Phương pháp Dideoxy hay còn
gọi là phương pháp gián đoạn
chuỗi (chain-determination
method) là một phương pháp xác
định trình tự DNA được Frederick
Sanger phát triển vào năm 1975.
Nguyên tắc cơ bản của phương
pháp Dideoxy dựa vào hoạt động
của enzyme DNA polymerase trong
quá trình tổng hợp DNA. Enzyme
DNA polymerase xúc tác gắn
các nucleotide vào mạch đơn DNA
đang tổng hợp ở vị trí 3'có chứa
nhóm -OH tự do, khi gặp
nucleotide không có nhóm 3'-OH
thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại.
Đặc trưng của phương pháp là sử
dụng dideoxynucleotide để làm
ngừng phản ứng tổng hợp DNA
một cách ngẫu nhiên. Trong phản
ứng sử dụng đoạn DNA mồi là
đoạn DNA mạch đơn có kích thước
20 nucleotide.
[sửa]Nội dung
Phương pháp được chia làm 4 phản
ứng thực hiện riêng rẽ có DNA
khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại
dNTP
(deoxynucleotide), enzyme Taq
polymerase, dung dịch đệm và các
điều kiện phản ứng thích hợp đồng
thời có bổ sung thêm khoảng 1%
một loại ddNTP
(dideoxynucleotide) cho mỗi phản
ứng khác nhau. Các
dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên
tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ
4. Do đó khi mạch DNA đang tổng
hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có
nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng
nên mạch đang tổng hợp không
được kéo dài tiếp tục phản ứng
tổng hợp sẽ dừng lại.
Chính do lượng ddNTP được đưa
vào với một lượng nhỏ so với
lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới
có một ddNTP được sử dụng ngẫu
nhiên làm phản ứng tổng hợp DNA
dừng lại. Kết quả sẽ tổng hợp được
các đoạn nucleotide có kích thước
dài ngắn khác nhau. Để xác định
trình tự, người ta điện di kết quả
thu được trên gel polyacrylamid.
Các đoạn oligonucleotide có kích
thước khác nhau sẽ di chuyển với
tốc độ khác nhau trên bản gel. Lúc
này thực hiện phản ứng hiện hình
phóng xạ có thể quan sát được các
đoạn mạch đơn DNA bằng các
vạch trên bản gel. Tổng hợp kết
quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các
nucleotide của đoạn gen.