao nên được sử dụng để sản

xuất cho vắc-xin thương mại (vắc-xin bất hoạt) cho cá. Tuy nhiên, đáp ứng miễn

dịch cho cá từ loại vắc-xin này là không tối ưu, đặc biệt là thời gian bảo hộ cho cá

khá ngắn [140]. Ngược lại, vắc-xin sống, nhược độc được đánh giá là có hiệu quả

hơn trong việc tạo ra các đáp ứng miễn dịch lâu dài so với vắc-xin bất hoạt [148].

Hiện nay, số lượng vắc-xin thương mại được cấp phép sử dụng trên thế giới cho các

loài cá còn khá khiêm tốn.

Bảng 1.2. Danh sách một số vắc-xin được cấp phép sử dụng cho cá [136, 140]

STT

Vắc-xin

Loại vắc-xin

Sử dụng cho cá Khu vực sử dụng

Vi khuẩn bất hoạt Cá Koi, cá hồi

Toàn cầu

Aeromonas salmonicida Bacterin

Cá hồi

Mỹ

Arthrobacter Vaccine

Arthrobacter sống và Renibacterium salmoninarum bất hoạt

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Chile, Canada,Mỹ

Vi khuẩn bất hoạt

Mỹ

Cá hồi, cá hồi cầu vồng

ruckeri

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Châu âu, Chile, Canada, Mỹ

Cá da trơn

Mỹ

Vi khuẩn sống, giảm độc lực

Vi khuẩn bất hoạt

Mỹ

Vi khuẩn sống, giảm độc lực

Cá trê kênh, cá bơn Nhật Bản Cá trê,cá hồi, cá da trơn

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Chile, Canada/USA

Vi khuẩn bất hoạt

Toàn cầu

Cá hồi, cá chẽm, cá đuôi vàng

salmonicida

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Châu âu, Chile, Canada, Mỹ

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Europe, Mỹ

Vi khuẩn bất hoạt Cá chép Ấn độ

Ấn độ

Renibacterium salmoninarum Vaccine Vibrio anguillarum- Ordalii Yersinia Bacterin Edwardsiella ictalurii Vaccine Edwardsiella ictaluri Bacterin Flavobacterium columnare Vaccine Flavobacterium psychrophilum Vaccine Listonella anguillarum Bacterin Vibrio Bacterin Vibrio anguillarum- salmonicida Bacterin Free-cell Aeromonas hydrophila Vaccine

Vi khuẩn bất hoạt

Lactococcus garvieae Vaccine

Italy, Pháp , Anh, Nhật

Cá hồi cầu vồng, cá đuôi vàng

Vi khuẩn bất hoạt

Cá rô phi

Châu Á

iniae

Vi khuẩn bất hoạt

Cá rô phi

Châu Á

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Chile

viscosa

Vi khuẩn bất hoạt

Cá hồi

Bắc âu

Streptococcus agalactiae Vaccine Streptococcus Vaccine Piscirickettsia salmonis Vaccine Moritella Vaccine

Vi khuẩn bất hoạt

Pasteurella piscicida Vaccine

Mỹ, Nhật Bản, Châu âu,Đài Loan

Vi khuẩn bất hoạt

Flexibacter columnaris, Maritimus Vaccine

Cá ayu, cá đuôi vàng, cá vược, cá chép Nhiều loài cá nước ngọt, cá bơn, cá hồi

Bắc Mỹ, Châu Á, Châu Âu, Nhật Bản

1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương

Miễn dịch ở cá xương gồm hai loại là miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch

đặc hiệu. Miễn dịch không đặc hiệu (hay còn gọi là miễn dịch tự nhiên, miễn dịch

bẩm sinh) là khả năng cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh bằng các phản ứng

không đặc hiệu, mang tính bẩm sinh, di truyền giữa các cá thể cùng loài. Đây là tuyến

phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ thể trong lúc các phản ứng miễn dịch đặc hiệu chưa đáp

ứng kịp trước sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Ba hàng rào bảo vệ chính của hệ

miễn dịch không đặc hiệu bao gồm: hàng rào bề mặt, hàng rào dịch thể và hàng rào tế

bào không đặc hiệu.

Miễn dịch đặc hiệu (hay còn gọi là miễn dịch mắc phải, miễn dịch thích nghi) là

đáp ứng miễn dịch được tạo ra do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng

nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên, có vai trò quan trọng

trong cơ chế chống lại sự tái nhiễm bệnh. Kháng nguyên tiếp xúc với cơ thể thông

qua hai phương thức: tiếp xúc ngẫu nhiên trong môi trường và tiếp xúc chủ động

bằng cách tiêm vắc-xin phòng bệnh.

Tuyến ức, tiền thận và lá lách là các cơ quan lympho có vai trò quan trọng

trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá [174]. Tuyến ức nằm trong xoang mang

của cá là nơi biệt hóa tế bào lympho T, ngoài ra nó còn chứa các đại thực bào,

dưỡng bào. Ở các loài cá khác nhau, thời điểm hoàn thiện tuyến ức khác nhau,

phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ môi trường [85]. Tiền thận (head kidney) của cá là

nơi chứa các tế bào lympho B sinh kháng thể, đại thực bào, dưỡng bào. Tương

tự, đại thực bào, tế bào lympho, kháng thể và dưỡng bào cũng được tìm thấy ở

lách của cá [151].

Cá xương có dạng kháng thể là IgM và IgD [57, 160]. Gần đây, một số loại

kháng thể Ig mới được phát hiện trên các đối tượng khác nhau như IgT trong cá hồi

[51] hoặc IgZ ở cá ngựa vằn và cá chép [135]. Cả IgZ và IgT đều có vai trò trong

phản ứng của niêm mạc chống lại ký sinh trùng và các mầm bệnh khác [135].

Cheng và cộng sự (2006) xác định IgM ở cá mú chấm cam có khối lượng chuỗi

nặng và chuỗi nhẹ lần lượt là 78 và 27 kDa, bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng tìm

thấy thêm một chuỗi polypeptide có khối lượng là 50 kDa và phán đoán đây là

chuỗi nặng thứ hai của phân tử IgM của loài cá này [36].

Một đặc tính quan trọng của hệ thống miễn dịch ở cá là khả năng phát triển trí

nhớ miễn dịch. Khi lần đầu tiên tiếp xúc với kháng nguyên, cơ thể cá tạo ra các tế

bào phản ứng lại với kháng nguyên (lympho B, lympho T gây độc, lympho T hỗ

trợ) có thời gian tồn tại tương đối ngắn. Tế bào lympho B đáp ứng miễn dịch dịch

thể thông qua việc sản sinh kháng thể nhận diện kháng nguyên và loại bỏ vi sinh vật

gây bệnh. Đáp ứng miễn dịch thông qua trung gian tế bào là cơ chế miễn dịch của tế

bào lympho T. Tế bào lympho T hỗ trợ tiết ra chất kích thích sự tăng sinh của tế bào

lympho B và T, các đại thực bào; trong khi đó, tế bào lympho T gây độc tiêu diệt vi

sinh vật gây bệnh và loại bỏ các ổ nhiễm trùng [8]. Ngoài ra, các tế bào lympho còn

có chức năng nhớ và tồn tại lâu dài qua các thế hệ của tế bào lympho. Các tế bào

nhớ này có khả năng “ghi nhớ” các kháng nguyên cụ thể mà cơ thể đã gặp phải. Khi

cơ thể này gặp lại kháng nguyên đó, những tế bào nhớ này có thể khởi động đáp

ứng miễn dịch một cách mạnh mẽ cho cơ thể chống lại mầm bệnh. Sự phát triển của

trí nhớ miễn dịch thường được đánh giá bằng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch thứ

cấp. Trong trường hợp trí nhớ chủ động (trí nhớ miễn dịch được tạo ra thông qua

tiêm chủng vắc-xin) thì đáp ứng miễn dịch thứ cấp sẽ nhanh hơn và mạnh mẽ hơn

so với đáp ứng miễn dịch sơ cấp khi kháng nguyên tiếp xúc với cơ thể lần đầu tiên.

Mức độ của phản ứng miễn dịch thứ cấp phụ thuộc vào lượng kháng nguyên trong

vắc-xin [107].

Có 2 nhân tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ở cá: nhân tố nội tại và nhân

tố ngoại cảnh. Nhân tố nội tại liên quan đến sự phát triển của cơ thể cá. Chỉ vài

ngày sau khi cá nở ra từ trứng thì hệ miễn dịch của cá phát triển và hoàn hoàn thiện,

điều này được xác định nhờ sự xuất hiện các tế bào lympho tại các cơ quan lympho.

Vì vậy, việc xác định thời điểm mà hệ miễn dịch của cơ thể cá hoàn thiện có ý

nghĩa rất lớn đến việc xác định thời điểm sử dụng vắc-xin cho cá, nó ảnh hưởng một

cách trực tiếp đến tỉ lệ bảo hộ của vắc-xin. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vắc-xin bất hoạt

Vibrio rất thấp ở cá hồi 2 tuần tuổi nhưng tỉ lệ này tăng lên 100% với cá hồi 10 tuần

tuổi. Nhiệt độ là nhân tố ngoại cảnh chính tác động đến đáp ứng miễn dịch của cá.

Trong giới hạn chịu đựng của loài, nhiệt độ càng cao thì đáp ứng miễn dịch diễn ra

càng nhanh và với cường độ càng cao. Ở nhiệt độ thấp, quá trình tổng hợp kháng

thể của cá sẽ bị ngưng trệ, đặc biệt khi có sự giảm đột ngột của nhiệt độ thì quá

trình này có thể bị rối loạn. Nhiệt độ thích hợp để sử dụng vắc-xin ở các loài cá có

thể khác nhau [125]. Với cá hồi Đại Tây Dương, ở nhiệt độ 10 - 12℃ là nhiệt độ

thích hợp để tạo kháng thể sau khi tiêm vắc-xin từ 4 - 6 tuần; nhưng đối với cá

chẽm, kháng thể tạo ra chỉ sau 1 tuần tiêm chủng khi được nuôi nhiệt độ 22℃.

Ngoài hai yếu tố trên, hiệu quả đáp ứng miễn dịch của cá có thể bị tác động bởi

trạng thái sức khỏe của cá, giới tính, điều kiện nuôi và chế độ dinh dưỡng [136].

1.3.3. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá

Có ba phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể của cá: tiêm vắc-xin, ngâm vắc-xin

và đưa vắc-xin vào cơ thể qua đường tiêu hóa.

(a) Phương pháp tiêm chủng vắc-xin

Vắc-xin được đưa vào cơ thể bằng cách tiêm có thể cung cấp trực tiếp một

lượng kháng nguyên xác định cho cơ thể cá. Tiêm vắc-xin cho cá có thể tiêm dưới

màng bụng (tiêm phúc mạc) hoặc tiêm cơ. Vắc-xin được đưa theo phương pháp này

có hiệu quả bảo hộ tốt và thời gian bảo hộ dài, không tiêu tốn một lượng lớn vắc-xin

như các phương pháp khác [125]. Tuy nhiên, tiêm vắc-xin cũng tồn tại một số hạn

chế như việc gây mê cá để tiêm gây stress cho cá, tốn nhiều công sức, tốn kém, khó

áp dụng cho cá có kích thước nhỏ. Việc tiêm cá có kích thước nhỏ và số lượng lớn

là rất ít khả thi [106].

(b) Phương pháp ngâm vắc-xin

Vắc-xin thương mại sử dụng phương pháp ngâm chủ yếu ở dạng vi khuẩn bất

hoạt hoặc vắc-xin vi khuẩn nhược độc. Phương pháp ngâm vắc-xin bao gồm hai

loại: cá được ngâm trong dịch kháng nguyên với nồng độ cao và thời gian ngắn (dip

vaccination) hoặc cho cá được ngâm trong dịch kháng nguyên với nồng độ thấp và

thời gian dài (bath vaccination). Nhiều loại vắc-xin được báo cáo có hiệu quả khi

ngâm cá ở độ pha loãng 1/10 dịch huyền phù vắc-xin đậm đặc với thời gian xử lý từ

30 đến 60s hoặc ở độ pha loãng 1/100 trong thời gian xử lý 02 giờ [31]. Phương

pháp ngâm vắc-xin có ưu điểm là có thể dễ dàng được thực hiện trên số lượng cá

lớn, cá có kích thước nhỏ, giảm việc gây stress cho cá, ít tốn công sức và thời gian,

tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn vắc-xin và thời gian

bảo hộ không dài [125].

Đưa vắc-xin vào cơ thể qua đường tiêu hóa là phương pháp trộn kháng nguyên

vào thức ăn cho cá để cung cấp vắc-xin. Loại vắc-xin được sử dụng theo phương

pháp này thường là dạng huyền phù để có thể phủ trực tiếp lên thức ăn hoặc trộn

kháng nguyên vào thức ăn trong quá trình chế biến. Loại vắc-xin này thường được

bổ sung một số thành phần khác như vi tảo, các hạt nano, alginate, chitosan nhằm

làm tăng khả năng hấp thu và dẫn truyền vắc-xin trong cơ thể cá [125]. Hiệu quả

phương thức này thường phụ thuộc vào: (1) hàm lượng kháng nguyên trong thức ăn

(2) khả năng chống lại sự phân hủy cũng như hấp thụ vắc-xin ở dạ dày (3) hiệu suất

hấp thu kháng nguyên ở ruột cá. Ưu điểm của vắc-xin được đưa vào qua đường tiêu

hóa là không gây stress cho cá, tiến hành đơn giản, dễ áp dụng, có thể áp dụng với

số lượng lớn cá ở các kích cỡ khác nhau, ít tốn kém công lao động. Tuy nhiên,

nhược điểm của phương pháp này là tiêu tốn một lượng vắc-xin lớn, hiệu quả bảo

hộ thu được chỉ đạt ở mức độ trung bình, hiệu quả của vắc-xin bị giảm do tác dụng

của các men tiêu hoá của cá, lượng kháng nguyên cung cấp cho mỗi con cá là không

đồng đều. So với phương pháp tiêm vắc-xin cho cá, phương thức này cho tỉ lệ bảo

hộ thấp hơn và thời gian bảo hộ ngắn hơn.

1.4. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc

phòng bệnh cho cá

Vắc-xin nhược độc là hướng nghiên cứu mang nhiều triển vọng ứng dụng sản

xuất vắc-xin thương mại cho cá. Vi khuẩn giảm độc lực có nguồn gốc là những vi

khuẩn dại, gây bệnh được nuôi cấy hoặc xử lý trong phòng thí nghiệm để tạo thành

chủng giảm độc lực. Chủng giảm độc lực phải có khả năng sinh trưởng nhưng

không có khả năng gây bệnh hoặc có thể gây bệnh ở mật độ vi khuẩn rất cao. Để

chủng vi khuẩn giảm độc lực được sử dụng như là vắc-xin sống, nhược độc thì

chúng cần giữ được cấu trúc kháng nguyên, tạo được đáp ứng miễn dịch mạnh cho

cá với thời gian bảo hộ dài. Có ba phương pháp tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực

bao gồm sử dụng tác nhân vật lý, tác nhân hóa học và công nghệ gen [5].

1.4.1. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý

Một số tác nhân vật lý được sử dụng để tác động vào chủng vi khuẩn dại, làm cho

chủng vi khuẩn này giảm độc lực:

Nhiệt độ: Trong giới hạn sinh trưởng, nếu nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ nằm

ngoài khoảng nhiệt độ không thuận lợi trong khoảng thời gian dài, vi khuẩn sẽ giảm

độc lực nhưng tính kháng nguyên của nó vẫn còn để tạo phản ứng miễn dịch cho cơ thể

được tiêm chủng [5].

Tia phóng xạ: bao gồm tia phóng xạ gây ion hóa (tia X, tia gamma) và tia

phóng xạ không ion hóa (tia cực tím). Tia phóng xạ có khả năng xuyên sâu vào

cơ thể, gây ion hóa tác động đến cấu trúc của DNA, có thể gây đột biến điểm

hoặc làm đứt gẫy cấu trúc phân tử DNA. Lê Minh Hải và cộng sự (2017) đã sử

dụng tia UV để gây đột biến chủng vi khuẩn Photobacterium damsalae dại, tạo dòng

đột biến giảm độc lực T4.3U6. Vi khuẩn giảm độc lực này được đánh giá có tiềm

năng trong việc phát triển vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài cá biển.

Dòng T4.3U6 có thể tạo đáp ứng miễn dịch trên cá mú ở các liều tiêm từ 105 - 108

CFU/ml với lượng kháng thể tạo ra tương tự nhau, tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 70 - 90%.

Mật độ vi khuẩn giảm độc lực thích hợp nhất để sử dụng tạo đáp ứng miễn dịch là 107

CFU/ml [4].

1.4.2. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học

Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục qua nhiều thế hệ hoặc nuôi cấy liên tục

trên môi trường bổ sung các chất hóa học, kháng sinh có thể tạo được các dòng vi

khuẩn giảm độc lực so với chủng dại. Một số chất có khả năng tác động đến cấu

trúc DNA hoặc quá trình biểu hiện gen liên quan đến độc lực của chủng vi khuẩn

được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn dại để gây đột biến.

(a) Nuôi cấy liên tục vi khuẩn dại

Chủng vi khuẩn Renibacterium salmoninarum dại gây bệnh thận (Bacterial

Kidney Disease - BKD) ở cá hồi chỉ phát triển trên môi trường thạch KDM-2. Hai

chủng vi khuẩn đột biến dinh dưỡng R. salmoninarum (RsTSA1; RsBHI1) được tạo

ra bằng cách nuôi cấy chủng dại liên tục trên hai loại môi trường trypticase soy agar

(TSA) và brain heart infusion agar (BHI). Vi khuẩn RsTSA1 được đánh giá có khả

năng bảo hộ tốt với tỷ lệ bảo hộ (RPS) 50% trên cá hồi sau 60 - 74 ngày tiêm chủng,

trong khi, 100% cá hồi đối chứng được tiêm bởi chủng dại đều bị bệnh [42].

Swain và cộng sự (2010) đã chọn lọc được hai dòng vi khuẩn Aeromonas

hydrophila Ahv và Ah1v bằng cách nuôi cấy liên tục chủng vi khuẩn dại trên môi

trường BHI agar trong thời gian là 8 năm, qua hơn 100 thế hệ. Hai dòng vi khuẩn

này được đánh giá là dòng giảm độc lực vì chúng không gây bệnh cũng như gây

chết cho cá được tiêm. Đáp ứng miễn dịch của cá chép Ấn Độ (Labeo rohita) được

tạo ra sau 15 và 21 ngày tiêm chủng [144].

Li và cộng sự (2015) đã tạo được chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae

YM001 giảm độc lực bằng phương pháp cấy chủng dại S. agalactiae HN016 liên

tục qua nhiều thế hệ trong ống nghiệm. Chủng giảm độc lực S. agalactiae

YM001 cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) trên cá rô phi là 96,88%; 67,22% và 71,81% sau

15 ngày hoặc 93,61%; 60,56% và 53,16% sau 20 ngày với phương thức đưa vắc-

xin vào cơ thể cá rô phi lần lượt tương ứng là tiêm, tắm và cho ăn vắc-xin với

liều 108 CFU/con [83].

(b) Nuôi cấy liên tục vi khuẩn dại trên môi trường bổ sung các chất hóa

học, kháng sinh

Vi khuẩn dại được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung một số chất hóa học

hoặc kháng sinh (đặc biệt là rifampicin) có thể chọn lọc được các chủng vi khuẩn

giảm độc lực. Pridgeon và cộng sự (2013) đã nuôi cấy liên tục các chủng dại A.

hydrophila, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae và S. agalactiae trên môi

trường có bổ sung riêng rẽ 4 hợp chất bao gồm gossypol, proflavine hemisulfate,

novobiocin và ciprofloxacin. Nhóm tác giả chọn lọc được các dòng vi khuẩn kháng:

A. hydrophila (9 dòng); E. tarda (9 dòng); S. iniae (9 dòng); và S. agalactiae (11

dòng). Trong các dòng kháng gossypol không phát hiện dòng giảm độc lực khi đánh

giá trên cá rô phi và cá da trơn. Phần lớn các dòng kháng proflavine hemisulfate đều

giảm độc lực nhưng không tạo đáp ứng miễn dịch cho cá. Vi khuẩn S. iniae và S.

agalactiae kháng novobiocin hoặc ciprofloxacin (8 dòng) là dòng giảm độc lực và

tạo được đáp ứng miễn dịch với tỉ lệ bảo hộ không cao hơn 70%. Dòng vi khuẩn E.

tarda 30305 kháng novobiocin có tính an toàn (tỉ lệ sống sót ở cá sau tiêm vắc-xin

là 100%) và tỉ lệ bảo hộ (RPS) ở cá rô phi lần lượt là 100% và 92% sau 14 và 28

ngày tiêm chủng [128]. Để phát triển vắc-xin sống nhược độc, Pridgeon và cộng sự

(2013) lựa chọn 40 dòng S. agalactiae kháng sparfloxacin để đánh giá độc lực trên

cá và lựa chọn dòng giảm độc lực. Trong 40 dòng kháng kháng sinh có 31 dòng vi

khuẩn là giảm độc lực khi chúng được đánh giá độc lực trên cá rô phi sông Nile.

Đánh giá về khả năng bảo hộ, 6/31 dòng vi khuẩn cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) 100% ở cá

rô phi sông Nile [127].

Chủng Edwardsiella ictaluri S97-773 giảm độc lực được Wise và cộng sự

(2015) tạo ra bằng cách nuôi cấy liên tục chủng dại trên môi trường chứa rifamycin

với nồng độ tăng dần. Vi khuẩn này được trộn vào thức ăn của cá nheo Mỹ

(Ictalurus puncatus) với hàm lượng 5 x 106 và 5 x 107 CFU/g cho tỉ lệ bảo hộ (RPS)

lần lượt là 82,6%; 100% sau 30 ngày cá ăn vắc-xin [161].

Rifampicin là tác nhân được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu tạo vi khuẩn

đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin phòng một số bệnh trên cá [58, 72,

97, 98, 129, 130]. Rifampicin là kháng sinh phổ rộng, có khả năng khuếch tán tự do

trong mô, tế bào sống, tế bào vi khuẩn. Nó có khả năng liên kết với tiểu đơn vị β

của RNA polymerase, gây cản trở hoạt động của RNA polymerase, ngăn chặn sự

khởi đầu phiên mã và từ đó có thể tiêu diệt vi khuẩn. Bên cạch đó, khi nuôi cấy các

chủng vi khuẩn dại trên môi trường chứa rifampicin với áp lực của việc tăng dần

nồng độ rifampicin có thể chọn lọc được các dòng giảm độc lực. Các dòng giảm độc

lực này có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cho cơ thể cá được tiêm chủng. Các

chủng vi khuẩn kháng rifampicin, giảm độc lực được sử dụng để phát triển vắc-xin

sống, nhược độc. Nhiều nghiên cứu tạo vắc-xin nhược độc cho cá bằng phương

pháp chọn lọc trên môi trường rifampicin đã được công bố:

Pridgeon và cộng sự (2011) đã chọn lọc được 03 dòng A. hydrophila giảm độc

lực bằng phương pháp nuôi cấy liên tục trên môi trường chứa 2 loại kháng sinh

novobiocin và rifampicin. Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) được tiêm dòng đột

biến với hàm lượng 4 x 105 CFU/con cho tỉ lệ sống sót 100%. Khi tiêm chủng dại

vào cá với liều tương tự thì 80 - 100% cá bị chết. Tương tự, cá rô phi sông Nile

được tiêm dòng đột biến với hàm lượng 2 x 108 CFU/con cho tỉ lệ sống 100%. Tuy

nhiên, khi cá rô phi được tiêm chủng dại với nồng độ tương tự thì 100% cá bị chết.

Các chủng vi khuẩn giảm độc lực này được sử dụng theo định hướng tạo vắc-xin

phòng bệnh xuất huyết ở cá. Trên cá nheo Mỹ, cá được tiêm vắc-xin nhược độc với

liều lượng 4 x 105 CFU/cá mang đến tỉ lệ bảo hộ (RPS) từ 86 - 100% sau 14 ngày

tiêm chủng. Trên cá rô phi sông Nile, cá được tiêm vắc-xin với liều lượng 2 x 108

CFU/cá cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 100% sau 14, 28 và 56 ngày tiêm chủng [130].

Tương tự, với phương pháp nuôi cấy liên tục trên môi trường chứa rifampicin, Jiang

và cộng sự (2016) cũng được tạo chủng A. hydrophila XX1LA giảm độc lực cho tỉ

lệ bảo hộ (RPS) là 83,7% sau 28 ngày tiêm chủng trên cá [65].

Vi khuẩn Edwardsiell ictaluri gây bệnh nhiễm trùng huyết cho nhiều loài cá

cũng được nghiên cứu tạo vắc-xin nhược độc bằng phương pháp nuôi cấy liên tục

trên môi trường chứa rifampicin với nồng độ tăng dần. Chủng vi khuẩn E. ictaluri

(RE-33) kháng rifampicin được sử dụng sản xuất vắc-xin AQUAVAC-ESCTM

phòng bệnh nhiễm khuẩn huyết cho cá được đăng ký bản quyền (US patent No.

6019981). Arias và cộng sự (2003) đánh giá rằng chủng vi khuẩn dại E. ictaluri

EILO và chủng RE-33 có sự tương đồng cao về lipopolysaccharides (LPS). Tuy

nhiên, phân tích protein màng cho thấy một số khác biệt giữa RE-33 và EILO [25].

Ở Việt Nam, rifampicin cũng được Vũ Thị Thanh Hương và cộng sự (2011) sử dụng

để tạo các chủng E. ictaluri giảm độc lực, sau đó, một số dòng giảm độc lực tiềm

năng được ứng dụng phát triển vắc-xin phòng bệnh cho cá [9].

Đối với vi khuẩn E. tarda, một loại mầm bệnh gây bệnh trên diện rộng cho

nhiều loài cá nước ngọt cũng như cá biển trên toàn thế giới, Sun và cộng sự (2010)

đã nuôi cấy chủng dại trên môi trường bổ sung rifampicin và chọn lọc được chủng

đột biến E. tarda TX5RM [143]. So với chủng dại, vi khuẩn TX5RM có đặc điểm:

(1) giá trị LD50 cao hơn chủng dại và giảm khả năng xâm chiếm mô và máu của cá;

(2) tốc độ sinh trưởng chậm hơn chủng dại và (3) có lượng protein tổng số khác so

với chủng dại. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của TX5RM trên cá bơn Nhật Bản (Paralichthys

olivaceus) đạt 80,6% và 69,4% lần lượt ở 5 và 8 tuần sau khi cho cá tắm và ăn thức

ăn trộn vắc-xin. Các phân tích vi sinh cho thấy TX5RM được phát hiện khi phân lập

lại từ ruột, gan, lá lách của cá sau 1 - 10 ngày dùng vắc-xin và từ lá lách, gan, thận

và máu của cá sau 1 - 14 ngày dùng vắc-xin [143].

Flavobacterium columnare và Flavobacterium psychrophilum - hai vi khuẩn

gây bệnh trên nhiều loài cá da trơn cũng được nghiên cứu tạo vắc-xin nhược độc

bằng phương pháp xử lý với rifampicin. Khi phân tích AFLP (amplified fragment

length polymorphism) và lipopolysaccharide (LPS) Olivares-Fuster và cộng sự

(2011) đã chọn lọc được 13 dòng vi khuẩn F. columnare kháng rifampicin, trong đó

8/13 dòng có đặc tính khác với chủng dại [113]. Dòng F. columnare 17-23 giảm

độc lực được chọn lọc từ các dòng vi khuẩn này cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) 90,9% trên

cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và 86,9% trên cá rô phi Nile (Oreochromis

niloticus) [104].

Nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn Flavobacterium

psychrophilum gây ra với các loài cá hồi nước lạnh (CWD) ở họ cá hồi, LaFrentz và

cộng sự (2008) đã tạo ra chủng F. psychrophilum 259-93B.17 và 259-93A16 giảm

độc lực bằng phương pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn dại F. psychrophilum CSF259-

93 trên môi trường chứa rifampicin với nồng độ tăng dần. Cả hai chủng giảm độc

lực được đánh giá đều có một số loại protein đặc thù khác biệt so với chủng dại

[47]. Chủng 259-93B.17 tạo ra đạt được tỉ lệ bảo hộ (RPS) trên cá hồi cầu vồng (O.

mykiss Walbaum) là 77,5% đến 85% lần lượt sau 8 và 15 tuần tiêm chủng [72].

Long và cộng sự (2013) khi phân tích trình tự gen rpoB, SNPs và cấu trúc LPS đều

nhận được một số đột biến và sự sai khác về cấu trúc LPS giữa chủng 259-93B.17

và chủng dại [90].

Gliniewicz và cộng sự (2015) đã đưa ra giả thuyết rằng việc nuôi cấy vi khuẩn

dại F. psychrophilum CSF259-93 qua nhiều thế hệ trên môi trường rifampicin gây

nên sự tích lũy của các đột biến trong hệ gen một cách ngẫu nhiên. Do đó, nó dẫn

đến việc giảm độc lực của các chủng vi khuẩn. Để đánh giá sự thay đổi về kiểu hình

và kiểu gen của chủng giảm độc lực so với chủng dại, nhóm tác giả đã đánh giá sự

đa hình protein, LPS và single nucleotide polymorphism (SNP) của chủng dại F.

psychrophilum CSF259-93 và các chủng giảm độc lực. Gen rpoB được phát hiện

xuất hiện đột biến thay thế amino acid Gln474Arg, Ser492Phe, Asp477Tyr và

Pro496Ser ở các chủng giảm độc lực. Một chủng giảm độc lực (với tỉ lệ gây chết

khi thử nghiệm trên cá là 4%) có sự sai khác ở 8 SNP so với chủng dại. Trong

nghiên cứu này, nhóm tác giả xác định 03 SNPs bị đột biến sai nghĩa (missense

mutation) liên quan đến sự giảm độc lực và đột biến Ser492Phe trên gen rpoB có

thể góp phần dẫn đến suy giảm độc lực. Rất ít sự sai khác về protein được quan

sát trên 2D SDS-PAGE và không có sự thay đổi một các rõ ràng về LPS giữa các

chủng giảm độc lực và chủng dại. Gliniewicz và cộng sự (2015) kết luận rằng có

nhiều đột biến được phát sinh trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn dại dưới áp lực

chọn lọc là rifampicin, có những đột biến đặc hiệu có thể được sử dụng để phát hiện

các chủng suy giảm độc lực hoàn toàn, suy giảm một phần ở F. psychrophilum [48].

Sudheesh và cộng sự (2016) đã đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của

dòng F. psychrophilum B.17-ILM giảm độc lực kháng rifampicin được phát sinh từ

chủng dại F. psychrophilum CSF259-93. Nhóm tác giả xác định được rằng trong cơ

thể cá sau 8 tuần sử dụng vắc-xin, hàm lượng kháng thể được tạo ra tăng lên một

cách đáng kể. Vắc-xin được ngâm cho cá hồi cầu vồng trong 3, 6 và 30 phút sẽ tạo

được đáp ứng miễn dịch với tỉ lệ bảo hộ (RPS) lần lượt là 47%; 53%; 52%. Kích

thước cá có ảnh hưởng đến tỉ lệ bảo hộ (RPS); cá 0,5 g đạt tỉ lệ bảo hộ (RPS) 55%

khi được ngâm với vắc-xin, trong khi với cá 1 - 2 g cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) 59 - 60%.

Với liều vắc-xin sử dụng cho cá 108 - 1010 CFU/ml cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 70%

trong 24 tuần. Liều vắc-xin 106 và 105 CFU/ml cho bảo hộ tốt trong 12 tuần, nhưng

tỉ lệ này giảm xuống còn 36% và 34% sau 24 tuần [142]. Cá hồi cầu vồng sau 28

ngày sử dụng vắc-xin F. psychrophilum B.17-ILM bằng phương pháp ngâm cho cá

được công cường độc bằng các chủng vi khuẩn gây bệnh và chủng dại được phân

lập từ các loài cá khác nhau. Vi khuẩn B.17-ILM có khả năng bảo hộ với tỉ lệ bảo

hộ từ 51 - 72%. Tất cả cá được tắm vắc-xin đều tạo được đáp ứng miễn dịch với

lượng kháng thể tăng đáng kể khi được công cường độc sau 8 tuần sử dụng vắc-xin.

Đây là một nghiên cứu chứng minh chủng vi khuẩn giảm độc lực F. psychrophilum

B.17-ILM có khả năng bảo hộ chéo chống lại các chủng dị hợp có nguồn gốc khác

nhau ở nhiều nơi trên thế giới [92].

Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp., rifampicin cũng đã được sử dụng để tạo

chủng đột biến giảm độc lực ở vi khuẩn V. anguillarum, V. harveyi. Yu và cộng sự

(2012) đã tạo được chủng V. anguillarum C312M kháng rifampicin. Sự sinh trưởng

của C312M chậm hơn so với chủng dại V. anguillarum C312, đặc biệt là trong điều

kiện thiếu sắt [173]. So với C312, C312M đã thay đổi độc lực, thể hiện liều gây chết

trung bình (LD50) tăng đáng kể. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá bơn Nhật Bản

(Paralichthys olivaceus) đạt 60% và 84% sau 1 tháng uống và tắm vắc-xin. Đối với

V. harveyi, chủng V. harveyi T4DM giảm độc lực phát sinh từ chủng dại V. harveyi T4D

có: (1) lượng protein tổng số khác với chủng dại T4D; (2) sinh trưởng chậm hơn và (3)

liều gây chết trung bình (LD50) tăng đáng kể so với chủng T4D. Sau hai tháng sử dụng

vắc-xin T4DM, cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) được bảo hộ với cả hai chủng

vi khuẩn V. harveyi và V. alginolyticus [58]. Nghiên cứu đã khẳng định các chủng giảm

độc lực có thể tạo được đáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo, nghĩa là cá được tiêm chủng vi

khuẩn giảm độc lực có thể được bảo hộ trước một vi khuẩn gây bệnh thuộc loài khác

(thường là vi khuẩn thuộc cùng họ với chủng giảm độc lực).

Như vậy, có thể nhận thấy rifampicin là một tác nhân dùng khá phổ biến trong

việc chọn lọc các chủng vi khuẩn giảm độc lực để phát triển vắc-xin sống, nhược

độc cho cá. Các chủng vi khuẩn dại phát sinh các đột biến gen ngẫu nhiên có thể

làm biến đổi một số đặc điểm về sinh trưởng, thành phần LPS, một số protein cũng

như thay đổi độc lực của các chủng vi khuẩn. Các chủng giảm độc lực sẽ được chọn

lọc từ các dòng kháng rifampicin và đánh giá về khả năng bảo hộ của chúng.

1.4.3. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen

Kĩ thuật gen thường được áp dụng cho tạo vắc-xin nhược độc là phương pháp

knock-out gen. Với phương pháp này, chủng vi khuẩn dại được sửa đổi hoặc xóa bỏ

các gen độc tố, làm giảm độc lực của chủng vi khuẩn, nhưng vẫn giữ được tính

kháng nguyên của vi khuẩn.

Transposon (yếu tố di truyền vận động) cũng đã được sử dụng trong việc tạo

đột biến ở các chủng vi khuẩn dại. Liu và cộng sự (2007) tạo chủng đột biến A.

hydrophila J1 bằng cách chèn một transposon vào gen mã hóa enzyme ngoại bào.

Cá kiếm (Xiphophorus helleri) đã tiêm vắc-xin A. hydrophila J1 được công cường

độc bằng chủng dại cho tỉ lệ sống sót của cá đạt 27/35 con (77,14%), trong khi cá

đối chứng chỉ có tỉ lệ sống sót là 13/35 con (37,14%) [88] .

Temprano và cộng sự (2005) tạo chủng vi khuẩn Yersinia ruckeri giảm độc

lực bằng cách chèn một đoạn DNA có chứa thông tin về tính kháng kháng sinh

kanamycin vào gen aroA, gen này mã hóa enzyme enolpyruvylshikimate 3-

phosphate synthase. Vi khuẩn đột biến gen aroA có thể bảo hộ chống lại chủng Y.

ruckeri gây bệnh đỏ ruột với tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 90% ở cá hồi [146].

Với chủng S. iniae gây bệnh cho nhiều loài cá nước ngọt và cá biển, Locke và

cộng sự (2008) đã tạo chủng đột biến bằng cách chèn đoạn DNA vào hai gen độc tố

simA và scpI của chủng dại. Chủng S. iniae Delta simA (ΔsimA - đột biến knock-

out gen simA) được đánh giá là chủng giảm độc lực, có tiềm năng tạo vắc-xin nhược

độc [89]. Tương tự, Wang và cộng sự (2014) cũng tạo chủng S. iniae TBY-1ΔsrtA

bằng phương pháp knock-out gen srtA, gen mã hóa enzyme sortase A. Enzyme này

gắn vào thành tế bào peptidoglycan và có thể ảnh hưởng đến việc định vị chính xác

các protein bề mặt, cũng như quá trình gây nhiễm của S. iniae. Chủng đột biến

TBY-1ΔsrtA cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 95,5% ở cá rô phi Nile [157].

Phương pháp knock-out gen được áp dụng cho nhiều nghiên cứu tạo chủng

Edwardsiella tarda giảm độc lực. Lan và cộng sự (2007) đã knock-out gen esrB

(gen mã hóa protein điều hòa trong hệ thống T3SS giúp vi khuẩn xâm nhập tế bào

chủ) tạo chủng đột biến E. tarda LSE40. Giá trị LD50 của chủng đột biến là 108

CFU/ml và tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt >50% sau 14 ngày tiêm chủng trên cá bơn

(Scophthamus maximus L.) [73]. Xiao và cộng sự (2011) tạo các chủng đột biến

bằng knock-out gen aroC, gen mã hóa sự tổng hợp chorismic acid [79] và một số

gen liên quan khác. Đánh giá độc lực của 19 dòng đột biến chọn lọc được 4 chủng

vi khuẩn E. tarda giảm độc lực: ΔaroC; ΔaroCΔesrC; ΔaroCΔslyA và

ΔaroCΔeseBCDΔesaC (delta, Δ là kí hiệu gen bị knock-out). Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của

4 chủng giảm độc lực trên cá ngựa vằn lần lượt là 68,3%; 71,3%; 80,1% và 81%

[165]. Li và cộng sự (2015) đã tiến hành knock-out các gen esrB, esaC, evpH, rpoS

và purA của chủng E. tarda LSE40ΔaroA. Năm dòng đột biến ở hai gen

(ΔaroAΔesrB, ΔaroAΔesaC, ΔaroAΔrpoS, ΔaroAΔevpH và ΔaroAΔpurA) cho tỉ lệ

bảo hộ (RPS) trên cá sặc cẩm thạch (Trichogaster trichopterus) là 26,1 - 82,6%,

trong đó đột biến ΔaroAΔesrB đạt tỉ lệ bảo hộ (RPS) cao nhất 82,6% [79].

Đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, Nho và cộng sự (2017) đã tạo các

dòng E. ictaluri ESC-NDKL1 (gcvPΔsdhCΔfrdA) và E. ictaluri ESC-NDKL2

(gcvPΔsdhCΔmdh) bằng cách knock-out gen frdA, mdh từ vi khuẩn E. ictaluri ESC

mang đột biến gen gcvP-sdh. Chủng ESC-NDKL1 được đánh giá là một ứng cử

viên vắc-xin tốt hơn so với ESC-NDKL2 vì nó có tính an toàn và hiệu quả tốt hơn

cho cá giống nhỏ (cá bột) và cá giống. ESC-NDKL1 được đưa vào cơ thể cá da trơn

bằng ba cách: ngâm vắc-xin giai đoạn cá bột, cho cá ăn vắc-xin ở trong ao và kết

hợp giữa việc cho ăn và cho ngâm vắc-xin trong ao, đã cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) lần

lượt là 86,74%; 81,67% và 95,22% [110].

Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp., phương pháp knock-out gen cũng được sử

dụng để tạo các chủng vi khuẩn giảm độc lực ở Vibrio anguillarum, Vibrio

alginolyticus. Liu và cộng sự (2018) tạo được chủng đột biến V. anguillarum

MVAV6203 bằng cách loại bỏ gen aroC của vi khuẩn V. anguillarum dại. Chủng

MVAV6203 có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cho cá nóc hổ (Takifugu rubripes)

với tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 90,67% và 80,31% ở cá con và cá trưởng thành [87]. Đối

với chủng V. alginolyticus, gen acfA có vai trò trong quá trình gây bệnh trên cá của

V. alginolyticus bằng cách điều hòa sự biểu hiện của một số gen độc tố. Chen và

cộng sự (2018) đã knock-out gen acfA tạo chủng đột biến giảm độc lực ΔacfA [35].

Cá mú ngọc trai được tiêm vắc-xin ΔacfA có khả năng chống lại chủng dại V.

alginolyticus HY9901 với tỉ lệ bảo hộ (RPS) 81,1%. Tương tự, chủng đột biến V.

alginolyticus HY9901Δhop được tạo bằng phương pháp knock-out gen

T3SEhopPmaJ (hop) từ chủng dại V. alginolyticus HY9901. Cá mú chấm cam (E.

coioides) được tiêm HY9901Δhop cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) 84% [116].

Tại Việt Nam, nghiên cứu tạo vắc-xin nhược độc từ vi khuẩn đột biến knock-

out gen còn khá mới mẻ. Trần Hạnh Triết và cộng sự (2014) tạo hai chủng đột biến

E. ictaluri Wzz và A. hydrophila Aro bằng phương pháp knock-out lần lượt hai gen

wzz và aroA. Độc lực của hai chủng đột biến đều thấp hơn chủng dại khi đánh giá

trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus [18]. Chủng E. ictaluri CH đột biến xóa

gen mã hóa Chonroitinase được Lê Thượng Khởi và cộng sự (2013) tạo ra cho đáp

ứng miễn dịch trên cá tra. Cá được tắm vi khuẩn E. ictaluri CH với liều 2,1 x 108

CFU/ml cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) là 39% cao hơn so với cá được tắm E. ictaluri CH

với liều 2,1 x 107 và 2,1 x 106 CFU/ml [10]. Tương tự, Nguyễn Trọng Bình và cộng

sự (2011) tạo chủng E. ictaluri giảm độc lực bằng cách xóa hai gen aroA và purA

[1]. Các chủng vi khuẩn này đều được đánh giá có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch

cho cá tra [1, 2, 13, 17]. Đối với vi khuẩn A. hydrophila, Trương Ngọc Thùy Liên và

cộng sự (2014) đã tạo chủng A. hydrophila đột biến xóa gen aroA. Một đoạn DNA

dài 683 bp của gen aroA được thay bằng gen kháng kanamycin (KmR) tạo nên tổ hợp

gen (cassette) aroA: KmR. Vi khuẩn E. coli chứa vector pGP704 mang cassette aroA:

KmR tiếp hợp với A. hydrophila dại tạo nên chủng A. hydrophila M25 với độc lực

thấp hơn 1000 lần so với chủng dại khi đánh giá trên cá tra [11].

1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá

1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

V. parahaemolyticus là nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan thận trên nhiều loài

cá biển, làm thiệt hại không nhỏ cho ngành nuôi cá biển. Do đó, nghiên cứu vắc-xin

phòng chống vi khuẩn này được nhiều nhà khoa học quan tâm. Một số hướng

nghiên cứu để tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận đã được công bố như sau:

Tạo vắc-xin bất hoạt là một trong hướng nghiên cứu đầu tiên được triển khai để

tạo vắc-xin cho cá. Wu và cộng sự (2015) đã tạo vắc-xin bất hoạt từ ba chủng vi khuẩn

bao gồm V. alginolyticus, V. parahaemolyticus và A. hydrophila. Vắc-xin này tạo

đáp ứng miễn dịch cho cá lù đù vàng lớn (Larimichthys crocea) với tỉ lệ bảo hộ

(RPS) khá cao 88,9% [164]. Tương tự, Clark và cộng sự (2010) đã tạo vắc-xin từ

hai loài vi khuẩn V. harveyi và V. parahaemolyticus bị bất hoạt bởi formalin. Vắc-

xin này được thử nghiệm trên cá mú chấm cam (E. coioides) tại Thái Lan, tỉ lệ bảo

hộ (RPS) đạt đến 77,6% [38]. Zhang và cộng sự (2017) tạo vắc-xin bất hoạt bằng

cách nuôi cấy vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường LB trong 16 giờ; 180

vòng/phút, ở nhiệt độ 30°C, sau đó, vi khuẩn được rửa bằng dung dịch PBS (pH

7,4) và ngâm trong formalin 0,5% ở 4°C trong 4 giờ. Với phương thức này, vi

khuẩn V. parahaemolyticus đã bị bất hoạt hoàn toàn [177].

Một loại vắc-xin bất hoạt được tạo ra từ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus

không mang vật chất di truyền (V. parahaemolyticus ghosts - VPGs). Vi khuẩn V.

parahaemolyticus được phân giải bởi sodium hydroxide, acetic acid, boric acid,

citric acid, maleic acid, hydrochloric acid và sulfuric acid với các nồng độ khác

nhau. Trong đó, sodium hydroxide có thể tạo được tế bào vi khuẩn V.

parahaemolyticus không chứa tế bào chất và DNA. Mặc dù, một số phân tử

lipopolysaccharides (LPS) của VPGs bị mất hoặc bị thay đổi so với vi khuẩn sống,

dại. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về khả năng gây nhiễm của VPGs so

với tế bào vi khuẩn dại. VPGs có khả năng kích hoạt các cytokine gây viêm (IL-1β

và iNOS), cytokine chống viêm (IL-10) và các tế bào đại thực bào, đây là những

yếu tố có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của cá. Những VPGs có tiềm năng

như một ứng cử viên vắc-xin bất hoạt an toàn, kinh tế và hiệu quả [119].

Protein màng ngoài (OMPs - outer membrane proteins) là một trong những

kháng nguyên bề mặt được chú ý trong những nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh

do V. parahaemolyticus gây ra [20]. Với hướng nghiên cứu này, protein màng ngoài

có thể được sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp (vắc-xin tái tổ hợp) hoặc gen

mã hóa các protein ngoại bào này được chuyển vào một vector để tạo ra vắc-xin

DNA, tiêm vào cơ của cơ thể cá, tạo đáp ứng miễn dịch cho cá.

Mao và cộng sự (2007) đã phân lập hai gen mã hóa hai protein màng ngoài

psuA và pvuA của vi khuẩn V. parahaemolyticus zj2003, chủng gây bệnh cho cá lù

đù vàng lớn (Pseudosciaena crocea). Hai gen này được biểu hiện trên vi khuẩn E.

coli và thu được protein tái tổ hợp. Cá lù đù vàng lớn được tiêm vắc-xin chứa riêng

rẽ từng protein tái tổ hợp của gen psuA, pvuA hoặc được tiêm đồng thời hai loại

protein cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) lần lượt là 50%; 62,5% và 75% [94]. Ngoài 2 loại

protein màng ngoài này, chủng V. parahaemolyticus zj2003 còn chứa 5 loại protein

màng ngoài khác có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cho cá bao gồm OmpW,

OmpV, OmpK, OmpU và TolC. Những protein này được tạo ra trong tế bào E.coli

thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp và được tiêm vào cá đù đù vàng lớn để đánh

giá khả năng đáp ứng miễn dịch. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) ghi nhận sau 8 tuần là 80% -

90% trong khi nhóm đối chứng lại chết hoàn toàn [95].

Li và cộng sự (2010) xác định rằng protein màng ngoài OmpK có thể được sử

dụng như một vắc-xin tái tổ hợp ngăn ngừa cả ba vi khuẩn V. harveyi, V.

alginolyticus và V. parahaemolyticus gây bệnh cho cá. Gen mã hóa OmpK từ 19

chủng Vibrio bao gồm V. harveyi (11 chủng), V. alginolyticus (6 chủng) và V.

parahaemolyticus (2 chủng) được phân lập và giải trình tự [84]. Phân tích trình tự

amino acid OmpK của V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus cho thấy

tỉ lệ tương đồng đạt 71,7 - 99,2% và khối lượng phân tử dao động 28 - 31 kDa. Gen

OmpK được sử dụng để tạo vắc-xin DNA tái tổ hợp. Vắc-xin DNA này có khả năng

bảo hệ chéo với các chủng vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh trên cá mú chấm cam (E.

coioides). Tỉ lệ bảo hộ (RPS) được đánh giá có tương quan với mức độ tương đồng

về trình tự amino acid suy diễn của gen OmpK. Li và cộng sự (2010) nhận định rằng

protein OmpK là một kháng nguyên bảo tồn có thể là một nguyên liệu tiềm năng tạo

vắc-xin phòng chống cả ba vi khuẩn V. harveyi, V. alginolyticus và V.

parahaemolyticus [84]. Sau đó, Li và cộng sự (2013) đã phát triển vắc-xin DNA

bằng cách kết hợp gen ompK phân lập từ chủng V. parahaemolyticus OS4 vào một

vector biểu hiện ở sinh vật nhân thực pEGFP-N2 tạo thành cấu trúc được đặt tên là

pEGFP-N2-OMPK (pDNA). Phân tử pDNA được gói gọn trong các hạt chitosan

tạo thành cấu trúc chitosan/pDNA với hiệu suất đóng gói 91,5% để đưa vắc-xin vào

cơ thể cá thông qua đường tiêu hóa. Phản ứng RT-PCR cho thấy sự tồn tại mRNA

của gen ompK trong ruột, gan, thận và cơ của cá sau 03 tuần uống vắc-xin ở cá

chẽm đen (Acanthopagrus schlegelii Bleeker). Đáp ứng miễn dịch với V.

parahaemolyticus OS4 ở cá chẽm đen cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 72,3%. Nhóm tác

giả cũng nhận định hạt nano chitosan là chất mang đầy triển vọng cho vắc-xin

pDNA thông qua đường tiêu hóa [82].

Li và cộng sự (2014) cũng cho rằng protein màng ngoài (OMPs) có tiềm năng

ứng dụng trong nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn V.

parahaemolyticus gây ra. Nhóm tác giả phát hiện ra một loại OMP miễn dịch -

VP0802, có tính bảo tồn cao trong số các loài Vibrio spp., cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt

66,7% [77]. Tương tự VP0802, LptD và LamB cũng là một protein màng có khả

năng tạo đáp ứng miễn dịch với tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 77,8% trên cá ngựa vằn (đối

với cá được tiêm DNA tái tổ hợp chứa gen mã hóa LamB). Hai loại protein này có

tiềm năng sử dụng tạo vắc-xin phòng bệnh do V. parahaemolyticus và một số loài vi

khuẩn Vibrio spp. khác gây ra [91, 176]. Bên cạnh đó, bảy protein màng ngoài bao

gồm DLD, VP1667, VP2369, VP2309, VP0887, VPA0548 và VP1019 cũng tạo

được đáp ứng miễn dịch trên nhiều loài Vibrio spp. trong đó có V. parahaemolyticus

với tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 80% trên cá mú chấm cam và tạo được đáp ứng miễn dịch

tốt trên cá ngựa vằn [115, 121, 122].

Liu và cộng sự (2011) cũng phát triển vắc-xin DNA từ gen mã hóa cho một

loại serine protease. Gen này được phân lập từ chủng V. parahaemolyticus

FYZ8621.4, mã hóa cho protein có kích thước 592 amino acid. Protein này có

khả năng thủy phân N-α-benzoyl-L-tyrosine p-nitroanilide (BAPNA), nhưng

không thủy phân được N-benzoyl-L-arginine ethylester (BAEE), N-benzoyl-L-

tyrosine ethylester (BTEE) và N-acetyl-L-tyrosine ethylester (ATEE). Serine

protease gây độc cho cá ngựa vằn với LD50 là 15,4 μg/con. Đột biến ở các vị trí

bảo tồn bao gồm Asp51 (Asp ® Asn), His89 (His ® Asp) và Ser318 (Ser ®

Leu hoặc Ser ® Pro) làm cho phân tử protease bị bất hoạt hoàn toàn. Vắc-xin

DNA được tạo ra bằng cách chèn gen mã hóa serine protease bị đột biến Ser318

® Pro vào plasmid pEGFP-N1 tạo thành cấu trúc pEGFP-N1/m-vps. Phân tử

pEGFP-N1/m-vps được tiêm vào cơ của cá bơn (Scophthalmus maximus) tạo tỉ lệ

bảo hộ (RPS) cao nhất đạt 96,11% [86].

Có thể nói, các nghiên cứu tạo vắc-xin phòng vi khuẩn V.

parahaemolyticus gây bệnh cho cá đã khá nhiều và tập trung vào nghiên cứu

tạo vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tái tổ hợp và vắc-xin DNA. Tuy nhiên, các nghiên

cứu tạo vắc-xin sống, nhược độc phòng bệnh này còn khá hạn chế. Mặc dù đã

có nhiều nghiên cứu tạo vắc-xin được công bố, nhưng vắc-xin thương mại

phòng bệnh hoại tử gan thận do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh trên cá

biển được cấp phép sử dụng trên thế giới hiện vẫn còn quá ít [61].

1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá

biển, thiệt hại rất nhiều cho ngành nuôi cá biển, tuy nhiên, những nghiên cứu tạo

vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn này còn khá mới ở nước ta và những công bố chủ yếu

theo hướng tạo vắc-xin bất hoạt.

Phan Thị Vân và nhóm nghiên cứu (2013) đã phát triển thành công vắc-xin bất

hoạt phòng bệnh Vibriosis cho cá giò nuôi. Vắc-xin bất hoạt này (AquaVib) được

tạo từ 3 chủng vi khuẩn V. alginolyticus, V. parahaemolyticus và V. harveyi được

bất hoạt bằng formalin phối trộn với nhũ dầu Montanide TMISA 760 (Seppic). Ở

quy mô phòng thí nghiệm, vắc-xin này có độ an toàn 100%, tỷ lệ phòng bệnh 70 -

100% sau 7 đến 30 ngày tiêm vắc-xin. Ở ngoài trại nuôi, vắc-xin có độ dài miễn

dịch từ 3 đến 12 tháng, tỷ lệ phòng bệnh trên 70%. Vắc-xin có thời gian bảo quản ở

nhiệt độ 4℃ ít nhất 9 tháng vẫn giữ nguyên hiệu lực [12, 19].

Nguyễn Thị Thanh Thùy và cộng sự (2013) đã tạo vắc-xin bất hoạt phòng

chống bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra trên cá mú chấm cam (E.

coioides). Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus V3 phân lập từ thận của cá mú bị

bệnh sau khi được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) với

lượng NaCl 2%, ở 33℃, trong 18 - 24 giờ, sau đó ngâm trong formalin 0,5%, trong

24 giờ ở 4℃. Sau khi vi khuẩn bị bất hoạt, vi khuẩn này được rửa bằng dung dịch

PBS (phosphate buffered saline) và pha loãng mật độ 109 CFU/ml trong dung dịch

PBS. Vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt này được kết hợp với chất bổ trợ FIA

với tỷ lệ 1:1. Khi đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-xin bất hoạt này trên cá mú

chấm cam, tỉ lệ bảo hộ (RPS) sau 30 ngày tiêm chủng vắc-xin bất hoạt có kết hợp

với chất bổ trợ và không có chất bổ trợ tương ứng đạt 87,5% và 50%; sau 60 ngày

tiêm chủng tỉ lệ bảo hộ đạt tương ứng lần lượt là 41,1% và 10,9%. Có thể nhận thấy,

vắc-xin bất hoạt có thể tạo được hiệu quả bảo hộ, tuy nhiên thời gian bảo hộ này

không được dài [147].

Những nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá do vi

khuẩn V. parahaemolyticus gây ra hiện nay đang tập trung vào hướng tạo vắc-

xin bất hoạt, vắc-xin tái tổ hợp với sản phẩm là các protein màng ngoài (OMPs -

outer membrane proteins), vắc-xin DNA. Đáng tiếc là, vắc-xin thương mại được

cấp phép sử dụng cho cá trong phòng chống V. parahaemolyticus đến nay vẫn

chưa có, kể cả vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi tạo dòng vi khuẩn giảm độc lực và đánh giá tiềm năng

của các dòng tạo ra nhằm chọn được một vài dòng để sử dụng như một nguyên

liệu cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng chống vi khuẩn V. parahaemolyticus

gây bệnh cho cá biển.

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Cá bệnh

Cá biển (cá mú, cá hồng, cá chẽm, cá giò) có các triệu chứng mắc bệnh hoại

tử gan thận được thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà,

khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình);

vùng biển Hải Thịnh (Nam Định).

Các mẫu cá bị bệnh thu thập vào tháng 4 năm 2015 và tháng 7, 8 năm 2016

được lưu giữ trong các dụng cụ vô trùng ở 4℃ trong suốt quá trình vận chuyển về

phòng thí nghiệm tại khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội để phân

lập vi khuẩn. Các mẫu được sử dụng để phân lập vi khuẩn trong 24 giờ kể từ thời

điểm thu thập mẫu.

2.1.2. Cá thí nghiệm

Cá thí nghiệm bao gồm:

Cá ngựa vằn (Danio rerio) dài 3 - 3,5 cm và cá rô phi (Oreochromis niloticus)

dài 6 - 6,5 cm do Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I (Từ Sơn, Bắc Ninh) cung

cấp sử dụng trong các thí nghiệm đánh giá về độc lực của các dòng vi khuẩn kháng

rifampicin.

Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 5,5 - 6 cm do Trung tâm Giống

thủy sản (Hải Phòng) cung cấp sử dụng để đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn

phân lập được, đánh giá mức độ an toàn và khả năng tạo kháng thể bảo hộ của dòng

vi khuẩn giảm độc lực tiềm năng.

2.1.3. Vi khuẩn

Chủng V. parahaemolyticus VTCC 12233 được cung cấp từ Viện Vi sinh vật

và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội được sử dụng làm chủng đối

chứng.

2.1.4. Hóa chất

(a) Hóa chất nuôi cấy vi khuẩn:

Brain Heart Infusion Broth - BHI Broth (HiMedia Laboratories, Ấn Độ).

Brain Heart Infusion Agar - BHI Agar (HiMedia Laboratories, Ấn Độ).

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS) (Titan Biotech, Ấn Độ).

(b) Hóa chất sử dụng để xác định hình thái, đặc điểm sinh hóa

Hóa chất nhuộm Gram: Dung dịch tím gentian bao gồm 2 g C25H30N3Cl

(Sigma-Aldrich, Mỹ); 20 ml ethanol 95% (Merck, Đức); 0,8 g ammonium

oxalate (Merck, Đức); 80 ml H2O. Dung dịch fuchsin bao gồm 1 g fuchsin basic

(Sigma-Aldrich, Mỹ); 10 ml ethanol 95% (Merck, Đức); 5 g phenol (Merck,

Đức); 100 ml H2O. Dung dịch lugol gồm các thành phần: 2 g KI (Merck, Đức); 1

g iodine tinh thể (Trung Quốc); 200 ml H2O; ethanol 95% (Merck, Đức).

Hóa chất dùng trong nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh hóa: Kligler Iron Agar

- KIA (HiMedia Laboratories, Ấn Độ); Tryptophan Broth (Merck, Đức); dung dịch

thuốc thử Kovac’s (Merck, Đức); Luria Bertani Broth - LB Broth (HiMedia

Laboratories, Ấn Độ); dung dịch H2O2 30%; môi trường thạch máu - Blood Agar

(Merck, Đức).

Rifampicin (SERVA, Đức).

Đĩa giấy tẩm kháng sinh của hãng Mast Diagnostics (Anh) với đường kính 6

mm bao gồm ampicillin 25 µg, gentamycin 30 µg, norfloxacin 10 µg, enrofloxacin

5 µg và erythromycin 15 µg dùng trong thí nghiệm đánh giá khả năng kháng kháng

sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được.

(d) Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Kit i-genomic BYF DNA Extraction Mini (iNtRON, Hàn Quốc), dH2O,

2xPCR Master mix Solution (iNtRON, Hàn Quốc), mồi PCR, 50X TAE Buffer

(Thermo Scientific, Mỹ), agarose (Bio Basic, Canada), DNA Ladder 1kb

(Invitrogen, Thermo Scientific, Mỹ), ethidium bromide (Thermo Scientific, USA).

(e) Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đánh giá độc lực của vi khuẩn: dung dịch

NaCl 0,9% (Việt Nam); phosphate buffered saline (PBS) được pha với thành phần

4,3 mM Na2HPO4.7H2O (Merck, Đức); 1,4 mM KH2PO4 (Merck, Đức); 2,7 mM

KCl KCl; 137 mM NaCl (Merck, Đức) với pH 7,2.

2.1.5. Thiết bị

Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu như: Tủ cấy vô trùng

(Sanyo, Nhật Bản), máy lắc Gyromax 737R (Amerex Instrument, Đức), máy PCR

(Eppendorf AG 22331, Đức), nồi hấp vô trùng (Nhật), tủ ấm nuôi khuẩn (Memmert,

Đức), tủ lạnh -20℃ (Sanyo, Nhật Bản), bộ điện di ngang (Advance Tech, Nhật

Bản), máy vortex (IKA, Đức), máy li tâm (Sorvall, Mỹ), máy quang phổ tử ngoại

khả biến (UV/VIS Spectrophotometer, Nhật Bản).

Các dụng cụ: bộ giải phẫu cá, ống nghiệm, đĩa Petri, đầu pipette, ống eppendorf,

que cấy, đèn cồn, kính hiển vi, lamen, lam kính, thùng nuôi cá, máy sục khí cho bể cá,

ống tiêm tiệt trùng 10cc.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Cá biển nuôi lồng có biểu hiện đặc trưng của bệnh hoại tử gan thận

Phân lập

Gây nhiễm vi khuẩn lại cho cá mú chấm cam

Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập

Xử lý rifampicin tử 5 μg/ml đến 250 μg/ml

Các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus kháng rifampicin

Đánh giá, chọn lọc

Các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực

Chọn lọc chủng tiềm năng

Đánh giá tính ổn định, khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của chủng vi khuẩn giảm độc lực tiềm năng

2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính

Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính

2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh

Phân lập các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus từ các mẫu cá bệnh được

tiến hành theo quy trình sau: gan, thận, da, vây của cá nghi bị bệnh hoại tử gan thận

được nghiền nhỏ trong dung dịch nước muối 1,5%, trộn đều bằng máy vortex để thu

được dung dịch huyền phù. Pha loãng dung dịch này với tỉ lệ 10-1, 10-2, 10-3… 10-7.

Lấy 100 µl từ mỗi dịch pha loãng cấy trải đều lên bề mặt môi trường TCBS trên đĩa

Petri và nuôi khuẩn trong tủ ấm ở 27℃ trong vòng 24 giờ.

Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái: tròn, bóng, lồi, có mầu xanh đậm trên

môi trường TCBS. Tiến hành cấy ria các khuẩn lạc chọn được riêng rẽ trên môi

trường thạch TCBS để làm thuần vi khuẩn. Chọn lần nữa các khuẩn lạc có hình thái

đặc trưng của V. parahaemolyticus để phân tích hình thái, đặc điểm sinh hóa, phân

tích trình tự gen độc tố để định danh chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus.

2.2.3. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn

Giữ giống trong môi trường BHI lỏng có bổ sung glycerol: Chủng vi khuẩn

được nuôi cấy trong môi trường BHI lỏng ở 28℃ sau 12 - 18 giờ. Bổ sung dung

dịch glycerol 20% vào dung dịch khuẩn trộn đều đồng nhất dung dịch bằng máy

vortex, giữ ống giống của vi khuẩn ở điều kiện -80℃.

2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram

Nhuộm Gram được thực hiện theo phương pháp của Hucker (1884), tiêu bản

được quan sát dưới vật kính 100X trên kính hiển vi quang học để phát hiện

chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus với dạng tế bào mầu đỏ, hình dấu phẩy.

Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus VTCC 12233 được sử dụng là mẫu đối

chứng dương.

2.2.5. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng phép đo mật độ quang

của dịch nuôi khuẩn tại bước sóng 600 nm (OD600). Vi khuẩn được hoạt hóa qua

đêm trên 5 ml môi trường BHI được chuyển sang 150 ml BHI có bổ sung NaCl 1%

sao cho giá trị OD600 đạt 0,1. Vi khuẩn được nuôi lắc 180 vòng/phút ở 27-28℃. Sau

đó, đo OD600 của dịch khuẩn tại các thời điểm 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 giờ.

Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp phương pháp đổ đĩa trên

môi trường BHI agar theo phương pháp của Trần Linh Thước (2009) [15].

2.2.6. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của

chủng vi khuẩn

(a) Đánh giá đặc điểm sinh hóa

Khuẩn lạc mầu xanh mọc trên môi trường TCBS agar được chọn lọc chuyển

sang môi trường BHI agar để sử dụng đánh giá các đặc điểm sinh hóa. Một số đặc

điểm sinh hóa như khả năng lên men, sinh indol, sinh catalase, khả năng di động,

sinh khí và sinh H2S và khả năng gây tan huyết của các vi khuẩn được đánh giá theo

phương pháp của Trần Linh Thước (2009) [15].

Phản ứng lên men đường trong môi trường KIA: Phương pháp này xác định

khả năng sử dụng nguồn carbohydrate (glucose/lactose), sinh khí trong quá trình lên

men và sinh H2S. Môi trường KIA gồm glucose, lactose, đỏ phenol (phenol red),

peptone, cao thịt, cao nấm men, natri clorua, natri thiosunfat và sắt sunfat. Phenol

đỏ là chất chỉ thị pH. Sự sản xuất acid bởi quá trình lên men lactose/glucose dẫn đến

làm đổi mầu chất chỉ thị từ mầu đỏ sang mầu vàng.

Ống nghiệm chứa môi trường tổng hợp KIA được khử trùng và nghiêng ống

thạch sao cho phần thạch nghiêng bằng 2 lần phần thạch đứng. Cấy ria vi khuẩn lên

bề mặt thạch nghiêng và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng. Nuôi vi

khuẩn ở nhiệt độ 28℃ trong 24 giờ và ghi nhận kết quả về:

• Khả năng sử dụng đường: Đối với vi khuẩn không lên men lactose, ban đầu

tạo mầu vàng ở cả phần thạch nghiêng và thạch đứng của ống nghiệm do sự lên men

glucose sinh acid. Do nồng độ của glucose rất thấp (1%), môi trường nhanh chóng

bị cạn kiệt glucose. Khi glucose được sử dụng hết trong môi trường hiếu khí (thạch

nghiêng), quá trình oxi hóa các acid diễn ra, môi trường trở lại mầu đỏ. Quá trình

này không diễn ra ở môi trường yếm khí (thạch đứng), do đó phần đáy ống nghiệm

chứa thạch đứng vẫn giữ mầu vàng trong khi vùng thạch nghiêng là mầu đỏ. Đối

với vi khuẩn lên men lactose, quá trình lên men tạo acid dẫn đến môi trường trong

ống nghiệm (cả thạch nghiêng và thạch đứng) đều chuyển mầu vàng. Do nồng độ

lactose cao, lượng acid được tạo ra lớn giúp duy trì độ pH acid của môi trường trong

điều kiện hiếu khí ở vùng thạch nghiêng. Ống nghiệm không đổi mầu cho thấy

không có sự lên men của cả glucose và lactose.

• Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S từ natri thiosunfat sẽ làm

ống thạch chuyển mầu đen do H2S tạo kết tủa với ion sắt có trong môi trường.

• Khả năng sinh khí: Nếu vi khuẩn sinh khí, có khí ở phần đáy của ống nghiệm

sẽ dẫn đến vết rạn ở vùng môi trường dưới đáy ống nghiệm hoặc đẩy môi trường

lên khỏi đáy ống nghiệm.

Khả năng sinh indol: Vi khuẩn được nuôi trong ống fancol chứa môi trường

lỏng tryptone water (10 ml/ống) ở nhiệt độ 28°C. Sau 24 giờ nuôi cấy, bổ sung 1 ml

xylen vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ, nhỏ 1 -

2 giọt thuốc thử Kovac’s. Những vi khuẩn có hệ enzym tryptophanase sẽ oxi hóa

axit amin tryptophan trong môi trường tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol khi nhỏ

thuốc thử vào, nó sẽ phản ứng với thuốc thử tạo một phức chất dạng quynone mầu

đỏ, nổi trên bề mặt ống. Kết quả ngược lại, không tạo phức chất có mầu đỏ sẽ cho

kết quả âm tính (-).

Khả năng sinh catalase: Vi khuẩn lấy từ môi trường thạch được đặt lên

lam kính sạch rồi nhỏ 1 - 2 giọt H2O2 30%. Sau 1 - 2 phút quan sát: kết quả là

dương tính nếu có hiện tượng sủi bọt khí, âm tính nếu không có hiện tượng sủi

bọt khí.

Khả năng gây tan huyết: Nhằm mục đích phát hiện các vi sinh vật có khả năng

làm tan hồng cầu. Haemolysin là tác nhân làm tan hồng cầu động vật, các vi sinh

vật khác nhau sẽ sinh haemolysin khác nhau nên cường độ biểu hiện tan hồng cầu

khác nhau. Sử dụng môi trường thạch máu hấp khử trùng, để nguội đến nhiệt độ

thích hợp sau đó bổ sung 5 - 10% máu cừu. Ria vi khuẩn cần thử nghiệm trên môi

trường nuôi ở 28ºC trong 24 - 48 giờ rồi quan sát và ghi nhận kết quả:

• Không tan huyết ( kiểu γ): không có sự tan huyết.

• Tan huyết kiểu β: Phân giải hoàn toàn hồng cầu, xung quanh khuẩn lạc là

một vòng trong suốt rộng 2 - 4 mm, tan huyết hoàn toàn, không còn hồng cầu ở

xung quanh.

• Tan huyết kiểu α: Xung quanh và dưới khuẩn lạc đổi mầu xanh nâu do việc

chuyển hóa haemoglobin (hồng cầu) => methemoglobin (mầu xanh hoặc nâu).

Methemoglobin hình thành do sắt hóa trị 2 bị chuyển hóa thành hóa trị 3 không có

khả năng vận chuyển oxy nữa.

Thử khả năng di động của vi khuẩn: Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường

LB bán thạch với 0,8% agar, thạch đứng. Dùng que cấy lấy vi khuẩn rồi đưa sâu

vào bên trong môi trường thạch, đọc kết quả phản ứng sau 24 - 48 giờ. V.

parahaemolyticus có 01 tiêm mao nên có khả năng di động, mọc lan ra khỏi đường

cấy, làm đục môi trường xung quanh, do đó cho kết quả dương tính (+) với thử

nghiệm này. Những chủng vi khuẩn không có tiêm mao thì không làm đục môi

trường, chỉ mọc trên đường cấy, cho kết quả âm tính (-).

Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus VTCC 12233 được sử dụng như

chủng đối chứng dương cho các thí nghiệm đánh giá đặc điểm sinh hóa.

(b) Xác định tính kháng kháng sinh

Để đánh giá được tính kháng kháng sinh của các chủng V. parahaemolyticus

phân lập, vi khuẩn được cấy trải trên môi trường BHI agar (50 µl dịch khuẩn/01 đĩa

thạch, nồng độ 106 CFU/ml). Các đĩa giấy tẩm kháng sinh có đường kính 6 mm:

ampicillin 25 µg, gentamycin 30 µg, norfloxacin 10 µg, enrofloxacin 5 µg và

erythromycin 15 µg (Mast Diagnostics, England) được đặt trên bề mặt môi trường

và nuôi vi khuẩn ở 28℃ trong 48 giờ. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn. Việc

đánh giá tính kháng kháng sinh được tiến hành theo tiêu chí của Clinical and

Laboratory (CLSI) (2006) dựa trên đường kính vòng vô khuẩn: ≥20 mm là mẫn cảm

với kháng sinh (S), từ 15 đến 19 mm là mẫn cảm trung bình (I) với kháng sinh và

<14 mm là kháng kháng sinh (D) [39].

2.2.7. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn

Để xác định độc lực của các chủng V. parahaemolyticus phân lập được, tiến

hành gây nhiễm vi khuẩn lên cá mú chấm cam theo phương pháp của Hu Yong-hua

và cộng sự (2012) có cải tiến [58]. Từ các cá mú được nuôi làm quen môi trường

trong bể chọn ngẫu nhiên 30 con khỏe mạnh để tiêm gây nhiễm chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus với liều lượng 100 µl/con và 107 CFU/ml. Cá được tiêm dung

dịch PBS (100 µl/con) được sử dụng làm mẫu đối chứng. Sau 24 giờ gây nhiễm

(ngày 0), bắt đầu theo dõi và đánh giá tỉ lệ sống sót của cá mú trong 14 ngày tiêm,

từ ngày 1 đến ngày 14. Thí nghiệm được nhắc lại 03 lần.

Tỉ lệ sống sót (%) = (số lượng cá sống sót/số lượng cá thí nghiệm) x 100

Hình 2.2. Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú

2.2.8. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin

Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus được xử lý với rifampicin theo

phương pháp của Hu Yong-hua và cộng sự (2012) có cải tiến [58].

(1) Chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập và được định danh là vi khuẩn V.

parahaemotycus (sau đây gọi là chủng dại) được nuôi lắc trong môi trường BHI

lỏng chứa 10 µg/ml rifampicin với tốc độ lắc 180 vòng/phút trong 6 - 8 giờ cho đến

khi OD600 đạt 0,6 - 0,8. Lấy ra 100 µl dịch khuẩn và cấy trải trên đĩa TCBS agar có

bổ sung 10 µg/ml rifampicin. Sau 12 - 24 giờ, khi khuẩn lạc mọc và đạt kích thước

2 - 3 mm;

(2) Lấy ngẫu nhiên 2 khuẩn lạc từ đĩa TCBS (1) tiếp tục nuôi lắc riêng rẽ trong

môi trường BHI chứa 20 µg/ml rifampicin cho đến khi dịch khuẩn đạt chỉ số OD600

từ 0,6 - 0,8 (thường sau 6 - 12 giờ nuôi lắc). Tiếp tục, lấy 100 µl từ mỗi dịch khuẩn

đưa cấy trải trên môi trường TCBS agar có bổ sung 20 µg/ml rifampicin cho đến khi

khuẩn lạc mọc đạt kích thước 2 - 3 mm (sau 12 - 20 giờ nuôi cấy);

(3) Quá trình nuôi cấy tương tự (2) được tiếp tục lặp lại nhưng trên các môi

trường BHI và TCBS agar có bổ sung nồng độ rifampicin tăng dần 10 µg/ml/lần

cho đến khi nồng độ rifampicin trong môi trường nuôi cấy đạt 250 µg/ml. Các dòng

vi khuẩn kháng rifampicin được chọn ra từ các khuẩn lạc mọc được trên môi trường

TCBS agar có 250 µg/ml rifampicin sẽ được sử dụng cho nghiên cứu đánh giá về

độc lực và xác định các dòng giảm độc lực.

Do áp lực chọn lọc rifampicin bổ sung tăng dần qua các lần nuôi cấy, thời gian

nuôi trong môi trường BHI lỏng vì thế có thay đổi giữa các lần nuôi cấy, dao động

trong khoảng từ 6 - 24 giờ. Thời gian nuôi cấy môi trường TCBS vì thế cũng có sự

khác nhau giữa các lần nuôi, dao động từ 12 - 48 giờ.

2.2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin.

Độc lực của chủng dại và dòng kháng rifampicin được đánh giá và so sánh dựa

vào: tỉ lệ sống sót của cá sau gây nhiễm và giá trị LD50 của các dòng vi khuẩn

kháng rifampicin. Từ đó, xác định dòng vi khuẩn giảm độc lực.

(a) Tỉ lệ sống sót của cá sau gây nhiễm chủng/dòng vi khuẩn

Các dòng vi khuẩn kháng rifampicin chọn lọc được đánh giá về độc lực bằng

phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trên cá theo phương pháp tiêm phúc mạc dưới da,

có cải tiến của Paranjpye và cộng sự (2013) với cá ngựa vằn và theo Hu Yong-hua

và cộng sự (2012) với cá rô phi [58, 117].

Trên cá ngựa vằn, mỗi dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus kháng rifampicin

với nồng độ 107 CFU/ml được tiêm gây nhiễm dưới da cho cá thí nghiệm (30 con)

với liều lượng 50 µl/con. Theo dõi và đánh giá tỉ lệ sống sót của cá mú bắt đầu từ 6

giờ sau gây nhiễm và trong suốt 120 giờ, tại các khoảng thời gian 6 giờ, 9 giờ, 12

giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ. Thí nghiệm được nhắc lại 3 lần.

Với thí nghiệm trên các rô phi, tiến hành tương tự như ở cá mú nhưng với liều

cao hơn (150 µl/con) và thời gian ghi nhận số liệu về tỉ lệ sống sót bắt đầu từ 24 giờ

sau tiêm gây nhiễm (ngày 0) và liên tục trong suốt 14 ngày sau gây nhiễm. Thí

nghiệm được nhắc lại 3 lần.

Thí nghiệm đối chứng dương sử dụng dịch khuẩn là các chủng vi khuẩn gây

bệnh phân lập được (chủng vi khuẩn dại) để tiêm vào cá với liều lượng tương tự

như thí nghiệm ở các dòng kháng rifampicin. Cá được tiêm dung dịch PBS vô trùng

được sử dụng làm mẫu đối chứng âm.

(b) Giá trị LD50 của chủng/dòng vi khuẩn

Phương pháp xác định giá trị LD50 của chủng dại và các dòng vi khuẩn

kháng rifampicin được tiến hành trên cá rô phi theo phương pháp của Reed và

Muench (1938) [133].

Cá rô phi được tiêm 150 µl/con với các liều lượng khác nhau từ 101 - 109

CFU/ml. Số lượng cá ở mỗi lô với mỗi liều lượng gây nhiễm là 30 con. Tiến hành

theo dõi và đánh giá tỉ lệ sống của cá sau 14 ngày gây nhiễm. Giá trị LD50 được tính

theo công thức:

LD50 = 10(a+x)

Trong đó:

10a: liều lượng tại đó số lượng cá sống và cá chết sau thí nghiệm là 50%;

x = (Pa – 50)/(Pa – Pu); trong đó: Pa, Pu là tỉ lệ cận trên và cận dưới của nồng

độ gây chết 50%.

2.2.10. Nhóm phương pháp sinh học phân tử

2.2.10.1. Phương pháp thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5 (QIAGEN

Bioinformatics) để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các gen độc tố toxR,

tdh, trh, tlh của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus dựa theo trình tự genome đã

công bố trên Genbank của vi khuẩn V. parahaemolyticus FORC_008 (số hiệu nhiễm

sắc thể I là CP009982 và nhiễm sắc thể II là CP009983) [68]; vi khuẩn V.

parahaemolyticus BB22OP với số hiệu nhiễm sắc thể II là CP003973.1 [62].

2.2.10.2. Phương pháp tách DNA tổng số

DNA tổng số của các chủng/ dòng vi khuẩn nghiên cứu được tách bằng kit i-

genomic BYF DNA Extraction Mini tiến hành theo quy trình hướng dẫn của hãng

iNtRON (Hàn Quốc).

DNA tổng số được kiểm tra trên gel điện di agarose 1,5% và bảo quản trong tủ -

20℃ để phục vụ cho nghiên cứu khuếch đại các gen bằng phương pháp PCR.

2.2.10.3. Phương pháp PCR, giải trình tự gen

(a) PCR khuếch đại gen độc tố và rpoB

Phản ứng PCR với thể tích 20 μl gồm các thành phần: 2 μl DNA khuôn; 10 μl

2x PCR Master mix; 1,5 μl/ mồi và 5 μl dH2O với nhiệt độ 94℃ biến tính ban đầu

trong 5 phút, 40 chu kì (94℃ trong 50 giây, bắt cặp mồi trong 30 giây 50-60℃, kéo

dài mạch ở 72℃ trong 90 giây), kết thúc phản ứng với 72℃ trong 10 phút. Các cặp

mồi được tối ưu về nhiệt độ bắt cặp khi khuếch đại các gen.

Có tổng số 9 cặp mồi khác nhau (5 cặp mồi tham khảo từ các công bố trên thế

giới và 4 cặp mồi tự thiết kế dựa trên các trình tự gen đã công bố trên NCBI) đã

được dùng để khuếch đại các gen độc tố (toxR, tlh, tdh, trh) và rpoB. Chi tiết về các

cặp mồi đã sử dụng trình bày trong bảng 2.1. DNA tổng số của chủng V.

parahaemolyticus VTCC 12233 được sử dụng như mẫu đối chứng dương.

(b) Phương pháp giải trình tự: Sản phẩm PCR được điện trên gel agarose

1,5% và gửi đi giải trình tự tại First BASE Laboratories, Lot. 7-1 to 7-4, Jalan SP

2/7, Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, 43300 Seri Kembangan, Selangor,

Malaysia.

Bảng 2.1. Trình tự và đặc điểm của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR

Mồi

Trình tự mồi (5’ – 3’)

Nguồn

Gen đích

Tm (℃)

Kích thước sản phẩm (bp)

toxR-4 GTCTTCTGACGCAATCGTTG

54,1

toxR

368

Kim Y.B. &cs (1999) [69]

toxR-7 ATACGAGTGGTTGCTGTCATG

55,0

toxR2 ACTCTACCCCCCTAAAAGCA

55,5

toxR

1070

Tự thiết kế

toxR4 CTGCCCCAGTACAACCAACC

58,5

tlhF AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG 58,0

tlh

450

Bej A.K. &cs (1999) [29]

tlhR GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCG 56,1

tlh1 TGTCGTGGCCATTTTGCTT

55,7

tlh

1484

Tự thiết kế

tlh3 CCGTGATGCCAAAATCAAAA

52,0

tdhF GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC

53,3

tdh

269

Bej A.K. &cs (1999) [29]

tdhR TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC

54,5

tdh1 ACTGGACTGTGGTTGGT

56,7

tdh

865

Tự thiết kế

tdh2 CCTCGAATTACGCAACAA

50,3

trhF TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT

52,2

trh

500

Bej A.K. &cs (1999) [29]

trhR TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT

52,8

trh1 TCGCATTTTTTCACCATTCCC

54,2

trh

772

Tự thiết kế

trh2 TAAGTTCACGCATTGAG

49,6

rpoB 1110F GTAGAAATCTACCGCATGATG

984

Tarr C.L. &cs

54,1

CM32b CGGAACGGCCTGACGTTGCAT

53,3

(2007) [145] Mollet C. & cs (1997) [105]

2.2.11. Phương pháp tin sinh

Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng các phần mềm tin sinh.

Đối với các chủng dại: Trình tự gen độc tố và rpoB được phân tích bằng công

cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) để xác nhận cặp mồi đã khuếch đại

chính xác gen thuộc loài V. parahaemolyticus; phần mềm CLC Genomics

Workbench 8.5 được dùng để xác định trình tự hoàn chỉnh của gen độc tố cũng như

đoạn gen rpoB. Đối với các dòng giảm độc lực: Trình tự các gen độc tố và rpoB của

các dòng giảm độc lực được so sánh với các trình tự này của các chủng dại thực

hiện trên phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5 để tìm những điểm đột biến.

Từ trình tự nucleotide của các gen độc tố suy diễn được trình tự chuỗi

polypeptide, sau đó sử dụng hai phần mềm Phyre2 và Swiss model để xây dựng cấu

trúc không gian của protein:

- Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)

- Swiss model (https://swissmodel.expasy.org/interactive).

2.2.12. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng

vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam

(a) Đánh giá tính ổn định của dòng giảm độc lực

Dòng giảm độc lực cất giữ ở -20℃ được hoạt hóa trên môi trường BHI lỏng,

sau đó cấy trải trên TCBS. Tăng sinh vi khuẩn trong dung dịch BHI và gây nhiễm

vào cơ thể cá mú chấm cam (30 con) với liều lượng 100 µl/con, nồng độ 107

CFU/ml để xác định tỉ lệ sống sót ở cá (đợt 1). Sau 24 giờ gây nhiễm (ngày 0), bắt

đầu theo dõi và đánh giá tỉ lệ sống sót của cá mú trong 14 ngày, từ ngày thứ nhất

đến ngày thứ 14.

Dòng giảm độc lực thu được tiếp tục nuôi cấy trên môi trường TCBS trong 2

tháng với 4 lần cấy chuyển trên môi trường TCBS. Sau 2 tháng nuôi cấy dòng giảm

độc lực được sử dụng để gây nhiễm trên cá và xác định tỉ lệ sống sót của cá (đợt 2).

Tiếp tục cấy chuyển dòng giảm độc lực này trên môi trường TCBS trong 4 tháng, 6

tháng và 8 tháng tiếp theo (tính từ lần thử nghiệm đầu tiên, đợt 1) và đánh giá về tỉ

lệ sống sót của cá sau khi bị gây nhiễm (đợt 3, 4, 5). So sánh tỉ lệ sống sót của cá

qua các đợt gây nhiễm với nhau để xác định tính ổn định của dòng vi khuẩn này.

Cá được tiêm dung dịch PBS và chủng dại với liều lượng 100 µl/con, 107

CFU/ml lần lượt là mẫu đối chứng âm và dương.

(b) Đánh giá mức độ an toàn của dòng giảm độc lực

Để đánh giá mức độ an toàn của dòng giảm độc lực, giá trị LD50 của dòng

giảm độc lực tiềm năng được xác định trên cá mú chấm cam. Từ giá trị LD50 của

chủng giảm độc lực, chọn liều lượng thấp hơn giá trị LD50 của dòng giảm độc lực

để chế vắc-xin dùng tiêm cho cá mú chấm cam. Đánh giá tỉ lệ sống sót của cá mú

sau 14 ngày tiêm vắc-xin để xác định tính an toàn. Cá đã tiêm vắc-xin tiếp tục được

sử dụng để đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc

lực khi được công cường độc bằng chủng dại.

2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc

lực trên cá mú

(a) Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch cho cá

Phương pháp đánh giá khả năng giá đáp ứng miễn dịch trên cá mú chấm cam

được thực hiện theo Gao Yuan và cộng sự (2014) có cải tiến [46].

Dòng vi khuẩn giảm độc lực được nuôi lắc trong môi trường BHI, sau đó vi

khuẩn được rửa bằng dung dịch PBS và pha loãng đến khi đạt liều lượng xác định

làm vắc-xin (liều lượng này được xác định sau thí nghiệm đánh giá mức độ an toàn

của chủng giảm độc lực) để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của vắc-xin tạo ra

từ dòng vi khuẩn giảm độc lực.

Thí nghiệm sử dụng 2 lô cá mú (lô A và lô B):

Lô thí nghiệm A: tiêm vi khuẩn giảm độc lực (100 µl/con).

Lô thí nghiệm B (lô đối chứng): tiêm dung dịch PBS (100 µl/con).

Sau 14 ngày tiêm, cá từ mỗi lô thí nghiệm A và B được chia thành 3 nhóm:

A1, A2, A3 (từ lô A) và B1, B2, B3 (từ lô B). Mỗi nhóm cá được tiêm công cường

độc bằng chủng dại. Cá mú thuộc nhóm A1, B1 tiêm liều 5LD50; nhóm A2, B2

tiêm liều 10LD50; nhóm A3, B3 tiêm liều 100LD50 (giá trị LD50 là của chủng vi

khuẩn dại).

Sau 24 giờ tiêm công cường độc bằng chủng vi khuẩn dại, bắt đầu theo dõi và

đánh giá tỉ lệ cá chết trong 14 ngày. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vắc-xin được xác định

theo công thức của Amend (1981) [23].

RPS (%) = [1 - (% cá được tiêm vắc-xin chết/% cá đối chứng chết)] x 100

(b) Đánh giá độ dài miễn dịch

Để đánh giá độ dài miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực tạo ra cho cá

khi tiêm vắc-xin, thí nghiệm được tiến hành như sau:

Cá mú được tiêm vắc-xin dòng giảm độc lực sẽ được công cường độc bằng

chủng dại với liều 5LD50, 10LD50; 100LD50 (giá trị LD50 của chủng vi khuẩn

dại), vào những khoảng cách thời gian khác nhau sau tiêm vắc-xin (1, 2, 4 và 6

tháng).

Cá đối chứng không được tiêm vắc-xin mà thay vào đó là tiêm dung dịch PBS

và được công cường độc bằng chủng dại ở các thời điểm khác nhau.

Sau 24 giờ tiêm công cường độc, số lượng cá chết được bắt đầu ghi nhận trong

14 ngày và tính tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vắc-xin theo công thức của Amend (1981)

[23]. So sánh tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vi khuẩn giảm độc lực cho cá qua các thời gian

tiêm chủng khác nhau để đánh giá độ dài miễn dịch .

2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel và Stata 2.0.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận

3.1.1. Phân lập vi khuẩn Vibrio

Cá biển với những triệu chứng mắc bệnh hoại tử gan thận (lở loét vùng da,

tróc vảy, mắt lồi, cụt vây và đuôi, xuất huyết nội quan từ 4 vùng cá nuôi lồng: ven

biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); biển Đồng

Châu (Thái Bình); biển Hải Thịnh (Nam Định) đã được thu thập và nghiên cứu phân

lập vi khuẩn Vibrio.

Kết quả cấy trải dịch nghiền mô bệnh cá trên môi trường chọn lọc TCBS đã

nhận thấy một số khuẩn lạc mọc trên môi trường (Hình 3.1). Có tổng số 43 mẫu cấy

mọc khuẩn lạc, hình thái khuẩn lạc cũng rất khác nhau quan sát thấy trên môi

trường TBCS trong các đĩa cấy Petri. Trong số đó, 26 mẫu cấy vi khuẩn (chiếm

60,46%) mọc khuẩn lạc có đặc điểm hình thái phù hợp với mô tả đặc điểm khuẩn

lạc của vi khuẩn nhóm Vibrio trên môi trường chọn lọc TCBS (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Các vi khuẩn phân lập từ mẫu cá bị bệnh

STT

Mẫu bệnh

Địa điểm thu mẫu

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Nhuộm Gram

Mẫu phân lập

B3.13

Cá mú

B3.15

Cá bớp

Thịnh

B5M1

Cá giò

B5M2

Cá mú

B5M3

Cá mú

(-),

B5M4

Cá mú

Thịnh

(+),

B5M5

Cá hồng

Thịnh

B13M1 Cá mú

Đồng Châu (Thái Bình) Cát Bà (Hải Phòng) Hải (Nam Định) Cát Hải (Hải Phòng) Cát Hải (Hải Phòng) Cát Bà (Hải Phòng) Hải (Nam Định) Hải (Nam Định)

Mầu xanh đậm, tròn, lồi, bóng D = 3 - 3,5 mm Mầu xanh nhạt, tròn, bóng, nhỏ, D = 1 - 1,5 mm Mầu xanh nhạt, tròn, lồi, bóng, D = 1,5 mm Mầu xanh đậm, tròn, lồi, bóng, D = 3,5 mm Mầu xanh đậm, lồi, tròn, bóng, D = 3 mm Mầu xanh đậm, tròn đều, bóng, D = 2 - 3 mm Mầu vàng, tròn đều, bóng, D = 3 - 4 mm Mầu xanh đậm, lồi, tròn, bóng, D = 3 - 4 mm

Gram (-), trực khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn Gram (-), trực khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn Gram phẩy khuẩn Gram trực khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn

B20M2 Cá mú

10 N9.2

Cá hồng

11 N13.1.1 Cá mú

12 N13.2.1 Cá mú

13 N20.M2

(-),

14 N20.M5

Cá chẽm Cá chẽm

15 N20.M6 Cá mú

16 A2.5

(+),

17 A3.2

Cá hồng Cá chẽm

(-),

18 A3.3

Cá mú

(+),

19 A3.5

Cá hồng

20 A5.12

Cá mú

21 A6.1

Thịnh

(+),

22 HH3-1

Thịnh

(-),

23 HH3-30

Thịnh

24 HH3-34

Cá chẽm Cá hồng Cá bớp Cá hồng

(-),

25 LBT6

Cá mú

26 TB1.6

Cá giò

Cát Bà (Hải Phòng) Đồng Châu (Thái Bình) Cát Bà (Hải Phòng) Đồng Châu (Thái Bình) Đồng Châu (Thái Bình) Cát Bà (Hải Phòng) Đồng Châu (Thái Bình) Đồng Châu (Thái Bình) Cát Bà (Hải Phòng) Cát Bà (Hải Phòng) Đồng Châu (Thái Bình) Cát Hải (Hải Phòng) Cát Bà (Hải Phòng) Hải (Nam Định) Hải (Nam Định) Hải (Nam Định) Cát Bà (Hải Phòng) Đồng Châu (Thái Bình)

Mầu xanh đậm, tròn, lồi, trơn bóng, D = 3 mm Xanh đậm, tròn, lồi, bóng, D = 3,5 mm Mầu xanh đậm, tròn, lồi, bóng, D = 3 mm Xanh đen, lồi, tròn, bóng, D = 3 mm Mầu vàng, dẹt, tròn, bóng, D = 1,5 - 2 mm Mầu vàng, dẹt, tròn, bóng, D = 1,5 - 2 mm Mầu xanh, lồi, tròn, bóng, D = 2,5 - 3 mm Mầu vàng, tròn, bóng D = 1,2 - 1,5 mm Mầu xanh đậm, tròn, dẹt, bóng, D = 0,8 - 1 mm Xanh đậm, tròn, lồi, bóng, D = 3,5 mm Mầu vàng nhạt, tròn, nhỏ, bóng, D = 1 mm Mầu xanh nhạt, tròn, bóng, lồi D = 0,5 - 1 mm Mầu vàng, dẹt, tròn, bóng, D = 2 - 3 mm Mầu vàng, to, trơn láng, bờ tròn đều, D = 3 - 3,5 mm Rìa khuẩn lạc xanh, tâm đen, bóng, D = 0,5 - 1 mm Mầu xanh đậm, lồi, bóng, D = 3 - 3,5mm Mầu xanh đậm, lồi, tròn, bóng, D = 3 mm Mầu xanh nhạt, tròn đều, bóng, D = 1,5 mm

Gram (-), phẩy khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn Gram (-), cầu trực khuẩn Gram (-), cầu khuẩn Gram phẩy khuẩn Gram (-), cầu trực khuẩn Gram (-), trực khuẩn Gram trực khuẩn Gram phẩy khuẩn Gram phẩy khuẩn Gram (-), cầu khuẩn Gram (-), hình que Gram trực khuẩn Gram phẩy khuẩn Gram (-), phẩy khuẩn Gram phẩy khuẩn Gram (-), cầu trực khuẩn

Ghi chú: D: đường kính khuẩn lạc (mm); Gram (-): Gram âm; Gram (+): Gram dương

A: khuẩn lạc của vi khuẩn LBT6 (mũi tên) B: hình thái vi khuẩn LBT6 khi nhuộm Gram

Hình 3.1. Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS

Từ kết quả đánh giá 26 mẫu vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio, chúng tôi đã chọn

lọc được 11 mẫu vi khuẩn (mang kí hiệu: B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1;

B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6) mọc trên môi trường TCBS có các

đặc điểm khuẩn lạc của loài V. parahaemolyticus: mầu xanh đậm, mặt bóng và có

hình tròn đều, đường kính khoảng từ 2,0 - 3,0 mm.

Môi trường TCBS là môi trường chọn lọc đặc trưng cho các chủng thuộc

nhóm Vibrio, cho phép phân biệt chủng Vibrio có sử dụng đường sucrose và chủng

Vibrio không sử dụng đường sucrose. Sự acid hóa của môi trường do quá trình lên

men sucrose ở các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio làm bryothymol blue (thành

phần có trong TCBS) từ mầu xanh chuyển thành mầu vàng. Vi khuẩn V.

parahaemolyticus là vi khuẩn gram âm (-) không có khả năng lên men sucrose, do

đó có khuẩn lạc của nó sẽ có mầu xanh khi mọc trên môi trường TCBS. Kết quả

nhuộm Gram cũng cho thấy vi khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram âm (-), có hình dấu

phẩy. Có thể kết luận bước đầu rằng vi khuẩn phân lập được là thuộc loài V.

parahaemolyticus. Tuy nhiên, để chắc chắn rằng tất cả khuẩn lạc mầu xanh mọc

trên môi trường TCBS, bắt mầu nhuộm vi khuẩn Gram (-) đều thuộc loài V.

parahaemolyticus chúng tôi đã tiến hành các phân tích sâu hơn về các đặc điểm sinh

hóa và phân tử nhằm khẳng định tính xác thực các vi khuẩn đã phân lập được là vi

khuẩn V. parahaemolyticus.

3.1.2. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập

Các mẫu vi khuẩn (11 mẫu) có đặc điểm hình thái khuẩn lạc phù hợp với V.

parahaemolyticus được đánh giá một số đặc điểm sinh hóa. Kết quả đánh giá một số

đặc điểm sinh hóa được thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập

Lên men

Catalase

Di động

Sinh indol

Sinh gas

Mẫu vi khuẩn

Sinh H2S

Glucose Lactose

B3.13 B5M2 B5M3 B5M4 B13M1 B20M2 N9.2

A3.3

+ + + + + + + + + + +

- - - - - - - - - - -

+ + + + + + + + + + +

Tan huyết β + + + + + + + + + + +

- - - - - - - - - - -

ST T 1 2 3 4 5 6 7 8 N13.1.1 9 10 HH3-34 LBT6 11 VTCC 12233

Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính

Dựa vào kết quả ở bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy tất cả 11 mẫu vi khuẩn phân

lập đều có các đặc điểm sinh hóa giống với chủng đối chứng dương VTCC 12233

và phù hợp với các đặc điểm đặc trưng của V. parahaemolyticus: đều có là có khả

năng lên men glucose, không lên men lactose, không sinh H2S, không sinh khí, sinh

indol, khả năng di động, sinh catalase, gây tan huyết kiểu β.

Kết quả đánh giá khả năng sử dụng các loại đường của vi khuẩn phân lập được

trong môi trường KIA (hình 3.2A) cho thấy có hiện tượng xuất hiện mầu vàng ở

phần thạch đứng trong khi phần thạch nghiêng có mầu đỏ trên tất cả các ống

nghiệm với 11 mẫu vi khuẩn phân lập và mẫu đối chứng. Chứng tỏ 11 mẫu vi khuẩn

đã sử dụng glucose làm nguồn carbon trao đổi chất mà không phải là sử dụng

lactose trong môi trường; không có hiện tượng sinh H2S làm đen môi trường cũng

như hiện tượng vỡ thạch ở đáy ống nghiệm do sinh khí bởi những vi khuẩn nghiên

cứu. Như vậy, các vi khuẩn phân lập được có khả năng lên men glucose nhưng

không có khả năng lên men lactose, không sinh H2S và không sinh khí.

Hình 3.2. Phản ứng lên men trên môi trường KIA (A) và phản ứng sinh indol với

thuốc thử Kovac (B) của các mẫu vi khuẩn

Trong thí nghiệm đánh giá khả năng sinh indol của 11 mẫu vi khuẩn phân lập,

quan sát thấy hiện tượng lớp mầu hồng xuất hiện trên bề mặt môi trường nuôi cấy

(hình 3.2B). Kết quả quan sát là có thể giải thích: enzym tryptophanase từ vi khuẩn

nuôi cấy đã thủy phân tryptophan có trong môi trường tạo các sản phẩm chứa gốc

indol. Các sản phẩm này kết hợp với thuốc thử Kovac (được nhỏ lên bề mặt của

dịch khuẩn nuôi cấy) làm xuất hiện lớp mầu hồng nổi trên bề mặt. Với kết quả sinh

hóa này, 11 mẫu vi khuẩn phân lập được đều có khả năng sinh indol.

Khi lấy khuẩn lạc của các mẫu vi khuẩn cho vào dung dịch hydrogen peroxide

(H2O2) đều thấy xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí ở 11 mẫu vi khuẩn phân lập và

mẫu đối chứng (hình 3.3). Điều này cho thấy các vi khuẩn trong dịch khuẩn nghiên

cứu đã sản sinh enzym catalase. Enzym catalase đã xúc tác chuyển hóa hydrogen

peroxide (H2O2) thành H2O và O2, làm xuất hiện bọt khí thoát ra.

Hình 3.3. Vi khuẩn VCTT 12233 (A) và HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi

bọt khi thử nghiệm với H2O2

Kết quả đánh giá khả năng di động của các mẫu vi khuẩn đều cho thấy: vi

khuẩn mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh (hình 3.4B).

Khả năng di động này có thể là nhờ cấu trúc tiêm mao của vi khuẩn V.

parahaemolyticus. Nghiên cứu khả năng tan huyết của 11 mẫu vi khuẩn qua

nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu đều xác nhận kết quả dương tính

với khả năng này (hình 3.4A). Tất cả các mẫu vi khuẩn đều gây tan huyết dạng β,

nghĩa là phân giải hoàn toàn hồng cầu, một vòng trong suốt rộng 2 - 4 mm xung

quanh khuẩn lạc cho thấy hiện tượng tiêu huyết hoàn toàn, không còn hồng cầu ở

xung quanh.

Hình 3.4. Vi khuẩn LBT6 gây hiện tượng tan huyết trên môi trường thạch máu (A)

và có khả năng di động trên môi trường LB bán lỏng (B)

Như vậy, 11 mẫu vi khuẩn phân lập đều có những đặc điểm hình thái, sinh hóa

đặc trưng của V. parahaemolyticus. Đây là căn cứ bước đầu để nhận định các mẫu

vi khuẩn này đều thuộc V. parahaemolyticus.

Song song với việc đánh giá các đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng một số loại

kháng sinh ở 11 mẫu vi khuẩn này cũng được khảo sát. Dựa vào đường kính vòng

vô khuẩn để xác định mức độ kháng của từng vi khuẩn với từng loại kháng sinh đã

phát hiện hầu hết các vi khuẩn phân lập được có khả năng kháng khác nhau với 5

loại kháng sinh nghiên cứu (bảng 3.3; hình 3.5). Số lượng mẫu vi khuẩn phân lập

còn mẫn cảm với một số loại kháng sinh nhất định là rất ít. Đặc biệt, có tới 10/11

mẫu vi khuẩn phân lập được đã kháng với kháng sinh ampicillin (25 µg).

Bảng 3.3. Đặc tính kháng 5 loại kháng sinh của 11 mẫu vi khuẩn phân lập

Tính kháng kháng sinh

ST T

Vi khuẩn

B3.13 B5M2 B5M3 B5M4 B13M1 B20M2 N9.2 N13.1.1 A3.3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HH3-34 LBT6 11

Erythromycin (15 µg) R R R R R R S R I R R

Gentamycin (30 µg) I R R R R R S R I R R

Norfloxacin (10 µg) R I S I I R R I I S R

Ampicillin (25 µg) R R R R R R S R R R R

Enrofloxacin (5 µg) R I I S S R R R I R I

Ghi chú: S - mẫn cảm; I - nhạy trung bình; R - kháng

Hình 3.5. Vi khuẩn N13.1.1 nuôi trên BHI agar với 5 đĩa giấy kháng sinh

Tính kháng kháng sinh ở chủng V. parahaemolyticus đã được nhiều nghiên

cứu ghi nhận. Zulkifli và cộng sự (2009) nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 31

mẫu vi khuẩn phân lập được với 16 loại kháng sinh đã phát hiện hiện tượng đa

kháng thuốc với chỉ số đa kháng MAR (multiple antibiotic resistance index) từ 0,31

đến 0,69; và phán đoán rằng các mẫu vi khuẩn phân lập được là từ những nguồn

mẫu thường xuyên được xử lý kháng sinh [182]. Tương tự, Xu và cộng sự (2016)

khi đánh giá tính kháng kháng sinh của 145 mẫu vi khuẩn phân lập được với 12 loại

kháng sinh đã ghi nhận tỉ lệ kháng 86,2% với streptomycin; 49,6% với ampicillin;

43,5% với cefazolin; 35,9% với cephalothin và với kanamycin là 22,1% [167].

Có thể nhận thấy, sử dụng kháng sinh một cách phổ biến và thiếu kiểm soát

trong điều trị các bệnh thủy sản đang là một mối lo ngại rất lớn đối với ngành nuôi

trồng thủy sản. Sử dụng vắc-xin phòng bệnh một cách chủ động cho động vật thủy

sản là giải pháp bền vững và rất cần thiết để giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh

ở chủng vi khuẩn gây bệnh do sử dụng quá thường xuyên và thiếu hợp lý hiện nay ở

các trang trại nuôi thủy sản.

3.1.3. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử

Các mẫu vi khuẩn phân lập (11 mẫu) và chủng đối chứng dương VTCC 12233

đã được tách DNA tổng số và kiểm tra chất lượng trên gel điện di agarose. Kết quả

cho thấy một băng điện di DNA tổng số trên gel agarose gọn và sắc nét (hình 3.6).

Kết quả tỉ lệ OD260/OD280 của 12 mẫu DNA tổng số đều nằm trong khoảng 1,8 đến

2,0. Như vậy, những mẫu DNA tổng số này là tinh sạch, đủ tiêu chuẩn để dùng trong

các phản ứng PCR.

Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2;

N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1kb

Hình 3.6. DNA tổng số của các vi khuẩn điện di trên gel agarose 1%

DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn được sử dụng làm khuôn để xác định sự

có mặt của các gen độc tố toxR, tlh, tdh và trh đặc trưng cho vi khuẩn V.

parahaemolyticus bằng phương pháp PCR. Mỗi gen độc tố toxR, tlh, tdh và trh

được khuếch đại bằng 2 cặp mồi: cặp mồi theo công bố của một số tác giả đã công

bố và cặp mồi do chúng tôi thiết kế (bảng 2.1). Kết quả PCR sử dụng DNA các vi

khuẩn phân lập làm khuôn với các cặp mồi được thể hiện ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Sự có mặt của các gen độc tố ở các mẫu vi khuẩn phân lập

Sự có mặt của các gen

STT

Vi khuẩn

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

B3.13 B5M2 B5M3 B5M4 B13M1 B20M2 N9.2 N13.1.1 A3.3 HH3-34 LBT6 VTCC 12233

toxR + + + + + + + + + + + +

tlh + + + + + + + + + + + +

tdh - - - - - - - - - - - -

trh - - - - - - - - - - - -

Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính

Theo bảng 3.4, gen độc tố toxR và tlh đã được khuếch đại thành công từ DNA

tổng số của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, sản phẩm PCR với các cặp

mồi đặc hiệu của 2 gen độc tố còn lại, tdh và trh, không quan sát thấy trên gel điện

di. Có lẽ trong hệ gen của các mẫu vi khuẩn này được không mang 2 gen độc tố tdh

và trh. Sự không có mặt gen tdh và trh trong hệ gen của V. parahaemolyticus cũng

đã được một số nhà khoa học báo cáo. Ilida và cộng sự (1997) đã nhận định rằng

không phải bất cứ chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus nào cũng mang gen tdh, trh

[60]. Chỉ 1 - 5% các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus mang gen tdh, trh [111].

Theo Rojas và cộng sự (2011) chỉ có 10,5% vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập

từ con trai và hàu là có chứa gen tdh [134]. Tương tự, Deepanjali và cộng sự (2005)

cũng chỉ tìm thấy 3/49 (6,1%) mẫu V. parahaemolyticus phân lập từ hàu có gen tdh

[43]. Xie và cộng sự (2005) xác định 07 mẫu vi khuẩn phân lập từ các động vật thủy

sản ở Quảng Tây (Trung Quốc) và 01 chủng V. parahaemolyticus VPL4-90 (từ viện

Vi sinh học, Quảng Đông Trung Quốc) đều không phát hiện được sự có mặt của gen

tdh và trh [166]. Chakraborty và cộng sự (2008) không phát hiện được gen tdh ở 23

mẫu V. parahaemolyticus phân lập được từ động vật thủy sản. Chỉ có 01 mẫu trong

số 23 mẫu phân lập nói trên là có chứa gen trh [33]. Trong số 39 mẫu vi khuẩn V.

parahaemolyticus phân lập từ cá nước ngọt, cá biển tại Chengicherla và Hyderabad

(Ấn Độ) chỉ 5,7% mẫu có gen tdh và 26,6% mẫu có gen trh [109]. Tại Việt Nam,

Nguyễn Văn Duy và cộng sự (2012) đã báo cáo về việc phát hiện 2 gen độc tố (toxR

và tlh) trong hệ gen của 5 mẫu vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên thủy sản

ở Nha Trang. Cũng theo các tác giả này, không phát hiện được gen tdh và trh trong

hệ gen các chủng vi khuẩn đã phân tích [3].

Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi

Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2;

N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 100 bp

toxR-4, toxR-7

Gen toxR là gen điều hòa sự biểu hiện của gen tdh và một số gen mã hóa

protein màng. Sản phẩm khuếch đại gen này với cặp mồi đặc hiệu toxR-4, toxR-7

có kích thước 368 bp [69, 75, 141, 182]. Gen toxR có chứa trình tự bảo tồn nên

được dùng làm gen đích trong các nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện

nhanh V. parahaemolyticus. Trong nghiên cứu này, gen toxR của tất cả các mẫu vi

khuẩn nghiên cứu đã được khuếch đại với cặp mồi toxR-4, toxR-7 cho sản phẩm có

kích thước ~368 bp (hình 3.7).

Với gen tlh – gen mã hóa protein độc tố haemolysin TLH, có trình tự amino

acid đặc trưng cho V. parahaemolyticus, đã được khuếch đại với sản phẩm có kích

thước ~450 bp bằng cặp mồi tlhF-tlhR. Kết quả này phù hợp với nhiều công bố

trước đây [29, 37, 70, 170]. Trong nghiên cứu này, hệ gen của tất cả 11 mẫu vi

khuẩn phân lập cũng như chủng đối chứng đều mang gen tlh (hình 3.8).

Hình 3.8. Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh của các mẫu vi khuẩn với

Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2;

N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 100 bp, M1: Marker 1 kb

cặp mồi tlhF-tlhR

Như vậy, DNA của 11 mẫu vi khuẩn phân lập và chủng đối chứng VTCC

12233 đều có mang các trình tự DNA với kích thước ~368 bp và ~450 bp đặc trưng

của gen toxR và tlh khi được khuếch đại với 02 cặp mồi tương ứng toxR-4, toxR-7

[69] và tlhF-tlhR [29]. Do đó, có thể khẳng định chính xác rằng 11 mẫu vi khuẩn đã

phân lập được là thuộc loài vi khuẩn V. parahaemolyticus. Từ đây, các vi khuẩn

nghiên cứu được chúng tôi gọi là các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus.

3.1.4. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập

Mười một chủng vi khuẩn phân lập được tiêm vào cá mú chấm cam với liều

lượng 107 CFU/ml, 100 µl/con. Quan sát các triệu chứng của cá bị mắc bệnh và ghi

nhận tỉ lệ sống sót của các cá mú sau 14 ngày tiêm với các chủng vi khuẩn phân lập

cho thấy: 100% cá được gây nhiễm biểu hiện triệu chứng xuất huyết, gốc vây xuất

huyết, tuột vẩy, tuột nhớt, loét da, vây cụt, vùng cơ quanh khu vực tiêm gây nhiễm

và da đổi mầu đậm hơn (hình 3.9A).

Hình 3.9. Cá mú chết ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) và ở ngày thứ 9

sau gây nhiễm chủng LBT6 với hiện tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B)

Bảng 3.5. Tỉ lệ sống sót của các mú khi gây nhiễm với chủng vi khuẩn phân lập

Tỉ lệ sống sót của cá sau ngày gây nhiễm (%)

Chủng

Ngày 14

LBT6

13,33ab ± 0,47

B3.13

6,67ab ± 0,00

A3.3

10,00ab ± 0,00

B5M2

18,89b ± 0,47

B5M3

2,22a ± 0,47

B5M4

18,89b ± 0,47

B13M1

22,22b ± 0,47

B20M2

16,67ab ± 0,00

N9.2

2,22a ± 0,47

N13.1.1

16,67ab ± 0,00

HH3-34

20,00b ± 1,41

PBS

100c

13,33 ± 0,00 7,78 ± 0,47 13,33 ± 0,47 22,22 ± 1,25 4,44 ± 0,00 20,00 ± 0,0 24,44 ± 0,47 21,11 ± 0,47 4,44 ± 0,47 18,89 ± 0,94 21,11 ± 1,63 100

14,44 ± 0,47 6,67 ± 0,00 11,11 ± 0,47 20,00 ± 0,82 2,22 ± 0,47 18,89 ± 0,47 22,22 ± 0,47 18,89 ± 0,47 2,22 ± 0,47 17,78 ± 0,47 20,00 ± 1,41 100

17,78 ± 0,47 14,44 ± 0,47 31,11 ± 0,47 33,33 ± 0,00 8,89 ± 0,47 26,67 ± 0,82 25,56 ± 0,47 30,00 ± 1,63 13,33 ± 0,82 23,33 ± 1,41 23,33 ± 0,82 100

55,56 ± 0,47 53,33 ± 1,24 70,00 ± 0,00 67,78 ± 0,47 27,78 ± 0,82 47,78 ± 0,47 55,56 ± 0,47 55,56 ± 2,05 45,56 ± 0,47 48,89 ± 1,25 48,89 ± 1,25 100

28,89 ± 0,47 35,56 ± 0,47 48,89 ± 0,47 45,56 ± 0,47 17,78 ± 0,47 38,89 ± 0,94 35,56 ± 1,25 44,44 ± 2,05 35,56 ± 0,47 30,00 ± 0,82 28,89 ± 0,47 100

Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13 13,33 ± 82,22 0,82 ± 1,25 6,67 ± 81,11 0,00 ± 1,70 11,11 ± 78,89 0,00 ± 0,67 18,89 ± 85,56 0,47 ± 0,47 2,22 ± 55,56 0,47 ± 0,47 18,89 ± 74,44 0,47 ± 1,25 22,22 ± 82,22 0,47 ± 0,82 16,67 ± 71,11 0,00 ± 0,47 2,22 ± 55,56 0,47 ± 0,47 17,78 ± 60,00 0,47 ± 1,41 20,00 ± 62,22 1,25 ± 0,94 100 100 Ghi chú : chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p<0,05

Tỉ lệ sống sót của cá mú sau 14 ngày gây nhiễm (bảng 3.5) dao động từ 2,22%

đến 22,22%, trong đó, cá gây nhiễm với chủng vi khuẩn B5M3 và N9.2 có tỉ lệ sống

sót thấp nhất (2,22%) và tỉ lệ sống sót cao nhất ghi nhận ở cá được gây nhiễm chủng

vi khuẩn B13M1 (22,22%). Tỉ lệ này ở cá gây nhiễm với chủng vi khuẩn LBT6,

B3.13, A3.3, B5M2, B5M4 lần lượt tương ứng là 13,33%; 6,67%; 10%; 18,9%;

18,9%. Tỉ lệ sống sót 16,67% quan sát thấy ở cá gây nhiễm với 3 chủng vi khuẩn

B20M2; N13.1.1; HH3-34. Cá chết nhiều ở tuần đầu tiên sau gây nhiễm, nhất là ở

ngày thứ 1 đến ngày thứ 5 sau gây nhiễm. Ở tuần tiếp theo, số lượng cá chết giảm

dần và khoảng dao động cũng ít hơn giữa các ngày theo dõi. Kết quả này cũng phù

hợp các báo cáo về đặc điểm gây bệnh của V. paraheomolyticus, nó có thể làm cá

chết hàng loạt khi ở thể cấp tính hoặc chết rải rác khi cá ở thể thứ cấp tính [16, 138].

Nghiên cứu độc lực của V. paraheomolyticus trên cá mú, Nguyễn Thị Thanh

Thủy và cộng sự (2012) cũng đã báo cáo tỉ lệ chết của cá mú chấm cam bị gây

nhiễm chủng V. parahaemolyticus A và V3 lần lượt là 90%; 91,7% [16]. Trên đối

tượng cá hồng bạc (Sparus sarba), Li và cộng sự (1999) chỉ ra rằng tỉ lệ sống sót

của cá khi bị gây nhiễm với chủng V. parahaemolyticus là 0% ở nồng độ 108

CFU/ml và 100 μl/con [80]. Trong nghiên cứu này, hai chủng vi khuẩn B5M3 và

N9.2 đã gây chết cho cá được gây nhiễm với tỉ lệ cá chết là 97,78% (tỉ lệ sống sót

2,22%) ở nồng độ gây nhiễm 107 CFU/ml. Đây là 2 chủng vi khuẩn có độc tính cao

nhất, tuy nhiên không có sự sai khác có ý nghĩa về tỉ lệ sống sót của cá sau gây

nhiễm với 2 chủng này so và ở cá gây nhiễm 5 chủng vi khuẩn khác (LBT6; B3.13;

A3.3; B20M2 và N13.1.1). Các chủng vi khuẩn B5M2, B5M4, B13M1 và HH3-34

được đánh giá có độc lực thấp hơn.

Giải phẫu và quan sát các nội quan của cá nhận thấy gan và thận cá bị hoại tử

nghiêm trọng. Phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu cá chết trên môi trường TCBS đã

phát hiện 30/30 (100%) mẫu cá bệnh phát hiện có vi khuẩn với đặc điểm đặc trưng

của vi khuẩn V. parahaemolyticus: khuẩn lạc mầu xanh đậm, mặt bóng và có hình

tròn đều, là vi khuẩn Gram âm, có khả năng lên men glucose, không lên men lactose

không sinh H2S, không sinh khí, sinh indol, có khả năng di động, sinh catalase. Đặc

biệt, với cá mú bị gây nhiễm bằng vi khuẩn LBT6, A3.3 và B3.13 có hiện tượng nội

quan bị tổn thương nghiêm trọng, có nhiều trường hợp cá chết được giải phẫu và

cấu trúc gan thận không còn nguyên vẹn, bị phân hủy.

Dựa vào kết quả đánh giá độc lực của các chủng V. parahaemolyticus phân lập

được, triệu chứng bệnh trên cá, chúng tôi chọn được 3/7 chủng vi khuẩn có độc lực

cao, bao gồm LBT6, A3.3 và B3.13. Các chủng này sẽ được sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo.

3.1.5. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi

khuẩn phân lập

(a) Xác định trình tự hoàn chỉnh của gen toxR và tlh

Gen toxR

Sử dụng cặp mồi tự thiết kế (toxR2-toxR4) dựa trên trình tự hệ gen V.

parahaemolyticus công bố trên ngân hàng gen (NCBI), chúng tôi đã khuếch đại gen toxR

từ DNA của 11 chủng vi khuẩn phân lập và chủng đối chứng VTCC 12233. Sản phẩm

PCR với cặp mồi toxR2-toxR4 có kích thước như dự kiến là ~1000 bp (hình 3.10) và gửi

giải trình tự tại First BASE Laboratories, Selangor, Malaysia.

Hình 3.10. Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR của các chủng vi khuẩn với cặp mồi toxR2, toxR4 Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1 kb

Số hiệu gen

STT

Chủng

Tổng số điểm

Tỉ lệ che phủ (%)

Độ tương đồng (%)

Giá trị kì vọng

1618

100

99,89

CP006008.1

0,0

1618

100

0,0

99,89

CP003972.1

V. parahaemolyticus CDC_K4557 V. parahaemolyticus BB22OP

1591

100

0,0

99,32

CP028342.1

1591

100

0,0

99,32

L11929.1

1585

100

0,0

99,20

AY527396.1

3 V. parahaemolyticus R13 V. parahaemolyticus AQ3815 V. parahaemolyticus ATCC 17802

1580

100

0,0

99,09 MF983556.1

1580

100

0,0

99,09

CP013826.1

…

0,0

1546

100

99,00

AB029910.1

6 V. parahaemolyticus VP3 V. parahaemolyticus FORC_018 V. parahaemolyticus Y- 27669

… 100 V. parahaemolyticus 1937

937

0,0

98,68

KM036063.1

Bảng 3.6. So sánh trình tự gen toxR của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST

Số liệu trình tự gen toxR của 3 chủng (A3.3, LBT6, B3.13) đã được phân

tích bằng công cụ BLAST. Mức độ tương đồng của các trình tự gen này ở 03

chủng vi khuẩn phân lập được so sánh với các trình tự đã được công bố trên

Genbank. Từ bảng 3.6 nhận thấy, sản phẩm khuếch đại gen toxR với cặp mồi

toxR2-toxR4 từ DNA tổng số của chủng vi khuẩn LBT6 có trình tự nucleotide

(phụ lục 1) tương đồng 99% với các trình tự gen này của các chủng V.

parahaemolyticus công bố trên ngân hàng gen. Hai chủng còn lại, B3.13 và

A3.3, cũng cho kết quả tương tự (phụ lục 6). Kết quả giải trình tự này một lần

nữa củng cố thêm cho nhận định rằng các chủng vi khuẩn phân lập: B3.13; A3.3

và LBT6 là thuộc loài V. parahaemolyticus và cặp mồi toxR2-toxR4 được thiết

kế trong nghiên cứu này là đặc hiệu, khuếch đại chính xác gen toxR.

Như đã đề cập trên đây, sản phẩm khuếch đại gen toxR trong các báo cáo

trước là khá khác nhau (368 bp [3, 162]; 474 bp [156]; 528 bp [55]; 555 bp [120])

tùy cặp mồi đã dùng để thực hiện phản ứng PCR với DNA khuôn của các chủng V.

parahaemolyticus. Do đó, việc xác định kích thước đầy đủ của các gen độc tố hoàn

chỉnh, từ bộ ba mã mở đầu đến bộ ba mã kết thúc (ORF) là hết sức cần thiết, không

chỉ là hiểu biết đầy đủ hơn về kích thước gen này mà còn giúp chúng tôi có thể so

sánh và phát hiện những đột biến có thể xảy ra trên trình tự gen này.

Phân tích của chúng tôi dựa trên hệ gen hoàn chỉnh của vi khuẩn V.

parahaemolyticus đã được công bố [21, 66, 68, 71], nhận thấy trình tự gen hoàn

chỉnh của gen này có kích thước 879 bp và sản phẩm có kích thước ~368 bp trong

báo cáo trước chỉ là một đoạn trong trình tự hoàn chỉnh của gen toxR. Với cặp mồi

toxR2-toxR4 được chúng tôi thiết kế dựa trên trình tự hệ gen đầy đủ đã khuếch đại

được sản phẩm PCR với kích thước ~1000 bp, trong khi sản phẩm PCR với cặp mồi

toxR-4, toxR-7 từ khuôn DNA tổng số của chủng A3.3; B3.13 và LBT6 chỉ có kích

thước ~368 bp. Giải trình tự và so sánh các trình tự từ sản phẩm khuếch đại ~1000

bp với sản phẩm PCR ~368 bp đã được tiến hành nhằm xác định tính hiệu quả cặp

mồi tự thiết kế trong việc có khuếch đại chính xác gen toxR đầy đủ hay không? Và

có chứa trình tự đã được báo cáo trong các công trình khác trước đây hay không?

Hình 3.11. So sánh hai trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi

toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) và toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB)

Hình 3.11 minh họa kết quả so sánh trình tự của các sản phẩm khuếch đại gen

toxR với hai cặp mồi khác nhau nêu trên bằng phần mềm CLC Genomics

Workbench 8.5. Có thể nhận thấy trình tự gen toxR được khuếch đại với cặp mồi

toxR2-toxR4 của chủng BLT6 đã bao phủ vùng trình tự của đoạn gen toxR khuếch

đại với cặp mồi toxR-4, toxR-7. Đoạn gen được khuếch đại nhờ cặp mồi toxR-4,

toxR-7 tương đồng hoàn toàn với đoạn trình tự nucleotide từ vị trí 453 đến vị trí

nucleotide 810 của trình tự gen đầy đủ 879 bp.

Hình 3.12. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen toxR của các chủng V.

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen toxR hoàn chỉnh của

chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13

(A) Gen toxR hoàn chỉnh của chủng A3.3/LBT6/B3.13 được khuếch đại bởi cặp mồi toxR2

và toxR4; (B) đoạn gen toxR và toxS của chủng KP34 với mã số DQ845170.1 [153] và các đoạn

gen toxR của (C) chủng CECT611 với mã số FM202714.1 [120], (D) chủng ATCC 17802 với mã

số GQ228073.1 [156], (E) chủng C1 với mã số JQ929913.1 [3] và chủng A3.3/B3.13/LBT6 được

khuếch đại bởi cặp mồi toxR-4, toxR-7.

Tương tự, chúng tôi cũng tiến hành so sánh các đoạn trình tự thuộc gen toxR

được công bố trên NCBI với đoạn trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch

đại bởi cặp mồi toxR2-toxR4. Các trình tự trên NCBI được dùng để so sánh bao

gồm: đoạn trình tự gen toxR của chủng V. parahaemolyticus KP34 với mã số

DQ845170.1 [153], của chủng V. parahaemolyticus CECT611 với mã số

FM202714.1 [120], chủng V. parahaemolyticus ATCC 17802 với mã số

GQ228073.1 [156], chủng V. parahaemolyticus C1 với mã số JQ929913.1 [3]. Mức

độ tương đồng giữa trình tự gen toxR của LBT6 với các trình tự nêu trên là rất cao,

99%. Phân tích về chiều dài, độ bao phủ của các đoạn trình tự toxR của chủng LBT6

cũng như 02 chủng còn lại (B3.13; A3.3) với các trình tự gen này trên ngân hàng

gen thu được kết quả như minh họa ở hình 3.12. Kết quả so sánh cho chúng tôi kết

luận rằng: 879 bp là kích thước đầy đủ của gen toxR hoàn chỉnh, từ mã mở đầu

ATG đến mã kết thúc TAA của gen. Các trình tự đoạn gen toxR thu được do khuếch

đại PCR đã được các tác giả khác công bố trước đây chỉ là một phần trong gen toxR

hoàn chỉnh (hình 3.12). Trình tự gen toxR của chủng A3.3 đã được chúng tôi đăng

kí trên Genbank với mã số MH047286. Phân tích trình tự chuỗi polypeptide suy

diễn do trình tự gen toxR hoàn chỉnh mã hóa đã cho thấy chuỗi polypeptide suy diễn

có kích thước 292 amino acid.

Gen tlh

Tương tự với gen toxR, gen tlh cũng được khuếch đại với cặp mồi tlh1-tlh3

được thiết kế trong nghiên cứu này. Sản phẩm PCR của gen tlh ở 11 chủng vi

khuẩn phân lập và chủng VTCC 12233 có kích thước như dự kiến ~1500 bp

(hình 3.13). Sản phẩm PCR của 03 chủng B3.13; A3.3 và LBT6 được giải trình

tự và phân tích trình tự.

N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1 kb

Hình 3.13. Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh của các chủng vi khuẩn với cặp mồi tlh1- tlh3 Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2;

Trình tự gen tlh của 3 chủng (A3.3, LBT6, B3.13) đã được phân tích bằng

công cụ BLAST. Trình tự gen tlh của 03 chủng vi khuẩn phân lập được so sánh

với các trình tự đã được công bố trên Genbank. Từ bảng 3.7 nhận thấy, sản phẩm

khuếch đại gen tlh bằng cặp mồi tlh1-tlh3 từ DNA tổng số của chủng LBT6 có

trình tự nucleotide tương đồng 99% với các trình tự gen này của hàng chục

chủng V. parahaemolyticus công bố trên ngân hàng gen. Tương tự, hai chủng

còn lại, B3.13 và A3.3, cũng cho kết quả mức độ tương đồng cao (99%) với các

chủng trên ngân hàng gen (phụ lục 7). Kết quả giải trình tự cho thấy cặp mồi

tlh1-tlh3 được thiết kế trong nghiên cứu này là đặc hiệu, khuếch đại chính xác

gen tlh.

Bảng 3.7. So sánh trình tự gen tlh của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các

trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST

STT

Tổng

Tỉ lệ che

Giá trị

Độ tương

Chủng

Số hiệu gen

số điểm

phủ (%)

kì vọng

đồng (%)

1 V. parahaemolyticus FORC_006 2 V. parahaemolyticus 160807 3 V. parahaemolyticus UCM-V493

2300 2278 2272

100 100 100

0,0 0,0 0,0

99,76 99,44 99,36

CP009766.1 CP033142.1 CP007005.1

2261

100

0,0

99,20

CP020035.1

2261

100

0,0

99,20

CP020428.2

V. parahaemolyticus 20130629002S01 V. parahaemolyticus FDAARGOS_191

2261 2261

100 100

0,0 0,0

99,20 99,20

JF513048.1 KT948112.1

2255

100

0,0

99,12 GU971655.1

6 V. parahaemolyticus Vp-18 7 V. parahaemolyticus VH12 V. parahaemolyticus ATCC 33846

10 V. parahaemolyticus VP

2250

100

0,0

99,04 AY289609.1

…

55 V. parahaemolyticus 1937

1092

0,0

99,01 KM036065.1

…

802

0,0

98,89

JX262976.1

V. parahaemolyticus ATCC 17802

100 V. parahaemolyticus JBW-8-11-2

802

0,0

98,89

JX262971.1

Sản phẩm khuếch đại gen tlh là khá khác nhau: 450 bp [3, 70, 170]; 404 bp

[166] hay 352 bp [40] tùy từng cặp mồi dùng để thực hiện trong phản ứng PCR với

DNA khuôn của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus. Phân tích của chúng tôi

dựa trên hệ gen hoàn chỉnh của vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được công bố [21],

nhận thấy trình tự gen hoàn chỉnh của tlh có kích thước 1254 bp và sản phẩm có

kích thước ~450 bp trong các báo cáo trước chỉ là một đoạn trong trình tự hoàn

chỉnh của gen tlh. Với cặp mồi tlh1 - tlh3 được chúng tôi thiết kế dựa trên trình tự

hệ gen đầy đủ đã khuếch đại được sản phẩm PCR với kích thước khoảng ~1500 bp,

trong khi sản phẩm PCR với cặp mồi tlhF-tlhR từ DNA tổng số của chủng A3.3;

B3.13 và LBT6 chỉ có kích thước ~450 bp. Giải trình tự và so sánh các trình tự từ

sản phẩm khuếch đại ~1500 bp với sản phẩm PCR ~450 bp đã được tiến hành nhằm

xác định tính hiệu quả cặp mồi tự thiết kế trong việc có khuếch đại chính xác gen

tlh đầy đủ.

Hình 3.14 minh họa kết quả so sánh trình tự của các sản phẩm khuếch đại gen

tlh với hai cặp mồi khác nhau nêu trên bằng phần mềm CLC Genomics Workbench

8.5. Có thể nhận thấy trình tự gen tlh được khuếch đại bởi cặp mồi tlh1-tlh3 của

chủng BLT6 là đã bao phủ vùng trình tự của đoạn gen tlh khuếch đại bởi cặp mồi

tlhF-tlhR. Đoạn gen được khuếch đại nhờ cặp mồi tlhF - tlhR tương đồng hoàn toàn

với đoạn trình tự nucleotide từ vị trí 784 đến vị trí nucleotide 1229 của trình tự gen

đầy đủ 1254 bp.

Hình 3.14. So sánh hai trình tự gen tlh của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi

tlhF - tlhR (LBT6-tlh-seqA) và tlh1-tlh3 (LBT6-tlh-seqB)

Hình 3.15. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen tlh của các chủng V.

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen tlh hoàn chỉnh của

chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13

(A) gen tlh hoàn chỉnh của chủng A3.3/LBT6/B3.13 được khuếch đại bởi cặp mồi tlh1-tlh3 và đoạn

gen tlh của (B) chủng C1 với mã số JQ929914.1 [3] và chủng A3.3/B3.13/LBT6 khuếch đại bởi

cặp mồi tlhF-tlhR (C) chủng VP với mã số AY829372.1 [166] (D) chủng KVp5 với mã số

HM195239.1 [40].

Tương tự, chúng tôi cũng tiến hành so sánh các đoạn trình tự thuộc gen tlh

được công bố trên NCBI với đoạn trình tự gen tlh của chủng LBT6 được khuếch đại

bởi cặp mồi tlh1-tlh3. Các trình tự trên NCBI được dùng để so sánh bao gồm trình

tự của của chủng V. parahaemolyticus C1 [3], chủng V. parahaemolyticus VP

[166] và chủng V. parahaemolyticus KVp5 [40]. Mức độ tương đồng giữa trình tự

gen tlh của LBT6 với các trình tự nêu trên là rất cao, 99%. Phân tích về chiều dài,

độ bao phủ của các đoạn trình tự tlh ở chủng LBT6 cũng như 02 chủng còn lại

(B3.13; A3.3) với các trình tự gen này trên ngân hàng gen thu được kết quả như

minh họa ở hình 3.15. Kết quả so sánh cho chúng tôi kết luận rằng: 1254 bp là kích

thước đầy đủ của gen tlh hoàn chỉnh, từ mã mở đầu ATG đến mã kết thúc TAA của

gen. Các trình tự đoạn gen tlh do khuếch đại PCR đã được các tác giả khác công bố

trước đây chỉ là một phần trong gen tlh hoàn chỉnh (hình 3.15). Trình tự gen tlh của

chủng A3.3 đã được chúng tôi đăng kí trên Genbank với mã số MH047289. Phân

tích trình tự chuỗi polypeptide suy diễn do trình tự gen tlh hoàn chỉnh mã hóa đã

cho thấy chuỗi polypeptide suy diễn có kích thước 417 amino acid.

(b) Xác định trình tự gen rpoB của các chủng vi khuẩn phân lập

Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase có kích thước là

4029 bp [93]. Chúng tôi sử dụng cặp mồi 1110F-CM32b khuếch đại một đoạn trình

tự gen rpoB với sản phẩm PCR có kích thước ~984 bp ở 11 chủng vi khuẩn phân

lập và chủng VTCC 12233 (hình 3.16). Sản phẩm PCR của 03 chủng vi khuẩn

B3.13; A3.3 và LBT6 được giải trình tự và phân tích trình tự và cho kết quả trình tự

từ vị trí nucleotide 1121 đến 2050.

Hình 3.16. Sản phẩm PCR (~984 bp) gen rpoB của các chủng vi khuẩn với cặp mồi

Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2;

N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1 kb

1110F-CM32b

Bảng 3.8. So sánh trình tự gen rpoB của chủng V. parahaemolyticus LBT6 với các

trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST

Chủng

Số hiệu gen

STT

Tổng số điểm

Giá trị kì vọng

1 2 3 4 5

Tỉ lệ che phủ (%) 1749 100 1749 100 1738 100 1733 100 1705 100

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Độ tương đồng (%) 99,79 CP026041.1 99,79 CP0232248.1 99,58 CP010883.1 99,48 CP023710.1 98,95 KJ647551.1

0,0

1688 100

98,64 CP014046.1

V. parahaemolyticus 10329 V. parahaemolyticus MAVP-26 V. parahaemolyticus CHN25 V. parahaemolyticus HA2 V. parahaemolyticus VN-10092 V. parahaemolyticus ATCC 17802

1688 100 1688 100 1685 100 1683 100

98,64 CP003972.1 98,64 EU909181.1 98,53 KJ647848.1 98,53 CP022473.1

1677 100

98,43 KJ647541.1

V. parahaemolyticus BB22OP 7 V. parahaemolyticus 17802 8 9 V. parahaemolyticus VN-3326 10 V. parahaemolyticus MAVP-R ……………… 55 V. parahaemolyticus VN-10078 ………………… 99 V. parahaemolyticus VN-2922 100 V. parahaemolyticus VN-4027

1668 100 1664 100

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

98,22 KJ647635.1 98,11 KJ648147.1

Trình tự gen rpoB của 03 chủng (A3.3; LBT6; B3.13) đã được phân tích bằng

công cụ BLAST. Mức độ tương đồng của trình tự gen rpoB ở 03 chủng vi khuẩn

phân lập được so sánh với các trình tự đã được công bố trên Genbank. Từ bảng 3.8

nhận thấy, sản phẩm khuếch đại gen rpoB bằng cặp mồi 1110F-CM32b từ DNA

tổng số của chủng LBT6 có trình tự nucleotide tương đồng 99% với các trình tự gen

này của hàng chục chủng V. parahaemolyticus công bố trên ngân hàng gen. Tương

tự, hai chủng còn lại (B3.13 và A3.3) cũng cho kết quả mức độ tương đồng cao

(99%) với các chủng trên ngân hàng gen (phụ lục 8).

Trình tự được khuếch đại bởi cặp mồi 1110F-CM32b gồm đoạn trình tự từ

vị trí nucleotide 1121 đến 2050 tương ứng với vị trí amino acid 374 đến 684.

Đây cũng là đoạn trình tự chứa các vùng bảo tồn của Vibrio và một số vùng có

vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác của RNA polymerase [123]. Kháng

sinh rifampicin có khả năng liên kết với tiểu đơn vị β (được mã hóa bởi gen rpoB)

của RNA polymerase gây cản trở sự khởi đầu phiên mã của vi khuẩn. Vùng trình tự

bao gồm 81 bp mã hóa cho amino acid từ vị trí 507 đến 533 (27 amino acid) được

gọi là rifampicin-resistance determining region (RRDR, vùng xác định kháng

rifampicin). Đột biến ở trình tự RRDR của gen rpoB là nguyên nhân gây đến tính

kháng rifampicin của vi khuẩn [108]. Như vậy, vùng trình tự từ nucleotide 1121

đến 2050 của gen rpoB đã bao phủ vùng RRDR. Một số nghiên cứu cho rằng

những biến đổi được phát hiện trên gen rpoB cũng có thể liên quan đến tính giảm

độc lực của vi khuẩn. Perez-Varela và cộng sự (2017) cho rằng những đột biến xảy

ra trên tiểu đơn vị β của RNA polymerase dẫn đến suy giảm khả năng di động cũng

như độc lực của vi khuẩn Acinetobacter baumannii [124].

Ba chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập (A3.3 ; LBT6 ; B3.13) có

khả năng gây bệnh cho cá mú chấm cam, có độc lực cao, đã được phân tích về trình

tự gen toxR, tlh và rpoB được chúng tôi sử dụng để xử lý rifampicin tạo các dòng vi

khuẩn giảm độc lực.

3.2. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực

3.2.1. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin

Ba chủng vi khuẩn chọn được: LBT6, A3.3 và B3.13, chúng tôi tạm gọi chúng

như là những chủng vi khuẩn dại vì được phân lập từ mô cá bệnh và có độc lực cao,

được nuôi cấy và chọn dòng trên các môi trường BHI và TCBS agar có bổ sung

nồng độ rifampicin tăng dần 10 µg/ml/lần nuôi cấy. Các dòng vi khuẩn kháng

rifampicin được chọn ra từ các khuẩn lạc mọc được trên môi trường TCBS agar có

250 µg/ml rifampicin sẽ được xem là dòng kháng rifampicin. Tổng cộng đã chọn

lọc được 13 dòng vi khuẩn kháng rifampicin từ 03 chủng vi khuẩn dại nuôi cấy: 03

dòng chọn được từ chủng dại A3.3 (kí hiệu A400, A500 và A650); 06 dòng (L1380,

L2100, L3600, L3900, L4200, L4650) từ chủng dại LBT6 và 04 dòng (B7900,

B7050, B5700, B5250) từ chủng dại B3.13.

(a) Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn A400, A500, A650

)

%

A3.3

A650

A500

A400

( á c a ủ c t ó s g n ố s ệ l ỉ

PBS

T

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

120

Thời gian sau gây nhiễm (giờ)

Hình 3.17. Tỉ lệ sống sót của cá ngựa vằn sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại A3.3

Ba dòng vi khuẩn kháng rifampicin A400, A500, A650 được đánh giá độc lực

thông qua thí nghiệm gây nhiễm khuẩn cho cá ngựa vằn và cá rô phi.

Đối với cá ngựa vằn, kết quả về tỉ lệ sống sót của cá sau thời gian gây nhiễm

được thể hiện tại hình 3.17. Cá ngựa vằn gây nhiễm bị chết do bị xuất huyết trên da

và loét ở vị trí gây nhiễm (hình 3.18).

Hình 3.18. Cá ngựa vằn chết do nhiễm khuẩn A3.3 sau 12 giờ

Khi tiêm chủng dại A3.3 và dòng A500 vào cá ngựa vằn, tỉ lệ sống sót của

cá giảm mạnh trong khoảng thời gian từ 03 giờ đến 24 giờ sau tiêm; và giảm

xuống 0% sau 24 giờ (đối với cá được gây nhiễm với A3.3) và 0% sau 48 giờ

(đối với cá được gây nhiễm với A500). Có thể nhận thấy dòng A500 không phải

dòng giảm độc lực so với chủng dại A3.3. Ngược lại, hai dòng A650 và A400

được đánh giá là dòng giảm độc lực so với chủng dại A3.3. Với dòng vi khuẩn

A650, sau 03 giờ tiêm gây nhiễm tỉ lệ cá sống sót là 94,44%, giảm xuống

77,78% sau 09 giờ, từ 09 giờ đến 120 giờ sau tiêm không thấy hiện tượng cá

chết. Dòng A400 cũng được ghi nhận là giảm độc lực so với chủng dại A3.3, tuy

nhiên, độc lực của nó vẫn cao hơn dòng A650 vì tỉ lệ cá sống sót sau 120 giờ chỉ

đạt 60%.

Paranjpye và cộng sự (2013) đã khẳng định cá ngựa vằn là đối tượng mô hình

có thể sử dụng trong nghiên cứu về độc lực của V. parahaemolyticus [117]. Trong

đó, tác giả nhận định rằng vi khuẩn này có tiến triển bệnh trên cá ngựa vằn khá

nhanh, sau 03 giờ gây nhiễm với vi khuẩn đã xuất hiện hiện tượng hoại tử ở nội

tạng (thận, gan) và có thể gây chết cá. Do đó, thời gian đánh giá tỉ lệ sống sót

của cá là khá ngắn (trong 120 giờ).

100

)

%

A3.3

A400

A500

A650

PBS

( á c a ủ c t ó s g n ố s ệ l ỷ T

9 10 11 12 13 14

8 Thời gian sau gây nhiễm (ngày)

Hình 3.19. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh

từ chủng dại A3.3

Đối với cá rô phi, tỉ lệ sống sót của cá khi được gây nhiễm với A650 và A400

sau 14 ngày tương ứng lần lượt là 80% và 66,67% (hình 3.19). Tỉ lệ này ở cá được

gây nhiễm với chủng vi khuẩn dại A3.3 và dòng A500 tại thời điểm 14 ngày sau

tiêm là 6,67%. Cá rô phi bị bệnh sau khi bị lở loét ở vùng gây nhiễm, cụt vây, cụt

đuôi và hoại tử các cơ quan như thận, gan (hình 3.20). Tỉ lệ sống sót ở cá rô phi đối

chứng được tiêm dung dịch PBS là 100%. Kết quả này cho thấy dòng vi khuẩn

A650 và A400 là những dòng giảm độc lực, trong đó dòng A650 là dòng giảm độc

lực nhiều hơn.

Ghi chú: Mũi tên chỉ bệnh tích của cá

Hình 3.20. Cá rô phi chết do nhiễm vi khuẩn (A) A3.3; (B) A400

Từ kết quả thí nghiệm với cả cá ngựa vằn và cá rô phi có thể kết luận rằng các

dòng vi khuẩn A650 và A400 phát sinh từ chủng vi khuẩn dại A3.3 là những dòng

giảm độc lực, trong đó dòng A650 giảm độc lực hơn. Riêng với dòng A500 còn độc

lực khá cao, gần tương đương với chủng dại A3.3.

Thí nghiệm đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn trong nghiên cứu này đã

cho kết quả tương tự nhau cả trong thí nghiệm với cá ngựa vằn và cá rô phi. Vì vậy,

có thể nói được rằng cá rô phi - loài thủy sản nuôi là một đối tượng mô hình tiềm năng

cho các nghiên cứu độc lực của V. parahaemolyticus. Cá ngựa vằn có kích thước nhỏ,

do đó những thao tác gây nhiễm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn vào phúc mạc dưới

da của cá khá khó khăn. Sử dụng cá biển như cá mú với số lượng lớn cho thí nghiệm

nghiên cứu đánh giá độc lực của nhiều dòng vi khuẩn Vibrio chọn lọc trong điều kiện

phòng thí nghiệm là ít khả thi. Từ đó, trong các thí nghiệm tiếp theo về đánh giá độc

lực của các chủng/dòng vi khuẩn chúng tôi lựa chọn tiến hành đánh giá trên đối tượng

cá rô phi mà không tiến hành trên đối tượng cá ngựa vằn.

Độc lực của các chủng/dòng vi khuẩn cũng được đánh giá chính xác thông qua

định liều LD50. Kết quả thí nghiệm định liều LD50 được trình bày tại bảng 3.9. Giá trị LD50 của chủng dại A3.3; dòng A650, A500, A400 tương ứng lần lượt là 104,03; 108,12; 104,06 và 107,32 CFU/ml. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu về tỉ lệ

sống sót của cá sau khi lây nhiễm cùng nồng độ giữa các chủng. Dòng A650 và

dòng A400 là hai dòng giảm độc lực, trong đó dòng A650 là dòng giảm độc lực

hơn. Dòng A500 không thay đổi đáng kể về độc lực so với chủng dại A3.3.

Bảng 3.9. Giá trị LD50 của chủng A3.3 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin

Nồng độ (CFU/ml)

Số cá chết (con)

Số cá sống (con)

Tỉ lệ chết (%)

Số cá chết cộng dồn (con)

Số cá thí nghiệm (con)

Số cá sống cộng dồn (con)

Tỉ lệ chết cộng dồn (%)

A3.3

108 107 106 105 104 103 102 101

30 30 30 30 30 30 30 30

30 27 26 21 15 11 6 0

0 3 4 9 15 19 24 30

100,00 90,00 86,67 70,00 50,00 36,67 20,00 0,00

136 106 79 53 32 17 6 0

0 3 7 16 31 50 74 104

100,00 97,25 91,86 76,81 50,79 25,37 7,50 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 50,79 và 25,37 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (50,79 - 50)/(50,79 - 25,37) = 0,03 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,03) = 104,03 A650 109 108 107 106 105 104 103 102 101

80,00 50,00 20,00 10,00 6,67 0,00 0,00 0,00 0,00

24 15 6 3 2 0 0 0 0

6 15 24 27 28 30 30 30 30

30 30 30 30 30 30 30 30 30

50 26 11 5 2 0 0 0 0

7 22 46 73 101 131 161 191 221

87,72 54,17 19,30 6,41 1,94 0,00 0,00 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 54,17 và 19,30 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (54,17 - 50)/(54,17 - 19,30) = 0,12 LD50 = 10(a+x) = 10(8 + 0,12) = 108,12 A500 108 107 106 105 104 103 102 101

100,00 90,00 83,33 70,00 50,00 40,00 23,33 0,00

137 107 80 55 34 19 7 0

30 27 25 21 15 12 7 0

30 30 30 30 30 30 30 30

0 3 5 9 15 18 23 30

0 3 8 17 32 50 73 103

100,00 97,27 90,91 76,39 51,52 27,54 8,75 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 51,52 và 27,54 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (51,52 - 50)/(51,52 - 27,54) = 0,06 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,06) = 104,06 A400 109 108 107 106 105 104 103 102 101

100,00 90,00 36,67 30,00 23,33 10,00 3,33 0,00 0,00

30 27 11 9 7 3 1 0 0

0 3 19 21 23 27 29 30 30

30 30 30 30 30 30 30 30 30

88 58 31 20 11 4 1 0 0

0 3 22 43 66 93 122 152 182

100,00 95,08 58,49 31,75 14,29 4,12 0,81 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 58,49 và 31,75 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (58,49 - 50)/(58,49 - 31,75) = 0,32 LD50 = 10(a+x) = 10(7 + 0,32) = 107,32

(b) Đánh giá độc lực của dòng L1380, L2100, L3600, L3900, L4200, L4650

Sáu dòng vi khuẩn kháng rifampicin bao gồm L1380, L2100, L3600, L3900,

L4200 và L4650 được tạo ra từ chủng dại LBT6. Các dòng vi khuẩn này sẽ được

đánh giá về độc lực thông qua: Tỉ lệ sống sót của cá rô phi khi bị gây nhiễm các

dòng kháng ở cùng một liều lượng (hình 3.21) và giá trị LD50 của các dòng này so

100

với chủng dại LBT6 (bảng 3.10).

)

%

LBT6

L1380

L2100

L3600

L4200

L3900

( á c a ủ c t ó s g n ố s ệ l ỉ

T

L4650

PBS

10 11 12 13 14

Thời gian sau gây nhiễm (ngày)

Hình 3.21. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh

từ chủng dại LBT6

Theo số liệu tại hình 3.21, tỉ lệ sống sót của cá rô phi sau 14 ngày gây nhiễm

dòng L4650 được đánh giá là cao nhất (85,56%). Tỉ lệ này ở cá được tiêm với dòng

vi khuẩn L4200, L3900, L3600 lần lượt là 62,22%; 54,44% và 17,78% và chúng

khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với tỉ lệ sống sót của cá rô phi khi tiêm chủng dại

LBT6 (8,89%). Như vậy, 04 dòng vi khuẩn giảm độc lực so với chủng dại LBT6

bao gồm L3600, L3900, L4200 và L4650. Trong đó, dòng L4650 là dòng vi khuẩn

giảm độc lực nhất. Ngược lại không có sự sai khác có ý nghĩa giữa tỉ lệ sống sót của

cá được tiêm với chủng LBT6 so với tỉ lệ này ở cá được tiêm với dòng L1380 và

L2100. Hai dòng vi khuẩn này không phải dòng giảm độc lực.

Giá trị LD50 của các dòng vi khuẩn L4650, L4200, L3900, L3600, L2100,

L1380 có giá trị lần lượt như sau 108,15; 108,09; 107,22; 105,03; 104,03 và 104,06 CFU/ml

trong khi chủng dại LBT6 có giá trị LD50 đạt 104,09 CFU/ml. Kết quả này kết hợp

với kết quả về tỉ lệ sống sót của cá sau khi gây nhiễm cùng nồng độ giữa các chủng

nhận thấy: dòng L3600, L3900, L4200, L4650 là những dòng giảm độc lực trong

khi dòng L1380 và L2100 không thay đổi về độc lực so với chủng dại. Trong đó,

dòng L4200 và L4650 là những dòng được đánh giá là có độc lực giảm mạnh nhất

so với chủng dại. Dòng L3600 có giảm độc lực nhưng không nhiều so với chủng

dại, do đó, không được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.10. Giá trị LD50 của chủng LBT6 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin

Nồng độ (CFU/ml)

Số cá chết (con)

Số cá sống (con)

Tỉ lệ chết (%)

Số cá thí nghiệm (con)

Số cá chết cộng dồn (con)

Tỉ lệ chết cộng dồn (%)

Số cá sống cộng dồn (con)

LBT6 108 107 106 105 104 103 102 101

30 30 30 30 30 30 30 30

30 28 27 21 16 11 4 0

0 2 3 9 14 19 26 30

100,00 93,33 90,00 70,00 53,33 36,67 13,33 0,00

137 107 79 52 31 15 4 0

0 2 5 14 28 47 73 103

100,00 98,17 94,05 78,79 52,54 24,19 5,19 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 52,54 và 24,19 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (52,54 - 50)/(52,54 - 24,19) = 0,09 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,09) = 104,09 L4650 109 108 107 106 105 104 103

86,67 56,67 13,33 10,00 0,00 0,00 0,00

50 24 7 3 0 0 0

4 13 26 27 30 30 30

26 17 4 3 0 0 0

30 30 30 30 30 30 30

4 17 43 70 100 130 160

92,59 58,54 14,00 4,11 0,00 0,00 0,00

102 101

30 30

0 0

30 30

0,00 0,00

0 0

190 220

0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 58,54 và 14,00 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (58,54 - 50)/(58,54 - 14,00) = 0,15 LD50 = 10(a+x) = 10(8 + 0,15) = 108,15 L4200 109 108 107 106 105 104 103 102 101

70,00 46,67 36,67 6,67 3,33 0,00 0,00 0,00 0,00

21 14 11 2 1 0 0 0 0

30 30 30 30 30 30 30 30 30

9 16 19 28 29 30 30 30 30

49 28 14 3 1 0 0 0 0

9 25 44 72 101 131 161 191 221

84,48 52,83 24,14 4,00 0,98 0,00 0,00 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 52,83 và 24,14 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (52,83 - 50)/(52,83 - 24,14) = 0,09 LD50 = 10(a+x) = 10(8 + 009) = 108,09 L3900 109 108 107 106 105 104 103 102 101

100,00 80,00 46,67 33,33 10,00 6,67 0,00 0,00 0,00

0 6 16 20 27 28 30 30 30

30 30 30 30 30 30 30 30 30

30 24 14 10 3 2 0 0 0

83 53 29 15 5 2 0 0 0

0 6 22 42 69 97 127 157 187

100,00 89,83 56,86 26,32 6,76 2,02 0,00 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 56,86 và 26,32 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (56,86 - 50)/(56,86 - 26,32) = 0,22 LD50 = 10(a+x) = 10(7 + 0,22) = 107,22 L3600 109 108 107 106 105 104 103 102 101

100,00 93,33 83,33 73,33 56,67 30,00 10,00 0,00 0,00

134 104 76 51 29 12 3 0 0

0 2 5 8 13 21 27 30 30

30 30 30 30 30 30 30 30 30

30 28 25 22 17 9 3 0 0

0 2 7 15 28 49 76 106 136

100,00 98,11 91,57 77,27 50,88 19,67 3,80 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 50,88 và 19,67 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (50,88 - 50)/(50,88 - 19,67) = 0,03 LD50 = 10(a+x) = 10(5 + 0,03) = 105,03 L2100 108 107 106 105 104 103 102 101

100,00 90,00 83,33 70,00 56,67 36,67 10,00 0,00

134 104 77 52 31 14 3 0

30 27 25 21 17 11 3 0

0 3 5 9 13 19 27 30

30 30 30 30 30 30 30 30

0 3 8 17 30 49 76 106

100,00 97,20 90,59 75,36 50,82 22,22 3,80 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 50,82 và 22,22 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (50,82 - 50)/(50,82 - 22,22) = 0,03 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,03) = 104,03 L1380 108 107 106 105 104 103 102 101

100,00 90,00 83,33 70,00 53,33 43,33 13,33 0,00

136 106 79 54 33 17 4 0

30 27 25 21 16 13 4 0

30 30 30 30 30 30 30 30

0 3 5 9 14 17 26 30

0 3 8 17 31 48 74 104

100,00 97,25 90,80 76,06 51,56 26,15 5,13 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 51,61 và 23,81 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (51,56 - 50)/(51,56 - 26,15) = 0,06 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,06) = 104,06

Bốn dòng vi khuẩn kháng rifampicin B5250, B7050, B7900 và B5700 phát

sinh từ chủng dại B3.13. Các dòng vi khuẩn này được tiêm vào cá rô phi với cùng

nồng độ. Tỉ lệ sống sót của cá sau 14 ngày được gây nhiễm với các dòng vi khuẩn

B7050, B7900 và B5700 có giá trị lần lượt là 46,67%; 35,56% và 32,22% (hình

3.22). Trong khi, tỉ lệ sống sót của cá được tiêm với chủng dại B3.13 và dòng

B5250 rất thấp, chỉ đạt 6,67% và 7,78%. Như vậy, ba dòng vi khuẩn B7050, B7900

và B5700 là các dòng giảm độc lực và dòng B5250 không phải là dòng giảm độc

lực so với chủng dại B3.13.

100

)

%

B3.13

B5250

B5700

B7050

B7900

( á c a ủ c t ó s g n ố s ệ l ỷ T

PBS

10 11 12 13 14

Thời gian sau gây nhiễm (ngày)

Hình 3.22. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm bằng các dòng vi khuẩn phát

sinh từ chủng vi khuẩn dại B3.13

Để đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn, giá trị LD50 của các dòng vi

khuẩn trên cá rô phi của cũng được xác định. Cụ thể là, dòng B7900; B7050;

B5700; B5250 có giá trị LD50 trên cá rô phi lần lượt tương ứng là 106,18; 106,25;

105,06; 104,06 CFU/ml; trong khi, giá trị LD50 của chủng dại B3.13 là 104,03 CFU/ml.

Kết quả này khẳng định một lần nữa rằng ba dòng vi khuẩn B7050, B7900 và

B5700 là dòng giảm độc lực, được tuyển chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.11. Giá trị LD50 của chủng B3.13 và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin

Nồng độ (CFU/ml)

Số cá chết (con)

Số cá sống (con)

Tỉ lệ chết (%)

Số cá thí nghiệm (con)

Số cá chết cộng dồn (con)

Tỉ lệ chết cộng dồn (%)

Số cá sống cộng dồn (con)

B3.13 108 107 106 105 104 103

30 30 30 30 30 30

30 28 25 20 17 11

0 2 5 10 13 19

100,00 93,33 83,33 66,67 56,67 36,67

134 104 76 51 31 14

0 2 7 17 30 49

100,00 98,11 91,57 75,00 50,82 22,22

102 101

30 30

3 0

27 30

10,00 0,00

3 0

76 106

3,80 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 50,85 và 22,22 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (50,85 - 50)/(50,85 - 22,22) = 0,03 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,03) = 104,03 B7900 108 107 106 105 104 103 102 101

90,00 63,33 50,00 36,67 23,33 6,67 0,00 0,00

30 30 30 30 30 30 30 30

27 19 15 11 7 2 0 0

3 11 15 19 23 28 30 30

81 54 35 20 9 2 0 0

3 14 29 48 71 99 129 159

96,43 79,41 54,69 29,41 11,25 1,98 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 54,69 và 29,41 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (54,69 - 50)/(54,69 - 29,41) = 0,18 LD50 = 10(a+x) = 10(6 + 0,18) = 106,18 B7050 108 107 106 105 104 103 102 101

86,67 53,33 50,00 40,00 30,00 16,67 0,00 0,00

83 57 41 26 14 5 0 0

30 30 30 30 30 30 30 30

26 16 15 12 9 5 0 0

4 14 15 18 21 25 30 30

4 18 33 51 72 97 127 157

95,40 76,00 55,41 33,77 16,28 4,90 0,00 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 55,41 và 33,77 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (55,41 - 50)/(55,41 - 33,77) = 0,25 LD50 = 10(a+x) = 10(6 + 0,25) = 106,25 B5700 108 107 106 105 104 103 102 101

96,67 66,67 60,00 53,33 43,33 30,00 3,33 0,00

106 77 57 39 23 10 1 0

30 30 30 30 30 30 30 30

29 20 18 16 13 9 1 0

1 10 12 14 17 21 29 30

1 11 23 37 54 75 104 134

99,07 87,50 71,25 51,32 29,87 11,76 0,95 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 51,32 và 29,87 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (51,32 - 50)/(51,32 - 29,87) = 0,06 LD50 = 10(a+x) = 10(5 + 0,06) = 105,06

B5250 108 107 106 105 104 103 102 101

30 30 30 30 30 30 30 30

30 28 25 22 17 10 3 0

0 2 5 8 13 20 27 30

100,00 93,33 83,33 73,33 56,67 33,33 10,00 0,00

135 105 77 52 30 13 3 0

0 2 7 15 28 48 75 105

100,00 98,13 91,67 77,61 51,72 21,31 3,85 0,00

Tỉ lệ cận trên (Pa) và và tỉ lệ cận dưới (Pu) lần lượt là 51,72 và 21,31 x = (Pa - 50)/(Pa - Pu) = (51,72 - 50)/(51,72 - 21,31) = 0,06 LD50 = 10(a+x) = 10(4 + 0,06) = 104,06

Rifampicin là kháng sinh phổ rộng, có khả năng khuếch tán tự do trong mô, tế

bào sống, tế bào vi khuẩn [32, 74]. Đây cũng là tác nhân được sử dụng nhiều trong

các nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin phòng

một số bệnh trên cá. Nhiều nghiên cứu đã công bố rằng, khi nuôi cấy và chọn lọc

các chủng vi khuẩn dại trên môi trường chứa rifampicin với áp lực của việc tăng

dần nồng độ kháng sinh có thể chọn lọc được các dòng giảm độc lực. Trong nghiên

cứu này, phân tích độc lực của vi khuẩn chỉ ra rằng chín dòng vi khuẩn V.

parahaemolyticus kháng rifampicin bao gồm L3600, L3900, L4200, L4650,

B5700, B7050, B7900, A400, A650 là các dòng giảm độc lực được chọn lọc từ 3

chủng dại. Mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn thuộc các nhóm khác

nhau hoặc các dòng vi khuẩn ngay trong cùng một nhóm là khác nhau. Trong đó,

ba dòng vi khuẩn L4650, A650, L4200 có tính giảm độc lực cao hơn so với chủng

dại. Như vậy, tác động chọn lọc rifampicin trong việc tạo ra từng dòng vi khuẩn

giảm độc lực từ các chủng vi khuẩn dại là khác nhau. Có những dòng giảm độc

lực lớn so với chủng dại và ngược lại. Tác động chọn lọc của rifampicin đã gây

ra một áp lực nào đó dẫn đến các dòng vi khuẩn thay đổi về độc lực của mình.

Và xu hướng thay đổi tăng, giảm hay giữ nguyên độc lực có tính chất ngẫu

nhiên.

Chúng tôi tiếp tục chọn lọc 8/9 dòng vi khuẩn giảm độc lực (trừ dòng L3600

có độc lực giảm ít nhất so với chủng dại LBT6) để đánh giá đặc tính hóa sinh cũng

như phát hiện những thay đổi trong trên độc tố và gen rpoB, lý giải mối liên hệ giữa

tính giảm độc lực và những thay đổi ở trình tự nucleotide của các gen này.

3.2.2. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực

Tám dòng vi khuẩn giảm độc lực được đánh giá về đặc điểm sinh hóa và so

sánh đặc điểm của chúng với chủng vi khuẩn dại. Kết quả cho thấy, các dòng vi

khuẩn này đều có đặc điểm giống chủng dại, hay nói cách khác chúng không bị

thay đổi các đặc điểm sinh hóa so với chủng dại. Cụ thể là chúng đều có khả

năng lên men glucose, không lên men lactose, không sinh H2S, không sinh khí,

sinh catalase, sinh indol, có khả năng di động.

(A) Khả năng lên men; (B) Khả năng sinh indol; (C) Khả năng sinh catalase; (D) Khả

năng di động

Hình 3.23. Đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực

3.2.3. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và

chủng vi khuẩn dại

3.2.3.1. So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi

khuẩn dại

(a) Kết quả PCR

Khuếch đại gen toxR, tlh với hai cặp mồi toxR2-toxR4, tlh1-tlh3 của 8 dòng vi

khuẩn giảm độc lực L3900, L4200, L4650, B5700, B7050, B7900, A400, A650 đã

thu được kết quả thể hiện tại hình 3.24 và 3.25. Từ hình 3.24, 3.25 có thể nhận thấy

ở tất cả các dòng vi khuẩn giảm độc lực đều chứa gen tlh, toxR tương ứng với sản

phẩm PCR có kích thước ~1500 bp và ~1000 bp. Các băng của sản phẩm này có

kích thước phù hợp với dự kiến, đủ tiêu chuẩn để gửi mẫu giải trình tự các gen

nghiên cứu.

Ghi chú: 1-8: L3900, L4200, L4650, B5700, B7050, B7900, A400, A650; M: Marker 1kb

Hình 3.24. Sản phẩm PCR gen toxR của các dòng giảm độc lực trên gel agarose 1%

Các sản phẩm này được tinh sạch và giải trình tự tại First BASE Laboratories,

Selangor, Malaysia. Trình tự các gen của các dòng giảm độc lực được sử dụng để so

sánh với trình tự của các chủng vi khuẩn dại (A3.3, LBT6, B3.13) để phát hiện

những điểm đột biến xảy ra khi chủng dại được xử lý rifampicin.

Ghi chú: 1-8: L3900, L4200, L4650, B5700, B7050, B7900, A400, A650; M: Marker 1kb

Hình 3.25. Sản phẩm PCR gen tlh của các dòng giảm độc lực trên gel agarose 1%

(b) Kết quả so sánh trình tự gen

Trình tự gen toxR và tlh của ba chủng vi khuẩn dại và 08 dòng giảm độc lực

đã được giải trình tự, phân tích và so sánh để tìm kiếm các điểm đột biến ở hai gen

này. Từ đó, có thể xác định mối liên quan giữa các đột biến ở hai gen độc tố so với

sự giảm độc lực của các dòng vi khuẩn.

Khi so sánh trình tự gen toxR (879 bp), không phát hiện thấy sự thay đổi

trình tự nucleotide giữa các dòng vi khuẩn giảm độc lực so với các chủng dại ở

cả ba nhóm vi khuẩn. Trong khi đó, phân tích trình tự gen tlh nhận thấy có một

vài sự thay đổi về trình tự nucleotide giữa các dòng giảm độc lực so với chủng

dại của nó. Những thay đổi này được phát hiện khi so sánh các trình tự gen tlh

của dòng/chủng vi khuẩn dại trên phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5

được thể hiện tại bảng 3.12.

Bảng 3.12. Sự thay đổi nucleotide của gen tlh ở các dòng giảm độc lực so với các

chủng dại

Đột biến

Dòng

Amino

Sự thay đổi

Vị trí

Sự thay đổi trình tự amino acid suy diễn

nucleotide

acid codon

trình tự nucleotide

A400

A650

Dòng A400, A650 phát sinh từ chủng dại A3.3 346 352 366 369 399 345

1037 1055 1096 1105 1195 1033 1036

346

1038

Glu ® Asp Ala ® Ala (đột biến câm) Asp ® Asn Tyr ® Asp Arg ® Leu Glu ® Lys Glu ® Asn, kết quả dẫn đến đột biến dịch khung từ codon 346 đến codon 413, xuất hiện stop codon ở codon 350

1238-1239

413

Ala ® His

415

Tyr ® Stop codon

416

Arg ® Pro

417

Phe ® Phe (đột biến câm)

418

Stop codon ® Asn

1245 1247 1248 1251 1252 1254

G ® C G ® A G ® A T ® G G ® T G ® A G ® A mất 01 nucleotide A thêm 01 nucleotide A C ® A G ® C T ® G C ® T T ® A A ® T

L3900

12 14 78 357 411

34 40 234 1069 1233

L4200

414

1241-1242

L4650

16 61 234 431 468 609 657 846 847 857 862 867 886 914 988 1006 1011 1134 1140 1152 1176 1239

6 21 78 144 156 203 219 282 283 286 288 289 296 305 330 336 337 378 380 384 392 413

Dòng L3900, L4200, L4650 phát sinh từ chủng dại LBT6 Leu ® Phe Leu ® Val Gly ® Gly (đột biến câm) Leu ® Leu (đột biến câm) Asn ® Lys Glu ® Ala, kết quả dẫn đến đột biến dịch khung, mất stop codon (codon 418). Thr ® Pro Glu ® Lys Gly ® Gly (đột biến câm) Asn ® Ile Thr ® Thr (đột biến câm) Gly ® Gly (đột biến câm) Gln ® Gln (đột biến câm) Thr ® Thr (đột biến câm) Leu ® Val Ala ® Val Lys ® Stop codon Ala ® Ala (đột biến câm) Thr ® Pro Thr ® Glu Leu ® Leu (đột biến câm) Leu ® Leu (đột biến câm) Phe ® Phe (đột biến câm) Ala ® Ala (đột biến câm) Ser ® Ser (đột biến câm) Lys ® Lys (đột biến câm) His ® His (đột biến câm) Ala ® Ala (đột biến câm)

C ® T C ® G C ® G T ® C C ® A thêm 01 nucleotide C A ® C G ® A C ® T A ® T G ® A T ® C G ® A A ® G C ® G C ® T A ® T G ® A A ® C C ® A T ® C T ® C C ® T G ® A C ® T A ® G C ® T C ® A

Dòng B5700, B7050, B7900 phát sinh từ chủng dại B3.13 B5700

B7050

B7900

270 766 786 858 738

90 256 262 286 246

không C ® A G ® T T ® A G ® A G ® T

Phe ® Leu Val ® Phe Asp ® Glu Ala ® Ala (đột biến câm) Leu ® Phe

Khi so sánh trình tự gen tlh của hai dòng giảm độc lực A400, A650 so với

chủng dại A3.3 nhận thấy: Dòng A400 sai khác với chủng dại A3.3 ở 05 nucleotide,

cho kết quả thay thế 04 amino acid ở các vị trí 346, 366, 369 và 399. Dòng A650 so

với chủng dại A3.3 có 10 nucleotide bị biến đổi trên trình tự gen tlh. Sự thay đổi

nucleotide ở vị trí 1038 (mất 01 nucleotide loại A); và sự thêm 01 nucleotide giữa vị

trí 1238 và 1239 dẫn đến kết quả đột biến dịch khung từ bộ ba mã hóa 346 đến bộ

ba 413, trong đó, có sự xuất hiện sớm của bộ ba mã kết thúc (stop codon) ở vị trí

350 làm trình tự amino acid suy diễn của dòng A650 chỉ còn 349 amino acid, tức là

trình tự polypeptide suy diễn này đã bị ngắn đi 68 amino acid so với chủng dại có

417 amino acid. Ngoài ra, sự thay thế amino acid cũng xảy ra ở vị trí 345, 415, 416,

417, 418 do có sự thay đổi nucleotide ở các vị trí 1033, 1245, 1247, 1248, 1251,

1252 và 1254 ở gen tlh của dòng A650.

So sánh trình tự gen tlh ở các dòng vi khuẩn L3900, L4200, L4650 so với

chủng dại LBT6 nhận thấy: Có 22 vị trí nucleotide bị thay đổi, trong đó có 8/22

nucleotide bị thay thế dẫn đến sự thay thế của 07 amino acid ở vị trí bộ ba thứ 6, 21,

144, 283, 286, 296, 305 và xuất hiện sớm 01 bộ ba mã kết thức (stop codon) ở vị trí

288 của dòng L4650 so với chủng dại LBT6. Do đó, trình tự polypeptide suy diễn

của dòng L4650 (287 amino acid) ngắn đi 130 amino acid so với chủng dại LBT6

(417 amino acid). Sự thay thế nucleotide ở các vị trí còn lại của dòng L4650 không

dẫn đến sự thay đổi của trình tự amino acid suy diễn. Trình tự gen tlh của dòng

L3900 được so sánh với trình tự này ở chủng dại LBT6 nhận thấy có sự thay đổi ở

04 vị trí nucleotide bao gồm vị trí số 34, 40, 234, 1069. Những sự thay đổi này chỉ

dẫn đến sự thay thế của 2 amino acid ở vị trí 12 (Leu ® Phe) và 14 (Leu ® Val).

Mặc dù, trình tự gen tlh của dòng L4200 và chủng LBT6 chỉ khác nhau ở 2 vị trí

nucleotide là 1233 và 1241-1242 nhưng nó cũng dẫn đến dự thay đổi của amino

acid số 411 và đột biến dịch khung từ bộ ba mã hóa 414, kết quả dẫn đến sự biến

mất của mã kết thúc (stop codon) ở vị trí bộ ba 418. Do vậy, trình tự polypeptide

suy diễn từ gen tlh của L4200 sẽ dài hơn trình tự của polypeptide suy diễn từ gen tlh

của chủng dại LBT6.

Đối với nhóm vi khuẩn giảm độc lực B5700, B7050, B7900 phát sinh từ

chủng vi khuẩn B3.13, so sánh trình tự gen tlh nhận thấy: Dòng B7050 sai khác với

chủng dại ở 04 vị trí nucleotide bao gồm 270, 766, 786 và 858 dẫn đến sự thay thế

của 3 amino acid ở vị trí 90, 256 và 262. Sự khác biệt duy nhất đã được ghi nhận

được ở trình tự gen tlh của dòng B7900 so với chủng dại là thay thế nucleotide vị trí

738 dẫn đến sự thay thế amino acid ở vị trí 246 (Leu ® Phe). Không có thay đổi về

trình tự nucleotide được phát hiện ở dòng B5700 so với chủng dại.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xem xét sự thay đổi về trình tự của các gen

độc tố (toxR và tlh) ở các dòng V. parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực

so với các chủng dại. Đây là nghiên cứu đầu tiên về sự thay đổi của các gen độc tố ở

những chủng vi khuẩn kháng rifampicin với nồng độ cao. Kết quả của nghiên cứu

này cho thấy trình tự gen toxR của các dòng giảm độc lực không có sự sai khác so

với trình tự này ở các chủng dại. Trong khi với gen tlh, có một số thay đổi trình tự

nucleotide giữa các dòng giảm độc lực và các chủng dại của chúng. Kết quả này cho

thấy gen toxR là có trình tự bảo thủ hơn so với gen tlh. Gen tlh có trình tự amino

acid đặc trưng trong loài V. parahaemolyticus, được coi là một dấu hiệu chẩn đoán

bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra, đồng thời nó cũng là một yếu tố tiềm năng cho

trong nghiên cứu tạo vắc-xin cho nhóm vi khuẩn này [59, 170]. Có mối liên quan

một cách tương đối giữa kết quả đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng

rifampicin (mục 4.2.1) và kết quả so sánh trình tự nucleotide gen tlh của ba chủng

dại và 08 dòng giảm động lực kháng rifampicin. Cụ thể là, các dòng giảm độc lực

nhiều nhất so với chủng dại bao gồm L4650, A650 và L4200 với tỉ lệ sống sót cá

gây nhiễm lần lượt là 85,56%; 80% và 62,22% đều có kiểu thay đổi trình tự

nucleotide dẫn đến sự thay đổi kích thước của trình tự polypeptide suy diễn. Dòng

L4650, A650 có trình tự chuỗi polypeptide suy diễn lần lượt là 287 anino acid và

349 amino acid, ngắn hơn trình tự của chủng dại là 417 amino acid, trong khi, trình

tự chuỗi polypeptide suy diễn ở dòng L4200 lại dài hơn trình tự của chủng dại do sự

biến mất của mã kết thúc. Dòng B5700 không có thay đổi nucleotide trong trình tự

gen toxR cũng như tlh, nhưng nó cũng là một chủng giảm độc lực tuy là sự giảm

độc lực này không lớn (tỉ lệ sống sót của cá khi bị gây nhiễm là 32,22 % cao hơn so

với cá bị gây nhiễm chủng B3.13 là 6,67%). Kết quả này gợi mở ra phải chăng có

một nguyên nhân nào khác ngoài đột biến ở gen tlh dẫn đến sự giảm độc lực của

dòng vi khuẩn này.

Từ trình tự protein TLH suy diễn của các chủng dại và các dòng giảm độc lực,

chúng tôi đã xây dựng cấu trúc bậc 2 và bậc 3 bằng phần mềm Phyre2

(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) và Swiss model

(https://swissmodel.expasy.org/interactive) của TLH. Trên cơ sở dữ liệu về cấu trúc

phân tử trên ngân hàng SWISSMODEL và trình tự amino acid TLH của các

chủng/dòng vi khuẩn đã tìm được 01 cấu trúc protein khuôn phù hợp là VvPlpA,

hay còn được gọi là thermolabile hemolysins (TLH) của vi khuẩn Vibrio vulnificus,

có bản chất là phospholipase [155]. Phospholipase có thể phá vỡ màng của tế bào

chủ, là một trong những yếu tố gây độc quan trọng của nhiều mầm bệnh. Protein

này chứa vùng gấp SGNH điển hình có hoạt tính hydrolase bao gồm 4 vị trí xúc tác

có tính bảo tồn Ser152, Gly203, Asn247 và His392. Đây được xác định là mô hình

cấu trúc 3D đầu tiên và duy nhất tính đến thời điểm này được xác định bằng

phương pháp X-ray cho protein TLH của Vibrio vulnificus. Chưa có một cấu trúc

không gian của TLH của V. parahaemolyticus được xác định bằng phương pháp

X-ray tính đến thời điểm hiện tại. Khi so sánh trình tự protein VvPlpA của

Vibrio vulnificus [155] và trình tự protein TLH của V. parahaemolyticus

A3.3/LBT6/B3.13 cho mức độ tương đồng đạt 74,25%. Theo lý thuyết, mức độ

tương đồng về trình tự amino acid của trình tự nghiên cứu với trình tự khuôn đạt

từ 30 - 40% thì có thể xây dựng mô hình cấu trúc protein dựa vào trình tự khuôn

đã công bố. Mặt khác, cấu trúc được sử dụng làm khuôn cần có độ phân giải từ

1-3Å [154]. Như vậy, protein VvPlpA được xây dựng với độ phân giải 2,3 Å [155]

đáp ứng các tiêu chí được chọn là khuôn xây dựng cấu trúc 3D của TLH ở các

chủng/dòng vi khuẩn nghiên cứu.

Hình 3.26. Sự tương đồng vị trí các amino acid Ser152, Gly203, Asn247 và His392

(được đánh dấu hình ngôi sao mầu vàng) của TLH ở 3 chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus LBT6, A3.3, B3.13 và VvPla của chủng V. vulnificus

Cấu trúc các protein TLH của cả ba chủng vi khuẩn dại A3.3, LBT6 và B3.13

được xây dựng trên cấu trúc khuôn của protein VvPlpA đều tương tự nhau với 12

xoắn a và 12 nếp gấp β (phụ lục 9). Tương ứng với 4 vị trí xúc tác có tính bảo tồn

Ser152, Gly203, Asn247 và His392 trên VvPlpA khuôn, trình tự amino acid TLH

của 3 chủng vi khuẩn dại cũng có tương ứng 4 amino acid ở các vị trí Ser152,

Gly203, Asn247 và His392 (hình 3.26).

Khi so sánh mô hình cấu trúc không gian TLH của hai dòng vi khuẩn A400 và

A650 so với chủng A3.3, nhận thấy một số thay đổi như sau: Dòng A400 có sự thay

thế của 4 amino acid (bảng 3.12) dẫn đến cấu trúc TLH của dòng này có số lượng

xoắn a và nếp gấp β giảm đi so với chủng dại (11 xoắn a và 10 nếp gấp β). Dòng

A650 có sự thay đổi 01 amino acid (Glu345®Lys) và đột biến dịch khung từ vị trí

amino acid 346 dẫn đến xuất hiện mã kết thúc sớm ở amino acid 350. Cấu trúc

không gian của TLH ở A650 biến đổi nhiều, cụ thể là mất 3 xoắn a ở vị trí 250-252;

382-384 và 393-407, thêm 01 nếp gấp β vị trí 85-86 và giảm 01 nếp gấp b ở vị trí

385-387 (phụ lục 9).

Với ba dòng vi khuẩn giảm độc lực L3900, L4200 và L4650, cấu trúc TLH

của chúng so với chủng dại có sự thay đổi như sau: Dòng L3900, với sự thay đổi

của 02 amino acid, có 11 xoắn a và 13 nếp gấp β; bị mất 01 xoắn a ở vị trí 250-252

và thêm 01 nếp gấp β vị trí 85-86. Dòng L4200 với đột biến làm mất bộ ba mã hóa

kết thúc (stop codon) dẫn đến chuỗi polypeptide suy diễn dài thêm. Trình tự

nucleotide gen mã hóa TLH của dòng vi khuẩn này kéo dài thêm 39 bp so với

chủng dại tương ứng với 01 xoắn a được hình thành. Dòng vi khuẩn L4650 với 7

amino acid bị thay thế và xuất hiện bộ ba mã hóa kết thúc sớm ở vị trí 288 dẫn đến

cấu trúc chỉ còn 11 nếp gấp β do mất 2 nếp gấp β ở vị trí 327-332; 385-387 và 01

nếp gấp β xuất hiện ở vị trí 42-51. Số lượng xoắn a của TLH ở L4650 là 05, trong

đó so với chủng dại, nó mất 04 xoắn a từ vị trí amino acid 288 đến bộ ba mã kết

thúc và mất 3 xoắn a ở vị trí 49-51; 159-161 và 250-252 (phụ lục 9). Đây là cấu

trúc TLH được dự đoán biến đổi rất nhiều so với cấu trúc của chủng dại LBT6. Cấu

trúc 3D của TLH ở chủng dại LBT6 và dòng giảm độc lực L4650 được thể hiện ở

hình 3.27.

Hình 3.27. Mô hình cấu trúc 3D protein TLH của chủng vi khuẩn LBT6 (A) và

dòng L4650 (B)

Dòng B7050 với sự thay thế 03 amino acid có số lượng xoắn a và nếp gấp β

không đổi so với chủng dại. Tuy nhiên, với tương ứng vị trí xoắn a ở amino acid

250-252 của chủng dại thì dòng B7050 có chiều dài xoắn dài hơn từ vị trí amino

acid 246-254 trong đó chứa vị trí xúc tác Asn247. Đối với chủng B7900, cấu trúc

TLH có số lượng xoắn a giảm đi 01 so với chủng dại tại vị trí 250-252 (phụ lục 9).

Có thể nhận thấy, cấu trúc không gian được dự đoán của TLH ở các dòng vi

khuẩn giảm độc lực có một vài thay đổi so với chủng dại, đặc biệt là ở các dòng có xuất

hiện mã kết thúc sớm (A650 và L4650) hoặc làm mất mã kết thúc (L4200). Mặt khác,

dựa trên cấu trúc không gian của TLH được dự đoán ở các chủng giảm độc lực đều

thấy xuất hiện những biến đổi tại xoắn a ở vị trí amino acid 250-252. Các dòng L3900,

L4650, A400, A650, B7900 đều bị mất xoắn a tại vị trí này. Dòng B7050 bị biến đổi

xoắn a ở vị trí này với độ dài từ amino acid 246 đến 254. Dòng L4200 không có đột

biến xảy ra trên toàn trình tự amino acid cho đến gần bộ ba mã kết thúc mới xuất hiện

đột biến làm mất bộ ba kết thúc. Do đó, vị trí xoắn a ở amino acid 250 đến 252 không

có thay đổi so với chủng dại (hình 3.28). Đây có thể là một cấu trúc dễ bị biến đổi trong

cấu trúc không gian của TLH ở V. parahaemolyticus. Cần có những nghiên cứu sâu

hơn để sáng tỏ vấn đề này.

Hình 3.28. Vị trí xoắn a 250-252 của TLH ở các dòng vi khuẩn và chủng dại khi

được xây dựng bằng phần mềm Phyre2

3.2.3.2. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực

Kích thước hoàn chỉnh của gen rpoB là 4029 bp. Chúng tôi sử dụng cặp mồi

100

1110F [145] và CM32b [105] để khuếch đại các sản phẩm PCR kích thước ~984 bp

của gen rpoB (hình 3.29). Sau quá trình giải trình tự, vùng trình tự từ vị trí

nucleotide 1121 đến 2050 (930 bp) tương ứng với với vị trí amino acid 374 đến 684

của 08 dòng giảm độc lực được xác định và so sánh với chủng dại của chúng.

Hình 3.29. Sản phẩm PCR của gen rpoB ở các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus

Ghi chú: 1-8: L3900, L4200, L4650, B5700, B7050, B7900, A400, A650; M: Marker 1kb

giảm độc lực trên gel agarose 1%

Đối với các dòng vi khuẩn phát sinh từ LBT6, không phát hiện sự thay đổi về

trình tự nucleotide của vùng gen rpoB (930 bp) ở hai dòng giảm độc lực là L3900 và

L4200 so với chủng dại. Trong khi đó, dòng giảm độc lực L4650 có thay đổi về trình

tự nucleotide dẫn đến thay đổi của 28 amino acid suy diễn (bảng 3.13). Trong 28 vị trí

bị biến đổi amino acid, có 01 vị trí bị thay thế amino acid 524 (Val524®Ile) thuộc

vùng xác định kháng rifampicin (RRDR, từ bộ ba mã hóa 507 đến bộ ba 533) và 27 vị

trí bị đột biến thay thế amino acid nằm ngoài cùng RRDR [175].

Không phát hiện sự thay đổi nucleotide cũng như thay đổi amino acid của 03

dòng giảm độc lực B5700, B7050, B7900 so với chủng dại B3.13 ở đoạn trình tự

được xác định của gen rpoB.

Trong 02 dòng giảm độc lực phát sinh từ chủng dại A3.3, dòng A650 có duy

nhất 01 nucleotide thay đổi dẫn đến thay đổi 01 amino acid ở vị trí 513, từ glutamin

thay thế bằng prolin (Gln513®Pro). Đây cũng là một trong những vị trí bị đột biến

với tần suất cao thuộc vùng RRDR được phát hiện ở những vi khuẩn kháng

101

rifampicin [175]. Dòng A400 không phát hiện sự thay đổi về trình tự nucleotide so

với chủng dại ở vùng trình tự xác định của gen rpoB.

Bảng 3.13. Những vị trí amino acid thay đổi trong đoạn trình tự gen rpoB (930 bp)

của các dòng giảm độc lực so với các chủng dại

Nucleotide thay đổi

Amino acid (suy diễn) thay đổi

A1538®C

T1841®A G1861®A, T1863®C

A1195®G, T1197®G

A1900®G, C1902®T G1927®A, T1929®C

A650 Gln513®Pro L4650 Ser387® Asn G1160®A Glu393®Asp G1179®C Thr399®Ala Glu412®Asp A1236®C Gln415®Glu C1243®G Glu422®Lys G1264®A Thr423®Glu A1267®G, C1268®A Ala434®Asp C1301®A, G1302®T Leu492®Met C1474®A G1570®A, A1572®C Val524®Ile C1672®G Leu558®Val C1730®T Ala577®Val T1733®A, T1734®C Phe578®Tyr Asp604®His G1810®C, T1812®C

Phe614®Tyr Ala621®Thr Lys622®Asn G1866®C Asn624®Asp A1870®G Asp626®Glu T1878®A Glu632®Asp G1896®C Ile634®Val Gly643®Ser Glu648®Asp G1944®C C1947®G His649®Gln C1949®T Ala650®Val G1966®T, G1968®C Ala656®Ser A1987®G Ile663®Val C1991®G Ala664®Gly

Rifampicin là một trong những kháng sinh có thể liên kết với RNA

polymerase, do đó ngăn chặn sự bắt đầu quá trình phiên mã và tiêu diệt vi khuẩn.

Các chủng kháng rifampicin đã được ghi nhận là các chủng giảm độc lực được sử

dụng như là ứng cử viên cho vắc-xin nhược độc [92]. Sự đề kháng với rifampicin

của vi khuẩn được xác định có liên quan đến đột biến gen rpoB, gen mã hóa tiểu

đơn vị β của enzyme RNA polymerase. Kích thước gen rpoB là 4029 bp mã hóa

chuỗi polypeptide chứa 1342 amino acid [108]. Nhiều đột biến trên gen rpoB được

phát hiện có liên quan đến tính kháng rifampicin của một số chủng vi khuẩn như

Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Bacillus

subtilis, V. parahaemolyticus và vị trí xảy ra đột biến có thể ảnh hưởng đến mức độ

kháng rifampicin [54, 102, 124, 175]. Hazen và cộng sự (2009) xác định rằng một

102

số chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus kháng rifampicin ở nồng độ rifampicin là

100 µg/ml xuất hiện những điểm đột biến trên gen rpoB, cụ thể là ở các bộ ba 513,

526, 529, 531, 586 (tương ứng với vị trí nucleotide 1538, 1576, 1577, 1592, 1586,

1703) [54]. Vùng trình tự bao gồm 81 bp từ bộ ba mã hóa 507 đến bộ ba 533 (27

amino acid) được gọi là rifampicin-resistance determining region (vùng xác định

kháng rifampicin, RRDR) [175]. Trong RRDR, các bộ ba thường bị đột biến với tần

suất cao của vi khuẩn M. tuberculosis kháng rifampicin bao gồm 513, 516, 526, 531

[131, 175] ngoài ra, một số bộ ba khác trong RRDR cũng được báo cáo xuất hiện

đột biến [175]. Những đột biến trong vùng RRDR được đánh giá là một trong

những nguyên nhân dẫn đến tính kháng rifampicin của các chủng vi khuẩn.

Rifampicin gắn vào tiểu đơn vị β của RNA polymerase, làm cản trở quá trình khởi

đầu phiên mã, từ đó dẫn đến tiêu diệt tế bào [108]. Những đột biến xảy ra trên gen

rpoB đặc biệt thuộc vùng RRDR sẽ ảnh hưởng lớn đến cấu trúc tiểu đơn vị β của

RNA polymerase. Từ đó dẫn đến việc rifampicin không thể kết hợp với RNA

polymerase do không có sự tương thích về cấu trúc không gian. Do vậy, hoạt động

của RNA polymarease vẫn diễn ra bình thường, quá trình phiên mã diễn ra và vi

khuẩn không bị tiêu diệt, có thể sống trên môi trường có bổ sung rifampicin tạo

thành vi khuẩn kháng rifampicin. Trong nghiên cứu này, dòng A650 và L4650 đều

có sự thay đổi ở 01 bộ ba mã hóa Gln513®Pro ở dòng A650, Val524®Ile ở dòng

L4650 trong vùng RRDR. Rất có thể đây là nguyên nhân dẫn đến tính kháng

rifampicin của các dòng vi khuẩn này.

Những đột biến xảy ra trên gen rpoB nhưng nằm ngoài vùng RRDR cũng

được phát hiện ở một số chủng vi khuẩn M. tuberculosis kháng rifampicin. Cụ thể

là, đột biến phát sinh ở bộ ba 413, 435, 451, 490, 505, 535, 536, 538, 550, 572 và

645 [175]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 27 bộ ba mã hóa nằm ngoài vùng

RRDR bị biến đổi ở dòng L4650 (bảng 3.13). Những biến đổi bên ngoài vùng

RRDR có liên quan đến đến tính kháng kháng sinh của vi khuẩn hay không còn

chưa rõ. Có giả thuyết cho rằng những biến đổi này làm thay đổi cấu trúc của tiểu

đơn vị β của RNA polymerase, trong khi tiểu đơn vị này cùng tiểu đơn vị β’ là hai

103

thành phần cấu trúc nên trung tâm xác tác của enzyme RNA polymerase. Điều này

có thể ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme RNA polymerase, từ đó ảnh hưởng

đến toàn bộ biểu hiện của các gen, dẫn đến sự giảm độc lực của tế bào vi khuẩn.

Perez-Varela và cộng sự (2017) xác định rằng những đột biến xảy ra trên tiểu đơn vị

β của RNA polymerase dẫn đến suy giảm khả năng di động cũng như độc lực của vi

khuẩn Acinetobacter baumannii [124]. Những chủng đột biến giảm độc lực được

chọn lọc từ dòng kháng rifampicin của các loài vi khuẩn khác nhau có thể có những

thay đổi toàn bộ về kiểu hình, sự sinh trưởng, phát triển [102], độc lực của vi khuẩn

[97] so với chủng dại. Đánh giá một số đặc điểm của dòng Edwardsiella ictaluri

hoặc Flavobacterium columnare giảm độc lực kháng rifampicin cho thấy chúng

khác với chủng dại của chúng ở cấu trúc của lipopolysacarit (LPS) và các thành

phần của protein màng ngoài [25, 137, 179], trong khi các chủng đột biến giảm độc

lực ở Flavobacterium psychropjilum và Vibrio harveyi lại giống chủng dại của

chúng ở cấu trúc LPS nhưng khác với chủng dại ở sự tăng trưởng của tế bào [58,

72]. Sự kháng với rifampicin thường đi kèm với những biến đổi làm thay đổi cấu

trúc cơ bản của một số protein [58]. Như vậy rất có thể, những dòng vi khuẩn giảm

độc lực kháng rifampicin xuất hiện những biến đổi ở gen rpoB là ảnh hưởng đến

hoạt động của RNA polymaerase. Từ đó, ảnh hưởng đến hoạt động phiên mã của

toàn bộ tế bào vi khuẩn, trong đó có các gen mã hóa protein độc tố của vi khuẩn.

Dòng L4650 có 28 vị trí amino acid của tiểu đơn vị β suy diễn bị đột biến thay

thế và số lượng 28 đột biến như vậy là cao hơn so với những công bố trước đây của

Hazen và cộng sự (2009), Perez-Varela và cộng sự (2017), Qazi và cộng sự (2014)

[54, 124, 131] về đột biến gen rpoB ở các chủng vi khuẩn kháng rifampicin. Sự sai

khác này có thể do các chủng vi khuẩn được được báo cáo chỉ được chọn lọc 01 lần

trực tiếp lên môi trường bổ sung rifampicin với nồng độ 40, 50 hoặc 100 μg/ml [54,

124, 131] trong khi với dòng L4650 được tạo ra bằng cách nuôi cấy chủng dại

LBT6 qua các thế hệ trên môi trường với áp lực tăng dần nồng độ rifampicin từ 10

đến khi đạt 250 μg/ml.

104

Dựa trên những kết quả phân tích độc lực cũng như các đột biến điểm xảy ra

trên các gen độc tố và rpoB, chúng tôi chọn lọc được 03 dòng vi khuẩn giảm độc

lực tiềm năng L4650, A650 và L4200, trong đó, dòng L4650 là dòng giảm độc lực

nhiều nhất so với chủng dại. Dòng vi khuẩn L4650 vì thế được nghiên cứu tiếp

nhằm đánh giá tiềm năng của dòng vi khuẩn này trong nghiên cứu tạo vắc-xin

nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển.

3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi

khuẩn giảm độc lực

3.3.1. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực

Một trong những điều kiện tiên quyết của dòng vi khuẩn giảm độc lực ứng

dụng để sản xuất vắc-xin là tính ổn định của nó. Kết quả đánh giá tính ổn định về

mức độ giảm độc lực của dòng vi khuẩn L4650 được thể hiện bảng 3.14.

Cá mú chấm cam được gây nhiễm với dòng L4650 có tỉ lệ sống sót cao (80 -

86,67%) và ổn định qua các đợt thí nghiệm, trong khi tỉ lệ này ở chủng dại (LBT6)

chỉ là 6,67- 16,67% (hình 3.30). Tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam khi gây nhiễm

với dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 cao hơn khoảng 4 lần so với

chủng vi khuẩn dại. Từ số liệu cho thấy, dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus

L4650 vẫn giữ mức độ độc lực giảm và tính giảm độc lực này là ổn định theo

thời gian so với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus LBT6.

Bảng 3.14. Đánh giá tính ổn định độc lực của dòng vi khuẩn L4650

Chủng/dòng vi khuẩn

Đợt Đợt 1

Đợt 2

Đợt 3

Đợt 4

LBT6 L4650 PBS LBT6 L4650 PBS LBT6 L4650 PBS LBT6 L4650 PBS

Số cá thí nghiệm (con) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30

Số cá chết (con) 28 5 0 26 6 0 25 6 0 24 4 0

Tỉ lệ cá chết (%) 93,33 16,67 0,00 86,66 20,00 0,00 83,33 20,00 0,00 80,00 13,33 0,00

Số cá sống (con) 2 25 30 4 24 30 5 24 30 6 26 30

Tỉ lệ cá sống (%) 6,67 83,33 100,0 13,33 80,00 100,0 16,67 80,00 100,0 20,00 86,67 100,0

105

Đợt 5

LBT6 L4650 PBS

30 30 30

83,33 16,67 0,00

4 25 30

13,33 83,33 100,0

25 5 0

Hình 3.30. Cá mú bình thường (A) và cá mú bị chết do vi khuẩn LBT6 (B)

Dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus L4650 là dòng giảm độc lực so với chủng

dại LBT6, để có thể sử dụng dòng L4650 như một ứng viên cho vắc-xin sống nhược

độc thì cần đánh giá về khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn này. Chúng tôi

tiến hành nuôi cấy chủng dại LBT6 và dòng giảm độc lực L4650 trên môi trường

BHI bổ sung 1,5% NaCl, sau đó đánh giá về chỉ số OD600 giữa hai loại vi khuẩn

trong các khoảng thời gian khác nhau từ 4 giờ đến 24 giờ. Kết quả thu được thể hiện

2.5

ở hình 3.31.

)

1.5

LBT6

m n 0 0 6 (

L4650

D O

0.5

8 10 12 14 16 18 20 22 24

Thời gian (giờ)

Hình 3.31. Đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn LBT6 và dòng L4650

Có thể nhận thấy, dòng vi khuẩn L4650 sinh trưởng chậm hơn vi khuẩn dại

LBT6. Tại 16 giờ sau nuôi cấy, giá trị OD600 của L4650 chỉ đạt 1,81 trong khi đó

giá trị này được ghi nhận với LBT6 là 2,48. Tuy nhiên, dòng vi khuẩn L4650 vẫn có

106

khả năng tăng trưởng tương đối tốt với OD600 đạt 1,81 sau 18 giờ nuôi cấy tương

ứng với mật độ vi khuẩn đạt 109 CFU/ml.

3.3.2. Xác định tính an toàn của dòng L4650

Giá trị LD50 của chủng dại LBT6 và dòng L4650 được xác định trên cá mú

chấm cam theo phương pháp của Reed và Muench (1938) [133]. Từ số liệu tỉ lệ cá

chết cộng dồn (hình 3.32), giá trị LD50 xác định được của chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus LBT6 và dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus L4650 lần lượt

tương ứng là 105,155 và 107,155 CFU/ml. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả

về tính giảm độc lực của dòng L4650. Với liều tiêm dòng vi khuẩn L4650 là 105

CFU/ml; 100 µl/con cá được tiêm chủng có tỉ lệ sống sót đạt 100%. Đây được xem

là nồng độ an toàn để tiêm vắc-xin cho cá trong thí nghiệm đánh giá khả năng gây

đáp ứng miễn dịch của dòng L4650 trên cá mú chấm cam.

Như vậy, có thể kết luận dòng vi khuẩn L4650 là dòng có tính ổn định về độc

lực và có tính an toàn đối với cá mú chấm cam với giá trị LD50 là 107,155 CFU/ml.

Hình 3.32. Tỉ lệ cá chết cộng dồn khi được tiêm với chủng LBT6 và dòng L4650

107

3.3.3. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc

lực ở cá mú

Cá mú chấm cam (E. coioides) được tiêm dòng V. parahaemolyticus L4650

vào phúc mạc dưới da, với liều lượng 100 µl/con, nồng độ 105 CFU/ml. Với liều

lượng này, cá được tiêm vắc-xin có tỉ lệ sống sót là 100%. Sau khi tiêm vắc-xin,

cá mú chấm cam được tiêm công cường độc bằng chủng dại LBT6 ở 3 liều lượng

tương ứng 5LD50 (14.288 CFU/con); 10LD50 (142.889 CFU/con) và 100LD50

(1.428.890 CFU/con). Trong đó, giá trị LD50 của chủng LBT6 là 105,155 tương

ứng với nồng độ 142.889 CFU/ml; liều lượng tiêm trên mỗi con cá là 100 µl/con.

Ở 15 ngày sau khi tiêm vắc-xin, khi cá mú chấm cam được công cường độc

bằng chủng vi khuẩn dại LBT6 ở ba liều công cường độc khác nhau (5 LD50; 10

LD50; 100 LD50), tỉ lệ cá chết được ghi nhận lần lượt là 0%; 1,67% và 3,45%,

tương ứng với tỉ lệ bảo hộ (RPS) là 100%; 98,1% và 96,91% (bảng 3.15). Kết quả

công cường độc sau 2 tháng tiêm chủng cũng tương tự, tỉ lệ bảo hộ tương ứng lần

lượt là 100%, 97,03% và 96,27%. Ngược lại, đối với cá không được tiêm chủng,

khi được công cường độc bằng chủng dại gây bệnh LBT6 tỉ lệ cá chết ghi nhận

được rất cao (76,67 - 97,33%). Phân lập lại vi khuẩn từ các con cá bị chết khi

được công cường độc với LBT6 cho kết quả 97% (98/101) mẫu cá chết đều xuất

hiện các khuẩn lạc mầu xanh đậm đặc trưng chủng V. parahaemolyticus trên môi

trường TCBS.

Bảng 3.15. Đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam được tiêm vắc-xin L4650 sau

Tỉ lệ cá chết (%) sau

RPS (%) sau

Nồng độ

Xử lý

LBT6

15 dpv*

60 dpv*

15 dpv*

60 dpv*

76,67a ± 1,01

76,69a ± 1,1

5LD50

PBS

87,67a,b ± 2,43 89,67a,b ± 2,23

10LD50

96,67b ± 1,27

97,33b ± 1,29

100LD50

0,00c ± 0,0

0,0c ± 0,0

100,0d ± 0,00

100d ± 0,0

5LD50

L4650

1,67c ± 0,02

1,89c ± 0,03

98,10d ± 2,71 97,03d ± 2,32

10LD50

15 ngày và 60 ngày

108

3,45c ± 0,04

3,67c ± 0,03

96,91d ± 2,03 96,27 d± 2,12

100LD50

Tỉ lệ cá chết (%), RPS (%) cho mỗi liều và thời gian công cường độc được so sánh tương ứng;

những giá trị với các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác biệt đáng kể ở p<0.05. * Days post-

vaccination/ ngày tiêm vacccine.

Không phải tất cả các dòng vi khuẩn giảm độc lực đều có thể sử dụng để phát

triển vắc-xin nhược độc. Chúng phải có tính ổn định, tính an toàn và đặc biệt phải

tạo được phản ứng bảo hộ cho cá thì mới có thể là dòng vi khuẩn tiềm năng cho

phát triển vắc-xin. Trong nghiên cứu này, dòng vi khuẩn L4650 có tính ổn định về

độc lực và có tính an toàn khi được dùng làm vắc-xin tiêm vào cá mú chấm cam đã

tạo phản ứng bảo hộ cho cơ thể cá chỉ sau 15 ngày tiêm chủng với tỉ lệ bảo hộ

(RPS) rất cao (từ 96,91% đến 100%), điều này chứng tỏ kháng thể bảo hộ còn được

tạo ra sớm hơn trước đó.

Một nghiên cứu tương tự được tiến hành để đánh giá khả năng bảo hộ của V.

parahaemolyticus bị bất hoạt bởi formalin cho cá mú chấm cam E. coioides ở Thái

Lan được báo cáo cho kết quả tỉ lệ bảo hộ (RPS) sau 15 ngày tiêm chủng đạt 77,6%

[38]. Nguyễn Thị Thanh Thủy và cộng sự (2013) khi đánh giá phản ứng miễn dịch

của cá mú chấm cam được tiêm vi khuẩn V. parahaemolyticus bất hoạt bởi formalin

cũng ghi nhận được tỉ lệ bảo hộ (RPS) là 50% (đối với vi khuẩn bất hoạt không trộn

với chất bổ trợ) và 87,5% (đối với vi khuẩn bất hoạt trộn với chất bổ trợ FIA) [147].

Mao và cộng sự (2007) tạo vắc-xin tái tổ hợp của hai protein màng ngoài psuA và

pvuA ở V. parahaemolyticus zj2003 cho tỉ lệ bảo hộ trên cá lù đù vàng lớn

(Pseudosciaena crocea) là 50%; 62,5% và 75% khi tiêm vắc-xin chứa riêng rẽ mỗi

loại protein tái tổ hợp của gen psuA, pvuA và tiêm đồng thời hai loại protein tái tổ

hợp [94]. Li và cộng sự (2014) phát triển vắc-xin tái tổ hợp từ protein màng

VP0802, có tính bảo tồn cao trong số các loài Vibrio, cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt

66,7% [77]. Bảy protein màng ngoài DLD, VP1667, VP2369, VP2309, VP0887,

VPA0548 và VP1019 cũng tạo được đáp ứng miễn dịch trên nhiều loài Vibrio trong

đó có V. parahaemolyticus với tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 80% trên cá mú chấm cam và

tạo được đáp ứng miễn dịch tốt trên cá ngựa vằn [115, 121, 122]. Liu và cộng sự

109

(2011) cũng phát triển vắc-xin DNA bằng cách chèn gen mã hóa serine protease bị

đột biến Ser318 ® Pro vào plasmid pEGFP-N1 tạo thành cấu trúc pEGFP-N1/m-

vps. Cấu trúc pEGFP-N1/m-vps sau đó được tiêm vào cơ của cá bơn (Scophthalmus

maximus) đã cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) cao nhất đạt 96,11% [86]. Có thể nhận thấy

rằng tỉ lệ bảo hộ (RPS) của dòng vi khuẩn L4650 tạo ra cho cá mú được đánh giá

bằng hoặc cao hơn so với một số công trình về phát triển vaccine chống vi khuẩn V.

parahaemolyticus đã công bố.

Rifampicin đã được sử dụng để tạo các chủng giảm độc lực phục vụ nghiên

cứu tạo vắc-xin ở một số loài vi khuẩn: Aeromonas hydrophila [65, 130]; E. tarda

[143]; F. columnare [104]; F. psychrophilum [72]; V. anguillarum [173]. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi chọn lọc dòng L4650 trên môi trường chứa rifampicin và

sử dụng phương pháp đưa vắc-xin vào cá mú bằng phương pháp tiêm đã cho tỉ lệ

bảo hộ (RPS) đạt 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng. So với các nghiên cứu đã

công bố về vắc-xin nhược độc có nguồn gốc từ các chủng vi khuẩn giảm độc lực

kháng rifampicin, tỉ lệ bảo hộ của dòng L4650 trên cá mú đạt được là khá cao.

Pridgeon và cộng sự (2011) tạo chủng Aeromonas hydrophila phòng bệnh xuất

huyết cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 86% ở cá nheo Mỹ và 100% ở cá rô phi sông Nile

sau 14 ngày tiêm chủng [130]. Chủng A. hydrophila XX1LA kháng rifampicin giảm

độc lực cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) đạt 83,7% sau 28 ngày tiêm chủng [65]. Chủng E.

tarda TX5RM cho tỉ lệ bảo hộ (RPS) ở cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus)

đạt 80,6% và 69,4% ở 5 và 8 tuần sau khi cho cá tắm và ăn thức ăn trộn vắc-xin

[143]. Chủng F. columnare 17-23 giảm độc lực kháng rifampicin cho tỉ lệ bảo hộ

(RPS) 90,9% trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và 86,9% trên cá rô phi Nile

(Oreochromis niloticus) [104]. Chủng F. psychrophilum 259-93B.17 giảm độc lực

kháng tạo sự bảo hộ đáng kể trên cá hồi cầu vồng (O. mykiss Walbaum) sau 8 và 15

tuần tiêm chủng [72]. Vi khuẩn V. anguillarum C312M kháng rifampicin cho tỉ lệ

bảo hộ (RPS) ở cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) đạt 84% và 60% sau 1

tháng với phương pháp ngâm vắc-xin và ăn vắc-xin cùng thức ăn cho cá [173].

110

Việc đưa vắc-xin vào cơ thể cá bằng phương pháp tiêm cho tỉ lệ tốt hơn

phương pháp cho ăn và ngâm vắc-xin. Tuy nhiên, nó cũng có nhược điểm là gây

stress cho cá sau khi tiêm chủng, tốn kém về mặt kinh tế và khó thực hiện với cá

giống có kích thước nhỏ. Chính vì thế, việc nghiên cứu đưa vắc-xin vào cơ thể cá

bằng phương pháp cho ăn và ngâm vắc-xin mà vẫn đạt được tỉ lệ bảo hộ (RPS) cao

là một hướng nghiên cứu tiếp theo, cần phát triển sau đề tài này. Đây là một trong

những nghiên cứu đầu tiên về vắc-xin nhược độc được tạo ra từ vi khuẩn giảm độc

lực phòng bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra cho cá.

Để đánh giá độ dài miễn dịch của dòng L4650 tạo ra trên cá mú chấm cam,

các lô cá thí nghiệm được tiêm vắc-xin L4650 (105 CFU/ml; 100 μl/con) và công

cường độc bằng chủng dại V. parahaemolyticus LBT6 ở thời điểm sau khi tiêm

chủng 01 tháng, 02 tháng, 04 tháng và 06 tháng. Tỉ lệ cá chết và tỉ lệ bảo hộ (RPS)

của dòng L4650 đối với cá mú tại các thời điểm được thể hiện tại bảng 3.16.

Bảng 3.16. Tỉ lệ cá chết và tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá được tiêm vắc-xin L4650 ở

các khoảng thời gian khác nhau

RPS (%) với các nồng độ công cường độc (CFU/ml)

Xử lý với

Tỉ lệ cá chết (%) với các nồng độ công cường độc (CFU/ml) 100LD50 5LD50

10LD50

Thời gian sau tiêm chủng

5LD50

10LD50

100LD50

1 tháng

100

2 tháng

100

96,67

4 tháng

100

93,33

6 tháng

100

96,29

93,33

PBS L4650 PBS L4650 PBS L4650 PBS L4650

76,67 0,00 76,67 0,00 73,33 0,00 76,67 0,00

83,33 0,00 80,00 0,00 86,67 0,00 90,00 3,33

96,67 0,00 100 3,33 100 6,67 100 6,67

Dựa vào kết quả thí nghiệm (bảng 3.16) có thể nhận thấy tỉ lệ bảo hộ của

L4650 cho cá mú chấm cam đạt cao và độ dài miễn dịch do vi khuẩn L4650 tạo ra

trên cá mú là đáng kể. Với nồng độ tiêm công cường độc 5LD50 của chủng LBT6,

tỉ lệ bảo hộ 100% được duy trì đến tháng thứ 6 sau tiêm vắc-xin. Khi nâng nồng độ

công cường độc tăng lên 10LD50, tỉ lệ này vẫn duy trì 100% đến tháng thứ 4 và

đạt 96,29% ở tháng thứ 6 sau tiêm chủng. Ở liều tiêm công cường độc lớn nhất

111

(100LD50), tỉ lệ bảo hộ được ghi nhận sau 2 tháng tiêm vắc-xin là 96,67%. Ở

tháng thứ 6 sau khi tiêm vắc-xin, tỉ lệ bảo hộ có giảm xuống đạt 93,33%.

Nguyễn Thị Thanh Thùy và cộng sự (2013) tiêm vắc-xin V. parahaemolyticus

bất hoạt có bổ sung chất bổ trợ (FIA) cho cá mú chấm cam (E. coioides) cũng tạo

được phản ứng bảo hộ khá tốt. Cụ thể là, ở 30 ngày sau khi tiêm chủng, cá được

tiêm công cường độc bằng V. parahaemolyticus gây bệnh đạt tỉ lệ bảo hộ (RPS) là

87,5%; trong khi mẫu cá đối chứng không tiêm tỉ lệ cá chết lên đến 70 - 90%.

Tuy nhiên, tỉ lệ bảo hộ ghi nhận ở cá tiêm vắc-xin giảm nhanh, sau 2 tháng tiêm

chủng tỉ lệ bảo hộ còn 41,1% [147]. Mặc dù các chủng vi khuẩn bất hoạt thường

được sử dụng để sản xuất vắc-xin thương mại cho cá bởi tính an toàn của chúng.

Tuy nhiên, vắc-xin bất hoạt có thời gian bảo hộ cho cơ thể cá không được dài

[140]. Ngược lại, vắc-xin sống, nhược độc được đánh giá là có hiệu quả hơn

trong việc tạo ra các đáp ứng miễn dịch cũng như về thời gian miễn dịch cho cơ

thể cá [148]. Những kết quả của chúng tôi chứng minh hướng nghiên cứu tạo ra

các chủng V. parahaemolyticus kháng rifampicin giảm độc lực phục vụ sản xuất

vắc-xin cho cá có thể là một cách tiếp cận hiệu quả, có tính khả thi cao. Dòng vi

khuẩn đột biến, giảm độc lực L4650 có tính ổn định độc lực cao, có tính an toàn,

có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cho cá sau 15 ngày tiêm chủng, đồng thời, độ

dài miễn dịch được tạo ra là dài, có đầy đủ những tính chất để làm nguyên liệu

sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển.

112

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

(1) Đã phân lập được 26 chủng Vibrio từ mẫu cá bị bệnh ở một số vùng nuôi

cá lồng ven biển miền Bắc. Đánh giá các chủng vi khuẩn phân lập về hình thái, đặc

điểm sinh hoá, độc lực đối với cá mú chấm cam, tính kháng với một số loại kháng

sinh và sự hiện diện của các gen độc tố đặc trưng đã xác định được 11 chủng vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Hệ gen các chủng vi khuẩn này có chứa 02 gen độc

tố đặc trưng toxR và gen tlh nhưng không chứa gen độc tố trh, tdh. Các gen tlh và

gen toxR đã được nhân bản thành công với kích thước đầy đủ tương ứng lần lượt là

879 bp và 1254 bp.

(2) Tuyển chọn được 09 dòng V. parahaemolyticus kháng rifampicin có độc

lực giảm từ 03 chủng vi khuẩn dại LBT6; B3.13; A3.3 nuôi cấy trên môi trường

TCBS bổ sung rifampicin ở nồng độ 250 µg. Trong đó, dòng L4650, có độ giảm

độc lực nhiều nhất. Một số đột biến sai khác nucleotide trong gen độc tố tlh và gen

rpoB đã xảy ra ở các dòng vi khuẩn giảm độc lực so với chủng dại. Đột biến dịch

khung phát hiện ở dòng A650, L4650 và L4200 là nguyên nhân dẫn tới kích thước

của phân tử protein suy diễn từ gen tlh ở các dòng này thay đổi. Đột biến thay thế

nucleotide xảy ra trong vùng trình tự nucleotide 1121 đến 2050 (930 bp) của gen

rpoB ở 02 dòng vi khuẩn A650 và L4650.

(3) Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu hiện ổn định về độc lực, tỉ lệ sống

sót của cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) được tiêm liều 100 µl/con; 105

CFU/ml đạt 100%. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650

đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm

chủng. Dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus L4650 là ứng viên tiềm năng cho

nghiên cứu sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số

loài cá biển nuôi lồng.

113

4.2. Kiến nghị

(1) Tiếp tục nghiên cứu cơ sở sinh học và phân tử làm sáng tỏ hơn mối liên

quan giữa những thay đổi trong trình tự của gen độc tố tlh và gen rpoB đến hiệu quả

giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Vibrio được xử lý bằng rifampicin ở nồng độ

cao.

(2) Xác định lượng kháng thể được tạo ra trong cơ thể cá tại các khoảng thời

gian khác nhau sau khi vắc-xin L4650 để cung cấp thêm cơ sở khoa học nhằm sớm

đưa dòng vi khuẩn này vào phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thân

cho cá biển nuôi.

(3) Đánh giá thêm về hiệu quả bảo hộ của dòng L4650 như một vắc-xin

nhược độc đối không chỉ với cá mú mà ở cả một số loài cá biển nuôi lồng khác

tại các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam.

114

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

Bài báo đã công bố 1. Cao Thị Thanh Hương, Phạm Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Xuân Viết, Vũ Thị Bích Huyền (2015). Đặc tính sinh học của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ cá biển mắc bệnh hoại tử gan thận. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn 8/2015: 72-78.

2. Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước, Nguyễn Đăng Quang, Đỗ Thanh Vân, Đặng Thị Hồng Thắm,(2018). Tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực bằng phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin, Báo cáo khoa học Hội nghị nghiên cứu và giảng dạy Sinh học toàn quốc lần thứ ba, tháng 5/2018: 1156-1163.

3. Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Đặng Thị Hồng Thắm, Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm (2018). Đánh giá tính ổn định và khả năng đáp ứng miễn dịch của chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus L4650 giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc - xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn số 21/2018: 79-85.

4. Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Huỳnh Việt Tùng, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước (2019). Đặc điểm sinh hóa và di truyền của chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá mú nuôi tại Cát Bà, Hải Phòng. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y tập 26 số 7/2019: 62-73.

5. Vu Thi Bich Huyen, Nguyen Xuan Viet, Pham Thi Tam, Man Hong Phuoc, Huynh Viet Tung, Nguyen Dang Quang, Do Thanh Van (2020). Development of attenuated Vibrio parahaemolyticus mutant strains as potential live vaccines. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 28(1): 52-67.

Trình tự gen đã công bố trên NCBI: 02 trình tự (đã được trích dẫn trong bài

báo của tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y).

- Gen toxR của chủng A3.3 với số hiệu (accession number) MH047286 - Gen tlh của chủng A3.3 với số hiệu (accession number) MH047289 Hội thảo Khoa học Quốc tế Vu Thi Bich Huyen, Chu Dinh Toi, Nguyen Xuan Viet, Man Hong Phuoc, Pham Thi Tam (2019). Isolation and evaluation the potential as live attenuated vaccine candidate of rifampicin-resistant Vibrio parahaemolyticus strains. 2019 International Academic Conference for Graduate Student of Nanjing Agricultural University in October 2019, Nanjing, China.

115

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Nguyễn Trọng Bình, Trần Hạnh Triết, Trần Thị Thanh Thanh, Nguyễn Quốc

Bình (2011), "Loại bỏ gen purA, aroA, wzz và ch để tạo chủng Edwardsiella

ictaluri nhược độc có khả năng làm vaccine", Tạp chí Công nghệ Sinh học,

9(4A), tr. 643-650.

2. Nguyễn Thị Chi, Võ Văn Nha (2015), "Khảo sát khả năng phát triển của

chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen purA ở các điều kiện

bảo quản khác nhau", Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, 4/2015, tr.

85-93.

3. Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Cẩm Ly (2012), "Phân lập và xác định gen

độc tố của Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống ở Nha Trang",

Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 2/2012, tr. 42-47.

4. Lê Minh Hải, Phạm Thị Tâm, Tô Long Thành (2017), "Nghiên cứu mức độ

đáp ứng miễn dịch của các dòng vi khuẩn Photobacterium damsalae đột biến

giảm độc lực ", Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, 17/2017, tr.

104-107.

5. Nguyễn Bá Hiên (2010), Giáo trình miễn dịch học ứng dụng, NXB Đại học

Nông nghiệp Hà Nội, 187 tr.

6. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn

Thị Nguyệt Huệ (2008), "Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi ở khánh

hòa ", Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 2/2008, tr. 16-24.

7. Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, Nguyễn Thị Thùy Giang (2008),

"Nghiên cứu bệnh mòn vây, cụt đuôi ở cá mú – Epinephelus spp nuôi ở

Khánh Hòa", Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 1/2008, tr. 6-13.

8. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004),

Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, 423 tr.

9. Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh, Lê Văn Hậu, Văn Xuân Thành,

Nguyễn Quốc Bình (2011), "Sàng lọc dòng Edwardsiella ictaluri kháng

116

rifampicin nồng độ cao và giảm độc lực có thể làm vaccine nhược độc tiềm

năng", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(4A), tr. 611-618.

10. Lê Thượng Khởi, Võ Văn Nha, Đặng Thị Hoàng Oanh (2013), "Kích thích

miễn dịch đặc hiệu ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri đột biến gen chondroitinase", Tạp chí Khoa học

Trường Đại học Cần Thơ, 25, tr. 214-222.

11. Trương Ngọc Thùy Liên, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh Tiếng, Nguyễn

Quốc Bình (2014), "Tạo chủng Aeromonas hydrophila đột biến nhược độc

bằng phương pháp knock - out gen aroA", Tạp chí Sinh học, 36(1se), tr. 15-

21.

12. Cung Thị Lý, Phan Thị Vân, Trần Ngọc Hùng (2015), "Biến đổi mô học sau

khi tiêm vacxin nhũ dầu trên cá giò Rachycentron cadadum", Tạp chí Khoa

học và phát triển, 13(1), tr. 49-55.

13. Hoàng Anh Tố Mai, Võ Văn Nha (2015), "Đặc điểm sinh học của chủng

Edwardsiella ictaluri bị đột biến gen aroA dùng làm vaccine phòng bệnh gan

thân mủ ở cá tra Pangasianodon hypophthalmus", Tạp chí khoa học - Công

nghệ thủy sản, 1/2015, tr. 140-145.

14. Nguyễn Trọng Nghĩa, Âu Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Minh Trang, Đặng Thị

Hoàng Oanh, Trương Quốc Phũ, Phan Anh Tuấn (2013), "Phân lập và xác

định khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus",

Hội nghị khoa học trẻ ngành thủy sản toàn quốc lần thứ IV, Kỷ yếu, tr. 411-

419.

15. Trần Linh Thước (2009), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,

thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo dục, 232 tr.

16. Nguyễn Thị Thanh Thùy, Nguyễn Hữu Dũng, Wergeland H.I. (2012),

"Thành phần protein và độc tính của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây

bệnh lở loét trên cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) nuôi thương phẩm

tại Khánh Hòa", Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 4/2012, tr. 180-184.

117

17. Trần Thị Bích Thủy, Võ Thị Ngọc Trâm, Nguyễn Thị Chi, Võ Hoàng Ánh,

Võ Văn Nha (2012), "Tìm hiểu khả năng gây bệnh gan thân mủ trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus) của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

bị đột biến gen purA", Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 3/2012, tr.

163-168.

18. Trần Hạnh Triết, Vũ Thị Thanh Hương, Bùi Thị Thanh Tịnh, Lê Văn Hậu,

Trần Thanh Tiếng, Nguyễn Quốc Bình (2014), "So sánh khả năng xâm

nhiễm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá

tra (Pangasius hypophthalmus)", Tạp chí Sinh học, 36(1se), tr. 1-7.

19. Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Thị Hạnh, Võ Anh Tú (2013),

"Đánh giá kháng nguyên và tác dụng của nhũ dầu lên tính kháng nguyên của

vi khuẩn bất hoạt Vibrio alginolyticus, Vibrio paramaemolyticus, Vibrio

haveyi trên cá Giò (Rachycentron canadum) nuôi tại Việt Nam", Tạp chí

nông nghiệp và phát triển nông thôn, 13/2013, tr. 153-158.

Tài liệu tiếng Anh

20. Abdallah F.B., Ellafi A., Lagha R., Bakhrouf A., Namane A., Rousselle J.C.,

Lenormand P., Kallel H. (2010), "Identification of outer membrane proteins

of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus altered in response to

gamma-irradiation or long-term starvation", Research in Microbiology, 161

(10), pp. 869-875.

21. Ahn S., Chung H.Y., Lim S., Kim K., Kim S., Na E.J., Caetano-Anolles K.,

Lee J.H., Ryu S., Choi S.H., Kim H. (2016), "Complete genome of Vibrio

parahaemolyticus FORC014 isolated from the toothfish", Gut Pathogens, 8,

pp. 59-64.

22. Akazawa N., Alvial A., Blanc P.P., Miguel Burgos J., W. Chamberlain G.,

Forster J., Tung H., Ibarra R., Khoa L.V., Kibenge F., V. Lightner D., Hao

N.V., Lussian Nikuli H., Omar I., Ralaimarindaza L., Bondad-Reantaso M.,

118

St-Hilaire S., Dick Towner R., Loc T.H., Villarreal M. (2014), Reducing

disease risk in aquaculture Word bank Report number 88257-GLB, 119 pp.

23. Amend D.F. (1981), "Potency testing of fish vaccines. International

symposium on fish Biologics: Serodiagnostics and vaccines.", Dev Biol

Stand, 49, pp. 447-454.

24. Anjay, Das S.C., Kumar A., Kaushik P., Kumari S. (2016), "Pathogenic and

pandemic Vibrio parahaemolyticus detection in fish and shellfish isolates",

Indian Journal of Geo-Marine Sciences, 45(9), pp. 1195-1198.

25. Arias C.R., Shoemaker C.A., Evans J.J., Klesius P.H. (2003), "A

comparative study of Edwardsiella ictaluri parent (EILO) and E.ictaluri

rifampicin-mutant (RE-33) isolates using lipopolysaccharides, outer

membrane proteins, fatty aciids, Biolog, API 20E and genomic analyses", J

Fish Dis, 26, pp. 415-421.

26. Ashrafudoulla M., Mizan M.F.R., Park H., Byun K.H., Lee N., Park S.H., Ha

S.D. (2019), "Genetic relationship, virulence factors, drug resistance profile

and biofilm formation ability of Vibrio parahaemolyticus isolated from

mussel", Frontiers in Microbiology, 10, pp. 513-526.

27. Austin B., Austin D.A. (2007), Bacterial fish pathogens. Disease of farmed

and wild fish, Springer/Praxis Publishing, Chichester, UK, 552 pp.

28. Azwai S.M., Alfallani E.A., Abolghait S.K., Garbaj A.M., Naas H.T.,

Moawad A.A., Gammoudi F.T., Rayes H.M., Barbieri I., Eldaghayes I.M.

(2016), "Isolation and molecular identification of Vibrio spp. by sequencing

of 16S rDNA from seafood, meat and meat products in Libya", Open

Veterinary Journal, 6 (1), pp. 36-43.

29. Bej A.K., Patterson D.P., Brasher C.W., Vickery M.C., Jones D.D., Kaysner

C.A. (1999), "Detection of total and hemolysin-producing Vibrio

parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tlh, tdh

and trh.", J Microbiol Methods, 36(3), pp. 215-225.

119

30. Broberg C., Calder T., Orth K. (2011), "Vibrio parahaemolyticus cell

biology and pathogenicity determinants", Microbes Infect, 13(12-13), pp.

992-1001.

31. Brudeseth B.E., Wiulsrod R., Fredriksen B.N., Lindmo K., Lokling K.E.,

Bordevik M., Steine N., Klevan A., Gravningen K. (2013), "Status and future

perspectives of vaccines for industrialised fin-fish farming", Fish & Shellfish

Immunology, 35 (6), pp. 1759-1768.

32. Campbell E.A., Korzheva N., Mustaev A., Murakami K., Nair S., Goldfarb

A. (2001), "Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA

polymerase", Cell, 104, pp. 901-912.

33. Chakraborty R.D., Surendran P.K. (2008), "Occurrence and distribution of

virulent strains of Vibrio parahaemolyticus in seafoods marketed from

Cochin (India)", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24 (9),

pp. 1929-1935.

34. Chao G., Jiao X., Zhou X., Yang Z., Huang J., Zhou L., Qian X. (2009),

"Distribution, prevalence, molecular typing, and virulence of Vibrio

parahaemolyticus isolated from different sources in coastal province Jiangsu,

China", Food Control 20, pp. 907-912.

35. Chen Y., Cai S., Jian J. (2018), "Protection against Vibrio alginolyticus in

pearl gentian grouper (♀Epinephelus fuscoguttatus × ♂Epinephelus

lanceolatu) immunized with an acfA-deletion live attenuated vaccine", Fish

& Shellfish Immunology, 86, pp. 875-881.

36. Cheng C.A., John J.A., Wu M.S., Lee C.Y., Lin C.H., Lin C.H., Chang C.Y.

(2006), "Characterization of serum immunoglobulin M of grouper and cDNA

cloning of its heavy chain", Veterinary Immunology and Immunopathology,

109(3-4), pp. 255-265.

37. Cheng K., Pan D., Teng J., Yao L., Ye Y., Xue F., Xia F., Chen W. (2016),

"Colorimetric integrated PCR protocol for rapid detection of Vibrio

parahaemolyticus", Sensors, 16 (10), pp. 1600-1610.

120

38. Clark J.S., Tangtrongpiros J., Chansue N. (2010), "Establishing safety and

efficacy of an injectable form of a Vibrio vaccine for the orange-spotted

grouper", Aquaculture Asia Pacific 6, pp. 30-33.

39. Clinical and Laboratory Standards Institure (2006a), Performance standards

for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests of bacteria isolate

from aquatic animals, Approve Standard, Clinical and Laboratory Standards

Institure, Wayne, JR.

40. Collin B., Rehnstam-Holm A.S. (2011), "Occurrence and potential

pathogenesis of Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio

vulnificus on the South Coast of Sweden", FEMS Microbiol Ecol, 78(2), pp.

306-313.

41. Cornelis G.R. (2006), "The type III secretion injectisome", Nature reviews

Microbiology, 4 (11), pp. 811-825.

42. Daly J., Griffiths S., Kew A., Moore A., Olivier G. (2001), "Characterization

of attenuated Renibacterium salmoninarum strains and their use as live

vaccines.", Dis Aquat Organ, 44(2), pp. 121-126.

43. Deepanjali A., Kumar H.S., Karunasagar I., Karunasagar I. (2005), "Seasonal

variation in abundance of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus

bacteria in oysters along the southwest coast of India", Applied and

Environmental Microbiology, 71 (7), pp. 3575-3580.

44. Dong H., Xiang Q., Gu Y., Wang Z., Paterson N.G., Stansfeld P.J., He C.,

Zhang Y., Wang W., Dong C. (2014), "Structural basis for outer membrane

lipopolysaccharide insertion", Nature, 511 (7507), pp. 52-56.

45. Espiñeira M., Atanassova M., Vieites J.M., Santaclara F.J. (2010),

"Validation of a method for the detection of five species, serogroups,

biotypes and virulence factors of Vibrio by multiplex PCR in fish and

seafood.", Food Microbiol, 27(1), pp. 122-131.

46. Gao Y., Wu H., Wang Q., Qu J., Liu Q., Xiao J., Zhang Y. (2014), "A live

attenuated combination vaccine evokes effective immune-mediated

121

protection against Edwardsiella tarda and Vibrio anguillarum", Vaccine, 32

(45), pp. 5937-5944.

47. Gliniewicz K., Plant K., LaPatra S., LaFrentz B., Cain K., Snekvik K., Call

D. (2012), "Comparative proteomic analysis of virulent and rifampicin-

attenuated Flavobacterium psychrophilum", J Fish Dis, 35(7), pp. 529-239.

48. Gliniewicz K., Wildung M., Orfe L.H., Wiens G.D., Cain K.D., Lahmers

K.K., Snekvik K.R., Call D.R. (2015), "Potential mechanisms of attenuation

for rifampicin-passaged strains of Flavobacterium psychrophilum", BMC

microbiology, 15, pp. 179-194.

49. Gotoh K., Kodama T., Hiyoshi H., Izutsu K., Park K.S., Dryselius R. (2010),

"Bile acid-induced virulence gene expression of Vibrio parahaemolyticus

reveals a novel therapeutic potential for bile acid sequestrants", PloS one,

5(10), pp. 5:e13365.

50. Gutierrez W.C.K, Klein S.L, Lovell C.R. (2013), "High frequency of

virulence factor genes tdh, trh, and tlh in Vibrio parahaemolyticus strains

isolated from a pristine estuary", Applied and environmental microbiology,

79 (7), pp. 2247-2252.

51. Hansen J.D., Landis E.D., Phillips R.B. (2005), "Discovery of a unique Ig

heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: Implications for a distinctive B

cell developmental pathway in teleost fish", Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 102 (19), pp. 6919-

6924.

52. Hasrimi A.N., Budiharjo A., Jannah S.N. (2018), "Detection of tlh and tdh

genes in Vibrio parahaemolyticus inhabiting farmed water ecosystem used

for L. Vannamei aquaculture", Journal of Physics: Conference Series, 1025

(Conference 1), pp. 012058.

53. Hassan M., Wefky S. (2017), "Phenotypic characterization of Vibrio species:

Application of indigenous phages for biological control of Vibrio in

122

aquaculture live Feeds", International Journal of Current Microbiology and

Applied Sciences, 6 (6), pp. 2760-2778.

54. Hazen T.H., Kennedy K.D., Chen S., Yi S.V., Sobecky P.A. (2009),

"Inactivation of mismatch repair increases the diversity of Vibrio

parahaemolyticus", Environmental microbiology, 11 (5), pp. 1254-1266.

55. Hoffmann M., Monday S.R., Fischer M., Brown E.W. (2012), "Genetic and

phylogenetic evidence for misidentification of Vibrio species within the

Harveyi clade", Lett Appl Microbiol, 54 (2), pp. 160-165.

56. Holt J.G., Krieg N.R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T. (1994),

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Hensyl, W.R., Williams &

Wilkins, Baltimore, USA, pp. 787.

57. Hordvik I., Berven F.S., Solem S.T., Hatten F., Endresen C. (2002),

"Analysis of two IgM isotypes in Atlantic salmon and brown trout", Mol

Immunol, 39(56), pp. 313-321.

58. Hu Y.H., Deng T., Sun B.G., Sun L. (2012), "Development and efficacy of

an attenuated Vibrio harveyi vaccine candidate with cross protectivity against

Vibrio alginolyticus", Fish & Shellfish Immunology, 32 (6), pp. 1155-1161.

59. Hubbard T.P., Chao M.C., Abel S., Blondel C.J., Abel Zur Wiesch P., Zhou

X., Davis B.M., Waldor M.K. (2016), "Genetic analysis of Vibrio

parahaemolyticus intestinal colonization", Proc Natl Acad Sci USA, 113

(22), pp. 6283-6288.

60. Iida T., Suthienkul O., Park K.S., Tang G.Q., Yamamoto R.K., Ishibashi M.,

Yamamoto K., Honda T. (1997), "Evidence for genetic linkage between the

ure and trh genes in Vibrio parahaemolyticus", Journal of Medical

Microbiology, 46 (8), pp. 639-645.

61. Ina-Salwany M.Y., Al-Saari N., Mohamad A., Mursidi F.A., Mohd-Aris A.,

Amal M.N.A., Kasai H., Mino S., Sawabe T., Zamri-Saad M. (2019),

"Vibriosis in Fish: A review on disease development and prevention", J

Aquat Anim Health, 31 (1), pp. 3-22.

123

62. Jensen R.V., Depasquale S.M., Harbolick E.A., Hong T., Kernell A.L.,

Kruchko D.H., Modise T., Smith C.E., McCarter L.L., Stevens A.M. (2013),

"Complete genome sequence of prepandemic Vibrio parahaemolyticus

BB22OP", Genome announcements, 1 (1), pp. e00002-00012.

63. Jesus H.D.L., Leon-Sicairos N., Velazquez-Roman J., Flores-Villasenor H.,

Guadron-Llanos A.M., Martinez-Garcia J.J., Vidal J.E., Canizalez-Roman A.

(2015), "A pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone causing most

associated diarrhea cases in the Pacific Northwest coast of Mexico",

Frontiers in microbiology, 6, pp. 221-132.

64. Jia A., Woo N.Y., Zhang X.H. (2010), "Expression, purification, and

characterization of thermolabile hemolysin (TLH) from Vibrio

alginolyticus", Dis Aquat Organ, 90 (2), pp. 121-127.

65. Jiang X., Zhang C., Zhao Y., Kong X., Pei C., Li L., Nie G., Li X. (2016),

"Immune effects of the vaccine of live attenuated Aeromonas hydrophila

screened by rifampicin on common carp (Cyprinus carpio L).", Vaccine,

34(27), pp. 3087-3092.

66. Kalburge S.S., Polson S.W., Boyd Crotty K., Katz L., Turnsek M., Tarr C.L.,

Martinez-Urtaza J., Boyd E.F. (2014), "Complete genome sequence of Vibrio

parahaemolyticus environmental strain UCM-V493", Genome

announcements, 2 (2), pp. 1-2.

67. Kim H.J., Ryu J.O., Lee S.Y., Kim E.S., Kim H.Y. (2015), "Multiplex PCR

for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with

primer sets designed using comparative genomics", BMC microbiology, 15,

pp. 239-250.

68. Kim S., Chung H.Y., Lee D.H., Lim J.G., Kim S.K., Ku H.J., Kim Y.T., Kim

H., Ryu S., Lee J.H., Choi S.H. (2016), "Complete genome sequence of

Vibrio parahaemolyticus strain FORC_008, a foodborne pathogen from a

flounder fish in South Korea", Pathogens and disease, 74(5), pp. ftw044.

124

69. Kim Y.B., Okuda J., Matsumoto C., Takahashi N., Hashimoto S., Nishibuchi

M. (1999), "Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species

level by PCR targeted to the toxR gene.", Journal of clinical microbiology,

37(4), pp. 1173-1177.

70. Klein S.L., Gutierrez West C.K., Mejia D.M., Lovell C.R. (2014), "Genes

similar to the Vibrio parahaemolyticus virulence-related genes tdh, tlh, and

vscC2 occur in other Vibrionaceae species isolated from a pristine estuary",

Applied and environmental microbiology, 80 (2), pp. 595-602.

71. Kondo H., Tinwongger S., Proespraiwong P., Mavichak R., Unajak S.,

Nozaki R., Hirono I. (2014), "Draft genome sequences of six strains of

Vibrio parahaemolyticus isolated from early mortality syndrome/acute

hepatopancreatic necrosis disease shrimp in Thailand", Genome

announcements, 2 (2), pp. e00221-00214.

72. LaFrentz B.R., LaPatra S.E., Call D.R., Cain K.D. (2008), "Isolation of

rifampicin resistant Flavobacterium psychrophilum strains and their potential

as live attenuated vaccine candidates", Vaccine, 26 (44), pp. 5582-5589.

73. Lan M.Z., Peng X., Xiang M.Y., Xia Z.Y., Bo W., Jie L., Li X.Y., Jun Z.P.

(2007), "Construction and characterization of a live, attenuated esrB mutant

of Edwardsiella tarda and its potential as a vaccine against the haemorrhagic

septicaemia in turbot, Scophthamus maximus (L.).", Fish & shellfish

immunology, 23(3), pp. 521-530.

74. Lee A.S., Lim I.H., Tang L.L., Wong S.Y. (2005), "High frequency of

mutations in the rpoB gene in rifampin-resistant clinical isolates of

Mycobacterium tuberculosis from Singapore", Journal of clinical

microbiology, 43 (4), pp. 2026-2027.

75. Lesley M.B., Yong S.F., Velnetti L., Pui C.F., Micky V., Apun K., Chong

Y.L.P., Fung C. (2014), "Incidence of Vibrio parahaemolyticus at estuarine

region of Sg. Sarawak (Sarawak) influenced by physicochemical

parameters", Bioremediation Science & Technology Research, 2(1), pp. 9-13.

125

76. Letchumanan V., Ser H.L., Chan K.G., Goh B.H., Lee L.H. (2016),

"Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus VP103 strain isolated from

shrimp in Malaysia", Frontiers in Microbiology, 7, pp. 1496-1500.

77. Li C., Ye Z., Wen L., Chen R., Tian L., Zhao F., Jianyi P. (2014),

"Identification of a novel vaccine candidate by immunogenic screening of

Vibrio parahaemolyticus outer membrane proteins", Vaccine, 32 (46), pp.

6115-6121.

78. Li H., Ye M.Z., Peng B., Wu H.K., Xu C.X., Xiong X.P., Wang C., Wang

S.Y., Peng X.X. (2010), "Immunoproteomic identification of polyvalent

vaccine candidates from Vibrio parahaemolyticus outer membrane proteins",

Journal of Proteome Research, 9 (5), pp. 2573-2583.

79. Li J., Mo Z., Li G., Xiao P., Huang J. (2015), "Generation and evaluation of

virulence attenuated mutants of Edwardsiella tarda as vaccine candidates to

combat edwardsiellosis in flounder (Paralichthys olivaceus)", Fish &

Shellfish Immunology, 43(1), pp. 175-180.

80. Li J., Yie J., Foo R.W.T., Ling J.M.L., Xu H.S., Woo N.Y.S. (1999),

"Antibiotic resistance and plasmid profi les of vibrio isolates from cultured

silver sea bream, Sparus sarba", Marine Pollution Bulletin, 39, pp. 245-249.

81. Li L., Gao M., Lu T., Gu D. (2019), "Dissection of ToxR-dependent and

ToxR-independent stress-regulated pathways in Vibrio parahaemolyticus",

Microbiological Research, 223-225, pp. 79-87.

82. Li L., Lin S.L., Deng L., Liu Z.G. (2013), "Potential use of chitosan

nanoparticles for oral delivery of DNA vaccine in black seabream

Acanthopagrus schlegelii Bleeker to protect from Vibrio parahaemolyticus",

J Fish Dis, 36 (12), pp. 987-995.

83. Li L., Wang R., Liang W., Huang T., Huang Y., Luo F., Lei A., Chen M.,

Gan X. (2015), "Development of live attenuated Streptococcus agalactiae

vaccine for tilapia via continuous passage in vitro", Fish & Shellfish

Immunology, 45(2), pp. 955-963.

126

84. Li N., Yang Z., Bai J., Fu X., Liu L., Shi C., Wu S. (2010), "A shared

antigen among Vibrio species: Outer membrane protein-OmpK as a versatile

Vibriosis vaccine candidate in Orange-spotted grouper (Epinephelus

coioides)", Fish & Shellfish Immunology, 28 (5-6), pp. 952-956.

85. Lin Y.H., Shiau S.Y. (2005), "Dietary L-ascorbic acid affects growth,

nonspecific immune response and disease resistance in juvenile grouper

Epinephelus malabaricus", Aquaculture Asia Pacific, 244, pp. 215- 221.

86. Liu R., Chen J., Li K., Zhang X. (2011), "Identification and evaluation as a

DNA vaccine candidate of a virulence-associated serine protease from a

pathogenic Vibrio parahaemolyticus isolate.", Fish & Shellfish Immunology,

30 (6), pp. 1241-1248.

87. Liu X., Jiao C., Ma Y., Wang Q., Zhang Y. (2018), "A live attenuated Vibrio

anguillarum vaccine induces efficient immunoprotection in Tiger puffer

(Takifugu rubripes)", Vaccine, 36 (11), pp. 1460-1466.

88. Liu Y., Bi Z. (2007), "Potential use of a transposon Tn916-generated mutant

of Aeromonas hydrophila J-1 defective in some exoproducts as a live

attenuated vaccine.", Prev Vet Med, 78(1), pp. 79-84.

89. Locke J.B., Aziz R.K., Vicknair M.R., Nizet V., Buchanan J.T. (2008),

"Streptococcus iniae M-like protein contributes to virulence in fish and is a

target for live attenuated vaccine development", PloS one, 3 (7), pp. e2824.

90. Long A., Fehringer T., Swain M., LaFrentz B., Call D., Cain K. (2013),

"Enhanced efficacy of an attenuated Flavobacterium psychrophilum strain

cultured under iron-limited conditions.", Fish & Shellfish Immunology,

35(5), pp. 1477-1482.

91. Lun J., Xia C., Yuan C., Zhang Y., Zhong M., Huang T., Hu Z. (2014), "The

outer membrane protein, LamB (maltoporin), is a versatile vaccine candidate

among the Vibrio species.", Vaccine, 32 (7), pp. 809-815.

92. Ma J., Bruce T., Sudheesh P., Knupp C., Loch T., Faisal M., Cain K. (2019),

"Assessment of cross-protection to heterologous strains of Flavobacterium

127

psychrophilum following vaccination with a live-attenuated coldwater

disease immersion vaccine", J Fish Dis, 42 (1), pp. 75-84.

93. Makino K., Oshima K., Kurokawa K., Yokoyama K., Uda T., Tagomori K.,

Iijima Y., Najima M., Nakano M., Yamashita A., Kubota Y., Kimura S.,

Yasunaga T., Honda T., Shinagawa H., Hattori M., Iida T. (2003), "Genome

sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from

that of V. cholerae", Lancet (London, England), 361 (9359), pp. 743-749.

94. Mao Z., Yu L., You Z., Wei Y., Liu Y. (2007), "Expression and

immunogenicity analysis of two iron-regulated outer membrane proteins of

Vibrio parahaemolyticus", Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 39 (10),

pp. 763-769.

95. Mao Z., Yu L., You Z., Wei Y., Liu Y. (2007), "Cloning, expression and

immunogenicty analysis of five outer membrane proteins of Vibrio

parahaemolyticus zj2003.", Fish & Shellfish Immunology, 23 (3), pp. 567-

575.

96. María E.C.G., Carlos V.S., Elsa I.Q.R. (2004), "Seralogic and molecular

characterization of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from seawater

and fish products of the Gulf of Mexico", Applied and Environmental

Microbiology, 70(11), pp. 6401-6406.

97. Mariam D.H., Mengistu Y., Hoffner S.E., Andersson D.I. (2004), "Effect of

rpoB mutations conferring rifampin resistance on fitness of Mycobacterium

tuberculosis", Antimicrob Agents and Chemother, 48 (4), pp. 1289-1294.

98. Marianelli C., Ciuchini F., Tarantino M., Pasquali P., Adone R. (2004),

"Genetic bases of the rifampin resistance phenotype in Brucella spp.",

Journal of Clinical Microbiology, 42 (12), pp. 5439-5443.

99. Marlina R.S., Kqueen C.Y., Napis S., Zakaria Z., Mutalib S.A., Nishbuchi

M. (2007), "Detection of tdh and trh genes in Vibrio parahaemolyticus

isolated from Corbicula moltkiana Prime in West Sumatera, Indonesia",

Southeast Asian J Trop Med Public Health 38(2), pp. 349-355.

128

100. Marudhupandi T., Ajith Kumar T.T., Prakash S., Balamurugan J., Dhayanithi

N.B. (2017), "Vibrio parahaemolyticus a causative bacterium for tail rot

disease in ornamental fish, Amphiprion sebae", Aquacult Rep, 8, pp. 39-44.

101. Matsumoto C., Okuda J., Ishibashi M., Iwanaga M., Garg P., Rammamurthy

T., Wong H.C., Depaola A., Kim Y.B., Albert M.J., Nishibuchi M. (2000),

"Pandemic spread of an O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus and

emergence of related strains evidenced by arbitrarily primed PCR and toxRS

sequence analyses", Journal of clinical microbiology, 38(2), pp. 578-585.

102. Maughan H., Galeano B., Nicholson W.L. (2004), "Novel rpoB mutations

conferring rifampin resistance on Bacillus subtilis: Global effects on growth,

competence, sporulation, and germination", J Bacteriol, 186 (8), pp. 2481-

2486.

103. Mohamad N., Mustafa M., Amal M.N.A., Saad M.Z., Md Yasin I.S., Al-

Saari N. (2019), "Environmental factors associated with the presence of

Vibrionaceae in tropical cage-cultured marine fishes", J Aquat Anim Health,

31(2), pp. 154-167.

104. Mohammed H., Olivares-Fuster O., LaFrentz S., Arias C. (2013), "New

attenuated vaccine against columnaris disease in fish: choosing the right

parental strain is critical for vaccine efficacy.", Vaccine, 31(45), pp. 5276-

5280.

105. Mollet C., Drancourt M., Raoult D. (1997), "rpoB sequence analysis as a

novel basis for bacterial identification", Molecular microbiology, 26 (5), pp.

1005-1011.

106. Muiswinkel W.B.V. (2008), "A history of fish immunology and vaccination

I. The early days", Fish & Shellfish Immunology, 25 (4), pp. 397-408.

107. Muiswinkel W.B.V., Nakao M. (2014), "A short history of research on

immunity to infectious diseases in fish", Developmental and Comparative

Immunology, 43 (2), pp. 130-150.

129

108. Murakami K.S. (2015), "Structural biology of bacterial RNA polymerase",

Biomolecules, 5 (2), pp. 848-864.

109. Nelapati S., Krishnaiah N. (2010), "Detection of total and pathogenic Vibrio

parahaemolyticus by polymerase chain reaction using toxR, tdh and trh

genes", Veterinary World, 3(6), pp. 268-271.

110. Nho S.W., Abdelhamed H., Karsi A., Lawrence M.L. (2017), "Improving

safety of a live attenuated Edwardsiella ictaluri vaccine against enteric

septicemia of catfish and evaluation of efficacy", Vet Microbiol, 210, pp. 83-

90.

111. Nishibuchi M., Kaper J.B. (1995), "Thermostable direct hemolysin gene of

Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium",

Infection and Immunity, 63 (6), pp. 2093-2099.

112. Novriadi R. (2016), "Vibriosis in aquaculture", OmniAkuatika, 12 (1), pp 1-

12.

113. Olivares-Fuster O., Bullard S., McElwain A., Llosa M., Arias C. (2011),

"Adhesion dynamics of Flavobacterium columnare to channel catfish

Ictalurus punctatus and zebrafish Danio rerio after immersion challenge",

Dis Aquat Organ, 96(3), pp. 221-227.

114. Osei-Adjei G., Gao H., Zhang Y., Zhang L., Yang W., Yang H., Yin Z.,

Huang X., Zhang Y., Zhou D. (2017), "Regulatory actions of ToxR and CalR

on their own genes and type III secretion system 1 in Vibrio

parahaemolyticus", Oncotarget, 8 (39), pp. 65809-65822.

115. Pang H., Chen L., Hoare R., Huang Y., Zaohe W., Jian J. (2016),

"Identification of DLD, by immunoproteomic analysis and evaluation as a

potential vaccine antigen against three Vibrio species in Epinephelus

coioides", Vaccine, 34 (9), pp. 1225-1231.

116. Pang H., Qiu M., Zhao J., Hoare R., Monaghan S.J., Song D., Chang Y., Jian

J. (2018), "Construction of a Vibrio alginolyticus hopPmaJ (hop) mutant and

evaluation of its potential as a live attenuated vaccine in orange-spotted

130

grouper (Epinephelus coioides)", Fish & Shellfish Immunology, 76, pp. 93-

100.

117. Paranjpye R.N., Myers M.S., Yount E.C., Thompson J.L. (2013), "Zebrafish

as a model for Vibrio parahaemolyticus virulence", Microbiology, 159 (Pt

12), pp. 2605-2615.

118. Paria P., Chakraborty H.J., Behera B.K., Das Mohapatra P.K., Das B.K.

(2019), "Computational characterization and molecular dynamics simulation

of the thermostable direct hemolysin-related hemolysin (TRH) amplified

from Vibrio parahaemolyticus", Microbial Pathogenesis, 127, pp. 172-182.

119. Park H.J., Oh S., Vinod N., Ji S., Noh H.B., Koo J.M., Lee S.H., Kim S.C.,

Lee K.S., Choi C.W. (2016), "Characterization of chemically-induced

bacterial ghosts (BGs) using sodium hydroxide-induced Vibrio

parahaemolyticus ghosts (VPGs)", International journal of molecular

sciences, 17(11), pp. 1904-1919.

120. Pascual J., Macian M.C., Arahal D.R., Garay E., Pujalte M.J. (2010),

"Multilocus sequence analysis of the central clade of the genus Vibrio by

using the 16S rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB and toxR genes",

International journal of systematic and evolutionary microbiology, 60 (Pt 1),

pp. 154-165.

121. Peng B., Lin X.P., Wang S.N., Yang M.J., Peng X.X., Li H. (2018),

"Polyvalent protective immunogens identified from outer membrane proteins

of Vibrio parahaemolyticus and their induced innate immune response.",

Fish & Shellfish Immunology, 72, pp. 104-110.

122. Peng B., Ye J.Z., Han Y., Zeng L., Zhang J.Y., Li H. (2016), "Identification

of polyvalent protective immunogens from outer membrane proteins in

Vibrio parahaemolyticus to protect fish against bacterial infection.", Fish &

Shellfish Immunology, 54, pp. 204-210.

131

123. Peramachi P. (2018), "Multi-subunit RNA polymerases of bacteria: An

insight into their active sites and catalytic mechanism", Indian Journal of

Science and Technology, 11 (39), pp. 1-37.

124. Perez-Varela M., Corral J., Vallejo J.A., Rumbo-Feal S., Bou G., Aranda J.,

Barbe J. (2017), "Mutations in the beta-cubunit of the RNA polymerase

impair the surface-associated motility and virulence of Acinetobacter

baumannii", Infection and Immunity, 85 (8), pp. e00327-00317.

125. Plant K.P., Lapatra S.E. (2011), "Advances in fish vaccine delivery",

Developmental and Comparative Immunology, 35 (12), pp. 1256-1262.

126. Praja R.K. (2018), "The infection of Vibrio parahaemolyticus in shrimp and

human", Oceana Biomedicina Journal, 1 (1), pp. 44-58.

127. Pridgeon J., Klesius P. (2013), "Development of live attenuated

Streptococcus agalactiae as potential vaccines by selecting for resistance to

sparfloxacin", Vaccine, 31 (24), pp. 2705-2712.

128. Pridgeon J., Klesius P., Yildirim-Aksoy M. (2013), "Attempt to develop live

attenuated bacterial vaccines by selecting resistance to gossypol, proflavine

hemisulfate, novobiocin, or ciprofloxacin", Vaccine, 31, pp. 2222-2230.

129. Pridgeon J.W., Klesius P.H. (2011), "Development of a novobiocin-resistant

Edwardsiella ictaluri as a novel vaccine in channel catfish (Ictalurus

punctatus)", Vaccine, 29, pp. 5631-5637.

130. Pridgeon J.W., Klesius P.H. (2011), "Development and efficacy of

novobiocin and rifampicin-resistant Aeromonas hydrophila as novel vaccines

in channel catfish and Nile tilapia", Vaccine, 29 (45), pp. 7896-7904.

131. Qazi O., Rahman H., Tahir Z., Qasim M., Khan S., Ahmad Anjum A., Yaqub

T., Tayyab M., Ali N., Firyal S. (2014), "Mutation pattern in rifampicin

resistance determining region of rpoB gene in multidrug-resistant

Mycobacterium tuberculosis isolates from Pakistan", International Journal

of Mycobacteriology, 3 (3), pp. 173-177.

132

132. Raghunath P. (2014), "Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and

TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus", Frontiers in

Microbiology, 5, pp. 805-809.

133. Reed L.J., Muench H. (1938), "A simple method for estimating fifty percent

endpoints", Am J Hyg, 27 (3), pp. 493-497.

134. Rojas M.V.R., Matté M.H., Dropa M., Silva M.L.D., Matté G.R. (2011),

"Characterization of Vibrio parahaemolyticus isolated from oysters and

mussels in São Paulo, Brazil", Revista do Instituto de Medicina Tropical de

São Paulo, 53 (4), pp. 201-205.

135. Ryo S., Wijdeven R.H., Tyagi A., Hermsen T., Kono T., Karunasagar I.,

Rombout J.H., Sakai M., Verburg-van K.B.M., R. S. (2010), "Common carp

have two subclasses of bony fish specific antibody IgZ showing differential

expression in response to infection", Developmental and Comparative

Immunology, 34(11), pp. 1183-1190.

136. Shefat S.H.T. (2018), "Vaccines for Use in Finfish Aquaculture", Acta

Scientific Pharmaceutical Sciences, 2 (11), pp. 15-19.

137. Shoemaker C.A., Klesius P.H., Evans J.J. (2007), "Immunization of eyed

channel catfish, Ictalurus punctatus, eggs with monovalent Flavobacterium

columnare vaccine and bivalent F. columnare and Edwardsiella ictaluri

vaccine", Vaccine, 25 (6), pp. 1126-1131.

138. Shyne A.P.S., Sobbhana K.S., George K.C., Paul R.R. (2008), "Phenotypic

characteristics and antibiotic sensitivity of Vibrio parahaemolyticus strains

isolated from diseases grouper (Epinephelus spp.)", J Mar Biol Ass, 50, pp.

1-6.

139. Shyne A.P.S., Sobhana K.S., George K.C., Paul R.R. (2016), "Selection of

specific cell wall antigen for rapid detection of fish pathogenic Vibrio

parahaemolyticus by enzyme immunoassay", Indian Journal of Fisheries,

63(2) (2), pp. 76-85.

133

140. Sommerset I., Krossoy B., Biering E., Frost P. (2005), "Vaccines for fish in

aquaculture", Expert Rev Vaccines, 4 (1), pp. 89-101.

141. Subhashini N., Krishnaiah N., Bindu K.C. (2011), "Detection of Vibrio

parahaemolyticus in shell fish by cultrural and polymerase chain reaction",

International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2, pp. 335-341.

142. Sudheesh P., Cain K. (2016), "Optimization of efficacy of a live attenuated

Flavobacterium psychrophilum immersion vaccine.", Fish & Shellfish

Immunology, 56, pp. 169-180.

143. Sun Y., Liu C., Sun L. (2010), "Isolation and analysis of the vaccine

potential of an attenuated Edwardsiella tarda strain", Vaccine, 28(38), pp.

6344-6450.

144. Swain P., Behera T., Mohapatra D., Nanda P.K., Nayak S.K., Meher P.K.,

Das B.K. (2010), "Derivation of rough attenuated variants from smooth

virulent Aeromonas hydrophila and their immunogenicity in fish", Vaccine,

28 (29), pp. 4626-4631.

145. Tarr C.L., Patel J.S., Puhr N.D., Sowers E.G., Bopp C.A., Strockbine N.A.

(2007), "Identification of Vibrio isolates by a multiplex PCR assay and rpoB

sequence determination", Journal of Clinical Microbiology, 45 (1), pp. 134-

140.

146. Temprano A., Riaño J., Yugueros J., González P., Castro L., Villena A.,

Luengo J.M., Naharro G. (2005), "Potential use of a Yersinia ruckeri O1

auxotrophic aroA mutant as a live attenuated vaccine.", J Fish Dis, 28(7), pp.

419-427.

147. Thuy N.T.T., Dung N.H., Wergeland H.I. (2013), "Specific humoral immune

response and protection against Vibrio parahaemolyticus in orange-spotted

grouper Epinephelus coioides", Int J Mar Sci, 4(1), pp. 24-35.

148. Titball R.W. (2008), "Vaccines against intracellular bacterial pathogens",

Drug Discov Today, 13 (13-14), pp. 596-600.

134

149. Torresi M., Sperandii A., Ricci L., Prencipe V., Migliorati G., Pomilio F.

(2018), "Detection and characterisation of potentially pathogenic species of

Vibrio in the Vibrata river, Abruzzo region, Italy", Veterinaria Italiana, 54

(2), pp. 125-135.

150. Tuyet D.T., Thiem V.D., Von S.L., Chowdhury A., Park E., Canh D.G.,

Chien B.T., Van T.T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy T.H.,

Nichibuchi M., Clemens J., Trach D.D. (2006), "Clinical, epidemiological,

and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio parahaemolyticus in

Khanh Hoa Province, Vietnam", Infect Dis 186(11), pp. 1615-1620.

151. Uribe C., Folch H., Enriquez R., Moran G. (2011), "Innate and adaptive

immunity in teleost fish: a review", Veterinarni Medicina, 56(10), pp. 486-

503.

152. USDA A., LPS Agricultural Analytics Division for the USDA National

Organic Program: Vaccines for Aquaculture. In.; 2014: 25 pp.

153. Vongxay K., Pan Z., Zhang X., Wang S., Cheng S., Mei L., Xu C., Fang W.

(2008), "Occurrence of pandemic clones of Vibrio parahaemolyticus isolates

from seafood and clinical samples in a Chinese coastal province", Foodborne

Pathog Dis, 5(2), pp. 127-134.

154. Vyas V.K., Ukawala R.D., Ghate M., Chintha C. (2012), "Homology

modeling a fast tool for drug discovery: current perspectives", Indian J

Pharm Sci, 74 (1), pp. 1-17.

155. Wan Y., Liu C., Ma Q. (2019), "Structural analysis of a Vibrio

phospholipase reveals an unusual Ser-His-chloride catalytic triad", The

Journal of Biological Chemistry, 294(30), pp. 11391-11401.

156. Wang D., Yu S., Chen W., Zhang D., Shi X. (2010), "Enumeration of Vibrio

parahaemolyticus in oyster tissues following artificial contamination and

depuration", Lett Appl Microbiol, 51 (1), pp. 104-108.

157. Wang J., Zou L.L., Li A.X. (2014), "Construction of a Streptococcus iniae

sortase A mutant and evaluation of its potential as an attenuated modified

135

live vaccine in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)", Fish & Shellfish

Immunology, 40(2), pp. 392-398.

158. Wang L., Shi L., Su J.Y., Ye Y.X., Zhong Q.P. (2013), "Detection of Vibrio

parahaemolyticus in food samples using in situ loop-mediated isothermal

amplification method", Gene, 515, pp. 421-425.

159. Whitaker W.B., Parent M.A., Naughton L.M., Richards G.P., Blumerman

S.L., Boyd E.F. (2010), "Modulation of responses of Vibrio

parahaemolyticus O3:K6 to pH and temperature stresses by growth at

different salt concentrations", Applied and Environmental Microbiology, 76

(14), pp. 4720-4729.

160. Wilson M.R., Warr G.W. (1992), "Fish immunoglobulins and the genes that

encode them", Annu Rev Fish Dis, 2, pp. 201-221.

161. Wise D., Greenway T., Byars T., Griffin M., Khoo L. (2015), "Oral

vaccination of channel catfish against enteric septicemia of catfish using a

live attenuated Edwardsiella ictaluri isolate.", J Aquat Anim Health, 27(2),

pp. 135-143.

162. Wong H.C., Chen C.H., Chung Y.J., Liu S.H., Wang T.K., Lee C.L., Chiou

C.S., Nishibuchi M., Lee B.K. (2005), "Characterization of new O3:K6

strains and phylogenetically related strains of Vibrio parahaemolyticus

isolated in Taiwan and other countries", Journal of Applied Microbiology, 98

(3), pp. 572-580.

163. Wong H.C., S. H. Liu, L. W. Ku, I. Y. Lee, T. K. Wang, Y. S. Lee, C. L.

Lee, L. P. Kuo, Shih D.Y. (2000), " Characterization of Vibrio

parahaemolyticus isolates obtained from foodborne illness outbreaks during

1992 through 1995 in Taiwan", J Food Prot, 63, pp. 900-906.

164. Wu Z., Wang S. (2004), "Experimental study on immune protection of

trivalent vaccine to common bacterial diseases of Pseudosciaena crocea", J

Xiamen Univ, 43(1), pp. 112-118.

136

165. Xiao J., Chen T., Wang Q., Liu Q., Wang X., Lv Y., Wu H., Zhang Y.

(2011), "Search for live attenuated vaccine candidate against Edwardsiellosis

by mutating virulence-related genes of fish pathogen Edwardsiella tarda",

Lett Appl Microbiol, 53(4), pp. 430-437.

166. Xie Z.Y., Hu C.Q., Chen C., Zhang L.P., Ren C.H. (2005), "Investigation of

seven Vibrio virulence genes among Vibrio alginolyticus and Vibrio

parahaemolyticus strains from the coastal mariculture systems in

Guangdong, China", Lett Appl Microbiol, 41 (2), pp. 202-207.

167. Xu X., Cheng J., Wu Q., Zhang J., Xie T. (2016), "Prevalence,

characterization, and antibiotic susceptibility of Vibrio parahaemolyticus

isolated from retail aquatic products in North China", BMC Microbiology,

16, pp. 32.

168. Xu X.J., Sang B.H., Chen W.B., Yan Q.P., Xiong Z.Y., Su J.B., Zou W.Z.

(2015), "Intracellular survival of virulence and low-virulence strains of

Vibrio parahaemolyticus in Epinephelus awoara macrophages and peripheral

leukocytes", Genetics and Molecular Research : GMR, 14 (1), pp. 706-718.

169. Yanagihara I., Nakahira K., Yamane T., Kaieda S., Mayanagi K., Hamada

D., Fukui T., Ohnishi K., Kajiyama S., Shimizu T., Sato M., Ikegami T.,

Ikeguchi M., Honda T., Hashimoto H. (2010), "Structure and functional

characterization of Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin",

The Journal of Biological Chemistry, 285 (21), pp. 16267-16274.

170. Yáñez R., Bastías R., Higuera G., Salgado O., Katharios P., Romero J.,

Espejo R., García K. (2015), "Amplification of tlh gene in other

Vibrionaceae specie by specie-specific multiplex PCR of Vibrio

parahaemolyticus", Electron J Biotechnol, 18 (6), pp. 459-463.

171. Yeung P.S., Hayes M.C., DePaola A., Kaysner C.A., Kornstein L., Boor K.J.

(2002), "Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization

of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates", Appl Environ Microbiol, 68,

pp. 2901-2909.

137

172. Yoon J.H., Bae Y.M., Lee S.Y. (2017), "Effects of varying concentrations of

sodium chloride and acidic conditions on the behavior of Vibrio

parahaemolyticus and Vibrio vulnificus cold-starved in artificial sea water

microcosms", Food Science and Biotechnology, 26 (3), pp. 829-839.

173. Yu L., Hu Y., Sun B., Sun L. (2012), "C312M: an attenuated Vibrio

anguillarum strain that induces immunoprotection as an oral and immersion

vaccine", Dis Aquat Organ, 102(1), pp. 33-42.

174. Zapata A., Diez B., Cejalvo T., Gutierrez-De Frias C., Cortes A. (2006),

"Ontogeny of the immune system of fish", Fish & Shellfish Immunology, 20,

pp. 126-136.

175. Zaw M.T., Emran N.A., Lin Z. (2018), "Mutations inside rifampicin-

resistance determining region of rpoB gene associated with rifampicin-

resistance in Mycobacterium tuberculosis", Journal of Infection and Public

Health, 11 (5), pp. 605-610.

176. Zha Z., Li C., Li W., Ye Z., Pan J. (2016), "LptD is a promising vaccine

antigen and potential immunotherapeutic target for protection against Vibrio

species infection", Scientific Reports, 6, pp. 38577.

177. Zhang X., Mu Y., Mu P., Ao J., Chen X. (2017), "Transcriptome analysis

reveals comprehensive insights into the early immune response of large

yellow croaker (Larimichthys crocea) induced by trivalent bacterial

vaccine", PloS one, 12 (1), pp. e0170958.

178. Zhang X.H., Austin B. (2005), "Haemolysins in Vibrio species", Journal of

Applied Microbiology, 98 (5), pp. 1011-1019.

179. Zhang Y., Arias C., Shoemaker C., Klesius P. (2006), "Comparison of

lipopolysaccharide and protein profiles between Flavobacterium columnare

strains from different genomovars", J Fish Dis, 29, pp. 657-663.

180. Zhang Y., Hu L., Osei-Adjei G., Zhang Y., Yang W., Yin Z., Lu R., Sheng

X., Yang R., Huang X., Zhou D. (2018), "Autoregulation of toxR and its

138

regulatory actions on major virulence gene loci in Vibrio parahaemolyticus",

Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 8, pp. 291.

181. Zhou S., Gao Z.X., Zhang M., Liu D.Y., Zhao X.P., Liu Y. (2016),

"Development of a quadruplex loop-mediated isothermal amplification assay

for field detection of four Vibrio species associated with fish disease",

SpringerPlus, 5 (1), pp. 1104.

182. Zulkifli Y., Alitheen N.B., Son R., Yeap S.K., Lesley M.B., Raha A.R.

(2009), "Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR targeted

to the toxR gene and detection of virulence genes", International Food

Research Journal, 16, pp. 289-296.

183. https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=382&idmid=2&ItemID=19036

184. https://tongcucthuysan.gov.vn/portals/0/bn%20tin%20thy%20sn%2027-

07%20-%202017.pdf

185. https://tongcucthuysan.gov.vn/portals/0/bn%20tin%20thy%20sn%20tin%no

ng%2017-08-2017.pdf

186. https://bnews.vn/da-tim-ra-nguyen-nhan-ca-chet-tren-song-cha-

va/53608.html

187. https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=19037

139

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Trình tự gen toxR của các chủng vi khuẩn

Trình tự gen toxR

Chủng

LBT6

ATGACTAACATCGGCACCAAATTTCTACTTGCTCAAAGGTTTACC TTTGATCCAAATAGTAATTCGCTCGCTGACCAACAAAGCGGCAA CGAAGTTGTACGATTAGGAAGCAACGAAAGCCGTATACTCCTGA TGTTGGCGGAGAGACCAAACGAAGTTTTAACCCGTAACGAGCTT CACGAGTTTGTTTGGCGTGAGCAAGGTTTTGAGGTGGATGACTC AAGCCTGACTCAAGCGATTTCTACTCTGCGTAAGATGTTGAAGG ATTCAACCAAATCTCCAGAGTTTGTTAAAACCGTTCCAAAACGA GGCTATCAACTCATTTGTACTGTTGAACGCCTAAGCCCGCTTTCT TCAGACTCAAGCTCAATTGAAGTTGAAGAACCTGCTTCTGATAA CAATGACGCCTCTGCTAATGAGGTAGAAACGATCGTAGAGCCGC CTTTAGCGACGTCTTCTGACGCAATCGTTGAACCAGAAGCGCCA GTAGTACCTGAAAAAGCACCTGTGGCTTCTGCTGTGAATCCTTG GATTCCACGCGTTATTTTATTTTTGGCACTATTACTACCGATTTG CGTACTGCTGTTTACAAACCCAGCGGAATCTCAGTTCCGTCAGA TTGGTGAGTATCAGAACGTACCAGTGATGACACCTGTAAATCAC CCGCAAATCAACAACTGGCTGCCTTCTATTGAGCAGTGCATTGA ACGCTACGTTAAGCACCATGCAGAAGACTCGTTACCAGTGGAAG TGATTGCCACTGGCGGACAAAATAACCAGCTGATTTTGAACTAC ATTCATGACAGTAACCACTCGTATGAGAACGTGACATTGCGTAT TTTCGCAGGTCAAAATGATCCAACAGATATCTGCAAATAA

A3.3

140

CGTACTGCTGTTTACAAACCCAGCGGAATCTCAGTTCCGTCAGA TTGGTGAGTATCAGAACGTACCAGTGATGACACCTGTAAATCAC CCGCAAATCAACAACTGGCTGCCTTCTATTGAGCAGTGCATTGA ACGCTACGTTAAGCACCATGCAGAAGACTCGTTACCAGTGGAAG TGATTGCCACTGGCGGACAAAATAACCAGCTGATTTTGAACTAC ATTCATGACAGTAACCACTCGTATGAGAACGTGACATTGCGTAT TTTCGCAGGTCAAAATGATCCAACAGATATCTGCAAATAA

B3.13

Phụ lục 2: Trình tự gen tlh của các chủng/dòng vi khuẩn

Chủng/

Trình tự gen tlh

dòng

LBT6

141

ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGT TGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACG CGTCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGT CACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGC GAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGTGCGGCTG GTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAGGTT TCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACC AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCCGAGTACCGTTTCTAA

L3900

ATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTATTCCCGGTTGC TTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTT CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACCTATACC TATGTTCGCTGTTGGTATCGCACCAGCTACTCGAAAGATGATCC GGCGACCGATTGGGAATGGGCAAAAAACGAAGATGGTAGCTAC TTCACCATTGACGGGTACTGGTGGAGCTCCGTTTCATTTAAAAAC ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGT TGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACG CGTCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGT CACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGC GAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGTGCGGCTG GTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAGGTT TCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACC

142

AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGA GTGATCCTTGTCTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCCGAGTACCGTTTCTAA

L4200

ATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGC TTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTT CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACCTATACC TATGTTCGCTGTTGGTATCGCACCAGCTACTCGAAAGATGATCC GGCGACCGATTGGGAATGGGCAAAAAACGAAGATGGTAGCTAC TTCACCATTGACGGCTACTGGTGGAGCTCCGTTTCATTTAAAAAC ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGT TGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACG CGTCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGT CACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGC GAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGTGCGGCTG GTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAGGTT TCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACC AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT

143

GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAAAT TAGCCGCAGTACCGTTCATA

L4650

ATGAAAAAAACAATCCCACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGC TTCTGCAGTTGCCGAAAAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTT CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACCTATACC TATGTTCGCTGTTGGTATCGCACCAGCTACTCGAAAGATGATCC GGCGACCGATTGGGAATGGGCAAAAAACGAAGATGGTAGCTAC TTCACCATTGACGGTTACTGGTGGAGCTCCGTTTCATTTAAAAAC ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCATCAAAGTGGTT GCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACGC ATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGTC ACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGCG AAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGCGCGGCTGG TGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAAGTTT CTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACCA GCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCATG AACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAGA AGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATGT TGATGACGGTGCCAGATGTGACGTAAGCACCTCAGTTTAAGTAC TCACCACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGAGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGCTGTTTGATACTCACGCCCTGTTTGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCAGCGTCTGGTGCT GAGAAGTTTGTGTTCTGGGATGTCACGCATCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCAGAGTACCGTTTCTAA

A3.3

144

ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGT TGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACG CGTCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGT CACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGC GAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGTGCGGCTG GTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAGGTT TCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACC AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCAA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCCGAGTACCGTTTCTAA

A400

145

AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGACCACGGTTTCGTGAACGCAA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCAATTACA TGGACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCTCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCCGAGTACCGTTTCTAA

A650

ATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGC TTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTT CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACCTATACC TATGTTCGCTGTTGGTATCGCACCAGCTACTCGAAAGATGATCC GGCGACCGATTGGGAATGGGCAAAAAACGAAGATGGTAGCTAC TTCACCATTGACGGCTACTGGTGGAGCTCCGTTTCATTTAAAAAC ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGT TGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACG CGTCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGT CACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGC GAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGTGCGGCTG GTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAGGTT TCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACC AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAAAAAACACGGTTTCGTGAACGCAAG TGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACAT GTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCTG

146

AGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAACT CACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACTT AGCACGAGTAACCGTTTAAT

B3.13

B5700

147

B7050

148

AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTGAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCTTTCCAGAAGTGAAAGCGGAATATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCAACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCCGAGTACCGTTTCTAA

B7900

ATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGC TTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTT CAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACCTATACC TATGTTCGCTGTTGGTATCGCACCAGCTACTCGAAAGATGATCC GGCGACCGATTGGGAATGGGCAAAAAACGAAGATGGTAGCTAC TTCACCATTGACGGCTACTGGTGGAGCTCCGTTTCATTTAAAAAC ATGTTCTACACCAACACGTCGCAAAACGTTATCCGTCAGCGTTG TGAAGCAACATTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGT TCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCTCATACAACCACACGATCTGGA GCAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAACAAAGTGGT TGCACTCGGTGACAGCTTGTCTGATACAGGCAACATCTTTAACG CGTCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGCTGGTTCTTAGGT CACTTCTCCAACGGTTTTGTGTGGACAGAATACATTGCCAAAGC GAAGAACCTTCCGCTCTACAACTGGGCAGTTGGCGGTGCGGCTG GTGAGAACCAATACATCGCGCTAACAGGGGTTGGTGAGCAGGTT TCTTCGTACTTAACCTACGCAAAACTGGCGAAGAACTACAAACC AGCAAACACCTTGTTTACGCTTGAGTTTGGTTTTAATGACTTCAT GAACTACAACCGTGGCGTTCCAGAAGTGAAAGCGGATTATGCAG AAGCACTGATTCGTTTGACGGACGCAGGTGCGAAGAACTTCATG TTGATGACACTGCCAGATGCGACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTA CTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTG AGATGAACGAGTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGC GCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGA GACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACGCGA GTGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCTCATCGTCTGTCGATTACA TGTACACCCACGCATTGCGCTCTGAGTGTGCGGCGTCCGGTGCT

149

GAGAAATTTGTGTTCTGGGATGTCACGCACCCAACAACAGCAAC TCACCGCTATGTTGCAGAGAAAATGCTAGAAAGTAGCAACAACT TAGCCGAGTACCGTTTCTAA

Phụ lục 3. Trình tự chuỗi polypeptide suy diễn từ gen tlh các chủng/dòng vi khuẩn

Chủng/

Trình tự polypeptide suy diễn các chủng/dòng vi khuẩn

dòng

LBT6

MKKTITLLTALLPLASAVAEEPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMFY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA MQPDQINKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGLNDFMNYNRGVPEVKADYAEALIRLTD AGAKNFMLMTLPDATKAPQFKYSTQEEIDKIRAKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPEEHGFVNASDPCLDINRSSSV DYMYTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHRYVAEKMLESS NNLAEYRF*

L3900

MKKTITLLTALFPVASAVAEEPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMFY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA MQPDQINKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGLNDFMNYNRGVPEVKADYAEALIRLTD AGAKNFMLMTLPDATKAPQFKYSTQEEIDKIRAKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPEEHGFVNASDPCLDINRSSSV DYMYTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHRYVAEKMLESS NNLAEYRF*

L4200

150

DYMYTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHRYVAEKMLESS NKLAAVPFI

L4650

MKKTIPLLTALLPLASAVAEKPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMFY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA MQPDQIIKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGLNDFMNYNRGVPEVKADYAEALIRLTD AGAKNFMLMTVPDVT*APQFKYSPQEEIDKIREKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPEEHGFVNASDPCLDINRSSSV DYMYTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHRYVAEKMLESS NNLAEYRF*

A3.3

A400

MKKTITLLTALLPLASAVAEEPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMFY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA MQPDQINKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGLNDFMNYNRGVPEVKADYAEALIRLTD AGAKNFMLMTLPDATKAPQFKYSTQEEIDKIRAKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPEDHGFVNASDPCLDINRSSS VNYMDTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHLYVAEKMLES SNNLAEYRF*

A650

MKKTITLLTALLPLASAVAEEPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMFY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA

151

MQPDQINKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGLNDFMNYNRGVPEVKADYAEALIRLTD AGAKNFMLMTLPDATKAPQFKYSTQEEIDKIRAKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPKNTVS*TQVILVWTSTAHRL SITCTPTHCALSVRRPVLRNLCSGMSRTQQQQLTAMLQRKC*KVAT T*HE*PFN

B3.13

B7050

MKKTITLLTALLPLASAVAEEPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMLY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA MQPDQINKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGLNDFMNYNRGFPEVKAEYAEALIRLTD AGAKNFMLMTLPDATKAPQFKYSTQEEIDKIRAKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPEEHGFVNASDPCLDINRSSSV DYMYTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHRYVAEKMLESS NNLAEYRF*

B7900

MKKTITLLTALLPLASAVAEEPTLSPEMVSASEVISTQENQTYTYVR CWYRTSYSKDDPATDWEWAKNEDGSYFTIDGYWWSSVSFKNMFY TNTSQNVIRQRCEATLDLANENADITFFAADNRFSYNHTIWSNDAA MQPDQINKVVALGDSLSDTGNIFNASQWRFPNPNSWFLGHFSNGFV WTEYIAKAKNLPLYNWAVGGAAGENQYIALTGVGEQVSSYLTYA KLAKNYKPANTLFTLEFGFNDFMNYNRGVPEVKADYAEALIRLTD AGAKNFMLMTLPDATKAPQFKYSTQEEIDKIRAKVLEMNEFIKAQA MYYKAQGYNITLFDTHALFETLTSAPEEHGFVNASDPCLDINRSSSV DYMYTHALRSECAASGAEKFVFWDVTHPTTATHRYVAEKMLESS

152

NNLAEYRF*

Phụ lục 4: Trình tự nucleotide đoạn gen rpoB của chủng/dòng vi khuẩn

Chủng/

Trình tự nucleotide đoạn gen rpoB của chủng/dòng vi khuẩn

dòng

LBT6

AGCCACCAACAAAAGAAGCTGCAGAAGCACTATTCGAAAGCCT ATTCTTCTCTGAAGAGCGTTACGATCTATCGACTGTTGGTCGTAT GAAGTTTAATAGCTCTATCGGTCGTGAAGATGCTCAAGAGCAAG GCACACTTGATGAAACAGATATCATCGAAGTGATGAAGAAGCTT ATCGCGATCCGTAACGGCAAAGGCGAAGTGGACGATATCGACCA CCTAGGCAACCGTCGTATCCGTTCTGTCGGCGAAATGGCTGAGAA CCAGTTCCGTGTAGGTCTAGTACGTGTTGAGCGTGCAGTTAAAGA GCGTCTAAGCCTAGGCGATCTTGACGCAATCATGCCTCAAGACCT GATCAACGCGAAGCCAATTTCTGCAGCGGTTAAAGAATTCTTTGG CTCTTCACAGCTTTCACAGTTCATGGACCAAAACAACCCGCTGTC AGAAGTAACGCACAAGCGTCGTATTTCTGCATTGGGTCCTGGCGG TCTGACTCGTGAACGTGCTGGCTTCGAAGTTCGAGACGTACACGT AACTCACTACGGTCGTCTATGTCCTATCGAAACGCCGGAAGGTCC AAACATCGGTCTGATCAACTCTCTATCTGCGTTTGCGCGTTGTAA CGAGTACGGTTTCCTTGAGACGCCATACCGTCGCGTTGTAGATGG TGTTGTAACAGACGAAGTAGATTACCTATCTGCAATCGAAGAAG GCCAATTCGTTATCGCTCAGGCGAACGCTAAGCTAAACGAAGAT GGTACTTTTGCAGATGAGCTGATCACAGCTCGTCAGAAAGGTGA ATCTGGTCTACACCCTCGTGAGCACGCTCAGTACATGGACGTTGC GACAAACCAGGTTGTATCTATCGCTGCATCGCTTATCCCGTTCCT AGAACACGATGATGCGAACCGTGCATTGATGGGTGCGA

L4650

ACTATTCGAAAACCTGTTCTTCTCCGAAGACCGCTACGATCTCTC CGCTGTTGGTCGTATGAAGTTCAACAGCTCTATCGGTCGTGACG ATGCTGAAGAGCAAGGTACACTGGATAAAGAAGACATCATCGA AGTGATGAAGAAGCTCATCGATATCCGTAACGGTAAAGGCGAA GTGGACGATATCGACCACCTCGGCAACCGTCGTATCCGTTCCGT AGGCGAAATGGCGGAAAACCAGTTCCGCGTTGGCCTGGTACGTG TAGAGCGTGCGGTGAAAGAGCGTCTGTCTCTGGGCGATCTGGAT GCAATCATGCCTCAGGATATGATCAACGCCAAGCCGATCTCCGC AGCAGTGAAAGAGTTCTTTGGTTCCAGCCAGCTGTCTCAGTTTAT GGACCAGAACAACCCGCTGTCTGAGATCACGCACAAGCGTCGTA TCTCTGCACTCGGCCCAGGCGGTCTGACCCGTGAGCGCGCAGGC

153

TTCGAAGTTCGAGACGTACACGTAACCCACTACGGTCGCGTATG TCCAATCGAAACGCCTGAAGGTCCAAACATCGGTCTGATCAACT CCCTGTCCGTGTACGCACGTTGTAACGAATACGGCTTCCTCGAG ACCCCGTACCGTCGCGTGGTAGACGGTGTTGTAACCGACGAAGT ACACTACCTGTCTGCTATCGAAGAAGGTCAATACGTTATCGCCC AGGCGAACACCAACCTGGACGAAGAAGGTACTTTTGCAGATGA CCTCGTTACAGCCCGTCAGAAAGGTGAATCCAGCTTACTCCCTC GTGACCAGGTTCAGTACATGGACGTTTCCACCAACCAGGTGGTT TCCGTCGGTGCGTCCCTGATCCCGTTCCTGGAACACGATGACGC CAACC

B3.13

ATCTACCGTATGATGCGCCCTGGTGAGCCACCAACAAAAGAAGC TGCAGAAGCACTATTCGAAAGCCTATTCTTCTCTGAAGAGCGTT ACGATCTATCGACTGTTGGTCGTATGAAGTTTAATAGCTCTATCG GTCGTGAAGATGCTCAAGAGCAAGGCACACTTGATGAAACAGA TATCATCGAAGTGATGAAGAAGCTTATCGCGATCCGTAACGGCA AAGGCGAAGTGGACGATATCGACCACCTAGGCAACCGTCGTATC CGTTCTGTCGGCGAAATGGCTGAGAACCAGTTCCGTGTAGGTCT AGTACGTGTTGAGCGTGCAGTTAAAGAGCGTCTAAGCCTAGGCG ATCTTGACGCAATCATGCCTCAAGACCTGATCAACGCGAAGCCA ATTTCTGCAGCGGTTAAAGAATTCTTTGGCTCTTCACAGCTTTCA CAGTTCATGGACCAAAACAACCCGCTGTCAGAAGTAACGCACAA GCGTCGTATTTCTGCATTGGGTCCTGGCGGTCTGACTCGTGAACG TGCTGGCTTCGAAGTTCGAGACGTACACGTAACTCACTACGGTC GTCTATGTCCTATCGAAACGCCGGAAGGTCCAAACATCGGTCTG ATCAACTCTCTATCTGCGTTTGCGCGTTGTAACGAGTACGGTTTC CTTGAGACGCCATACCGTCGCGTTGTAGATGGTGTTGTAACAGA CGAAGTAGATTACCTATCTGCAATCGAAGAAGGCCAATTCGTTA TCGCTCAGGCGAACGCTAAGCTAAACGAAGATGGTACTTTTGCA GATGAGCTGATCACAGCTCGTCAGAAAGGTGAATCTGGTCTACA CCCTCGTGAGCACGCTCAGTACATGGACGTTGCGACAAACCAGG TTGTATCTATCGCTGCATCGCTTATCCCGTTCCTAGAACACGATG ATGCGAACCGTGCATTGATGGGTGCGAACATGCAACGTCAGGCA GTTCCAA

A3.3

154

CGAAATGGCTGAGAACCAGTTCCGTGTAGGTCTAGTTCGTGTTGA GCGTGCAGTTAAAGAGCGTCTGAGTCTGGGCGACCTTGATGCGAT CATGCCTCAAGACCTGATCAATGCGAAACCAATTTCTGCAGCGGT TAAAGAATTCTTTGGCTCTTCACAGCTTTCACAGTTCATGGACCA AAACAACCCGTTATCAGAAGTAACGCACAAGCGTCGTATTTCTGC ATTGGGTCCTGGCGGTCTAACTCGTGAACGTGCTGGCTTCGAAGT TCGAGACGTACACGTAACTCACTACGGCCGTCTATGTCCTATCGA AACGCCGGAAGGTCCAAACATCGGTCTGATCAACTCTCTATCTGC GTTTGCGCGTTGTAACGAGTACGGTTTCCTTGAGACGCCATACCG TCGCGTTGTAGATGGTGTTGTAACAGACGAAGTAGATTACCTATC TGCAATCGAAGAAGGCCAATTCGTTATCGCTCAGGCGAACGCTA AGCTAAACGAAGATGGTACTTTTGCAGATGAGCTGATCACAGCTC GTCAGAAAGGTGAATCTGGTCTACATCCTCGTGAGCACGCTCAGT ACATGGACGTTGCGACAAACCAGGTTGTATCTATCGCTGCATCGC TTATCCCGTTCCTAGAACACGATGATGCGAACC

A650

TGATGCGCCCTGGTGAGCCACCAACAAAAGAAGCTGCAGAAGC ACTATTCGAAAGCCTATTCTTCTCTGAAGAGCGTTACGATCTATC GACTGTTGGTCGTATGAAGTTTAATAGCTCTATCGGTCGTGAAG ATGCTCAAGAGCAAGGCACACTTGATGAAACAGATATCATCGAA GTGATGAAGAAGCTTATCGCGATCCGTAACGGCAAAGGCGAAG TGGACGATATCGACCACCTAGGCAACCGTCGTATCCGTTCTGTC GGCGAAATGGCTGAGAACCAGTTCCGTGTAGGTCTAGTACGTGT TGAGCGTGCAGTTAAAGAGCGTCTAAGCCTAGGCGATCTTGACG CAATCATGCCTCAAGACCTGATCAACGCGAAGCCAATTTCTGCA GCGGTTAAAGAATTCTTTGGCTCTTCACAGCTTTCACCGTTCATG GACCAAAACAACCCGCTGTCAGAAGTAACGCACAAGCGTCGTAT TTCTGCATTGGGTCCTGGCGGTCTGACTCGTGAACGTGCTGGCTT CGAAGTTCGAGACGTACACGTAACTCACTACGGTCGTCTATGTC CTATCGAAACGCCGGAAGGTCCAAACATCGGTCTGATCAACTCT CTATCTGCGTTTGCGCGTTGTAACGAGTACGGTTTCCTTGAGACG CCATACCGTCGCGTTGTAGATGGTGTTGTAACAGACGAAGTAGA TTACCTATCTGCAATCGAAGAAGGCCAATTCGTTATCGCTCAGG CGAACGCTAAGCTAAACGAAGATGGTACTTTTGCAGATGAGCTG ATCACAGCTCGTCAGAAAGGTGAATCTGGTCTACACCCTCGTGA GCACGCTCAGTACATGGACGTTGCGACAAACCAGGTTGTATCTA TCGCTGCATCGCTTATCCCGTTCCTAGAACACGATGATGCGAAC C

155

Phụ lục 5: Trình tự chuỗi polypeptide suy diễn từ đoạn gen rpoB

Chủng/

Trình tự chuỗi polypeptide suy diễn từ đoạn gen rpoB

dòng

LBT6

PGEPPTKEAAEALFESLFFSEERYDLSTVGRMKFNSSIGREDAQEQG TLDETDIIEVMKKLIAIRNGKGEVDDIDHLGNRRIRSVGEMAENQFR VGLVRVERAVKERLSLGDLDAIMPQDLINAKPISAAVKEFFGSSQLS QFMDQNNPLSEVTHKRRISALGPGGLTRERAGFEVRDVHVTHYGR LCPIETPEGPNIGLINSLSAFARCNEYGFLETPYRRVVDGVVTDEVD YLSAIEEGQFVIAQANAKLNEDGTFADELITARQKGESGLHPREHA QYMDVATNQVVSIAASLIPFLEHDDANRALMGANMHR

L4650

LFENLFFSEDRYDLSAVGRMKFNSSIGRDDAEEQGTLDKEDIIEVMK KLIDIRNGKGEVDDIDHLGNRRIRSVGEMAENQFRVGLVRVERAVK ERLSLGDLDAIMPQDMINAKPISAAVKEFFGSSQLSQFMDQNNPLSE ITHKRRISALGPGGLTRERAGFEVRDVHVTHYGRVCPIETPEGPNIG LINSLSVYARCNEYGFLETPYRRVVDGVVTDEVHYLSAIEEGQYVI AQANTNLDEEGTFADDLVTARQKGESSLLPRDQVQYMDVSTNQV VSVGASLIPFLEHDDAN

A3.3

MRPGEPPTKEAAEALFESLFFSEERYDLSTVGRMKFNSSIGREDAQE QGTLDETDIIEVMKKLIAIRNGKGEVDDIDHLGNRRIRSVGEMAEN QFRVGLVRVERAVKERLSLGDLDAIMPQDLINAKPISAAVKEFFGSS QLSQFMDQNNPLSEVTHKRRISALGPGGLTRERAGFEVRDVHVTH YGRLCPIETPEGPNIGLINSLSAFARCNEYGFLETPYRRVVDGVVTD EVDYLSAIEEGQFVIAQANAKLNEDGTFADELITARQKGESGLHPRE HAQYMDVATNQVVSIAASLIPFLEHDDAN

A650

MRPGEPPTKEAAEALFESLFFSEERYDLSTVGRMKFNSSIGREDAQE QGTLDETDIIEVMKKLIAIRNGKGEVDDIDHLGNRRIRSVGEMAEN QFRVGLVRVERAVKERLSLGDLDAIMPQDLINAKPISAAVKEFFGSS QLSPFMDQNNPLSEVTHKRRISALGPGGLTRERAGFEVRDVHVTHY GRLCPIETPEGPNIGLINSLSAFARCNEYGFLETPYRRVVDGVVTDE VDYLSAIEEGQFVIAQANAKLNEDGTFADELITARQKGESGLHPRE HAQYMDVATNQVVSIAASLIPFLEHDDAN

156

Phụ lục 6: So sánh trình tự gen toxR của chủng V. parahaemolyticus A3.3 và B3.13 với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST

Chủng A3.3

STT

Chủng

Số hiệu gen

Tỉ lệ che phủ (%)

Độ tương đồng (%)

Tổng số điểm

Giá trị kì vọng

1618

100

99,89

CP006008.1

0,0

1618

100

99,89

CP003972.1

0,0

1591

100

99,32

CP013472.1

0,0

V. parahaemolyticus CDC_K4557 V. parahaemolyticus BB22OP V. parahaemolyticus FORC_072

1591 1591

100 100

99,32 99,32

CP028342.1 CP028341.1

0,0 0,0

1591

100

99,32

L11929.1

0,0

4 V. parahaemolyticus R13 5 V. parahaemolyticus R14 V. parahaemolyticus toxR and toxS genes

1585

100

99,20

CP043421.1

0,0

1585

100

99,20

AY527396.1

0,0

7 V. parahaemolyticus MVP1 V. parahaemolyticus ATCC 17802 ……………

1552

100

0,0

98,52

CP028481.1

V. parahaemolyticus S107- 1

……………

100

948

0,0

98,87

KT194122.1

V. parahaemolyticus Vp2010-008 toxR

Chủng B3.13

STT

Chủng

Số hiệu gen

Tỉ lệ che phủ (%)

Độ tương đồng (%)

Tổng số điểm

Giá trị kì vọng

1618

100

99,89

CP006008.1

0,0

1618

100

99,89

CP003972.1

0,0

1591

100

99,32

CP013472.1

0,0

V. parahaemolyticus CDC_K4557 V. parahaemolyticus BB22OP V. parahaemolyticus FORC_072

1591 1591

100 100

99,32 99,32

CP028342.1 CP028341.1

0,0 0,0

1591

100

99,32

L11929.1

0,0

4 V. parahaemolyticus R13 5 V. parahaemolyticus R14 V. parahaemolyticus toxR and toxS genes

1585

100

99,20

CP043421.1

0,0

1585

100

99,20

AY527396.1

0,0

7 V. parahaemolyticus MVP1 V. parahaemolyticus ATCC 17802 ……………

157

1552

100

0,0

98,52

CP028481.1

V. parahaemolyticus FORC-004

……………

100

948

0,0

98,87

KT194123.1

V. parahaemolyticus Vp2010-068 toxR

Phụ lục 7: So sánh trình tự gen tlh của chủng V. parahaemolyticus A3.3, B3.13 với

các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST

Chủng A3.3

Chủng

Số hiệu gen

STT

Tổng số điểm

Tỉ lệ che phủ (%)

Giá trị kì vọng

Độ tương đồng (%)

2300

100

0,0

99,76

CP009766.1

CP012951.1

V. parahaemolyticus FORC_006 V. parahaemolyticus FORC- 023

2278

100

0,0

99,44

CP033142.1

2272

100

0,0

99,36

CP023486.1

2266

100

0,0

99,28

CP007005.1

3 V. parahaemolyticus 160807 V. parahaemolyticus FORC- 071 V. parahaemolyticus UCM- V493

2255 2255 2255 2255 2250

100 100 100 100 100

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

99,12 99,12 99,12 99,12 99,04

CP043422.1 CP028482.1 KT948112.1 JF513048.1 CP041201.1

6 V. parahaemolyticus MVP1 7 V. parahaemolyticus S107-1 8 V. parahaemolyticus VH12 9 V. parahaemolyticus Vp-18 10 V. parahaemolyticus Vb0624 ………………

1552

100

0,0

89,00

CP012095.1

44 V. parahaemolyticus 1682 …………………

802

0,0

98,89

JX262952.1

V. parahaemolyticus TBW-9- 11-1

100 V. harveyi VIB647

800

0,0

79,13 DQ224369.1

Chủng B3.13

Chủng

Số hiệu gen

STT

Tổng số điểm

Tỉ lệ che phủ (%)

Giá trị kì vọng

Độ tương đồng (%)

2300

100

0,0

99,76

CP009766.1

CP012951.1

V. parahaemolyticus FORC_006 V. parahaemolyticus FORC- 023

158

2278

100

0,0

99,44

CP033142.1

2272

100

0,0

99,36

CP023486.1

2266

100

0,0

99,28

CP007005.1

3 V. parahaemolyticus 160807 V. parahaemolyticus FORC- 071 V. parahaemolyticus UCM- V493

6 V. parahaemolyticus MVP1 7 V. parahaemolyticus VPD14

2261 2261

100 100

0,0 0,0

99,20 99,20

CP031782.1 CP028482.1

2261

100

0,0

99,20

CP028482.1

V. parahaemolyticus 20130629002S01

………………

2135

0,0

99,16

KT948114.1

42 V. parahaemolyticus VP1.1997 …………………

808

0,0

99,11

JX262952.1

V. parahaemolyticus TBW-9- 11-1

100 V. diabolicusi JPW-8-11-8

802

0,0

98,89

JX262986.1

Phụ lục 8: So sánh trình tự gen rpoB của chủng V. parahaemolyticus A3.3, B3.13

với các trình tự trên NCBI bằng công cụ BLAST

Chủng A3.3

Chủng

Số hiệu gen

STT

Tổng số điểm

Tỉ lệ che phủ (%)

Giá trị kì vọng

Độ tương đồng (%)

1701

100

0,0

99,78

CP026041.1

1701

100

0,0

99,78 CP0232248.1

1690

100

0,0

99,57

CP010883.1

1685

100

0,0

99,46

CP023710.1

1657

100

0,0

98,92

KJ647551.1

1688

0,0

98,64

CP014046.1

1640

100

0,0

98,60

CP003972.1

V. parahaemolyticus FDAARGOS_51 V. parahaemolyticus MAVP-26 V. parahaemolyticus CHN25 V. parahaemolyticus HA2 V. parahaemolyticus VN- 10092 V. parahaemolyticus ATCC 17802 V. parahaemolyticus 7 BB22OP ………………

1629

100

0,0

98,38

KJ647561.1

V. parahaemolyticus VN- 2815

50 …………………

100

1616

100

0,0

98,06

KJ648147.1

V. parahaemolyticus VN- 4027

159

Chủng B3.13

Chủng

Số hiệu gen

STT

Tổng số điểm

Tỉ lệ che phủ (%)

Giá trị kì vọng

Độ tương đồng (%)

1792

100

0,0

99,69

CP014046.2

1792

100

0,0

99,69

CP007004.1

1781

100

0,0

94,49

CP009765.1

1764

0,0

99,69

KJ647744.1

1764

0,0

99,69

EU909181.1

1755

0,0

98,48

JK647843.1

V. parahaemolyticus ATCC17802 V. parahaemolyticus UCM- V493 V. parahaemolyticus FORC_006 V. parahaemolyticus VN- 3112 V. parahaemolyticus 17802 V. parahaemolyticus VN- 4004

98,06 HQ533927.1

6 ……………… 50 V. parahaemolyticus SO150 …………………

1703

100

0,0

100

1679

0,0

98,02

KJ648140.1

V. parahaemolyticus VN- 4019

Phụ lục 9: Cấu trúc bậc 2 của TLH ở các chủng/dòng vi khuẩn

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description LBT6-TLH_

Date

Thu Aug 22 08:52:38 BST 2019

c435cab434f11aee

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

30 .

40 .

50 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N AD I T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 160 .

. 170 .

. 140 .

. 150 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

. 190 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ? ? ?

. 250 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 340 .

. 350 .

. 320 .

. 330 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 360 Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

?

. 370 .

. 380 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

?

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 22%) Alpha helix ( 31%) Beta strand ( 15%) TM helix ( 4%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description L4650-TLH

Date

Sun Aug 25 03:50:06 BST 2019

0e1e7c751d2b9f96

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

20 .

30 .

40 .

50 .

. .

. 60 Sequence M K K T I P L L T A L L P L A S A V A E K P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S YS K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

80 .

90 .

Disorder ? ? ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T NT S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N ADI T F F A Secondary structure SS confidence

? ?

?

? ?

? ? ?

. 130 .

. 140 .

. 150 .

. 160 .

. 170 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . . . 180 I K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N

Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ?

. 190 .

. 200 .

. 210 .

. 220 .

. 230 .

. .

Disorder ? Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

? ? ?

? ? ? ?

? ? ? ? ?

. 250 .

. 260 .

. 270 .

. 280 .

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D AG A K N F M L M T V P D V T Secondary structure SS confidence

? ? ? ?

Disorder Disorder confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 25%) Alpha helix ( 26%) Beta strand ( 23%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description L4200-TLH+39bp

Date

Sat Aug 24 13:14:17 BST 2019

e0dff388e84cf5bf

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

30 .

40 .

50 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N AD I T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 170 .

. 160 .

. 140 .

. 150 .

Disorder Disorder confidence

. .

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ?

?

. 190 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

Disorder Disorder confidence

. .

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

? ? ?

? ? ? ? ?

. 250 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 300

Disorder Disorder confidence

. .

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 340 .

. 350 .

. 320 .

. 330 .

Disorder Disorder confidence

. .

. . 360 Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

? ?

. 370 .

. 380 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. 420

Disorder Disorder confidence

. .

Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N K L A AV P F I T S Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ? ?

? ?

Disorder Disorder

confidence

. .

. . 430 . Sequence H T R K T E R H A F V Secondary structure SS confidence

Disorder ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Disorder confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 23%) Alpha helix ( 31%) Beta strand ( 14%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description L3900-TLH

Date

Thu Aug 22 09:35:04 BST 2019

85de98dc21e5ba0b

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

30 .

40 .

50 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L F P V A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N AD I T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 160 .

. 170 .

. 140 .

. 150 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ? ?

?

. 190 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ?

. 250 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 340 .

. 350 .

. 320 .

. 330 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 360 Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

?

. 370 .

. 380 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

?

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 20%) Alpha helix ( 31%) Beta strand ( 15%) TM helix ( 4%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description B3_13-TLH

Date

Thu Aug 22 09:54:03 BST 2019

5fd3a982e0312ab6

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

30 .

40 .

50 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N AD I T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 160 .

. 170 .

. 140 .

. 150 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

. 190 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ? ? ?

. 250 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 340 .

. 350 .

. 320 .

. 330 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 360 Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

?

. 370 .

. 380 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

?

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 22%) Alpha helix ( 31%) Beta strand ( 15%) TM helix ( 4%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description B7050-TLH

Date

Thu Aug 22 09:58:42 BST 2019

cf48b13aeac5c243

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

20 .

30 .

40 .

50 .

. .

Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

80 .

90 .

. 100 .

. 110 .

. 120

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M L Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N ADI T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ?

. 130 .

. 150 .

. 160 .

. 170 .

. 140 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

. 190 .

. 210 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ?

? ? ? ? ?

. 250 .

. 270 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G F P E V K A E Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ? ?

? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 320 .

. 330 .

. 340 .

. 350 .

. 360

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

? ?

. 370 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. 380 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 22%) Alpha helix ( 32%) Beta strand ( 16%) TM helix ( 4%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description B7900-TLH

Date

Thu Aug 22 10:00:53 BST 2019

e98ea2433cbc140d

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

30 .

50 .

40 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N AD I T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ?

. 130 .

. 160 .

. 170 .

. 140 .

. 150 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ? ?

? ?

. 190 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

? ?

? ? ?

? ? ? ? ?

. 250 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G F N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 340 .

. 350 .

. 320 .

. 330 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 360 Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

?

. 370 .

. 380 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 21%) Alpha helix ( 30%) Beta strand ( 16%) TM helix ( 4%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description A3_3_____

Date

Thu Aug 22 09:43:36 BST 2019

da03514f02b57c04

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

40 .

50 .

30 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 110 .

. 100 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N AD I T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 170 .

. 160 .

. 140 .

. 150 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

. 190 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ? ? ?

. 250 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 340 .

. 350 .

. 320 .

. 330 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 360 Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E E H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

?

. 370 .

. 380 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence R S S S V D Y M Y T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H R Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

?

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 22%) Alpha helix ( 31%) Beta strand ( 15%) TM helix ( 4%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description A400-LBT6

Date

Thu Aug 22 09:48:34 BST 2019

acc7c65ec56be0b0

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

20 .

30 .

40 .

50 .

. .

Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S Y S K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ?

?

? ? ? ? ? ? ? ?

70 .

80 .

90 .

. 100 .

. 110 .

. 120

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N ADI T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 150 .

. 160 .

. 170 .

. 140 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ?

? ?

. 190 .

. 210 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

? ?

? ? ? ?

. 250 .

. 270 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q E E I Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ? ?

. 310 .

. 320 .

. 330 .

. 340 .

. 350 .

. 360

. .

Disorder Disorder confidence

Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P E D H G F V N AS DP C L D I N Secondary structure SS confidence

?

. 370 .

. 390 .

. 400 .

. 410 .

. 380 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . Sequence R S S S V N Y M D T H A L R S E C A A S G A E K F V F WD V T H P T T A T H L Y V A E K M L E S S N N L A E Y R F Secondary structure SS confidence

?

? ?

? ? ? ? ? ? ?

Disorder Disorder

confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 20%) Alpha helix ( 33%) Beta strand ( 11%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description A650-TLH_

Date

Sun Aug 25 11:14:44 BST 2019

3982b204bd9f33a3

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

40 .

30 .

50 .

20 .

. .

. 60 Sequence M K K T I T L L T A L L P L A S A V A E E P T L S P E M V S A S E V I S T Q E N Q T Y T Y V R C WY R T S YS K D D P A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ?

? ? ? ? ? ?

70 .

. 100 .

. 110 .

90 .

80 .

Disorder ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence T D WE WA K N E D G S Y F T I D G Y WWS S V S F K N M F Y T N T S Q N V I R Q R C E A T L D L A N E N ADI T F F A Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ?

. 130 .

. 150 .

. 170 .

. 160 .

. 140 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence A D N R F S Y N H T I WS N D A A M Q P D Q I N K V V A L G D S L S D T G N I F N A S Q WR F P N P N S WF L G H F S N Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ?

? ? ? ? ? ?

. 190 .

. 210 .

. 220 .

. 230 .

. 200 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 240 Sequence G F V WT E Y I A K A K N L P L Y N WA V G G A A G E N Q Y I A L T G V G E Q V S S Y L T Y A K L A K NY KP A N T L F Secondary structure SS confidence

?

? ? ? ? ? ?

. 250 .

. 270 .

. 280 .

. 290 .

. 260 .

. 300

. .

Disorder Disorder confidence

. Sequence T L E F G L N D F M N Y N R G V P E V K A D Y A E A L I R L T D A G A K N F M L M T L P D A T K A P Q F K YS T Q E E I Secondary structure SS confidence

? ? ?

? ?

?

? ?

. 310 .

. 320 .

. 330 .

. 340 .

. .

Disorder Disorder confidence

. .

Sequence D K I R A K V L E M N E F I K A Q A M Y Y K A Q G Y N I T L F D T H A L F E T L T S A P K N T V S Secondary structure SS confidence

?

? ? ?

Disorder Disorder confidence

Confidence Key High(9) Low (0)

? Disordered ( 22%) Alpha helix ( 31%) Beta strand ( 18%)

Email bichhuyenbh88@gmail.com

Description VvPlpA___

Date

Tue Sep 17 15:30:57 BST 2019

c356ec62c1e2da4b

Unique Job ID

Secondary structure and disorder prediction

10 .

. 40 .

20 .

30 .

50 .

. .

. 60 Sequence V A D E P A L S P E A I T S A Q V F S T Q S K E T Y T Y V R C WY R T G NS HD E S A T D WE WA E N P D G S Y F T I D Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

?

? ? ? ? ? ? ? ? ?

70 .

. 110 .

. 100 .

80 .

90 .

. .

Disorder ? ? ? ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 120 Sequence G Y WWS S V R L K N M F Y T N T S Q N V I K Q R C E E T L G V T H D A ADI T Y F A A D N R WS Y N H T I WT N D P V Secondary structure SS confidence

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ?

. 130 .

. 170 .

. 140 .

. 150 .

. 160 .

. .

Disorder Disorder confidence

. . 180 Sequence M Q A D Q I N K I V A F G D S L S D T G N I F N A A Q WR F P N P D T WF L GH F S N G F V WT E Y I A Q A K K L P L Y Secondary structure SS confidence

? ?

?

. 190 .

. 230 .

. 200 .

. 210 .

. 220 .

. .

Disorder ? ? ? ? ? Disorder confidence

. .

. . 240 Sequence N WA V G G A A G S N Q Y V A L T G V K D Q V L S Y L T Y A K M A K N Y KP E N T L F T L E F G L N D F M N Y N R E V V Secondary structure SS confidence

? ?

?

. 250 .

. 290 .

. 260 .

. 270 .

. 280 .

. .

Disorder ? Disorder confidence

. . 300 Sequence D V K T D F S T A L I K L T D A G A K N I M L M T L P D A T K A P Q F K Y S T Q AE I E K V R A K I V E F N E F I K A Q Secondary structure SS confidence