PCR và giải trình tự
Giải trình tự là gì?
DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn
được cấu tạo từ 4 lo ại nucleotide khác nhau nh ờ các base c ủa chúng, đó là: A (adenine),
C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này n ối kết liên ti ếp với nhau
theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4
loại nucleotide này trên phân tử DNA.
Các phương pháp giải trình tự gene
1. Ph ương pháp hóa học giải trình tự DNA
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa h ọc
để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên t ắc của phương pháp này là: (1) Tr ước
hết là ph ải đánh dấu một đầu của đoạn DNA c ần ph ải gi ải trình t ự bằng một gốc phospho đồng vị phóng x ạ (32P); (2) X ử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với ch ất
hóa học có th ể làm bi ến đổi đặc hiệu một hoặc hai lo ại base của nucleotide trên đoạn
DNA. Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vị
trí nitrogen th ứ 7 (N7), hydrazine làm bi ến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và
NaCl để làm bi ến đổi Cytosine, acid để làm bi ến đổi Guanine và Adenine, NaOH để
làm biến đổi Adenine và Cytosine v ới Adenine ưu tiên h ơn Cytosine. Nh ư vậy trong
giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử
lý với một lượng rất gi ới hạn của một trong các ch ất hóa h ọc nêu trên để mỗi ống
nghiệm ch ỉ có ch ứa các đoạn DNA mà trên m ỗi đoạn DNA này ch ỉ có m ột vị trí
nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi; (3) Các nucleotide b ị biến đổi này
sẽ bị lấy ra kh ỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) c ủa đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu
bị mất phân tử base vì phân t ử này đã bị lấy ra kh ỏi mạch khung (hình 37). (4) Th ực
hiện điện di m ẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghi ệm này trên 4 hàng c ủa một gel
polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến
đổi trong quá trình điện di. Nh ờ đó, sau khi hoàn t ất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng
tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc
81
suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các v ị trí dừng
lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các v ị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các m ạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P.
Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của
các nucleotide của đoạn DNA (hình 38).
Phương pháp hóa h ọc xác định trình tự DNA c ủa Maxam và Gilbert trên th ực tế
không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm,
trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao
cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P được tách ra.
Chính vì sự phức tạp này, ph ương pháp Maxam Gilbert hi ện nay ít được sử dụng, mà
thay vào đó các nhà khoa h ọc dùng ph ương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội
hơn.
32P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..
Mạch đơn DNA
Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P
32P 32P 32P 32P 32P
Hình 37: Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị biến đổi. Các mạch đơn này có chi ều dài ng ắn khác nhau tùy thu ộc vào vị trí của Guanidine trên đoạn DNA.
3’ 5’
G C C C A C T T C A G A A G A A A A A G G
C
T+G
G
A>C
Hình 38: Hình x ạ ký tự ghi trên phim nhạy tia X một gel polyacrylamide sau khi đã điện di. Các vạch là vị trí các mạch đơn bị dừng lại sau điện di. Các vị trí này gần hay xa khởi điểm là tuỳ kích thước của mạch đơn dài hay ngắn khác nhau. Từ các vạch này, đọc trình tự của đoạn DNA trong mẫu.
82
2. Ph ương pháp enzyme giải trình tự DNA
Phương pháp enzyme được Sanger và các c ộng sự phát minh cũng vào năm 1977,
và ngày hôm nay ph ương pháp này càng ngày càng được hoàn thi ện và th ực hi ện dễ
dàng tại các phòng thí nghi ệm. Nguyên tắc chung của phương pháp này có th ể tóm tắt
như sau:
CATACGTGG
CCTTACG
mồi GGAATGC
CATACGTGG
CCTTACG GGAATGC
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddATP
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP
CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA
CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG
CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT
CGTAAGGdC CGTAAGG*CdC CGTAAGG*C*C*AdC
điện di trên gel
Chiều điện di
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*CdC CGTAAGGdC
Hình 39: Ph ương pháp Enzyme gi ải trình tự DNA. Đoạn DNA được chèn vào m ột vector tại một vị trí bi ết rõ trình tự, nhờ đó có th ể tổng hợp được các mạch đơn có một đầu là mồi, một đầu là các nucleotide tận. Trong hình các nucleotide đánh dấu * là các nucleotide được dánh dấu 35S, nhờ vậy các mạch đơn được đánh dấu.
83
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage
hay plasmid tại một vị trí mà trình t ự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển
thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào t ế bào vi khu ẩn để nhân bản
các vector này thành nhi ều bản sao, sau đó tách chi ết và tinh khi ết các vector t ừ vi
khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung m ột cách đặc hi ệu với trình t ự của vector t ại vị trí
chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 lo ại nucleotide
tự do (g ọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và m ột lượng rất gi ới hạn các
nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, c ũng như dNTP,
có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Ph ản ứng được thực hiện trong 4
ống, và m ỗi ống cho m ột lo ại ddNTP khác nhau. B ắt đầu từ đoạn mồi, men DNA
polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn
A C G T
trên vector, và s ự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng
lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì
T 3’
dNTP. Lý do s ự tổng hợp bị dừng lại là vì
C G
ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại
C A
G
vị trí carbon th ứ 3 c ủa đường deoxyribose, mà
T C
gốc OH t ại vị trí này chính là n ơi để dNTP k ế
C T
tiếp được gắn vào. Nh ờ vậy trong ống phản ứng
A
có các m ạch đơn DNA có các chi ều dài khác
G C
nhau tương ứng với các v ị trí trình t ự các
T T
A
nucleotide trên đoạn DNA gốc (hình 39).
G C
Để giải trình tự, người ta dùng ph ương pháp
G G 5’
Hình 40: Hình x ạ ký tự ghi một kết quả giải
trình tự DNA trên gel polyacrylamide. Từ kết qu ả này, đọc được trình tự DNA
điện di trên gel polyacrylamide bi ến tính. V ới
phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP b ằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di,
cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, ng ười ta phát hi ện các vạch điện
di bằng kỹ thu ật xạ ký t ự ghi, và t ừ các v ạch này gi ải được trình t ự của đoạn DNA
84
(hình 40).
3. Gi ải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp
enzyme, nhưng khi làm gi ải trình tự thì thường dùng các máy t ự động chứ không dùng
kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động
thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu
huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm
tia sáng laser. C ấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai ph ần chính yếu, đó
là: phần điện di với gel polyacrylamide và ph ần phát hi ện các vạch điện di. Ph ần điện
Mắt cảmquang Mắt cảmquang
Tia Tia LASER LASER
A G C T T A C G G A C T A A T G C A G C T T A C G G A C T A A T G C
Màu 1 Màu 1
Màu 2 Màu 2
Máytính Máytính
Màu 3 Màu 3
Màu 4 Màu 4
Th i gian Th i gian
Hình 41: Sơ đồ kh ối một máy tự động gi ải trình t ư dùng bản gel polyacrylamide. Máy g ồm hai ph ần: phần điện di gel polyacrylamide, phần phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng
85
di polyacrylamide có th ể là một bản gel hay là m ột ống mao quản chứa gel. Ph ần phát
hiện vạch điện di là nh ững con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua tr ước nó.
Nguyên tắc ho ạt động của máy là trong su ốt quá trình điện di, mỗi khi có m ột vạch
điện di đi qua chùm tia laser thì v ạch điện di sẽ phát sáng lên và s ự phát sáng này s ẽ
được con m ắt cảm quang
CATACGTGG CATACGTGG
ghi nh ận và l ưu lại thành
CCTTACG CCTTACG GGAATGC GGAATGC
một đỉnh cường độ sáng
trong bi ểu đồ. Từ bi ểu đồ
thêm thêm thêm dNTP, DNA dNTP, DNA dNTP, DNA polymerase, polymerase, polymerase, ddATP, ddTTP, ddATP, ddTTP, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP ddGTP, ddCTP ddGTP, ddCTP
của các đỉnh cường độ
sáng này, máy s ẽ so dòng
của các đỉnh tương ứng
với các màu để cu ối cùng
phân tích thành trình t ự
CGTAAGGCCdA CGTAAGGCCdA CGTAAGGCdC CGTAAGGCdC CGTAAGGCCACdG CGTAAGGCCACdG CGTAAGGCCACGTdA CGTAAGGCCACGTdA CGTAAGGdC CGTAAGGdC CGTAAGGCCACGTA TdG CGTAAGGCCACGTA TdG CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGTAdT CGTAAGGCCACGTAdT
của đoạn DNA (hình 41).
Với các máy th ế hệ
mới sau này, ng ười ta có
Chiều điệndi Chiều điệndi
thể dùng 4 màu hu ỳnh
quang khác nhau để đánh
*CGTAAGGCCACGTA TdG *CGTAAGGCCACGTA TdG *CGTAAGGCCACGTA dT *CGTAAGGCCACGTA dT *CGTAAGGCCACGT dA *CGTAAGGCCACGT dA *CGTAAGGCCACGdT *CGTAAGGCCACGdT *CGTAAGGCCACdG *CGTAAGGCCACdG *CGTAAGGCCAdC *CGTAAGGCCAdC *CGTAAGGCCdA *CGTAAGGCCdA *CGTAAGGCdC *CGTAAGGCdC *CGTAAGGdC *CGTAAGGdC
dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy
phản ứng gi ải trình t ự có
thể th ực hi ện được ch ỉ
Hình 42: Với các ddNTP đánh dấu hùynh quang khác nhau, các đọan trình tự tận cùng ở đầu 5’ sẽ được đánh dấu bằng 4 màu hùynh quang khác nhau t ương ứng với nuleotide tận là A, hay T, hay C hay G. Chính nh ờ vậy không c ần ph ải th ực hiện phản ứng giải trình tự trong 4 ống phản ứng.
trong một ống nghi ệm và
khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau
như trước đây (hình 42). Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có
thể ch ạy một lần mà ng ười làm thí nghi ệm có th ể có s ố mẫu cho mỗi lần ch ạy nhiều
hay ít. Hình 43 là sơ đồ khối minh họa cho một gi ải trình tự 8 mao qu ản (CEQ8000,
hay CEQ8800). Tùy thu ộc vào qui mô c ủa phòng thí nghi ệm cùng với số mẫu gi ải
trình tự mà phòng thí nghi ệm có thể trang bị giải trình tự ít hay nhiều mao quản. Ví dụ
với ABI thì có nhiều loại: chỉ 1 mao quản, 4 mao quản, 16 mao quản, 48 mao quản, rồi
96 mao qu ản. Phòng thí nghi ệm R&D của công ty Nam Khoa tr ước đây nhu cầu giải
86
trình tự không nhi ều nên ch ỉ trang bị CEQ8000 có 8 mao qu ản (hình 44). Nhưng nay
do nhu cầu nghiên cứu và dịch vụ ngày càng nhi ều nên đã trang bị thêm ABI 3130XL
có đến 16 mao quản (hình 44).
Các thế hệ máy về sau ngày càng có nh ững chương trình đi kèm để chẳng những
có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên
cứu có th ể: (1) Phát hi ện các chi ti ết cần thiết trên trình t ự nh ư mã kh ởi đầu, mã kết
thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình t ự đặc hiệu cho các enzyme c ắt
giới hạn (restriction enzyme), các d ấu ấn di truyền...mà các chi ti ết này rất cần thiết để
lập bản đồ gen...(2) Phiên d ịch trình tự trong vùng đọc mở (t ức là vùng trình t ự có ý
nghĩa) thành trình t ự acid amin c ủa một protein, nh ờ đó có th ể xác định, phỏng đoán,
hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình t ự
DNA trong thí nghi ệm hay
một trình t ự DNA n ạp vào
máy, hay có th ể trình t ự acid
Cảm Cảm Cảm quang quang quang
amin của protein, v ới các
trình tự khác đã có trong ngân
] ] ] + + + [ [ [ c c c ự ự ự C C C
Mao Mao quản quản
hàng dữ li ệu để phát hi ện
được sự tương đồng với trình
Cực[-] Cực[-] Cực[-]
Laser Laser Laser
tự đã bi ết, nh ờ đó làm c ơ sở
Điệnth ế cao Điệnth ế cao Điệnth ế cao
để xác định gen và ch ức năng
gen...
Hình 43: Sơ đồ khối một máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA
Hình 44: Máy gi ải trình tự CEQ8000 có 8 mao quản của Beckman Coulter và ABI 3130XL có 16 mao quản của Applied Biosystem được trang bị tại phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa
87
PCR là công cụ giúp hoàn thiện và mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự
PCR đã đóng góp rất nhiều vào công nghệ giải trình tự làm cho công ngh ệ giải trình tự
ngày càng dễ dàng hơn và thu ận tiện hơn. Không ch ỉ vậy PCR còn làm cho gi ải trình tự
có nhiều ứng dụng hơn không chỉ trong nghiên cứu mà cả trong chẩn đoán nữa.
Trước khi có PCR thì ng ười ta ch ỉ có th ể gi ải trình t ự các đoạn gene được cô l ập và
chèn vào plasmid vì ch ỉ có nh ư vậy thì mới có th ể nhân bản được đoạn gene mu ốn giải
trình tự thành nhiều bản sao với số lượng đủ để chạy được phản ứng giải trình tự. Ngoài
ra, enzyme polymerase c ũng là lo ại enzyme không ch ịu nhiệt nên ph ản ứng giải trình tự chỉ th ực hi ện ở 37 oC, do vậy mà vấn đề tối ưu các thành ph ần của ph ản ứng rất là khó
đồng thời hiệu quả của phản ứng giải trình tự cũng không cao.
Từ khi có s ự ra đời của kỹ thuật PCR thì k ỹ thuật giải trình tự cũng có nh ững tiến bộ
rất vượt bực. Chỉ cần dùng PCR là có th ể nhân bản đoạn gene mu ốn gi ải trình tự thành
hàng tỷ bản sao hoàn toàn gi ống hệt nhau và s ản ph ẩm khuếch đại này có th ể đưa vào
giải trình tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào một plasmid giải trình tự nữa. Sự phát
minh ra kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm bằng PCR cũng giúp cho vi ệc cải tiến
phản ứng giải trình tự kém hiệu quả trước đây trở nên hiệu quả hơn nhờ áp dụng enzyme
polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các
chu kỳ nhiệt giống hệt PCR, mà ngày nay chúng ta gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình
tự. Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự thì hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều, đồng
thời tối ưu hóa các thành ph ần của ph ản ứng cũng dễ dàng h ơn rất nhi ều. Có th ể nói
chính sự ra đời và hoàn thi ện kỹ thuật PCR đã giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự không
những trong vấn đề hoàn thiện nó, mà cả trong vấn đề phạm vi áp dụng.
Giải trình tự bộ gene người
1. Làm th ế nào giải trình tự bộ gene người
Giải trình tự bộ gen người tức là giải trình tự toàn bộ thứ tự sắp xếp các nucleotide
A, T, C, và G của DNA trong 23 cặp nhiễm sắc thể tế bào người. Dự án giải trình tự bộ
gen người được Ti ến Sĩ James Watson, cha đẻ của phát hi ện cấu trúc DNA, đề ra t ừ
giữa thập niên 1980. Đến tháng 10 năm 1990, dự án được ra đời với kinh phí 3 t ỷ Mỹ
kim do HGP (Human Genome Project) c ủa Vi ện Qu ốc Gia Y T ế Hoa K ỳ lãnh đạo
88
cùng với sự tham gia của nhiều trung tâm nghiên c ứu bộ gen người của nhiều quốc gia
trên thế giới. Do tiên đoán giá tr ị kinh tế mang lại từ việc gi ải mã thành công b ộ gen
người sẽ rất lớn, nên đã có một số công ty sinh h ọc chuyên về bộ gen ng ười đã được
hình thành. Sự nhập cuộc của các công ty tư nhân này đã tạo nên một bầu không khí thi
đua cho vi ệc khai phá bí m ật về bộ gen của loài ng ười chúng ta, càng g ần đến những
ngày đến đích càng cực kỳ ngoạn mục. Trong cu ộc chạy đua này, nh ờ đã áp dụng một
phương pháp c ực kỳ độc đáo kết hợp gi ữa công ngh ệ PCR, công ngh ệ gi ải trình t ự
DNA với công ngh ệ tin h ọc, nên ch ỉ với kinh phí kho ảng 200 tri ệu mỹ kim, Ti ến Sĩ
Crag Venter của Celera Genomics tr ở thành người dẫn đầu thành công nh ất trong vi ệc
giải trình tự được gần như hoàn toàn bộ gen người.
Cái khó kh ăn của việc giải trình tự bộ gene ng ười là không th ể nào tách t ừng đại
phân tử DNA của từng nhi ễm sắc th ể rồi đem gi ải trình t ự đại phân t ử DNA nguyên
vẹn này. Các nhà khoa h ọc của HGP cũng như các trung tâm khác trên th ế giới nghiên
cứu về bộ gen người thường cắt các đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể một cách định
hướng theo bản đồ di truyền, rồi đem giải trình tự các đoạn cắt DNA này, và cuối cùng
tìm cách ghép nối chúng lại với nhau cho đúng vị trí của chúng trên đại phân tử DNA.
Phương pháp này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức vì có nhiều khi các đoạn
cắt DNA quá lớn, rất khó giải trình tự cũng như khó cho kết quả giải trình tự chính xác.
Do đó, với mỗi một đoạn DNA các nhà khoa h ọc phải thực hiện giải trình tự ít nhất là
7 lần để đảm bảo độ lặp lại. Chính vì v ậy, với cách ti ếp cận này, nhi ều vị trí trên các
đại phân tử DNA vẫn không thể giải trình tự được mà từ đó các nhà khoa học của HGP
có th ể hoàn t ất vi ệc xếp đúng vị trí các đoạn DNA đã gi ải trình t ự trên đại phân t ử
DNA của nhiễm sắc thể.
Tiến sĩ Crag Venter đã thực hiện một phương pháp giải trình tự bộ gen người một
cách hoàn toàn khác h ẳn (hình 45). Trước hết ông cho tách chi ết toàn bộ DNA nhi ễm
sắc th ể tế bào ng ười rồi phá bung m ột cách không định hướng các đại phân t ử DNA
thành các mảnh DNA nhỏ hơn. Đem giải trình tự tất cả các mảnh DNA nhỏ này. Cu ối
cùng dùng những máy điện toán cực mạnh mà ông đã hợp tác với công ty ABI ch ế tạo
ra, dò tìm các đầu trùng lặp của các mảnh DNA nhỏ này để lắp nối vào đúng các vị trí
của chúng trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Chính nhờ áp dụng chiến lược giải
trình tự này mà Celera Genomics đã giải trình tự rất nhanh các mảnh DNA, chỉ cần lặp
89
lại cho mỗi mảnh DNA có 5 l ần, và đã xếp đúng gần như hầu hết vị trí của các mảnh
DNA đã giải trình tự trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Hơn thế nữa, TS. Crag
Venter cũng tuyên bố công ty đã triển khai một kỹ thuật mới có th ể làm cho ph ương
pháp gi ải trình t ự bộ gen c ủa công ty, v ốn dĩ đã là ph ương pháp nhanh nh ất rồi, tr ở
thành nhanh hơn nữa. Cuối năm 2000, Celera Genomics đã hoàn thành vi ệc giải trình
tự bộ gen của chuột với 2.3 tỷ “ký tự hóa học” trong đó có rất nhiều tương đồng với bộ
gen người, nhờ vậy sẽ giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc truy tìm các ch ức
năng của các gen.
2. Kết quả giải trình tự bộ gene người
Sau gần 10 n ăm nghiên c ứu
thực hiện với những năm càng về
sau càng sôi động không khí thi
DNA từ mhiễm sắc thể được phá bung thành nhiều mãnh nhỏ
đua do sự nhập cuộc của các công
ty tư nhân, ngày 26 tháng 6 n ăm
2000, tại Tòa B ạch Ốc với sự
Các mãnh DNA nhỏ được giải trình tự
g g c g g c g g a g c a g
hiện di ện của Tổng Th ống Hoa
c a g g c a t t t c c a g c
Kỳ Bill Clinton, hai khoa h ọc gia
c g a g c g g c g g
Mỹ là Ti ến Sĩ Crag Venter đại
c c a g c a g t g a g g a g a c a g c
diện cho Celera Genomic và Ti ến
Các mãnh DNA nhỏ được chương trình phân tích tự động tìm các đầu trùng lặp, nhờ đó tái hiện được trình tự của đại phân tử DNA
Sĩ Francis Collins đại di ện cho
HGP (HGP: Human Genome
c c a g c a g t g a g g a g a c a g c
g g c g g c g g a g c a g
c a g g c a t t t c c a g c
Project) của NIH (NIH: National
c g a g c g g c g g
Institute of Health) công b ố một
c g a g c g g c g g c g g a g c a g g c a t t t c c a g c a g t g a g g a g a c a g c t g t a c
cách long tr ọng là ch ương trình ccgtcaaccggagtta
giải trình t ự bộ gen ng ười đã
hoàn tất. Đây chính là m ột th ời
khắc lịch sử cực kỳ quan trọng và
acgttct
đáng nhớ của nhân loại, đánh dấu
Hình 45:
ngày nhân lo ại đã có trong tay
một bản đồ sinh h ọc cần thi ết để
Phương pháp gi ải trình tự bộ gen ng ười của công ty Celera Genomics: trước hết tách chi ết toàn bộ DNA của nhiễm sắc thể tế bào người, sau đó phá tung DNA thành các mảnh nhỏ, giải trình tự tất cả các mảnh nhỏ này, cuối cùng nhờ chương trình vi tính c ực mạnh để nối kết các đoạn DAN nh ỏ này l ại với nhau bằng cách dò tìm các đầu trùng lặp nhờ vậy tái hiện được mạch DNA nguyên thủy
bước vào k ỷ nguyên m ới với
90
nhiều hứa hẹn các thành t ựu vĩ
đại về sinh y h ọc trong t ương lai. Dù thành công c ủa các nhà khoa h ọc gi ải trình t ự
được 3.1 tỷ các “ký tự hóa học” làm nên b ộ gen người đã được ví nh ư sự kiện lịch sử
con người bước lên mặt trăng (ngày 26 tháng 7 n ăm 1969, từ khoang đổ bộ phi thuyền
Apollo, Neil Armstrong b ước xuống đi dạo trên mặt trăng và đánh dấu thời điểm con
người thực hiện được hoàn toàn ước mơ đã từng ao ước bấy lâu: kh ắc dấu chân mình
trên bề mặt chị Hằng), nhưng đây chưa phải là thời điểm mà con người đã toại nguyện
được ước mơ hiểu biết tường tận được bộ gen của mình.
Thật sự cho đến th ời điểm đó các nhà khoa h ọc ở Công ty Celera Genomic hãy
còn chưa giải trình tự được 3% bộ gen ng ười, tức khoảng 150 tri ệu, và công vi ệc này
đòi hỏi phải từ 1 đến 2 năm nữa mới có th ể hoàn tất vì 3% còn l ại này nằm trên ph ần
khó giải trình tự nhất. Còn HGP thì thành công ít h ơn, hãy còn nhiều đoạn trình tự của
bộ gen mà các nhà khoa học của HGP chưa giải được và cũng có nhiều đoạn trình tự đã
giải được nhưng họ vẫn chưa sắp xếp vào đúng vị trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa
học có gi ải trình t ự được một cách tr ọn vẹn bộ gen con ng ười, thì cu ốn sách của đời
sống (the book of life) này hãy còn ch ưa đọc được, như Gerald Rubin, Phó Giám đốc
Nghiên Cứu Y Sinh Học của Viện Y Học Howard Hughes giải thích: “Cuốn sách được
viết bằng một ngoại ngữ rất phức tạp, cần phải có một thời gian dài chúng ta m ới hiểu
được”. Th ật vậy, có th ể tưởng tượng là nếu các trình t ự của bộ gen ng ười được in ra
thành sách thì s ẽ cần phải khoảng 200 cu ốn và mỗi cuốn dày ph ải 500 trang. Có 3000
trang nằm rải rác trong 200 cuốn sách trên là có ý ngh ĩa tức là có gen, mà cho đến hiện
nay chỉ mới có một số ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa h ọc đã đọc được tức là
xác định được gen. Hãy còn vài trang (kho ảng 3%) chưa viết xong và nh ững trang này
là những trang khó vi ết nhất vì thu ộc những vùng khó gi ải trình tự nhất trong bộ gen
người.
Cho đến tháng 4 n ăm 2003, các trang khuy ết này đã được các nhà khoa h ọc viết
hoàn tất. Tuy vậy, một việc rất lớn hiện đang đặt ra tr ước mắt các nhà khoa h ọc đó là
phải xác định được các trình t ự nào là gen và ch ức năng của các gen này. Ch ỉ có 3%
của bộ gen người là mang gen tức là mang trình tự có ý nghĩa và hiện nay các nhà khoa
học cũng chưa biết chính xác là th ật sự có bao nhiêu gen trong b ộ gen ng ười. Câu tr ả
lời phỏng chừng nhất là từ 28.000 đến 140.000 gen, và g ần đây nhất có lẽ là đang gần
91
đến con s ố chính xác h ơn, đó là 30.000 gen. Trong kho ảng 30.000 gen này, các nhà
khoa học hi ện ch ỉ bi ết được ch ức năng của khoảng 10.000 gen, hãy còn 20.000 ch ưa
biết chức năng của chúng. Đây chính là một cuộc đua mới cũng hứa hẹn đầy sôi động
vì kết quả từng chặng một của cuộc đua, tức kết quả của việc xác định được chúc năng
của từng gen, đều hứa hẹn những áp dụng cực kỳ ngoạn mục và đầy triển vọng trong
sinh học cũng như y học.
3. Gi ải trình tự bộ gene người – cuộc đua chưa kết thúc
Gen chính là trình t ự các nucleotide trong chu ỗi DNA ch ỉ huy được sự tổng hợp
một protein. Chính vì v ậy xác định được chức năng của một gen tức là xác định được
protein mà gen tổng hợp có cấu trúc nh ư thế nào và có nhi ệm vụ gì trong cơ thể sống.
Sau kết quả giải trình tự bộ gen người, hiện nay các nhà khoa h ọc đang có nhiều chiến
lược để có th ể nhanh chóng phát
hiện ch ức năng của các gen trong
Dùng PCR để tổng hợp các gen
bộ gen ng ười. Chúng tôi xin trình
Clone vào các vector
bày ra đây ba trong số những chiến
lược đó.
(1) Nh ờ kết qu ả gi ải trình t ự
Đưa vào các hệ thống tế bào biểu hiện
bộ gen ng ười, các nhà khoa h ọc sẽ
nhanh chóng xác định các trình t ự
mang gen. V ới các k ỹ thu ật sinh
Lập thư viện protein
học phân t ử hi ện đại nh ư kỹ thu ật
PCR, các nhà khoa h ọc sẽ dễ dàng
Thử nghiệm trên các loại tế bào đích
nhân bản các gen này trong ống
nghiệm rồi dòng hóa chúng vào các
vectơ để sau đó nh ờ các h ệ tế bào
biểu hi ện để bi ểu hi ện các protein.
Với cách này các nhà khoa h ọc sẽ
Hình 46: Chiến lược tạo thư vi ện protein để đò tìm ch ức năng của gen, tóm t ắt là t ừ gen t ổng hợp các protein, tr ữ trong thư viện protein, rồi thử trên các hệ thống tế bào đích để phát hi ện ch ức năng của protein, t ừ đó bi ết được chứng năng của gen.
nhanh chóng thành l ập được một
thư vi ện các protein c ủa các gen có trong b ộ gen ng ười. Vấn đề tiếp theo là ph ải xác
định các protein trong thư viện protein là có chức năng gì? Để biết được chức năng của
protein trong th ư vi ện, các nhà khoa h ọc sẽ th ử nghiệm các protein này h ệ th ống các
92
loại nuôi cấy tế bào để tìm hiểu mối giao tiếp giữa protein thử nghiệm với tế bào đích,
nhờ đó xác định tế bào đích nào có ph ản ứng với protein th ử nghiệm, và nh ờ vậy sẽ
biết được chức năng protein để biết được chức năng của gen. (hình 46).
(2) Giải trình tự bộ gen của động vật hữu nhũ
như dã nhân (r ất gi ống bộ gen ng ười) hay chu ột,
đây là nh ững bộ gen c ủa các động vật có nhi ều
tương đồng với bộ gen ng ười, nh ưng lại trên các
động vật mà các nhà khoa h ọc rất dễ làm thí
nghiệm. Trên b ộ gen động vật này, các nhà khoa
học sẽ dễ dàng phát hiện các gen, và các chức năng
của gen thông qua s ự thay đổi ho ặc biểu hiện của
một tính trạng nào đó của động vật thí nghiệm một
Hình 47: Hình dạng của phân tử kháng thể
được vi tính hóa
khi các nhà nghiên c ứu dùng các kỹ thuật sinh học
phân tử gây đột biến hay làm knock-out ngay trên nh ững vùng mang gen c ủa bộ gen.
Một khi đã xác định được gen và chức năng của một gen trên động vật thí nghiệm, các
nhà nghiên cứu sẽ dễ dàng truy tầm và phát hiện gen và chức năng của gen này trên bộ
gen người nhờ phát hi ện sự tương đồng về trình tự trong gen ng ười với gen của động
vật thí nghiệm.
(3) Chúng ta biết rằng một protein được tổng hợp từ gen hoạt động như một vai trò
cấu trúc ho ặc vai trò ch ức năng là nh ờ hình dáng c ủa nó với các hốc nhỏ hay các n ếp
gấp. Chính vì vậy cho nên dù m ột gen có được giải mã và bi ểu hiện được một protein,
thì cũng ch ưa th ể xác định được ch ức năng của protein này n ếu ch ưa bi ết được các
hình dáng của nó. Chính vì v ậy mà Vi ện Quốc Gia Khoa H ọc Y Khoa T ổng Quát tại
Hoa Kỳ đang chi một khoảng 20 tri ệu đô la để thành lập các trung tâm Proteomics, là
các trung tâm chuyên nghiên cứu và lưu trữ các cấu trúc và hình dáng được vi tính hóa
(hình 47 ) của các protein có trong thiên nhiên. Các vi ện Proteomics nh ư vậy cũng
đang và sẽ thành lập tại các nước khác. Các nhà khoa h ọc hy vọng rằng trong vòng 10
năm tới đây, các vi ện proteomics sẽ lưu trữ được hình dáng của gần 10.000 protein có
trong thiên nhiên. Con s ố này dù hãy còn r ất nh ỏ so v ới một số lương khá l ớn các
protein thực sự có trong thiên nhiên, nh ưng các nhà khoa h ọc cũng hy vọng rằng th ư
viện này đủ sức bao gồm tất cả hình dạng của tất cả các protein có liên quan đến sinh
93
học và y học, vì các protein khác không có trong danh sách cũng chỉ là các biến thể hay
các đồng dạng với các protein có trong danh sách mà thôi. Nh ờ các trung tâm
proteomics và thư viện các hình dạng protein, các nhà nghiên cứu chắc chắn sẽ dễ dàng
hơn trong xác định các chức năng của gen.
4. Vi ệt Nam có thể tham gia vào cuộc đua này không?
Hiện nay các nhà khoa h ọc đang cố gắng nghiên c ứu khai phá các bí m ật trong
cuốn sách đời sống ghi chép đầy đủ trình tự bộ gen ng ười với nhiều triển vọng sẽ có
các ứng dụng cách mạng trong sinh h ọc, y h ọc, cũng như các lĩnh vực khoa học khác
và sẽ đưa đến nhiều tiến bộ mới cho loài ng ười trong kỷ nguyên mới này. Các nhà y-
sinh học của chúng ta hoàn toàn có th ể tham gia trong cu ộc đua này, vì theo chúng tôi
thì sinh h ọc phân t ử đối với các qu ốc gia thu nh ập th ấp có th ể coi nh ư là một ngành
khoa học tiểu th ủ công nghi ệp hi ện đại. Tiểu th ủ công nghi ệp vì không nh ất thi ết
phải có các máy móc c ực kỳ hiện đại và tốn kém mà vẫn có thể thực hiện được các kỹ
thuật bằng các thi ết bị không quá đắt ti ền. Hiện đại vì nhà nghiên c ứu th ực hi ện kỹ
thuật dựa trên các ki ến thức hiện đại với các kết quả hoàn toàn có th ể có đóng góp lớn
vào kho tàng ki ến thức hiện đại của nhân loại. Vấn đề chính là chúng ta ph ải có chuẩn
bị như thế nào và phải có chiến lược tham gia vào cuộc đua như thế nào.
Để chuẩn bị, quan tr ọng nhất là chúng ta ph ải cố gắng xây dựng và đào tạo trong
cũng như ngoài n ước đội ngũ các nhà nghiên c ứu y sinh h ọc có trình độ và bản lĩnh
ngang tầm với thế giới. Các nhà nghiên c ứu của chúng ta không ch ỉ phải có ki ến thức
và kỹ năng về chuyên môn sinh-y h ọc mà còn ph ải có kh ả năng tiếp cận để khai thác
được kho tàng ki ến thức cũng như các dữ liệu ngày càng c ập nhật trên mạng internet.
Ngoài ra, chúng ta ph ải tránh tình tr ạng đào tạo các nhà nghiên c ứu nh ưng lại không
chuẩn bị cho họ các điều kiện cũng như phương tiện làm vi ệc. Chính vì s ự thiếu thốn
điều ki ện cũng như ph ương tiện làm vi ệc mà các nhà nghiên c ứu của chúng ta dù có
trình độ và bản lĩnh đến đâu cũng sẽ thui chột dần nhiệt huyết cũng như khả năng theo
thời gian, và d ần dần tình tr ạng ch ảy máu ch ất xám trong c ũng nh ư ngoài n ước sẽ
không thể tránh khỏi.
Về chiến lược, thì có l ẽ chúng ta cũng cố gắng tham gia cu ộc đua với những đích
nhắm là gi ải quyết và khai thác nh ững đặc thù trong n ước. Chẳn hạn khai thác nghiên
cứu cơ chế ở mức độ sinh học phân tử tác động của các dược liệu trong nước bằng cách
94
xây dựng các mô hình thí nghi ệm ex-vivo trên các c ấy tế bào để phát hiện sự cảm ứng
biểu hiện gen khi cho các h ệ thống nuôi cấy tế bào này ti ếp cận với các trích phân c ủa
dược liệu. Phát hiện các cơ chế tác động của dược liệu ở mức độ sinh học phân tử, chắc
chắn chúng ta sẽ khai thác được các nguồn dược liệu quí mà chúng ta vốn có sẵn trong
nước. Ngoài ra, dân t ộc Việt của chúng ta là m ột dân tộc khá thu ần nhất, bên cạnh đó
chúng ta cũng có nh ững dân tộc ít người sống rất tập trung và ch ưa hề bị lai tr ộn, đây
chính là cơ sở cho các nghiên c ứu về sự phân b ố các gen c ũng như các mã di truy ền
cho các nghiên cứu ứng dụng sau này để phát hiện, chữa trị hoặc phòng ngừa các bệnh
lý di truyền.
Nhân loại đang bước vào thiên niên kỷ 21 với hành trang mang theo là các ti ến bộ
vượt bậc ở nhi ều lĩnh vực khoa h ọc khác nhau, trong đó có khoa h ọc Y h ọc và Sinh
học. Một hành trang c ần yếu nh ất cho một cu ộc sống dễ dàng h ơn và t ốt đẹp hơn là
cuốn sách của đời sống với hầu như toàn bộ trình tự của bộ gen người mà các nhà khoa
học mới vừa kịp hoàn tất. Việc khai thác cuốn cẩm nang sinh học cần yếu nhất này của
nhân loại đòi hỏi một sự hợp tác đa ngành cũng như chuyên ngành. Chính vì v ậy nên
chúng tôi cho rằng chúng ta cũng không thể bỏ qua yếu tố hợp tác và học hỏi: chúng ta
phải hợp tác và h ọc hỏi từ bạn bè qu ốc tế, và quan tr ọng nhất là ph ải biết học hỏi và
biết hợp tác giữa chúng ta với nhau.
Ứng dụng công nghệ giải trình tự tại phòng thí nghiệm NK-Biotek
Phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã ứng dụng khá
thành công kỹ thuật giải trình tự vào các dịch vụ chẩn đoán và nghiên cứu. Dưới đây xin
đưa ra một số thành tựu tiêu biểu.
1. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn
Nhờ phát hi ện được một cặp mồi mà sau đó được đặt tên là NK16s-F và NK16s-R
khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps ch ứa các trình tự giúp phân bi ệt giống và loài
các vi khuẩn, phòng thí nghi ệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã
xây dựng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình gi ải trình tự trực
tiếp sản ph ẩm PCR này để định danh vi khu ẩn. Thành công này đã giúp phòng thí
nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa thực hiện được khá nhiều ứng dụng
95
trong các xét nghiệm dịch vụ và nghiên cứu.
a. Ứng dụng trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí
Vi khuẩn kị khí là các vi khu ẩn chỉ có th ể tăng trưởng trong điều kiện khí tr ường
không có oxygene phân t ử (O2). Vi khu ẩn kị khí có th ể là các vi khu ẩn có lợi được sử
dụng trong công ngh ệ vi sinh, tuy nhiên v ề mặt y học rất có nhiều loài vi khu ẩn kị khí
là các tác nhân nhiễm khuẩn nội sinh hay ngoại sinh. Bệnh lý nhiễm khuẩn kị khí rất đa
dạng, từ các nhiễm khuẩn tại chỗ kết hợp với các vi khuẩn không kị khí, hay các nhiễm
khuẩn hệ thống, hay các nhiễm khuẩn đặc hiệu. Do đa dạng như vậy nên việc xác định
một nhiễm khuẩn kị khí về mặt lâm sàng không phải dễ dàng. Trong khi đó xét nghiệm
vi sinh lâm sàng tại các phòng thí nghiệm thường bỏ hẳn xét nghiệm vi khuẩn kị khí vì
gặp phải nhiều trở ngại về kỹ thuật như là: (1) Có được phương tiện chuyên ch ở bệnh
phẩm sao cho giữ được bệnh phẩm luôn ở điều kiện kị khí cho đến khi đến được phòng
thí nghiệm. (2) Tạo khí trường kị khí để nuôi cấy phân lập được vi khuẩn kị khí từ các
bệnh phẩm. (3) Định danh cho được vi khu ẩn kị khí. (4) Làm được kháng sinh đồ vi
khuẩn kị khí.
Trong các trở ngại trên, tr ở ngại khó gi ải quyết nhất là vấn đề định danh vi khu ẩn
kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm. Có nhiều bộ thử nghiệm như API 20A của Bio- Merieux, RapID TM ANA II c ủa Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA
card (Vitek)...có sẵn trên thị trường để cho các phòng thí nghiệm chuyên dùng cho định
danh vi khuẩn kị khí. Tuy nhiên các bộ thử nghiệm này khó có sẵn tại Việt Nam vì nhu
cầu không nhiều. Hơn nữa các bộ thử nghiệm này cũng có nhiểu hạn chế như tỷ lệ định danh sai khá cao (19% đối với API 20A, 10% đối với RapID TM ANA II), t ỷ lệ không thể định danh đến loài c ũng nhiều (38% đối với RapID TM ANA II, 29% đối với API
20A).
Chính vì vậy nên để có th ể thực hiện được xét nghi ệm vi sinh lâm sàng vi khu ẩn
kị khí, phòng thí nghi ệm NK-Biotek và đơn vị R&D c ủa công ty Nam Khoa đã tri ển
khai một gi ải pháp toàn di ện, bao gồm chế tạo được môi tr ường chuyên ch ở CaryBac
có th ể gi ữ bệnh ph ẩm ở điểu ki ện kị khí trong th ời gian 24 gi ờ hơn cả th ời gian cần
thiết để chuyển mẫu từ lâm sàng đến phòng thí nghi ệm, sử dụng ổn định phương tiện
tạo khí trường kị khí bằng các túi Anaerocult A c ủa Merck, thực hiện được kháng sinh
đồ vi khu ẩn kị khí b ằng bộ th ử nghiệm kháng sinh đồ kị khí do đơn vị R&D nghiên
96
cứu và thi ết kế ra. Trong định danh vi khu ẩn kị khí, phòng thí nghi ệm NK-Biotek và
đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã đưa ra một tiếp cận hoàn toàn mới và hiện đại,
nhưng lại ít tốn kém nhất, đó là giải pháp giải trình tự một đoạn chứa trình tự đặc hiệu
giống và loài nằm trong gene 16S của vi khuẩn.
Có thể tóm tắt qui trình nh ư sau: Vi khu ẩn mọc trên hộp thạch phân lập được gặt
vào nước muối sinh lý vô khu ẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun cách thủy sôi
trong 10 phút. Để nguội rồi ly tâm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5ml dịch nổi cho vào PCR
mix 45ml chứa sẵn các thành ph ần kể cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R khuếch đại đoạn
DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loài trên gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95 oC/5’ để kích ho ạt enzyme hot start Taq polymerase, rồi 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30”-72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” c ủa Promega. Sản phẩm tinh sạch được
điện di trên th ạch và sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau
đó được đưa vào ph ản ứng giải trình t ự 2 chi ều sử dụng mồi xuôi và m ồi ng ược của
PCR thực hiện trên bộ thuốc thử “DTCS cycle sequencing kit” c ủa Beckman Coulter.
Chương trình luân nhi ệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trên là 30 chu k ỳ 96oC/20”-50oC/20”-60oC/4’. Sản ph ẩm của ph ản ứng gi ải trình t ự được tủa bằng
ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự CEQ8000. Kết
quả giải trình tự được so chu ỗi bằng chương trình blast search trên ngân hàng d ữ liệu
gene của NCBI. Từ kết quả so chuỗi, chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khu ẩn.
Sau này, với các trang b ị thêm nh ư điện di b ằng DNA chip c ủa Bio-analyzer và máy
giải trình tự ABI 3130XL 16 capillary, qui trình c ủa phản ứng giải trình tự và điện di
giải trình t ự cũng đã được nghiên cứu để tương thích với các trang b ị này. C ụ th ể là
thay vì điện di trên gel r ồi định lượng bằng quang phổ 260/280 thì kết hợp cả hai bằng
điện di và định lượng trên Bio-analyzer DNA chip c ủa Agilent; thay vì dùng DTCS để
là ph ản ứng gi ải trình t ự thì dùng “BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit”
của ABI với chương trình luân nhi ệt của phản ứng giải trình t ự là tr ước hết 1 chu k ỳ 96oC/1’, theo sau 25 chu k ỳ 96 oC/10”-50oC/5”-60oC/4’. Sản ph ẩm của ph ản ứng gi ải
trình tự sau khi tủa bằng ethanol, được chạy điện di giải trình tự trên máy gi ải trình tự
ABI 3130XL với gel POP 7 và mao qu ản 50cm. Hình 48 là m ột kết qu ả định danh
bằng giải trình tự 16s rDNA vi khuẩn kị khí phân lập từ mẫu mủ xoang của bệnh nhân.
97
Phòng thí nghiệm NK biotek đã áp dụng tiếp cận này trong n ăm 2008 cho xét nghi ệm
vi sinh lâm sàng vi khu ẩn kị khí với các mẫu bệnh phẩm là 39 m ẫu mủ xoang lấy từ
bệnh nhân bị viêm xoang mạn tính. Kết quả xét nghiệm cho thấy có 31% (18/59) cấy ra
tác nhân vi khu ẩn kị khí và k ết qu ả định danh b ằng ph ương pháp gi ải trình t ự 16s
rDNA cho thấy có 11% (2/18) Veillonella (cầu khuẩn Gram -), 17% (3/18) Prevotella
buccae (tr ực khu ẩn Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes , 6% (1/18) là
Streptococcus aginosus , 17% (3/18) là Streptococcus constellatus , 17% (3/18) là
Streptococcus gordonii , 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros , và 6% (1/18) là
Peptostreptococcus stomatis. Kết quả này cho th ấy PCR và gi ải trình tự 16s rDNA là
một gi ải pháp k ỹ thu ật hoàn toàn có th ể sử dụng để định danh vi khu ẩn kị khí, gi ải
quyết được khâu kỹ thuật phức tạp và khó kh ăn nhất trong qui trình xét nghi ệm vi sinh
lâm sàng vi khuẩn kị khí.
Hình 48: Kết quả giải trình tự 16s rDNA trực khuẩn Gram [+] phân lập kị khí từ bệnh phẩm mũ xoang lấy từ bệnh
nhân cho phép kết luận đây là Propionibacterium acnes
b. Phát hi ện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản
Probiotic chính là các vi sinh v ật không gây b ệnh, được dùng làm s ản phẩm trợ
sinh qua đường ăn hay uống sử dụng trên người, gia súc, hay thủy sản để phát huy hiệu
98
quả chống lại các nhi ễm trùng nhờ các cơ chế như cạnh tranh ch ất dinh dưỡng và chổ
bám của vi sinh vật gây bệnh, phục hồi vi khuẩn chí bình thường cho ruột hay cho môi
trường, kích thích h ệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể vật chủ chống lại vi
sinh vật gây b ệnh, hay ti ết ra các ch ất có tính kháng sinh kháng được các vi sinh v ật
gây bệnh.
Các vi khu ẩn th ường được dùng làm probiotic là Bacillus subtilis , Lactobacillus
acidophilus, Bifidobacterium...và thường được cung cấp dưới dạng bột ghi hàm l ượng
và các loại vi khuẩn có trong sản phẩm. Do các vi khuẩn này thường là các vi khuẩn dễ
mọc nên ch ỉ với các ph ương tiện phòng thí nghi ệm và các môi tr ường nuôi cấy thông
thường là có thể sản xuất được các sản phẩm probiotic nên hiện nay trên thị trường của
chúng ta xuất hiện khá nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ rất nhiều cơ sở trong
và ngoài nước để sử dụng không ch ỉ cho gia súc, th ủy sản mà cả cho ng ười. Chính vì
tình trạng này nên có m ột vấn đề mà nhi ều người rất quan tâm, đó là li ệu chất lượng
của các sản phẩm probiotic hiện đang có mặt trong thị trường có thật sự đúng như nhà
sản xuất công bố hay không, đặc biệt là liệu các vi khuẩn được ghi trong nhãn hi ệu sản
phẩm có đúng là vi khu ẩn có trong s ản ph ẩm hay không, và hàm l ượng có đảm bảo
đúng như vậy hay không.
Để trả lời câu hỏi trên, trong n ăm 2008 phòng thí nghi ệm NK-Biotek và b ộ phận
R&D của Nam Khoa đã hướng dẫn một số đề tài t ốt nghiệp lu ận văn Th ạc Sĩ có n ội
dung tìm hi ểu ch ất lượng các s ản ph ẩm probiotic dùng cho ng ười và th ủy sản hi ện
đang lưu thông trên th ị tr ường. Để ki ểm tra hàm l ượng thì gi ải pháp k ỹ thu ật không
khó, chỉ cần th ực hi ện cấy định lượng bằng phương pháp th ạch đổ hay ph ương pháp
láng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng và ủ ở điều kiện thích hợp là có th ể cho được
kết qu ả định lượng chính xác hàm l ượng vi khu ẩn đích có trong m ẫu sản ph ẩm cần
phải ki ểm tra. Tuy nhiên để xác định chính xác tên vi khu ẩn có trong s ản ph ẩm có
đúng như tên được nêu trong nhãn s ản phẩm hay không l ại là một vấn đề không đơn
giản vì các vi khu ẩn probiotic nh ư B. subtilis , L. acidophilus ...không ph ải là các vi
khuẩn dễ dàng được định danh đến loài nếu chỉ dựa vào các tính chất sinh vật hóa học.
Chính vì vậy, chúng tôi đã giải pháp PCR và gi ải trình tự gene 16s rDNA của vi khuẩn
phân lập được từ các sản phẩm probiotic để xác định danh tính c ủa vi khuẩn. Kết quả
cho thấy có khá nhi ều loại sản phẩm probiotic sử dụng cho ng ười và cho th ủy sản có
99
vấn đề về mặt chất lượng cả về hàm lượng lẫn về vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm.
Bảng 13 và 14 trình bày k ết quả cho th ấy sự khác bi ệt gi ữa vi khu ẩn thật sự có trong
sản phẩm probiotic so với kết quả được nhà sản xuất công bố trên nhãn.
Bảng 13: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và gi ải trình tự 16s rDNA và k ết quả định lượng các vi khu ẩn
thật sự có trong các probiotic sử dụng trên người
Tên sản phẩm
Tên vi khuẩn trên nhãn sản phẩm
Kết quả PCR và giải trình tự 16sDNA
STT
Bacillus subtilis 10
7/gr
Bacillus subtilis 10
6/gr
Biosubtyl DL
1
Bacillus subtilis 10
8/gr
Bacillus cereus 10
7/gr
Bidisubtilis (gói giấy)
Bacillus subtilis 10
8/gr
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bidisubtilis (gói nhôm)
2 3
Bacillus subtilis 10
8/gr
Bacillus cereus 10
7/gr
Bio – Acimin
Bacillus subtilis 10
7/gr
Bacillus pumilus 10
7/gr
Biosubtyl II (gói)
Bacillus subtilis 10
8/gr
Bacillus subtilis 10
8/gr
Biosubtyl II (viên)
4 5 6
Bacillus subtilis 10
7/gr
Bacillus cereus 10
7/gr
Subtyl
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bacillus cereus 10
6/gr
Medilac – Vita
7 8
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bio Baby
9
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bio Vita
10
Bảng 14: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và gi ải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng* các vi khu ẩn
thật sự có trong các probiotic sử dụng cho thủy sản
Tên sản phẩm
STT
Tên và lượng* vi khuẩn trên nhãn sản phẩm
Kết quả định danh và định lượng* thực tế
DT-LACTO
1
Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus
Bacillus pumilus Không tìm thấyL. acidophilus
9/gr
6/gr
Bio-DW
Bacillus subtilis 10 Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 10 Không tìm thấyL. acidophilus
Bacillus subtilis
B. megaterium
Probiotex-one
Bacillus subtilis 10
Bacillus subtilis 10
11/gr
4/gr
Vime-Subtyl
2 3 4
Bacillus subtilis 10
6/gr
Bacillus subtilis 10
9/gr
Biozyme for fish
Bacillus subtilis 10
Bacillus subtilis 10
9/gr
5/gr
Novazyme F
Bacillus subtilis
Bacillus pumilus
Subtyl-LA
5 6 7
6/gr
NPV-Prozyme 90
Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 10
Bacillus subtilis 10 Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 10
Bacillus subtilis 10
9/gr
6/gr 7/gr
ProKura
Men gấu vàng
8 9 10
Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus
Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
Biobac
11/gr
5/gr
Pond clear
Bacillus subtilis 10 Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 10 Không tìm thấyL. acidophilus
8/gr
5/gr
Bio Pond
11 12 13
Bacillus subtilis 10 Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 10 Không tìm thấyL. acidophilus
Men Bac
14
Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus
Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus
5/gr
Microzyme
15
Bacillus subtilis 10 Không tìm thấyL. acidophilus
Bacillus subtilis ? Lactobacillus acidophilus
Acidovorax sp.
Lactobacillus acidophilus
Zymmix
Lactobacillus acidophilus
Clostridium phylofermentant
Lactovet
16 17
Lactobacillus acidophilus 10
9/gr
L. acidophilus 10
6/gr
Zeofarm
18
*Chỉ nêu lên lượng các vi khuẩn mà định danh bằng PCR và giải trình tự cho thấy kết quả không sai lệch
100
Phân tích các d ữ kiện trình bày trong hai b ảng trên, chúng ta th ấy đối với các sản
phẩm probiotic dùng cho ng ười, sự sai biệt về hàm lượng giữa kết quả kiểm tra so với
công bố trên nhãn không nhi ều (không quá 10 l ần), nh ưng có đến 50% tên vi khu ẩn
công bố không đúng với kết quả định danh. Thậm chí có đến 4 sản phẩm lại sử dụng B.
cereus, vi khu ẩn không được phép có m ặt trong th ực ph ẩm vì có kh ả năng gây tiêu
chảy và ói mữa do có th ể chứa các toxin, làm vi khu ẩn trợ sinh. Đối với các sản phẩm
probiotic dùng cho th ủy sản, kết quả kiểm tra cho th ấy đối với vi khuẩn B. subtilis, có
6/15 mẫu không ph ải là B. subtilis mà là B. cereus hay B. pumilus; và ch ỉ có một sản
phẩm là có ch ứa L. acidophilus còn hầu hết là không tìm th ấy vi khu ẩn này nh ư công
bố trên nhãn. Hình 49 minh họa một kết quả giải trình tự gene 16s rDNA xác định vi
Hình 49: Một chủng vi khuẩn phân lập từ một sản phẩm probiotic nếu chi dựa vào tính chất khuẩn lạc và nhuộm Gram thì không thể biết đây không phải là B. subtilis, nhưng khi giải trình tự 16s rDNA thì xác định được đây là B. cereus.
khuẩn là B. cereus trong khi nhãn sản phẩm lại là B. subtilis. Còn về mặt hàm lượng thì
thật thảm hại, trong các các s ản phẩm được kiểm tra th ật sự có vi khu ẩn như công bố thì đa số hàm lượng tụt giảm từ 104 đến 105 so với công bố. Kết quả của nghiên cứu là
101
một ti ếng chuông báo động để các nhà s ản xu ất cũng nh ư các c ơ quan ki ểm tra ch ất
lượng nên quan tâm đến vấn đề ch ất lượng của các s ản ph ẩm probiotic s ử dụng cho
người và th ủy sản hi ện đang lưu hành t ại Vi ệt Nam; và để ki ểm tra được ch ất lượng
các sản phẩm probiotic thì ph ải sử dụng PCR và gi ải trình tự gene 16s rDNA vì ch ỉ có
giải pháp này m ới có th ể định danh chính xác vi khu ẩn được sử dụng làm probiotic,
tránh nhầm lẫn với các vi khu ẩn không có tác d ụng probiotic hay th ậm chí có th ể độc
hại.
khuẩn lạc, hình ảnh Gram, các tính chất sinh hóa cơ bản, và quan trọng nhất là trình tự gene 16s rDNA
102
Hình 50: Một phiếu lý lịch 16s rDNA của một chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn với các thông tin về tính chất
c. Xây d ựng lý lịch 16s rDNA của các chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn
Trong nội kiểm hay ngo ại kiểm vi sinh, r ất cần thiết phải dùng các ch ủng vi sinh
có lý l ịch định danh ch ủng chính xác. Các phòng thí nghi ệm vi sinh th ường yêu c ầu
cung cấp các ch ủng quốc tế với lý lịch xuất phát từ nhà cung c ấp chủng. Hiện nay rất
khó để có th ể đạt mua các ch ủng gốc qu ốc tế vì vấn đề nguy c ơ kh ủng bố sinh h ọc.
Chính vì vậy giải pháp hay nh ất hiện nay là sử dụng các ch ủng gốc quốc tế hiện đang
lưu gi ữ tại các phòng thí nghi ệm, th ậm chí s ử dụng các ch ủng gốc phân l ập được
nhưng phải có lý lịch dịnh danh chính xác đến loài. Đứng trước yêu cầu này, phòng thí
nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã xây dựng lý lịch 16s rDNA c ủa
tất cả các chủng quốc tế ATCC, cũng như một số chủng phân lập được và tiêu biểu cho
các gi ống và lo ại vi khu ẩn cần cho ki ểm chu ẩn. Hình 50 minh h ọa một lý l ịch 16s
rDNA của 1 ch ủng vi khu ẩn được phòng thí nghi ệm NK-Biotek và đơn vi R&D c ủa
Nam Khoa để cung cấp dùng trong kiểm chuẩn.
Hình 51: Một kết quả định danh bằng PCR và giải trình tự 16s rDNA của một chủng vi sinh công nghi ệp cho thấy đây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khuẩn rất khó định danh bằng vi sinh kinh điển
103
d. Làm xét nghi ệm dịch vụ định danh vi khuẩn
Cũng với công ngh ệ PCR và gi ải trình t ự 16s rDNA c ủa vi khu ẩn, phòng thí
nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã và đang thực hiện dịch vụ định
danh các vi khuẩn được dùng trong vi sinh công nghiệm cũng như vi sinh nông nghiệm
được gửi đến từ các công ty, nhà máy, hay t ừ các yêu c ầu của các đề tài nghiên c ứu.
Mẫu được gửi đến để định danh có thể là các ch ủng vi khuẩn cấy trên môi trường nuôi
cấy, hay là các dịch tách chiết DNA, hay huyền dịch vi khuẩn. Có thể nói với giải pháp
kỹ thuật PCR và gi ải trình tự gene 16s rDNA, các vi khu ẩn dù lạ đến đâu, dù khó định
danh đến đâu cũng đều được định danh đến loài. Hình 51 là kết qu ả một ch ủng vi
khuẩn dùng trong vi sinh công nghi ệm được yêu cầu định danh, và k ết quả định danh
cho thấy đây là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
2. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm
Trong các xét nghiệm vi sinh thì định danh vi nấm có lẽ là một trở ngại lớn nhất vì
nếu sử dụng các phương pháp kinh điển thì không ch ỉ phân tích hình thái đại thể và vi
thể, vốn dĩ phức tạp và công phu, mà còn ph ải làm cho được các khảo sát sinh vật hóa
học khác nh ư đồng hóa đường, phân tích các ch ất bi ến dưỡng...Chính vì v ậy thông
thường ít có phòng thí nghiệm vi sinh làm được xét nghiệm vi nấm.
Nhận diện được trở ngại kỹ thuật chính yếu này, phòng thí nghi ệm NK-Biotek và
đơn vị R&D công ty Nam Khoa đã cố gắng tìm gi ải pháp vượt qua, và sau m ột th ời
gian nghiên cứu - thử nghiệm, đã xây dựng được một giải pháp kỹ thuật đó là sử dụng
PCR và gi ải trình t ự gene 28s rDNA. Nguyên t ắc của gi ải pháp này là s ử dụng bộ NKFUNGI-DNAPREP do đơn vị R&D c ủa công ty Nam Khoa ch ế tạo để tách chi ết
DNA toàn ph ần từ mẫu vi n ấm hay mẫu th ử ch ứa vi n ấm cần định danh, sau đó sử dụng PCR v ới một cặp mồi được đặt tên là NK28s-F và NK28s-R đặc hi ệu một đoạn
DNA dài kho ảng 260 bps có ch ứa các trình t ự đặc hiệu giống và loài c ủa vi nấm trên
gene 26s rDNA, và sau cùng là gi ải trình tự trực tiếp và 2 chiều sản phẩm PCR để định
danh vi nấm qua blast search trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI.
Ứng dụng gi ải pháp k ỹ thu ật này, phòng thí nghi ệm NK-Biotek và đơn vị R&D
104
của công ty Nam khoa đang thực hiện rất thành công hai dịch vụ, đó là:
a. Phát hi ện và định danh vi n ấm trong các bi n ấm lấy ra t ừ ph ẫu thu ật bệnh nhân
viêm xoang
Trước đây, các b ệnh ph ẩm bi n ấm (fungus ball) th ường được các bác s ĩ tai m ũi
họng gửi đến phòng thí nghi ệm giải phẩu bệnh và kết quả thường được nhận về sau 1
Xylaria curt a 1 (2%)
Penicitrium citrinum 3 (5%)
Rhinocladiella atrovirens
3 (5%)
Malassezia restricta 2 (3%)
Neosartorya fischeri 2 (3%)
Aspergillus niger
Candida orthopsilosis
4 (7%)
1 (2%)
Aspergillus fumigatus 23 (40%)
Schizophyllum cominune 1 (2%)
Pichia guilliermondii 1 (2%)
Aspergillus oryzae
11 (19%)
Aspergillus flavus 2 (3%)
Pseudallescheria boydi 4 (7%)
tuần là nhìn thấy vi thể các sợi tơ nấm nghi Aspergillus. Hiện nay với xét nghiệm PCR
Biểu đồ 12: Tổng kết các kết quả phát hiện và định danh nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 28s rDNA trong
các mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang trên bệnh nhân
và giải trình tự được thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-biotek thì các nhà lâm sàng s ẽ
có kết quả sau 2 ngày v ới định danh vi nấm đến loài. Biểu đồ 12 tổng kết các kết quả
phát hiện và định danh vi n ấm trong các bi n ấm được bệnh viện Tai Mũi Họng TP.Hồ
Chí Minh gửi đến trong thời gian gần đây. Có tổng cộng 58 mẫu được gửi đến làm xét
nghiệm, và cả 58 đều phát hiện và định danh được vi nấm là tác nhân gây bệnh.
b. Dịch vụ định danh vi nấm
Trên cơ sở của kỹ thu ật PCR và gi ải trình t ự gene 28s rDNA, phòng thí nghi ệm
NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa tri ển khai được xét nghiệm dịch vụ
định danh vi n ấm với các ngu ồn mẫu là từ các công ty, nhà máy trong l ĩnh vực công
nông nghiệp, hay là t ừ các phòng thí nghi ệm của các trường đại học hay của các trung
tâm nghiên cứu. Có thể nói là cho đến nay, hầu như không có mẫu vi nấm nào gửi đến
phòng thí nghiệm NK-Biotek là không có kết quả định danh. Hình 52 và hình 53 minh
họa hai kết qu ả định danh n ấm trong xét nghi ệm dịch vụ định danh vi n ấm của NK-
105
Biotek.
Hình 52: Vi n ấm có hình d ạng vi th ể hình hạt men nh ư góc trên trái cho k ết quả PCR và gi ải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho k ết quả định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99%.
Hình 53: Vi n ấm có hình d ạng vi th ể hình que dài nh ư góc trên trái cho k ết quả PCR và gi ải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho k ết quả định danh Rhinocladiella atrovirens với độ tương đồng 99%.
3. Ứng dụng PCR và gi ải trình tự để phát hi ện, định lượng và xác định genotype
HCV
Phát hi ện, định lượng và xác định genotype HCV là các thông s ố mà bác s ĩ cần
phải biết trước khi cho chỉ định điều trị đặc hiệu bằng interferon phối hợp với ribavirin
là phát đồ điều trị chuẩn cho bệnh nhân có antiHCV [+]. Phát hi ện HCV-RNA để xác
định là bệnh nhân đang nhiễm HCV, định lượng HCV-RNA là để xác định lượng virus
trước khi b ắt đầu điều tr ị và làm c ơ sở để theo dõi hi ệu qu ả điều tr ị, còn xác định
genotype HCV là để giúp bác s ĩ điều tr ị quy ết định được th ời gian điều tr ị cho b ệnh
nhân. Thông thường các phòng thí nghi ệm lâm sàng sẽ phải thực hiện các yêu cầu này
106
riêng lẽ, nghĩa là họ phải phát hiện HCV-RNA trước, rồi mới định lượng, và cuối cùng
mới định genotype HCV và th ường thì
do yêu c ầu kỹ thu ật nên các xét
Yêu cầu xác định genotype HCV
nghiệm này đều ph ải bắt đầu từ mẫu
huyết thanh c ủa bệnh nhân. Công ty
Nam Khoa l ại sử dụng một ti ếp cận
khác rất mới mẽ, tiện lợi, và ít tốn kém
hơn để phát tri ển một gi ải pháp toàn
Định lượng HCV-RNA bằng xét nghiệm RT-qPCR sử dụng kit NKRT-HCVqPCR
diện th ực hi ện được các yêu c ầu này
của bác s ĩ cùng m ột lúc. Đó là gi ải
pháp sử dụng RT real-time PCR để
Xác định genotype HCV: giải trình tự trực tiếp sản phẩm HCVqPCR (#200bp trên vùng 5’NC)
phát hi ện và định lượng HCV-RNA
trong mẫu huy ết thanh b ệnh nhân và
sau đó giải trình tự trực tiếp sản phẩm
real-time PCR để xác định genotype
HCV bằng cách so chu ỗi trình t ự gi ải
CEQ8000 (8 capillaries)
ABI 3130XL (16 capillaries)
được với ngân hàng d ữ li ệu genotype
HCV trên th ư vi ện NCBI và th ư vi ện
KẾT QUẢ 24 giờ sau khi nhận mẫu
Los Alamos.
Định lượng
37.017 copies/ml
Để xác định genotype HCV, ngoài
Kiểu gene
1c
lý do là m ột mắt xích c ủa gi ải pháp
toàn di ện nh ư đã nêu ở trên, công ty
Nam Khoa ch ọn ti ếp cận gi ải trình t ự
vì còn có nhiều lý do: (1) Nếu sử dụng
kit InoLIPA của Siemen (Bayer) là kit
được các nhà y h ọc thừa nhận thì sẽ là
một lựa chọn khá tốn kém vì giá thành
của kit này khá cao, k ết quả có đôi khi
Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR và gi ải trình tự vùng 5’NC để phát hi ện, định lượng và định genotype HCV
không phân bi ệt được subtype , và với
version cũ thì có sự nh ầm lẫn gi ữa 6a và 1b ; (2) N ếu sử dụng kỹ thu ật gi ải trình t ự
vùng 5’NC của HCV bằng hệ thống gi ải trình t ự kín Trugene c ủa Siemen (Bayer) dù
107
rất được nhi ều nhà y h ọc th ừa nh ận, nh ưng cũng sẽ là một lựa ch ọn tốn kém vì giá
thành của các vật liệu tiêu hao đi kèm theo h ệ thống này rất cao; (3) S ử dụng phương
pháp real-time PCR v ới các probe đặc hiệu là một tiếp cận đơn giản và rẻ tiền nhưng
không đủ nhạy cảm cho ch ẩn đoán vì vùng khu ếch đại không ph ải là vùng 5’ NC (là
vùng được công nh ận là nh ạy cảm nhất cho ch ẩn đoán), không có kh ả năng phân bi ệt
cao các subtype th ường gặp vì khó thi ết kế được các probe đặc hi ệu đến subtype, và
nguy cơ phát hi ện chéo không đặc hi ệu mà vẫn được lầm tưởng là có kh ả năng phát
hiện đồng nhiễm.
Chính vì các lý do trên, Phòng thí Nghi ệm Y Khoa NK-BIOTEK và công ty Nam
Khoa đã nghiên c ứu và xây d ựng được ph ương pháp xét nghi ệm xác định genotype
HCV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC của HCV nhưng thay vì sử dụng hệ thống
giải trình t ự kín c ủa Trugene, s ử dụng hệ th ống gi ải trình t ự mở của ABI (máy ABI
3130XL có 16 mao qu ản) hay của Beckman Coulter (máy CEQ8000 có 8 mao qu ản).
Tiếp cận này đã mang đến cho bệnh nhân và các nhà lâm sàng nhi ều lợi điểm: (1) Nhờ
giải trình t ự tr ực ti ếp được sản ph ẩm PCR t ừ real-time PCR s ử dụng mồi và taqman
probe đặc hiệu vùng 5’NC nên k ết quả xét nghi ệm xác định genotype luôn đi kèm với
kết quả định lượng HCV-RNA. Do vậy các nhà lâm sàng tr ước khi quy ết định điều trị
đặc hiệu cho bệnh nhân ch ỉ cần cho một chỉ định xét nghi ệm xác định genotype HCV
là đủ mà không c ần cho thêm xét nghi ệm định lượng. (2) Đạt được độ nhạy cho ch ẩn
đoán nh ờ sản ph ẩm đích để gi ải
trình tự xác định genotype HCV
chính là s ản ph ẩm PCR d ựa trên
vùng đích 5’NC là vùng duy nh ất
trên genome HCV được th ừa
nhận là đủ nhạy cảm để làm chẩn
đoán xác định và định lượng
HCV. (3) Đạt được độ chính xác
trong xác định genotype HCV
không khác biệt với hệ thống giải
Biểu đồ 13: Phân bố các genotype HCV trong 2000 m ẫu huyết thanh b ệnh nhân nhi ễm HCV được gửi đến xét nghi ệm tại phòng thí nghi ệm NK-Biotek trong năm 2008
trình tự kín Trugene nh ờ gi ải
trình tự đúng ngay đoạn đích mà h ệ th ống Trugene s ử dụng trên vùng 5’-NC c ủa
108
genome HCV. (4) Nhà lâm sàng hay nghiên c ứu còn được cung cấp thông tin về trình
tự vùng 5’NC đã gi ải được và các thông tin này r ất quí giá trong các nghiên c ứu về
phylogenetic để góp ph ần trong nghiên c ứu ngu ồn gốc nhi ễm trùng hay nghiên c ứu
đồng nhiễm HIV/HCV.
Hình 54 tóm tắt qui trình phát hi ện, định lượng và định genotype HCV b ằng kỹ
thuật RT real-time PCR trên đích là vùng 5’ NC c ủa bộ gene HCV rồi sau đó giải trình
tự trực tiếp sản phẩm PCR để xác định genotype HCV. Trong năm 2008, tổng kết 2000
mẫu xét nghiệm định genotype HCV thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-Biotek, chúng
tôi nhận thấy đa số genotype của HCV nhiễm trên bệnh nhân là 1b (58%), k ế đó là 6a
(17%). Biểu đồ 13 tổng kết sự phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh
bệnh nhân nhi ễm HCV được gửi đến xét nghi ệm tại phòng thí nghi ệm NK-Biotek
trong năm 2008.
4. Áp d ụng PCR và giải trình tự để phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV
Hiện nay tại Việt Nam, nh ờ các ti ến bộ về kỹ thuật sinh học phân tử định lượng
được HBV để làm cơ sở đánh giá hi ệu quả điều trị; và phát đồ cũng như các thu ốc có
khả năng điều trị bệnh viêm gan virus B m ạn tính luôn có s ẵn trên thị trường để bác sĩ
dễ dàng lựa chọn, nên vi ệc điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan virus B m ạn tính
đã phổ biến hơn. Tuy nhiên, điều trị đặc hiệu bệnh lý viêm gan virus B m ạn tính bằng
các thuốc kháng virus là một điều trị lâu dài. Chính vì vậy nên HBV (virus viêm gan B,
hepatitis B virus) có c ơ hội tiếp xúc lâu dài v ới các thuốc kháng virus và t ạo được các
đột biến kháng thu ốc, và từ đấy nảy sinh ra yêu c ầu phải có xét nghi ệm phát hi ện các
đột biến kháng thuốc của HBV, đặc biệt đối với các thuốc như lamivudine, adefovir và
entecavir là các thuốc thường được sử dụng hiện nay.
Để phát hiện đầy đủ các đột biến kháng các thuốc nêu trên, nếu chọn tiếp cận real-
time PCR hay PCR-RFLP thì ch ỉ có thể phát hiện được rất ít đột biến kháng thuốc của
HBV vì có quá nhi ều các bi ến th ể của HBV đã làm cho vi ệc thi ết kế các probe phát
hiện đột biến hay thi ết kế các vị trí để enzyme cắt giới hạn nhận diện bị khó kh ăn rất
nhiều. Hơn nữa cho đến hi ện nay, y v ăn ch ỉ mới báo cáo có real-time PCR và PCR-
RFLP phát hi ện đột bi ến kháng lamivudine ở hai v ị trí 180 và 204 trong khi đó còn
nhiều đột bi ến nữa không ch ỉ tạo cho virus kháng lamivudine, mà c ả adefovir và
109
entecavir nữa. Chọn tiếp cận như vậy chắc chắn sẽ không đáp ứng được thực tế.
Do vậy phòng thí nghi ệm NK-
BIOTEK và công ty Nam Khoa đã
Yêu cầu tìm đột biến kháng thuốc của HBV
chọn một ti ếp cận khác d ựa trên
phương ti ện và trang thi ết bị hi ện
đại đang có ở công ty, đó chính là
PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 550bps trên vùng gene preS của HBV
tiếp cận PCR và gi ải trình t ự một
đoạn DNA dài 550 bps trên vùng
Tìm đột biến kháng thuốc: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 550bps từ vùng gene preS
gene preS để làm xét nghi ệm phát
hiện các đột bi ến kháng
Lamivudine, Adefovir và
Entecavir. Xét nghiệm dựa trên tiếp
ABI 3130XL (16 capillaries)
KEÁT QUAÛ (24 giôø sau khi nhaän maãu)
cận này hi ện nay đang được nhi ều
nhà lâm sàng và nghiên c ứu y h ọc
tin cậy nh ờ các ưu điểm sau: (1)
Phát hi ện được hầu hết các v ị trí
đột bi ến có th ể xảy ra để gây ra
TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATC TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATC AACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGG AAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTA GTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAAC ATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT
kháng 3 lo ại thuốc trên; (2) V ới độ
nhạy cảm của thi ết bị gi ải trình t ự
hiện nay (sequencer ABI 3130XL,
giải hai chiều), không chỉ tất cả các
Genotype C
Genotype Phát hiện đột biến
điểm đột biến kể trên đều được giải
đến, mà cả tình tr ạng heterozygote
của đột bi ến/hoang dại vẫn được
phát hi ện; (3) V ới trình t ự gi ải
được, kết quả xét nghi ệm còn cung
Kháng Lamivudine I169T V173L L180M A181T T184S M204I V207M/I Q215S
KQ K K Coù K K Coù K K
Kháng Adefovir L80V/I S85A V84M A181V/T V214A Q215S N236T
KQ K K K K K K K
Kháng Entecavir T184G S202I M250V
KQ K K K
cấp thông tin m ột cách chính xác
về genotype c ủa HBV mà không
Hình 55: Qui trình xét nghi ệm phát hi ện đột bi ến kháng thuốc và xác định genotype c ủa HBV b ằng kỹ thuật PCR và giải trình tự một đọan DNA 550 bps trên gene PreS của HBV
cần ph ải có ch ỉ định xét nghi ệm
này từ lâm sàng. Hình 55 mô tả qui trình xét nghiệm PCR và giải trình tự gene preS để
phát hiện các đột biến kháng thu ốc và xác định genotype HBV, trong đó kết quả phát
110
hiện đột biến được trình bày trong m ột bảng liệt kê các v ị trí đột biến đột biến kháng
lamivudine, adefovir và entecavir đã được các nhà nghiên cứu ghi nhận và tất cả các vị
trí đột biến này đều nằm trong trình tự được
giải.
54.28
60
50
40
Trong năm 2008, phòng thí nghi ệm
NK-Biotek của công ty Nam Khoa đã th ực
29.89
30
20
hiện được 455 xét nghiệm PCR và giải trình
tự vùng gene PreS c ủa HBV, k ết qu ả cho
8.79
6.59
10
0.45
0
thấy có đến 69% các tr ường hợp là thu ộc
204
204+207 204+180 204+180+207Khoâng ÑB
genotype B và 31% là genotype C, không
Biểu đồ 14:
Sự phân b ố tỷ lệ các v ị trí đột bi ến kháng lamivudine phát hiện được
có các genotype khác. Có 46% phát hi ện có
đột biến kháng lamivudine với 30% ở vị trí
204, 9% ở hai vị trí 204 và 207, 6.5% ở 204 và 180, và 0.5% đột biến cả 204, 180 và
207. Kết quả này được trình bày trong biểu đồ 14.
5. Áp d ụng PCR và gi ải trình tự phát hiện đột biến precore/ promoter và genotype
HBV
Trong quá trình phản ứng với các đáp ứng miễn dịch từ bệnh nhân, HBV có th ể bị
đột bi ến precore và đột bi ến core promoter. Đột bi ến precore là đột bi ến tại vị trí
nucleotide 1896 t ừ G thành A (G1896A) làm cho codon TGG tr ở thành TAG là m ột
stop codon. Đột biến này đã làm cho HBV không th ể tổng hợp được HBeAg. Do vậy,
khi thử máu bệnh nhân, không phát hi ện được HBeAg mà HBV-DNA vẫn tồn lại cùng
với HBeAb [+]. Đây là một đột bi ến rất quan tr ọng cần ph ải được phát hi ện vì b ệnh
nhân sẽ có nguy cơ cao vào xơ gan hay ung th ư gan, đặc biệt khi phát hi ện được thêm
đột biến core promoter t ại hai vị trí nucleotide 1762 và 1764 (A1762T, G1764A). Khi
bệnh nhân b ị phát hi ện mang HBV có các đột bi ến này thì ph ải được điều tr ị bằng
thuốc kháng virus su ốt đời. Chính vì t ầm quan tr ọng đối với lâm sàng nh ư vậy nên
trong thời gian qua phòng thí nghi ệm NK-BIOTEK & công ty Nam Khoa đã xây dựng
được kỹ thu ật PCR và gi ải trình t ự vùng gene core để làm xét nghi ệm phát hi ện đột
biến precore và đột bi ến core promoter và không ch ỉ vậy, còn cho bi ết thêm v ề
genotype HBV. Hình 56 minh họa qui trình này.
Xét nghiệm này hiện nay đang được nhiều nhà lâm sàng và nghiên cứu y học quan
111
tâm và tin c ậy. Trong năm 2008, phòng thí nghi ệm NK-Biotek và công ty Nam Khoa
đã th ực hi ện 134 m ẫu xét nghi ệm đột
Yêu cầu tìm đột biến precore/promoter của HBV
Bệnh nhân có HBeAg- HBeAb+, HBVDNA+, ALT ›fl bất thường
biến precore và core promoter c ủa
HBV trên các b ệnh nhân bị bác sĩ điều
trị nghi ng ờ có đột bi ến precore/core
PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 250bps trên vùng gene core của HBV
promoter. Kết quả cho thấy có đến 73%
phát hi ện đột bi ến với nhi ều ki ểu đột
Tìm đột biến precore/promoter: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 250bps từ vùng gene core
biến khác nhau, có th ể ch ỉ đột bi ến
precore, có th ể ch ỉ đột bi ến core
ABI 3130XL (16 capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries)
promoter, có th ể đột bi ến cả promoter
KẾT QUẢ (24 gi ờ sau khi nh ận m ẫu)
và core promoter. Các thông tin này s ẽ
rất hữu dụng để các nhà y h ọc có th ể
nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ với
lâm sàng, b ệnh học và sinh b ệnh học.
Biểu đồ 15 trình bày t ỷ lệ phân bố các
kiểu đột biến phát hiện được.
6. PCR và gi ải trình tự phát hiện đột
biến kháng rifampicine và INH
của M. tuberculosis
Từ năm 1996, chúng tôi đã bắt đầu
Hình 56: Qui trình PCR và gi ải trình tự phát
hiện đột biến precore/promoter
triển khai k ỹ thu ật PCR phát hi ện M.
tuberculosis và cho đến hi ện nay xét
G1896A A1762T
9 6%
A1762T
2 1%
nghiệm PCR phát hi ện M. tuberculosis
G1896A 36 26%
do chúng tôi phát triển này đã được các
Không đột biến 27 19%
nhà y học trong nước chấp nhận nhờ độ
nhạy cảm rất cao so v ới kh ảo sát tr ực
tiếp và nuôi cấy. Với PCR, kết quả phát
hiện M. tuberculosis có thể đến tay nhà
lâm sàng chỉ 24 gi ờ sau khi gửi mẫu đi
G1896A A1762T, G1764A 28 20%
xét nghiệm. Nhờ ưu điểm nhanh chóng
38 28% A1762T, G1764A
và nh ạy cảm nên có th ể nói công c ụ
Biểu đồ 15: Tỷ lệ phân b ố các ki ểu đột bi ến ện
precore/core promoter phát hi được trong 134 mẫu xét nghiệm
112
PCR đã mang đến một lợi ích không
427
405 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG
Pro CCG
Leu CTA
Val GTC
/..../ Dele
Leu TTG
Pro CCG
(3%)
(3%)
(9%)
(1%)
(1%)
(1%)
Leu TTG Gln CAG Trp TGG
(52%)
Tyr TAC Asp GAC Gln CAG Asn AAC Arg CGC Pro CCC
(28%)
Hình 57: Vùng nóng v ới các đột biến trên rpoB gene và tỷ lệ thường xãy ra
chối cãi trong lĩnh vực chẩn đoán lao, vượt qua các công cụ vi sinh kinh điển. Một vấn
đề hiện nay đang được các nhà y h ọc quan tâm là làm th ế nào có th ể có được kết quả
kháng sinh đồ vi khuẩn M. tuberculosis với thời gian ngắn hơn, vì với phương pháp vi
sinh kinh điển thì kết quả kháng
Yêu cầu
sinh đồ ch ỉ có th ể có được sau
PCR phát hiện MTB Tìm đột biến kháng Rifampicine và INH
hơn 2 tháng v ới 1 tháng để có
được vi khu ẩn mọc được trên
tự 249bp trên
môi trường nuôi cấy và 1 tháng
PCR khuếch đại trình tự đặc hi ệu ch ứa các đột bi ến trên rpoB, katG, và inhA
PCR phát hi ện MTB dựa trên khu ếch đại trình IS6110
để có k ết qu ả kháng sinh đồ.
Thông tin về kháng sinh đồ mà
bác sĩ cần bi ết nh ất là li ệu vi
Giải trình tự phát hiện đột biến rpoB, katG và inhA
Kết quả phát hiện MTB trong vòng 24giờ
khuẩn phân l ập trên b ệnh nhân
có đề kháng v ới thu ốc kháng
lao rifampicin, được coi là hi ệu
quả nh ất cho đến hi ện nay hay
Đột biến rpoB L430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V
không để có th ể tiếp tục duy trì
Đột biến katG S315T
hay ch ỉ định cho b ệnh nhân
Đột biến inhA C-15T
công th ức kháng lao có
rifampicine.
Kết quả kháng sinh đồ MTB 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm
Trước th ực tế đòi hỏi này,
phòng thí nghi ệm NK-Biotek
và đơn vị R&D công ty Nam
Hình 58: Mô t ả qui trình PCR và gi ải trình t ự để phát hi ện các ủa vi khu ẩn M. đột bi ến kháng rifampicin và INH c tuberculosis tr ực ti ếp từ mẫu đàm mà không ph ải qua nuôi cấy. Kết quả đến tay các nhà lâm sàng ch ỉ 72 gi ờ sau khi lấy mẫu đàm
113
Khoa đã nghiên cứu và th ử nghiệm một qui trình PCR và gi ải trình tự để khuếch đại
một vùng nóng c ủa gene rpoB c ủa M. tuberculosis để có th ể phát hi ện được tất cả các
đột biến thường xảy ra tạo cho vi khuẩn kháng được rifampicine (hình 57).
Ngoài vùng nóng này, chúng tôi c ũng đã thành công trong xây d ựng một qui trình
phát hiện đề kháng INH bằng kỹ thuật PCR và gi ải trình tự gene katG để phát hi ện vị
trí đột biến thường gặp là S315T và gene inhA để xác định vị trí đột biến C-15T. Hiện
nay qui trình này đã được chúng tôi áp d ụng để phát hi ện trực tiếp các đột biến kháng
thuốc này từ bệnh phẩm mà không cần thiết phải qua nuôi cấy. Hình 58 minh họa tóm
tắt qui trình được phòng thí nghi ệm NK-Biotek th ực hi ện để phát hi ện MTB và cho
luôn kết qu ả kháng sinh đồ ch ỉ 72 gi ờ sau khi l ấy mẫu đàm từ bệnh nhân. Hi ện nay
chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu để có th ể có thêm các k ết quả kháng sinh đồ phát
hiện các đột bi ến kháng các thu ốc kháng lao khác nh ư ethambutol, PAS, PZA,
Ofloxacin...để có th ể đáp ứng được một cách đầy đủ các yêu c ầu đến từ các nhà lâm
sàng trong cu ộc chiến đấu chống lại tình hình lao đa kháng ngày càng tr ầm trọng hiện
114
nay.
