Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô
thực vật
1. Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy
ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả
nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số
nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao
tác trong quá trình cấy, từ côn trùng như ve
bét, môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết
bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông
khí trong phòng cấy.
- Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn
gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai
đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy
có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá,
phát hoa hay rễ non. Tuy nhiên để mẫu sống
và phát triển trong điều kiện vô trùng thì không
phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất
nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh
nhỏ, nách lá, lớp vẩy…. của cây mẹ, đây là
nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng
không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt, vi
khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch
và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy.
Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường
gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy
và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai
nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm:
Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium,
Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia,
Pseudomonas….
- Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ
cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình
nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít
nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng. Các
bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó
làm sạch hơn các bộ phận khác.
- Môi trường không khí phòng sáng, phòng
cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được
xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân
gây nhiễm chính trong trường hợp này. Nấm
thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong
không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra
vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng
nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây
nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy.
Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm
những chai môi trường chưa sử dụng hoặc
những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài
nấm thường gặp: Aspergillus, Candida,
Cladosporium, Microsprium và Phialophra.
- Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy
hiểm không thua gì nấm mốc, chúng có nhiều
loài khác nhau: Dermataphagoides
pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và
Tyropharus putrescentiae… Ve bét có thể
sống trong ống dẫn của máy điều hòa không
khí, góc phòng, dưới kệ nuôi cấy. Nó hoạt
động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những
nơi có độ ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của
chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta thường
không phát hiện nhiễm chúng, nhưng sau vài
ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên bề
mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường,
đó là đường di chuyển của chúng. Ve bét xâm
nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui
qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâm
nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình
nuôi cấy vừa nhiễm nấm và ve bét cùng lúc.
Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn
và chết khi chúng xâm nhập sau khoảng 2
tuần.
2. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục
đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số
lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra
những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô
sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên
cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng
nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo
cáo. Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau
và không lặp lại (Creissen và Karp 1985; Fish
và Karp 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị
nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị
biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là
biến dị về chất lượng , số lượng và năng suất
và biến dị này không di truyền. Đến nay việc
gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng
được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA.
Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần
cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều
càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể
nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và
Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời
gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm
sự biến dị.
3.Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy
Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa
nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của
mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng
này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất
Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô
già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol
làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và
Tyramine. Có vài phương pháp làm giảm sự
hóa nâu mẫu:
- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp
ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt
có hiệu quả trên các loài phong lan
Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với nồng
độ thường dùng 0.1-0.3%. Tuy nhiên than
hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển
của mô do hấp thu các chất kích thích tăng
trưởng và các chất khác.
- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc
loại polyamide hấp thu phenol qua vòng
hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại
cây trồng khác nhau.
- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất
khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn
chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử
thường được dùng như ascorbic acid, citric
acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol,
glutathione và mecaptoethanol
Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa
học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:
- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non
- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử
trùng
- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric
acid vài giờ trước khi cấy
- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy
thấp, không có đèn 1-2 tuần
4. Hiện tượng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện
tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy. Khi chuyển
ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước
và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thường thấy
khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi
trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí
thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong
cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một
phương pháp hiệu quả nhất được nhiều người
ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng
nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách
tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi
trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí)
thích hợp.